Mise en évidence de Helicobacter pylori à partir des biopsies

République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
Université d’Oran
Faculté des Sciences
Département de Biologie
Pour obtenir le diplôme de Docteur ES SCIENCES
en Biologie
Spécialité Microbiologie
Intitulé
Mise en évidence de Helicobacter pylori à partir
des biopsies gastriques et son antagonisme
avec les lactobacilles
Présenté par Mme :
MEDOUAKH Lynda
.
Sous direction du :
Pr BENSOLTANE Ahmed
Devant le jury :
Président
AOUES Abdelkader
Professeur Université d’Oran
Directeur de thèse BENSOLTANE Ahmed Professeur Université d’Oran
Examinateur
LAROUS Larbi
Professeur Université de Sétif
Maitre de conférence -A- Université de Mostaganem
Examinateur
DJIBAOUI Rachid
Examinateur
CHOUGRANI Fadéla
Maitre de conférence -A- Université de Mostaganem
Examinateur
BEKADA M. Ahmed
Maitre de conférence -A- Université d’Oran
Année : 2010 - 2011
Sommaire
Résumé
Liste des tableaux
Liste des figures
Liste des abréviations
Revue bibliographique
Introduction………………………………………………...........................................................................................1
I Généralité sur H. pylori
I-1 Historique ………………………….……………………………………………………….………………………………………………4
I-2 Anatomie et Histologie…………………………………………………………………….…………………………………………..6
I-2-1 Anatomie……………………..…………………………………………………………..........……………………………………..6
I-2-2 Histologie………………………………………………………………………..………………………………………..……………….7
I-3 Physiologie de l’estomac……………………………………..………………………………………………………………………. 9
I-3-1-Fonction mécanique………………………………..…………………………………………………………………………………9
I-3-2-Fonction chimique…………………………………………………………………………………………..………………..........9
I-4 Mécanisme de régulation…………………………………………………………………………………………………………..10
I-5 Taxonomie de H. pylori …………………………………………………………..…………………………………….……………10
I-6 Ecologie………………………………………………………………………..………………………………………………….………...12
I-7 caractères morphologiques………………………………………………………………….........................................16
I-8 Caractères culturaux…......................................................................................................................17
I-9 caractères phénotypiques .........................................................................................................…...17
I-10 Caractères génétiques…………………………………………………………………………………………………………..…..19
I-11 Transmission…………………………………………………………………………......................................................21
I-12 Prévalence…………………………………………………………………………………………………………………….………….22
I-13 Facteurs de colonisation ………………………………………………………………………………………………….……….24
I-13-1 Mobilité …………………………………………………………………………………………………………..…………………….25
I-13-2 l’Urease …………………………………………………………………………………………………………………………..…….25
I-13-3 Adhérence ………………………………………………………………………………………………………………….…..…….25
I-14 MECANISME DE PERSISTANCE………………………………………………………………………………………………………....26
I-15 REACTIONS INFLAMMATOIRES…………………………………………………………………………………………………………..26
I-16 MÉTHODES DE DIAGNOSTIC ……………………………………………………………………………………………………….…...28
I-16-1 METHODES INVASIVES……………………………………………..………………………………………………………………….28
I-16-1-1 TEST À L’URÉASE ……………………………………………………………………………………………………………………28
I-16-1-2 EXAMEN CYTOLOGIQUE…………………………………… ………………………………………………………………………31
I-16-1-3 EXAMEN ANATOMOPATHOLOGIQUE…………………………………………………………………………………………....31
I-16-1-4 CULTURE…………………………………………………………………………………………………………………................32
I-16-1-5 PCR EN TEMPS REEL………………………………………………………………..………………………..……………….......32
I-16-2 METHODES NON INVASIVES………………………………..……………………………..………………….………………………33
I-16-2-1 TESTS RESPIRATOIRES ……………………………………….………………………………..……………..…………………….33
I-16-2-2 SEROLOGIE …………......................................................................................................................34
I-17 PATHOLOGIES ASSOCIEES A HELICOBACTER PYLORI ………………………………………………..………….……………….…35
I-17-1 GASTRITES…………………………………………………….…………………………………………………..………………………35
I-17-1-1 GASTRITE AIGUE………………………………….…………………………..…………………………………..………………...37
I-17-1-2 GASTRITE CHRONIQUE ……………………………..…….…………………………………………………………..………….. 37
I-17-2 ULCÈRE DUODÉNAL……………………………………………………………………………………………………………………. 38
I-17-3 ULCÈRE GASTRIQUE ………………………………………………………………....……………………………………………..…39
I-17-4 CANCER GASTRIQUE………………………………………….……………………………..………………………………………….40
I-17-5 LYMPHOME GASTRIQUE DE MALT ………………………………………………………..………………..………………..….41
I-18 SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES…………………………..……….………………………………..………………………………..43
I-19 Traitement………………………………………………………………………………………………………………………………..43
I-20 Traitement par les probiotiques ……………………………………………………………………………………………… 46
I-21 Vaccination………………………………………………………………………………………………………………………………..47
II- Généralité sur les bactéries lactiques………………………………………………………………………….…………......48
II-1 Historique……………………………………………………………………………………………………………………….………... 48
II-2 Caractères généraux ……………………………………………………………………….............................................48
II-3 Taxonomie ………………………………………………………………………………………………………………………………...50
II-4 Habitat ……………………………………………………………………………………....................................................52
II-5 Ecosystème gastro-intestinal……………………………………………………………….........................................52
II-6 Utilisation des bactéries lactiques dans le domaine agro-alimentaire …........................................55
II-7 Intérêts des bactéries lactiques en santé humaine ………………………………………...............................59
II-8 Souches probiotiques utilisées…………………………………………………………… ………………………………….. .59
II-9 Probiotiques et les infections gastro-intestinales……………………………………………………………............60
II-10 Interaction entre les bactéries lactiques…………………………………………………………………………….…...60
II-10-1 Inhibition des bactéries lactiques…………………………………………………………………………………….…….61
II-10-1-1 Acides organiques……………………………………………………………………….…………………………………....61
II-10-1-2 peroxyde d'hydrogène ……………………………………………………………………………………………………. 64
II-10-1-3 dioxyde de carbone ………………………………………………………………………………………………….........65
II-10-1-4 Diacétyle……………………………………………………………………………………………………………………………65
II-10-1-5 Acétaldéhyde………..…………………………………………………………………………………………………………..66
II-10-1-6 Reutérine……………………………………………………………….…………………………………………………………..66
II-10-1-7 Bactériocines …………………………………………………………………………………………………………………..67
II-11 Les lactobacilles………………………………………………………………………………………………………………………..68
II-11-1 Caractères généraux……………………………………………………………………………………………….…………….68
II-11-2 Habitat………………………………………………………………………………………………………………..…………………71
II-11-3 Effets des lactobacilles sur la santé…………………………………………….……………………………………71
Matériel et méthodes
Objectif du travail………………………………………….……………………………………………………………………………….74
I-Isolement et identification de H. pylori …………………………………………………………………..…………………….75
I-1 Echantillon et origine du matériel……………………………………….……………………………………………………..75
I-2 Prélèvement ……………………………………………………………………………………………………………………………...75
I-3 Conservation des biopsies …………………………………………………………………………………………….…………76
I-4 Examen anatomopathologique …………………………………………….…………………………………………………..76
I-5 Examens microbiologiques …………………………………………………………………………………………………..….. 76
I-5-1 Examen cytologique ………………………………………………………………………………………………….……….... 76
I-5-2 Test rapide à l’Urée……………………………………………………………………………..………………………………...77
I-5-3 Culture et isolement ……………………………………………………………………………..…………………...........78
I-5-3-1 Condition de culture ……………………………………………………………………………………..………………...78
I-5-3-2 Milieux de culture ……………………………………………………………………………………………………………..78
I-5-3-3 Isolement ………………………………………………………………………………….……………………………………...79
I-5-3-4 Identification ………………………………………………………………………………..…………………………………...79
I-5-3-4-1 Examen macroscopique…………………………………………………….……………………………………………….79
I-5-3-4-2 Examen microscopique …………………………………………………..…………………………………………………80
I-5-3-4-3 Etat frais………………………………………………………………………………………………………………………….…80
I-5-3-4-4 Tests biochimiques ………………………………………………………………………………………………………… 80
I-5-4 Antibiogramme ……………………………………………………………………………………………………………………….80
I-5-5 Conservation ..………………………………………………..………..…………………………………….……………………..81
I-5-6 APPLICATION DE LA TECHNIQUE PCR EN TEMPS REEL……………………………………………………………………… 83
II- ISOLEMENT ET CARACTERISATION DES LACTOBACILLES…………………………………………………………………………......85
II-1 PROVENANCES DES ECHANTILLONS DU LAIT…………………………………………………………………….…………………...85
II-2 MILIEUX DE CULTURE ……………………………………………………………………………….…………………………………….85
II-3 ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DES LACTOBACILLES……………………………………………………………………………….85
II-3-1 ISOLEMENT……………………………………………………………………………………….……………………………………...85
II-3-2 IDENTIFICATION DES LACTOBACILLES……………………………………………………………..……………………………...86
II-3-2-1 CARACTERISATION MORPHOLOGIQUE……………………………………………………..…………………………………....86
II-3-2-2 DETERMINATION DES ISOLATS………………………………………………………................................................86
II-3-2-3 DETERMINATION DU GENRE………………………………………………………………………………………………....…..87
II-3-2-3-1 TEMPERATURE……………………………………………………………… ………………………………………………….. 87
II-3-2-3-2 TYPE FERMENTAIRE………………………………………………………………………………………………………………87
II-3-2-3-3 HYDROLYSE DE L’ARGININE……………………………………………………………………………………………………..87
II-3-2-3-4 UTILISATION DU CITRATE ……………………………………………………………………………………………..…………88
II-3-2-3-5 HYDROLYSE DE L’ESCULINE ………………………………………………………………….…………………………………88
II-3-2-4 DETERMINATION DE L’ESPECE……………………………………………………………………..…………………………….88
II-3-2-4-1 IDENTIFICATION PAR LE SYSTEME API 50 CHL……………………………………………………………………………89
II-3-3 CONSERVATION DES SOUCHES…………………………………………………………………….…………………………………90
III- MISE EN EVIDENCE DES INHIBITIONS ENTRE LACTOBACILLE ET H. PYLORI……………………….............................91
III-1 METHODE DIRECTE ……………………………………………………………………………………………………………………….91
III-2 METHODE INDIRECTE ……………………………………………………………………………………………………………………92
III-3 DETERMINATION DE LA NATURE DE L’AGENT INHIBITEUR……………………………………………………………………….93
III-3-1 INHIBITION DUE AU PEROXYDE D’HYDROGENE ……………………………………………………………………………….93
III-3-2 INHIBITION DUE A L’ACIDE LACTIQUE ……………………………………………………………………………………………..93
III-3-3 INHIBITION DUE AUX BACTERIOPHAGES………………………………………………………………………………………….94
III-3-4 RECHERCHES DE LA NATURE PROTEIQUE DE LA SUBSTANCE ANTIMICROBIENNE …………………………………….94
III-3-5 EFFET DE LA TEMPERATURE…………………………………………………………...................................................95
III-4 MESURE DE L’ACIDITE TITRABLE………………………………………………………………………………………………………..95
III-4-1 DOSAGE DE L’ACIDITE…………………………………………………………………………………………………………………95
III-5 MISE EN EVIDENCE DES INHIBITIONS EN MILIEU LIQUIDE…………………………………………….………………………..96
III-6 EFFET INHIBITEUR DES LACTOBACILLES SUR LES BACTERIES PATHOGENES……………………….........................97
RESULTAT
I-MISE EN EVIDENCE DE H.PYLORI………………………………….…………..…………………..……………………………………..98
I-1 EXAMEN CYTOLOGIQUE…………………………………………………………………………………………………………………….98
I-2 TEST RAPIDE A L’UREE ………………………………………………………………….…………………………………………………..98
I-3 EXAMEN ANATOMOPATHOLOGIQUE………………………………………………………..……………………………………….100
I-4 ISOLEMENT ET IDENTIFICATION ………………………………………………………..……………………………………………….100
I-4-1 ASPECT MACROSCOPIQUE ……………………………………………………………..……………………………………………100
I-4-2 ASPECT MICROSCOPIQUE ……………………………………………………………………………………………..……………100
I-4-3 ETAT FRAIS ……………………………………………………………………………………………………………………………….104
I-4-4 ETUDE BIOCHIMIQUE …………………………………………………………….……………………………………………………104
I-5 ANTIBIOGRAMME…………………………………………………………………………………………………………………………105
I-6 MISE EN EVIDENCE DE H. PYLORI PAR LA PCR EN TEMPS REEL………………………………………………………….……. 109
II ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DES LACTOBACILLES…………………………………………………………………………………115
II-1 EXAMEN MORPHOLOGIQUE …………………………………………………………………………………………………………...115
II-2 CARACTERES PHYSIOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES………………………………………………………………………………..115
II-3 REPARTITION DES ESPECES DE LACTOBACILLE………………………………………………………………………..……………127
III PRODUCTION DES SUBSTANCES ANTIMICROBIENNES ………………………………………………………………………….....129
III-1 Mise en évidence des inhibitions entre les lactobacilles et H. pylori …………………………………….…129
III- 2 Acidification……………………………………………….…………………………………………………………………………..139
III-3 Détermination de l’agent inhibiteur ………………………………………..……………………………………………..143
III-3-1 Effet de la production d’acide lactique ………………………………………………………………………………..144
III-3-2 Effet du peroxyde d’hydrogène ……………………………………………………………………..……………………146
III-3-3 productions de phage lysogène: ………………………………………………………………………………………….146
III-3-4 Effet de la bactériocine…………………..……………………………………………………………………….…….…... 147
III-4 Effet de surnageant de lactobacille sur H. pylori en milieu liquide ………….…………………………....150
III-5 Inhibitions des bactéries pathogènes par les lactobacilles…………………………………………………..…..152
Discussion ……………….………………………………………………………………………………………….…………………………156
Conclusion et perspectives….………………………………............................................................................179
Références bibliographiques ….……………………………………………………………………………..………………………182
Annexe……………………………………………………………………………………………………………................................215
Activités scientifiques…………………………………………………………………………………………………………………….219
Résumé
Le but de ce présent travail est de détecter in vitro le pouvoir inhibiteur des souches de
Lactobacilles isolés du lait de chèvre sur la bactérie pathogène de H. pylori isolée des biopsies
gastriques et de déterminer l’agent inhibiteur.
En premier temps, la recherche de H. pylori a été réalisé à partir des biopsies gastriques des
patients atteints de maladies gastroduodénales (gastrite chronique, ulcére gastroduodénale), et
ayant subi une endoscopie digestive haute.
La présence de cette bactérie a été mise en évidence par des tests invasifs : test rapide à
l’uréase, l’examen cytologique, l’examen histologique, la culture et l’amplification génique
PCR en temps réel.
L’identification des souches de H. pylori
isolées a été basée sur les caractères
morphologiques (macroscopique et microscopique) et biochimiques (test à l’uréase, test à
l’oxydase et la catalase).Nous avons pu isoler trois souches de H. pylori alors que les autres
tests invasifs utilisés montrent parfois la présence de H. pylori dans les échantillons présentant
une négativité de la culture (résultat faussement négatif). Ceci est probablement du à l’erreur
de l’échantillonnage ou la sensibilité de la culture. .
Par ailleurs, l’étude de la sensibilité des souches de H. pylori aux antibiotiques habituellement
utilisés dans le choix thérapeutique a montré l’excellente activité de la plupart des
antibiotiques testés vis-à-vis de H. pylori. Aucune résistance à la clarithromycine n’a été
observée chez toutes les souches de H. pylori, cette résistance constitue le facteur majeur
d’échec du traitement d’éradication de H. pylori.
De plus, La technique moléculaire de la PCR en temps réel a permis de détecter à la fois H.
pylori et d’éventuelle mutation de résistance à la clarithromycine à partir des biopsies
gastriques ou de la colonie. En effet, les souches isolées de H. pylori (HP1, HP2, HP3),
traitées par cette technique ont révélé d’une part leur conformité à l’Helicobacter pylori
(ADN positif). Elles sont identifiées comme des souches dites sauvages (Wite type), et d’autre
part, montre que ces souches ne présentent aucune mutation de résistance à la clarithromycine
En second temps, 42 souches de lactobacilles ont été isolés à partir du lait cru de chèvre, et
identifiés en se basant sur des critères morpholologiques,biochimiques et physiologiques. Les
souches lactiques sont rattachées aux 3 groupes (I, II, III). Par ailleurs, cette identification a
révélé la présence d’une diversité en espéces dans le genre de lactobacilles répartie
essentiellement entre Lb. delbrueckii (sp. bulgaricus et sp. lactis ); Lb. helveticus; Lb.
salivarius ; Lb. plantarum ; Lb. casei (sp. casei et sp. rahmnosus) ; Lb. rhamnosus ; Lb.
paracasei ; Lb. pentosus ; Lb. brevis et Lb. fermentum.
D’autre part, nous avons testé l’activité antimicrobienne in vitro des lactobacilles isolés ainsi
que la souche de référence vis-à-vis des souches isolés de H. pylori (HP1, HP2, HP3) et les
souches de référence (HP4) et (HP5) par la méthode directe de diffusion (Geis et al., 1983).
Les souches de Lactobacillus sp. ont présenté dans l’ensemble une activité antagoniste vis-àvis de H. pylori, démontrée par l'apparition de zone d’inhibition avec des diamètres variés
d’une souche à l’autre. La souche de Lb. rhamnosus (LBR1) a prouvé un pouvoir inhibiteur
le plus élevé dont le diamètre d’inhibition est de 19 mm.
L’évaluation du pouvoir acidifiant chez les 14 souches sélectionnés pour leur pouvoir
inhibiteur élevé a été réalisée par la mesure du degré Dornic. Les espèces ayant un pouvoir
acidifiant élevé sont: Lb. rhamnosus (LBR1) avec 69 D°, Lb. delbrukii sp. bulgaricus
(LBDB1, LBDB3) et Lb. plantarum (LBP1) avec une acidité de 65 D°.
La recherche de la nature de l’agent inhibiteur chez les 14 souches de lactobacilles par
la méthode indirecte des puits a révélé que la production d’acide lactique est le facteur
responsable de l’inhibition de H. pylori chez la majorité des lactobacilles testés. Tandis que
chez la souche Lb. brevis, l’agent inhibiteur est l’acide lactique et une autre substance
indéterminé, qui n’est pas une bactériocine, ni peroxude d’hydrogéne.
Par ailleurs, l’étude de la viabilité de H. pylori en milieu liquide en présence de surnageant de
la souche Lb. rhamnosus1, selectionné pour son pouvoir inhibiteur élevé, et de l’acide
lactique a confirmé l’effet inhibiteur de l’acide lactique sur la croissance de H. pylori.
Enfin, nous avons testé le pouvoir inhibiteur de nos souches lactiques vis-à-vis des bactéries
pathogènes Gram positive (St aureus, B. subtilis) et bactéries gram négatives (E. coli, Kb.
Pneumoniae, S.entertidis, Ps. aeruginosa). Les souches de lactobacilles testées exercent
également une activité antimicrobienne contre les bactéries pathogènes et présentent un
spectre d’activité large renfermant les bactéries Gram positive et les bactéries Gram
négative montrant ainsi la capacité des lactobacilles à inhiber des bactéries pathogène en
générale et l’Helicobacter pylori en particulier.
