TP L3 microbiologie 2013-2014 - umtice

Université du Maine
2013-2014
Travaux pratiques - Microbiologie
Avant-propos : règles de travail en laboratoire de microbiologie
Au cours des séances de travaux pratiques, vous serez amenés à manipuler de nombreux microorganismes. Certaines espèces peuvent être pathogènes. L’infection est un risque biologique potentiel (pour
soi, comme pour les personnes de son entourage) qui s’additionne aux autres risques inhérents aux activités
de laboratoire. Les consignes suivantes doivent donc être impérativement respectées pour éliminer
tous risques de contamination.
- Attacher des cheveux longs; porter une blouse (elle doit être enlevée avant de sortir).
- Ne pas fumer, ni manger, ni boire pendant les séances.
- Se laver les mains avant et après chaque séance de laboratoire.
- Nettoyer la surface de travail (alcool 70%, puis eau de Javel diluée) avant et après chaque séance.
- Eviter de parler ou de se déplacer inutilement lorsque des ensemencements sont faits.
- Organiser et disposer le matériel de telle sorte que rien ne soit renversé.
- Toujours manipuler les micro-organismes près de la flamme.
- Ne déposer les instruments sur la table qu’après les avoir stérilisés (anse, verrerie : par flambage;
pipette : par trempage dans l’alcool ou l’eau de Javel).
- Désinfecter immédiatement toute zone où a été renversé un liquide contaminé.
Pour les 4 séances de TP, apporter :
- des petites étiquettes à coller sur les tubes
- du scotch pour mettre sur les étiquettes (pour qu’elles ne partent pas lors de l’autoclavage)
- des feutres résistants à l’eau ou crayon de papier
- une blouse et quoi s'attacher les cheveux
- les calculs sont faits AVANT la séance de TP (pour la séance I) et APRES pour les autres
séances
Pour chaque tube ou boite ensemencé(e), sur l’étiquette il sera écrit :
- vos initiales
- votre groupe de TP
- quelle est la condition testée (ex : NaCL 2,5 %)
- un code pour la souche bactérienne
A la fin de certaines séances les étiquettes seront à enlever entièrement des tubes (eau chaude et
grattoir), de l'eau de javel devra être rajouté (~1 mL) dans les tubes, qui seront vidés à l'évier et
rincés, après 5 min d'incubation avec la javel.
Analyse bactériologique d’un prélèvement tellurique
Les micro-organismes sont omniprésents. En milieu naturel, ils ont pour origine le sol, l’eau, les
poussières et aérosols, les végétaux, les animaux (essentiellement au niveau de la peau, du tube digestif,
des voies respiratoires). L’objectif de ces manipulations est d’isoler et de déterminer certaines des
caractéristiques physiologiques et biochimiques de souches bactériennes présentes dans un échantillon de
terre. Cet échantillon se trouve dans un tube stérile de 50 mL (un tube fourni par binôme) afin d’éviter toute
contamination. Le tube ne doit être ouvert qu’au moment du prélèvement et sera maintenu fermé jusqu’aux
manipulations.
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Poste de Microbiologie
Zone stérile délimitée par un bec Bunsen
Consignes de sécurité : Exemplaire étudiant
Ne jamais travailler avec des gants en présence de la flamme
Nettoyage de la paillasse :
Désinfecter la paillasse avec de l’eau de javel : LUNETTES
Nettoyage des mains
Lavage des mains avec du savon, puis friction avec de l’alcool à 70 %
Allumage du bec Bunsen
Préparer la zone de manipulation et le matériel
Demander l’autorisation de l’encadrant
Ecarter la pissette d’alcool ou tout matériau inflammable (ex : polycopiés)
Allumer le bec Bunsen en position flamme éclairante (virole fermée = flamme jaune) ou en
position veilleuse
Manipulation en zone stérile
La zone stérile se situe dans un rayon de 20 cm autour
du bec Bunsen en position flamme chauffante
(virole ouverte = flamme bleue)
Manipuler assis !!!
Fin de manipulation
Mettre toute pipette contaminée dans le bocal eau de Javel
Eteindre le bec Bunsen
Javelliser les tubes de culture à évacuer
Enlever les étiquettes (voir plus haut)
Ranger et javelliser la paillasse
Se laver les mains avant de sortir de la salle
Zone stérile
Conduite à tenir en cas de coupure avec du matériel souillé :
Avertir l’encadrant
Laver à l’eau et au savon puis désinfecter avec de l’alcool à 70 %
Conduite à tenir en cas de projection de liquide contaminé :
Avertir l’encadrant
Laver abondamment au savon et à l’eau
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Préparation de l’analyse bactériologique : séance I
I - Extraction et mise en culture des bactéries présentes dans l’échantillon
1. Détermination de la teneur en eau
Cette étape est indispensable pour déterminer la teneur en micro-organismes par
gramme de terre sèche afin de pouvoir comparer les résultats entre les échantillons.
