Isolement et sélection des souches de bactéries lactiques
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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université d’ORAN Es Senia Faculté des Sciences Département de Biologie Mémoire de Magistère Option : Microbiologie Alimentaire et Industrielle Intitulée Isolement et sélection des souches de bactéries lactiques productrices des métabolites antibactériennes Présentée par : BELARBI Fatima Devant le jury Mr. BELKHODJA Moulay Président Professeur, Université d’Oran Es-Sénia Mr. AOUES Abdelkader Examinateur Professeur, Université d’Oran Es-Sénia Mm. CHOUGRANI Fadela Examinatrice M.C.A, Université de Mostaghanem Mr. BEKADA Ahmed Examinateur M.C.A, Université d’Oran Es-Sénia Mr. BENSOLTANE Ahmed Encadreur Professeur, Université d’Oran Es-Sénia 2010-2011 REMERCIEMENT Avant tout, je remercie Dieu le Tous Puissant de m’avoir donné la force, le courage, la santé et la patience pour pouvoir accomplir ce travail. Au terme de ce travail, mes remerciements au Prof. BENSOLTANE A. Pour la confiance que vous avez placée en moi. Ses conseils judicieux m’ont permis de mener à bien ce travail. Je tiens bien sûr à remercier Prof. BELKHODJA M. d’voir accepter de présider le jury de soutenance. Je remercie Prof. AOUES A.K., Mr BEKADA A. et Mm CHOUGRANI F. d’avoir accepté d’évaluer mon travail et de l’investissement que cela représente. Je remercie aussi tous ceux qui m’ont accompagnée pendant ces années en dehors du laboratoire et qui ont été là quand j’en avais besoin. Merci à mes parents de m’avoir permis de réaliser mon rêve. J’espère que vous êtes fiers de moi. Akila votre amitié aura été d’un soutien inestimable et j’essaierai d’être à l’avenir plus disponible… Résumé : Les bactéries lactiques font naturellement partie de notre environnement et notre alimentation. On reconnait depuis longtemps, aux bactéries lactiques la propriété de produire des substances antimicrobiennes et sont utilisées dans la fermentation et la biopréservation des aliments. La recherche de souches bactériennes lactiques productrices des substances antimicrobiennes a été entreprise à partir du lait cru de chèvre et de vache. L’isolement des bactéries lactiques à partir de lait cru de vache et de chèvre nous a permis d’obtenir 53 souches (Gram positif, catalase négatif) qui ont purifiés et conservées. L’étude des caractéristiques phénotypiques ; biochimiques et physiologiques (type fermentaire, croissance en présence de NaCl : 4% et 6,5% , croissance à pH 9,6, tests de croissance des différentes températures : 30°C et 45°C, étude de la thermorésistance, test de croissance en milieu lait de Sherman, test d’hydrolyse de l’arginine (ADH), test d’hydrolyse de l’esculine, production d’acétoїne, utilisation du citrate, production de CO2 à partir du citrate, production des exopolysaccharides et le test de résistance à la vancomycine) a permis d’identifier : 32% Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides, 53% Enterococcus ssp, 12% Lactococcus lactis subsp lactis biovar diacetylactis et 2% Lactobacillus plantarum. Les 53 souches ont été testées pour leur effet antibactérien à l’encontre de Staphylococcus aureus ATCC 25923 et Escherichia coli ATCC 25922. L’interaction de nos souches lactiques et les bactéries pathogènes a donné des résultats positifs pour toutes les souches, observés par des zones d’inhibition. Les souches du genre Leuconostoc (Ln), ont été retenues pour sa forte activité bactéricide, notamment vis-à-vis de Staphylococcus aureus et Escherichia coli. En culture mixte, les deux souches lactiques Ln10 et Ln14 diminuent considérablement la croissance de Staphylococcus aureus et Escherichia coli après quelques heures d’incubation. Mots-clés: Bactéries lactiques ; Leuconostoc ; Enterococcus ; Lactococcus ; Lactobacillus ; Interaction ; Bactériocines ; activité antibactérienne ; lait de chèvre ; lait de vache. Abstract : Lactic acid bacteria are a natural part of our environment and our food. It has long recognized, with the property of lactic acid bacteria produce antimicrobial substances and are used in fermentation and food biopreservation. The search for lactic acid bacteria strains producing antimicrobial substances has been taken from the raw goat’s milk and cow’s milk. The isolation of lactic acid bacteria from raw cow's milk and goat's allowed us to obtain 53 strains (Gram positive, catalase negative) were purified and stored. The study of phenotypic characteristics, biochemical and physiological (fermentation type, growth in the presence of 4% NaCl and 6.5%, growth at pH 9.6, the ability to grow at 30°C and 45°C, survival after heating at 60°C for 30 min, growth in Sherman test milk, hydrolysis of arginine (ADH) test, hydrolysis of esculin, production of acétoїne, citrate utilization, CO2 production from citrate, production of exopolysaccharides, testing for resistance to vancomycin) has identified 32% Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides 53% Enterococcus ssp, 12% Lactococcus lactis subsp lactis biovar diacetylactis and 2% Lactobacillus plantarum. The 53 strains were tested for their antibacterial effect against Staphylococcus aureus ATCC 25923 and Escherichia coli ATCC 25922. All our lactic acid bacteria strains showed antimicrobial activity against pathogenic bacteria, observed by zones of inhibition. The strains of the genus Leuconostoc (Ln) have been selected for its strong bactericidal activity, particularly toward Staphylococcus aureus and Escherichia coli. In mixed culture, both strains Ln10 and Ln14 significantly decrease the growth of Staphylococcus aureus and Escherichia coli after a few hours of incubation. Keywords: Lactic acid bacteria ; Leuconostoc ; Enterococcus ; Lactococcus ; Lactobacillus ; Interaction ; Bacteriocins ; antibacterial activity ; goat’s milk ; cow’s milk. الملخص : بكتزَب حبيط انالكتُك هٍ خشء ؼبُؼٍ يٍ بُئتُب وغذائُبَ ،ؼهى يُذ قذَى انشيٍ أٌ هذِ انبكتزَب نهب خبصُت إَتبج يىاد يعبدة نهًُكزوببث فهٍ تستخذو فٍ انتخًُز و حفظ األغذَت .إٌ انبحث ػٍ سالالث بكتُزَت يُتدت نهًىاد انًعبدة نهًُكزوببث قذ تى ػهً يستىي حهُب انًبػش و انبقز انخبو. ػشل بكتزَب حبيط انالكتُك يٍ حهُب انًبػش و انبقز انخبو قذ سًح نُب نهحصىل ػهً 53سالنت (يىخبت انصبغ ندزاو ، سبنبت انكبتالس ) انتٍ تى تُقُتهب وتخشَُهب. دراست انخصبئص انًظهزَت انبُىكًُُبئُت وانفُشَىنىخُت ( َىع انتخًُز ،انًُى فٍ وسػ َحتىٌ ػهً كهىرَذ انصىدَىو بتزكُش ٪ 4 :و ، ٪ 6،5انًُى فٍ ، 9،6 pHواختببراث ًَى فٍ دراخبث حزارة يختهفت 30و 45درخت يئىَت ،دراست انًقبويت انحزارَت ،اختببر انًُى فٍ انًتىسػ حهُب شُزيبٌ ،اختببر تحهم األرخٍُُُ ) ،(ADHاختببر تحهم االَسكىنٍُ ،إَتبج ، acétoїneاستخذاو انستزاث ،إَتبج CO2يٍ انسُتزاث ،إَتبج ، exopolysaccharidesو اختببر انًقبويت نهفبَكىيبَسٍُ) يكُُب يٍ تحذَذ ٪ 12 ، Eenterococcus ssp ٪ 53 ، Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides ٪ 32 Lactococcus lactis subsp lactis biovar diacetylactisو ٪ 2يٍ .Lactobacillus plantarum 53سالنت اختبزث بسبب تأثُزهب انًعبد نهبكتُزَب ظذ Staphylococcus aureus ATCC 25923و Escherichia .coli ATCC 25922انتفبػم بٍُ سالالتُب و انبكتُزَب انًسببت نأليزاض ،أػؽب َتبئح إَدببُت ندًُغ انسالالث انًهحىظت ػٍ ؼزَق يُبؼق انتثبُػ . تى اختُبر سالالث يٍ خُس ) Leuconostoc (Lnنُشبؼهب انقىي ظذ اندزاثُى ،السًُب ظذ Staphylococcus aureusو .Escherichia coliفٍ وسػ يختهػ ،انسالنتٍُ Ln10و Ln14أخفعتب ًَى Staphylococcus aureus و Escherichia coliبؼذ بعؼت سبػبث يٍ انحعبَت. الكلمات المفتاحية : بكتزَب حبيط انالكتُك ،Lactococcus ،Eenterococcus ،Leuconostoc ، ،Lactobacillusانتفبػم ،Bactériocines ،حًط انالكتُك ،انُشبغ انًعبد نهبكتُزَب. Liste des abréviations : ADH : Arginine dihydrolase ADN : Acide désoxyribonucléique ARN : Acide ribonucléique °C : Degré Celsius CO2 : dioxyde de carbone g : Gramme h : Heure ml : millilitre min : minute mm : millimètre NaCl : Chlorure de sodium pH : Potentiel d’hydrogène ppm : Partie pour million p/v : poids par volume μl : microlitre v/v : volume par volume UFC : Unité Formant Colonie Liste des figures : N° Figure Figure (I) 1 Figure (I) 2 Figure (I) 3 Figure (I) 4 Figure (I) 5 Figure (I) 6 Figure (I) 7 Figure (I) 8 Figure (I) 9 Figure (I) 10 Figure (I) 11 Titre Principales voies assurant le transport et le métabolisme du glucose par les bactéries lactiques (Desmazeaud et De Roissart, 1994). Schéma montrant l’arbre phylogénique des bactéries lactiques y compris des genres apparenté (Axelsson, 2004) Morphologie de A: Lactobacillus casei and B: Lactobacillus acidophilus (Examen en microscopie électronique, 7000 ×) Photo Bottazzi Vittorio Morphologie en microscopie électronique de Streptococcus thermophilus (Liebefeld, 2002) Morphologie en microscopie électronique de Lactococcus lactis subsp. “diacetylactis” (Teuber et Geis, 2006) Fixation des Leuconostocs sur les moules en grès-vernissé. (Examen en microscopie électronique de balayage, 11 500×). Photo Micheline Rousseau - Christiane Le Gallo INRA - C.R. Jouy-en-Josas Morphologie en microscopie électronique de Pediococcus sp Photo Sylviane Lemarinier (Université de Caen) Morphologie en microscopie électronique de Bifidobacterium animalis Photo Sylviane Lemarinier (Université de Caen) Structure de la reutérine, 3-hydroxypropanal (Axelsson, 2004) Séquence et structure de lantibiotiques de type A (nisin) et B (mersacidin) (Dortu et Thonart, 2009) Mode d’action des bactériocines de bactéries lactiques (Paul et al., 2005) Figure(II) 1 Figure(II) 2 Figure(II) 3 Protocole d’isolement des souches lactiques protocole de la fermentation des hydrates de carbones Les différentes méthodes utilisées pour la recherche de substances antimicrobienne. Figure(III) 1 Aspect macroscopique sur milieu MRS des souches; Leuconostoc (A), Lactococcus (B), Lactobacillus (C) et Enterococcus (D) sur milieu M17 après 24h d’incubation. Aspect des Colonies des souches sur milieu MRS Leuconostoc (A) et Lactobacillus (B), lactocoques(C) sur Elliker, Enterococcus (D) sur milieu M17 après 24h d’incubation (vue sous une loupe) Observation microscopique de la souche Lactobacillus (A), Leuconostoc (B), lactocoques (C) et Enterococcus (D) après coloration de Gram (G x100). Distribution du pourcentage des isolats lactiques Croissance en présence de 6.5% NaCl pour les souches S1, S2, S3 et S4 (Enterococcus). Figure(III) 2 Figure(III) 3 Figure(III) 4 Figure(III) 5 Page 9 10 13 14 15 16 17 18 24 26 30 37 41 45 47 48 48 49 50 Figure(III) 6 Figure(III) 7 Figure(III) 8 Figure(III) 9 Figure(III) 10 Figure(III) 11 Figure(III) 12 Figure(III) 13 Figure(III) 14 Figure(III) 15 Figure(III) 16 Figure(III) 17 Figure(III) 18 Figure(III) 19 Figure(III) 20 Figure(III) 21 Croissance en milieu gélosé à l’esculine (A : en tubes, B : en boite de pétri) après 24h d’incubation. T : témoin, L3; L5; S5; S8 ; S11 : Enterococcus Résultat de la recherche de l’acétoїne. T : témoin, L1; L2; L9; L11 : Lactococcus Croissance en milieu lait de Sherman à 1%. T : témoin, L4; L5; L9; L2 : Lactococcus Résultat de production de dextrane par la souche Ln16 (Leuconostoc) sur milieu MSE. Test de type fermentaire des souches : L5 ; L6 ; L7 (Lactococcus), Ln6 ; Ln8 ; Ln10 (Leuconostoc) Résultat de la production du CO2 à partir du citrate. T : témoin, Ln3; Ln12; Ln13; Ln15; Ln16 : Leuconostoc Résultat de test du citratase sur milieu KMK. A: méthode de mutipoint et B: la méthode des stries. Ln1; Ln2; Ln3; Ln4; Ln5; Ln6; Ln7; Ln8; Ln9; Ln10: Leuconostoc (cit+), Lb1:Lactobacillus (cit-) Résultat de dégradation de l’arginine. T : témoin, Lb1 (Lactobacillus), S21; S22; S23 (Enterococcus) Résultat de la fermentation des hydrates de carbones de la souche Ln1: Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides (A) et la souche L2: Lactococcus lactis subsp lactis var diacetylactis (B) Résultat du profil fermentaire de la souche: Lactobacillus plantarum Lb1 sur la galerie API 50 CHL après 48h d’incubation Résultat du profil fermentaire de la souche: Leuconostoc mesenteroides subs mesenteroides Ln5 sur la galerie API 50 CHL après 48h d’incubation Aspect macroscopique des bactéries pathogènes après 24h d’incubation A: Staphylococcus aureus ATCC 25923 sur milieu Chapman B: Escherichia coli ATCC 25922 sur milieu Héktoine Inhibitions obtenues par la méthode de Fleming (1975) par les souches de Ln2, Ln3, Ln12, Ln13 (Leuconostoc mesenteroides subs mesenteroides) contre E. coli (A) et Staphylococcus aureus (B) Inhibitions obtenues par la méthode de Fleming (1975) par des souches de Ln14, Ln15, Ln16, Ln17 (Leuconostoc mesenteroides subs mesenteroides) contre E. coli (A) et Staphylococcus aureus (B) Inhibitions obtenues par la méthode de Fleming (1975) par des souches de Ln1, Ln6, Ln10 Ln10 (Leuconostoc mesenteroides subs mesenteroides) et L2 (Lactococcus lactis subsp lactis biovar diacetylactis) contre E. coli (A) et Staphylococcus aureus (B) Inhibitions obtenues par la méthode Barefoot et Kaenhammer (1983) par des souches de Ln1, Ln2, Ln3, Ln11 (Leuconostoc mesenteroides subs mesenteroides) vis-à-vis de S. aureus 50 51 51 52 52 53 53 54 59 63 64 67 68 68 69 72 Figure(III) 22 Figure(III) 23 Figure(III) 24 Figure(III) 25 Figure(III) 26 Inhibitions obtenues par la méthode de Fleming (1975) sur milieu MRS tamponnée à pH 6,1 par des souches de Ln13, Ln14, Ln15, Ln16 (Leuconostoc mesenteroides subs mesenteroides) vis-à-vis de Staphylococcus aureus (A) et E. coli (B) Inhibitions obtenues par la méthode de Fleming (1975) sur milieu MRS tamponnée à pH 6,1 par des souches L2 (Lactococcus lactis subsp lactis biovar diacetylactis) et Ln10, Ln11 (Leuconostoc mesenteroides subs mesenteroides) vis-à-vis de Staphylococcus aureus. La croissance de Staphylococcus aureus dans le lait à 37°C en présence de la souche Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln10 La croissance de Staphylococcus aureus dans le lait à 37°C en présence de la souche Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln14 La croissance d’Escherichia coli dans le lait à 37°C en présence de la souche Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln14 73 74 75 75 76 Liste des tableaux : N° Tableau Tableau (I) 1 Tableau (I) 2 Tableau (I) 3 Tableau (I) 4 Tableau (I) 5 Tableau (I) 6 Tableau (I) 7 Tableau (I) 8 Tableau (I) 9a Tableau (I) 9b Tableau(II) 1 Tableau(III) 1 Tableau(III) 2 Tableau(III) 3 Tableau(III) 4a Tableau(III) 4b Tableau(III) 4c Tableau(III) 5a Tableau(III) 5b Tableau(III) 6a Tableau(III) 6b Tableau(III) 7 Tableau(III) 8 Titre Caractère physique du lait cru (Larpent J-P. et al., 1997) Composition moyenne des laits de chèvre, vache et de femme par 100ml (Pellerin, 2001) Flore indigène du lait cru (Lamontagne et al, 2002) Critères différentiels des trois groupes de Lactobacilles (Sharpe, 1981; Kandler et Weiss, 1986) Les différentes caractéristiques de bactéries lactiques (Axelsson, 2004) Principaux produits issus de la fermentation des bactéries lactiques (Penaud, 2006) Liste non exhaustive et séquences de bactériocines appartenant à la classe II (Dortu et Thonart, 2009) Liste des bactériocines appartenant à la classe III (Klaenhammer, 1993; Riley et Wertz, 2002) Indique les différentes classes de bactériocines I et IIa produiten par les bactéries lactiques et leur spectre d’activité (Chen et Hoover, 2003). Indique les différentes classes de bactériocines I et IIa produiten par les bactéries lactiques et leur spectre d’activité (Chen et Hoover, 2003). Milieux l’isolement des bactéries lactiques (Badis et al, 2004) Page 3 4 Critères d'identification des isolats lactiques du groupe de Leuconostocs. Critères d'identification des isolats lactiques du groupe : Lactocoques, Lactobacilles et Enterocoques. Critères d'identification des isolats lactiques du groupe d’Entérocoques. Profils fermentaires des isolats Profils fermentaires des isolats Profils fermentaires des isolats Profils fermentaires des isolats par les galeries API 50CHL Profils fermentaires des isolats par les galeries API 50CHL Spectre d’activité antimicrobienne des souches lactiques par la méthode de Fleming (1975) Spectre d’activité antimicrobienne des souches lactiques par la méthode de Fleming (1975) Spectre d’activité antimicrobienne des souches lactiques par la méthode de Fleming (1975) sur milieu MRS tamponnée à pH 6,1 Résultats de dénombrement de Staphylococcus aureus en culture pure et mixte avec Leuconostoc mesenteroides Ln10. 55 7 12 20 21 27 28 31 32 36 56 57 60 61 62 65 66 70 71 73 annexe Tableau(III) 9 Tableau(III) 10 Résultats de dénombrement de Staphylococcus aureus en culture pure et mixte avec Leuconostoc mesenteroides Ln14. Résultats de dénombrement d’Escherichia coli en culture pure et mixte avec Leuconostoc mesenteroides Ln14. annexe annexe Sommaire : Remerciements Résumé Sammary الملخص Liste des abréviations Liste des figures Liste des tableaux I. Revue de littérature Introduction ............................................................................................................................. 1 1. Lait ....................................................................................................................................... 3 1.1 Présentation générale ....................................................................................................... 3 1.2 Lait de chèvre ................................................................................................................... 4 1.3 Lait de vache .................................................................................................................... 4 1.4 Microflore du lait .......................................................................................................... 6 1.4.1 Flore contaminante ................................................................................................... 6 1.4.2 Flore indigène ou originelle ................................................................................... 7 2. Les bactéries lactiques ....................................................................................................... 7 2.1 Définition ......................................................................................................................... 8 2.2 Caractéristiques principales des bactéries lactiques ........................................................ 8 2.3 Classification des bactéries lactiques ............................................................................. 10 2.4 Les différents genres ...................................................................................................... 11 2.4.1 Lactobacillus ......................................................................................................... 11 2.4.2 Carnobacterium .................................................................................................... 13 2.4.3 Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus et Vagococcus ................................... 14 2.4.4 Leuconostoc, Oenococcus et Weissella ................................................................. 16 2.4.5 Aerococcus, Pediococcus et Tetragenococcus ...................................................... 17 2.4.6 Bifidobacterium ..................................................................................................... 18 2.5 Méthodes d’identification des bactéries lactiques ......................................................... 19 2.5.1 Méthodes classiques .............................................................................................. 19 2.5.2 Méthodes moléculaires .......................................................................................... 20 2.6 Bactéries lactiques et fermentation alimentaire ............................................................ 21 2.7 Bactéries lactiques et santé humaine ............................................................................. 22 2.8 Les propriétés antimicrobiennes des bactéries lactiques ............................................... 22 2.8.1 Les acides organiques ............................................................................................ 22 2.8.2 Le peroxyde d’hydrogène ...................................................................................... 23 2.8.3 Le dioxyde de carbone ........................................................................................... 24 2.8.4 Le diacétyl .............................................................................................................. 