Mots clés : H. pylori, Lactobacillus, lait de chèvre, antagonisme, acide lactique, agent
antimicrobiens.
Abstract
The aim of the present work is to detect in vitro the inhibitory strains of lactobacilli isolated
from goat milk on H. pylori isolated from gastric biopsies and to determine the inhibitory
agent.
First time, the search for H. pylori was done from gastric biopsies of patients with
gastroduodenal diseases (chronic gastritis, peptic ulcer) who underwent upper gastrointestinal
endoscopy.
The presence of this bacterium has been detected by invasive tests: rapid urease test, cytology,
histology, culture and PCR real time.
The identification of strains of H. pylori isolates was based on morphological (macroscopic
and microscopic) and biochemical (urease test, oxidase test and catalase). However, we have
isolated three strains of H. pylori while other invasive tests used sometimes show the presence
of H. pylori in the samples with negative culture (false negative). This is probably due to
sampling error or the sensitivity of culture.
Moreover, the study of the sensitivity of strains of H. pylori to antibiotics commonly used in
the therapeutic choice showed excellent activity of most antibiotics tested vis-à-vis H. pylori.
No resistance to clarithromycin was observed in all strains of H. pylori, this resistance is the
major cause of treatment failure to eradicate H. pylori.
In addition, the molecular technique of PCR real-time has detected both H. pylori and
possible transfer of resistance to clarithromycin in gastric biopsies or from the colony.
Indeed, isolates of H. pylori (HP1, HP2, HP3), treated with this technique have revealed one
hand, their compliance with Helicobacter pylori DNA (positive). They are identified as socalled wild strains (Wild type), and secondly, shows that these strains show no mutation of
resistance to clarithromycin.
Second time, 42 strains of lactobacilli were isolated from raw milk goat, and identified based
on criteria morpholological, biochemical and physiological. Lactic strains are attached to the
3 groups (I, II, III). Moreover, this identification has revealed the presence of species diversity
in the genus Lactobacillus distributed mainly between Lb. delbrueckii (sp. bulgaricus and sp.
lactis), Lb. helveticus, Lb. salivarius, Lb. plantarum, Lb. casei (sp. casei et sp. rahmnosus)
Lb. rhamnosus, Lb. paracasei, Lb. pentosus, Lb. brevis and Lb. fermentum.
Secondly, we tested the in vitro antimicrobial activity of lactobacilli isolated and the reference
strain vis-à-vis the isolated of H. pylori strains (HP1, HP2, HP3) and reference strains (HP4)
and (HP5) using the direct method of dissemination (Geis et al., 1983). The strains of
Lactobacillus sp. showed an overall antagonist activity vis-à-vis H. pylori, as demonstrated by
the appearance of inhibition zone with various diameters from one strain to another. The
strain of Lb. rhamnosus (LBR1) showed an inhibitory highest inhibition whose diameter is
19mm.
The evaluation of the acidifying power among 14 strains selected for their inhibitory rate was
achieved by measuring the degree Dornic. Species with high acidifying power are: Lb.
rhamnosus (LBR1) with 69 D °, Lb. delbrueckii sp. bulgaricus (LBDB1, LBDB3) and Lb.
plantarum (LBP1) with an acidity of 65 D°.
Research on the nature of the inhibitor in 14 strains selected of lactobacilli by the indirect
method of wells revealed that the production of lactic acid is the factor responsible for the
inhibition of H. pylori in the majority of the lactobacilli tested. While in strain Lb. brevis, the
inhibitor is lactic acid and another substance unknown, which is not a bacteriocin or hydrogen
peroxyde.
The study of the viability of H. pylori in liquid medium in the presence of supernatant of the
strain Lb. rhamnosus1, selected for its high inhibitory power, and lactic acid confirmed the
inhibitory effect of lactic acid on the growth of H. pylori.
Finally, we tested the inhibitory power of our lactic strains vis-à-vis the Gram positive
bacteria (St. aureus, B. subtilis) and Gram negative bacteria (E. coli, Kb. pneumoniae,
S.entertidis, Ps aeruginosa). The lactobacilli strains tested also exert antimicrobial activity
against pathogenic bacteria and present a broad spectrum of activity containing Gram-positive
and Gram-negative bacteria showing the ability of lactobacilli to inhibit pathogenic bacteria in
generally Helicobacter pylori in particular.
Key words: H. pylori, Lactobacillus, goat milk, antagonism, lactic acid antimicrobial agent.
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Liste des figures
Fig. 1 : Structure de l’estomac
Fig. 2 : Schéma général de la muqueuse gastrique
Fig. 3 : Structure de la muqueuse fundique
Fig. 4 : Structure de la muqueuse pylorique
Fig. 5 : Schéma de la régulation physiologique de la sécrétion gastrique
Fig. 6: Relation phylogénétique de H.pylori
Fig. 7 : Localisation de H. pylori au niveau de la muqueuse gastrique
Fig. 8: Helicobacter pylori sous microscope électronique
Fig. 9 : Milieux de culture de H. pylori
Fig. 10 : Aspect de colonies de H. pylori
Fig. 11 : Distribution géographique de l’infection à H. pylori
Fig. 12: Mécanismes de colonisation de H. pylori
Fig. 13 : Méthodes diagnostiques de H.pylori
Fig. 14 : Test à l’uréase
Fig. 15: Examen anatomophathologique d’une biopsie gastrique
Fig. 16 : Test respiratoire à l’urée marquée
Fig. 17 : Test d’ELISA
Fig. 18 : Rôle pathogène de H. pylori.
Fig. 19 : Aspects endoscopiques des gastrites
Fig. 20 : Mécanismes de l’ulcère gastrique et duodénale
Fig. 21 : Mécanisme pour la carcinogenèse gastrique
Fig. 22 : Détermination de la sensibilité de H. pylori par le E-test
Fig . 23 : Arbre phylogénique des bactéries lactiques
Fig . 24 : Principaux compartiments de l’appareil digestif
Fig. 25: Principaux effets bénéfiques des probiotiques
Fig. 26: Propriétés et critères de sélection des probiotiques
Fig . 28 : Lactobacillus bulgaricus et Lactobacillus casei
Fig. 29 : Arbre phylogénétique du genre lactobacilles
Fig. 30 : Schéma d’isolement et identification de H. pylori
Fig. 31 : Observation microscopique d’une biopsie biopsique
Fig. 32 : Test rapide à l’uréase
Fig. 33 : Test rapide à l’urée (CLO test)
Fig. 34 : Examen anatomopathologique de la biopsie
Fig. 35: Aspect macroscopique de H. pylori sur milieu pylori
Fig. 36 : Aspect macroscopique de H. pylori sur gélose au sang
Fig. 37 : Aspect macroscopique de H. pylori après purification
Fig. 38 : Observation microscopique de H. pylori
Fig. 39: Sensibilité de H. pylori à la clarithromycine
Fig. 40: Sensibilité de H. pylori à l’amoxicilline
Fig. 41: Sensibilité de H. pylori au métronidazole
Fig. 42: Sensibilité de H. pylori Tétracycline, Rivampin et Levofloxacin
Fig. 43 : Témoins utilisés dans la PCR en temps réel
Fig. 44: Cas positif de la PCR à partir de la culture de H. pylori
Fig. 45: Cas négatif de la PCR à partir des biopsies gastriques
Fig. 46: Cas positif de la PCR à partir des biopsies gastriques
Fig. 47: Aspect macroscopique des colonies de lactobacilles
Fig. 48: Aspect microscopique des lactobacilles
Fig. 49: Utilisation du citrate
Fig. 50: tests biochimiques des lactobacilles
Fig. 51: Répartition des lactobacilles
Fig. 52 : Galeries API 50 CHL
Fig. 53 : Répartition des espèces de lactobacilles
Fig. 54 : Mise en évidence de l’effet inhibiteur des lactobacilles sur la croissance de H. pylori
Fig. 55 : Mise en évidence de l’effet inhibiteur des lactobacilles sur la croissance de H. pylori
Fig. 56 : Mise en évidence de l’effet inhibiteur des lactobacilles sur la croissance de H. pylori
Fig. 57: Evolution de l’acidité et du pH en fonction du temps chez LBCR1, LBCC1, LBH1, LBH2,
Fig. 58 : Evolution de l’acidité et du pH en fonction du temps chez LBP1, LBP3, LBS1, LBS2
Fig. 59: Evolution de l’acidité et du pH en fonction du temps chez LBR1, LBR2, LBDB1, LBDB3
Fig. 60: Effet de surnageant traité de lactobacille sur H. pylori
Fig. 61: Viabilité de H. pylori en présence de surnageant de LBR1 et de l’acide lactique
Fig. 62: Effet antimicrobien des lactobacilles sur les bactéries pathogènes
Liste des tableaux
Tab. 1: Classification d’Helicobacter pylori
Tab. 2: Quelques espèces du genre Helicobacter
Tab. 3: caractéristiques biochimiques et culturales de H. pylori
Tab. 4: Facteurs de pathogénécité bactériens
Tab. 5 : Différents types de thérapies anti-H. pylori
Tab. 6: Principales souches microbiennes probiotiques
Tab. 7 : Valeurs de pH limites de la croissance des microorganismes
Tab. 8 : Valeurs des antibiotiques
Tab. 9 : Caractérisation biochimique de H. pylori
Tab. 10 : Détermination de la CMI et du diamètre de la zone d’inhibition
Tab. 11: Sensibilité des souches de H. pylori aux antibiotiques
Tab. 12 : Code des espèces de lactobacilles isolées à partir du lait de chèvre
Tab. 13: Caractéristiques des lactobacilles
Tab. 14 : Profils fermentaires des lactobacilles
Tab. 15 : Profils fermentaires des lactobacilles par galerie API 50 CHL
Tab. 16 : Activité antimicrobienne des Lactobacille sp. sur H. pylori
Tab. 17 : Inhibition de H. pylori par lactobacilles
Tab. 18: Effet de la production d’acides et du peroxyde d’hydrogène sur H. pylori
Tab. 19: Effet de la production de la bactériocine
Tab. 20: Activité antimicrobienne des lactobacilles vis-à-vis des bactéries pathogènes.
Liste des Abréviation
H. pylori : Helicobacter pylori
C. pylori : Campylobacter pylori
C. jejuni: Campylobacter pylori
LBDL : Lactobacillus delbrueckii sp. lactis
LBDB : Lactobacillus delbrueckii sp. bulgaricus
LBCC : Lactobacillus casei sp. casei
LBCR: Lactobacillus casei sp. rhamnosus
LBB : Lactobacillus brevis
LBR : Lactobacillus plantarum
LBP: Lactobacillus rhamnosus
LBS: Lactobacilles salivarus
LBH: Lactobacillus helveticus
Malt : tissu lymphoide associé aux muqueuse
DNU : dyspepsie non ulcéreuse
ADH: arginine dihydrolase
ADN: acide désoxyribonucléique
ARN: acide ribonucléique
ATP: Adénosine Triphosphate
Ara.: Arabinose
Cel.: Cellobiose
Fru.: Fructose
Gal.: Galactose
Lac.: Lactose
Mal.: Maltose
Man: Mannitol
Mél.: Mélibiose
Raf.: Raffinose
Rib.: Ribose
Sac.: Saccharose
Sor.: Sorbitol
Tré.: Tréhalose
HES (Hémateine-Eosine-Safran)
BHIB : Bouillon Cœur Cervelle
BHI-A : Cœur Cervelle Agar
Introduction
Introduction
Depuis sa découverte dans l’estomac humain, Helicobacter pylori, bactérie de
la décennie, a bouleversé les concepts concernant certaines maladies
gastroduodénales (Fléjou, 1989; Fagniez, 1995 ; Chamouard, 1996; Simsek et
al., 2000).
H. pylori est un pathogène gastrique humain, spiralé à Gram négatif, qui
colonise la muqueuse de l'épithélium gastrique et survit dans l’environnement
acide (Lorca et al., 2001). Il est aujourd’hui admis que la bactérie Helicobacter
pylori est l’agent étiologique des pathologies gastro-duodénales (Missonier et
Dorval, 1994; Simsek et al., 2000 Raymond et al., 2010), elle est responsable
des gastrites chroniques, des ulcères duodénaux (Megraud et Lamouliatte,
1992), et joue un rôle important dans la genèse des cancers gastriques
(adénocarcinomes et lymphomes) (Blaser, 1993; Parsonnet et al., 1991).
Ceci conduit à réviser le traitement de la maladie ulcéreuse désormais
considérée comme une maladie infectieuse. En effet, L'infection à H. pylori
figure parmi les infections bactériennes chroniques les plus répandues et touche
plus de 50% de la population mondiale (Dun et al., 1997 ; Pinchuk et al., 2001 ;
Perez-Perez et al., 2004).
L'éradication de l'Helicobacter est indispensable lors de sa mise en évidence
pour notamment éviter les risques de cancer de l'estomac. Les indications de
l’éradication de H. pylori font l’objet de discussions. La trithérapie utilisant un
inhibiteur de la pompe à protons associée à deux antibiotiques est actuellement
le traitement de référence recommandé pour l'éradication de H. pylori
(Malfertheiner et al., 2002; Mignon, 2010). Toutefois, le traitement classique
par les antibiotiques n’est pas toujours efficace contre l'infection à H. pylori du
fait de la résistance de la bactérie aux antibiotiques, principal facteur d’échec
des traitements (Hunt, 2006; Raymond et al., 2010) .
1
Introduction
Par conséquent, le développement de méthodes alternatives serait nécessaire et
la recherche de nouveaux agents antimicrobiens est recommandée (Pinchuk et
al., 2001; Rokka et al., 2006).
De nombreuses études scientifiques ont rapporté les propriétés prophylactiques
et thérapeutiques de certaines bactéries lactiques particulièrement celles
appartenant au genre Lactobacillus (Parker, 1974; Varcoe et al., 2003; Marelli et
al., 2004 ; Lin et al., 2005). Ces microorganismes favorables pour la santé de
l’homme et de l’animal ont reçu le nom de «Probiotiques». Ce concept a été
développé tout particulièrement après l’émergence, ces dernières décennies, des
bactéries résistantes aux antibiotiques et l’intérêt suscité par les agents naturels
d’inhibition pour le contrôle des germes pathogènes (Ouewhand et al., 1999;
Kailasapathy et Chin, 2000).
Effectivement, les lactobacilles sont utilisés depuis des années contre
les maladies infectieuses et sont largement étudiées pour leur capacité à protéger
l’homme contre les bactéries pathogènes (Silva et al., 1987 ; Bernet et al.,
1994; Tsai et al., 2003 ; Corr et al., 2007; Ryan et al., 2008).
Plusieurs études
ont montré que les lactobacilles présentent un pouvoir
inhibiteur contre la bactérie pathogène de H. pylori in vitro et in vivo ( Michetti
et al., 1995; Kabir et al., 1997; Coconnier et al., 1998). Ce pouvoir exercé par
les lactobacilles est généralement due à la production d'acides organiques,
le peroxyde d'hydrogène, ainsi que des bactériocines (Silva et al., 1987 ;
Vandenbergh, 1993 ; Midolo et al., 1995; Trammer, 1966).
Les lactobacilles montrent de manière évidente une meilleure tolérance à
la trithérapie classique et semblent avoir un effet de prévention.
Par conséquent, l’administration des probiotiques pourrait être exploitée comme
un agent thérapeutique potentiel pour l’éradication de Helicobacter pylori.
(Armuzzi et al., 2001; Hamilton-Miller, 2003; Midolo et al., 1995).
Une alternative de traitement pourrait donc être la consommation de
probiotiques.
2
Introduction
C’est ainsi que notre présent travail est structuré en 4 volets :
Le premier est consacré à une étude bibliographique comprenant deux parties
dont la première concerne l’étude des aspects microbiologiques, diagnostiques
et thérapeutiques de H. pylori, la deuxième partie traite les caractères des
bactéries lactiques et les lactobacilles en particulier, leur application en santé
humaine ainsi que leur activité antimicrobienne.
L’ensemble du matériel et méthodes mis en œuvre au cours de l’étude est
présenté dans un second volet.
Les résultats expérimentaux sont abordés dans le troisième volet
manuscrit suivi par une discussion générale.
3
de ce
Helicobacter pylori
Revue bibliographique
I- Généralité sur l’Helicobacter pylori
I-1 Historique
L’intervention d’agents infectieux dans la pathogénie de certaines affections
gastroduodénales a été suspectée en 1915 (Berstad, 1993; Vallot, 1994).
En 1938, Doengens observa des bactéries spiralées dans l’estomac de singe,
retrouvées par la suite dans des estomacs humains obtenue à l’autopsie (Veron et
Fauchère, 1989; Megraud, 1994e; Illoul et al., 1995).
En 1940, Freedberg et Baron observèrent ces bactéries dans 37% des estomacs
réséqués puis un oubli total avant qu’elle ne soit de nouveau observées dans
les années 1970 (Megraud, 1994e; 1996b).
C’est en effet en 1975 que Steer et Colin Jones, en étudiant la muqueuse
gastrique au microscope à balayage, ont noté la présence de ces bactéries
spiralées. Cependant, leur tentative de mise en culture, sur milieu standard, ne
permit de retrouver que Pseudomonas aeroginosa (Megraud, 1994e, 1996b).
En 1979, Robin Warren, un anatomopathologiste australien, après avoir observé
de très nombreuses bactéries spiralées ressemblant à des Campylobactéries sur
un prélèvement histologique de gastrite aiguë, entreprit avec succès la recherche
systématique de cette bactérie sur les biopsies qui fut alors appelée
Campylobacter Like Organisms (CLO) (Marshall et Warren, 1984; Avril, 1988;
Lee, 1992; Darra, 1994; Megraud, 1996b).
Ce n’est qu’en 1982 que son collègue B. Marshall fut le premier à cultiver à
partir de biopsies de la muqueuse gastrique cette bactérie spiralée appelée
C. pyloridis, dénomination remplacée par C. pylori et aujourd’hui Helicobacter
pylori (Marshall et Warren, 1984; Megraud, 1989b; Houdart, 1995; Megraud,
1996b).
Et depuis, 1983, de nombreux travaux ont étudié les rapports entre l’infection
antrale par H. pylori et les affections gastroduodénales (Dorval, 1992) et un
débat s’est établi entre bactériologistes, gastro-entérologues et histologistes pour
savoir si ces bactéries sont une cause, un facteur favorisant ou une conséquence
4
Helicobacter pylori
Revue bibliographique
des maladies gastriques (Veron et Fauchère, 1989) jusqu’à apparaître en 1994
comme le principal agent responsable des maladies gastroduodénales (Cayla,
1995). En 1995, une conférence de consensus de la communauté médicale
reconnaît qu’Helicobacter pylori est bien la cause majeure des ulcères
gastroduodénaux et non le stress comme il était auparavant admis, désormais
classés dans la catégorie des maladies infectieuses. Depuis, les conférences de
consensus et les articles sur cette pathologie infectieuse se suivent et le lien entre
H. pylori et pathologie gastro-duodénale, est reconnu par tous en médecine.
La découverte de la responsabilité de Helicobacter pylori dans les ulcères et les
gastrites a été récompensée par le prix Nobel de physiologie et de médecine de
2005, attribué conjointement à Barry J. Marshall et J. Robin Warren qui leur est
décerné en 2005. La découverte de Warren et de Marshall a préparé le terrain
pour que les ulcères peptiques soient traités par l'éradication de la bactérie avec
une combinaison d’antibiotiques et d’inhibiteurs de la sécrétion acide.