- Déterminer précisément le poids d’un poudrier (ou du matériel équivalent). M1=___
- Peser 5 g de terre et placer cet aliquote dans le poudrier.
- Déterminer précisément la masse du poudrier + terre. M2=___
- Placer l’ensemble dans une étuve à 100 °C pendant au moins 24 h.
- Déterminer la masse du poudrier + terre après ce délai. M3=___ (séance suivante)
- Estimer la teneur en eau et le poids sec de la terre (en gramme et en %) (Séance
suivante)
2. Extraction de la flore microbiologique
Cette étape permet de récupérer l’ensemble de la flore microbiologique sans
contrainte sélective. Elle est réalisée dans une solution d’eau physiologique qui constitue
un milieu isotonique empêchant la lyse des cellules en maintenant une valeur de pression
extracellulaire proche de celle de la pression intracellulaire.
- Peser 5 g de terre.
- Placer cet échantillon dans le tube contenant 30 mL de solution d’extraction A
(eau physiologique stérile)
sous la flamme
- Homogénéiser vigoureusement.
- Ajuster le « volume contenant la terre » à 50 mL avec la solution stérile
d’extraction B
sous la flamme
3. Dilutions et étalements
Sous la flamme
La suspension de micro-organismes est diluée en cascade de 10-1 à 10-6. Le
transfert de 1 mL de la suspension initiale dans le 1er tube contenant 9 mL de solution de
dilution constitue la dilution 10-1. Répéter jusqu’à obtenir la dilution 10-6.
- Homogénéiser entre chaque dilution.
- Etaler 0,1 mL de chaque dilution (en commençant par la dilution la plus élevée) sur
une boîte de Gélose nutritive fournie (identifier les boîtes par vos initiales et le
N° de groupe sur le fond).
- Bien rincer la pipette avant et après chaque prélèvement (dans le tube inoculé).
- Placer les boîtes à incuber à l’envers à 20 °C pendant 24 h.
- Placer le tube de 50 mL contenant l’échantillon de terre + solution physiologique à
4 °C.
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-Après les étalements, mettre un peu d’eau de javel dans les tubes ayant servis à la
dilution en cascade pour tuer les bactéries. Attendre quelques minutes et les vider
dans le bécher prévu à cet effet (« poubelle liquide »). Enlever les étiquettes ou
les inscriptions et mettre les tubes dans la bassine prévue à cet effet.
* L’étalement consiste à répartir de façon homogène l’échantillon (0,1 mL) sur la BP,
à l’aide d’un « râteau » stérile du moins concentré au plus concentré. A ne pas confondre
avec un ensemencement (transfert de bactéries sur un milieu axénique, qui ne contient
pas de micro-organisme), qui peut se faire, entre autre, par pipetage (III-1, III-2, III-3a), par
piqûre (III-3b), ou encore par la méthode des stries (III-3c).
II - Préparation des milieux
Cette étape permet de préparer les milieux liquides qui seront utilisés au cours de
ces travaux pratiques. Les compositions des milieux sont indiquées en annexe. Une fois
les mélanges réalisés et « aliquotés », ils seront stérilisés par autoclavage.
Penser à l’échantillon témoin en spectrophotométrie lors de l'estimation du
volume de BN à préparer.
- Estimer le volume de BN pour préparer les tubes (20 tubes : 2 ensemencements
multipliés par 4 températures, 5 concentrations NaCl, et 1 témoin). Rajouter deux
tubes pour le cas où vous vous tromperiez.
- Calculer les masses et les volumes nécessaires pour la suite des manipulations
(par exemple NaCl).
- Noter sur chaque tube et boîte vos initiales et n° de groupe et le milieu.
- Préparer les milieux selon les protocoles donnés en annexe.
Ces milieux seront stérilisés et utilisés lors des séances suivantes.
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Analyse bactériologique de l’échantillon : séance II
I - Extraction et mise en culture des bactéries présentes dans l’échantillon (fin)
Peser les boites de terre sèche : masse M3 = _____
Estimer la teneur en eau et le poids sec de la terre (en gramme et en %)
1. Estimation de la teneur bactérienne
En partant du principe que chaque colonie isolée provient d’une seule cellule,
dénombrer les colonies contenues dans une boîte de Pétri. Les calculs seront effectués
à partir du nombre de colonies isolées comptabilisées sur les boîtes. Ces calculs devront
tenir compte des facteurs de dilution et des volumes étalés.