24 2.8.5 La reutérine ............................................................................................................ 24 2.8.6 Les bactériocines .................................................................................................... 25 II. 2.8.6.1 Classification des bactériocines ..................................................................... 25 2.8.6.2 La production des bactériocines et sa régulation ........................................... 28 2.8.6.3 Les mécanismes d’action des bactériocines ................................................... 29 2.8.6.4 Spectre d’activité des bactériocines ............................................................... 30 2.8.6.5 Les applications des bactériocines dans l’industrie alimentaire .................... 32 Matériel et méthodes 1. Provenance des échantillons ........................................................................................... 35 2. Souches utilisées .............................................................................................................. 35 2.1 Souches pathogènes ........................................................................................................ 35 2.2 Souches de référence....................................................................................................... 35 3. Isolement et culture de la flore lactique ........................................................................ 35 4. Purification et conservation des souches ........................................................................ 36 5. Identification des isolats .................................................................................................. 36 5.1 Critères morphologiques ................................................................................................ 36 5.1.1 Caractérisation macroscopique ............................................................................. 36 5.1.2 Caractérisation microscopique .............................................................................. 36 5.2 Critères physiologiques et biochimiques ....................................................................... 38 5.2.1 Test de la catalase ................................................................................................ 38 5.2.2 Croissance à différentes températures .................................................................. 38 5.2.3 Type fermentaire ................................................................................................. 38 5.2.4 Croissance dans des conditions hostiles ............................................................... 38 5.2.4.1 La culture à pH 9,6 et celle en présence de NaCl : 4% , 6,5% ....................... 38 5.2.4.2 Croissance sur le lait bleu de Sherman (1937) ................................................ 39 5.2.5 La thermorésistance ............................................................................................. 39 5.2.6 Hydrolyse de l’arginine (ADH) ........................................................................... 39 5.2.7 Hydrolyse de l’esculine ....................................................................................... 39 5.2.8 Production d’acétoїne .......................................................................................... 39 5.2.9 Utilisation du citrate ............................................................................................. 40 5.2.10 Production de CO2 à partir du citrate ................................................................... 40 5.2.11 Fermentation des hydrates de carbones ............................................................... 40 5.2.12 Identification par la galerie API 50CHL ............................................................. 42 5.2.13 Production de dextrane ........................................................................................ 43 5.2.14 Vancomycine-résistance ..................................................................................... 43 6. Etude de l’activité antibactérienne des souches ............................................................ 43 6.1 Méthode de double couche (méthode de Fleming et al., 1975) ..................................... 43 6.2 Méthode des puits (méthode de Barefoot et Kaenhammer, 1983) ................................. 44 6.3 Inhibition due à l’acide lactique ..................................................................................... 44 6.4 Etude de l’évolution de la croissance en culture mixte .................................................. 46 III. Résultats 1. Identification des isolats .................................................................................................. 47 1.1 Critères morphologiques ................................................................................................ 47 1.2 Critères physiologiques et biochimiques ....................................................................... 49 1.3 Identification des espèces ............................................................................................. 58 1.3.1 La fermentation des hydrates de carbones .............................................................. 58 1.3.2 Profil fermentaire sur galeries API 50CHL ............................................................ 63 2. L’activité antibactérienne des souches .......................................................................... 67 2.1 Mise en évidence des inhibitions ................................................................................. 67 2.1.1 Méthode de Fleming et al., (1975) .......................................................................... 67 2.1.2 Méthode de Barefoot et Kaenhammer (1983) ......................................................... 71 2.1.3 Inhibition due à l’acide lactique .............................................................................. 72 2.2 Etude de l’évolution de la croissance en culture mixte ................................................ 74 2.2.1 Dénombrement de Staphylococcus aureus en culture pure et mixte ..................... 74 2.2.1 Dénombrement d’Escherichia coli en culture pure et mixte ................................... 76 IV. Discussion 1. Isolement et identification des souches ......................................................................... 77 2. L’activité antibactérienne des souches .......................................................................... 81 Conclusion et perspectives ...................................................................................................... 86 Références bibliographiques ................................................................................................... 88 Publications scientifiques Annexe I. REVUE DE LITTERATURE Introduction Introduction : Le lait occupe une place stratégique dans l'alimentation quotidienne de l'homme, de par ses composants nobles (protéines, glucides et lipides) et sa richesse en vitamines et en minéraux, notamment en calcium alimentaire. De nos jours, les besoins en lait sont de plus en plus importants vu que ce produit peut être consommé à l’état frais, mais aussi sous forme pasteurisé, stérilisé ou transformé en produits dérivés. Plusieurs produits laitiers sont obtenus par fermentation et cela par ensemencement du lait cru ou stérilisé par des bactéries lactiques qui sont capables de bioconvertir ses différents éléments en nouvelles molécules dotant le lait de nouvelles propriétés organoleptiques, hygiéniques et même sanitaire. Les bactéries lactiques sont des microorganismes très répandus dans la nature ; on les trouve dans le sol, sur les végétaux, elles jouent un rôle important dans notre santé car elles constituent une fraction majeure de notre flore intestinale et tapissent les muqueuses nasales, buccales et vaginales, contribuant ainsi à nous protéger contre l’invasion des germes pathogènes. Les bactéries lactiques sont utilisées depuis des siècles pour fermenter les aliments. Elles sont largement présentées un grand intérêt biotechnologique. Considérées comme inoffensives pour l’homme, leur usage est fréquent dans le monde entier pour fabriquer des produits laitiers fermentés (fromage, yaourts…). La production d’acide lactique est essentielle à la fermentation de ces produits et leur confère une saveur typique. Les bactéries lactiques colonisent naturellement plusieurs matrices alimentaires. Elles sont depuis des siècles associées à l’alimentation humaine et animale. Ces micro-organismes sont tolérés par l’homme et les animaux, ce qui a conduit à la reconnaissance de leur statut GRAS (Generally Recognized As Safe) (Klaenhammer et al., 2005). Certaines souches de BL s’avèrent bénéfiques pour la santé humaine et sont appelées probiotiques. Ils sont capables de survivre dans le système digestif humain, voire de le coloniser et sont utilisées pour le traitement des diarrhées et autres troubles digestifs. Des études récentes mettent en évidence des propriétés de stimulation de la réponse immunitaire spécifique et certaines souches auraient la capacité de réduire les réactions d’allergie alimentaire, en particulier aux protéines du lait (Salminen et al., 1996). L’utilisation des bactéries lactiques comme vecteurs vivants en vue d’une vaccination par voie orale est aujourd’hui un axe de recherche très privilégié. 1 Introduction En industrie agro-alimentaire, les bactéries lactiques sont employées pour aider à la fois à la fabrication et à la conservation des produits à partir de certaines matières premières telles que le lait, la viande, le poisson, les végétaux et les céréales. Elles sont utilisées en tant que telles (biotechnologies empiriques) ou sous forme de ferment (souche sélectionnée et purifiée) Elles réalisent dans les aliments une acidification, une production d’arômes, une production d’enzymes permettant d’améliorer la digestibilité des aliments et une inhibition des microorganismes qu’elle soit pathogène ou d’altération. Cette dernière activité est due à la production de substances antagonistes tels que les acides organiques (acétique et lactique), le peroxyde d’hydrogène, le diacétyle et les bactériocines (Klaenhammer et al., 1994 ; Lasagno et al., 2002; De Vuyst et Leroy, 2007). Actuellement, les scientifiques exploitent les interactions microbiennes pour assurer la salubrité des aliments et pour réduire d’une façon considérable la présence des microorganismes indésirables et nuisibles. L’intérêt de ce travail est d’identifier et de caractériser des bactéries lactiques isolées de laits cru (chèvre et vache), provenant de la région de l’Ouest Algérien. La partie suivante nous avons étudié les interactions dans le but de sélectionner des souches inhibitrices qui possèdent un pouvoir inhibiteur contre les germes pathogènes et de déterminer la nature des substances inhibitrices. 2 Revue de littérature 1. Lait : Le lait destiné à l’alimentation humaine a été défini en 1909 par le congrès international de la répression des fraudes : « le lait est le produit intégral de la traite totale et ininterrompue d’une femelle laitière bien portante, bien nourrie et non surmenée. Il doit être recueilli proprement et ne pas contenir de colostrum » (Larpent J-P., 1996b) 1.1 Présentation générale : Le lait est produit par les ruminants qui transforment les protéines végétales en protéines animales. Le lait est sécrété par les glandes mammaires des femelles de plus de quelques 4000 espèces de mammifères. Sa composition varie légèrement d’une espèce de mammifère à l’autre. Le lait est un fluide aqueux opaque, blanc mat, légèrement bleuté, d’une saveur douceâtre et d’un pH (6,6 à 6,8) légèrement acide, proche da la neutralité (Pougheon et Goursaud, 2001) Couleur Caractère normal Caractère anormal Blanc mat Gris jaunâtre : lait de mammite Bleu, jaune… Blanc jaunâtre : Lait riche en crème Lait coloré par des substances chimiques ou des pigments bactériens Odeur faible Odeur Odeur de putréfaction, de moisi, de rance… Saveur agréable Saveur Saveur salée : Lait de mammite Gout amer : Lait très pollué par des bactéries Consistance Homogène Grumeleuse : mammite Visqueuse ou coagulée : Pollution bactérienne Tableau (I) 1 : Caractère physique du lait cru (Larpent J-P et al., 1997) 3 Revue de littérature Le lait est un substrat très riche fournissant à l’homme et aux jeunes animaux naissants, un aliment presque complet. Protides, glucides, lipides, sels minéraux et vitamines sont présents à des concentrations tout à fait satisfaisantes pour la croissance et la multiplication cellulaire (Larpent J-P et al., 1997). Les principaux constituants du lait sont donc par ordre décroissant : de l’eau, très majoritaire ; des glucides, principalement représentés par le lactose ; des lipides, essentiellement des triglycérides rassemblés en globules gras ; des protéines : caséines rassemblées en micelles, albumines et globulines solubles ; des sels et minéraux à l’état ionique et moléculaire ; des éléments à l’état de traces mais au rôle biologique important : enzymes, vitamines, oligoéléments… Composition Unité Lait de chèvre Lait de vache Lait de femme Eau g 87,5 87,7 87,1 Energie Kcal 71 65 69 Proteines g 3,3 3,3 1,3 Lipides g 4,5 3,8 4,1 Glucides g 4,6 4,7 7,2 Na mg 40 50 14 K mg 180 150 58 Ca mg 130 120 34 Mg mg 20 12 3 P mg 110 95 12 Fe mg 0,04 0,05 0,07 Cu mg 0,05 0,02 0,04 Zn mg 0,3 0,35 0,28 Caséines % 83 82 40 Protéines de % 17 18 60 lactosérum Tableau (I) 2 : Composition moyenne des laits de chèvre, vache et de femme par 100ml (Pellerin, 2001) 4 Revue de littérature 1.2 Lait de chèvre : Le lait de chèvre est caractérisé par sa couleur blanche due à l’absence de bêta carotène, contrairement au lait de vache. Le lait de chèvre se digère plus facilement que le lait de vache et il est donc recommandé pour les bébés et les personnes qui supportent mal ce dernier. De plus il est naturellement homogénéisé car il est dépourvu d'une protéine, l'agglutinine. Les concentrations en calcium, magnésium, potassium et en phosphore dans le lait de chèvre et le lait de vache sont presque équivalentes (IDF, 1990). Pour ce qui est des vitamines, le lait de chèvre est particulièrement plus pauvre en vitamines C, D, pyridoxine, B12 et acide folique. La quantité du lactose dans le lait de chèvre est équivalente à celle du lait de vache soit 10g/250ml. La teneur en protéines du lait de chèvre est comparable à celle du lait de vache. Les caséines représentent la partie la plus importante des protéines du lait, elles constituent environ 70% des matières azotés (Corsy, 1991). Les matières grasses du lait de chèvre sont caractérisées par la longueur des chaînes de carbone (C18). Ces matières grasses sont constituées de triglycérides et d’acides gras. 1.3 Lait de vache : Le lait de vache est un liquide opaque de couleur blanche, plus au moins jaunâtre selon la teneur de la matière grasse en bêta carotène. Sa saveur est douce et son odeur faible. Le ait de vache de part sa richesse en matière azotée, en calcium et en vitamines offre un intérêt alimentaire exceptionnel. Les proportions des différents composants du lait de vache varient quelque peu selon les espèces de mammifères et parmi ces espèces selon leur race. Un litre de lait cru contient près de 900 g d'eau et 132 g d'extrait sec. Le pourcentage de matière grasse est sensiblement le même que dans le lait de chèvre. Cependant, le diamètre moyen des globules gras dans le lait de vache est de 6um, le lait de chèvre est d’environ 3um. Les principales protéines du sérum sont identiques, soit l’α-lactalbumine, la β-lactoglobuline et les immunoglobulines. Le lait de vache contient des quantités équivalentes entre les caséines alpha et bêta alors que le lait de chèvre contient une quantité plus grande de caséines de type bêta. 5 Revue de littérature Le lait contient presque toutes les vitamines indispensables à la vie à l’exception de la vitamine C (très petite quantité). 1.4 Microflore du lait : Milieu neutre, le lait, par ce caractère, prédispose encore à la prolifération des éléments microbiens qui l'habitent. Enfin, élément liquide, il permet en outre le déplacement dans toute sa masse des corps étrangers vivants qui l'ont envahi. Le lait constitue donc au sens écologique du terme un « écosystème ». Du fait de sa composition physicochimique, le lait est un excellent substrat pour la croissance microbienne. 1.4.1 Flore contaminante : La flore contaminante est l’ensemble des microorganismes ajoutées au lait, de récolte jusqu’à la consommation. Elle peut se composer d’une flore d’altération, qui causera des défauts sensoriels de gout, d’arômes ou qui réduira la durée de conservation des produits, et d’une flore pathogène capable de provoquer des malaises chez des personnes (Lamontagne et al, 2002). Le lait au cours de la traite, du transport et du stockage à la ferme ou à l’usine, est contaminé par une grande variété de microorganismes (Larpent J-P., 1997). Les principales sources de contamination sont les suivantes ; fèces et téguments de l’animal : coliformes, Bacillus, Clostridium, Salmonella ; sol : Streptomyces, bactéries sporulées, spores de champignons ; litières et aliments : flore banale, lactobacilles, Clostridia butyriques (ensilage) ; air et eau : flores diverses ; équipement de traite et de stockage du lait : flore lactique, microcoques, lactobacilles, Chromobacterium, Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium, Acinitobacter, levures ; manipulateurs : staphylocoques des mains, germes d’expectoration et de contamination fécale ; vecteurs divers : insectes en particulier. Les principaux genres identifiés comme flore d’altération sont : Pseudomonas, Proteus, les coliformes, soit principalement les genres Escherichia et Enterobacter, les sporulées telles que Bacillus, Clostridium et certaines levures et moisissures. 6 Revue de littérature D’autres microorganismes peuvent se trouver dans le lait lorsqu’il est issu d’un animal malade : ils sont généralement pathogènes et dangereux. Il peut s’agir par exemple d’agents de mammites. Les mammites sont dues à des infections par Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Corynebacterium bovis ou Corynebacterium pyogenes, Mycoplasma, Nocardia asteroides. 1.4.2 Flore indigène ou originelle : Le lait contient peu de microorganismes lorsqu’il est prélevé dans des conditions aseptiques, à partir d’un animal sain, il devrait contenir moins de 5000 germes/ml et de moins de 1 coliforme/ml. La flore indigène du lait se définit comme l’ensemble de germes saprophytes du pis et des canaux galactophores. Microorganismes Pourcentage(%) Micrococcus 30-90 Lactobacillus 10-30 Streptococcus ou < 10 Lactococcus Gram négatif < 10 Tableau (I) 3 : Flore indigène du lait cru (Lamontagne et al, 2002) La flore microbienne du lait cru participe de façon importante à l’établissement des caractéristiques organoleptiques des fromages et ce, indépendamment de la présence des ferments (Michel V. et al., 2001) Les fabrications de produits laitiers utilisent beaucoup de microorganismes et, en particulier, des bactéries lactiques. 2. Les bactéries lactiques : Les bactéries lactiques sont très anciennes et sont apparues avant les cyanobactéries, il y a près de 3 milliards d’années (Tailliez, 2001). 7 Revue de littérature Les bactéries lactiques sont utilisées depuis des millénaires dans l’alimentation humaine (Penaud, 2006). La découverte de leur action sur le lait fut probablement accidentelle mais leur utilisation fut perpétuée sous forme de levains, simple récupération d’une partie du milieu de fermentation. La fermentation confère aux aliments une saveur et une texture particulière, permet de mieux les conserver et apporte aussi certains bénéfices nutritionnels et de santé. Ces bactéries furent et sont encore utilisées sous la forme de levains artisanaux, mais le développement de l’industrie de transformation, en particulier de l’industrie laitière, a conduit à la production de ferments industriels capables d’assurer à la fois la qualité et la constance du produit. Malgré leur importance économique, les bactéries lactiques n’ont pas toujours reçu l’attention nécessaire ni de la part des microbiologistes ni de celle des industriels. Depuis quelques années, elles deviennent un sujet d’étude privilégie de par le monde (Novel G., 1993). 