5
Helicobacter pylori
Revue bibliographique
I-2 Anatomie et Histologie
I-2-1 Anatomie
L’estomac est une vaste poche musculeuse ayant la forme d’un J majuscule et
située sous le diaphragme entre l’œsophage et l’intestin grêle (Poilleux, 1943;
Frexinos, 1983; Labayle, 1990) et présente une ouverture en haut, le cardia qui
permet la jonction avec l’œsophage. Il comprend le sphincter œsophagien
inférieur et le pylore à sa sortie vers le duodénum en bas. Il occupe la plus
grande partie de la loge phrénique gauche de la cavité abdominale (Poilleux,
1943; Frexinos et al., 1989). Sa capacité est de 1 à 1,5 litres (Frexinos, 1983;
Frexinos et al., 1989). Il est séparé de l’œsophage par le cardia et du duodénum
par le pylore (Poilleux, 1943; Labayle, 1990) et il comprend schématiquement 2
parties, une partie verticale (fundus) occupant le 2/3 de l’estomac et une partie
horizontale (l’antre) (fig. 1) (Poilleux, 1943; Frexinos, 1983; Frexinos et
al., 1989).
Fig. 1 : Structure de l’estomac (Frexinos, 1983)
6
Helicobacter pylori
Revue bibliographique
I-2-2 Histologie
D’une épaisseur de 5mm, la paroi gastrique est formée par les quatre tuniques
caractéristiques du tube digestif : muqueuse, sous muqueuse, musculeuse, et
séreuse. La muqueuse est recouverte par un épithélium revêtu par un mucus
la protégeant contre l’acidité gastrique (fig. 2) (Frexinos, 1983; Frexinos et
al.,1989). L’épithélium reposant sur un chorion, la lamina propria, dessine à
la surface luminale des cryptes qui s’invaginent profondément dans la lamina
propria pour former des glandes dont l’aspect varie avec la région considérée au
niveau du fundus et au niveau de l’antre (Czyba et Girod, 1967; Frexinos et
al., 1989).
Au niveau du fundus
Les cryptes sont courtes et étroites. Les glandes sont tubulaires et rectilignes
(fig. 3) (Czyba et Girod, 1967; Frexinos, 1983; Frexinos et al., 1989). Elles sont
surtout exocrines en produisant la majeure partie du suc gastrique. Deux types
cellulaires principaux sont représentés dans les glandes fundiques. Les cellules
pariétales responsables de la sécrétion d’acide chlorhydrique et Les cellules
principales sécrétant la pepsine sous forme de précurseur, le pepsinogène inactif,
qui sera activé lors de l’abaissement du pH gastrique (Frexinos, 1983; Frexinos
et al., 1989).
Au niveau de l’antre
Les cryptes sont hautes et étroites. Les glandes antrales sont courtes et
fréquemment tubulo-ramifiées (fig. 4). La plupart des cellules sont de type
muqueux (Czyba et Girod, 1969; Frexinos, 1983; Frexinos et al., 1989).
La caractéristique cytologique la plus remarquable est la présence d’un très
grand nombre de cellules endocrines comme la cellule G, la plus connue, qui
synthétise et sécrète la gastrine. D’autres types cellulaires endocrines sont
également présentes dans la muqueuse antrale et la muqueuse fundique comme
les cellules D sécrétant la somatostatine (Frexinos, 1983; Frexinos et al., 1989).
7
Helicobacter pylori
Revue bibliographique
Fig. 2 : Schéma général de la muqueuse gastrique (Frexinos et al., 1989)
Fig. 3 : Structure de la muqueuse fundique ((Frexinos et al., 1989)
Fig. 4 : Structure de la muqueuse pylorique (Frexinos et al., 1989)
8
Helicobacter pylori
Revue bibliographique
I-3-Physiologie de l’estomac :
L’estomac possède une double fonction : mécanique et chimique (Lambo et
al., 1990).
I-3-1 Fonction mécanique :
L’estomac permet d’assurer la digestion par sa fonction mécanique (brassage). Il
reçoit un mélange d’aliments solides et liquides provenant de la déglutition, les
évacue vers l’intestin sous une forme fluide « le chyme ».
Le brassage alimentaire est réalisé par des ondes péristaltiques mettant en cause
les couches musculaires de l’organe. Elles débutent à la partie supérieure du
corps et se dirigeant vers le pylore à raison de trois contraction par minute.
L’évacuation du chyme vers le duodénum débute lorsque le bol alimentaire est
suffisamment liquide, la vitesse de cette vidange dépend à la fois du volume et
de la composition chimique du contenue gastrique.
I-3-2 Fonction chimique :
Elle correspond à la sécrétion gastrique dont le volume atteint entre 1 à 2litres
par jour. Cette sécrétion gastrique est réalisée par les multiples glandes
gastriques dont l’activité est stimulée lors du repas. La sécrétion est
principalement
composée
d’eau,
d’acide
chloridrique
et
d’enzyme
protéolytiques. L’estomac sécrète également un mucus qui protège sa paroi de
l’action des sécrétions acides. La protection de la paroi gastrique contre l’acidité
(PH 1.5 à 3.5) est assurée par trois facteurs : une couche épaisse de mucus,
la présence de jonctions serrées entre les cellules empêchant la pénétration du
suc gastrique dans la paroi et le remplacement cellulaire rapide.
9
Helicobacter pylori
Revue bibliographique
I-4 Mécanisme de régulation :
L’état de jeûne inhibe la sécrétion de la gastrine et la prise alimentaire la stimule
La cellule G antrale libère de la gastrine qui stimule la sécrétion acide. Elle est
dans l’antre en contact étroit avec les cellules D qui synthétisent et sécrètent
la somatostatine qui à son tour, inhibe la cellule G (Sobhani et al., 1994,1995).
H. pylori se trouve au contact de ces cellules (Sobhani et al., 1994).
La sécrétion gastrique acide stimulée exerce un effet de rétrocontrôle négatif sur
la production et la libération de gastrine en stimulant la sécrétion de
somatostatine par les cellules D antrales. Celles-ci inhibent la synthèse de
gastrine par la cellule G antrale. La somatostatine peut agir aussi en amont de la
gastrine en inhibant la libération du GRP appelé encore bombésine, l’un des
stimulants majeures de la cellule à gastrine. La somatostatine fundique inhibe la
sécrétion acide et module la réponse des cellules pariétales aux stimulations
gastriniques et vagales (fig. 5) (Sobhani et al., 1994, 1995).
L’infection chronique par H. pylori est directement responsable d’une
hypergastrinémie modérée (Vallot et Merrouche, 1992; Ruszniewski, 1994;
Sobhani et al., 1995) qui se traduit par un hyperfonctionnement des cellules G
antrales et ceci peut s’expliquer par la baisse de la somatostatine antrale,
secondaire à la réduction du fonctionnement des cellules à somatostatine
(cellules D antrales) (Gotz et al., 1994; Delchier, 1995; Sobhani et al., 1995).
I-5 Taxonomie
Helicobacter pylori peut être considéré comme le chef de file d’un nouveau
groupe de bactéries appelé superfamille VI de bacilles Gram négatifs.
Le genre Helicobacter a été créé en 1989. bactéries préalablement placées dans
le genre Campylobacter (Goodwin et al., 1989). H. pylori fait partie d’un grand
groupe de bactéries qui phylogénétiquement sont éloignées des autres bactéries à
Gram négatif (fig. 6) (Lamouliatte et al., 1992; Minor et Veron, 1990). Ce
groupe réunit les genres Campylobacters, Hélicobacter, Aerobacter et Wolinella
10
Helicobacter pylori
Revue bibliographique
Fig. 5: Schéma de la régulation physiologique de la sécrétion
gastrique acide chez l’homme (Sobhani et al., 1995)
Escherichia coli
Rocchalimaea quintana
Agrobacterium
tumefaciens
Wolinella succinogenes
Campylobacter pylori
Campylobacter
sputorum
Campylobacter laridis
Campylobacter
Campylobacter coli
Campylobacter fetus
fetus
Thiovulum sp.
Anacystis nidulans
Fig. 6: Relation phylogénétique de H.pylori avec certaines
bactéries à Gram négatives (Romaniuk et al., 1987)
11
Helicobacter pylori
Revue bibliographique
ayant la particularité d’être adapté aux mucus du tube digestif de l’homme et des
animaux (Sobhani et al., 1995; Lamouliatte et al., 1992). Cette particularité
s’accompagne de caractéristiques morphologiques (forme spiralée, flagelles
polaires) et physiologiques (métabolisme microaérobie et absence d’utilisation
des carbohydrates) (Lamouliatte et al., 1992). Il a initialement été dénommé C.
pyloridis en raison de certaines similitudes morphologiques avec les espèces du
genre Campylobacter et de sa nature gastrique (pylore) (Chamouard, 1996,
Fennerty, 1994 ; Sobhani et al., 1991; Goodwin et al., 1989). il a ensuite été
renommé C. pylori en accordance avec le code international de la nomenclature
des bactéries puis classé au sein d’un nouveau genre appelé Helicobacter pylori
(Fennerty, 1994 ; Marshall et Goodwin, 1987 ; Goodwin et al., 1989). Le nom
pylori tire son origine du latin « pylorus », qui signifie « gardien de
l'ouverture », et qui fait référence à l'ouverture circulaire (pylore) menant de
l'estomac au duodénum.
Le genre Helicobacter appartient à la famille des Helicobacteraceae (ordre des
Campylobacterales,
classe
des
Epsilonproteobacteria,
phylum
des
"Proteobacteria", domaine ou empire des "Bacteria" ou "Eubacteria"(tableau 1)
Depuis une dizaine d’années, d’autres espèces ont été découvertes ou reclassées
dans ce genre (tableau 2), la plupart colonisent l’estomac de différents animaux.
Les autres Helicobacter sont rencontrés rarement chez l’homme. H pylori est
l’espèce type la plus importante en médecine (Goodwin et al., 1989).
I-6 Ecologie
L’estomac a longtemps été considéré comme étant stérile du fait du caractère
acide du liquide gastrique (pH 2-3), qui lui confère un rôle bactéricide majeur
(Dubois, 1996; Drasar, 1989; Foliguet et al., 1989; Vincent et Leclerc, 1991).
12
Helicobacter pylori
Revue bibliographique
Tableau 1: Classification d’Helicobacter pylori (Goodwin et al., 1989)
Classification classique
Règne
Bacteria
Division
Proteobacteria
Classe
Epsilon Proteobacteria
Ordre
Campylobacterales
Famille
Helicobacteraceae
Genre
Helicobacter
Espèce
Pylori
Tableau 2: Quelques espèces du genre Helicobacter (Goodwin et al., 1989)
Espèces
Niche écologique
Site d’infection
Helicobacter pylori
Homme
Estomac
Helicobacter cinaedi
Hamster, homme
Intestin
Helicobacter fennelliae
Homme
Intestin
Helicobacter mustelae
Furet
Estomac
Helicobacter felis
Chien, chat
Estomac
Helicobacter muridarum
Souris
Intestin
Helicobacter nemestrinase
Singe macaque
Estomac
Helicobacter acinonyx
Léopard
Estomac
Helicobacter heilmanu
Chien, chat, homme
Estomac
Helicobacter canis
Chien
Intestin
Helicobacter hepaticum
Souris
Intestin, foie
Flexispira rappini
Souris
Intestin
13
Helicobacter pylori
Revue bibliographique
Les bactéries ingérées au cours des repas ont une survie limitée à l’estomac
(Vincent et Leclerc, 1991) à l’exception de celles qui traversent rapidement
l’estomac ou qui résiste au pH gastrique (Savage, 1977).
En effet, les cas de colonisation bactérienne de l’estomac par des espèces
d’origine
aérodigestive
(Streptococcus,
Lactobacillus,
Staphylococcus,
Bactéroïdes, Bifidobactéries…) et occasionnellement les entérobactéries,
les bacilles pyocyaniques et les levures (candida) peuvent être dus à
l’hypochloridrie liée à l’âge, au traitement antisecrétoire ou à la chirurgie
(Vagotomie, gastrectomie) (Savage, 1977; Drasar, 1989; Vincent et Leclerc,
1991).
L’isolement en 1983 d’une bactérie spiralée désignée H. pylori de la muqueuse
gastrique a changé les concepts concernant la stérilité de l’estomac, pouvant être
le siège d’une croissance bactérienne (Vincent et Leclerc, 1991; Conférence de
consensus, 1995; Conclusions et recommandations du jury, 1996a ).
H. pylori est retrouvé dans l’estomac humain essentiellement dans l’antre mais
également dans le fundus (Moris et Nicholson, 1987; Foliguet et al., 1989;
Megraud, 1996b) ainsi que dans le liquide gastrique (Vincent et Leclerc, 1991;
Lamouliatte et al., 1992).
L’adaptation à l’estomac humain, site généralement hostile aux bactéries, est
une caractéristique essentielle de H. pylori liée à la microaérophilie et à la
résistance à l’acidité gastrique en produisant une uréase permettant
l’alcalinisation de son environnement (Goodwin et al., 1986; Vincent, 1995).
De plus, cette acidité gastrique évite une alcalinisation létale pour H. pylori lors
de la dégradation de l’urée (Clyne et Dramm, 1994).
H. pylori
fait partie des bactéries de mucus (Lamouliatte et al., 1992;
Missonier et Dorval, 1994 ). Il vit sous la couche de mucus de l’épithélium de
surface de la muqueuse gastrique (fig. 7) (Vallot, 1994; Vincent, 1994a) ou
occupant la lumière des cryptes gastriques (De Mascarel et Merlio, 1989;
14
Helicobacter pylori
Revue bibliographique
Sobhani et al., 1991), et tendent à se regrouper en amas dans les espaces
intercellulaires (Hazell et al., 1986; Vallot, 1994). Cependant, il n’est pas
retrouvé en situation intracellulaire (Le Minor et Veron, 1990; Vallot et
Merrouche, 1992; Vallot, 1994).
H. pylori est également présent dans les zones métaplasiques gastriques du
duodénum, de l’œsophage voire du rectum (Missonier et Dorval, 1994 ; Vallot,
1994 ; Vincent, 1994a). Il a aussi été isolé à partir de la plaque dentaire, la salive
et les selles (Kelly et al., 1993; Missonier et Dorval, 1994; Vincent, 1995 ).
Chez les animaux, la présence de H. pylori a été démontrée dans l’estomac des
chats et du porc (Handt et al., 1994; Vincent et al., 1996; Weeb et al., 1997) et
des singes (macaques, babouins et les chimpanzés) (Marshall, 1989; Hazell
et al., 1992; Vincent, 1994 ; Dubois, 1996).
Le réservoir environnemental est controversé. L’eau semble être un milieu
mieux adapté (Vincent, 1994a; Megraud, 1996b; Vincent et al., 1996).
Des études ont montré que l’eau peut être une source possible de transmission
d’Hélicobacter pylori et que H.pylori pouvait subsister sous une forme coccoide
dans l’eau pendant une longue période. Les formes cultivables de H. pylori ne
survivent pas plus de 48 heures dans l’eau (Benallal, 2009; de Korwin, 1993).
Fig. 7: Localisation de H. pylori au niveau de la muqueuse gastrique (Bigard, 1991)
15
Helicobacter pylori
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I-7 Caractères morphologiques
C’est un bacille à Gram négatif de 3 à 5 µm de long et 0,5 à 1 µm de large
(Fléjou, 1989 ; De Mascarel et Merlio, 1989 ; Avril, 1988). Il se présente sous
forme spiralée, incurvée ou en forme de U ou O dans les jeunes cultures (fig. 8)
(Sobhani et al., 1995; Fauchère, 1994; Fauchère et Rosenau, 1991) pouvant
évoluer vers des formes coccoïdes non cultivables dans les vielles cultures et en
milieu défavorable, seraient pour certains des formes de dégénérescence, pour
d’autres des formes de résistance (Cellini et al., 1994; Sobhani et al., 1995 ;
Megraud, 1994 ; Fauchère, 1994 ; Fauchère
sporulé
et Rosenau, 1991). Il est non
et dépourvu de capsule. Il est mobile par un système flagellaire
composé de 4 à 6 flagelles unipolaires engainés (fig. 8) lui permettant de se
mouvoir par frétillement et par des mouvements de rotation caractéristiques
(Sobhani et al., 1995 ; Vallot, 1994). Chaque flagelle possédant un bulbe
terminal le distingue des autres campylobacters (Fléjou, 1989; De Mascarel et
Merlio, 1989).
Fig. 8: Helicobacter pylori sous microscope électronique
16
Helicobacter pylori
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I-8 Caractères culturaux
H. pylori est une bactérie relativement fragile, sensible à la dessiccation et
exigeante sur le plan métabolique (Lamouliatte et al., 1992; Megraud, 1992;
Loziniewski, 1996 c’est. Elle ne peut pousser que dans une atmosphère
microaérophile humide contenant 5% d’O2, 10% CO2, 85% d’N2, une des
particularités que l’on utilise pour la mise en culture (Avril, 1988; Cellini et al.,
1994, 1995a; Yousfi et al., 1997). De plus, sa culture exige des milieux enrichis
tels que des milieux gélosés additionnés de sang, lysé ou cuit, d’hémines, du
sérum du charbon ou d’amidon (fig. 9) (Megraud, 1989a ; Fauchère et Rosenau,
1991; Fauchère, 1994a; Sobhani et al., 1995). Ces milieux sont rendus sélectifs
par addition d’antibiotiques spécifiques visant à éliminer les contaminants (Le
Minor et Veron, 1990; Lozniewski, 1996).
La température optimale de sa croissance est de 37°C. Par contre, H. pylori perd
sa viabilité à température ambiante et à l’air (Belblidia et al., 1995; Cellini et al.,
1995b; Lamouliatte et al., 1992).
Dans ces conditions, les colonies apparaissent en 3 à 7 jours voire 10 jours pour
une primoculture, ou en 2 à 4 jours pour un repiquage (Cellini et al., 1995b)
H. pylori développe de petites colonies de 1 mm de diamètre, transparentes ou
grisâtres, luisantes, discrètement bombées, rondes et régulières (fig. 10) (Cellini
et al., 1995b; Sobhani et al., 1995).
I-9 caractères phénotypiques :
H. pylori ont un métabolisme respiratoire comme les Campylobacters et tirent
principalement leur énergie des réactions de phosphorylation oxydative.
Le caractère microaérophilique dépend de l’inhibition d’enzymes comme la
lactate déshydrogénase plutôt que celle de la chaîne de cytochrome (Sobhani
et al., 1991).
17
Helicobacter pylori
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Fig. 9 : Milieux utilisés pour la culture de H. pylori
Fig. 10: A²spect des colonies de H. pylori sur gélose au sang et sur gélose selective
18
Helicobacter pylori
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Le capital enzymatique de H. pylori est important puisqu’il possède
une catalase, phosphatase alcaline, phosphatase acide, cytochrome oxydase,
superoxyde dismutase, DNAse, gamma glutamyl transpeptidase, leucine
aminopeptidase, des amidases, des protéases, des lipases, des phospholipases et
surtout une uréase extracellulaire en quantité extrêmement importante, Ce qui
permet de la différencier des Campylobacters (tableau 3). Cette puissante uréase
hydrolyse l’urée du liquide gastrique, en libérant de l’ammoniaque, permettant
ainsi l’alcalinisation du milieu et la survie de la bactérie dans l’estomac acide.