- A partir des boîtes obtenues avec les dilutions (séance I), estimer la teneur de
micro-organismes en Unités Formant Colonies/g de terre sèche.
2. Mise en culture de colonies isolées
L’isolement des colonies pour le dénombrement permet de travailler sur des souches
spécifiques de micro-organismes en vue d’identifier certaines de leurs caractéristiques
physiologiques et biochimiques. Pour cela il est nécessaire de partir de souches pures
mises en culture sur un milieu liquide non sélectif (le bouillon nutritif BN).
- Choisir 2 colonies isolées, d’aspect différent, obtenues sur boîtes.
- Décrire ces colonies : grandes, petites, lisses, rugueuses…..
sous la
- Les mettre en culture dans 3 mL de BN = Solution d’ensemencement
flamme, prélever sans gélose 2 à 3 colonies (suivant leur taille) et les mettre
dans les 3 mL de BN. Mélanger.
II - Techniques de coloration
L’observation des micro-organismes se fait grâce à la microscopie, le plus souvent
à l’aide de diverses techniques de coloration. Les colorants servent à mettre en évidence
la forme des cellules ou certaines de leurs caractéristiques, et apportent parfois une
information sur la composition de leur paroi. Les deux colorations proposées (coloration
de Gram, coloration de spores) se font sur des bactéries tuées, après préparation d’un
frottis.
1. Préparation d’un frottis bactérien
Les différentes étapes de la réalisation d’un frottis sont l’étalement d’un
prélèvement bactérien sur une lame, le séchage, la fixation. Déposer sur une lame une
petite goutte d’eau. Sous la flamme bleue, prélever, à l’aide d’une anse à ensemencer,
une colonie à étudier et l’écraser dans la goutte d’eau. Laisser sécher à l’air avant de fixer
la préparation à la chaleur en passant la lame 3 fois sur la flamme éclairante (cellules vers
le haut). Le passage doit être rapide (1 s pour l’ensemble de la lame), et effectué d’un
mouvement continu (la lame chauffée doit pouvoir être tenue dans la main sans
ressentir de douleur).
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2. Coloration de Gram
METTRE DES GANTS
La coloration de Gram est une coloration différentielle. Elle permet de diviser les
bactéries en deux groupes selon la composition de leur paroi. Les bactéries dont la paroi
retient le colorant primaire (cristal violet) après lavage à l’alcool, sont dites Gram
positives (Gram+); elles apparaissent violet ou bleu foncé. Celles qui sont décolorées
par le passage dans l’alcool sont dites Gram négatives (Gram-). Pour mieux observer ces
dernières, on utilise un second colorant (safranine) qui les colore en rose. Il est
préférable d’utiliser des cultures jeunes (en phase exponentielle de croissance), certaines
espèces Gram+, notamment des Bacillaceae, ayant un comportement de Gram- en
vieillissant (l’inverse ne se produisant pas).
Matériel :
- Culture de l’échantillon de sol sur boites
- Kit de coloration de Gram (Difco 212539)
Procédure :
METTRE DES GANTS
- Plonger la lame dans la solution de cristal violet pendant 1 min.
- Jeter le colorant dans le bac à cet effet et rincer délicatement à l’eau dans le bac.
- Plonger la lame dans la solution d’iode (agent mordant) pendant 1 min.
- Jeter le colorant dans le bac à cet effet et rincer délicatement à l’eau dans le bac.
- Décolorer avec le mélange alcool-acétone pendant 10 sec.
- Rincer délicatement à l’eau dans le bac.
- Plonger la lame dans la safranine pendant 1 min.
- Jeter le colorant dans le bac à cet effet et rincer délicatement à l’eau dans le bac.
- Sécher le dessous de la lame et le tour du frottis (papier essuie-tout, papier buvard,
air). Le frottis peut être repassé à la flamme.
Observer la lame à l’objectif 100 X à immersion. (Attention, commencer par faire
la mise au point sur les petits grossissements, tourner les objectifs toujours dans le même
sens pour ne pas les salir avec l’huile à immersion)
III - Effets de facteurs environnementaux sur la croissance bactérienne
Les principaux facteurs de l’environnement qui interviennent sur la croissance
bactérienne sont la quantité de nutriments, la présence de substances toxiques, l’humidité,
la température, le pH, la pression osmotique, la composition de l’atmosphère (notamment
présence ou absence de dioxygène). Seuls les facteurs suivants seront étudiés :
température, pression osmotique.