2.1 Définition : La première culture pure était des Bacterium lactis probablement des Lactococcus lactis, obtenue par Lister en 1873 (Ho, 2008). Les bactéries lactiques ont été isolées pour la première fois à partir du lait (Metchnikoff, 1908; Sandine et al., 1972; et Carr et al., 2002). Les bactéries lactiques sont définies comme des cellules vivantes, procaryotes, hétérotrophes et chimio-organotrophes (De Roissart, 1986). 2.2 Caractéristiques principales des bactéries lactiques : Le groupe des bactéries lactiques a été défini par Orla-Jensen (1919) et réunit plusieurs genres caractérisés par leur capacité à fermenter les glucides en produisant de l’acide lactique (Novel G., 1993). Les bactéries lactiques sont un groupe de bacilles ou coccobacilles ont pour principales caractéristiques d’être : à Gram positif, généralement immobiles, asporulés, anaérobies mais aèrotolérantes, dépourvus de cytochromes-oxydase et de nitrate-réductase, ne possède pas le catalase (certaines souches possèdent une pseudo-catalase) (Dellaglio et al., 1994 ; Carr et al., 2002 ; Axelsson, 2004). Pour se développer, elles ont besoin de sources de carbone organique (glucides fermentescibles) et de nombreuses bactéries lactiques ont des exigences nutritionnelles 8 Revue de littérature complexes en ce qui concerne les acides aminés ou les peptides, les vitamines et les acides gras (Prescott et al., 1999). Les bactéries lactiques sont un groupe hétérogène de microorganismes produisant de l’acide lactique comme produit principal du métabolisme fermentaire. Selon le type de fermentation préférentiellement utilisé, les bactéries lactiques sont dites : - homofermentaires : l’acide lactique est le seul produit de la fermentation du glucose - hétérofermentaires facultatif : la fermentation du glucose aboutit à la formation d’acide lactique ou de l’acide lactique et de l’acide acétique - hétérofermentaires strict : elles produisent, en plus de l’acide lactique, de l’acide acétique ou de l’éthanol et du CO2 Figure (I) 1 : Principales voies assurant le transport et le métabolisme du glucose par les bactéries lactiques (Desmazeaud et De Roissart, 1994). 9 Revue de littérature Beaucoup de ces caractères sont typiques et servent à définir le « cœur » du groupe lactique que les recherches taxonomiques et phylogéniques (ou phylogénétiques) sont en train de modifier de façon significative, soit au niveau des genres et des espèces, soit au niveau de la ligne de démarcation avec d’autres groupes de bactéries (Dellaglio et al., 1994). 2.3 Classification des bactéries lactiques : La systématique est en évolution permanente. Il n'y a jamais eu de règles unanimement reconnues sur la façon dont deux bactéries différentes devraient être phénotypiquement classées. Par exemple, quelles caractéristiques sont importantes dans la définition des sousespèces, des espèces et du genre ? La littérature scientifique suit généralement les recommandations des comités de taxonomie qui opèrent sous les auspices de l'Union internationale de Sociétés Microbiologiques (Sneath, 2001). La première classification des bactéries lactiques basée sur les propriétés observables à savoir les propriétés morphologiques, biochimiques et physiologiques a été établie en 1919 par OrlaJensen. Figure (I) 2 : Schéma montrant l’arbre phylogénique des bactéries lactiques y compris des genres apparenté (Axelsson, 2004) 10 Revue de littérature D’après Ludwig et al. (2008), le phylum Firmicutes comprend trois classes : Bacilli, Clostridia et Erysipelotrichi. Appartenant à la classe Bacilli, les bactéries lactiques sont divisées en trois familles : Famille des Lactobacillaceae comportant les Lactobacillus, Paralactobacillus et Pediococcus. Famille des Leuconostocaceae contenant les Leuconostoc, Oenococcus et Weissella. Famille des Streptococcaceae comprenant les Streptococcus, Lactococcus et Lactovum. Historiquement, le genre Bifidobacterium était aussi considéré comme faisant partie du groupe des bactéries lactiques grâce à la similarité de ses propriétés physiologiques et biochimiques et à sa présence dans le même habitat écologique, tel que le tube gastrointestinal (Klein et al., 1998). 2.4 Les différents genres : La classification actuelle des bactéries lactiques fait apparaître douze genres qui incluent Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Oenococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et Weissella (Stiles et Holzapfel, 1997). 2.4.1 Lactobacillus : Le genre Lactobacillus est le genre principal de la famille des Lactobacillaceae. Les lactobacilles représentent un genre important des bactéries lactiques tant au niveau industriel qu’au niveau de la flore commensale infantile. L’hétérogénéité des espèces est illustrée par le contenu en G + C qui peur varier de 32 à 53 % (Schleifer et Stackebrandt, 1983 ; Pilet M-F. et al., 2005) La classification remaniée par Kandler et Weiss (1986) les subdivise en 3 groupes selon leur type fermentaire : groupe I : anciennement appelé Thermobacterium. Il regroupe les lactobacilles homofermentaires stricts et thermophiles, ils sont incapables de fermenter les pentoses et le gluconate. Ces bactéries fermentent les hexoses par la voie d’Embden-Meyerhof, en produisant exclusivement de l’acide lactique, elles se développent à 45°C mais pas à 15°C. Leurs cellules sont longues, droites souvent en palissades (Bottazzi, 1988). 11 Revue de littérature groupe II : anciennement appelé Streptobacterium. rassemble les lactobacilles hétérofermentaires facultatifs et mésophiles qui se développent à 15°C. Les hexoses sont fermentés par la voie d’Embden-Meyerhof, en produisant exclusivement de l’acide lactique (mais pour certaines souches : du lactate, de l’acétate, de l’éthanol et du formiate), celle des pentoses et du gluconate peuvent être dégradés par la voie hétérofermentaire avec une production d’acide lactique et d’acide acétique par une phosphokétolase inductible. Leurs cellules sont courtes, souvent arrangées en filaments (Bottazzi, 1988). groupe III : anciennement appelé Betabacterium. Ces espèces ont un métabolisme strictement hétérofermentaire. la fermentation des hexoses produit de l’acide lactique, de l’acide acétique (ou de l’éthanol) et du CO2, celle des pentoses, de l’acide lactique et de l’acide acétique. ces bactéries possèdent une phosphokétolase (tableau (I) 4). c’est un groupe qui rassemble des espèces relativement hétérogènes, surtout mésophiles. les cellules sont courtes, droites et séparées (Bottazzi, 1988). Group I, homofermentaires Obligatoires Group II, hétérofermentaires Facultatifs Group III, hétérofermentaires Obligatoires Fermentation des pentoses CO2 à partir du glucose - + - - - + CO2 à partir du gluconate - + + FDP aldolase + + - Phosphokétolase - + + Caractéristiques Lb. acidophilus Lb. delbrueckii Lb. helveticus Lb. salivarius Lb. casei Lb. curvatus Lb. plantarum Lb. sakei Lb. brevis Lb. buchneri Lb. fermentum Lb. reuteri Tableau (I) 4 : Critères différentiels des trois groupes de Lactobacilles (Sharpe, 1981; Kandler et Weiss, 1986) FDP : Fructose 1-6 diphosphate aldolase 12 Revue de littérature Les Lactobacilles, de par leur variété, sont présents dans des milieux très différents (Novel G., 1993) : cavité buccale, tractus digestif, organes génitaux chez l’homme, produits végétaux, lait et produits laitiers (différents type de fromages), produits carnés, poissons marinés ou fumés. A B Figure (I) 3 : Morphologie de A: Lactobacillus casei and B: Lactobacillus acidophilus (Examen en microscopie électronique, ×7000) Photo Bottazzi Vittorio 2.4.2 Carnobacterium : Ce genre a été créé par Collins et al. (1987). sont des bacilles hétérofermentaires souvent trouvés dans les viandes de bœuf, de poisson et de volaille emballées sous vide et stockées à basse température (Novel G., 1993 ; Joffraud et al., 2006). Ils ont originellement décrit comme Lactobacillus mobile, Lb. gallinarum, Lb. divergens, Lb. piscicola (Novel G., 1993). Une étude taxonomique de ces différentes souches a permis de les regrouper après hybridations ADN-ADN, dans un nouveau genre, Carnobacterium. Morphologiquement proche des Lactobacillus (petits batonnets isolés, par paires ou en courtes chaines), ils s’en différencient par leur production de l’acide lactique L(+) et leur incapacité à se développer dans les substrats à base d’acétate. En général, les Carnobacterium peuvent croître à un pH relativement élevé (par exemple, pH=9) tandis que les lactobacilles ne peuvent pas s’y développer (Schillinger et Lücke, 1987). La croissance est possible à 0°C et 10°C mais pas à 45°C, ni en présence de NaCl 8% (Larpent J-P., 1996a). Leur contenu G+C est compris entre 33 et 37% (Dellaglio et al., 1994). 13 Revue de littérature Ce genre comprend 4 espèces fréquemment associées aux aliments C. divergens, C. piscicola, C. mobile et C. gallinarum. Ils sont isolés de produits carnés, ou de produits de la mer, saumon fumé mais certains ont également été isolés de fromages. 2.4.3 Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus et Vagococcus : Les genres Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus et Vagococcus étaient précédemment inclus dans un seul genre : Streptococcus (Axelsson, 2004). Ce sont des coques en paire ou en chaîne, leur fermentation est homolactique, produisant en majorité de l’acide L-lactique. Ces espèces diffèrent principalement entre elles par la présence d’un antigène de groupe dit antigène de Lancefield. - Le genre Streptococcus comprend la majorité des espèces de streptocoques. ces organismes ont un contenu en G+C de 35 à 46% (Pilet M-F. et al., 2005). Ce genre est généralement divisé en trois groupes : pyogène, oral et les autres streptocoques. Le groupe pyogène contient essentiellement des espèces pathogènes, hémolytiques (hémolyse β) comme Streptococcus pyogenes ; d’autres streptocoques oraux (α- ou non-hémolytiques) sont associés principalement à la cavité orale de l’homme et de l’animal (Streptococcus mutans). L’espèce thermophile qui soit utilisée en technologie alimentaire est Streptococcus thermophilus. Les Sp. thermophilus ont été inclus dans le groupe des « autre streptocoques » par Scheilfer et Kilpper-Bälz (1987). Du fait par son habitat (lait et produits laitiers), et son caractère non pathogène seul cette espèce est considérée comme appartenant aux bactéries lactiques. Figure (I) 4 : Morphologie en microscopie électronique de Streptococcus thermophilus (Liebefeld, 2002) 14 Revue de littérature - Le genre Lactococcus appartient au groupe N de Lancefield, représente les streptocoques dits « lactiques ». Récemment Schleifer et al. (1985), se fondant sur des critères moléculaires, ont proposé de séparer les streptocoques lactiques mésophiles du genre Streptococcus et de créer le genre Lactococcus (Novel G., 1993). Les lactocoques sont associés à de nombreuses fermentations alimentaires et ne possèdent aucun caractère pathogène, mais seuls les Lactococcus lactis sont actuellement utilisés dans la technologie laitière.Trois sous-espèces de La. lactis peuvent être distinguées : L. lactis ssp. lactis, L. lactis ssp. cremoris et L. lactis ssp. hordniae. Seules les deux premières interviennent dans la plupart des produits laitiers. Figure (I) 5 : Morphologie en microscopie électronique de Lactococcus lactis subsp. “diacetylactis” (Teuber et Geis, 2006) - Le genre Enterococcus rassemble la plupart des espèces du groupe D de Lancefield (streptocoques fécaux), présentent une hémolyse de type λ, β, et qui se caractérisent par leur développement à 10 et 45°C, leur aptitude à croitre en présence de 6,5 % NaCl, et leur grande résistance aux facteurs de l’environnement. Les espèces rencontrées dans l’alimentation sont essentiellement En. faecalis (auparavant Streptococcus faecalis), et ses variétés (En. durans et En. bovis). Leur habitat est très varié : intestin de l’homme et des animaux, produit végétaux, sol, produits laitiers (Giraffa et al., 1997). Les entérocoques jouaient un rôle important dans la maturation des fromages. - Les espèces du nouveau genre Vagococcus sont facilement confondues avec les lactocoques au niveau morphologique, mais ces deux genres sont clairement distincts par leur composition en acides gras (Ho, 2008). 15 Revue de littérature 2.4.4 Leuconostoc, Oenococcus et Weissella : Ils rassemblent les coques lenticulaires en paires ou en chaines, mésophiles, qui possèdent un caractère hétérofermentaire marqué, avec production de l’acide D(-) lactique. - Le genre Leuconostoc a été défini par Van Thieghem en 1878. Ce genre a auparavant inclus des coccobacilles hétérofermentaires, produisant uniquement de l’acide lactique, et ne produisant pas d’ammoniaque à partir de l’arginine. Leur température optimale de croissance se situe entre 25°C et 30°C, et leurs contenG+C sont assez voisins (37 à 45%) (Garvie, 1986). Leur croissance est toujours lente. Ils ne sont pas hémolytiques ni pathogènes. ces espèces sont caractérisées par la production à partir du citrate du lait de diacétyle et pafois par la synthèse de dextranes et de lévanes extracellulaires en présence de saccharose (Novel G., 1993). Les études phylogénétiques des Leuconostoc montrent une diversité dans ce genre (Eom et al., 2007). En général les Leuconostocs sont utiles dans différents types de fromages (Devoyod et Poullain, 1988 ; Ogier et al., 2008) où ils facilitent l’ «ouverture » par la production de CO2. Ils interviennent aussi dans l’industrie laitière (beurre et crème) principalement les Ln. mesenteroides ssp. cremoris, ensilage et les végétaux fermentés (olives, choucroute, ets) (Hemme et Foucaud-Scheunemann, 2004). Figure (I) 6 : Fixation des Leuconostocs sur les moules en grès-vernissé. (Examen en microscopie électronique de balayage, 11 500×). Photo Micheline Rousseau - Christiane Le Gallo INRA - C.R. Jouy-en-Josas 16 Revue de littérature - L’espèce Leoconostoc oenos isolée de vins a été renommée Oenococcus oeni et certains lactobacilles hétérofermentaires ont été groupés avec Leoconostoc paramesenteroides dans le nouveau genre Weissella (Stiles et Holzapfel, 1997). 2.4.5 Aerococcus, Pediococcus et Tetragenococcus : Ce sont des coques formées de cellules groupées en paires ou en tétrades. Ils sont mésophiles, homofermentaires, et le plus souvent incapable d’utiliser le lactose. - Sept espèces de Pediococcus sont connues : P. acidilactici, P. damnosus, P. - dextrinicum, P. inopinatus, P. parvutus, P. pentosaceus et P. urinaeequi. Ils fermentent les sucres en produisant de l’acide lactique DL ou L(+) et sont aussi caractérisés par le GC% de leur ADN (34-42%). Ces dernières sont importantes dans l’agroalimentaire tant sous l’aspect négatif que positif. Ce sont des agents de dégradation en brasserie (P. damnosus). Les P. acidilactici et P. pentosaceus ont démontré leur utilité dans l’élaboration de plusieurs produits carnés fermentés naturels. ils sont parfois utilisés comme levains lactiques pour les charcutries. Les pédiocoques sont également des bactéries lactiques autochtones qui permettent la maturation des fromages (Gonzalez et al., 2007 ; Gurira et al., 2005). Figure (I) 7 : Morphologie en microscopie électronique de Pediococcus sp Photo Sylviane Lemarinier (Université de Caen) - L’espèce Pediococcus halophilus a été renommée Tetragenococcus halophilus. Seulement deux espèces de Tetragenococcus sont connues : T. halophilus et T. muriaticus. Ces bactéries résistent à des concentrations élevées en sel (supérieures à 17 Revue de littérature 18 % NaCl). Ils ont un rôle crucial dans la fabrication des produits alimentaires comme les saumures (anchois salés), les sauces de soja, ets. - Le genre Aerococccus qui contient cinq espèces est généralement moins intéressant dans l’agroalimentaire (Axelsson, 2004). 2.4.6 Bifidobacterium : Les Bifidobacterium (l’ancien nom étant Lactobacillus bifidus), la forme des cellules de Bifidobacterium est très irrégulière, pouvant être : cellules courtes, conoïdales, cellules ramifiées, spatulées, isolées ou en chaine, disposées en V ou en palissade (Larpent J-P., 1996a ; Pilet M-F. et al., 2005). Elles se différencient des autres bactéries lactiques par leur caractère anaérobie, leur contenu G+C (55-67%) et la présence d’une enzyme, la fructose-6-phosphocétolase). En fait Bifidobacterium permet de fermenter les hexoses en produisant plus d’acide acétique que d’acide lactique (rapport 3:2), de faible quantités d’éthanol et d’autres acides organiques. Cette fermentation « lactique » a conduit à les rapprocher du groupe des bactéries lactiques (Pilet M-F. et al., 2005). Leur température de croissance est comprise entre 37°C et 41°C. Ils sont isolés à partir de la flore intestinale du nouveau-né, on les retrouve aussi dans l’intestin de l’homme et de nombreuses espèces animales. Ils sont utilisés dans la fabrication du yaourt et produits laitiers fermentés (probiotiques). Leur présence entraînerait une protection contre les agents infectieux au niveau intestinal grâce à la présence d’un facteur bifidogène (Sondergaard, 2005). Figure (I) 8 : Morphologie en microscopie électronique de Bifidobacterium animalis Photo Sylviane Lemarinier (Université de Caen) 18 Revue de littérature 2.5 Méthodes d’identification des bactéries lactiques : Les bactéries lactiques ont de nombreuses propriétés métaboliques dont les industriels. Ces propriétés (technologiques, sensorielles antimicrobiennes ou probiotiques) sont spécifiques de l’espèce, ce qui implique qu’on puisse les mettre en évidence par des techniques d’identification et de différenciation. 2.5.1 Méthodes classiques : Les caractéristiques phénotypiques ont généralement servi de point de départ pour plusieurs tests sophistiqués et constituent la base de différenciation et d’identification des bactéries lactiques. Différents tests clefs sont largement adoptés. La morphologie ainsi que les méthodes physiologiques, métaboliques/biochimiques et chimiotaxonomiques sont les plus utilisées. Les méthodes physiologiques incluent principalement, la croissance à certaines températures, à certaines concentrations de NaCl, à différents pH. Les méthodes métaboliques/biochimiques incluent principalement, la production de CO2 en milieu glucosé le profil de fermentation de nombreux sucres, l’hydrolyse de l’arginine, de l’esculine et la détermination de l’isomère optique de l’acide lactique. Les méthodes chimiotaxonomiques incluent principalement, la détection de l’acide meso-diaminopimelique (mDAP) dans le peptidoglycane. Le Tableau (I) 5 présente les différentes caractéristiques de bactéries lactiques. Schillinger et Lücke (1987) ont été les premiers à proposer une clef d’identification des bactéries lactiques de la viande basée sur la comparaison des caractéristiques physiologiques et biochimiques typiques des différentes espèces (Ammor, 2004). Plus les méthodes mentionnés en dessus, il ya aussi la technique sérologique. pour les bactéries lactiques, l’analyse sérologique de fait principalement suivant la méthode de Lancefield (1933), basée sur l’utilisation de polysaccharides de l’enveloppe cellulaire en tant qu’antigènes (Curk et al., 1994). 19 Revue de littérature Pediococcus Streptococcus Tetragenococcus Weissella + - - - - - + - Production de gaz - ± - - - + - - - + Croissance à 10°C + ± + + + + ± - + + Croissance à 45°C - ± - + - - ± ± - - Croissance à 6.5% NaCl ND ± + + - ± ± - + ± Croissance à 18% NaCl - - - - - - - - + - Croissance à pH 4,4 ND ± - + ± ± + - - ± Croissance à pH 9,6 - - + + - - - - + - Acide lactique L D,L,DL L L L D L,DL L L D,DL Oenococcus Vagococcus Leuconostoc - Lactococcus - Lactobacillus Formation des tétrades caractéristiques Carnobacterium Enterococcus Coques Aerococcus Bacilles Tableau (I) 5 : Les différentes caractéristiques de bactéries lactiques (Axelsson, 2004) + : positif ; - : négatif ; ± : réponse variable selon les espèces ; ND : non déterminé. 