H. pylori ne réduit pas les nitrates et n’hydrolyse pas l’hippurate (Megraud,
1989; Veron, 1989). Il n’utilise pas les sucres (asaccharolytiques) ni par
fermentation, ni par oxydation, c’est à dire qu’il tire son énergie d’autres
sources : les acides aminés et les acides organiques (Monterio, 1994; Megraud,
1994; Sobhani et al., 1991).
I-10 Caractères génétiques
Le génome de H. pylori est trois fois plus petit que celui de E.coli, et codé pour
environ 27000 protéines dont 500 sont reconnues spécifiques à la bactérie,
soulignant le particularisme de l’Helicobacter pylori (Lamarque, 1998).
Cependant, les découvertes faites sur le génome permettent d’élaborer des
mutants dont les facteurs pathogènes ou les voies métaboliques sont inactivés
(Lamarque, 1998). D’autre part, l’espèce de H.pylori se distingue par la valeur
plus base de (G+C) de son ADN qui varie entre 36 et 37%, valeur différente de
celle du genre Vibrio (G + C = 38-51%) et du genre Wolinella (G + C = 4649%) (Leclerc et al., 1989; Sobhani et al., 1991a).
De plus, H.pylori se révèle d’une grande homogénéité sur le plan
phénotypique mais d’une extrême diversité génomique par les mesures
d’hybridation ADN-ADN (Megraud et Labigne, 1998).
Les travaux d’hybridation ADN-ADN et ADN-ARN montrent également
que H.pylori a un profil éloigné des Campylobacter (C.jejuni, C.fetus),
19
Helicobacter pylori
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Tableau 3: Caractéristiques biochimiques et culturales de H. pylori (Goodwin
et al., 1989).
Caractéristiques
H. pylori
NCTC
11637
Oxydase
+
Catalase
+
Uréase
+
Hydrolyse de l’hippurate
-
Réduction de nitrate
-
Production de H2S dans TSI
-
Gamma-glutmyltranspaspeptidase
+
Alcaline phosphatase
+
Motilité dans le bouillon cœur –cervelle
+
Motilité sur les milieux gélosés
-
Croissance en anaérobiose à 37°c
-
Croissance sur la gélose au sang contenant 3.5% NaCl
-
Croissance sur 0.5% de glycine
+
Croissance sur 1% de glycine
-
Croissance sur 1% de bile
-
Sensibilité à l’acide nalidixique(30 g)
R
Sensibilité à la céphalothine (30 g)
S
Sensibilité au métronidazole( 5 g)
S
20
Helicobacter pylori
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ce qui explique le changement récent de dénomination (Sobhani et al., 1991a).
La présence de plasmide a été observée chez plusieurs isolats de H.pylori
(Minnis et al., 1995). En effet, des études récentes ont reporté que 58% d’isolats
de H.pylori contiennent des plasmides dont la taille varie de1,8 à 40 kbp (Tijia et
al., 1987; Penfold et al., 1988).
A ce jour, la composition génomique complète de deux souches de H.pylori est
connue : « H. pylori 26695 » isolée en Angleterre en 1987 et « H.pylori J99 »
isolée au USA en 1994 (Flejou, 2001). Leur génome consiste en une structure
chromosome circulaire dont
91% sont constitués de régions codantes
(1,7×106pb ,1590 séquences codantes). Ils ont été entièrement séquencés en
1997(Lee , 1996).
I-11 Transmission
La transmission interhumaine directe de H. pylori est la plus probable.
On peut distinguer deux modes de transmissions :
a- Oro-orale
C’est le mode prédominant de transmission de H. pylori (Fauchère et Rosenau,
1991; Vincent, 1994b; Chow et al., 1995) qui se fait par l’intermédiaire du
liquide gastrique ou par la salive (Conférence de consensus, 1995; Riachi et
Colin, 1995; Conclusions et recommandations du jury, 1996).
La contamination par le liquide gastrique infectant (vomissement-régurgitation)
s’observe
surtout
chez
l’enfant.
L’origine
salivaire
(régurgitations
physiologiques) est incriminée chez l’adulte (Riachi et Colin, 1995 ; Vincent et
al., 1996). Le risque d’infection est accru chez les enfants nés de mères H. pylori
positives (Lamouliatte et al., 1992; Vincent, 1994b; Megraud, 1996b) ainsi que
chez les adolescents (Lamouliatte et al., 1992; Schultze et al., 1995; Megraud,
1996b ).
21
Helicobacter pylori
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b- Féco-orale
La transmission d’origine fécale intervient en cas de mauvaises conditions
d’hygiène (Vincent, 1994b; Vincent et al., 1996). Les eaux de surface pourraient
jouer le rôle de vecteur (Conférence de consensus, 1995; Conclusions et
recommandations du jury, 1996; Vincent et al., 1996 ), mais le mode de
transmission à partir de l’environnement (alimentation, animaux…) est peu
vraisemblable (Riachi et Colin, 1995; Vincent et al., 1996) compte tenu de
la grande fragilité du germe (Conclusions et recommandations du jury, 1996;
Conférence de consensus, 1995).
Enfin la transmission par le matériel endoscopique contaminé est probable
(Fauchère et Rosenau, 1991; Conférence de consensus, 1995; Conclusions et
recommandations du jury, 1996; Megraud, 1996b). Les endoscopistes pourraient
être un groupe de risque en raison du contact fréquent avec les malades
(Fauchère, 1994a; Riachi et Colin, 1995; Sobhani et al., 1995). Ceci souligne
l’importance des mesures de désinfection du matériel ainsi que du port des gants
par les endoscopistes (Conférence de consensus, 1995; Conclusions et
recommandations du jury, 1996; Megraud, 1996b).
I-12 Prévalence
Environ deux tiers de la population mondiale sont infectés par cette bactérie.
Le taux d'infection varie d'un pays à l'autre. En effet, cette infection est plus
élevée dans les pays en développement que dans les pays développés, environ
25 % dans les pays occidentaux avec d'importantes disparités et de 90% dans
les pays du Tiers-Monde (Fig. 11). La distribution géographique de l’infection à
H. pylori est associée principalement à l’état de développement économique.
Le taux d’infection décroît généralement avec l’amélioration des conditions
socio-économiques (Benallal, 2009; Sobhani et al., 1991;
al., 1992 ; Vincent, 1994b; Illoul et al., 1995 ).
22
Lamouliatte et
Helicobacter pylori
Revue bibliographique
De plus, l’infection par H. pylori est souvent acquise dans l’enfance et en
particulier au cours des cinq premières années de la vie (Lamouliatte et
al., 1992; Guerre, 1996; Vincent et al., 1996). Sa prévalence augmente avec
l’âge pour atteindre 50% voire plus pour les sujets de plus de 60 ans (Vincent,
1995; Veldhuyzen van Zanten et al., 1994; Megraud, 1994 f; Sobhani et
al., 1995).
Les facteurs suivants favorisent l’infection : le niveau socio-économique,
l’ethnie (plus fréquent chez les noirs que chez les blancs), la promiscuité
(nombre d’enfant par pièce, la taille de la famille, la taille des logements…) et
les conditions d’hygiène (Nowottny et Heilman, 1989; Colin et al., 1995;
Sobhani et al., 1995).
Fig. 11 : Distribution géographique de l’infection à H. pylori dans les différentes
régions du monde .
23
Helicobacter pylori
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I-13 Facteurs de colonisation
Helicobacter pylori, comme toutes les autres bactéries, est sensible à l’acidité
gastrique. Pour pouvoir coloniser et survivre dans la muqueuse gastrique, il va
devoir mettre en jeu un certain nombre de propriétés.
En effet, H. pylori possède 3 principales propriétés lui permettant de coloniser
l’estomac malgré la barrière constituée par le mucus visqueux et malgré l’acidité
gastrique qui tue la plupart des bactéries : la mobilité, l’uréase et l’adhérence
(fig. 12) (Fauchère et Rosenau, 1991; Lamouliatte et al., 1992; Fauchère,
1994b ; Monterio, 1995 ; Bretagne, 1996).
Fig. 12 : Mécanismes de colonisation de H. pylori de la muqueuse gastrique
24
Helicobacter pylori
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I-13-1 Mobilité
Elle permet à H. pylori de se mouvoir dans le mucus mieux que d’autres
bactéries. Elle est non seulement due à sa forme spiralée mais aussi à la présence
des flagelles engainés. En effet, H. pylori possède un système flagellaire adapté
à cet environnement particulièrement visqueux. De plus, la morphologie spiralée
s’accentue quand la viscosité augmente. Ces deux particularités permettent à
la bactérie d’avoir une plus grande mobilité et de traverser ainsi les mucus avec
une vélocité plus importante (Fauchère et Rosenau, 1991; Lamouliatte et
al., 1994; Labigne, 1994; Monterio, 1995; Bretagne, 1996).
I-13-2 Uréase
Lors de l’infestation, H. pylori va se retrouver dans le lac gastrique extrêmement
acide. Pour se protéger de cette acidité gastrique, H. pylori produit une uréase
très active capable d’hydrolyser l’urée normalement présente dans l’estomac en
libérant de l’ammoniac . Cet ammoniac neutralise le micro-environnement de
la bactérie, ce qui rendra le milieu plus accueillant à cette bactérie (Fauchère et
Rosenau, 1991 ; Lamouliatte et al., 1992 ; Labigne, 1994 ; Wadstrom, 1996 ).
I-13-3 Adhérence
H. pylori est étroitement adhérente aux membranes de cellules épithéliales
gastriques mais reste extracellulaire (Fauchère et Rosenau, 1991 ; Fauchère,
1994a, 1994b). Cette adhérence est due à la présence des antigènes bactériens
(désignés adhésines) comme l’hémagglutinine capable de se fixer sur les
récepteurs de l’épithélium comme le N-acétyl-neuraminyl lactose. Il en résulte
la formation d’une lésion d’attachement et rupture membranaire. Cette capacité
d’adhérence permet aux bactéries de résister aux mouvements péristaltismes
gastriques et à la mobilité de l’extrémité apicale des cellules épithéliales (Evans
et al., 1999; Labigne, 1994).
25
Helicobacter pylori
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1-14 Mécanisme de persistance
Après la phase de contamination, H. pylori va coloniser la muqueuse gastrique
et persister au site d’infection pendant un temps plus au moins long, puis
le pouvoir pathogène d’Helicobacter pylori commencera. De plus, l’adhésion
cellulaire favorise et multiplie la toxicité des facteurs intrinsèquement
responsables des lésions de la muqueuse épithéliale gastrique (tableau 4).
L’agression de la muqueuse gastrique va stimuler le système immunitaire et
malgré une réponse humorale spécifique et locale,
H. pylori échappe à
la phagocytose. Pour se défendre, la bactérie synthétise deux enzymes :
la catalase et la superoxide dismutase. Mais aussi grâce à l’activité uréasique et
la libération d’ammoniaque, elle est capable de neutraliser le contenu du
phagolysosome diminuant ainsi la bactéricide. De plus, la grande quantité
d’antigènes relargués par la bactérie, pourrait saturer les anticorps et rendre
inefficace la réponse immunitaire locale. Ces différents processus permettent
d’expliquer la colonisation à long terme de la muqueuse gastrique (Fauchère,
1994c; Lamouliatte et al., 1992; Monteiro, 1995; Sobhani et al., 1995).
I-15 Réactions inflammatoires
L’inflammation se définit, entre autre, par un infiltrat cellulaire, constitué de
polynucléaires neutrophiles, de lymphocytes et de macrophages.
H. pylori, qui n’a pas de caractère invasif, peut produire des facteurs de
chimiotactismes
et
d’activateurs
des
polynucléaires
neutrophiles.
Ces
polynucléaires sécrètent à leur tour, des enzymes protéolytiques et des radicaux
libres. Ce qui permettra à la bactérie de perpétuer l’inflammation et de
provoquer, à long terme, une lyse des cellules de la muqueuse gastrique (Beil,
1995; Labigne, 1994). Certaines souches de H. pylori, possédant le marqueur
Cag A, stimulent activement la production d’interleukine -8 (II-8). Cette
cytokine, puissant médiateur de l’inflammation, est responsable du recrutement
par chimiotactisme des polynucléaires neutrophiles et de leur activation
(Fauchère, 1994c; Sobhanie et al., 1991; De Korwin, 1994a).
26
Helicobacter pylori
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Tableau 4: Facteurs de pathogénécité bactériens (Lamouliatte et al., 1992 ;
Monteiro, 1995 ; Sobhani et al., 1995)
Facteur
Uréase
Action
L’ammoniac produit est responsable de perturbation de la
sécrétion de mucus, action cytotoxique sur les cellules
épithéliales et effet toxique sur les polynucléaires.
Lipopolysaccharide
sialidase
Altération du mucus gastrique.
Oxydase-catalasesuperoxydedismutase
(SOD)
Protection contre les défenses de l’hôte
Protéase
phospholipase
Facilité de migration de la bactérie.
Altération du mucus, altération de la perméabilité des
membranes cellulaires
Production des médiateurs pro-inflammatoires.
N-alpha methyl histamine.
Inhibition de la production de somatostatine.
Cytotoxine
Vac
vacuolisante Formation de vacuoles au niveau des cellules épithéliales
et endommagement de la muqueuse.
Système de captation du Elaboration des systèmes pour capter le fer chez l’hôte.
fer.
27
Helicobacter pylori
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I-16 Méthodes de recherche de H. pylori
Les méthodes diagnostiques de l’infection à H. pylori sont nombreuses mais
aucune d’entres-elle ne peut aujourd’hui être considérée comme un test de
référence (Bruley Des Varannes, 1996 ; Riachi et Colin, 1995 ; Souquet, 1995).
Leur utilisation varie en fonction des buts recherchés et des populations ou
individus étudiés (Souquet, 1995).
On distingue en pratique deux grands types de méthodes, méthodes dites
invasives nécessitant une endoscopie digestive et des biopsies (test rapide à
l’uréase, examen histologique « anatomopathologique », examen cytologique,
culture et amplification génique par PCR) et méthodes non invasives (test
respiratoire à l’urée et sérologique) (fig. 13) (Yousfi et al., 1997 ; Bruley
Des Varannes, 1996 ; Conclusions et recommandations du jury, 1996 ;
Conférence de consensus, 1995 ; Riachi et Colin, 1995 ; Sobhani et al., 1995 ;
Lamouliatte et al., 1992 ; Megraud, 1992 ; Faniez, 1995).
I-16-1 Méthodes invasives
I-16-1-1 Test à l’uréase :
Ce test est basé sur l’existence d’une uréase très intense chez H. pylori dans un
prélèvement gastrique qui va hydrolyser l’urée pour libérer de l’ammoniac et du
CO2, augmentant ainsi le pH du milieu et faire virer la couleur de l’indicateur du
pH (Megraud, 1994a, 1996a; Riachi et Colin, 1995 ; Lamouliatte et al., 1992).
Ce test a beaucoup de succès car il est simple, rapide, peu coûteux et surtout
réalisable par l’endoscopiste lui-même (Megraud, 1996a ; Sobhani et al., 1995;
Bruley Des Varannes, 1996). Actuellement différents tests sont commercialisés.
Ils varient en fonction de leurs milieux (gélosés, liquides, semi-gélosés comme
le CLO test).
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Helicobacter pylori
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Sujet gastralgique
Méthode invasive
(endoscopie)
Biopsie
Amplification
génique par PCR
Au laboratoire.
Méthode non invasive
(pas d’endoscopie)
Sérodiagnostic
(sérologie)
Sur 1 mg de sang
Test Elisa
délai de réponse 4h
Test Uréase
En salle
d’endoscopie
Test
commercialisé
(CLO ou CU test)
délai de réponse
20 minutes
Bactériologie
Au
Laboratoire
Culture
Méthode de référence
Milieu commercialisé
délai de réponse 5
jours
Test respiratoire à
C13 ou C14 urée sur
l’air expiré mesuré
de CO2
Histologie
Au laboratoire,
coloration HES ou
Giemsa, délai de
réponse 2jours.
Cytologie
Coloration de Gram
Délai de réponse 30
minutes
Antibiogramme
Fig. 13: Méthodes diagnostiques de H.pylori (Megraud, 1992 ; Sobhani et al., 1995)
29
Helicobacter pylori
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La lecture s'effectuera en moins d'une heure (20 à 30 min), directement en salle
d'endoscopie (fig. 14). La sensibilité du test est augmentée en utilisant deux
biopsies pour une spécificité excellente (supérieure à 95%) (Bruley Des
Varannes, 1996; Conférence de consensus, 1995 ; Riachi et Colin, 1995 ;
Megraud, 1994a; Souquet, 1995). Car il faut en effet un nombre de bactéries
important (> 105 bactéries) pour faire virer le test, ce qui limite son utilité pour
le contrôle de l’éradication du germe. Toutefois, au-delà de 18 heures, outre
la perte de l’intérêt d’un diagnostic rapide, sa spécificité décroît en raison de
l’apparition de faux positifs, dus à la présence de bactéries contaminantes uréase
positive d’origine buccale comme Staphylococcus. sp, Streptococcus. Sp voire
Klebsiella, Proteus ou même gastrique tel que Gastrospirillum hominis, bactérie
rarement rencontrée mais pouvant être à l’origine de gastrites (Delchier, 1994 ;
Megraud, 1992 ; Megraud, 1994a; Lamouliatte et al., 1992).
Fig. 14 : Test à l’uréase sur milieu urée-indole (a), avec le kit CLO test (b)
30
Helicobacter pylori
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I-16-1-2 Examen cytologique
L’examen cytologique d’une empreinte biopsique après simple coloration de
Gram permet de repérer les Helicobacters par leur morphologie caractéristique
(Sobhani et al., 1995 ; Megraud, 1994a , 1996a; Lozniewski, 1996).
Le prélèvement peut être coloré au Gram, au Giemsa modifiée ou à l'orange
d'acridine fluorescent.
Des formes coccoïdes peuvent être présentes qui
évoquent la présence d’H.pylori mais ne permet de conclure sans l’utilisation de
tests immunologiques avec des anticorps spécifiques marqués (Megraud, 1992,
1994 ; Lamouliatte et al., 1992 ; Sobhani et al., 1991). Cet examen est simple,
rapide, reproductible, relativement sensible mais
spécifique (Sobhani et
al., 1991, 1995).
I-16-1-3 Examen anatomopathologique
Il s’agit du moyen de détection le plus répandu. Il permet à la fois de mettre en
évidence H. pylori à partir des coupes histologiques de la biopsie gastrique et
d'identifier les lésions de la muqueuse gastrique (fig. 15). Il n’est satisfaisant que
s’il est pratiqué par un praticien spécialisé, La sensibilité et la spécificité de cet
examen sont supérieures à 90%. La méthode doit comporter une fixation des
biopsies dans le formol et adopter des colorations facilitant la reconnaissance de
la bactérie au microscope (Giemsa modifié, HES, Warthin- Starry ou crésyl
violet) (Lozniewski , 1996; Megraud 1994a; Sobhani et al., 1995).
Fig. 15: Examen anatomopathologique d’une biopsie gastrique (Lynch, 1997).
