Analyse chromosomique sur puce à ADN : Apports en pathologie Dr Nicolas CHATRON Laboratoire de Cytogénétique Constitutionnelle Hospices Civils de Lyon 18/10/2018 Introduction ADN et chromosome Introduction Structure des gènes ADN Gène Introduction Structure des gènes ADN Gène TRANSCRIPTION ARN Epissage des introns Introduction Structure des gènes Gène ADN TRANSCRIPTION ARN Epissage des introns TRADUCTION PROTEINE Modifié à partir de http://www.snv.jussieu.fr/vie/dossiers/evolution/evol/traits_2.html Génétique moléculaire: lecture des séquences codantes (exons) Introduction Niveaux d’étude du génome Cytogénétique conventionnelle « Etude à l’échelle du chromosome » Cytogénétique moléculaire Biologie moléculaire « Etude à l’échelle du nucléotide » La Cytogénétique Le caryotype ❖ Culture cellulaire, coloration au Giemsa, classement des chromosomes ❖ 46 chromosomes chez l’homme (23 paires) ❖ Recherche anomalies de nombre, de structure O'Connor, 2008, Nature Education et http://www.nichd.nih.gov/ Principal problème : niveau de résolution : 5-10 Mb: 1 bande La Cytogénétique Cytogénétique moléculaire: la FISH 22q11.2 Non délété Microdélétion 22q11.2 Niveau de résolution 150 kb mais analyse ciblée Rauch et al. J Med Genet 2005 Introduction Niveaux d’étude du génome Cytogénétique conventionnelle « Etude à l’échelle du chromosome » Cytogénétique moléculaire Biologie moléculaire « Etude à l’échelle du nucléotide » ACPA : Analyse Chromosomique sur puce à ADN • CGH-array : Hybridation Génomique Comparative sur muse à ADN. Détection des variations du nombre de copies (CNV) • SNP-array : Single Nucleotide Polymorphism Détection des variations du nombre de copies + Détection des pertes d’hétérozygotie Génotypage CGH array …CGGACTGCCAGCATTCTGGTTTTAATTATCGGAGTATG TGTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGGCTTT CTAATGCCTTTCTCAGCGCATCTAAGGAAAGACTAAGGA AAAAAAAAAGTACAAAGAATTGTTGTTTGACTGTTGCCC GA… …GTTAATGGCTTTCTTACTCTCGTCTCACAGACACATAC TCCATAATTTAAAACCAAATGCTTGTGAGAAAGCTTGCT CATCATACTTGCTGCTTCAAAGAAAGACTAAGGAAAAAA AAAAGTACAAAGAATTGTTGTTTGATTGTTGTCAATCAA … CGH array Oligonucléotide X = 60 bases …CGGACTGCCAGCATTCTGGTTTTAATTATCGGAGTATG TGTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGGCTTT CTAATGCCTTTCTCAGCGCATCTAAGGAAAGACTAAGGA AAAAAAAAAGTACAAAGAATTGTTGTTTGACTGTTGCCC GA… …GTTAATGGCTTTCTTACTCTCGTCTCACAGACACATAC TCCATAATTTAAAACCAAATGCTTGTGAGAAAGCTTGCT CATCATACTTGCTGCTTCAAAGAAAGACTAAGGAAAAAA AAAAGTACAAAGAATTGTTGTTTGATTGTTGTCAATCAA … CGH array Oligonucléotide X = 60 bases …CGGACTGCCAGCATTCTGGTTTTAATTATCGGAGTATG TGTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGGCTTT CTAATGCCTTTCTCAGCGCATCTAAGGAAAGACTAAGGA AAAAAAAAAGTACAAAGAATTGTTGTTTGACTGTTGCCC GA… Oligonucléotide Y = 60 bases …GTTAATGGCTTTCTTACTCTCGTCTCACAGACACATAC TCCATAATTTAAAACCAAATGCTTGTGAGAAAGCTTGCT CATCATACTTGCTGCTTCAAAGAAAGACTAAGGAAAAAA AAAAGTACAAAGAATTGTTGTTTGATTGTTGTCAATCAA … CGH array Oligonucléotide X = 60 bases …CGGACTGCCAGCATTCTGGTTTTAATTATCGGAGTATG TGTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGGCTTT CTAATGCCTTTCTCAGCGCATCTAAGGAAAGACTAAGGA AAAAAAAAAGTACAAAGAATTGTTGTTTGACTGTTGCCC GA… Intervalle 30 Kb = environ 30 000 bases Oligonucléotide Y = 60 bases …GTTAATGGCTTTCTTACTCTCGTCTCACAGACACATAC TCCATAATTTAAAACCAAATGCTTGTGAGAAAGCTTGCT CATCATACTTGCTGCTTCAAAGAAAGACTAAGGAAAAAA AAAAGTACAAAGAATTGTTGTTTGATTGTTGTCAATCAA … CGH array Synthèse in silico des oligos Oligonucléotide X = 60 bases ATGTGTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGG CTTTCTAATGCCTTTCTCAGCGC Oligonucléotide Y = 60 bases TGTGAGAAAGCTTGCTCATCATACTTGCTGCTTCAAAG AAAGACTAAGGAAAAAAAAAAG CGH array Synthèse in silico des oligos Oligonucléotide X = 60 bases ATGTGTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGGCTTTCTAATGCCTTTCTCAGCGC Oligonucléotide Y = 60 bases TGTGAGAAAGCTTGCTCATCATACTTGCTGCTTCAAAGAAAGACTAAGGAAAAAAAAAAG CGH array Synthèse in silico des oligos En réalité, nombreux oligonucléotides de même séquence par spot ATGTGTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGGCTTTCTAATGCCTTTCTCAGCGC ATGTGTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGGCTTTCTAATGCCTTTCTCAGCGC ATGTGTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGGCTTTCTAATGCCTTTCTCAGCGC ATGTGTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGGCTTTCTAATGCCTTTCTCAGCGC CGH array Synthèse in silico des oligos ATGTGTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGGCTTTCTAATGCCTTTCTCAGCGC ATGTGTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGGCTTTCTAATGCCTTTCTCAGCGC ATGTGTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGGCTTTCTAATGCCTTTCTCAGCGC Oligo X … n fois Nombre total d’oligonucléotides différent suivant les formats de lame… TGTGAGAAAGCTTGCTCATCATACTTGCTGCTTCAAAGAAAGACTAAGGAAAAAAAAAAG TGTGAGAAAGCTTGCTCATCATACTTGCTGCTTCAAAGAAAGACTAAGGAAAAAAAAAAG TGTGAGAAAGCTTGCTCATCATACTTGCTGCTTCAAAGAAAGACTAAGGAAAAAAAAAAG Oligo Y … n fois CGH array Préparation des ADNs 1. 2. 3. 4. Extraction d’ADN Normalisation à la même concentration Digestion par des enzymes de restriction Marquage par fluorochrome CGH array Hybridation Exemple : même quantité d’ADN patient que d’ADN témoin / oligo ATGTGTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGGCTTTCTAATGCCTTTCTCAGCGC …CACCUCUGCUCUCAUUCAUUUUGAUGUCCGUUUGAUUACGGAAAGAGUCGCG… ATGTGTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGGCTTTCTAATGCCTTTCTCAGCGC …CACCUCUGCUCUCAUUCAUUUUGAUGUCCGUUUGAUUACGGAAAGAGUCGCG… ATGTGTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGGCTTTCTAATGCCTTTCTCAGCGC …CACCUCUGCUCUCAUUCAUUUUGAUGUCCGUUUGAUUACGGAAAGAGUCGCG… ATGTGTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGGCTTTCTAATGCCTTTCTCAGCGC …CACCUCUGCUCUCAUUCAUUUUGAUGUCCGUUUGAUUACGGAAAGAGUCGCG… CGH array Hybridation Exemple : même quantité d’ADN patient que d’ADN témoin / oligo ATGTGTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGGCTTTCTAATGCCTTTCTCAGCGC …CACCUCUGCUCUCAUUCAUUUUGAUGUCCGUUUGAUUACGGAAAGAGUCGCG… ATGTGTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGGCTTTCTAATGCCTTTCTCAGCGC …CACCUCUGCUCUCAUUCAUUUUGAUGUCCGUUUGAUUACGGAAAGAGUCGCG… ATGTGTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGGCTTTCTAATGCCTTTCTCAGCGC …CACCUCUGCUCUCAUUCAUUUUGAUGUCCGUUUGAUUACGGAAAGAGUCGCG… ATGTGTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGGCTTTCTAATGCCTTTCTCAGCGC …CACCUCUGCUCUCAUUCAUUUUGAUGUCCGUUUGAUUACGGAAAGAGUCGCG… 5 µm CGH array Hybridation Exemple : plus d’ADN patient que d’ADN témoin / oligo ATGTGTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGGCTTTCTAATGCCTTTCTCAGCGC …CACCUCUGCUCUCAUUCAUUUUGAUGUCCGUUUGAUUACGGAAAGAGUCGCG… ATGTGTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGGCTTTCTAATGCCTTTCTCAGCGC …CACCUCUGCUCUCAUUCAUUUUGAUGUCCGUUUGAUUACGGAAAGAGUCGCG… ATGTGTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGGCTTTCTAATGCCTTTCTCAGCGC …CACCUCUGCUCUCAUUCAUUUUGAUGUCCGUUUGAUUACGGAAAGAGUCGCG… ATGTGTCTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACAGGCTTTCTAATGCCTTTCTCAGCGC …CACCUCUGCUCUCAUUCAUUUUGAUGUCCGUUUGAUUACGGAAAGAGUCGCG… Niveau de résolution: Dépend du nombre de sondes Déposées sur la lame 180 000 oligos : résolution 30-50 kb 100 fois plus sensible que le caryotype Miller AJHG 2010 La Cytogénétique Du caryotype à l’ACPA ❖ ACPA: Analyse Chromosomique sur Puce à ADN = CGH array = Caryotype moléculaire ❖ Etude à l’échelle de l’ADN (pas de culture de cellule, pas de visualisation des chromosomes) ❖ Principe de