2.5.2 Méthodes moléculaires : Les méthodes modernes d’identification des bactéries lactique font appel à l’étude des constituants des cellules. le séquençage de l’ARN 16S reste une des méthodes les plus appliquées pour obtenir une identification précise en complément des méthodes classiques. Cependant plusieurs méthodes d’identification par PCR, plus abordables en routine se sont développées pour l’identification des bactéries lactiques. Pour la différenciation intraspécifique, les différentes méthodes moléculaires, comme composition en base de l’ADN : G+C%, l’hybridation ADN/ADN et ADN/ARN, l’analyse des fragments de restriction de l’ADN par l’électrophorèse en champ pulsé (R-ECP), les profils protéiques par SDS-PAGE, sont généralement couplées et permettent l’analyse de la biodiversité des isolats dans un écosystème donné. 20 Revue de littérature 2.6 Bactéries lactiques et fermentation alimentaire : L’utilisation de la fermentation par l’Homme remonte à des temps très anciens. Les ferments lactiques, contenant une ou plusieurs cultures pures en proportions définies de différentes bactéries lactiques, sont largement utilisés en agroalimentaire (Holzapfel, 2002). Les bactéries lactiques interviennent dans de nombreuses transformations du lait (crème maturée, laits fermentés comme le yaourt, fromages frais et affinés), mais également dans la vinification (fermentation malolactique), la fabrication des salaisons, la fermentation des végétaux (choucroute et ensilages) et en boulangerie traditionnelle (Desmazeaud, 1998). Les bactéries lactiques ont plusieurs rôles dans la production de produits fermentés. Tout d’abord, les bactéries lactiques (BL) vont permettre de changer la saveur de l’aliment et sa texture. Ces changements sont dus notamment à l’acide lactique produit au cours de la croissance. D’autre part, les BL produisent des peptides et des molécules comme l’acétoine, l’acétaldéhyde, le diacétyle ou l’éthanol qui sont importants pour la flaveur des aliments (Tableau(I) 6). Genre Substrat Exemples de produits Bifidobacterium Lactobacillus lait lait viande végétaux céréales lait Végétaux lait végétaux viande végétaux lait laits fermentés yaourts, laits fermentés, kéfirs, fromages saucissons secs, jambons secs choucroute, olives, "yaourts" au lait de soja pain au levain, bières fromages, kéfirs choucroute, olives, vin fromages, kéfirs choucroute saucisses semi-séchées vin yaourts, laits fermentés, fromages Lactococcus Leuconostoc Pediococcus Oenococcus Streptococcus Tableau (I) 6 : Principaux produits issus de la fermentation des bactéries lactiques (Penaud, 2006) Dans les produits laitiers, il s’agit du domaine d’application le plus courant des fermentations lactiques. Les ferments lactiques naturels ou commerciaux interviennent dans l’élaboration de tous les produits laitiers fermentés (Pilet et al., 2005), ces micro-organismes assurent plusieurs fonctions telles que la protéolyse pour donner aux fromages leurs caractères 21 Revue de littérature rhéologiques et la production d’agents épaississants pour améliorer la texture du fromage. Les bactéries lactiques sont souvent utilisées en association par exemple le yaourt est obtenu par deux espèces lactiques : Lb delbrueckii ssp. bulgaricus et Streptococcus thermophilus. Dans les produits carnés, les bactéries lactiques améliorent la qualité hygiénique et marchande en réduisant d’avantage les risques de croissance de microorganismes indésirables. Les bactéries lactiques interviennent aussi dans la préparation de nombreux produits végétaux fermentés. L’exemple le plus connu est la choucroute, elle fait intervenir quatre espèces lactiques : Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis et Pediococcus damnosus. 2.7 Bactéries lactiques et santé humaine : Dans le domaine de la santé, certaines bactéries lactiques spécifiques sont utilisées comme probiotiques c'est-à-dire des micro-organismes vivants dont l’application à l’homme ou à l’animal exercent un effet bénéfique sur ce dernier par amélioration des propriétés de la flore intestinale. Les espèces couramment utilisées sont Lb. Acidophilus, Lb. casei, Lb. johnsonii, Lb. reuteri, Lb. delbruecki, subsp bulgaricus (Salminen et al., 2004). Les souches lactiques sont également utilisées dans le traitement de certaines affections telles que les diarrhées, les allergies alimentaires. D’autres effets, comme la prévention des gastro-entérites nosocomiales chez le nourisson, des propriétés anticancérigènes, antihypercholestérolémiques, lutte contre Clostridium difficile et Helicobacter pylori, prévention des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. 2.8 Les propriétés antimicrobiennes des bactéries lactiques : On reconnait depuis longtemps, aux bactéries lactiques, la propriété de produire des substances antibactériennes leur permettant de se développer préférentiellement dans divers écosystèmes. L’activité antagoniste des bactéries lactiques est due aux métabolites excrétés : l’acide lactique et autre acides organiques, peroxyde d’hydrogène, diacétyl, reutérine et les bactériocines (Leveau et al., 1991 ; Klaenhammer et al., 1994 ; De Vuyst et Leroy, 2007). 2.8.1 Les acides organiques : Le métabolisme principal des bactéries lactiques a pour effet une production importante des acides organiques. Les acides organiques sont produits soit par les bactéries homofermentaire, soit par les bactéries hétérofermentaire. Le métabolisme du pyruvate conduit à la formation 22 Revue de littérature uniquement d’acide lactique chez les homofermentaires tandis qu’il conduit à la formation d’acide lactique, acétique et formique, d’éthanol et de dioxyde de carbone chez les hétérofermentaires (Liu, 2003). En général, la production d'acides organiques permet une acidification du milieu qui peut limiter la croissance de certaines bactéries entre autres les bactéries indésirables et pathogène. Ainsi, les acides organiques ont différentes actions telles qu'un excellent pouvoir bactéricide ou un effet bactériostatique contre les micro-organismes pathogènes se trouvant dans le tube digestif. Les acides organiques sont un des agents classiques de préservation des aliments (Brul et Coote, 1999) et sont reconnus comme des additifs alimentaires. 2.8.2 Le peroxyde d’hydrogène : L’intervention du peroxyde d’hydrogène dans les phénomènes d’inhibition par les bactéries lactiques a été établie. en 1951 Wheater et al., mettent en évidence l’inhibition de Staphylococcus aureus par Lactobacillus lactis et l’attribuent à une « lactobacilline ». Dés 1952 ils montent que l’agent inhibiteur est en fait le peroxyde d’hydrogène produit par le lactobacille (Mathot et al., 1996). Les bactéries lactiques sont catalase négatives et certaines souches peuvent accumuler du peroxyde d’hydrogène (H2O2) essentiellement par le métabolisme aérobie ou en microaérobiose des glucides. Le peroxyde d’hydrogène est, depuis lontemps, reconnu comme un agent majeur de l’activité antimicrobienne des bactéries lactiques en particulier celle des lactobacilles. Il peut s’accumuler et être inhibiteur de différents micro-organismes par l’oxydation des lipides membranaires et la destruction des structures des protéines cellulaires (Zalan et al., 2005). En plus de son effet bactéricide direct, le peroxyde d’hydrogène active le système lactoperoxydase-thyocynate présent dans le lait des mammifères, et génère par oxydation deux puissants inhibiteurs microbiens, à savoir l’hypothyocyanate(OSCN) et l’acide hypothyocyaneux (HOSCN). D’un point de vue pratique, ce système agit contre les germes psychotrophes, en permettant un report appréciable de la date limite de vente du lait cru ; il permet aussi d’inhiber les germes pathogènes potentiellement présents dans des aliments 23 Revue de littérature 2.8.3 Le dioxyde de carbone : Celui-ci est formé pendant la fermentation hétérolactique et crée un environnement anaérobie qui inhibe les microorganismes aérobies. L’accumulation de dioxyde de carbone dans la bicouche lipidique peut causer un dysfonctionnement de la perméabilité (Ammor et al., 2006). Ainsi le CO2 peut effectivement inhiber la croissance de nombreux germes d’altération et essentiellement les germes psychrotrophes à Gram négatif. 2.8.4 Le diacétyl : Le diacétyl produit par nombre de bactéries lactiques est un inhibiteur actif contre de nombreux microorganismes, bactéries ou moisissures. Le diacétyl (C4H6O2) est un des composants aromatiques essentiels du beurre. L’action inhibitrice est accue en milieu acide, les bactéries Gram-négatives sont plus sensibles que les bactéries Gram-positives ((Mathot et al., 1996). Les concentrations nécessaires à l’obtention d’une inhibition sont de l’ordre de 100 ppm, et sont supérieures à celles présentes dans le beurre et susceptibles de provoquer son arôme (2 à 7 ppm) (Caplice et Fitzgerald, 1999). 2.8.5 La reutérine : Axelsson et al., (1989) ont mis en évidence l’action inhibitrice d’une substance produite par Lactobacillus reuteri. Cette substance (reutérine) a été purifiée et identifiée. La reutérine (ou 3-hydroxypropionaldehyde) est une substance antimicrobienne qui est produite comme métabolite intermédiaire pendant la fermentation anaérobique du glycérol. La reutérine a un large spectre d’activité. Elle a une action contre les procaryotes (Gram-positif ou Gram-négatif), les eucaryotes, les virus, les champignons et les protozoaires. Elle interfère avec la réplication de l’ADN. Elle a des applications aussi bien dans le domaine médical que dans le domaine alimentaire (Vollenweider, 2004). Figure (I) 9 : Structure de la reutérine, 3-hydroxypropanal (Axelsson, 2004). 24 Revue de littérature 2.8.6 Les bactériocines : La détection de la première bactériocine remonte à 1925 par André Gratia qui a observé que la croissance de certaines souches d'Escherichia coli a été inhibée en présence d'un composé antibactérien, dont il a donné le nom de colicin V. La découverte d'une bactériocine chez les lactocoques remonte à 1933. À cette époque, Whitehead (1933) avait observé dans un lot de lait spécifique que la présence de deux souches de lactocoques inhibait la croissance d'un ferment de culture fromagère. En 1953, Jacob et al. proposèrent le terme général « bactériocine ». Les bactériocines diffèrent de la plupart des antibiotiques thérapeutiques par leur composition protéique et possèdent généralement une spécificité d'action étroite contre les mêmes espèces (Tagg et al., 1976). Différentes définitions des bactériocines ont été données au cours du temps. Cependant, la définition qui reste la plus largement acceptée est celle de Klaenhammer (1988) qui définit les bactériocines comme des protéines, ou complexes de protéines, avec une activité bactéricide contre des espèces proches de la souche productrice. Les bactériocines représentent une large classe de substances antagonistes qui varient considérablement du point de vue de leur poids moléculaire, de leurs propriétés biochimiques, de leur spectre d’action et de leur mode d’action (Klaenhammer, 1988). Toutes les bactériocines produites par des bactéries lactiques décrites jusqu’à présent ont une activité dirigée contre les bactéries Gram-positive. Aucune bactériocine produite par des bactéries lactiques avec une activité contre des bactéries Gram-négatif n’a été décrite. En effet, la membrane externe des bactéries Gram-négatif ne permet pas aux bactériocines d’atteindre la membrane interne, siège de leur activité. 2.8.6.1 Classification des bactériocines : On trouve des souches productrices de bactériocines chez tous les genres de bactéries lactiques. Le nombre de bactériocines des bactéries lactiques caractérisées a augmenté de façon exponentielle depuis une dizaine d'années en raison de l'intérêt tant fondamental qu'appliqué qu'elles suscitent. D'après (Klaenhammer, 1993), leur structure primaire a permis de définir une classification en quatre classes : Classe I - Les lantibiotiques : Il s’agit de peptides de taille réduite (< à 5 kD), contenant des acides aminés inhabituels obtenus par modification post-traductionnellement dont le plus caractéristique est la 25 Revue de littérature lanthionine (Morisser et al., 2005). Les lantibiotiques sont stables à la chaleur. Ils peuvent être divisés en deux types : la classe Ia qui contient des peptides cationiques hydrophobes allongés contenant jusqu’à 34 acides aminés et la classe Ib qui contient les peptides globulaires chargés négativement ou sans charge nette et contenant jusqu’à 19 acides aminés. (Mc Auliffe et Hill, 2001; Twomey et al., 2002). La nisine, la subtiline, la duramycine ainsi que la cytolysine L1 sont des exemples de lantibiotiques . Figure (I) 10 : Séquence et structure de lantibiotiques de type A (nisin) et B (mersacidin) (Dortu et Thonart, 2009) Classe II : La classe II est caractérisée par des petits peptides (< 10 kDa). Ces peptides demeurent également stables après un traitement à la chaleur et sans modification post-traductionnelle. Ces peptides sont le plus souvent produits sous forme de prépeptides dont leader N-terminal sera clivé au niveau d’un doublet glycine. Cette classe est divisée en trois sous classes. Sous classe IIa Bactériocine active contre les espèces de Listeria monocytogenes (Cenatiempo et al., 1996 ; Axelsson, 2004). Ils contiennent entre 27 et 48 acides aminés et ont toutes une partie N-terminale hydrophobe contenant la séquence consensus YGNGV ainsi qu’un pont disulfure et une partie C-terminale moins conservée, hydrophobe ou amphiphile qui détermine la spécificité d’action (Fimland et al., 2000 ; Richard et al., 2006). Ces bactériocines semblent par ailleurs avoir une meilleure activité antimicrobienne, un spectre d’action plus large et une meilleure résistance à l’exposition à des hautes températures (Fimland et al., 2000 ; Drider et al., 2006 ; Richard et al., 2006). 26 Revue de littérature Tableau (I) 7 : Liste non exhaustive et séquences de bactériocines appartenant à la classe II (Dortu et Thonart, 2009) Sous classe IIb correspond à des bactériocines à deux composants. Ont pour trait commun la nécessité de la mise en commun de plusieurs petits peptides aboutissant à un ensemble biologiquement actif. Entrent dans cette catégorie diverses lactococcines, plantaricines ou encore la lactacine F (Allison et al, 1994). Sous classe IIc Peptides thiol-actives requérant la réduction du résidu cystéine pour être actif. Les bactériocines de classe II n’appartenant pas aux sous-classes IIa et IIb seront considérées comme étant de sou-classe IIc. Classe III : Les bactériocines de classe III sont caractérisées par leu grande taille. Il s’agit de protéines dont la masse est supérieur à 30 kDa et thermosensible. Ils sont en effet détruits par un chauffage de 10 à 15 min à 60°C. 27 Revue de littérature La plupart d’entre elles sont produites principalement par des souches de lactobacilles. l’helveticin J produite par Lactobacillus helveticus A, l’enterolysin A produite par Enterococcus faecium, la zoocin A produite par Spreptococcus zooepidemicus et la millericin B produite par Streptococcus milleri (Nilsen et al., 2003 ; Papagianni, 2003 ; Nigutova et al., 2007). Tableau (I) 8 : Liste des bactériocines appartenant à la classe III (Klaenhammer, 1993; Riley et Wertz, 2002) Classe IV : Englobe les bactériocines qui nécessitent une partie non protéique pour être active. Cette quatrième classe, comportant des bactériocines complexes qui exigent des carbohydrates ou des fractions lipidiques pour leur activité biologique (Morisset et al., 2005 ; Savadogo et al., 2006). Les bactériocines de classe IV présentée par Klaenhammer (1993) a été contestée par la suite par de nombreux auteurs, puisque aucun de ces peptides n’a été copurifié avec sa partie glucidique ou lipidique (Nes et al., 1996) 2.8.6.2 La production des bactériocines et sa régulation : Différentes protéines sont impliquées dans la production des bactériocines et sa régulation. Les bactériocines sont produites sous forme d’un prépeptide non-biologiquement actif qui subira des modifications post-traductionnelles pour aboutir au peptide actif. Cette production est souvent régulée par un système de Quorum Sensing, un mécanisme permettant à certains gènes d’être exprimés en fonction de la densité de la population bactérienne (Dortu, 2008). L'ensemble des déterminants génétiques responsables de la production d'une bactériocine sont en général trouvés au voisinage les uns des autres groupés en une ou plusieurs unités 28 Revue de littérature transcriptionnelles. Elles sont portées par des éléments génétiques mobiles (transposons, plasmides) et exceptionnellement localisées sur le chromosome bactérien (Cenatiempo et al., 1996). 2.8.6.3 Les mécanismes d’action des bactériocines : Toutes les bactériocines de bactéries lactiques, dont le mode d'action a été étudié, paraissent agir de façon similaire en formant des pores dans la membrane plasmique des cellules cibles. La formation des pores dans la membrane cytoplasmique va causer l’efflux rapide de petits composés cytoplasmiques tels que les ions, les acides aminés, l’ATP… (Montville et al., 1995 ; Dortu et Thonart, 2009) qui aura pour conséquence de perturber le potentiel transmembranaire et le gradient de pH, à la cessation rapide des activités cellulaires et à la mort de la cellule. Certaines bactériocines, comme la nisine (lantibiotiques), n'ont pas de récepteur spécifique. En effet, la nisine semble se lier aux lipides et phospholipides cationiques présents à la surface de la cellule (Rink et al., 2005; Moll et al. 1999). Par contre, il semblerait que pour les lactococcines A, B et M. l'initiation de la formation de pores nécessite la présence d'un récepteur spécifique qui permet la fixation de la bactériocine à la membrane cellulaire (van Belkum et al., 1991). De plus, certaines bactériocines, telles que, la bactériocine J46 dont l’activité dépend de la présence d'une force proton motrice sur la membrane pour pouvoir s'y lier. Certaines bactériocines ne sont pas actives à pH 7 et donc une activité due à la production d’une bactériocine pourrait être considérée comme étant due à la production d’acide (Klaenhammer, 1993). Gravesen et al., (2002) ont examiné la résistance de Listeria monocytogenes à la classe II des bactériocines et ont trouvés un rapport avec le site spécifique de reconnaissance. Huit mutants de L. monocytogenes résistants aux bactériocines de la classe IIa, tel que la pediocine PA-1 et la leucocine A, ont été isolés et étudiés. La lacticine 3147 est un lantibiotique constitué de 2 composants, 2 peptides appelés lac 1 et lac 2 (McAuliffe et al., 1998); les deux composants sont nécessaire pour exercer une activité antagoniste complète résultant de la formation de pores ioniques spécifiques dans la membrane de la cellules gram positive cible. McAuliffe et al., (2000) ont démontrés que la lacticine 3147 exige une enzyme de modification séparée pour chacun des prepeptides lac1 et lac2. 29 Revue de littérature Figure (I) 11 : Mode d’action des bactériocines de bactéries lactiques (Paul et al., 2005) 2.8.6.4 Spectre d’activité des bactériocines : Les bactériocines peuvent être produites par la plupart des espèces de bactéries lactiques et leur spectre d'activité est restreint en général aux bactéries taxonomiquement proches du microorganisme producteur (Piard et Desmazeaud, 1992). La plupart des bactériocines de la classe I, ont un spectre d'activité relativement large, touchant à la fois à des bactéries lactiques elles-mêmes mais aussi des espèces pathogènes, tel que Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, et Clostridium botulinum. Plusieurs bactériocines dans cette classe, tel que la nisine et la thermophiline 13, empêchent la germination des spores de Bacillus cereus et Clostridium botulinum. La plantaricine LP84 (produite par Lactobacillus plantarum NCIM 2084) a montré un antagonisme contre Escherichia coli (Suma et al., 1998). La plupart des bactériocines de la clase IIa, ont des spectres d'activité étroits et inhibent seulement des bactéries gram positif apparentées. En général, les membres du genre Enterococcus, Lactobacillus, Pediococcus sont sensibles à cette classe IIa, et les membres du genre Lactococcus sont résistants. 