31
Helicobacter pylori
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I-16-1-4 Culture:
C'est la méthode de diagnostic de référence car la seule permettant d’une part
l’isolement et l’identification de H. pylori et d’autre part l’étude de la sensibilité
aux antibiotiques et le typage moléculaire des souches (Megraud, 1994a;
Fagniez, 1995 ; Conférence de consensus, 1995 ; Riachi et Colin, 1995).
Elle est d’une spécificité absolue car elle permet une identification précise de
la bactérie (Megraud, 1989; Souquet, 1995 ; Bruley Des Varannes, 1996).
Elle est aussi d’une sensibilité assez importante car il suffit, théoriquement qu’il
y’ ait une bactérie dans la biopsie pour obtenir une colonie et donc un résultat
positif. Cependant, quelques difficultés techniques peuvent influencer
la sensibilité de la culture, qui est extrêmement dépendante des performances du
laboratoire et des conditions techniques (transport, nombre de biopsies,
laboratoire…). En effet, le transport de biopsie gastrique au laboratoire dans de
bonnes conditions reste un élément très important pour la réussite de la culture.
Il est donc nécessaire de ne pas exposer les fragments biopsiques à l’air, et de
les placer dans une solution saline pour un transport de courte durée d’un
maximum de 4 h, ou au mieux dans un milieu de transport comme le Portagerm
qui permet à la culture d’être retardée de 24 h (Benallal, 2009; Lozniewski,
1996 ; Megraud, 1994g).
I-16-1-5 PCR en temps réel ou PCR quantitative :
La nouvelle technique PCR en temps réel (Real-time PCR) est une innovation
dans le diagnostic de H. pylori parce qu'elle permet non seulement une détection
rapide et précise de H. pylori mais également sa quantification ainsi que
la détection des mutations qui sont associées à la résistance aux antibiotiques.
Effectivement, la PCR en temps réel est une révolution dans l’utilisation de
la PCR, cette technique consiste à mesurer la quantité d’ADN polymérisé à
chaque cycle (temps réel) (expliquant l'appellation PCR quantitative), grâce à un
marqueur fluorescent, mais elle nécessite des thermocycleurs particuliers.
32
Helicobacter pylori
Revue bibliographique
Elle utilise le principe de base de la PCR classique avec pour différence
une amplification mesurée non pas en final mais tout au long de la réaction,
donc en temps réel. Plusieurs systèmes de détection sont utilisés pour
la détection ou la quantification du signal fluorescent en temps réel. Ils sont
généralement divisés en 2 groupes les agents intercalants et les sondes (Wittwer
et al., 1997; Vaira et al., 2000). De plus, la PCR en temps réel est utilisée pour
de nombreuses applications notamment à des fins diagnostiques et/ou de
recherche pour la détection et/ou la quantification rapide d’agents pathogènes.
Cependant, cet examen n'est pas encore passé dans la pratique courante.
La disponibilité de ces tests est encore limitée. Il s'agit d'une technique d'avenir
qui permet le diagnostic rapide de l'infection de H. pylori avec des conditions de
prélèvement ou de transport moins contraignantes que celles de la culture.
Elle peut servir à la détection de H. pylori même en cas de dégradation
des prélèvements (Benallal, 2009 ; Ho et al., 2000).
I-16-2 Méthodes non invasives :
I-16-2-1 Test respiratoire à l’urée marquée (Urea breath test C 13 )
Comme pour le test rapide à l'urée, on utilise la propriété d'H. pylori à posséder
une activité uréasique en utilisant une solution d'urée marquée au carbone 13
(isotope naturel, stable, et non radioactif) que l'on fait ingérer au patient.
Dans l'estomac cette urée 'isotopique" est hydrolysée par l'uréase de la bactérie
provoquant ainsi la libération d'ammoniac et CO2 marqué. Ce 13CO2 passe
la barrière intestinale, se retrouve dans la circulation sanguine puis dans l'air
expiré par le poumon (Fig.16). L'analyse est effectuée à l'aide d'un spectromètre
de masse. On peut également utiliser l'urée marquée au carbone 14.
Les performances du test respiratoire sont excellentes, avec des sensibilités et
des spécificités de 90-95 %, aussi bien avant qu’après traitement d’éradication
de H. pylori. Ce test est actuellement considéré comme la meilleure méthode
33
Helicobacter pylori
Revue bibliographique
de diagnostic et de contrôle de l’éradication de H. pylori, lorsque l’endoscopie
n’est pas nécessaire (Graham et al., 2000 ; Logan et al., 1998 ; Vincent et
al., 1999)
Fig. 16: Etapes du test respiratoire à l’urée marquée au c13 (Logan et al., 1998)
I-16-2-2 Sérologie:
Helicobacter pylori stimule le système immunitaire de l'hôte, provoquant ainsi
l'apparition d'anticorps sériques spécifiques de type lgG, parfois d'IgA. La
détection d’anticorps contre l’ H. pylori permet le diagnostic d’infection à H.
pylori avec une sensibilité et une spécificité de l’ordre de 85 à 95%.
La technique la plus utilisée est l’Elisa de type IgG (Fig. 17).Cet anticorps
sérique lgG diminue très lentement après éradication de la bactérie (6 à 8 mois),
ce qui limite son utilisation pour le contrôle précoce après traitement. Il trouve
cependant sa place dans les études épidémiologiques. Cette technique est
avantageuse parce qu’elle permet de diagnostiquer plusieurs personnes,
rapidement et à coûts réduits. De plus, elle a l’avantage de ne pas être trop
invasive en comparaison à la biopsie par endoscopie. Elle est la méthode la plus
recommandée pour un test initial non seulement parce qu’elle est non-invasive
34
Helicobacter pylori
Revue bibliographique
mais aussi parce qu’elle est précise, moins dispendieuse et reproductible
(Kosunen et al., 1992 ; Leodolter et al., 2003).
Fig. 17: Test d’ELISA
I-17 Pathologies associées à H. pylori
L’infection à H. pylori une fois acquise persiste en l’absence d’éradication
thérapeutique. Elle provoque dans un premier temps une gastrite aiguë suivie
le plus souvent d’une gastrite chronique. Cette gastrite peut rester superficielle
ou évoluer vers un ulcère duodénal ou gastrique et à long terme un risque de
cancer gastrique ou lymphome de Malt (fig. 18) (Bretagne, 1996; Buckley et
O’Morain, 1996).
I-17-1 Gastrites
Le terme de gastrite désigne toute lésion inflammatoire de la muqueuse
gastrique en réponse à une agression de l'estomac. La muqueuse agit comme une
barrière protectrice de la paroi de l’estomac. Sans cette protection, la paroi de
l’estomac devient plus sensible et serait vite attaquée par les acides ou par
d’autres substances irritantes qui provoqueraient des ulcères, c’est ce qui se
produit dans le cas de l’ulcère gastro-duodénale, mais il arrive aussi que
la muqueuse soit elle même irritée, sans que la paroi soit touchée : on parle alors
de gastrite. La gastrite peut être aigue et se manifester soudainement ou être
chronique et évoluer lentement sur plusieurs années (Stanghellini et al., 2001).
35
Helicobacter pylori
Revue bibliographique
Ulcère
duodénal
Métaplasie
duodénal
Hypersécrétion
acide
Gastrite
aïgue
Guérison
Gastrite
chronique
Lymphomes
gastriques
Atrophie
muqueuse
et
métaplasie
Tumeurs
carcinoïdes
Ulcère
Adénocarcinome
gastrique
Fig. 18 : Représentation schématique du rôle pathogène
de Helicobacter pylori (Schilio, 1996).
36
Helicobacter pylori
Revue bibliographique
I-17-1-1 Gastrite aigue
C’est une inflammation aiguë de la muqueuse gastrique (Burley Des Varannes
et Scarpignato, 1996). Elle est caractérisée par la présence d’un infiltrat
inflammatoire polynucléaire neutrophile venant phagocyter les bactéries (Burley
Des Varannes et Scarpignato, 1996; Chamouard, 1996).
Cette phase aiguë de l’infection est courte, symptomatique, habituellement
accompagnée
d’une
diminution
de
la
sécrétion
gastrique
acide
(hypochlorhydrie) et une légère augmentation de la gastrine (Sobhani et
al., 1991, 1995; Buckley et O’Morain, 1996 ). La gastrite aiguë peut disparaître
si la bactérie n’est pas retenue par la muqueuse gastrique (Sobhani et al., 1995).
Elle évolue le plus souvent vers la gastrite chronique (Sobhani et al., 1995;
Buckley et O’Morain, 1996).
I-17-1-2 Gastrite chronique
L'installation de la gastrite chronique constitue alors la deuxième phase de
l'infection à H. pylori (fig.19). C’est une inflammation chronique de
la muqueuse gastrique, caractérisée par l’infiltration de plasmocytes et de
lymphocytes avec la présence de polynucléaires et de monocytes signe d’activité
constamment associée à la présence de la bactérie. Elle est souvent
asymptomatique (Chamouard, 1996; Fléjou, 1996; Riachi et al., 1995).
Le rôle de H. pylori dans son étiologie est maintenant bien admis par
la communauté scientifique. Effectivement, H. pylori est le principal agent
étiologique de la gastrite chronique antrale de type B ou bactérienne (Vallot,
1994; Sobhani et al., 1995; Chamouard, 1996 ), gastrite qui touche
principalement l’antre gastrique mais elle peut parfois s'étendre vers le fundus
(gastrite antrofundique) (Colin et al., 1995; Chamouard, 1996). Cette gastrite
peut rester superficielle ou évoluer vers un ulcère duodénal ou gastrique et à
long terme un risque de cancer gastrique ou lymphome de Malt (Bretagne, 1996;
Bommelaer, 1996; Colin, 1996). La gastrite antrale (gastrite B) augmente
37
Helicobacter pylori
Revue bibliographique
le risque d’ulcère duodénal, la gastrite antrofundique (gastrite AB) augmente
celui de l’ulcère gastrique (Colin et al., 1995 ; Dorval, 1992).
L’éradication de l’infection entraîne la disparition de la gastrite de type B
(Kuipers, 1995; Sobhani et al., 1995; Buckley et O’Morain, 1996).
Fig. 19: Aspects endoscopiques des gastrites (Burley Des Varannes
et Scarpignato, 1996).
I-17-2 Ulcère duodénal
H. pylori joue un rôle important dans le déclenchement de l’ulcère duodénal qui
est presque toujours associé à une gastrite à H. pylori. Cette association est
retrouvée chez près de 90% des patients (Fennerty, 1994; de Korwin, 1994b;
Sobhani et al., 1995).
L’infection par H. pylori apparaît comme une condition nécessaire à la survenue
d’une récidive ulcéreuse du fait de la quasi-disparition des rechutes ulcéreuses
en cas d’éradication de H. pylori (Vallot, 1994; de Korwin, 1994b; Curel et al.,
1999). L’un des mécanismes pathogènes avancés expliquant l’ulcérogénèse
duodénale par l’infection à H. pylori est l’hypersécrétion postprandiale de
la gastrine (Hypergastrinémie) responsable d’une hypersécrétion d’acide
38
Helicobacter pylori
Revue bibliographique
(Fennerty, 1994; Missonier et Dorval, 1994; Gouyon et al., 1996). Ces deux
anomalies peuvent être liées aux effets de H. pylori sur les cellules D antrales
sécrétant la somatostatine, qui a un effet inhibiteur sur la libération de la gastrine
et donc sur la production d’acide (Fennerty, 1994; Missonier et Dorval, 1994;
Dorval , 1992,1995; Buckley et O’Morain, 1996 ) .
Dans le duodénum, cet apport excessif d’acide favorise l’apparition de zones de
métaplasie gastrique duodénale (essentiellement bulbaire). H. pylori présent au
niveau antrale colonise ces zones métaplasiques (Vallot, 1994; Bretagne, 1996;
Futami
el al., 1999) et provoque localement une réponse inflammatoire
chronique active par la libération éventuelle de cytotoxine produite par des
souches dites ulcérogènes de H. pylori, qui diminue la résistance muqueuse
duodénale (de Korwin, 1994b; Dorval, 1995 ; Missonier et Dorval, 1994).
Ceci favorise l’apparition d’une duodénite (bulbite), érosion bulbaire puis d’un
ulcère (fig. 20) (de Korwin, 1994b; Missonier et Dorval, 1994 ; Sobhani et al.,
1995).
I-17-3 Ulcère gastrique
La prévalence de l’infection par H. pylori dans l’ulcère gastrique est moins
fréquente que celle observée dans l’ulcère duodénal (Lamouliatte et al., 1992).
Elle varie de 59 à 86% (Buckley et O’Morain, 1996). L’ulcère gastrique
s’accompagne souvent de gastrite chronique à H. pylori qui prédomine
nettement dans l’antre et s’étend vers le fundus en réalisant une pangastrite
antrale (Conférence de consensus, 1995; Buckley et O’Morain, 1996; Fléjou,
1996). Le schéma physiopathologique de l’ulcère gastrique ressemble à celui de
l’ulcère duodénal avec toutefois une plus grande importance des lésions
cellulaires locales (fig. 20). L’éradication de H. pylori améliore la guérison des
ulcères et diminue significativement la fréquence des rechutes ulcéreuses
gastriques (Buckley et O’Morain, 1996; Chamouard, 1996; Curel et al., 1999).
39
Helicobacter pylori
Revue bibliographique
Fig. 20: Mécanisme de l’ulcère gastrique et duodénale (Megraud et al., 2001)
I-17-4 Cancer gastrique
Le cancer gastrique est la deuxième cause mondiale de mortalité par le cancer.
Le rôle de H. pylori dans la genèse de l’adénocarcinome gastrique, tumeur
maligne de l’estomac la plus fréquente, est bien établi (Correa, 1988, 1991 ;
Flejou, 1994 ; Munoz et Pisani, 1994 ; Uemura et al., 2001). H. pylori est en
effet mis en évidence chez plus de 90% des patients ayant un cancer gastrique
(Bretagne, 1996; Uemura et al., 2001).
Cette bactérie a été classée, en 1994, par l’O.M.S. comme facteur carcinogène
de grade I (Sobhani et al., 1995; Bretagne, 1996; Buckley et O’Morain, 1996).
L’infection chronique par H. pylori précède le développement du cancer d’une
période supérieure à 15 ans (Correa, 1988, 1991; Deltenne et al.,
1995; Bretagne, 1996) et constitue la première étape de ce processus par
l’intermédiaire de la gastrite chronique (Fuccio et al., 2007; Nomura et al.,
1991; Parsonnet et al., 1991; O’Morain et al., 1994; Sobhani et al., 1995).
40
Helicobacter pylori
Revue bibliographique
Le cancer gastrique est donc la conséquence de transformation successive de
la muqueuse gastrique, de la gastrite chronique superficielle en gastrite
chronique atrophiante. Cette dernière aboutit à des lésions de métaplasies
intestinales puis de dysplasie et enfin de l’adénocarcinome (fig. 21) (Correa,
1988, 1991; Fléjou, 1994; Dobrilla et al., 1994; O’Morain et al., 1994; Deltenre
et al., 1995).
I-17-5 Lymphome gastrique de MALT
Les lymphomes gastriques ne constitue que 1 à 5% des tumeurs malignes dont
la presque totalité sont des lymphomes B de type Malt (Tissu Lymphoïde
Associé aux Muqueuses ou Malt) (Deltenne et al., 1995; Fléjou,1995 ; François,
1995). L’infection par H. pylori est associée à ce type de lymphome (Buckley
and O’Morain, 1996 ; Fourmestraux, 1996 ; François, 1995 ; Fléjou, 1995). Elle
est, en effet présente chez plus de 90% des patients ayant un lymphome de type
Malt (Bretagne, 1996 ; Buckley et O’Morain, 1996 ; Vallot, 1994).
H. pylori joue un rôle prolifératif dans les lymphomes gastriques par
la stimulation durable qu’il impose (François, 1995 ; Sobhani, 1994 ; Hussel,
1993). Il provoque un infiltrat lymphocytaire de la muqueuse gastrique, qui
aboutit parfois à une gastrite folliculaire. Cette gastrite folliculaire peut dans de
rares cas, aboutir à la prolifération des lymphocytes B, caractéristique du
Lymphome de MALT (tissu lymphoïde associé aux muqueuses) (Hussel, 1993 ;
Sobhani, 1994). La plupart des lymphomes de Malt sont associés à la gastrite
chronique à H. pylori en particulier la gastrite folliculaire (Fléjou, 1994, 1995;
Fourmestraux, 1996).
41
Helicobacter pylori
Revue bibliographique
Normal
H. pylori
Gastrite superficielle
Gastrite atrophique
Métaplasie intestinale I-II
Métaplasie intestinale III
Dysplasie
Cancer
Fig. 21: Mécanisme proposé pour la carcinogenèse gastrique
(Correa, 1991).
42
Helicobacter pylori
Revue bibliographique
I-18 Sensibilité aux antibiotiques
L’étude de la sensibilité in vitro de H. pylori aux antibiotiques, utile dans
le choix thérapeutique, a montré l’excellente activité de la plupart des
antibiotiques à l’exception de la vancomycine, de la cefsulodine, du
triméthoprine, des sulfamides, du cotrimoxazole et de l’acide nalidixique (Avril,
1988 ; Fauchère et Rosenau, 1991; Sobhani et al., 1995).
Les antibiotiques les plus actifs sont des fluoroquinolones, les furanes,
les rifamycines, les tétracyclines, les β-lactamines (en particulier l’amoxicilline)
et les macrolides (en particulier la clarithromycine) et les nitroimidazolés
(metronidazole, tinidazole) (Lamouliatte, 1989, Fauchère et Rosenau, 1991;
Megraud, 1994a ; Cayla, 1996). Ces trois dernières classes d’antibiotiques sont
très utilisées dans les thérapeutiques (Burucoa, 2009 ; Conférence de consensus,
1995). Cependant, H. pylori peut développer rapidement des résistances
prédictives de l’échec thérapeutique (Burucoa, 2009 ; Fellous, 2009 ; Tankovic
et al., 2001 ; Lamouliatte et al., 1992 ; Megraud, 1992, 1994c ; Colin, 1995).
Seules les β-lactamines en particulier l’amoxicilline et les tétracyclines ne
sélectionnent pas des souches résistantes (Fauchère and Rosenau, 1991;
Lamouliatte, 1992 ; Megraud, 1994c). Il faut donc étudier le métronidazole
(30% de souches résistantes), la clarithromycine (20% de souches résistantes),
les tétracyclines et l’ampicilline qui sont les antibiotiques habituellement utilisés
dans le traitement d’éradication de H. pylori. La méthode d'antibiogramme par
la technique E-test est la plus adaptée à H. pylori, donnant les résultats les plus
reproductibles (Benallal, 2009 ; Burucoa, 2009) (fig. 22).
I-19 Traitement
Le traitement d’éradication de H. pylori repose actuellement sur l’utilisation
d’associations thérapeutiques entre antisécrétoire et antibiotiques (Burucoa,
2009 ; Fellous, 2009 ; Cayla, 1995, 1996; Catalono et al., 1999).
43
Helicobacter pylori
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La bithérapie (associant un antisécrétoire à un antibiotique ATB) donne des taux
d’éradication maximum de 60% (Colin, 1995; Conférence de consensus, 1995;
Vincent et al., 1996) mais la trithérapie (association d’un antisécrétoire et de
deux antibiotiques ATB) dont le taux d’éradication supérieur à 85% constitue le
traitement actuel le plus performant et le plus efficace en terme d’éradication
(tableau 7) (Khurana et al., 2007; Lamouliatte, 1994 a, 1994c; Vincent et al.,
1996; Chiba et al., 2000; Wong et al., 2000).