1. Ensemencement : milieux tests « températures »
2. Ensemencement : milieux test « osmose »
1. Ensemencement des milieux et variation des facteurs environnementaux
a. Effet de la température
Quatre températures seront testées afin d’estimer la température optimale de
croissance pour les 2 souches isolées à partir du mélange microbiologique initial. Les
cultures seront toutes réalisées dans un milieu non sélectif identique afin que la
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température constitue le seul facteur variable et potentiellement limitant de la croissance
des micro-organismes.
Pour chaque culture obtenue à partir d’une colonie isolée, prendre 4 tubes
contenant 3 mL de milieu BN préalablement préparé (séance I, manip II).
Sous la
flamme.
Pour chaque ensemencement (réalisé plutôt), prélever 100 µL de chacune des
cultures de souches pures et déposer l’aliquote dans un tube de culture. Chaque souche
sera mise en culture dans une enceinte pendant une nuit aux températures suivantes : 4
°C, 20 °C, 30 °C et 50 °C.
b. Effet de la pression osmotique
Pour chaque culture obtenue à partir d’une colonie isolée (séance II), prendre les
tubes contenant 3 mL de milieu BN avec une gamme complète de concentrations en
NaCl (soit : 0%, 2,5%, 5%, 7,5% et 10% de NaCl, préparés lors de la séance I).
Sous
la flamme.
Prélever 100 µL de chacune des cultures de souche pure (solution
d’ensemencement), et déposer l’aliquote dans un tube de culture. Chaque tube sera ainsi
mis en culture pendant une nuit dans une enceinte à 20°C.
Analyse bactériologique de l’échantillon : séance III
I - Effets de facteurs environnementaux sur la croissance bactérienne (suite)
2. Evaluation de la croissance bactérienne et analyse de l’influence de facteurs
physiques
Le Zéro sera systématiquement fait le BN non ensemencé (Mesure d'Abs : pour
NaCl de concentration la plus faible à la plus haute). Rincer entre deux souches
ou utiliser deux cuves.
La DO est à une longueur d’onde de 550 nm.
a. Estimation de la température optimale de croissance
La température optimale de croissance parmi les 4 testées sera déterminée par
mesure de la densité optique à une longueur d’ondes de 550 nm (DO550). Pour que
les valeurs de DO puissent être comparées, elles doivent être inférieures à 1,5. Des
dilutions seront peut-être nécessaires pour certaines cultures. Elles seront effectuées
après une première estimation de la DO550 et réalisées dans du milieu BN (prévoir un 10
mL de milieu supplémentaire pour cette étape).
- Faire le « zéro » à partir de milieu BN non ensemencé.
- Mesurer les densités optiques de chacune des cultures sans dilution.
- Réaliser les dilutions nécessaires et mesurer les DO550 des cultures diluées.
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- Tracer la courbe Concentration cellulaire = f(température) pour chacune des
souches.
b. Estimation de l’effet de la pression osmotique
La croissance sera estimée par mesure de la DO, et comparée à celle du témoin
(0 % NaCl ajouté). Tracer la courbe Concentration cellulaire = f(pression osmotique)
pour chacune des souches.
II - Détermination de caractéristiques du métabolisme bactérien
1. Préparation des échantillons
Après la phase d’isolement et la mise en culture pure, l’identification d’une souche
bactérienne repose souvent sur la mise en évidence de réactions biochimiques
particulières, caractéristiques de son métabolisme cellulaire (identité biochimique) ou de
son type respiratoire.
a. Bouillon glucosé au rouge de phénol
L’utilisation de ce milieu permet de mettre en évidence la fermentation du glucose
avec production d’acide (virage de l’indicateur coloré) ou de gaz (accumulation dans la
cloche de Durham).
Pour chaque souche de bactéries, inoculer le bouillon glucosé (soit avec 1 goutte
de culture liquide soit avec une colonie sur boite). Mettre à incuber à 20 °C pendant 24 h
à 48 h.
b. Gélose VF (viande – foie) en tube
La consistance de ce milieu est une gélose molle. Placée dans un tube fin, et
après passage à l’autoclave (dégazage assurant l’élimination des gaz dissous), l’ouverture
du bouchon permet d’obtenir un gradient de pression partielle en O2 (rééquilibrage
partiel avec l’atmosphère).