30 Revue de littérature Quelques unes des bactériocines IIa, tel que la pediocine PA-1, ayant des spectres inhibiteurs assez large et pouvant inhiber des bactéries, tel que S. aureus et des cellules végétatives de Clostridium sp. et de Bacillus sp. Quelques bactériocines de la classe IIa, tel que la mundticine produite par Enterococcus mundtii, empêche la germination des spores de Clostridium botulinum. Les bactériocines de la classe IIa, sont généralement actives contre Listeria. Dans une comparaison directe, Il a été montré que la nisine a un spectre d’inhibition plus large contre Listeria monocytogenes que la pediocin PA-1 (Ennahar et al., 2000). Tableau (I) 9a : Indique les différentes classes de bactériocines I et IIa produiten par les bactéries lactiques et leur spectre d’activité (Chen et Hoover, 2003). 31 Revue de littérature Tableau (I) 9b : Indique les différentes classes de bactériocines I et IIa produiten par les bactéries lactiques et leur spectre d’activité (Chen et Hoover, 2003). 2.8.6.5 Les applications des bactériocines dans l’industrie alimentaire : Les bactériocines sont employées dans plusieurs domaines, leur utilisation dans le domaine alimentaire est devenue très intéressante grâce à leur potentiel d'assurer une sécurité microbienne et une bonne qualité du produit alimentaire. Leur spectre antimicrobien peut être large ou étroit, elles peuvent donc cibler sélectivement des bactéries pathogènes ou détériorantes sans inhiber les bactéries indispensables et ont un mode d’action bactéricide (Galvez et al., 2007). Les bactériocines produites par les bactéries lactiques, peuvent être 32 Revue de littérature considéré comme des conservateurs naturels ou biopreservateurs qui accomplissent ces exigences. Les bactériocines peuvent être appliquées sous un forme purifiée, semi-purifiée ou sous la forme d’une concentré obtenu après fermentation d’un substrat alimentaire. Les bactériocines purifiées ou semi-purifiées sont appliquées après production en fermenteur. Jusqu’à présent, seule la nisine, un lantibiotique, est acceptée comme additif alimentaire (E234) (Guinane et al., 2005). Les bactériocines peuvent également être appliquées sous la forme d’un concentré obtenu après fermentation par la souche productrice et atomisation d’un substrat alimentaire tel que le lait par exemple. Elle contiendra la bactériocine mais d’autres métabolites antimicrobiens tels que l’acide lactique. La pediocin est commercialisée sous cette forme sous le nom ALTA 2341. Un autre mode d’application des bactériocines, des emballages en polyéthylène ou d’autres films plastiques contenant des bactériocines ont été développés. Ces emballages permettent de réduire la croissance des microorganismes pathogènes ou indésirables pouvant se développer en surface durant la conservation du produit (Luchansky et Call, 2004 ; Ghalfi et al., 2006 ; Galvez et al., 2007). Les bactéries productrices peuvent également être appliquées dans les produits alimentaires, peuvent être ajoutées comme starter dans des produits fermentés ou comme culture protectrice. Elles doivent être capables de croître et de produire des bactériocines dans l’aliment à conserver. La combinaison de différentes bactériocines permet d’augmenter l’activité et le spectre d’action, tout particulièrement en combinant des bactériocines appartenant à des classes différentes (Vignolo et al., 2000). La combinaison des bactériocines avec d’autres traitements de conservation chimique ou physique donne des résultats prometteurs pour la conservation des aliments. 33 II. MATERIEL & METHODES Matériel et méthodes Objectif du travail Notre étude répond à trois objectifs : Isolement et identification de souches lactiques à partir de laits crus de chèvre et de vache collectés dans la région de l’Ouest Algérien. Sélection des souches lactiques productrices des substances antibactériennes. Rechercher la nature des substances inhibitrices. 34 Matériel et méthodes 1. Provenance des échantillons : Les échantillons de laits crus de vache et de chèvre proviennent de la région Ouest Algérien (Oran), ils sont prélevés auprès des éleveurs, et cela dans deux fermes différentes : - Lait de chèvre : ferme situé aux amandiers - Lait de vache : ferme situé à Messereguine Les mamelles sont lavées avec l’eau savonneuse puis rinçage à l’eau javellisée. Les échantillons du lait (100 ml) sont recueillis dans des flacons de 250 ml stériles. Les échantillons de lait sont conservés à 4°C et transportés au laboratoire où ils sont analysés. 2. Souches utilisées 2.1 Souches pathogènes : Pour les tests d’activité antibactérienne, nous avons choisi trois micro-organismes pathogènes : Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27883, ces bactéries sont des souches de références de la collection du laboratoire d’analyses médicales de l’Hôpital Universitaire d’Oran. ATCC: American Type Culture Collection 2.2 Souches de référence : Deux souches de bactéries lactiques : Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus CNRZ 449 et Streptococcus thermophilus CNRZ 447. Ces souches provenaient de CIRM-BIA de Rennes INRA (France). 3. Isolement et culture de la flore lactique : Après coagulation de l’échantillon de lait qui est réparti en deux tubes, le premier tube est incubé à 30°C et le deuxième à 45°C, Des dilutions décimales (10-1 à 10-9) de la suspension mère sont réalisées à l'aide de milieu de dilution (peptone-sel) (voir annexe) et 1ml de chaque dilution est ensemencé dans la masse des milieux gélosés suivant : 35 Matériel et méthodes Milieux d’isolement bactéries T°C/durée Incubation MRS (Man et al., 1960) M17 (Terzaghi et Sandine, 1975) Elliker (Elliker, 1956) MSE (Mayeux et al., 1962) M17 (Terzaghi et Sandine, 1975) Lactobacilles 37/24h-72h Anaerobiose Streptocoques lactiques Lactocoques 45/24h-72h Aerobiose 30/48h-72h Aerobiose Leuconostocs 30/48h-72h Aerobiose Pediocoques 30/48h-72h Aerobiose Tableau(II) 1 : Milieux l’isolement des bactéries lactiques (Badis et al, 2004) T°C : température optimale de croissance 4. Purification et conservation des souches : Seules les bactéries à Gram positif et catalase négative ont été retenues. Pour chaque échantillon, 5 à 10 colonies sont prélevées sur les milieux MRS ou M17 et repiquées sur milieu MRS ou M17. Après purification, les souches sont conservées par deux méthodes : - Conservation de courte durée : les souches pures étaient ensemencées dans des tubes de gélose inclinée, après l’incubation à 30°C, les tubes sont placés à +4°C et le renouvellement des souches se fait toutes les 4 semaines. - Conservation de longue durée : les cellules des isolats purifiés sont congelée à -20°C dans un milieu contenant 70% de lait écrémé (enrichi par 0.05 % d’extrait de levure) et 30% de glycérol (Samelis et al., 1994) après la centrifugation à 3000 tr/min pendant 10min . La culture peut être conservée plusieurs mois. 5. Identification des isolats : 5.1 Critères morphologiques : 5.1.1 Caractérisation macroscopique : L’examen macroscopique est portée sur l’observation macroscopique qui permet de décrire l’aspect des colonies (la forme, taille, pigmentation contour, viscosité…) 5.1.2 Caractérisation microscopique : La coloration de Gram a été utilisée pour classer les bactéries selon leur Gram, leur morphologie et leur mode d’association Les bactéries Gram positives et catalase négatives sont présumées des bactéries lactiques. 36 Matériel et méthodes à 45°C Incubation (l’enrichissement) à 30°C Echantillon de lait cru Dilution décimale 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Milieu de dilution (peptone-sel) 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Recherche: Lactobacilles MRS Incubation à 37°C Recherche: Streptocoques M17 Lecture des résultats Incubation à 45°C Recherche: Lactocoques Elliker Incubation à 30°C Recherche: Leuconostocs MSE Incubation à 30°C Purification et conservation Identification Figure(II) 1 : Protocole d’isolement des souches lactiques 37 Matériel et méthodes 5.2 Critères physiologiques et biochimiques : 5.2.1 Test de la catalase : le test catalase sert à démontrer si la bactérie possède l’enzyme catalase servant à décomposer le peroxyde d’hydrogène. L’activité catalytique consiste à prélever une colonie sur gélose MRS ou M17 et dissociée dans une goutte d'eau oxygénée (H2O2) à 10 volumes; l’apparition de bulles révélant le dégagement d'oxygène (Ahmed et Irene, 2007). 5.2.2 Croissance à différentes températures : Ce test est important car il permet de distinguer les bactéries lactiques mésophiles des bactéries lactiques thermophiles (Leveau et al., 1991). L’aptitude à la culture est testée à : 37°C et 45°C (lactobacilles) sur milieu MRS (Man et al., 1960) 37°C (leuconostocs) sur milieu MRS 45°C (streptocoques, lactocoques et enterocoques) sur milieu M17 (Terzaghi et Sandine, 1975) La croissance est appréciée par l’apparition de trouble. 5.2.3 Type fermentaire : Ce test permet de classer les bactéries en hétérofermentaire ou homofermentaire. Il est effectué dans un milieu dépourvu de citrate pour éviter la formation de CO 2 liée à ce métabolisme particulier (Dicks et Van Vuuren, 1987). On Ensemence abondamment un tube de 10 ml de bouillon MRS (sans citrate) ou M17 dans le milieu on introduit une cloche de Durham, le CO2 dégagé par les bactéries hétérofermentaires s’accumule dans la cloche après l’incubation à 30°C pendant 24 à 48 h. 5.2.4 Croissance dans des conditions hostiles : Ce test est réalisé pour la caractérisation les lactocoques des enterocoques (Schleifer et al., 1985 ; Hardie et Whiley, 1995; Stiles et Holzapfel, 1997) 5.2.4.1 La culture à pH 9,6 et celle en présence de NaCl : 4% , 6,5%: Un milieu hypersalé à différentes concentration de NaCl (4% et 6,5%) et le milieu MRS alcalinisé à pH 9,6 sont ensemencées et incubées à 30°C pendant 2à 3 jours. On apprécie la croissance par apparition d’un trouble. 38 Matériel et méthodes 5.2.4.2 Croissance sur le lait bleu de Sherman (1937) : Tester le développement en présence 1% et 3% de bleu de méthylène. Du lait écrémé additionné de 0,1% et/ou 0,3% de bleu de méthylène (1ml de solution à 1% et/ou 3% par tube de 9ml de lait) est ensemencé et incubé durant une période de 24 à 48h à 30°C. Lactococcus lactis est capable de pousser en présence de 0,3% de bleu de méthylène (Leveau et al., 1991). 5.2.5 La thermorésistance : La thermorésistance est réalisée pour les cocci, un chauffage du milieu à une température de 60°C pendant 30 min (Stiles et Holzapfel, 1997; Teuber et Geis, 2006) est testé en utilisant le milieu M17 liquide et mettre à l’étude 24h à 30°C. Le chauffage est réalisé dans un bain-marie. 5.2.6 Hydrolyse de l’arginine (ADH) : Elle est mise en évidence sur un milieu de Moëller (Moëller, 1955; Harrigan et McCance, 1976), pour chaque souche isolée ensemencé ; un tube de bouillon Moëller arginine et un tube témoin (Moëller sans arginine) recouvrir le milieu avec 4 à 5 mm d’huile de paraffine (V/V) stérilisé. Après 2 à 6 jours d’incubation à 30°C la culture dans le tube témoin se manifeste par un virage au jaune dû à l'acidification du milieu (métabolisme du glucose) (Larpent-Gourgaud et al., 1997; Carr et al., 2002). La dégradation de l’arginine aboutissant à la formation d’ammoniaque est révélée par alcalinisation du milieu qui devient violet. 5.2.7 Hydrolyse de l’esculine : L’hydrolyse de cet hétéroside est mise en évidence sur le milieu gélosé à l’esculine (Devoyod et Poullain, 1988; Larpent-Gourgaud et al., 1997), inoculer le milieu à partir d’une culture de 24h. Après une incubation à 30°C pendant 24h à 48h, Une réaction positive se traduit par un noircissement du milieu dû aux sels ferriques soluble et l’esculétine. Pour les bactéries négatives, le milieu reste inchangé mais il ya croissance. 5.2.8 Production d’acétoїne : La recherche de l’acétoïne est testée par la réaction de Voges Proskauer (VP) (Harrigan et McCance, 1976; Zourari et al., 1991; Facklam et Elliot, 1995) après une culture de 24h à 30°C sur milieu Clark et Lubs (annexe). 39 Matériel et méthodes Ajouter 5 gouttes du réactif VP1 (solution de soude NaOH à 16% dans l’eau distillée) et le même volume du réactif VP2 (alpha-naphtol à 6% dans l’alcool à 95°). Agiter soigneusement les tubes et attendre un temps maximum de 10 min. La présence d'acétoïne se traduit par une coloration rose en surface mais pouvant diffuser dans tout le milieu. 5.2.9 Utilisation du citrate : Utilisation du citrate est détectée sur le milieu Kempler et Mc Kay (1980). Après l’incubation à 30°C pendant 24h à 48h, les colonies qui fermentent le citrate sont des colonies bleues ou ayant un centre bleu (Citr+). Les colonies incapables de fermenter le citrate restent blanches (Citr-). 5.2.10 Production de CO2 à partir du citrate : Cette recherche est faite en inoculant la souche dans un tube (10,5ml) de lait écrémé stérile 10%, ajouter 0,5ml d’une solution de citrate de sodium stérile (10%) et verser environ 4ml de gélose blanche (1,5%) elle-même stérilisée. La décomposition du citrate se manifeste par la production de gaz dans la masse du milieu en trois à cinq jours d’incubation à 30°C (Harrigan et McCance, 1976; Leveau et al., 1991). La production de gaz chez les leuconostocs et Lactococcus lactis ssp biovar diacétylactis se traduit par la fragmentation de la gélose dans le tube (Larpent-Gourgaud et al., 1997). 5.2.11 Fermentation des hydrates de carbones : Il s’agit d’apprécier l’aptitude des souches à métaboliser divers substrats carbonés en particulier les sucres. Ce test est réalisé en galeries classiques de tubes sur bouillon MRS sans extrait de viande et sans citrate (MRSc-ev) selon Leveau et al., (1991) additionné d’un indicateur de pH (pourpre de bromocrésol à 0.05 g/l), le glucose du milieu MRS est remplacé par l’hydrate de carbone à tester, les solutions de sucres (mannitol, dextrine, raffinose, xylose, maltose, galactose, fructose, inositol, rhamnose, glucose, lactose, saccharose, arabinose) sont stérilisées par tyndallisation après ils ont introduit dans le milieu avec une concentration finale de 1%. Une culture bactérienne de 24h est centrifugée à 3000 tr/min pendant 10min, le culot est rincé 2 fois à l’eau physiologique stérile, une suspension est réalisé avec l’eau physiologique. 0,1 ml de cette suspension est ensemencé dans 2ml du MRSc-ev-BCP-sucre recouvrir avec une couche mince d’huile de paraffine (V/V) stérilisé (Samelis et al., 1994). 40 Matériel et méthodes Après incubation pendant 48h à 72h le développement de la culture et le virage au jaune de l’indicateur coloré dû à l’acidification du milieu traduit la fermentation du sucre. Culture bactérienne de 24h Milieu MRS Sans extrait de viande Sans citrate Centrifugation 3000 tr/min pendant 10min MRSc-ev + Pourpre de bromocrésol 2 fois rinçage du culot MRSc-ev-BCP Suspension culot + eau physiologique + Solution de sucre 0,1 ml Milieu MRSc-ev-BCP-sucre Recouvrir avec 4 à 5 mm d’huile de paraffine Incubation 48h à 72h virage au jaune de l’indicateur fermentation du sucre Figure(II) 2 : protocole de la fermentation des hydrates de carbones. 41 Matériel et méthodes 5.2.12 Identification par la galerie API 50CHL : Les galeries API 50 CHL (Biomérieux, REF 50 300, France) permettent une identification des bactéries lactiques au niveau de l’espèce et même parfois de la sous-espèce sur la base de la fermentation de 49 sucres différents. La galerie API 50 CHL est constituée de 50 microtubes permettant l’étude de la fermentation de substrat, appartenant à la famille des hydrates de carbone et dérivés (hétérosides, polyalcools, acides uroniques). Préparation des galeries : Chaque galerie est constituée de 5 bandes comprenant chacune 10 tubes numérotés. Préparer une boite d’incubation (fond et couvercle) Inscrire la référence de la souche sur la languette latérale de la boite. Répartir environ 10 ml d’eau distillée ou déminéralisée dans les alvéoles du fond pour créer une atmosphère humide. Sortir les bandes de leur embalage, séparer en deux les bandes 0-19 et 20-39 et les déposer dans le fond de la boite d’incubation. Compléter la galerie avec la bande 40- 49 Préparation de l’inoculum : Cultiver les bactéries sur un milieu adapté à sa croissance Après 24 h d’incubation, la culture est récupérée par centrifugation à 3100 tr/mn pendant 10 mn, le culot est rincé 2 fois à l’eau physiologique stérile. Préparer l’inoculum dans le milieu de l’API 50 CHL. Inoculation des galeries : Répartir la suspension bactérienne à l’aide d’une pipette stérile dans les 50 tubes de la galerie en se conformant aux précautions suivantes : Incliner légèrement vers l’avant la boite d’incubation. Eviter la formation de bulles en posant la pointe de la pipette sur le coté de la cupule. Lorsque les tubes doit être inoculés, les cupules sont remplie avec de l’huile de paraffine stérile. Incuber les galeries à la température optimum de croissance de bactéries étudiées. 42 Matériel et méthodes Durant la période d’incubation, la fermentation des sucres est indiquée par une couleur jaune exceptée pour l’esculine (brun foncé). Les résultats sont lus à 24 h et vérifiés après 48 h d’incubation. L’interprétation des résultats peut se faire par le logiciel Api Web (BioMérieux) pour identifier les bactéries lactiques. 5.2.13 Production de dextrane : Appliqué pour les isolats de Leuconostoc (Carr et al., 2002; König et Fröhlich, 2009), les souches à tester sont ensemencées sur la gélose MSE (Mayeux et al., 1962), après incubation à 30°C pendant 48h les colonies sont muqueuses brillantes d’une pellicule opaque à la surface de la gélose. 5.2.14 Vancomycine-résistance : Seuls les isolats de genre Leuconostoc ont été testés pour la résistance à la vancomycine. Elle est mise en évidence par culture sur milieu MSE (Mayeux et al., 1962) gélosé à une concentration de vancomycine égale 200 µg/ml (Orberg et Sandine, 1984; Swenson et al., 1990) l’ensemencement est réalisé à la surface et les boites sont incubées à 30°C pendant 48h. 6. Etude de l’activité antibactérienne des souches : Cette étude est réalisée par deux méthodes : 6.1 Méthode de double couche (méthode de Fleming et al., 1975) : Pour mettre en évidence les zones d'inhibition, les souches lactiques ont été ensemencées en touche (à l’aide d’un inoculateur multipoint stérile) à la surface d’un milieu MRS ou M17 solide à partir d’une culture de 24h, les boites sont séchées sous la température ambiante pendant 2h. Après 24 h d’incubation chaque spot est recouvert avec une goutte de gélose nutritive maintenue en surfusion (50°C). Cela permet de fixer les colonies et d’éviter leur dispensions (Larpent-Gourgaud et al., 1997). Une couche de gélose moelle (0,7%) contenant 0,1 ml d’une culture en milieu liquide de 18h d’une souche indicatrice (pathogène), est coulée au-dessus de la première couche de gélose. La lecture des boites s’effectue après 24h d’incubation à 37°C en aérobiose, les souches présentant une zone transparente sont considérées comme productrices de substances antimicrobiennes. La taille des zones d’inhibition produites a été mesurée en mm. 43 Matériel et méthodes 6.2 Méthode des puits (méthode de Barefoot et Kaenhammer, 1983) : Cette méthode est réalisée sur les bactéries lactiques inhibitrices possédant les plus grande zones d’inhibition montrant la présence de substances inhibitrices, ces substances peuvent diffuser dans un milieu de culture solide. Les bactéries lactiques sont repiquées dans du milieu MRS ou M17 liquide et incubées pendant une période de 18h à 30°C. Après incubation une centrifugation réfrigérée (4°C) est réalisée à 4000 tr/min pendant 15 min. Des puits de 5 mm de diamètre sont creusés stérilement à l’aide d’un emporte-pièce (cloche de Durham) sur la gélose nutritive inoculé par la souche indicatrice (pathogène) et seront remplies avec 100 μL du surnageant de culture ou d’extrait cellulaire. Les boîtes de Petri sont mises à une température de +4°C/4h pour permettre la bonne diffusion de la substance antibactérienne (Doumandji et al., 2010). Les boites sont incubées à 37°C et la présence de zones d’inhibition formées autour des puits est examinée après 24h d’incubation (Hwanhlem et al., 2011). 