des biofilms
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Cours de Microbiologie Générale LV342 Cours 4 Microorganismes agents de maladies chez l’homme Catherine Esnault, Maître de Conférences Université Pierre et Marie Curie (Paris 6) UFR 927 Sciences de la Vie Licence de Sciences et Technologie Mention Sciences de la Vie L3 LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 1 Relations avec un hôte ou d'autres organismes définitions Saprophytisme : microorganisme se développant dans l'environnement aux dépends de la matière organique morte. Exemple : champignons. • Commensalisme : microorganisme se développant sur un hôte sans le gêner et en l'aidant indirectement. Par exemple, les bactéries de la peau et des muqueuses. • Symbiotisme : association étroite de deux ou plusieurs organismes dissemblables. On parle d'endosymbiose lorsqu'un microorganisme se trouve à l'intérieur de son partenaire. Exemple : lichen, symbiose algue-champignon • Mutualisme : association de deux ou plusieurs organismes, dans laquelle tous les membres sont avantagés par bénéfice réciproque. C'est un symbiotisme au sens large, chaque membre pouvant aussi être autonome. Exemple : rhizobium-légumineuse LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 2 Définitions (suite) • Syntrophisme (du grec "se nourrir mutuellement") ou cross feeding : association de deux microorganismes, qui coopèrent pour une activité métabolique globale bien précise sans que leur dépendance mutuelle ne puisse être remplacée par une simple addition de substrat ou de nutriment. C'est un cas particulier du symbiotisme. Exemple : le rumen • Parasitisme : microorganisme profitant de l'association aux dépends de l'hôte. Les microorganismes pathogènes ainsi que l'ensemble des virus sont des parasites, même si en médecine ce terme est plutôt réservé aux microorganismes eucaryotes. La parasitologie est l’étude des maladies provoquée par les parasites eucaryotes. Exemple : la maladie du sommeil provoquée par Trypanosome • Opportunisme : microorganisme commensal profitant d'une faiblesse de l'hôte pour devenir pathogène. Exemple : E. Coli intestinal devient pathogène dans les voies urinaires. Cette situation est un bon exemple indiquant qu'il n'y a pas de frontières strictes entre les catégories définies ci-dessus : Symbiotisme Mutualisme Commensalisme Parasitisme LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 3 Localisation des microorganismes • • • • • Peau Voies respiratoires supérieures Poumons Les voies digestives Le tractus urogénital • Infection : multiplication d’un microorganisme pathogène dans un organe • Maladie : infection qui produit des symptômes • Exemple d’infection aiguë la diphtérie, par contre la tuberculose est une infection chronique (fatale), la peste pulmonaire une infection fulgurante. Il peut exister des infections sans maladie, inapparente (gonorrhée) ou la typhoïde (porteur sain). LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 4 •Chez un individu immuno-déprimé on observe des infections dites opportunistes (flore naturelle non pathogène) ex sidéens. •On appelle virulence la capacité d’un microbe à réaliser une infection. • On appelle facteur de virulence un produit qui contribue à l’infection de l’hôte. •Remarque pour certaines maladies comme la tuberculose c’est la réponse immunitaire qui est responsable de la maladie (voir endotoxine) en effet ce sont les cytokines (médiateurs) libérés par les cellules lymphoïdes qui sont responsables des dommages chez l’hôte . LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 5 Les étapes de l’infection • Adhésion à une surface (suite par exemple à une blessure • Adhésion généralement spécifique (Neisseria.gonnorrhœa) • Les facteurs d’adhésion:capsule, fimbriæ, pilus, flagelles • Invasion: lymphe et sang LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 6 Facteurs de virulence (1) contribuent à la colonisation et l’invasion de l’hôte Colonisation: apports nutritionnels de l’hôte causent des dommages à l’hôte Toxicité et pouvoir d’envahissement Toxicité: Clostridium tetani, Corynebacterium diphteriæ Envahissement: Streptococcus pneumoniæ Mesure de la virulence: LD5O – Nombre de bactéries entraînant la mort de 50 % des animaux Exemple: Streptococcus pneumoniae (S5O) et Salmonella enterica (S5OOO) LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 7 Les facteurs de virulence (2) • • Contrôle de l’invasion: caillot – Lyse: streptokinase – Production: coagulase Les toxines – Exotoxines:hémolysine, toxine diphtérique, botulinique, tétanique. – Entérotoxine: V.choleræ • Autres cas: E.coli, S.enterica – Endotoxines : Dérivées du LPS des gram- , Lipide A, « core » polysaccharide, O-polysaccharide – Superantigènes: • stimulation massive des lymphocytes (Staphylococcus aureus) LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 8 Modification de cytosquelette et secrétion de type III LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 9 Modification de l’actine EPEC :Enthero Pathogenic E Coli, Shigella. Par le SS de type III, EPEC injecte les protéines Tir, il y a recrutement des protéines cellulaires WASP et Arp2/3 dans la cellule et il se forme un piédestal qui va permettre le contact avec les adhésines bactériennes, les protéines « intimin ». Nature, 2000, Donnenberg MS Ce piédestal est un récepteur pour la bactérie Shigella qui va ainsi s’internaliser. Une fois internalisée, elle dépolymérise l’actine et provoque l’effondrement de la structure des microvillosités de la brosse et la polymérise en nouvelles structures (comète d’actine) qui vont permettre le passage de cellule en cellule (processus d’invasion). Ces modifications de l’actine contribuent ainsi à la phagocytose des bactéries par des cellules qui n’ont pas naturellement cette propriété. L’entrée dans les cellules fait que les bactéries échappent au système immunitaire. LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 10 Acquisition du fer Enterobactin is a 669-Da catecholate that is synthesized by