UFR Pharmacie - DFGSP3 UE7 Travaux pratiques de bactériologie Objectif : Une souche bactérienne cultivée sur milieu gélosé et en bouillon est distribuée à chaque étudiant. Vous devez réaliser l’identification phénotypique de cette souche bactérienne en réalisant les tests proposés ci-dessous. 1 – Observation microscopique après coloration de Gram Réaliser des frottis sur une lame propre : 1) à partir de la culture en bouillon (bien remettre les bactéries en suspension avant de prélever une goutte et la déposer sur la lame) 2) à partir de la culture sur milieu gélosé (déposer préalablement une goutte d’eau distillée (ED) stérile à l’aide d’une pipette avec cône jaune puis dilacérer une colonie à l’intérieur) Laisser sécher les frottis à côté de la flamme Fixer le frottis (3 aller-retours rapides dans la flamme) Laisser refroidir puis procéder à la coloration de Gram Coloration de Gram : - Violet de Gentiane : 1 min - Lugol : 1 min - Alcool et rinçage rapide à l’eau - Fushine de Zielh diluée sur la lame : 1 min - Rinçage à l’eau Laisser sécher près de la flamme Après séchage complet, ajouter une goutte d’huile à immersion Observer la morphologie (cocci, bacilles), taille, couleur (violet si Gram positif, rose si Gram négatif) et groupements cellulaires (seulement sur la coloration réalisée à partir de la culture en bouillon et seulement pour les cocci) : diplocoques, tétrades, chaînettes, amas ou grappes de raisin… ) avec l’objectif à immersion x 100. Après observation, jeter les lames dans la poubelle de paillasse. 2 – Identification des bacilles à Gram négatif (le cas échéant) 1) Test d’orientation : recherche de la cytochrome oxydase (enzyme de la chaine respiratoire bactérienne) Imprégner un disque stérile avec une goutte de réactif et y écraser une colonie à l’aide d’un ensemenceur. Après 30 secondes : - Si apparition d’une coloration violette : la bactérie possède une cytochrome oxydase = Oxydase (+) = Non entérobactérie = Pseudomonas, Vibrio, Aeromonas, … - Si aucune coloration violette n’apparait : la bactérie ne possède pas de cytochrome oxydase = oxydase (-) = Entérobactérie. 2) Tests biochimiques d’identification : inoculation d’une galerie API (Biomérieux) Galerie API = système standardisé utilisé pour l’identification bactérienne. Si oxydase (-) : - Préparer une suspension trouble dans un tube d’ED stérile - Ensemencer une galerie API 20E - Incuber la galerie 24h à 37°C Si oxydase (+) : - Préparer une suspension trouble dans un tube de sérum physiologique (SP) - Ensemencer les tests de NO3 à PNPG d’une galerie API 20NE - Ensemencer une ampoule AUX avec 10 gouttes (200µL) de suspension préalablement préparée en sérum physiologique - Ensemencer la suite de la galerie API 20NE correspondant à l’auxanogramme (tests GLU à PAC) - Incuber la galerie 24h à 37°C Pour ensemencer la galerie : - test non souligné : remplir le tube - test souligné : remplir le tube et ajouter de l’huile de paraffine pour créer une anaérobiose - test encadré : remplir le tube et la cupule cupule tube 3) Tests métaboliques et culturaux A partir de la suspension réalisée en ED ou en SP, ensemencer : - une gélose trypticase soja (TS) : gélose non sélective - une gélose Drigalski : gélose sélective (cristal violet et sels biliaires) et différentielle : (lactose et indicateur coloré de pH, le bleu de bromothymol). Si fermentation du lactose, virage de l’indicateur coloré au jaune (acidification) colonies jaunes = lactose (+) ; colonies bleues ou vertes = lactose (-) - une gélose au cétrimide (ammonium quaternaire) - un milieu viande-foie (VF) qui permet la détermination du type respiratoire : aérobie stricte, microaérophile, aéro-anaérobie facultative, anaérobie stricte - Incuber 24h à 37°C 4) Après incubation - Pour les galeries API 20E et API 20NE : ajouter les réactifs (cf tableau de lecture), lire la galerie et interpréter à l’aide du catalogue analytique correspondant - Interpréter les milieux de culture 3 – Identification des cocci à Gram positif (le cas échéant) 1) Test d’orientation : recherche de la catalase (enzyme de la chaine respiratoire bactérienne) Sur une lame de verre, déposer : - une goutte d’H2O2 à 10 volumes (avec une pipette et un cône jaune) - une goutte de culture (bouillon) (avec une pipette et un cône jaune) - une lamelle Observer la formation de bulles d’O2 : - présence de bulles : Catalase (+) = Staphylocoques, microcoques - absence de bulles : catalase (-) = Streptocoques, entérocoques 2) Tests culturaux A partir de la culture fournie en bouillon, ensemencer : - une gélose trypticase soja (TS) - une gélose Chapman (sélectivité liée à la forte concentration en NaCl et différentielle par la présence d’un sucre (mannitol) et d’un indicateur de pH (rouge de phénol)). Virage au jaune (acidification) = fermentation du mannitol = mannitol (+) Pas de virage coloré = pas de fermentation du mannitol = mannitol (-) - un milieu viande foie (VF) qui permet la détermination du type respiratoire : aérobie stricte, microaérophile, aéro-anaérobie facultative, anaérobie stricte - une gélose au sang qui permet la culture de bactéries exigeantes, sur laquelle placer un disque de bacitracine et un disque d’optochine Incuber 24h à 37°C 3) Pour les cocci Gram (+) catalase (+) - A partir du bouillon de culture, ensemencer une gélose à ADN en stries radiales pour rechercher la désoxyribonucléase (DNase) et l’incuber à 37°C pendant 24h. - Rechercher la coagulase : - ajouter 200µL de bouillon dans 200µL de plasma de lapin - placer au bain marie à 37°C pendant 2 heures au minimum - retourner le tube pour vérifier si un coagulum s’est formé 4) Pour les cocci Gram (+) catalase (-) Ensemencer une gélose BEA (Bile – Esculine – Azide) et l’incuber 24h à 37°C 5) Après incubation Interpréter les milieux de culture : - sur gélose au sang, présence d’une hémolyse α (hémolyse partielle) ou β (hémolyse totale), inhibition autour des disques d’optochine (seul Streptococcus pneumoniae est sensible à l’optochine) et bacitracine (la grande majorité des streptocoques de groupe A est sensible à la bacitracine) - sur gélose BEA, noircissement du milieu lié à l’hydrolyse de l’esculine (entérocoques) - sur gélose à ADN, ajouter de l’HCl (1N) pour révéler la présence d’une DNase (si présence de l’enzyme, clarification autour des stries) Pour les cocci Gram(-), catalase (-) et β-hémolytiques, réaliser le test de sérogroupage de Lancefield (test d’agglutination avec des particules de latex sensibilisées avec des Ac dirigés vers les Ag de groupe). Schéma récapitulatif