6.3 Inhibition due à l’acide lactique : L’acide lactique est un facteur majeur dans les inhibitions. Ce test a pour but d’étudier l’effet de l’abaissement du pH sur le développement des souches indicatrices. Nous avons procédé selon la méthode de Fleming et al. (1975) sauf que nous avons utilisé le milieu MRS tamponnée à pH 6,1 (Larpent-Gourgaud et al., 1997) La lecture des boites s’effectue après 24h d’incubation à 37°C en aérobiose, la lecture des résultats se fait par comparaison au milieu témoin non tamponnée .La taille des zones d’inhibition produites a été mesurée en mm. 44 Matériel et méthodes Méthode de Fleming et al., 1975 Inoculateur multipoint Culture bactérienne Incubation 18h à 30°C Culture de 18h (bactérie lactique) Inoculation de 4 souches lactiques 0,1 ml Incubation 24h à 37°C Culture de 18h (bactérie pathogène) 7 ml de gélose moelle 7 ml de gélose moelle + souche indicatrice Zone d’inhibition Méthode de Barefoot et Kaenhammer, 1983 100 μl Centrifugation 4°C à 4000 tr 100 μl surnageant de la culture bactérienne Surnageant pd 15 min Culot Culture de 18h (bactérie lactique) Incubation 24h Zone d’inhibition Gélose nutritive contenant la souche indicatrice à 37°C Figure(II) 3 : Les différentes méthodes utilisées pour la recherche de substances antimicrobienne. 45 Matériel et méthodes 6.4 Etude de l’évolution de la croissance en culture mixte : Cette étude est réalisée sur milieu lait écrémé (10%). L’évolution de la croissance des bactéries pathogènes (Staphylococcus aureus et Escherichia coli) a été faite en culture pure et culture mixte (présence de bactéries lactiques inhibitrices) Une culture de 18h de la souche Ln7, Staphylococcus aureus et Escherichia coli sont d’abord pré-incubés sur milieu lait à 30°C pendant 18h. Des tubes contenant 10 ml de lait écrémé sont ensemencés à raison de 3% à partir de la culture de pré-incubation. Ils sont ensuite incubés à une température de 30°C. La première série reçoit la souche lactique Ln7, la deuxième une culture pure de Staphylococcus aureus, la troisième Escherichia coli et la quatrième représente la culture mixte la souche lactique Ln7 et les bactéries pathogènes (Staphylococcus aureus et Escherichia coli). La croissance est effectuée juste après l’ensemencement, puis chaque intervalle de temps suivant : 0h, 4h, 8h, 18h, 24h. Chaque heure d’incubation des comptages sur milieu solide sont effectués selon la méthode officielle (IFD) (Guessas, 2006). Des séries de dilutions des méthodes suivantes ont été utilisées pour : - Staphylococcus aureus : dénombrement sur milieu Chapman, incubation 24 h à 37°C - Escherichia coli : dénombrement sur milieu gélose nutritif, incubation 24 h à 37°C - La souche Ln7 : dénombrement sur milieu MRS, incubation 24 h à 30°C - Culture mixte : seules Staphylococcus aureus et Escherichia coli sont comptés. Tous les milieux ont été ensemencés à la surface de la gélose. 46 III. RESULTATS Résultats 1. Identification des isolats : Lors de cette étude nous avons identifié les souches isolées à partir du lait de vache et du lait de chèvre par les procédures phénotypiques conventionnelles basées sur les tests morphologiques, physiologiques et biochimiques. Les isolats Gram positif, catalases négatifs sont étudiées. 1.1 Critères morphologiques : L’examen macroscopique sur milieu solide MRS ou M17 montre des colonies circulaires, bombées et de couleur blanche, leur taille est d’environ 1mm à 2 mm de diamètre (Figure(III) 2), une deuxième forme de colonie irrégulière, érodée, de couleur crème et de 1 à 3 mm de diamètre (Figure(III) 2). L'aspect microscopique des souches après coloration de Gram a révélée deux formes de cellules : Coques et Bâtonnets. Les coques sont disposées en paires (diplocoques) ou en courtes chaînettes (Figure(III) 3), mais les bâtonnets présents des cellules associées en paires ou en courtes chaînettes (figure(III) 3). Tandis que la forme ovoïde est associée en paire ou en chainette. A B C D Figure(III) 1 : Aspect macroscopique sur milieu MRS des souches; Leuconostoc (A), Lactococcus (B), Lactobacillus (C) et Enterococcus (D) sur milieu M17 après 24h d’incubation. 47 Résultats A B C D Figure(III) 2 : Aspect des Colonies des souches sur milieu MRS Leuconostoc (A) et Lactobacillus (B), lactocoques(C) sur Elliker, Enterococcus (D) sur milieu M17 après 24h d’incubation (vue sous une loupe) A B C D Figure(III) 3 : Observation microscopique de la souche Lactobacillus (A), Leuconostoc (B), lactocoques (C) et Enterococcus (D) après coloration de Gram (G x100). 48 Résultats 1.2 Critères physiologiques et biochimiques : Un total de 53 isolats lactiques ont été rattachés à 4 groupes de bactéries avec leur pourcentage (Figure(III) 4) .Ces isolats ont été identifiés au stade du genre en se basant sur leurs caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiques. Lctobacillus Lactococcus Lactococcus 3,44% 13,79% Leuconostoc Enterococcus 8,33% Leuconostoc Enterococcus 45,83% 45,83% 20,68% Lait de chèvre 62,06% Lait de vache Figure(III) 4 : Distribution du pourcentage des isolats lactiques Les résultats des méthodes phénotypiques appliquées pour l’identification des souches sont regroupés dans le tableau(III) 1, tableau(III) 2 et tableau(III) 3 L’identification du genre est d’abord orientée par la morphologie, puis par le type fermentaire (production de CO à partir du glucose) et les conditions physiologiques de croissance (Pilet MF. et al., 2005) Genre Enterococcus : les résultats (Tableau(III) 3) des tests préliminaires montrent que les isolats appartenant au groupe d’Enterococcus 45,83% (lait de chèvre), 62,06% (lait de vache) sont homofermentaires, poussent dans le milieu 4% et 6.5% de NaCl (Figure(III) 5), peuvent aussi croitre à 1% de lait de Sherman et à pH 9,6. Toutes les souches du genre Enterococcus donnent des résultats positifs pour différents tests : croissance à 45°C, hydrolyse de l’arginine, thermorésistance, hydrolyse de l’esculine (voir Figure(III) 6), 49 Résultats S1 S3 S2 S4 Figure(III) 5 : Croissance en présence de 6.5% NaCl pour les souches S1, S2, S3 et S4 (Enterococcus). T L3 S5 L5 S8 S11 S2 S1 S3 S4 S3 S5 S S2 S3 A B S1 Figure(III) 6 : Croissance en milieu gélosé à l’esculine (A : en tubes, S4 B : en boite de pétri) après 24h d’incubation. S5 T : témoin, L3; L5; S5; S8 ; S11 : Enterococcus Genre Lactococcus : parmi les cocci on a des souches du genre Lactococcus qui sont homofermentaires, citrate positif, ADH positif, aucune croissance en présence de 4% et 6,5% de NaCl. Les souches L3, L5, L8, représentent une croissance variable en présence 6,5% de NaCl ; nous l’avons situé parmi le genre Lactococcus Parmi ce genre certaines souches sont acétoїne positif, d’autres sont incapable de produire l’acétoїne (montrer dans la Figure(III) 7), la majorité des souches n’ont produit 50 Résultats pas de CO2 à partir du citrate sauf les souches : L3, L8 (réaction faible) et la souche L11 : nous l’avons situé parmi l’espèce Lactococcus lactis subsp lactis biovar diacetylactis. Toutes les souches possèdent résultat négative pour la croissance dans 3% pour lait de Sherman (sauf la souche L5), mais les deux souches : L1 et L2 ne représentent aucune croissance dans 1% et 3% de lait de Sherman (Figure(III) 8) T L1 L2 L9 L11 Figure(III) 7 : Résultat de la recherche de l’acétoїne. T : témoin, L1; L2; L9; L11 : Lactococcus T L4 L5 L9 L2 Figure(III) 8 : Croissance en milieu lait de Sherman à 1%. T : témoin, L4; L5; L9; L2 : Lactococcus 51 Résultats Genre Leuconostoc : Les leuconostocs ont été déterminés comme Leuconostoc mesenteroides grâce ces souches produisent le dextrane (Figure(III) 9) Toutes les souches donnent des résultats positifs aux tests suivants : croissance à 37°C, résistent à 200 µg/ml de Vancomycine, ADH négatif, citrate positif (Figure(III) 11). Les souches de Leuconostocs sont hétérofermentaires (Figure(III) 10), acétoїne négatif, produisent le CO2 à partir du citrate (sauf Ln5, Ln6, Ln7, Ln8) (voir Figure(III) 11), esculine positif (sauf Ln12, Ln13, Ln14, Ln15, Ln16 et Ln17) Figure(III) 9 : Résultat de production de dextrane par la souche Ln16 (Leuconostoc) sur milieu MSE. L5 L6 Ln6 L7 Ln8 Ln10 Figure(III) 10 : Test de type fermentaire des souches : L5, L6, L7 (Lactococcus), Ln6, Ln8, Ln10 (Leuconostoc) 52 Résultats T Ln3 Ln12 Ln13 Ln15 Ln16 Figure(III) 11 : Résultat de la production du CO2 à partir du citrate. T : témoin, Ln3; Ln12; Ln13; Ln15; Ln16 : Leuconostoc Ln1 Ln2 Ln3 Ln8 Ln10 Ln7 Ln4 Ln5 Ln6 Lb1 Ln7 Ln8 Ln9 A B Figure(III) 12 : Résultat de test du citratase sur milieu KMK. A: méthode de mutipoint et B: la méthode des stries. Ln1; Ln2; Ln3; Ln4; Ln5; Ln6; Ln7; Ln8; Ln9; Ln10: Leuconostoc (cit+) Lb1: Lactobacillus (cit-) 53 Résultats Genre Lactobacillus : La forme bâtonnets est représentée par le genre Lactobacillus, on a trouvé une seule souche Lb1 qui possède les caractéristiques suivantes : homofermentaire, pousse à 45°C, ADH négatif (Figure(III) 13), esculine positif. T Lb1 S21 S22 S23 Figure(III) 13 : Résultat de dégradation de l’arginine. T : témoin, Lb1 (Lactobacillus), S21; S22; S23 (Enterococcus) 54 Résultats + + + Ln2 Ovoïde + + Hétéro - + - + + + + Ln3 Ovoïde + + Hétéro - + - + + + + Ln4 Ovoïde + + Hétéro - (+) - + + + + Ln5 Ovoïde + - Hétéro - - - + + + + Ln6 Ovoïde + - Hétéro - - - + + + + Ln7 Ovoïde + - Hétéro - - - + + + + Ln8 Ovoïde + - Hétéro - - - + + + + Ln9 Ovoïde + + Hétéro - + - + + + + Ln10 Ovoïde + + Hétéro - + - + + + + Ln11 Ovoïde + + Hétéro - + - + + + + Ln12 Ovoïde + ND Hétéro - + - - + + + Ln13 Ovoïde + ND Hétéro - + - - + + + Ln14 Ovoïde + ND Hétéro - (+) - - + + + Ln15 Ovoïde + ND Hétéro - + - - + + + Ln16 Ovoïde + ND Hétéro - + - - + + + Ln17 Ovoïde + ND Hétéro - + - - + + + Groupe + Leuconostocs Vancomycinerésistance - Leuconostocs Production de dextrane + Citratase - Hydrolyse de l’esculine Hétéro Acétoїne CO2 à partir du citrate + NaCl 6,5% + 37°C Ovoïde Morphologie Ln1 Code Arginine di hydrolase Production de : Type fermentaire Lait de vache Lait de chèvre L’origine Croissance Tableau(III) 1 : Critères d'identification des isolats lactiques du groupe de Leuconostocs. + : croissance positive, - : négative, (+) : croissance faiblement positive, ND : non déterminé, Hétéro : hétérofermentaire 55 Résultats Type fermentaire Arginine di hydrolase CO2 à partir du citrate Acétoїne + - - - ND Homo + - + + + + L2 Cocci + + + - - - ND Homo + - + + + + L3 Cocci + + + V - - ND Homo + (+) - + (+) + L4 Cocci + + + + + - ND Homo + - - + + + L5 Cocci + + + V + + ND Homo + - + + + + L6 Cocci + + + + + - ND Homo + - - + + + L7 Cocci + + + + + - ND Homo + - - + + + L8 Cocci + + + V + - ND Homo + (+) + + + + L9 Cocci + + + + + - ND Homo + - - + + + L10 Cocci + + + + ND ND ND Homo + - - ND + ND L11 Cocci + + - - ND ND ND Homo - + - ND + ND Lb1 Bacille + + ND - ND ND ND Homo + - V ND + - S1 Cocci + + ND + + + + Homo + - + + + + S2 Cocci + + ND + + + + Homo + - + + + + S3 Cocci + + ND + + - + Homo + - + + + + S4 Cocci + + ND + + + + Homo + - + + + + S5 Cocci + + ND + + + + Homo + - + + + + S6 Cocci + + ND + + - + Homo + - + + + + Tableau(III) 2 : Critères d'identification des isolats lactiques du groupe : Lactocoques, Lactobacilles et Enterocoques. + : croissance positive, - : négative, (+) : croissance faiblement positive ND : non déterminé, V : croissance variable, Homo : homofermentaire, Lacb : Lactobacille 56 Groupe pH 9,6 + Lactocoques NaCl 6,5% + 3% Lacb NaCl 4% Cocci 1% Entérocoques 45°C Thermorésista nce60°C pd 30 min Hydrolyse de l’esculine Citratase 37°C Lait de Sherman Morphologie Lait de chèvre Lait de vache Lait de chèvre Production de : L1 Code L’origine Croissance Résultats Type fermentaire Arginine di hydrolase CO2 à partir du citrate Acétoїne + ND + + - + Homo + - + + + + S8 Cocci + + ND + + - + Homo + - + + + + S9 Cocci + + ND + + + + Homo + - + + + + S10 Cocci + + ND + + + + Homo + - + + + + S11 Cocci + ND ND + + ND ND Homo + - + ND + + S12 Cocci + ND + + ND ND ND Homo + - + ND + + S13 Cocci + ND + + ND ND ND Homo + - + ND + + S14 Cocci + ND + + ND ND ND Homo + - + ND + + S15 Cocci + ND + + ND ND ND Homo + - + ND + + S16 Cocci + ND + + ND ND ND Homo + - + ND + + S17 Cocci + ND + + ND ND ND Homo + - + ND + + S18 Cocci + ND + + ND ND ND Homo + - + ND + + S19 Cocci + ND + + ND ND ND Homo + - + ND + + S20 Cocci + ND + + ND ND ND Homo + - + ND + + S21 Cocci + ND + + ND ND ND Homo + - + ND + + S22 Cocci + ND + + ND ND ND Homo + - + ND + + S23 Cocci + ND + + ND ND ND Homo + - + ND + + S24 Cocci + ND + + ND ND ND Homo + - + ND + + Tableau(III) 3 : Critères d'identification des isolats lactiques du groupe d’Enterocoques. + : croissance positive, - : négative, (+) : croissance faiblement positive, ND : non déterminé, V : croissance variable, Homo : homofermentaire 57 Groupe pH 9,6 + 3% Entérocoques NaCl 6,5% Cocci 1% Entérocoques NaCl 4% Thermorésista nce60°C pd 30 min Hydrolyse de l’esculine Citratase 45°C S7 Code 37°C Lait de Sherman Production de : Morphologie Lait de vache Lait de chèvre L’origine Croissance Résultats 1.3 Identification des espèces : 1.3.1 La fermentation des hydrates de carbones : L’identification est complétée avec l’étude de la fermentation des hydrates de carbones par les souches isolées. La fermentation des sucres par les souches isolées et leur identification ont été présentées dans le tableau(III) 2. L’identification des souches isolées est basée sur les profils des souches de référence selon les travaux de : Leveau et al., 1991 ; Larpent J-P, 1996 ; Bjökroth J. et Holzapfel W., 2006 ; Devoyod J.J. et Poullain F., 1988 ; Teuber M. et Geis A., 2006 ; Hammes W.P. et Hertel C., 2006 Les souches de Leuconostoc généralement sont capable de fermenter la plupart des sucres, mais ne fermentent pas l’inositol. Les souches Ln1, Ln2, Ln3, Ln5, Ln8, Ln12, Ln13, Ln14, Ln15, Ln16, Ln17 ont le même profil fermentaire sauf : Ln1 fermente le mannitol, Ln17 ne fermente pas le cellobiose, Ln5 et Ln8 sont arabinose négatif Les souches Ln4, Ln6, Ln7, Ln9, Ln10, Ln11 ont le même profil fermentaire excepté que Ln6 ne fermente pas le raffinose, Ln9 ne fermente ni le raffinose ni le rhamnose aussi Ln11 ne fermente pas le xylose. Elles sont classées parmi l’espèce Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides La souche de Lactobacillus (Lb1) fermente la majorité des sucres, elle ne fermente ni le xylose, ni l’inositol, ni le rhamnose. Elle est classée parmi l’espèce Lactobacillus plantarum Les souches de Lactococcus ont le même profil fermentaire, tandis que les souches L1, L2, L11 fermentent le raffinose, mais le rhamnose est utilisé par les souches L1 et L2. Toutes ces souches sont classées parmi l’espèce Lactococcus lactis subsp lactis biovar diacetylactis Toutes les souches d’entérocoques sont capables d’utilisées la majorité des sucres, elles sont alors au genre Enterococcus ssp aucun Streptococcus thermophilus n'a été trouvé. 58 Résultats T Rf Mn Xy Gl Ml In Fr Lc Sc Ar Cl Me G Lc Sc Ar Cl Rh G A T Dx Rf Mn Xy Ml Gl Fr In Rh Me B Figure(III) 14 : Résultat de la fermentation des hydrates de carbones de la souche Ln1: Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides (A) et la souche L2: Lactococcus lactis subsp lactis var diacetylactis (B) T : Témoin, Dx : Dextrine, Rf : Raffinose, Mn : Mannitol, Xy : Xylose, Ml : Maltose, Gl : Galactose, Fr : Fructose, In : Inositol, Rh : Rhamnose, G : Glucose, Lc : Lactose, Sc : Saccharose, Ar : Arabinose, Cl : Cellobiose, Me : Mélibiose. 59 Résultats Dextrine Raffinose Mannitol D-Xylose Maltose D-Galactose D-Fructose Inositol L-Rhamnose Glucose Lactose Saccharose Arabinose Cellobiose Melibiose Production d’acide à partir de : Souches Ln1 - - + T + + + - - + + + + + + Ln2 - - - + + + + - - + + + + + + Ln3 - - - + + + + - - + + + + + + Ln4 + + + T + + + - T + + + + + + Ln5 - - - + + + + - - + + + - + + Ln6 + - + T + + + - + + + + + + + Ln7 + + + T + + + - + + + + + + + Ln8 - - - + + + + - - + + + - T + Ln9 + - + + + + + - - + + + + + + Ln10 + T + T + + + - + + + + + + + Ln11 + + + - + + + - T + + + + + + Ln12 - - - + + + + - - + + + + + + Ln13 - - - + + + + - - + + + + + + Ln14 - - - + + + + - - + + + + + + Ln15 - - - + + + + - - + + + + + + Ln16 - - - + + + + - - + + + + + + Ln17 - - - + + + + - - + + + + - + Identification Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Tableau(III) 4a : Profils fermentaires des isolats + : dégrade le sucre, - : ne dégrade pas le sucre, T : dégrade le sucre mais tardivement ND : non déterminé 60 Résultats D-Xylose Maltose D-Galactose D-Fructose Inositol L-Rhamnose Glucose Lactose Saccharose Arabinose Cellobiose + + - + + + - + + + + + + ND ND ND L2 + T + - + + + - + + + + + + + ND ND L3 + - + - + + + - - + + + ND + ND ND ND L4 + - + - + + + - + + + + ND + ND ND ND L5 + - + - + + + - - + + + ND + ND + - L6 + - + - + + + - - + + + ND + ND ND ND Enterococcus ssp L7 + - + - + + + - - + + + ND + ND ND ND Enterococcus ssp L8 + - + - + + + - - + + + ND + ND + - L9 + - + - + + + - + + + + ND + ND ND ND L11 + + + - + + + - - + + + ND + ND + - Lactococcus lactis subsp lactis var diacetylactis Lb1 + + + - + + + - - + + + + + ND ND - S1 - + + - + + + - T + + + ND + ND ND ND Lactobacillus plantarum Enterococcus ssp S2 T + + - + + + - T + + + ND + ND ND ND Enterococcus ssp S3 + + + - + + + - T + + + ND + ND ND ND Enterococcus ssp S4 + - - - + + + - - + + + ND + ND ND ND Enterococcus ssp S5 - - + - + + + - - + + + ND + ND ND ND Enterococcus ssp S6 + - + - + + + - - + + + ND + ND ND ND Enterococcus ssp Dulcitol Mannitol + Salicine Raffinose Souches L1 Melibiose Dextrine Production d’acide à partir de : Identification Lactococcus lactis subsp lactis var diacetylactis Lactococcus lactis subsp lactis var diacetylactis Lactococcus lactis subsp lactis var diacetylactis Enterococcus ssp Lactococcus lactis subsp lactis var diacetylactis Lactococcus lactis subsp lactis var diacetylactis Enterococcus ssp Tableau(III) 4b : Profils fermentaires des isolats + : dégrade le sucre, - : ne dégrade pas le sucre, T : dégrade le sucre mais tardivement ND : non déterminé 61 Résultats Mannitol D-Xylose Maltose D-Galactose D-Fructose Inositol L-Rhamnose Glucose Lactose Saccharose Cellobiose + - + - + + + - - + + + + ND ND Enterococcus ssp S8 - + + - + + + - - + + + + ND ND Enterococcus ssp S9 - - + - + + + - - + + + + ND ND Enterococcus ssp S10 - - + - + + + - - + + + + ND ND Enterococcus ssp S11 - - - T + + + - - + + + + + + Enterococcus ssp S12 + + + - + + + - - + + + + ND ND Enterococcus ssp S13 - + + - + + + - - + + + + ND ND Enterococcus ssp S14 T + + - + + + - - + + + + ND ND Enterococcus ssp S15 T + + - + + + - - + + + + ND ND Enterococcus ssp S16 + + + - + + + - - + + + + ND ND Enterococcus ssp S17 + + + - + + + - - + + + + ND ND Enterococcus ssp S18 - + + - + + + - - + + + + ND ND Enterococcus ssp S19 T + + - + + + - - + + + + ND ND Enterococcus ssp S20 + + + - + + + - + + + + + ND ND Enterococcus ssp S21 - + + - + + + - - + + + + ND ND Enterococcus ssp S22 + + + - + + + - - + + + + ND ND Enterococcus ssp S23 T + + - + + + - - + + + + ND ND Enterococcus ssp S24 T + + - + + + - + + + + + ND ND Enterococcus ssp Melibiose Raffinose S7 Arabinose Dextrine Production d’acide à partir : Souches Identification Tableau(III) 4c : Profils fermentaires des isolats + : dégrade le sucre, - : ne dégrade pas le sucre, T : dégrade le sucre mais tardivement ND : non déterminé 62 Résultats 1.3.2 Profil fermentaire sur galeries API 50 CHL : Dans le tableau(III) 3, on rapporte les profils de fermentation sur galeries API 50 CHL (Biomérieux, France) des 6 souches isolées. Le système API 50 CHL (Biomérieux, France) a été utilisé pour déterminer la production d’acides à partir des hydrates de carbone. L’identification par la galerie API 50 CHL est faite en confirmant les profils obtenus avec les résultats des profils fermentaire de la galerie classique, et en comparant avec les données de la littérature. Figure(III) 15 : Résultat du profil fermentaire de la souche: Lactobacillus plantarum Lb1 sur la galerie API 50 CHL après 48 h d’incubation 63 Résultats Figure(III) 16 : Résultat du profil fermentaire de la souche: Leuconostoc mesenteroides subs mesenteroides Ln5 sur la galerie API 50 CHL après 48 h d’incubation 64 Résultats Souches Ln5 Ln10 Ln13 Lb1 L2 L3 sucres 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 0 GLY ERY DARA LARA RIB DXYL LXYL ADO MDX GAL GLU FRU MNE SBE RHA DUL INO MAN SOR MDM MDG NAG AMY ARB ESC SAL CEL MAL LAC MEL SAC TRE + + +/+ + + + +/+ + + + + + + + + + + + + + +/+ + +/+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +/+/+ +/+ +/+/+ + + + + + + + + + + + + + +/+/+ + + + + + + + + +/+/+/+ + + + + + + + + + + + +/+ + + + + + +/+ + + + + + + + + + + + + + + + +/+ + + + + + + + + + +/- +/+/+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + +/+ +/+ + + +/+/+ +/+/+ +/+/+ + + + + +/+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +/+ + + + + - + + + + + + + + + + - Tableau(III) 5a : Profils fermentaires des isolats par les galeries API 50 CHL 65 Résultats Souches Ln5 Ln10 Ln13 Lb1 L2 L3 sucres 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h INU MLZ RAF AMD GLYG XLT GEN TUR LYX TAG DFUC LFUC DARL LARL GNT 2KG 5KG + +/+ + + - + +/+ +/+ + - + + - + +/+ - +/+ + + +/+/- +/+/+ + + + + + +/- + + + + - + + + +/+/+ - + +/- +/+/+ + +/- +/- +/- Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Lactobacillus plantarum Lc. lactis subsp lactis var diacetylactis Lc. lactis subsp lactis var diacetylactis Tableau(III) 5b : Profils fermentaires des isolats par les galeries API 50 CHL 0: Témoin, GLY: Glycérol, ERY: Erythritol, DARA: D-Arabinose, LARA: L-Arabinose, RIB: DRibose, DXYL: D-Xylose, LXYL: L-Xylose, ADO: D-Adonitol, MDX: Méthyl-βD-Xylopyranoside, GAL: D-Galactose, GLU: D-Glucose, FRU: D-Fructose, MNE: D-Mannose, SBE: L-Sorbose, RHA: L-Rhamnose, DUL: Dulcitol, INO: Inositol, MAN: D-Mannitol, SOR: D-Sorbitol, MDM: Méthyl-αDMannopyranoside, MDG: Méthyl-αD-Glucopyranoside, NAG: N-AcétylGlucosamine, AMY: Amygdaline, ARB: Arbutine, ESC: Esculine, SAL: Salicine, CEL: D-Cellobiose, MAL: D-Maltose, LAC: D-Lactose, MEL: D-Mélibiose, SAC: D-Saccharose, TRE: D-Trehalose, INU: Inuline, MLZ: D-Mélizitose, RAF: D-Raffinose, AMD: Amidon, GLYG: Glycogène, XLT: Xylitol, GEN: Gentiobiose, TUR: D-Turanose, LYX: D-Lyxose, TAG: D-Tagatose, DFUC: D-Fucose, LFUC: LFucose, DARL: D-Arabitol, LARL: L-Arabitol, GNT: Gluconate, 2KG: 2-CétoGluconate, 5KG: 5CétoGluconate. 