l’ACPA: ADN témoin ADN patient + → 1 copie / 2 copies La Cytogénétique Du caryotype à l’ACPA ❖ ACPA: Analyse Chromosomique sur Puce à ADN = CGH array = Caryotype moléculaire ❖ Etude à l’échelle de l’ADN (pas de culture de cellule, pas de visualisation des chromosomes) ❖ Principe de l’ACPA: ADN témoin ADN patient + → 3 copies / 2 copies CNV : Variation du Nombre de Copies SNP array SNP : Single Nucleotide Polymorphism = variants nucléotidiques polymorphiques Possibilité d’étudier à une position génomique le génotype SNP array Plusieurs techniques coexistent : Technologie Illumina : 1/ Hybridation d’une sonde à l’ADN génomique juste en amont d’un SNP 2/ Action d’une polymérase pour ajout du dNTP complémentaire au SNP 3/ Identification spécifique du dNTP ajouté par réaction AC-haptène SNP array Technologie Affymetrix : Utilisation de sondes « inversées » s’hybridant sur l’ADN. Suppression de l’ADN génomique Linéarisation puis hybridation et révélation Avantage : permet de s’affranchir de la qualité de l’ADN SNP array Résultats : Log ratio : niveau de fluorescence par rapport à un set de référence ➔ CNV B-Allelle Frequency : retranscription du génotypage (à confronter aux données log ratio) SNP array : Interprétation Log Ratio 2 1 0 -1 -2 B allele Frequency 1 0 Normal Perte Gain Perte d’hétérozygotie SNP array Technologie Agilent : Action d’enzymes de restriction reconnaissant des motifs comprenant le SNP ➔ en fonction du génotype il y a cassure ou non cassure PUIS : marquage, lavage et hybridation identique à la technique de CGH Agilent Avantage : permet de faire CGH et SNP sur une même puce SNP array Technologie Agilent : Résultats SNP array SNP array SNP array Apport de la SNP-array En constitutionnel : détection des isodisomies uniparentales MAIS peu de régions concernées En acquis : Intérêt physiopathologique + pronostic + possible détection de mutations de cibles. La Cytogénétique Du caryotype à l’ACPA Confirmation par une seconde technique Sélection d’une sonde de FISH 1. Confirmation de l’anomalie 2. Etude parentale pour interprétation et conseil génétique 3. Etude de la mécanique chromosomique pour conseil génétique La Cytogénétique Du caryotype à l’ACPA Limite principale : le niveau de résolution : 5-10 Mb Niveau de résolution théorique : 30-50 kb 100x plus sensible que le caryotype La Cytogénétique Histoire de la cytogénétique 1882 1882 Flemming: découverte des chromosomes Zellsubstanz, Kern und Zelltheilung, W. Flemming, 1882 1956 1956 Premiers caryotypes Tijo et Levan: 46 chr chez l’homme 1959 Lejeune, Gautier et Turpin: Trisomie 21 Lejeune, Gautier et Turpin, Annales de Génétique, 1959 1980 1970 Marquage en bandes 1980 Techniques de FISH 2000 1997 ACPA 1998 Applications en diagnostic 2010 Première intention La Cytogénétique L’ACPA: une révolution diagnostique 1882 1882 Flemming: découverte des chromosomes 1956 1956 Premiers caryotypes Tijo et Levan: 46 chr chez l’homme 1959 Lejeune, Gautier et Turpin: Trisomie 21 Un chromosome 50 Mb 1980 1970 Marquage en bandes 1980 Techniques de FISH 2000 1997 ACPA 1998 Applications en diagnostic 2010 Première intention Une bande Un gène 5-10 Mb 30-50 kb 2x plus de diagnostics faits Pathologie Constitutionnelle = Présente dès la naissance : DI Malformations Epilepsie … Pathologie Acquise Tumeurs : Diagnostique Pronostic Théranostique … Introduction Génétique constitutionnelle Patient venant de lui-même ou adressé par un confrère pour: ❖ Syndrome polymalformatif, déficience intellectuelle (enfants) - - But: établir un diagnostic (dysmorphologie++, recherche d’anomalies viscérales: écho abdo, écho cœur, examen ophtalmo,…) avec l’aide des outils de cytogénétiques et de biologie