Les antibiotiques dont l’efficacité est démontrée sont :
- L’amoxicilline, pour lequel le taux de résistance est pratiquement nul, mais qui
n’a qu’une faible diffusion dans la muqueuse gastrique.
- La clarithromycine, macrolide le plus efficace sur H. pylori, mais qui peut
favoriser l’émergence de souches résistantes.
- Les nitro-imidazolés, métronidazole ou tinidazole, qui ont une excellente
diffusion, mais induisent rapidement une résistance bactérienne
Les anti-sécrétoires jouent un rôle majeur dans les trithérapies d’éradication non
seulement pour leur effet antalgique rapide et cicatrisant, mais surtout pour leur
capacité à augmenter le PH intragastrique permettant ainsi de potentialiser
l’effet des antibiotiques et leur diffusion. L’inhibiteur de pompe à protons (IPP)
utilisé est généralement l’oméprazole (tableau 5) (Colin, 1995; Conférence de
consensus, 1995; Gouyon et al., 1996).
Par ailleurs, le traitement idéal devra répondre aux critères de simplicité,
d’efficacité, de courtes durées, de faible coût et de tolérance (Lamouliatte,
1994b; Cayla, 1995; Colin, 1995; Van der Huls et al., 1997).
Cependant, H. pylori est une bactérie difficile à éradiquer (Megraud, 1994c;
Conférence de consensus, 1995), les facteurs limitant son éradication sont :
résistance aux antibiotiques, compliance du patient, durée de traitement, récidive
de l’infection et effet secondaires (Lamouliatte et al., 1992; Lamouliatte, 1994a,
1994b, 1994c; Sobhani et al., 1995; Colin, 1996 ).
44
Helicobacter pylori
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Fig. 22 : Détermination de la résistance et la sensibilité de H. pylori par E-test
Tableau 5: Les différents types de thérapies anti-H. pylori (Cayla, 1995)
Type
de Thérapie
Trithérapie
Bithérapie
Composition
Efficacité
IPP + Amox + Clarit
60 à 90%
Mode de
Consommation
Per os
IPP + Metro + Clarit
60 à 90%
Per os
IPP + Metro + Amox
60 à 90%
Per os
IPP + Amox
50 à 80%
Per os
IPP + Clarit
50 à 80%
Per os
45
Helicobacter pylori
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I-20 Traitement par les probiotiques
La colonisation de la muqueuse gastrique par H. pylori est fréquente et souvent
associée à une gastrite, un ulcère, un cancer ou un lymphome. L’introduction
des probiotiques, espèces bactériennes bénéfiques pour le tractus gastrointestinal pourrait être une option très intéressante pour rétablir l’équilibre
microbien et prévenir les maladies. Il a été prouvé que différentes souches de
probiotiques et, en particulier, les lactobacilles développent une activité
inhibitrice contre H. pylori. Elles agissent sur la viabilité de la bactérie et sur son
adhérence aux cellules épithéliales et stabiliser la fonction gastrique en
diminuant l’inflammation par leur action anti-oxydante et anti-inflammatoire.
Or, les probiotiques ne permettent pas l’éradication mais ils maintiennent
un taux diminué de bactéries pathogènes dans l’estomac, et combinés aux
antibiotiques, ils augmentent le taux d’éradication. Dans une revue de 13 études
cliniques, les patients de 6 d’entre elles ne prenant que des probiotiques et ceux
des 7 autres des probiotiques et une antibiothérapie, des effets des probiotiques
sur la bactérie ont été démontrés. L'administration des souches de Lactobacillus
à des souris infectées par la bactérie H. pylori a permis d'observer une réduction
de la quantité de la bactérie infectieuse de H. pylori dans l'estomac et un recul
des gastrites engendrées par cette bactérie. Ces résultats suggèrent que
l'utilisation de souches de bactéries lactiques sélectionnées avec soin permettrait
de mieux protéger l'homme contre les bactéries pathogènes. Les recherches
menées dans ce cadre se poursuivront par l'analyse de la composition chimique
des composés antimicrobiens bénéfiques et par des essais cliniques destinés à
tester l'effet des souches lactiques probiotiques les plus prometteuses sur
H. pylori (Gotteland et al., 2006).
46
Helicobacter pylori
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I-21 Vaccination comme perspective
Le traitement actuel, basé sur l'utilisation d'un inhibiteur de pompe à protons et
les antibiotiques, pose des problèmes d’efficacité par rapport à l’observance au
traitement, la résistance aux antibiotiques, et la répétition possible de l'infection.
Le développement d’un vaccin efficace contre H. pylori offrirait ainsi plusieurs
avantages. Diverses approches ont été suivies dans le développement des
vaccins contre H. pylori. Pour la plupart, elles ont été basées sur l'utilisation des
antigènes connus pour être impliqués dans la pathogénie de l'infection, comme
l'uréase, la cytotoxine vacuolating (VacA), l’antigène cytotoxine-associé
(CagA), antigenes les plus promotteurs pour le développement d’un vaccin
humain. Plusieurs études menées sur des modèles animaux ont démontré qu'une
approche immunologique permettait de prévenir et même de traiter
l’infection à H. pylori. Les premières études cliniques ont indiqué qu'une
immunisation fondée sur l'utilisation de l'uréase de H. pylori était sûre,
immunogène, et pouvait amener à une diminution du nombre de bactéries dans
la muqueuse gastrique. Cependant, les mécanismes exacts de la protection
induite par l'immunisation sont encore mal compris. Une protection complète
contre H. pylori devra faire appel à des vaccins plus puissants.
Plusieurs essais sont prévus chez l'homme, avec l’espoir que la plupart des
questions posées actuellement sur le germe seront résolues. Les efforts actuels
s'orientent donc vers trois axes principaux : une définition des marqueurs de
l'immunité liés à la protection, la caractérisation de nouveaux antigènes
protecteurs et la recherche de la meilleure voie d'immunisation. (CorthesyTheulaz et Michetti, 2000 ; Giuseppe et al., 2001).
47
Bactéries lactiques
Revue bibliographique
II- Généralités sur les bactéries lactiques
II-1 Historique
Les bactéries lactiques sont utilisées depuis des millénaires dans l’alimentation
humaine. L’utilisation de la fermentation par l’homme remonte à des temps très
anciens. Les premiers produits fermentés ont certainement été obtenus par
acidification spontanée des jus végétaux (vins, bières…) ou par contamination
naturelle du lait (yaourts, fromages…). La fermentation est réalisée à partir de
différents types d’aliments : des végétaux (concombres, betteraves, dattes, jus de
fruits, soja, etc...), des produits animaux (viande, lait) ou du poisson. Elle permet
de conserver les aliments mais aussi de leur donner une saveur différente du
produit original. Il faudra attendre Pasteur et ses travaux sur la fermentation en
1857 (Pasteur, 1857) pour établir un lien entre la fermentation lactique et les
bactéries. Metchnikoff isole en 1904 le « bacille bulgare » (Lactobacillus
delbrueckii sp. bulgaricus) présent dans le yaourt. Il étudie les propriétés
acidifiantes des bactéries du yaourt et il développera l’idée que les bactéries
contenues dans les laits fermentés ont un effet bénéfique sur la santé
(Metchnikoff, 1907). Il plaidera en faveur de l’introduction de produits laitiers
fermentés dans le régime alimentaire et en 1905, les premières entreprises
fabricant du yaourt à partir des souches de l’Institut Pasteur voient le jour (Bibel,
1988). Depuis 1960, la production industrielle de yaourt connaît un
développement international considérable et le yaourt est devenu aujourd’hui un
produit de consommation courante.
II-2 Caractères généraux
Orla-Jensen (1919) a été le premier auteur à définir les bactéries lactiques ou
bactéries de l’acide lactique. Les bactéries lactiques ont été isolées pour
la première fois à partir du lait (Metchnikoff, 1907; Sandine et al., 1972; Carr et
al., 2002). Elles forment un groupe de bactéries relativement divers, mais reliées
48
Bactéries lactiques
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entre elles par un certain nombre de fonctions métaboliques et physiologiques
typiques (Schleifer et Ludwig, 1995; Stiles et Holzapfel, 1997).
Les bactéries lactiques sont des cellules vivantes, procaryotes, hetérotrophes et
chimioorganotrophes. Elles sont Gram positive, immobiles, asporulées, de
formes coccoide ou bâtonnet et produisent l'acide lactique comme produit final
principal pendant la fermentation des carbohydrates (Kandler, 1983).
Elles sont anaérobies mais aérotolérantes et ne possèdent ni catalase (certaines
possédent une pseudocatalase), ni nitrate réductase, ni cytochrome-oxydase.
Elles ne liquéfient pas la gélatine, ne produisant pas d’indole, ni d’hydrogène
sulfureux. De plus, elles sont caractérisées par un métabolisme fermentaire qui,
en utilisant des glucides, produisent soit exclusivement de l’acide lactique
(bactéries homolacticques), soit de l’acide lactique, de l’acide acétique, de
l’éthanol ou de CO2 (bactéries hétérolactiques). Elles ont une capacité de
biosynthèse faible. Les bactéries lactiques sont également caractérisées par des
exigences nutritionnelles nombreuses complexes en acides aminés, acides
organiques,
bases
nucléiques,
sels,
vitamines
et
les
carbohydrates
fermentescibles pour leur croissance (Stamer, 1976 Hammes et Hertel, 1998,
2003). Les souches sont généralement faiblement protéolytiques et lipolytiques
(Law et Haandrikman, 1997; Shihata et Shah, 2000).
Les bactéries lactiques utilisées dans les fermentations laitières peuvent être
divisées en deux groupes sur la base de leur croissance optimale. Les bactéries
mésophiles avec une température optimum de croissance entre 20° C et 30°C et
les thermophiles entre 30°C et 45°C (Bissonnette et al., 2000). Elles se
développent majoritairement à des pH compris entre 4 et 6,5 majorité de
souches se développent à pH 4,0-4,5, et certaines sont encore actives à pH 9,6 et
d'autres à pH 3,2 (Hammes et Hertel, 1998, 2003).
L'acide lactique produit peut être sous deux formes stéréoisomèriques, L ou,
moins fréquemment, D ou un mélange des deux. Il convient de noter que l'acide
49
Bactéries lactiques
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lactique (forme D) n'est pas métabolisé par des humains et n'est pas
recommandé pour les enfants à bas âge (Who, 1974).
II-3 Taxonomie
La première classification des bactéries lactiques a été établie en 1919 par OrlaJensen sur divers critères morphologiques et physiologiques (Stiles et Holzapfel,
1997). En effet, les bactéries lactiques est subdivisé en 11 genres différents
partagés entre les coques et les bâtonnets : Lactobacillus, Leuconostoc,
Pediococcus , Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Lactococcus,
Oenococcus,Tetragenococcus, Vagococcus et Weissella (Stiles et Holzapfel,
1997; Klein et al., 1998; Axelsson, 2004) (Fig. 23). Les bactéries du genre
Bifidobacterium ne sont pas considérées comme des bactéries lactiques typiques,
mais leur usage se répand en industrie laitière. D’autres bactéries Gram positive
non sporulées et productrices d’acide lactique appartenant à la famille des
actinobacteriacée
et
au
genre,
Aerococcus,
Microbacterium,
et
Propionibacterium sont aussi impliquées dans l’industrie agro-alimentaire
(Sneath et Holt, 2001).
Cependant les méthodes phénotypiques ne rendent pas compte des relations
phylogénétiques entre les groupes. En 1977, Woese et Fox introduisent
la phylogénie moléculaire basée sur la séquence des ARN ribosomiques.
La taxonomie bactérienne moderne basée sur les caractéristiques phénotypiques
et génotypiques a eu comme conséquence la reclassification de beaucoup
d’espèces de bactéries lactiques. La composition d’ADN mesuré par
le pourcentage en base Guanine et cytosine (GC) est le premier critère de
parenté qui permet de connaitre l’homogénéité des espèces constituantes.
Les bactéries lactiques sont un groupe phylogénétique divers avec un GC de
50% (guanine et cytosine) en leur ADN.
50
Bactéries lactiques
Revue bibliographique
Fig. 23: Arbre phylogénique basée sur la comparaison du
gène de l’ARN 16 S (Holzapfel et al., 2001).
51
Bactéries lactiques
Revue bibliographique
Le pourcentage G+C (GC%) de leur ADN donne une composition assez proche
pour le genre Lactococcus (34,46%), Leuconostoc (36,43%), Pediococcus
(34,42%) et Bifidobacterium (67%) alors que le genre Lactobacillus est
caractérisée par une grande hétérogénéité (32, 53 %) (Novel, 1993). Les
bactéries
lactiques possèdent un pourcentage (GC%)
au dessous de 50%,
cependant certaines espèces de Lactobacillus ont des valeurs pouvant atteindre
55% (Axelsson, 2004). La classification est également possible avec des
méthodes génotypiques (RAPD-PCR, ribotyping) ou d’autres techniques
semblables. Les révisions taxonomiques des bactéries lactiques indiquent que
ces micro-organismes peuvent comprendre environ
une quarantaine
de genres. Les révisions récentes de la taxonomie des bactéries lactiques sont
présentées dans le manuel Bergey –Trust (Garrity et al., 2008).
II-4 Habitat
Les caractéristiques métaboliques d’un microorganisme jouent un rôle important
dans le choix de son habitat. Etant donné que les bactéries lactiques sont des
bactéries exigeantes, elles colonisent des milieux riches très différents.
Elles sont trouvées dans diverses niches écologiques, telles que les végétaux,
les animaux, les produits laitiers et carnés
ainsi que la cavités buccale,
les tractus gastro-intestinaux et urogénitaux des humains et des animaux
(El Shafei et al., 2000; Mathara et al., 2004 ; Dortu et Thonart, 2009 ). Elles
constituent aussi la flore microbienne dominante responsable de la fermentation
des céréales et des plantes fourragères ensilées (Carr et al., 2002; Dalié, 2010).
II-5 Ecosystème et microflore gastro-intestinaux
Le tractus gastro-intestinal est un écosystème complexe et ouvert aux
microorganismes exogènes. Il est généré par une alliance stable entre
l’épithélium gastro-intestinal, le système immunitaire et une importante flore
microbienne. Les interactions entre les microorganismes et l’hôte peuvent être
52
Bactéries lactiques
Revue bibliographique
de trois types: symbiose, commensalisme et pathogénicité (Hooper et Gordon,
2001). Le tractus gastro-intestinal de l’homme et des animaux constitue
le principal habitat naturel des bactéries lactiques, du fait qu’ils fournissent
un environnement stable et un approvisionnement continu en éléments nutritifs,
sous forme d’aliments ingérés ou sécrétés par l’hôte. On y retrouve plus
communément les genres Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus et
Bifidobacterium. Généralement les espèces de Lactobacillus isolées du tube
digestif de l'homme comprennent L. acidophilus, L. salivarius, L. casei,
L. plantarum, L. fermentum, L. brevis et L. reuteri (Mikelsaar et al., 1987).
La microflore du tractus gastro-intestinal a été estimée à près de 1013-1014
cellules microbiennes représentant 400 à 500 espèces et sous espèces (Moore et
Holdeman, 1974; Bjorksten, 2004) (fig. 24).
En effet, Le tractus digestif humain est l’écosystème présentant la plus grande
densité cellulaire décrite jusqu’à aujourd’hui dont le nombre de bactéries
présentes est supérieur au nombre total de cellules humaines constituant
l’organisme. Les lactobacilles comptent parmi la flore dominante du microbiote
intestinal et sont présents tout au long du tractus gastro-intestinal en quantités
variables.
Ils
représentent
environ
1%
des
micro-organismes,
soit
approximativement 103 à 107 bactéries/g de contenu intestinal (Dal Bello et al.,
2003; Tannock, 2005).
L’environnement gastro-intestinal comprend trois régions principales qui offrent
des conditions très différentes pour la survie des différents microorganismes.
Dans le premier compartiment, l’estomac, la prolifération microbienne est
fortement réduite par la présence d’oxygène apporté par la déglutition et d’une
forte acidité. De ce fait, l’estomac héberge sélectivement les microorganismes
acidotolérants et anaérobies facultatifs comme les lactobacilles, streptocoques,
levures, etc. Dans le deuxième compartiment qui est le petit intestin,
la microflore est constituée essentiellement de bactéries anaérobies facultatives
53
Bactéries lactiques
Revue bibliographique
Œsophage : mucus, péristaltisme.
Seuls les microorganismes provenant
des aliments ou de la cavité orale sont
présents
Duodénum: Secrétions pancréatiques
et biliaires, mucus, faible O2.
Microflore: 103-104 cfu/g
Bacteroides Candida albicans
Estomac: pH acide (HCl), O2,
enzymes (pepsines, lipases…),
mucus.
Microflore: 104 cfu/g
Candida albicans, Helicobacter pylori
Lactobacillus
Lactobacillus Streptococcus
Jéjunum: Secrétions pancréatiques
et biliaires, mucus, péristaltisme.
Microflore: 105-107 cfu/g
Bacteroides, Candida albicans
Lactobacillus, Streptococcus
Colon: Anaérobiose, motricité, enzymes
bactériennes, acides gras volatiles,
ammoniaque
Microflore: 1010-1011 cfu/g
Bacteroides, Bacillus, Bifidobacterium
Clostridium, Enterococcus, Eubacterium
Fusobacterium, Peptostreptococcus
Ruminococcus , Streptococcus
Iléon : Anaérobiose, sels
biliaires, enzymes.
Microflore : 107-108 cfu/g
Bacteroides, Clostridium
Enterobacteriacea, Enterococcus
Lactobacillus, Veillonella
Fig. 24 : Principaux compartiments du tractus digestif de
l’homme et leurs microflores (Isolauri et al., 2004).
54
Bactéries lactiques
Revue bibliographique
tels que les lactobacilles, les streptocoques et les entérobactéries, et anaérobies
strictes notamment les bifidobactéries, les bactéroides et les clostridies.
Dans le dernier compartiment qui est le colon (dépourvu d’oxygène), le transit
digestif est plus lent et la flore microbienne est plus abondante, représentant 35 à
50 % du volume du contenu du colon humain. La microflore du colon est très
complexe et dominée par les bactéries anaérobies strictes (Bacteroides spp.,
Clostridium spp, Bifidobacterium spp., Atopobium spp…). Tandis que
les bactéries anaérobies facultatives sont moins nombreuses et représentées par
les lactobacilles, les entérocoques, les streptocoques et les Enterobacteriaceae
(Cummings et al., 1989; Gounier-Château,1994).
Les bifidobactéries et les lactobacilles, ainsi que certains entérocoques, E. coli,
streptocoques et bactéroides, se distinguent par leurs effets bénéfiques sur
la santé de l’hôte, comme l’amélioration de la maturation et de l’intégrité de
l’intestin, l’antagonisme contre les pathogènes et la modulation de la fonction
immunitaire (Gibson et Roberfroid, 1995; Schiffrin et Blum, 2002).
Les rôles principaux de la flore digestive portent sur des aspects métaboliques,
trophiques et immunitaires (Guarner et Malagelada, 2003). Elle protègeraient
l’hôte des infections bactériennes à deux niveaux : elles stimuleraient le système
immunitaire de l’hôte et le protègeraient des pathogènes par «l’effet barrière».