Pour chaque souche de bactéries, inoculer la gélose VF avec une anse droite
stérile (partie fine et rectiligne) par une piqûre centrale jusqu’à environ 2cm du fond. Mettre
à incuber à 20 °C pendant 24 h à 48 h.
c. Gélose sélective pour entérobactéries
Ce milieu contient un inhibiteur de la croissance des bactéries Gram+. Il permet
de mettre en évidence la présence d’entérobactéries, et leur capacité à fermenter le
lactose.
Pour chaque souche de bactéries, inoculer par la méthode des stries une des
géloses sélectives fournies. Mettre à incuber à 20 °C pendant 24 h à 48 h.
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Notes : les flèches représentent les sens des stries faites avec une anse. Entre les stries 1
et 2, il vous faut flamber cette anse puis la refroidir dans la gélose.
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ATTENTION
Après les ensemencements, mettre un peu d’eau de javel dans les tubes (dont la DO
a été lue et après l’ensemencement des boites et derniers tubes). Attendre quelques
minutes et les vider dans le bécher prévu à cet effet (« poubelle liquide »). Enlever
les étiquettes ou les inscriptions et mettre les tubes dans la bassine prévue à cet
effet.
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Analyse bactériologique de l’échantillon : séance IV
I - Détermination de caractéristiques du métabolisme bactérien (suite)
1. Détermination de caractéristiques du métabolisme bactérien (fin)
a. Bouillon glucosé au rouge de phénol
b. Gélose VF (viande – foie) en tube
c. Gélose sélective pour entérobactéries
Observer et interpréter les résultats pour les deux souches bactériennes.
d. Mise en évidence de la production de peroxydase/catalase
- Utiliser BP de séance II
- Placer une ou deux gouttes de la solution de peroxyde d’hydrogène fournie
directement sur une colonie isolée (dans la BP).
- Observer. Interpréter.
☞Remarque 1 : les molécules organiques trop grosses pour pénétrer dans la cellule sont
hydrolysées à l’extérieur de la cellule par des exoenzymes, excrétées par la bactérie. Les
produits de l’hydrolyse peuvent alors entrer dans la cellule (transport actif ou passif,
diffusion) et être assimilés. Les cellules bactériennes effectuent l’essentiel de leurs
réactions métaboliques grâce à des endoenzymes (synthèses organiques, production
d’énergie ou de déchets).
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☞Remarque 2 : la catalase fait partie des péroxydases qui sont des enzymes permettant
à la cellule de convertir le peroxyde d'hydrogène H2O2 en H2O et O2 / donneur (ex
glutathion pour la glutathion peroxydase).
Annexe
Composition des milieux (pour 1L)
* Bouillon nutritif (BN) :
- 8 g / L nutribroth (peptone de caséine, extrait de viande)
☞ Note : une peptone est un mélange (plus ou moins bien défini) d’acides aminés, de
peptides et de protéines, obtenu par protéolyse plus ou moins complète (selon les
enzymes utilisées) de divers substrats riches en protéines (soja, viande, poisson, caséine,
etc.).
Effet de la pression osmotique
Pour chaque souche isolée précédemment (séance I – 5), préparer un bouillon nutritif
avec 2,5%, 5%, 7,5% et 10% de NaCl (sur une base pondérale), plus un témoin (sans
NaCl ajouté).
Bouillon glucosé au rouge de phénol (2 tubes de 10 mL fournis par binôme)
Dans une base de bouillon nutritif (BN), ajouter (g/litre) :
- Glucose 5,0
- Rouge de phénol 0,018
☞Note 1 : le rouge de phénol est un indicateur de pH, jaune à pH acide (pH < 6,8), rouge
à pH basique (pH > 8,2).
☞Note 2 : l’addition d’un tube ou d’une cloche de Durham (en position renversée) dans le
bouillon, avant le passage à l’autoclave, permet de mettre en évidence la production de
gaz liée au métabolisme des cellules bactériennes. Cette production est prise en compte
lorsque le gaz occupe plus de 1/10ème du volume du tube de Durham.
Gélose VF (viande – foie) (2 tubes fournis par binôme)
Composition (g/litre) :
- Base viande-foie 30
- Glucose 2
- Agar 6
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Milieu sélectif pour entérobactéries (2 géloses fournies par binôme)
Composition (g/litre) :
- Peptone 10
- Lactose 10
- NaCl 5
- KH2PO4 2
- Citrate de sodium 1
- Désoxycholate de sodium 1
- Rouge neutre 0,03
- Agar 13
☞Note : le désoxycholate de sodium inhibe la croissance des bactéries Gram+. La gélose
est rouge à pH > 7, jaunâtre à pH < 7 (rouge neutre).
☞Remarque : les bactéries du genre Enterococcus peuvent se développer sur ce milieu.
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