Escherichia coli and Salmonella typhumuriun, but is used by all known enterobacteria LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 11 Survivre à la phagocytose LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 12 Camouflage de Mycobacterium tuberculosis LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 13 Echapper aux anticorps LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 14 Endotoxine : le LPS LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 15 Ilots de pathogénicité:structure générale • • • • V1-V4: gènes de virulence DR: séquences répétées « directes » Int: gène de mobilité IS: séquence d’insertion entière (Isc) ou défective (Isd) LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 16 Phages et virulence • Phages tempérés et conversion lysogénique • Transferts horizontaux • Toxine botulinique (Clostridium botulinum) – Souche pathogènes et non pathogènes • Toxine diphtérique: (Corynebacterium diphteriæ) phage et gène tox. • Toxine cholérique: (Vibrio choleræ) phage CTX • Shiga toxine: (Shigella) – Phage et traitement antibiotique. – Transfert à E.coli (STEC) LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 17 Maladies et biofilms : Définitions Matrice* ou Slime (Staphylococcus epidermidis) Forme planctonique Surface non-biologique (abiotique) biologique (biotique) Forme attachée (« sessile ») * La matrice comprend un ou plusieurs exopolysaccharides (glycocalyx), des protéines, des acides nucléiques, des éléments minéraux, métalliques etc. Elle enchâsse les bactéries LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 18 Les biofilms sont universels - toutes les surfaces sont colonisables (lentilles de contact, émail dentaire, pipelines, conduites d’eau potable, roches immergées, implants médicaux) - le support peut être une source de nutriments (cellulose du papier, chitine) - certains matériaux retardent l’adhésion, aucun ne l ’empêche totalement - aucune espèce bactérienne connue n’existe que sous forme planctonique - les bactéries cultivées sur support solide ne forment par toujours un biofilm (Ex : culture sur milieu gélosé) LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 19 Biofilm microscopie électronique à balayage Biofilm sur support métallique (conduite d ’eau) Donlan and Costerton (2002) Clin Microbiol Rev, 15, 2:167-193 LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 20 Biofilm microscopie confocale Vue transversale d ’un biofilm Donlan and Costerton (2002) Clin Microbiol Rev, 15, 2:167-193 LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 21 Biofilm modèle structural actuel Cellules vivantes : 15% vol.tot. Matrice : 85% vol.tot Zones de dispersion « champignons » Flux hydriques « tours » canaux support Donlan and Costerton (2002) Clin Microbiol Rev, 15, 2:167-193 LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 22 Genèse des biofilms Cellules planctoniques 1µm Cellules attachées Microcolonie 2µm Biofilm 2µm 20µm 10µm LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 23 Génétique des biofilms • L ’activité biologique des formes attachées et des formes planctoniques est différente (ex: production métabolites différents, taux division altéré etc.) • Les protéines sont produites à des niveau différents et/ou sont différentes (ex: disparition des protéines flagellaires) • Le profil transcriptionnel des gènes est différent Méthodes d ’étude... • Analyse différentielle des transcriptomes • Analyse différentielle des protéomes • Analyse fonctionnelle : recherche des gènes par mutagenèse LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 24 Apport de la protéomique Analyse d’un biofilm à L.monocytogenes Milieu liquide Biofilm Gels 2D Coloration argentique Identification des protéines par MALDI-TOF-MS et séquençage N-terminal LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 25 Apport de la mutagénèse bactéries Phage+insertTn10 (KanR) Isolement sur milieu sélectif (Kan) Inoculation des clones en plaque (polystyrène) 96 puits Réplique Lavages et coloration (cristal violet) Identification des mutants non-adhérents Identification des gènes mutés LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 26 Rôle(s) protecteur(s) des biofilms - contre les antibiotiques et d’autres agents antibactériens (acide hypochloreux, détergents comme le SDS, U.V.) - contre les variations brusques de l’environnement (pH…) - contre la dessiccation - contre les bactériophages (?) - contre certaines amibes - contre la réponse anticorps et cellules phagocytaires LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 27 Les biofilms sont des communautés mono- ou polymicrobiennes - Les biofilms peuvent être mono- ou polyspécifiques - Les inter-relations entre les bactéries dans les biofilms sont complexes - compétition trophique - intoxication - coopération trophique - coopération dans les phases d’adhésion - échanges d’informations LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 28 Biofilm et plaque dentaire (1) • Le support bactérien. – Les glycoprotéines salivaires • Colonisation; les espèces « pionnières » – Streptococcus mutans et S.sanguis – Synthèse de dextrane fortement adhésif à partir de sucrose par la dextrane sucrase. • Evolution du biofilm; les nouvelles espèces colonisant le biofilm – Fusobacterium, Borelia puis Actinomyces LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 29 Biofilm et plaque dentaire (2) S.mutans: microscope à balayage développement du biofilm avec (au dessus) ou sans brossage (au dessous). Développement de la plaque dentaire sans lavage des dents à J1 et J10 LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 30 Étapes schématisées de la pathogénie du choléra Voir poly de cours LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 31 Bordure en brosse de la muqueuse intestinale LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 32 Action de la toxine cholérique LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 33 Îlot de pathogénicité de la toxine cholérique LV342 cours 4 Catherine Esnault 2012 34