La fonction protectrice de la flore sur les bactéries pathogènes porte sur deux
aspects : la compétition pour l’habitat et la production d’agents anti-microbiens.
Cette protection impliquerait notamment les bactéries lactiques commensales
particulièrement les genres Lactobacillus et Bifidobacterium (Servin, 2004).
II-6 Utilisation des bactéries lactiques dans le domaine agro-alimentaire
Les bactéries lactiques sont largement utilisées dans les procédés industriels de
fabrication agro-alimentaire tels que l’industrie laitière et fromagère,
la brasserie, la boulangerie, la charcuterie, l’œnologie, la cidrerie, la vinaigrerie,
la fabrication d’alcool…..etc. L’exemple le plus connu est probablement le plus
55
Bactéries lactiques
Revue bibliographique
stable reste la fabrication du yaourt par S.thermophilus et Lb. bulgaricus.
Les bactéries lactiques contribuent aux caractéristiques organoleptiques et
assurent une meilleure conservation des aliments elles contribuent à la saveur de
l’aliment et sa texture. Ceci est dû notamment à l’acide lactique produit au cours
de la croissance. D’autre part, les bactéries lactiques produisent des peptides et
des molécules comme l’acétoine, l’acétaldéhyde, le diacétyle ou l’éthanol qui
sont importants pour la flaveur des aliments. Les levains se composent de
microorganismes choisis sur la base de leurs caractéristiques propriétés
technologiques (acidifiante, aromatisante, texturante et antagoniste) (Bigret,
1989; Stiles, 1996). Certaines bactéries lactiques comme L. helveticus sont
utilisées pour produire industriellement de l’acide lactique employé comme
additif en alimentation et dans les produits cosmétiques ou pharmaceutiques
(Penaud, 2006).
II-7 Intérêts des bactéries lactiques en santé humaine
Si les bactéries lactiques sont importantes pour l’alimentation humaine, elles
le sont aussi pour sa santé. En effet, les bactéries lactiques sont aussi nommées
«
agents de la vie » vu toutes les fonctions qu’on leur attribue. Elles sont de plus
en plus utilisées sous forme de probiotiques qui sont par définition des
microorganismes vivants administrés en quantités adéquates et qui sont
bénéfiques pour la santé de l’hôte (Metchnikoff, 1907; Parker, 1974; Gibson et
Roberfroid 1995). Parmi les effets bénéfiques de ces probiotiques, nous pouvons
citer : Amélioration de la digestion du lactose, production de vitamines, effet
prophylactique et thérapeutique vis-à-vis des diarrhées, prévention des
infections gastro-intestinales (virus, H. pylori…) et urogénitales, régulation de
la motilité intestinale (constipation,syndrome d’irritation intestinale), diminution
du taux de cholestérol sanguin, stimulation du système immunitaire et activité
anticarcinogène (Mercennier et al., 2002) (fig. 25).
56
Bactéries lactiques
Revue bibliographique
De façon plus spécifique, pour qu’un organisme soit considéré comme étant
potentiellement probiotique, il doit présenter les caractéristiques suivantes
(Salminen et al.,1996, 1998; Stanton et al., 2001)(fig. 26)
- être un habitant naturel de l’intestin.
- être capable de coloniser, persister et se multiplier dans le milieu intestinal
- adhérer aux cellules intestinales et exclue ou réduit l’adhérence des pathogènes
- avoir un métabolisme actif et produire des substances inhibant les pathogènes
(acides, H2O2, bactériocines…)
- non invasif, non carcinogène et non pathogène
- être capable de co-agréger pour former une flore normale équilibrée
- survivre aux différents procédés technologiques de production
- garder sa viabilité dans l'aliment et durant le transit intestinal
57
Bactéries lactiques
Revue bibliographique
Fig. 25: Schéma simplifié montre les principaux effets
bénéfiques attribués aux probiotiques (Mercenier et al., 2002).
Fig. 26: Propriétés et critères de sélection des probiotiques (Salminen et al., 1998).
58
Bactéries lactiques
Revue bibliographique
II-8 Souches microbiennes probiotiques utilisées
En générale, les souches probiotiques sont sélectionnées prioritairement pour
leurs effets bénéfiques et leur innocuité. Les souches ou espèces probiotiques
sont des composants normaux de la flore intestinale (Dunne et al., 2001). En
alimentation humaine, les microorganismes probiotiques sélectionnés sont
représentés essentiellement par les bactéries lactiques, particulièrement celles
appartenant au genre Lactobacillus et Bifidobacterium (Borriello et al., 2003;
Saito, 2004). Aujourd’hui, ces deux genres bactériens sont largement utilisés
dans la fabrication de produits laitiers fermentés. Par contre, en alimentation
animale de nombreux genres bactériens et fongiques sont utilisés, comme
Lactobacillus,
Bifidobacterium,
Bacillus,
Streptococcus,
Pediococcus,
Enterococcus, Propionibacterium, Saccharomyces, Aspergillus et Torulopsis
(tableau 6) (Gournier-château et al., 1994; Tannock, 1997; Holzapfel et al.,
2001).
Tableau 6: Principales souches microbiennes probiotiques (Holzapfel et al., 2001)
59
Bactéries lactiques
Revue bibliographique
II-9 Probiotiques et les infections gastro-intestinales
Plusieurs études cliniques ont évalué l'efficacité des probiotiques dans
la prévention et le traitement des maladies gastro-intestinales.
En effet, il a été démontré que certaines infections gastro-intestinales telles que
l’infection à H. pylori, les diarrhées et les allergies alimentaires peuvent être
contrecarrées avec succès par l’utilisation de probiotiques (Mercenier et al.,
2002, Turchet et al., 2003; Rosenfeldt et al., 2004). A titre d’exemple, Wang et
al. (2004) ont rapporté que la consommation régulière de yogourt additionné de
Lactobacillus acidophilus La5 ou de Bifidobacterium lactis Bb12 induit une
suppression effective de l’infection due à H. pylori. D’autre part, Michetti et al.
(1999) ont démontré une efficacité partielle liée à l’administration de
surnageants de culture de L. acidophilus La1 à des volontaires.
Tandis que Rosenfeldt et al. (2002) ont mentionné que des souches de
L. rhamnosus et L. reuteri ont permis de traiter des gastro-entérites à rotavirus
chez des enfants hospitalisés. Dans une autre étude menée, Hickson et al.,
(2007) signalent que la consommation d'une boisson contenant les souches
probiotiques L. casei, L. bulgaricus et S. thermophilus peut réduire l'incidence
de la diarrhée associée aux antibiotiques et de la diarrhée associée à C. difficile.
De plus, des entérites induites par Campylobacter peuvent être traitées par
Bifidobacterium longum.
II-10 Interaction entre les bactéries lactiques
Les interactions entre deux populations microbiennes constituent un ensemble
complexe de phénomène biologique hétérogène. Elles sont définies selon leurs
effets avantageux ou désavantageux. Des bactéries appartenant au même
système taxonomique peuvent montrer des attitudes différentes. Qui dit
association de souches, dit possibilité d’interaction. Si ces interactions sont
bénéfiques pour une ou pour plusieurs souches, on parlera de coopération, si
elles sont néfastes pour une ou plusieurs souches, on parlera d’inhibition.
60
Bactéries lactiques
Revue bibliographique
II-10-1 Inhibition des bactéries lactiques
Les bactéries lactiques sont connues pour leur aptitude à produire des composés
antibactériens leur permettant de se développer préférentiellement dans divers
écosystèmes. La découverte des substances inhibitrices actives contre les germes
pathogènes est devenue d’un grand intérêt au cours des dernières années et ceci
à cause de la propagation des maladies véhiculées généralement par les aliments
(Bibek et Daeschel, 1992; Jack et al., 1995).
Les milieux permettant le développement des bactéries lactiques sont complexes
du point de vue nutritionnel. Ils présentent soit des substrats de fermentation,
soit des écosystèmes digestifs comme c’est le cas pour les bactéries lactiques
séjournant dans le tractus intestinal de l’homme ou des animaux. Ces
écosystèmes sont également peuplés par de nombreux autres microorganismes
comprenant des espèces pathogènes ou d’altération.
La capacité de survie des bactéries lactiques dans de tels environnement résulte
de leur activité fermentaire associé à la production de divers composés antimicrobiens tels que les acides organiques, le peroxyde d’hydrogène, des
bactériocines (Lewus et al., 1991; Van De Guchte et al., 2001).
.
II-10-1-1 Acides organiques
L'acide lactique est le métabolite principal des bactéries lactiques causant
la réduction du pH qui inhibe la plupart de microorganismes (Eklund, 1989;
Schnürer et Magnusson, 2005). Les bactéries lactiques hétérofermentaires
produisent des quantités d'acide organique autre que l'acide lactique tel que
l’acide acétique et l’acide propionique. Ces acides organiques traversent
passivement la membrane cytoplasmique et se dissocie à l'intérieur de la cellule,
libérant les ions H+ qui acidifient le cytoplasme à un point tel que les fonctions
cellulaires sont inhibées (Kashet, 1987; Piard et Desmazeaud, 1991).
En plus, l'acide fait chuter le gradient électrochimique de proton entraînant
la bactériolyse et finalement la mort des bactéries sensibles (Eklund, 1989).
61
Bactéries lactiques
L’accumulation
Revue bibliographique
d’acide
organique
est
directement
inhibitrice
pour
les microorganismes nuisibles qui présentent un seuil bas de résistance aux
changements de pH intracellulaire tels que Salmonella, E. coli, Pseudomonas et
Clostridium. L’acide lactique est toxique pour beaucoup de bactéries (Tableau
7) mais aussi pour des champignons et moisissures (Geis, 1989 ; Piard et
Desmazeaud, 1991). Adams et Hall (1988) ont démontré que les acides lactique
et acétique peuvent avoir des effets synergiques sur certaines espèces tel que
E. coli et Salmonella enteritidis. L’acide lactique diminue le pH du milieu,
augmentant ainsi la toxicité de l’acide acétique.
L'effet inhibiteur spécifique des acides organiques est généralement attribué à
leur forme dissociée et non dissociée. L’ampleur de la dissociation dépend du
pH. A pH bas, une grande quantité d'acide est sous la forme non dissociée, et
elle est toxique à beaucoup de bactéries, champignons et levures (Podolak et al.,
1996). En général, la forme moléculaire (non dissociée) de l’acide lactique est
le facteur inhibiteur pour les bactéries lactiques. Les concentrations en acide
lactique non dissocié nécessaire pour provoquer une inhibition sont pour
les levures, les Enterobacteriaceae et les Microccocaceae de l'ordre 1 mM; pour
les moisissures de 3 mM; et pour les Bacillaceae de 4 Mm (Baird-Parker, 1980;
Adams et Hall, 1988). Cependant, le comportement des différents microorganismes vis-à-vis de l'acide lactique varient considérablement. L’acide
lactique à pH 5,0 a un effet inhibiteur contre les bactéries sporulantes mais il est
inefficace
contre
les
levures
et
les
champignons
(Woolford,1975).
Les stéréoisomères de l'acide lactique diffèrent également dans l'activité
antimicrobienne, l’acide lactique (L) étant plus inhibiteur que l’isomère D
(Benthin et Villadsen, 1995).
Les acides acétiques et propioniques produits par les bactéries lactiques par
les voies hétérofermentaires peuvent agir sur les membranes, et causent
l'acidification intracellulaire et la dénaturation des protéines (Huang et
al., 1986).
62
Bactéries lactiques
Revue bibliographique
Tableau 7: Valeurs de pH limites permettant l’initiation de la croissance de divers
microorganismes (Piard et Desmazeaud, 1991)
Bactéries à Gram négatif
Valeurs de pH limite
Escherichia coli
4,4
Klebsiella pneumoniae
4,4
Proteus vulgaris
4,4
Pseudomonas aeruginosa
5,6
Salmonella paratyphi
4,5
Salmonella typhi
4,0 – 4,5
Vibrio parahaemolyticus
4,8
Bactéries à Gram positif
Valeurs de pH limite
Bacillus cereus
4,9
Clostridium botulinum
4,7
Enterococcus sp
4,8
Lactobacillus sp
3,8 – 4,4
Micrococcus sp
5,6
Staphylococcus aureus
4
Lactococcus lactis
4,3 – 4,8
Brevibacterium linens
5,6
Listeria monocytogenes
5,5
63
Bactéries lactiques
Revue bibliographique
Ils ont un effet antimicrobien plus fort que l'acide lactique dus à leurs valeurs
plus élevées de pKa (acide lactique 3,08, acide acétique 4,75, et acide
propionique 4,87), et un pourcentage plus élevé d'acides non dissociés à un pH
donné (Earnshaw, 1992).
II-10-1-2 Peroxyde d'hydrogène
En présence d’oxygène, les bactéries lactiques peuvent produire du peroxyde
d’hydrogène, toxique pour d’autres bactéries. Il est formé par des peroxydases
ou par la superoxyde-dismutase ou encore quand la concentration intracellulaire
en ions manganèse est élevée (Piard et Desmazeaud, 1991). Les lactocoques
lactiques produisent suffisamment de peroxyde d’hydrogène pour entraîner une
auto-inhibition (Subramanian et Olson., 1968).
Le peroxyde d’hydrogène est capable d’endommager les membranes
bactériennes par la peroxydation des lipides entrainant ainsi l'augmentation de
la perméabilité membranaire, mais il peut aussi inhiber les enzymes de la
glycolyse, perturber les systèmes de transport des sucres et des acides aminés
ainsi que la synthèse des protéines et des acides nucléiques (Kong et Davison,
1980). Il peut également agir comme précurseur pour la production de radicaux
libres bactéricides tels que les radicaux du superoxyde (O2-) et de l’hydroxyle
OH- qui peuvent endommager l’ADN des bactéries (Byczkowski et Gessner,
1998).
En plus de son effet bactéricide, le peroxyde d’hydrogène active le système
lactoperoxydase présent dans le lait en produisant deux puissants inhibiteurs
microbiens à savoir l’hypothiocyanate (OSCN) et l’acide hypothiocyaneux
(HOSCN). Ce système agit contre les germes psychrotrophes en permettant
un report appréciable de la date limite de vente du lait cru (Condon, 1987 ;
Adams et Nicolaides, 1997).
64
Bactéries lactiques
Revue bibliographique
La catalase constitue le système le plus efficace contre ce produit, cependant
les bactéries lactiques en sont dépourvues et à la place elles sont dotées
d’une peroxydase qui est moins efficace (Doleyres, 2003).
La production de H2O2 par Lactobacillus et Lactococcus inhibe la croissance
de Staphylococcus aureus, de Pseudomonas sp. Et divers microorganismes
psychrotrophes (Davidson et al., 1983). L'inhibition est négociée par l'effet
d'oxydation fort sur des lipides de membrane et des protéines cellulaires
(Morris, 1976; Lindgren et Dobrogosz, 1990). La quantité de peroxyde
d'hydrogène produite par les bactéries lactiques dépend en grande partie de
la souche et la disponibilité de l'oxygène (Helander et al., 1997).
II-10-1-3 Dioxyde de carbone
Il est produit par les bactéries lactiques hétérofermentaires. Le mécanisme précis
de son action antimicrobienne reste indéterminé. Cependant, le CO2 peut jouer
un rôle antimicrobien en créant un environnement anaérobique qui inhibe
la décarboxylation enzymatique et l'accumulation de CO2 dans la bicouche
lipidique de la membrane peut aussi causer un dysfonctionnement de
la perméabilité membranaire (Eklund, 1984).
Le CO2 inhibe la croissance de beaucoup de microorganismes d’altération,
particulièrement les bactéries psychrotrophes à Gram négatif (Farber, 1991;
Hotchkiss et al., 1999). Le degré d'inhibition varie considérablement selon
les espèces (Ammor et al., 2005).
II-10-1-4 Diacétyle
Il est généralement produit par des souches de Lc. lactis subsp. lactis biovar.
diacetylactis par la fermentation du citrate (Lindgren et Dobrogosz, 1990;
Cogan et Hill, 1993). Il est responsable de L’arome et de la saveur du beurre et
de quelques autres produits laitiers fermentés (Earnshaw, 1992).
Beaucoup de bactéries lactiques comprenant des souches de Leuconostoc,
65
Bactéries lactiques
Revue bibliographique
de Lactococcus, de Pediococcus et de Lactobacillus peuvent produire
le diacétyle (Cogan, 1986 ; Budde et al., 2003). Son utilisation pratique comme
conservateur est limitée.
Cependant, le diacétyle peut agir synergiquement avec d'autres facteurs
antimicrobiens et contribuer aux systèmes combinés de conservation en
nourritures fermentées. Les bactéries Gram négatives, les levures et
les champignons sont plus sensibles au diacétyle que les bactéries Gram
positives (Jay, 1982).
1I-10-1-5 Acétaldéhyde
Chez Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, l'action d'une thréonine aldolase, clive
la thréonine en acétaldéhyde et en glycine. L'acétaldéhyde à une concentration
de 10 à 100 ppm empêche la croissance de Staphylococcus aureus, de
Salmonella typhimurium et d’E. coli dans les produits laitiers (Piard et
Desmazeaud, 1991). La contribution de l'acétaldéhyde à la biopréservation est
mineure puisque le seuil de saveur est beaucoup inférieur aux niveaux qui sont
considérés nécessaires à l'inhibition des microorganismes (Kulshrestha et Marth,
1974).
II-10-1-6 Reutérine
La reutérine est produite par Lactobacillus reuteri, une espèce hétérofermentaire
qui niche dans l'appareil gastro-intestinal des humains et des animaux (Axelsson
et al., 1989). La reutérine est formée pendant la croissance anaérobique de Lb.
reuteri par l'action du glycérol déhydratase qui catalyse la conversion du
glycérol en reutérine. Elle est produite pendant la phase stationnaire de
Lactobacillus reuteri dans un milieu contenant du glucose et du glycérol ou du
glycéraldéhyde (Talarico et al.,1988, 1989). La reutérine montre un large spectre
d'activité antimicrobienne contre certaines bactéries à Gram+ et à Gram-.
Les microorganismes de détérioration sensibles à la reutérine comprennent
66
Bactéries lactiques
Revue bibliographique
Salmonella, Shigella, Clostridium, Staphylococcus, Listeria, Candida, et
Trypanosoma (Axelsson et al., 1989).
II-10-1-7 Bactériocines
La découverte de la première bactériocine remonte à 1925. Cette dernière, isolée
de E. coli, possédait une activité bactéricide envers une autre souche de E. coli.
Elle fut nommée colicine V (Gratia, 1925). À cette époque, le concept de
compétition entre diverses bactéries était instauré et bien accepté.
Les bactériocines produites par les bactéries sont généralement définies en tant
que parties protéiques biologiquement actives, possédant une activité bactéricide
contre des espèces proches de la souche productrice (Tagg et al., 1976;
Klaenhammer, 1988; James et al., 1991).
Les bactériocines sont synthétisées par les ribosomes, se composent de 51 à 113
acides aminés, avec une structure hélicoïdale (van Belkum et al., 1991, 1992).
La classification actuelle des bactériocines est fondée sur leur taille, leur
résistance à la chaleur, certaines propriétés physicochimiques, leur spectre
d'activité et la présence ou non d'acides aminés modifiés. Quatre classes
distinctes de bactériocines ont été définies (Cenatiempo et al., 1996 ;
Klaenhammer, 1988 ; Dortu et Thonart, 2009). Elles ont en général des spectres
d’activités étroits mais ils sont surtout spécifiques aux bactéries à Gram positive.