moléculaire organiser la prise en charge conseil génétique ❖ Pathologie de l’adulte: maladies à révélation tardive, présymptomatique, absence de diagnostic antérieur, … ❖ ATCD dans la famille: conseil génétique (risque de récurrence chez les apparentés) ❖ Diagnostic prénatal La Cytogénétique Les indications de l’ACPA Nombreuses : détecter avec un haut niveau de résolution des déséquilibres génomiques (perte ou gain de matériel chromosomique) Pathologie acquise Pathologie constitutionnelle (pré et post natal) Syndrome malformatif Déficience intellectuelle Troubles envahissants du développement Caractériser des anomalies vues sur le caryotype … Introduction Causes des déficiences intellectuelles (D.I.) Plus de 60% des causes identifiables sont génétiques Neuroscience and Biobehavioral Reviews, 2014 La Cytogénétique L’ACPA Détecte Variations du nombre de copie : CNV Perte (délétion) ou gain (duplication, triplication) Ne préjuge pas de la structure du chromosome La SNP array détecte les pertes d’hétérozygotie Ne détecte pas : Réarrangements équilibrés Mosaïques ( < 20%) Triploïdies Anomalies moléculaires (mutation génique) … La Cytogénétique L’ACPA en première intention Etude de Hochstenbach et al, EJMG 2009 36 325 patients ACPA en 1° 0,78 % « anomalies » non détectées 0,48 % familiales 0,23 % de novo Si ACPA en 1° intention Prévenir le clinicien et les parents de cette limite Ne pas faire un caryotype (coût) … La Cytogénétique Interprétation des résultats de l’ACPA ❖ Les variants identifiés en ACPA (CNV) sont classés en: - Variants pathogènes / probablement pathogènes - Polymorphismes / polymorphismes probables - Variants de signification indéterminée - Prédisposition ou variants à pénétrance incomplète ❖ Variants pathogènes le plus souvent de novo, récurrents ou uniques ❖ ACPA: détection de variants pathogènes dans 14-18% des cas testés (D.I. / malformations congénitales) ❖ A Lyon, en 2013: 10,6% de variants pathogènes identifiés dans des cas de D.I. / Troubles des apprentissages isolés dont 50 % de novo ❖ Prédispositions aux troubles neuro-développementaux (D.I., troubles du spectre autistique, troubles spécifiques des apprentissages, épilepsie) récurrents La Cytogénétique Les polymorphismes: CNP Nous sommes tous porteurs de délétions ou duplications ! Première carte du génome décrivant les microdélétions et microduplications obtenue grâce à l’étude de 270 individus normaux de 4 populations différentes La Cytogénétique Les polymorphismes: CNP 1.447 CNVs couvrant 12% du génome (360 Mb) CNP (copy number polymorphism) : CNV ayant une fréquence > 1 % La Cytogénétique Polymorphisme ou pathogène?? ❖ Cf bases de données et littérature ❖ Si CNV jamais décrit ni comme un CNP ni comme pathogène, schématiquement: ❖ Plus le CNV est de grande taille, plus la probabilité qu’il soit pathogène est grande ❖ Ségrégation familiale +++ ❖ Del > Dup ❖ Gènes dans la région? ❖ Le plus souvent, CNV classable ❖ Sinon: VOUS ❖En pathologie acquise ❖anomalies de très grande taille La Cytogénétique Quelques exemples Pathologie constitutionnelle : - Syndrome clinique reconnaissable = diagnostique - Identification diagnostique - Description de nouveaux syndromes - Description de nouveaux gènes Pathologie acquise : - Classification pronostique = conséquences thérapeutiques - Distinction primitif vs métastases. La Cytogénétique Nouveaux syndromes microdélétionnels Délétion 17q21.3 ❖1 % des retards mentaux ? ❖ Clinique – – – – – Hypotonie sévère Retard psychomoteur Dysmorphie faciale Convulsions Difficultés d’alimentations La Cytogénétique Corrélations génotype-phénotype Délétion 3p25 • 1ère description en 1978 : del(3)(p25) • Hypothèse d’un