66 Résultats 2. L’activité antibactérienne des souches : Les souches isolées du lait cru de vache et du lait de chèvre ont été testées pour leur capacité à inhiber les bactéries pathogènes Gram négatif tel que Escherichia coli ATCC 25922 et les Gram positifs Staphylococcus aureus ATCC 25923 A B Figure(III) 17 : Aspect macroscopique des bactéries pathogènes après 24h d’incubation A: Staphylococcus aureus ATCC 25923 sur milieu Chapman B: Escherichia coli ATCC 25922 sur milieu Héktoine 2.1 Mise en évidence des inhibitions : 2.1.1 Méthode de Fleming et al., (1975) : Notre choix s’est donc porté sur une technique largement décrite dans la littérature notamment celle de Fleming et al (1975) qui nous a permis de faire une première sélection des souches lactiques antibactériennes. Les résultats de l’interaction obtenue, révèlent la présence d’une zone claire au tour des souches de bactéries lactiques de nos collection ensemencées en touches. Les résultats de l’interaction entre les souches lactiques et les bactéries pathogènes : Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923 sont mentionnés dans les figures suivantes. 67 Résultats Ln2 Ln3 Ln13 Ln12 Ln13 Ln12 Ln3 Ln2 A B Figure(III) 18 : Inhibitions obtenues par la méthode de Fleming (1975) par les souches de Ln2, Ln3, Ln12, Ln13 (Leuconostoc mesenteroides subs mesenteroides) contre E. coli (A) et Staphylococcus aureus (B) Ln14 Ln15 Ln16 Ln15 Ln14 Ln17 Ln17 Ln16 A B Figure(III) 19 : Inhibitions obtenues par la méthode de Fleming (1975) par des souches de Ln14, Ln15, Ln16, Ln17 (Leuconostoc mesenteroides subs mesenteroides) contre E. coli (A) et Staphylococcus aureus (B) 68 Résultats Ln6 Ln1 L2 Ln6 Ln1 Ln10 L2 A Ln10 B Figure(III) 20 : Inhibitions obtenues par la méthode de Fleming (1975) par des souches de Ln1, Ln6, Ln10 (Leuconostoc mesenteroides subs mesenteroides) et L2 (Lactococcus lactis subsp lactis biovar diacetylactis) contre E. coli (A) et Staphylococcus aureus (B) Spectre d’inhibition : Le tableau (III) 6 représente les résultats des interactions sur milieu solide (Fleming et al (1975)), ce tableaux montrent clairement que tous les 53 souches utilisés avait d’activité inhibitrice contre les bactéries pathogènes (E. coli et Staphylococcus aureus). L’inhibition est notée positive lorsqu’elle est supérieure à 1 mm (Schillinger et Lucke, 1989). Les différentes souches de Leuconostoc sélectionnées, présentent un spectre d’activité très proche vis-à-vis des germes cibles testés. Les longueurs des zones d'inhibition variaient de 8 à 24 mm. La seule souche de Lactobacillus, présente le même spectre d’inhibition contre E. coli et S. aureus (10 mm de diamètre). Les souches de lactocoques, possèdent aussi un spectre d’activité vis-à-vis des germes cibles testés. Il a été noté que la souche L2 a spectre d’activité plus important parmi les autres lactocoques. On note aussi que les souches L3 et L8 ne présentent aucune inhibition contre S. aureus. 69 Résultats Pour les souches d’entérocoques leur spectre d’inhibition est moins important car le diamètre des zones d'inhibition variable entre de 2 à 10 mm. Il a été noté que les souches S1 et S3 ne présentent aucune inhibition contre E. coli La souche de référence Streptococcus thermophilus CNRZ 447 présente un spectre d’activité très proche vis-à-vis E. coli (4 mm) et S. aureus (2 mm). Souches Indicatrices Inhibitrices Ln1 Ln2 Ln3 Ln4 Ln5 Ln6 Ln7 Ln8 Ln9 Ln10 Ln11 Ln12 Ln13 Ln14 Ln15 Ln16 Ln17 Lb1 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L11 S1 S2 Diamètre de la zone d’inhibition en mm Escherichia Staphylococcus coli aureus 14 10 16 10 18 8 14 10 20 12 14 14 16 12 10 12 18 8 18 14 18 10 22 14 20 16 24 12 24 10 16 16 20 16 10 10 8 6 18 10 2 0 2 2 3 2 3 2 2 2 2 0 2 2 2 3 0 2 4 2 Tableau(III) 6a : Spectre d’activité antimicrobienne des souches lactiques par la méthode de Fleming (1975) 70 Résultats Souches Indicatrices Inhibitrices S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S23 S24 Streptococcus thermophilus CNRZ 447 Diamètre de la zone d’inhibition en mm Escherichia Staphylococcus coli aureus 0 2 4 2 2 10 2 10 2 8 2 10 3 2 2 2 4 2 2 2 3 2 2 2 3 2 3 2 3 2 3 2 2 2 2 3 3 2 3 3 2 3 4 2 4 2 Tableau(III) 6b : Spectre d’activité antimicrobienne des souches lactiques par la méthode de Fleming (1975) 2.1.2 Méthode de Barefoot et Kaenhammer (1983) : Dans ce test, aucune zone d’inhibition n’a été observée autour des puits, que ce soit dans le cas de l’utilisation des cultures de bactéries ou des filtrats de cultures de bactéries (Figure(III) 21), et ceci malgré de nombreuses répétitions. 71 Résultats Ln2 Ln1 Ln11 Ln3 Figure(III) 21 : Inhibitions obtenues par la méthode Barefoot et Kaenhammer (1983) par des souches de Ln1, Ln2, Ln3, Ln11 (Leuconostoc mesenteroides subs mesenteroides) vis-à-vis de Staphylococcus aureus 2.1.3 Inhibition due à l’acide lactique : Dans ce test, on a sélectionné les souches lactiques qui ont un large spectre d’activité antibactérienne par rapport des autres souches par la méthode de Fleming (1975). Sur milieu solide MRS tamponné le nombre et la dimension des diamètres on diminué (Tableau(III) 7). On remarque que les bactéries pathogènes cibles testés Escherichia coli et Staphylococcus aureus ont été inhibés par toutes les souches lactiques utilisées. Les différentes souches de Leuconostoc (Ln) sélectionnées, présentent un spectre d’activité très proche vis-à-vis des germes cibles testés. Les longueurs des zones d'inhibition variable entre de 4 à 16 mm, ces zones d'inhibition sont petits comparativement aux zones d’inhibition qui ont trouvées précédemment. Il a été noté que seule la souche Lactococcus (L2), leur spectre d’inhibition est augmenté contre E. coli (18 mm observé par la méthode de Fleming sur milieu non tamponnée et 20 mm observé par la méthode de Fleming sur milieu tamponnée). Mais le spectre d’activité vis-à-vis de Staphylococcus aureus reste stable (10 mm). 72 Résultats Souches Indicatrices Inhibitrices Ln1 Ln2 Ln3 Ln5 Ln6 Ln9 Ln10 Ln11 Ln12 Ln13 Ln14 Ln15 Ln16 Ln17 L2 Diamètre de la zone d’inhibition en mm Escherichia coli Staphylococcus aureus 14 16 14 6 14 4 12 12 14 8 10 16 12 10 20 6 12 6 4 6 8 6 12 12 12 14 16 16 10 10 Tableau(III) 7 : Spectre d’activité antimicrobienne des souches lactiques par la méthode de Fleming (1975) sur milieu MRS tamponnée à pH 6,1 Ln14 Ln13 Ln13 Ln16 Ln15 Ln14 Ln15 A Ln16 B Figure(III) 22 : Inhibitions obtenues par la méthode de Fleming (1975) sur milieu MRS tamponnée à pH 6,1 par des souches de Ln13, Ln14, Ln15, Ln16 (Leuconostoc mesenteroides subs mesenteroides) vis-à-vis de Staphylococcus aureus (A) et E. coli (B) 73 Résultats Ln10 L2 Ln11 Figure(III) 23 : Inhibitions obtenues par la méthode de Fleming (1975) sur milieu MRS tamponnée à pH 6,1 par des souches L2 (Lactococcus lactis subsp lactis biovar diacetylactis) et Ln10, Ln11 (Leuconostoc mesenteroides subs mesenteroides) vis-à-vis de Staphylococcus aureus. 2.2 Etude de l’évolution de la croissance en culture mixte : 2.2.1 Dénombrement de Staphylococcus aureus en culture pure et mixte : Le suivit de la croissance Staphylococcus aureus exprimé en UFC/ml en culture pure et mixte a été étudié sur le milieu lait. Les résultats obtenus de dénombrement Staphylococcus aureus en culture pure et mixte avec les souches lactiques Ln10 et Ln14 (Leuconostoc) sont montés dans les figures(III) 24 et 25 respectivement. Dans les huit premières heures d’incubation à 37°C en aérobiose on observe une croissance des deux souches de Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln10 et Ln14 et S. aureus en culture pure et mixte. On a remarqué une diminution du nombre de S. aureus en culture mixte atteint 0 UFC/ml après 24h d'incubation, par contre la culture pure de S. aureus, on a noté une croissance progressive. 74 Log UFC/ml Résultats 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 4 8 18 24 Temps (h) Figure(III) 24: La croissance de Staphylococcus aureus dans le lait à 37°C en présence de la souche Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln10 Log UFC/ml La souche Ln10 ; Staphylococcus aureus ; Staphylococcus aureus avec Ln10. 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 4 8 18 24 Temps (h) Figure(III) 25 : La croissance de Staphylococcus aureus dans le lait à 37°C en présence de la souche Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln14 La souche Ln14 ; Staphylococcus aureus ; 75 Staphylococcus aureus avec Ln14. Résultats 2.2.2 Dénombrement d’Escherichia coli en culture pure et mixte : Le suivit de la croissance d’Escherichia coli exprimé en UFC/ml en culture pure et mixte a été étudié sur le milieu lait. La figure(III) 26 montre une courbe de la croissance d’Escherichia coli en culture pure et mixte avec la souche lactique Ln14 (Leuconostoc). On note une croissance après huit heures d’incubation à 37°C pour la souche de Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln14, E. coli en culture pure et culture mixte. Après 24h d'incubation, on observe une décroissance d’E. coli en culture mixte atteint 0 Log UFC/ml UFC/ml, en revanche la culture pure d’E. coli, suivre une croissance progressive. 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 4 8 18 24 Temps (h) Figure(III) 26 : La croissance d’Escherichia coli dans le lait à 37°C en présence de la souche Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln14 La souche Ln14 ; Escherichia coli ; 76 Escherichia coli avec Ln14. IV. DISCUSSION Discussion 1. Isolement et identification des souches : Cinquante trois souches de bactéries lactiques ont été isolées du lait cru de vache et du lait de chèvre. Elles ont été cultivées et isolées sur milieu MRS, M17, Elliker et MSE. Du fait des exigences nutritionnelles des bactéries lactiques, les milieux de culture doivent être très riches en sucres, en matières azotées et surtout en facteurs de croissances (Pilet M-F. et al., 2005). La présence de divers genres de bactéries lactiques dans le lait de la chèvre et de la vache était prévisible car des bactéries lactiques ont été trouvées dans la microflore de tous les laits étudiés. L’étude des principaux caractères morphologiques, biochimiques et physiologiques ont montré une diversité de genres et d’espèces isolées à partir du lait cru de chèvre et de vache. Les espèces de bactéries lactiques détectées dépendent essentiellement de la nature du lait cru et des conditions d’analyse (Saidi et al., 2002) Les résultats d’identification de cette étude montrent une présence majoritaire de coques avec 97% par rapport les bâtonnets est ont été retrouvées à des faibles pourcentages 3%. Le même type de résultat est apporté par Franciosi et al., (2009); Cheriguene A. (2008) ; Bekhouche F. Boulahrouf A. (2005) et Kacem M. et al., (2002) Les espèces lactiques des laits crus de vache et de chèvre sont très variées. Les entérocoques occupent un pourcentage important (53%), cette résultat est aussi obtenus par Boubekri K. et al., (1995). Abdi R. et al., (2006) ont démontré que 42% des souches isolées à partir de "Lighvan" un fromage Iranien fabriqué à partir du lait de brebis sont des entérocoques. Les Enterococus sont utilisées pour améliorer la qualité gustative du cheddar et d’autres fromages. Puis, viennent les Leuconostoc mesenteroides (32%), et Lactococcus lactis (12%). La même constatation a été mentionnée par Ayad et al. (2006) ayant isolé un nombre réduit de Lactococcus (8%) à partir du fromage artisanal Egyptien. Dans d’autres travaux, il a été isolé Leuconostoc mesenteroides à partir d’échantillons de lait cru de vache (Bekhouche et Boulahrouf, 2005), du lait camelin (Khedid et al., 2009) et différent partie du chèvre Africaine (Olaoye et Onilude, 2009). Dans le genre Lactobacillus, n’est représentée que par une seule souche identifiée : l’espèce Lactobacillus plantarum, La faible proportion de ces espèces parmi nos isolats ceci est probablement dû au fait que les milieux utilisés insuffisamment sélectifs. Des études menées sur 17 souches représentatives de bactéries lactiques de Jeotgal aliment fermenté Coréen ont 77 Discussion montré que Lactobacillus ssp n’est qu’un groupe mineur représenté par seulement 3 souches de la population totale (Gyu et Hyung, 2006). Aucun Streptococcus thermophilus n'a été isolé des laits examinés, ceci est probablement dû au fait que la méthode d’identification basée sur les caractéristiques morphologiques et physiologiques sur un grand nombre d’échantillons (Cheriguene A., 2008). L’identification phénotypique des souches conventionnelles basées sur les tests morphologiques, physiologiques et biochimiques. La flore dominante est représentée par les entérocoques (53%), macroscopiquement ces bactéries forment sur milieu M17 (Terzaghi et Sandine, 1975) solide des colonies bombées, circulaire, surface lisse et de couleur blanche environ 0,5 à 1 mm de diamètre. L'aspect microscopique des souches après coloration de Gram a révélée des coques associées en deux ou courte chaine (Franz C.M.A.P. et Holzapfel W. H., 2004). Les entérocoques poussent dans les conditions hostiles, en présence de 6.5% NaCl, à pH 9,6, croissance à 45°C et survivent généralement 30 min à 60°C (Stiles M.E. et Holzapfel W.H., 1996 ; Larpent G.M. et al., 1997) L’identification des espèces d’Enterococcus repose sur le profil fermentaire, mais dans notre étude les sucres utilisés ne nous permettent pas une identification précise de l’espèce. D’après Franz C.M.A.P. et al., 2004 l’utilisation de l’identification phénotypique traditionnelle pour caractériser les espèces devient extrêmement difficile, si pas impossible. Les souches de Leuconostoc développées sur milieu MSE (Mayeux et al., 1962) forment des colonies brillantes transparentes, gluantes (1 à 5 mm) ne devenant muqueuses qu’après séjour à la température du laboratoire à cause de la production de dextrane (Larpent G.M. et al., 1997), sur milieu MRS solide révélées des petites colonies ponctiforme de couleur blanchâtre à pourtour régulier de 1 mm de diamètre. L’observation après coloration de Gram, indique qu’il s’agit des coques ovoïdes Gram positif en paires ou en chainettes (Novel G., 1993), selon Garvie (1986) les corps cellulaires des Leuconostocs peuvent être sphériques, mais souvent lenticulaires, surtout lorsqu'ils sont cultivés sur milieu gélosé. Les Leuconostocs fermentent le glucose avec production de gaz (CO2), donc sont hétérofermentaires, ces souches produisent aussi du CO2 à partir du citrate, ne produisent pas l’acétoїne, n'hydrolysant pas l'arginine, développant à 37°C, présence une croissance à 6,5% NaCl, la plupart des souches hydrolyse l’esculine (Larpent G.M. et al., 1997 ; Novel G., 1993 ; Larpent J-P., 1996 ; Ogier J.-C. et al., 2008 ; Bjökroth J. et Holzapfel W., 2006 ; Badis 78 Discussion A. et al., 2004). Ces espèces sont mésophiles et caractérisées par la production, à partir du citrate du lait, de diacétyle (Novel G., 1993). La production du CO2 par Leuconostoc provient de l’hétérofermentation du lactose et de l’utilisation du citrate (Bourel G. et al., 2001) . À partir de ces tests on trouve que toutes les souches de ce genre appartiennent à l’espèce : Leuconostoc mesenteroides. Toutes les souches sont résistantes à la vancomycine (200 µg/ml) cette résultat est obtenu par plusieurs auteurs (Swenson J. M. et al., 1990 ; Orberg et Sandine, 1984 ; Benkerroum N. al., 1993). Certaines souches ne produisent pas du CO2 à partir du citrate (souches atypiques) Le test de la dégradation des carbohydrates soit par les galeries classiques soit par les galeries API 50 CHL est indispensable pour identifier l’espèce et même la sous-espèce. Les souches, au vu de leurs profils de fermentation sont différentes. Pour le genre Leuconostoc sont identifiées Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides par la dégradation de l’arabinose, arbutine, cellobiose, mannitol, salicine (Larpent J-P., 1996 ; Devoyod J.J. et al., 1988 ; Bjökroth J. et Holzapfel W., 2006 ; Milliere J.B., et al., 1989) Leuconostoc mesenteroides subsp dixtranicum se distingue aisément de Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides parce qu'il ne fermente ni l’arabinose, arbutine, cellobiose, mannitol, salicine et mesenteroides subsp cremoris parce qu'il ne produise pas le dextrane. (Holzapfel W., 2006 ; Milliere J.B., et al., 1989). Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris n’a pas été rencontré dans cette étude. Il est difficile d’identifier une espèce ou sous-espèce par les méthodes classiques. Parmi le genre Lactococcus, nous avons montré par les méthodes physiologiques et biochimiques que les six souches étaient identifiées Lactococcus lactis subsp lactis var diacetylactis Aspects macroscopiques a montré que les Lactocoques développent sur le milieu M17 de petites colonies à contour régulier de couleur blanchâtres, lisses et légèrement bombées. Microscopiquement sont des Gram positif, de forme cocci sphérique, associé en paire, groupées en chaînettes plus aux moins longues (Teuber M. et Geis A., 2006). Par ailleurs, nous distinguons par nos isolats, des souches typiques et d’autres sont atypiques car certains de leurs caractères ne correspondent pas au données rapportées par Teuber M. et Geis A., 2006 ; Stiles M.E. et Holzapfel W.H., 1997. Selon ces auteurs, les Lactocoques sont des bactéries homofermentaires, ne poussent pas à 45°C, et ne poussent en présence de 6,5% 79 Discussion NaCl. Cependant au cours de cette étude, nous avons isolé des souches atypiques qui poussent à 45°C même résultat a été obtenu par Franciosi et al., (2009) et en présence de 6,5% NaCl. Des résultats similaires sont été rapportés par Kacem M. et al., 2002 ; Zadi Karam H. et al., 2006. Ces souches atypiques résistent aussi à 63°C pendant 30 min (Bensalah, 2006). lactocoques atypiques présentent un double intérêt, vu leur croissance en milieu à haut salinité et leur taux de survie dans des conditions hostiles à haute température (Bensalah, 2006). Les souches L3, L5 et L8 présentent un développement positif à 4%, croissance variable à 6,5%, mais L3 produise de CO2 à partir du citrate et acétoїne négatif, par contre la souche L5 ne produise pas du CO2 à partir du citrate et elle est acétoїne positif, et la souche L8 ces deux tests sont positifs. Toutes les souches d’une même espèce ne réagissent pas de manière identique pour un même test. Les souches L11, L1 et L2 ne poussent pas à 4% et à 6,5%, mais L11 produise de CO2 à partir du citrate et acétoїne négatif, par contre les deux souches L1 et L2 sont acétoїne positif et ne produisent pas le de CO2 à partir du citrate. La comparaison des profils fermentaires des sucres montre que des souches appartenant à la même espèce peuvent présenter des profils fermentaires différents (Kacem M. et al., 2002) Toutes ces souches étaient identifiées Lactococcus lactis subsp lactis var diacetylactis Il est à signaler que la plupart des espèces lactiques identifiées dans cette étude sont atypiques par rapport aux souches de références utilisées. Cette atypicité des souches est confirmée par les propriétés métaboliques mises en évidence. Aucune souche de lactococcus ne présentait de profils de fermentation des sucres similaires à celui de l’espèce de référence. Dans cette étude nous avons isolé une souche de Lactobacillus. Dans les produits carnés, Hugas et al., (1993) ont trouvé que Lactobacillus plantarum représente 8 % des lactobacilles isolées. D’après l’observation macroscopique faite sur la souche de Lactobacillus (Lb1) développée sur milieu MRS (Man et al., 1960), on remarqué que les colonies sont colonie irrégulière, érodée, de couleur crème et de 1 à 3 mm de diamètre, et l’observation sous microscope après coloration de Gram, indique qu’il s’agit de bacilles apparents Gram positif (Klein et al., 1998; Axelsson, 2004; Hammes et Hertel, 2006; Tabasco et al., 2007). La souche de Lactobacillus fermente le glucose sans production de gaz (CO2), donc cette souche est homofermentaire (Hammes et Hertel, 2006). 