point de cassure récurrent écartée aux débuts de la cytogénétique moléculaire • srGAP3 = principal gène candidat de DI car : – Exprimé dans le cerveau, nécessaire au développement axonal – Modèle murin srgap3 -/- : activité synaptique anormale, troubles du comportement – 1 cas de patient DI porteur d’une t(X;3) avec point de cassure dans srGAP3 Mutation perte de fonction découverte chez un patient DI héritée d’un parent sain et présente chez plusieurs autres MAIS membres sains de la famille (Hamdan et al. 2009) 59 Implication de SETD5 dans la déficience intellectuelle dans le syndrome de délétion 3p25 Eté 2014 Un seul gène est concerné par l’ensemble des délétions : SETD5 60 Gène SETD5 9 cas de mutations (distinctes) pertes de fonction identifiées en NGS dans deux cohortes distinctes de patients DI (0,7%) Comparaison de profils : primitif ou métastases ? Rein gauche Rein droit ➔ Profils génomiques distincts = deux primitifs Activité d’ACPA en pathologie acquise à Lyon Mise en routine en septembre 2014 - Mélanomes uvéaux : classification pronostique - Tumeurs cérébrales : - Glioblastome : confirmation diagnostique - Médulloblastome : classification pronostique - Astrocytome pilocytique : recherche de mutations - Tumeurs du rein : apport diagnostique L’ACPA ne détecte pas les mutations - Tumeurs pulmonaires : distinction primitifs vs métastases en cas de tumeurs bifocales - Tumeurs gynécologiques : intérêt diagnostique - Tumeurs dermatologiques : aide à la distinction bénin / malin Analyse globale: - 55 prélèvements reçus •Indications Hémopathies; 3 Mélanomes cutanés; 4 1 T. Rein Hémopathies T. Ovaire 4% 4% 5% T. Ovaire; 2 T. Rein; 2 Mélanomes uvéaux, 19 Mélanomes cutanés 7% Mélanomes uvéaux 35% T. cérébrales; 8 T. cérébrales 14% T. utérus; 17 3 T. Utérus 31% 2 Nb % Analyse globale: -Résultats pré-analytiques Echecs d’extraction MU 19 T. Utérus 17 T. SNC 8 T. peau 4 Hémopathies 3 Autres 4 Total 5 (26%)* / / / / / 5/55 (9%) Analyse réalisable : 91% *dont 1 ponction blanche Analyse globale: -Résultats analytiques (évalués sur 46 prélèvements analysés en a-CGH [hors reins et ovaires]) ➢ Qualité technique basée sur l’analyse des dlrs dlrs < 0,3 MU 14 T. Utérus 17 T. SNC 8 T. Cutanées 4 Hémopathies 3 Total 5 (36%) 2 (12%) 8 (100%) 1 (25%) 3 (100%) 19/ 46 (41%) 5 (36%) 7 (41%) 0 2 (50%) / 14/46 (31%) 4 (89%) 8 (47%) 0 1 (25%) / 13/46 (28%) 100 % 75 % 100 % 72% Résultats de bonne qualité 0,3 <dlrs < 0,5 Résultats acceptables dlrs > 0,5 Résultats sous réserve 1E dlrs bonnes/acceptables 72% 53 % Analyse de qualité correcte : 72 % MELANOMES DE L’UVEE Profils et pronostic - Curie (338 pts) HCL (13 pts) Risque faible 27% 3 (23%) Risque intermédiaire 26% 4 (31%) Risque élevé 47% 6 (46%) N= 338 pts low risk: chrom. 3 et 8q normaux intermédiate risk: -3/8N ou 3N/gain 8q High risk: -3 et gain 8q Série lyonnaise encore petite mais les résultats sont en adéquation avec ceux d’un laboratoire de référence. D ’après Cassoux N, 2014 Conclusions Révolution technologique • Pas de nécessité de culture cellulaire = éviter les biais + gain de temps • Résolution analytique améliorée = contenu génique = progrès dans les connaissances • Technique automatisable = reproductibilité + débit • Coût • Expérience JB Rivière, CHU de Dijon Prendre en charge, à l’horizon 2020, environ 235 000 séquençage de génomes par an correspondant à : - 20 000 patients atteints de maladies rares et leurs familles (environ 60 000 génomes) - 50 000 patients prioritaires car atteints de cancers métastatiques/réfractaires au traitement (environ 175 000). Au-delà de 2020, une montée en puissance du dispositif est prévue avec la prise en considération de maladies communes.