80 Discussion Le test de la dégradation des carbohydrates soit par les galeries classiques soit par les galeries API 50 CHL a été étudié, cette souche fermente la majorité des sucres, elle ne fermente pas le xylose, l’inositol et dégrade légèrement le rhamnose. Elle est identifiée Lactobacillus plantarum (Larpent, 1996a). 2. L’activité antibactérienne des souches : La deuxième étape a permis de recenser des souches possédant l’activité antibactérienne intéressantes. Les bactéries lactiques métabolisent le lactose en acide lactique, abaissant ainsi le pH et créant un environnement défavorable au développement des bactéries pathogènes et des microorganismes d’altération. L'inhibition des micro-organismes pathogènes et la flore de contamination des aliments sont un souci important en ce qui concerne la transformation des produits alimentaires. Les microorganismes pathogènes d'importance particulière en produits laitiers, incluent Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Staphylococcus aureus. Un total de 53 souches bactériennes avec des effets antagoniques sur Escherichia coli et Staphylococcus aureus a été détecté. Cette interaction positive indique l’inhibition de la croissance des deux bactéries pathogènes testés (E. coli et S. aureus) et montre une activité antagonisme, qui est traduite par l’apparition des zones d’inhibition (Fleming et al., 1975; Barefoot et Kaenhammer, 1983; Tabak et al., 2007). Les souches ayant le une activité inhibitrice le plus important que nous avons rencontré sont Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides, Lactococcus lactis subsp lactis var diacetylactis et Lactobacillus plantarum et ne présentent pas le même spectre d’action vis-àvis des bactéries pathogènes. Vaughan et al., (1994) démontrent les capacité des bactéries lactiques isolées du lait cru de chèvre à inhiber aussi la croissance de Staphylococcus aureus. Des bactéries lactiques démontrant une activité antibactérienne ont pourtant été isolées de plusieurs produits tels que les viandes, poulet, produits laitiers, et divers aliments (Erdoúrul et Erbülür, 2006; Lima et al., 2007; Castro et al., 2010 ). La majorité des souches de Leuconostocs (Ln) présentent un potentiel à inhiber la croissance des bactéries ciblées. Au sein de ces bactéries, plusieurs possèdent un potentiel élevé et surtout les deux souches Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln14 et Ln15 qui présentent un spectre d’activité le plus large (24 mm) vis-à-vis Escherichia coli. S. aureus est 81 Discussion inhibée par Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln13, Ln16 et Ln17 avec un diamètre de 16 mm. Des résultats ont été démontrés par Gyu et Hyung (2006) ayant trouvé que parmi les souches isolées à partir Jeotgal aliment fermenté Coréen les souches Leuconostoc mesenteroides présentent des inhibitions contre S. aureus avec un diamètre de 22 mm. Gonzalez et al. (2007) ont démontré que les souches de Leuconostoc qui ont été isolées à partir de « Genestoso » un fromage fabriqué à partir du mélange des laits chèvre, vache et de brebis en Espagne avaient une activité inhibitrice contre: S. aureus, L. monocytogenes, Cl. tyrobutyricum et E. faecalis. Une étude a été réalisée par Fujitoshi et al. (2006) montre que des souches de Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides qui ont été isolées a partir du sol, possèdent des inhibition contre Lactobacillus sakei JCM 1157T. Nos travaux ont démontré que les souches Lactococcus lactis subsp lactis var diacetylactis présente un potentiel à inhiber la croissance des bactéries ciblées. Les deux souches Lactococcus lactis subsp lactis var diacetylactis L1 et L2 possèdent un spectre d’activité large parmi les autres lactocoques avec un diamètre d’inhibition de 8 mm et 18 mm contre E. coli, et 6 mm 10 mm contre S. aureus respectivement. González et al., (2007) ont isolé et identifié 125 souches de Lactococcus dont 13 souches étaient capable d’inhiber la croissance de Staphylococcus aureus. Millette et al., (2007) ont pu isolé de l’intestin de l’Homme un Lactococcus lactis subsp. lactis MM19 capable d’inhiber la croissance de Staphylococcus aureus. L’activité antibactérienne de Lactococcus lactis subsp lactis, isolé de les produits végétaux a été récemment rapporté par Ponce et al. (2008). Pour les souches de références pathogènes testés E. coli et S. aureus ses croissances sont inhibées par les souches de lactocoques, mais essentiellement par. Pulusani et al. (1979) ont montré que S. thermophilus produit une substance inhibitrice qui agit contre les bactéries pathogènes. Des résultats similaires ont été observés par Diop et al. (2007); Metlef et Dilmi-Bouras (2009) La croissance de Staphylococcus aureus et la croissance d’Escherichia coli est inhibé par Lactobacillus plantarum (Lb1) avec un spectre d’activité important avec un diamètre de 10 mm et plusieurs auteurs ont déjà montré que L. acidophilus produisait une substance inhibitrice agissant aussi contre les bactéries pathogènes (Shahani et al., 1977). Lima et al. (2007) ont constaté que Les souches identifiées comme étant Lactobacillus reuteri, L. salivarius, ou Lactobacillus spp. ont inhibé Enterococcus faecalis, E. faecium, Listeria monocytogenes, et Salmonella spp. Allouche et al. (2010) que toutes les souches de 82 Discussion Lactobacillus isolées du lait cru et d'un ferment lactique commercial produisent et excrètent dans le milieu de culture des substances inhibitrices capables d'inhiber la croissance de Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa. Des résultats similaires ont été observés par Frey et Hubert (1993); Erlend et al. (1998); De Martinis et al. (2001); Labioui et al. (2005); Ayad et al. (2006); Erdoúrul et Erbülür (2006); Bey (2009); Medouakh et al. (2010). Les entérocoques qui ont été isolés à partir du lait de chèvre et du lait de vache possèdent une activité antimicrobienne mais avec des valeurs étaient moins importantes, ses pouvoirs inhibiteur est beaucoup moins grand que celui des autres bactéries. Karam et al., 2008 montre des inhibition par la souche Enterococcus faecalis. D’autre part Hwanhlem et al. (2011) ont également observé une activité inhibitrice des souches Enterococcus faecalis vis-à-vis Escherichia coli, S. aureus et Salmonella sp. Izquierdo et al., 2009; Molinos et al., 2009 ont proposés, que l’entérocine produite par Enterococcus faecalis présente un intérêt potentiel car elle inhibe : Salmonella enterica, L. monocytogenes, S. aureus, et B. cereus. Des résultats semblables ont été obtenus par Hittu et Ravinder, (2007), qui ont examiné des souches d’entérocoques isolés de 68 produits laitiers et 28 échantillons fécaux humains et ont constaté que la production de bactériocine était maximale dans les échantillons laitiers, et que les isolats avaient un effet anti-listeria. Les résultats de l’interaction concernant l’inhibition dans le milieu tamponné ont montré que la dimension des diamètres on diminué pour certains souches et d’autres souches comme Lactococcus lactis subsp lactis var diacetylactis L2 leur spectre d’inhibition est augmenté 20 mm vis-à-vis E. coli. En fait bien que la culture initiale ait produit une zone d'inhibition de 18 mm de diamètre. Donc l’acide lactique a un effet antagonique sur les bactéries pathogènes. Ces résultats concordent avec ceux rapportés par Desmazeaud (1983) durant l'étude de l’effet des acides organiques produits par les lactocoques dans l'inhibition des autres microorganismes. Spilman et al (1978) ont remarqué que certaines zones d'inhibition sont dues à l'acidité. Ces résultats nous ont permis de constater la présence des bactériocines, des acides organiques ou de peroxyde d’hydrogène par les souches. Comme la présence d’anneau d’inhibition ne signifie pas forcement production de bactériocine, (Klaenhammer, 1993) 83 Discussion Les bactéries lactiques sont généralement connu par la production des acides organique dans le milieu ce qui se manifeste par l'apparition de zone claire, on peut aussi reconnaître que ces bactéries produisent des substances antimicrobiennes par le peroxyde d'hydrogène (Barefoot et Klaenhammer, 1984). Beaucoup d'études faites dans des conditions de cultures plus ou moins contrôlées mettent en évidence des inhibitions de croissance sans toutefois pouvoir donner de façon définitive les raisons de l'interaction. Suivant les recherches, sont incriminées: des bactériocines, des produits du métabolisme tels que des acides organiques, le pH ou le peroxyde d'hydrogène. Aucune des souches sélectionnées (cultures de bactéries ou filtrat) n’avait d’activité antibactérienne contre la flore pathogène (S. aureus, E. coli) lorsqu’on utilise la méthode des puits. Dans le cas de cultures de bactéries, l’absence de halo d’inhibition nous incite à penser que la croissance bactérienne est trop faible pour permettre de visualiser une inhibition (Dalache, 2006). Dans le cas d’utilisation les filtrats de culture, l’absence d’activité antibactérienne observée peut s’expliquer par une trop faible concentration en agent inhibiteur dans les filtrats. Des résultats similaires ont été trouvés par Ammor et al. (2006). L’activité inhibitrice a été détectée dans le milieu solide par la méthode de Fleming (double couches) a partir de cette observation, on peut dire que la production de l’agent inhibiteur est activée lorsque les souches productrices est cibles entrent en contact. L’utilisation de filtrats concentrés est donc nécessaire pour la suite de l’étude. Nous avons réalisé sur milieu lait des cultures mixtes bactéries lactiques-Staphylococcus aureus et bactéries lactiques-Escherichia coli. Les souches Ln10 et Ln14 du genre Leuconostoc, ont été retenue pour sa forte activité inhibitrice, notamment vis-à-vis de S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922. La souche test de Staphylococcus aureus est cultivée seule ou en présence de Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln10 ou de Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln14. Le nombre de cellules viables par millilitre diminuées après 18 heures d'incubation. En revanche, aucune croissance n’a été décelée après 48 h d’incubation. La deuxième souche test d’Escherichia coli est cultivée seule ou en présence de Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln14. Une diminution du nombre de cellules et après 48 h 84 Discussion d’incubation aucune croissance n’a été décelée. Ces résultats indiquent un mode bactéricide de l'action du composé antibactérien. Des résultats similaires ont été observés par Ammor (2006) ; Gessas (2006) L'inhibition de Staphylococcus aureus par la souche Ln10 et Ln14 est dû à la production de substances antibactérienne cependant l’acidité produite joue un rôle combiné dans cette inhibition. Des résultats semblables ont été rapportés par Noonpakdee et al., (2003). D’une manière générale, l’activité antimicrobienne des deux souches sélectionnées est détectée au début de la phase exponentielle et n’atteint son niveau maximal de sécrétion qu’après acidification quasiment complète du milieu de culture (Allouche et al., 2010). 85 Conclusion et perspectives Les bactéries lactiques ont un intérêt primordial en alimentation il y a au moins quatre milles ans que l'homme sert de ces bactéries pour la fermentation des aliments, et sont connues pour leur aptitude à produire des composés antibactériens leur permettant de se développer préférentiellement dans divers écosystèmes mais aussi d’être utilisées en tant que bio-conservateurs. A travers cette étude a été d’isoler et identifier des bactéries lactiques à partir des laits crus de vache et de chèvre. Leur culture sur milieu spécifique permet à l’étude bactériologique proprement dite de s’orienter vers ces bactéries, leurs caractères physiologique et biochimique permettent de les différencier des autres groupes bactériens. La détermination de leur capacité à produire des substances inhibitrices contre leurs souches cibles (Staphylococcus aureus ATCC 25923 et Escherichia coli ATCC 25922) a été démontrée par contact direct cellule-cellule entre la souche productrice et la souche indicatrice. Le test de l’antagonisme a montré l’effet inhibiteur de nos souches vis-à-vis des souches cibles. Nous avons montré que la plus part des souches lactiques étaient productrices d’agent inhibiteur soit H2O2 soit bactériocines à l’encontre de Staphylococcus aureus et Escherichia coli. Les résultats obtenus ont montré que les souches de Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides présentaient des effets antibactériens plus prononcés que les autres souches. La cinétique de croissance de Staphylococcus aureus et Escherichia coli a été évaluée en culture pure et en culture mixte dans le milieu naturel le lait en présence des souches productrices de substances antimicrobiennes. Ce travail nous a permet de détecter plusieurs souches de bactéries lactiques capable d’inhiber Staphylococcus aureus et Escherichia coli en milieu lait. Ces observations ouvrent des perspectives futures : Application du génie génétique pour l’identification des souches isolées. 86 Il serait intéressant de faire une caractérisation plus poussée et une purification des substances inhibitrices produites par les souches de Leuconostoc mesenteroides Ln. Des études plus approfondies doivent être menées pour purifier, caractériser l’agent inhibiteur. L’enjeu à long terme, surtout pour l’agro-industrie et de trouver un moyen naturel de diminuer l’utilisation des conservateurs. Cependant toute méthode in vitro doit être complètement validée in vivo avec des expériences sur des animaux afin de s'assurer de son applicabilité et de déterminer ses limites. 87 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES A Abdi R., Sheikh-Zeinoddin M. et Soleimanian-Zad S., 2006. Identification of Lactic Acid Bacteria Isolated From Traditional Iranian Lighvan Cheese, Pakistan Journal of Biological Sciences, 9(1): 99-103 Ahmad Faris Mohd Adnan, Irene K.P. Tan, 2007. Isolation of lactic acid bacteria from Malaysian foods and assessment of the isolates for industrial potential. Bioresource Technology., 98: 1380-1385 Allison G. E., Fremaux C., Klaenhammer T.R., 1994. Expansion of bacteriocin activity and host range upon cornplementation of Iwo peptides encoded wilhin the lactacin F operon. J. Bacteriol., 176: 2235-2241 Allouche F.N., Hellal A., Laraba A., 2010. Etude de l’activité antimicrobienne des souches de lactobacilles thermophiles utilisées dans l’industrie laitière. 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Lait., 71:445-461 102 ANNEXE Milieux de cultures : Milieu MRS (Man, Rogosa et Sharpe, 1960) Peptone 10 g Extrait de viande 8g Extrait de levure 5g Acétate de sodium 5g Phosphate bipotassique 2g Citrate d'ammonium 2g Sulfate de magnésium 0.1 g Sulfate de manganèse 0,05g Glucose 20 g Tween 80 1ml Agar 15g Eau distillée 1000ml Pour les lactobacilles ajuster le pH à 5,4 avec l’acide acétique. Autoclaver 20min à 120°C Milieu M17 (Terzaghi et Sandine, 1975) Peptone papainique de soja 5g Peptone trypsique de caséine 2,5 g Peptone pepsique de viande 2,5 g Extrait de levure 2.5 g Extrait de viande 5g Glycérophosphate de sodium 19 g Sulfate de magnésium 0.25 g Acide ascorbique 0.5 g Agar 15g Eau distillée 950ml pH 7,1 ± 0.2 50 ml de lactose à 10 % sont ajouté après autoclavage 20min à 120°C Milieu d’Elliker (Elliker, 1956) Bactotryptone 20g Extrait de levure 5g Gélatine 2.5g Lactose 5g Saccharose 5g Glucose 5g Acétate de sodium 1.5g Chlorure de sodium 4g Acide ascorbique 0.5g Gélose 20g Eau distillée 1000 ml pH 6,5 Autoclavage 20min à 120°C Milieu Mayeux, Sandine et Elliker – MSE Tryptone 10 g Gélatine 2.5 g Extrait de levure 5g Saccharose 100 g Glucose 5g Citrate de sodium 1g Azide de sodium 0.075 g Agar bactériologique 15 g Eau distillée 1000 ml pH du milieu prêt à l'emploi : 6.9 ± 0.2 Bouillon hypersalé : (Leveau et al., 1991). Glucose 5g Extrait de viande 5g Peptone 15g NaCl 65g Eau distillée 1000ml pH 7,5 Stérilisation 20 min à 120°C , on peut évidemment faire varie la concentration en NaCl de 4% Milieu de Moëller (Moëller, 1955) : Peptone 5g Extrait de viande 5g Glucose 0,5g Pridaxal 5mg Pourpe de bromocrésol 0,1g Rouge de crésol 5mg Eau distillée 1000ml Ajuster le pH à 6,4 Le milieu à l’arginine est obtenu en ajoutant 10g d’arginine. Stériliser 15 min à 120°C. Milieu gélose esculine : peptone 10g Esculine 1g Citrate de fer ammoniacal 1g gélose 20g Eau distillée 1000ml pH 7, Stérilisation 20 min à 120°C Milieu Clark et Lubs Peptone 7g Phosphate dipotassique 5g Glucose 5g Eau distillée 1000ml pH 7, autoclaver 20 min à 120°C Milieu Kempler et Mc Kay (1980) Peptone 10g Extrait de levure 3g Glucose 5g Agar 15 g Eau distillée 1000 ml pH du milieu prêt à l'emploi : 6,6 Le milieu est réparti à raison de 100 ml par flacon, puis autoclavé 15min à 121°C Au moment de l’emploi on ajoute : 1 ml d’une solution aqueuse de ferricyanide de potassium 10 % (p/v) 1 ml d’une solution aqueuse à 2.5 % (p/v) de citrate ferrique et citrate de sodium (p/p) Ces solutions sont stérilisées par filtration sur filtre millipore et sont conservées à l’obscurité à 4°C Milieu de dilution (peptone-sel) : NaCl 8,5g Peptone 1g Eau distillée 1000 ml Autoclavage durant 15 min à 121°C. Gélose nutritif (GN) : Peptone 5g Extrait de viande 1g Extrait de levure 2g NaCl 5g Agar 15g Eau distillée 1000 ml pH 7 Autoclavage durant 15 min à 121°C. Milieu lait écrémé : Lait écrémé 10g Eau distillée 100 ml La stérilisation à 110°C pd 10 min MRS tamponnée à pH 6,1 : Milieu MRS (Man, Rogosa et Sharpe, 1960) + Tampon phosphate : Phosphate monopotassique 54 g/l Phosphate disodique 17,8 g/l Autoclaver 20min à 120°C Temps (h) Souches (Log UFC/ml) Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln10 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus avec Ln10 0 4 8 18 24 6,69 8,05 8,25 8,3 8,6 4,27 5 5,5 8 9 4,44 6 6,5 2 0 Tableau(III) 8 : Résultats de dénombrement de Staphylococcus aureus en culture pure et mixte avec Leuconostoc mesenteroides Ln10. Temps (h) Souches (Log UFC/ml) Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln14 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus avec Ln14 0 4 8 18 24 7,47 7,83 7,95 8 8,5 4,27 5 5,5 8 9 6,6 7,17 7,32 2 0 Tableau(III) 9 : Résultats de dénombrement de Staphylococcus aureus en culture pure et mixte avec Leuconostoc mesenteroides Ln14. Temps (h) 0 4 8 18 24 Souches (Log UFC/ml) Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Ln14 Escherichia coli 7 7,17 7,69 8 8,59 7 7,23 8,64 8,95 9 Escherichia coli avec Ln14 7,16 7,92 8,57 1,14 0 Tableau(III) 10 : Résultats de dénombrement d’Escherichia coli en culture pure et mixte avec Leuconostoc mesenteroides Ln14. La galerie API 50CHL :