En effet, toutes les bactériocines produites par des bactéries lactiques décrites
jusqu’à présent ont une activité dirigée contre les bactéries Gram+, la membrane
externe des bactéries Gram- ne permettant pas aux bactériocines d’atteindre
la membrane interne, siège de leur activité. En plus, les bactériocines sont
produites pendant ou à la fin de la phase exponentielle de croissance, puis
exportées à l’extérieur des cellules productrices (Tagg et al., 1976; Van De
Guchte et al., 2001; Dortu et Thonart, 2009). La production d’une bactériocine
peut être considérée comme un moyen pour éliminer des bactéries envahissantes
concurrentes (Lachance, 2000).
67
Bactéries lactiques
Revue bibliographique
En effet, les bactériocines sont caractérisées et sélectionnées pour être utilisées
en tant qu’antagoniste vis-à-vis des bactéries de contaminations et pathogènes
Elles sont largement répandues chez les bactéries alimentaires telles que
les bactéries lactiques ayant pour cible des bactéries du genre Listeria,
Clostridium, Staphylococcus aureus et d’autres bactéries à Gram positif comme
les bactéries lactiques (Cintas et al., 2001).
Une attention particulière, ces dernières années est accordée aux bactériocines
produites par les bactéries lactiques et ceci est due en grande partie à leur
éventuelle application dans l'industrie alimentaire en tant que biopréservateurs
(Rodriguez et al., 2002). Les bactériocines occupent un rôle prometteur dans
la conservation naturel des produits fermentés, ce qui est un atout
supplémentaire pour les industriels (Daeschel, 1993; Ray et Daeschel, 1994).
II-11 Les lactobacilles
Les lactobacilles représentent le groupe le plus important des bactéries lactiques
tant au niveau industriel qu’au niveau de la flore commensale (Penaud, 2006).
Ils contiennent plus de 120 espèces et 20 sous espèces. Ce nombre évolue
régulièrement, 13 nouvelles espèces ont été proposées en 2005, 9 en 2006 et
7 autres en 2007 (Lee et
Salminen, 2009). Cependant, ce genre est très
hétérogène, aussi bien sur le plan génétique que sur le plan de la distribution des
habitats (Penaud, 2006).
II-11-1 Caractères généraux
Le genre Lactobacillus a été décrit par Beijerinck en 1901 pour regrouper des
bactéries à Gram positif isolées de produits laitiers et à métabolisme fermentaire.
Les lactobacilles appartiennent au groupe des Firmicutes, à la classe des Bacilli,
à l’ordre des Lactobacillales et à la famille des Lactobacilliaceae (Schleifer et
Ludwig, 1995). Il s’agit de bacilles souvent allongés parfois isolés ou groupé en
paires ou en chaînes (fig. 28), non sporulés généralement immobiles avec
68
Bactéries lactiques
Revue bibliographique
un pourcentage G+C inferieur à 50%. Ils sont dépourvus de catalase (certains
ont une pseudo-catalase) et d’oxydase. Ils sont micro-aérophiles ou anaérobies.
Ces bactéries peuvent se développer à des températures basses ou extrêmes
comprises entre 2 et 50°C, avec un optimum compris entre 30 et 40°C
(Kandler et Weiss, 1986).
Fig. 28: Lactobacillus bulgaricus et Lactobacillus casei observés au
microscope électronique (G x 10 000)
Les lactobacilles sont acidophiles, avec un optimum de pH entre 5,5 et 6,2.
Ils se montrent généralement plus résistants au stress acide que les lactocoques .
De plus, ces microorganismes sont auxotrophes avec de fortes exigences en
facteurs de croissance (Morishita et al., 1981). Les critères phénotypiques
restent encore très importants aujourd’hui pour la classification des lactobacilles.
D’autre part, Les études basées sur les ARN 16S ont permis de mettre en
évidence l’existence de différents groupes phylogénétiques au sein des
lactobacilles (Schleifer et Ludwig, 1995) (fig. 29).
69
Bactéries lactiques
Revue bibliographique
Fig. 29: Arbre phylogénétique des groupes principaux du genre Lactobacillus basé sur
les ARNr 16S (Schleifer et Ludwig, 1995)
Les lactobacilles ont un métabolisme fermentaire produisant de l’acide lactique
Certaines espèces sont homolactiques, d’autres hétérolactiques produisant des
acides volatils, de l’éthanol et du CO2 en plus de l’acide lactique.
Stiles et Holzapfel (1997) rapportent que les lactobacilles peuvent être classés en
trois groupes selon leur métabolisme fermentaire
Le
groupe
1
représente
les
lactobacilles
homofermentaires,
ou
“Thermobacterium” qui produise exclusivement de l’acide lactique à partir de
la fermentation du glucose alors que le groupe 2 représentant les lactobacilles
hétérofermentaires facultatives ou “Streptobacterium” produisent en plus de
l’acide lactique, de l’éthanol, du CO2, de l’acide acétique
à partir de
la fermentation des hexoses tandis que le groupe 3 représenté par
les lactobacilles hétérofermentaires strictes ou “Betabacterium” fermentent
les hexoses et les pentoses en acide lactique, acide acétique et/ou éthanol et
CO2.
70
Bactéries lactiques
Revue bibliographique
II-11-2 Habitat
Les lactobacilles colonisent un nombre important de niches écologiques et
représentent le groupe de bactéries
lactiques le plus ubiquitaire dans
l’environnement (de Roissart et Luquet, 1994). Ils appartiennent à la flore
normale de la cavité buccale, urogénitale et du tractus gastro-intestinal de
l’homme et de l’animal. Ces bactéries sont importantes pour le maintien de
l’équilibre de la flore commensale et donc pour la santé de l’hôte (Saad, 2010).
Les lactobacilles sont également isolés d’autres niches telles que les plantes,
le sol, l’eau, les produits laitiers, carnés ou végétaux fermentés ou en
décomposition.
Les
lactobacilles
sont
très
utilisés
dans
l’industrie
agroalimentaire (en laiterie, fromagerie, charcuterie, dans la fabrication de
la choucroute, ...). Ils sont notamment utilisés pour les fermentations lactiques
du lait (L. bulgaricus), de la viande (L. sakei) ou de produits végétaux
(L. plantarum). Cependant, les lactobacilles peuvent aussi être des contaminants
indésirables de produits alimentaires. Ils sont notamment à l’origine de
la détérioration de produits tels que la bière (L. casei, L. plantarum), le lait
(L. maltaromicus), la viande et les produits carnés (L. sakei, L. curvatus) (Stiles
et Holzapfel, 1997 ; de Roissart et Luquet, 1994).
Ils sont utilisés industriellement dans trois domaines en tant que probiotiques
dans l’alimentation animale, dans les préparations pharmaceutiques destinées à
l’homme, et en tant que ferments lactiques pour les produits fermentés (dans
les domaines laitiers et carnés) (Saad, 2010).
II-11-3 Effets des lactobacilles sur la santé
L’effet probiotique des lactobacilles a été et est encore largement étudié.
Les lactobacilles font partie de la flore digestive et participent aux effets
bénéfiques de la microflore sur l’hôte, que ce soit au niveau métabolique,
trophique ou immunitaire. Un des effets majeurs des lactobacilles sur la santé
humaine décrits dans la littérature est leur rôle antagoniste vis à vis des bactéries
71
Bactéries lactiques
Revue bibliographique
pathogènes (Silva et al., 1987 ; Dambélé et al., 1998 ; Servin, 2004; Saad,
2010). Les effets des lactobacilles sur les bactéries pathogènes reposent sur
différentes propriétés telles que la capacité à adhérer aux cellules en inhibant
ainsi l’adhésion des pathogènes, l’inhibition de la croissance des pathogènes, la
capacité d’entrer en compétition avec les pathogènes pour les ressources
nutritives et la modulation de la réponse immunitaire de l’hôte (Reid et Burton,
2002).
Effectivement, certains lactobacilles sont capables d’induire la réponse
immunitaire de l’hôte. Cet effet a été observé par plusieurs souches de
lactobacilles comme L. johnsonii La1, L. casei rhamnosus GG ou L. casei
Shirota. L’adhésion des lactobacilles aux cellules humaines permettrait d’une
part aux lactobacilles de se maintenir dans l’hôte et d’autre part, d’inhiber
l’adhésion des pathogènes (Grangette et al., 2005).
En outre, La capacité des lactobacilles à inhiber la croissance de bactéries
pathogènes repose sur plusieurs propriétés (Silva et al., 1987). La production de
peroxyde d’hydrogène (H2O2), facteur inhibiteur de la croissance des
pathogènes a surtout été étudiée pour les lactobacilles commensaux du tractus
urogénital (Marelli et al., 2004). La microflore vaginale des femmes souffrant
d’infections vaginales bactériennes est constituée en majorité de lactobacilles
commensaux ne produisant pas d’H2O2 (seuls 14% des lactobacilles en
produisent) alors que pour les femmes « saines », les lactobacilles producteurs
d’H2O2 représentent 75% de la flore (Al-Mushrif et Jones, 1998).
Un autre facteur permettant l’inhibition de la croissance des pathogènes est
la production d’acides organiques (lactique ou acétique), et par là-même
l’acidification du milieu. Ces effets ont été étudiés in vitro pour plusieurs
lactobacilles probiotiques. L. casei rhamnosus GG inhibe l’adhésion de
Salmonella typhimurium par un effet dépendant du pH, l’inhibition étant levée à
pH neutre (Lehto et Salminen, 1997). L. casei Shirota et L. acidophilus YIT0070
inhibent la croissance de E. coli O157:H7 par la production d’acide lactique
72
Bactéries lactiques
Revue bibliographique
(Ogawa et al., 2001). Fayol-Messaoudi et al. (2005) ont montré que l’activité
antagoniste de L.johnsonii La1, L. casei rhamnosus GG, L. rhamnosus GR1,
L. casei Shirota et L. casei DN-114 sur S. enterica est principalement due à
l’effet de l’acide. Cependant, il semble que l’acide lactique joue un rôle dans
l’inhibition de la croissance des bactéries à Gram négatif (auxquelles
appartiennent un grand nombre de pathogènes) par perméabilisation de
la membrane externe, ce qui faciliterait l’entrée de molécules antibactériennes
dans les cellules et augmenterait ainsi leur efficacité (Alakomi et al., 2000).
De plus, l’accumulation de lactate dans la cellule induit aussi des effets délétères
pour la cellule (Presser et al., 1997).
D’autre part, Certains lactobacilles produisent des molécules protéiques
bactéricides appelées bactériocines dont le rôle dans l’inhibition de pathogènes
en conditions technologiques a été largement étudié. Les bactériocines ont
un spectre d’action variable, plus souvent limité à certaines espèces à Gram
positif. Certaines bactériocines peuvent éventuellement être utiles pour limiter
les
contaminations
alimentaires
par
des
pathogènes
comme
Listeria
monocytogenes ou Clostridium botulinum (Ross et al., 2002). L’usage des
bactériocines pour le traitement de troubles intestinaux est limité car elles sont
peu ou pas actives sur des bactéries à Gram négatif, principaux agents de ces
troubles. Cependant, quelques bactériocines de lactobacilles sont actives sur des
bactéries à Gram négatif comme l’acidophiline 801 active contre E. coli Raw et
S. panama. (Zamfir et al., 1999).
Différentes espèces de lactobacilles sont largement étudiées pour leurs effets
bénéfiques sur la santé. Cependant, certaines de ces bactéries ont été impliquées
dans des cas de bactériémies, d’endocardites ou d’infections localisées (Cannon
et al., 2005). Les infections dues aux lactobacilles sont rares mais, comme tout
micro-organisme, les lactobacilles peuvent être associés à des infections, dans
certaines conditions, notamment dans le cas de sujets immunodéprimés ou déjà
malades (Salminen et Arvilommi, 2002).
73
Objectif du travail
Les lactobacilles sont connus pour leur pouvoir inhibiteur contre les bactéries
pathogènes y compris Helicobacter pylori. C’est dans ce contexte que s’inscrit
notre étude qui consiste à :
Mettre en évidence H. pylori à partir des biopsies gastriques.
Isoler et identifier H. pylori des biopsies gastriques
Isoler et caractériser les lactobacilles du lait cru de chèvre.
Mettre en évidence l’inhibition des lactobacilles vis-à-vis de H. pylori, et
d’autres bactéries pathogènes.
Enfin, déterminer la nature de l’agent inhibiteur impliqué dans cet antagonisme.
74
Matériels et Méthodes
I- Isolement et identification de Helicobacter pylori
I-1 Echantillon et origine du matériel
La recherche de H. pylori a été basée sur des méthodes directes invasives,
nécessitant une fibroscopie. En effet, l’étude a été réalisée sur des biopsies
antrales gastriques, prélevées chez des patients atteints de maladies gastroduodénales (gastrite chronique, ulcère duodénal ou ulcère gastrique).
Ces patients se présentaient à jeun et ayant subit une endoscopie
gastroduodénale au niveau du service gastro-entérologie à l’hôpital militaire
d’Oran.
Deux souches de H. pylori de référence ont aimablement été fournies par le Pr.
F. Megraud du Laboratoire de Bactériologie (Bordeaux, France). Les souches
sont H. pylori J 99, H. pylori 26695.
I-2 Prélèvement
Les prélèvements biopsiques doivent être effectués à distance d’un traitement
par des antibiotiques ou des antisecrétoires (Lamouliatte et al., 1992; Megraud,
1992; Megraud,1994a). Les conditions de stérilité doivent être respectées au
moment du prélèvement (Megraud, 1989).
Les prélèvements ont été effectués sous endoscopie dans la région antrale à
environ de 2 cm du pylore à l’aide d’un endoscope type (Olympus GIFXQ 10) et
d’une pince à biopsie, préalablement désinfectés au glutaraldhyde et bien rincés
en raison du pouvoir inhibiteur de ce produit sur H. pylori (Lozniewski, 1996;
Lamouliatte et al., 1992; Megraud,1992). Le port des gants lors de la fibroscopie
est recommandé pour éviter une éventuelle contamination (Megraud, 1994a).
L’endoscopiste prélève 4 biopsies antrales qui serviront à pratiquer
respectivement un test rapide à l’urée, un examen cytologique, un examen
anatomopathologique et une culture
(Lamouliatte et al.,1992;
1994b).
75
Megraud,
Matériels et Méthodes
I-3 Conservation des biopsies
La biopsie destinée à l’examen anatomopathologique est déposée
dans
un fixateur, le liquide de Bouin (Lamouliatte et al., 1992; Megraud, 1992).
Pour la bactériologie, les trois autres biopsies sont placées, dans un pot stérile
contenant 1 ml du sérum ou eau physiologique
stérile où la biopsie sera
protégée de l’oxygène de l’air et de la dessiccation (Megraud, 1994a, 1994g),
puis acheminées
au laboratoire à 4 °C et ceci pour un délai de transport
n’excédant pas les 4 heures de temps (Lamouliatte et al,1992; Megraud, 1992,
1994g). Le milieu de transport « Portagem pylori » est utilisé pour le transport
des biopsies durant 24h.
Il est à noter que le test rapide à l’urée peut être pratiqué directement dans
la salle d’endoscopie en utilisant le CLO test (Megraud, 1994b).
I-4 Examen anatomopathologique
Cet examen est réalisé par l’anatomopathologiste (Megraud, 1996a). Il permet
d’une part, d’étudier la muqueuse gastrique et ses modifications histologiques, et
d’autre part de visualiser les bactéries spiralées (Lamouliatte et al,1992; Sobhani
et al, 1995). Il s’effectue sur des coupes histologiques préparées à partir des
biopsies gastriques, colorées à la coloration de Giemsa modifiée, puis observées
au fort grossissement (Megraud, 1994a).
I-5 Examens microbiologiques
I-5-1 Examen cytologique
Cet examen consiste en la mise en évidence de bactéries spiralées par une
coloration de Gram de l’empreinte biopsique (Megraud, 1994a; Sobhani et
al., 1995). Pour cela, une biopsie est déposée sur une lame porte-objet, puis
écrasée à l’aide d’une seconde lame afin d’obtenir un frottis fin et régulier
(Lamouliatte et al., 1992; Megraud, 1994a, 1994b). Le frottis préparé est ensuite
76
Matériels et Méthodes
séché, fixé, puis coloré à la coloration de Gram (Sobhani et al., 1991; Megraud,
1994b; Cellini et al., 1995b). L’ensemble de la préparation est observé
attentivement au microscope optique au faible grossissement, pour repérer
les zones plus riches en cellules puis au fort grossissement pour bien observer
les bactéries spiralés à Gram négative (Megraud, 1994b). Il est nécessaire
d’observer un grand nombre de champs microscopiques du fait de la répartition
parfois non homogène des bactéries dans la biopsie gastrique (Megraud, 1989;
Lamouliatte et al, 1992).
I-5-2 Test rapide à l’Urée
Helicobacter pylori a la particularité de posséder une uréase très active. Cette
propriété est utilisée pour le diagnostic de l’infection à H. pylori par un test
rapide à l’urée (Delchier, 1994). Ce dernier est basé sur la recherche directement
au niveau de la biopsie gastrique, de l’activité uréasique chez H. pylori, qui va
alcaliniser un milieu riche en urée et faire virer l’indicateur du pH par
la libération de l’ammoniac (Lamouliatte et al, 1992 ; Megraud, 1994a ;
Lozniewski, 1996 ; Megraud, 1996a). Pour cela, nous avons effectué cette
recherche en salle d’endoscopie et au laboratoire (Megraud, 1989, 1994a).
En salle d’endoscopie, nous avons utilisé le CLO test: c’est un dispositif en
plastique, constitué d’un gel d’agar contenant de l’urée, d’un indicateur de pH
coloré (rouge de phénol), de tampon et d’un agent bactériostatique n’ayant pas
d’effet sur H. pylori. La biopsie gastrique est déposée à la surface du gel aussitôt
que le prélèvement est effectué. Ensuite, le dispositif est incubé à 37°C
(Delchier, 1994; Riachi et Colin, 1995; Delchier, 1996b).
La lecture des résultats (virage de l’indicateur de sa couleur jaune initiale à une
couleur rouge) s’effectue au bout de 30 min. et 3h, voire au maximum 24h
(Megraud, 1989).
Au laboratoire, nous n’avons qu’a déposé un fragment biopsique à l’aide d’une
anse stérile dans un tube contenant 0,5 ml de milieu urée-indole (annexe).
77
Matériels et Méthodes
L’incubation se fait à 37°C. La lecture des résultats (virage de l’indicateur vers
le rouge) s’effectue au bout de 20 min et 24 h (Megraud, 1989a; Sobhani et al,
1991; Megraud, 1994b).
I-5-3 Culture et isolement
I-5-3-1 Condition de culture
Helicobacter pylori est une bactérie fragile et microaérophile. La composition
gazeuse idéale pour sa croissance est de 5 % d’O2, 10 % de CO2 et 85% de N2
(Leclerc et al., 1989; Cellini et al., 1994).
Il est donc essentiel d’utiliser
un générateur d’atmosphère microaérophile placé dans une jarre d’anaérobiose.
Dans notre présent travail, l’atmosphère microaérophile est obtenue en utilisant
le système de Campy pack (BioMerieux) (Sobhani et al, 1991).
I-5-3-2 Milieux de culture
Helicobacter pylori est une bactérie exigeante sur le plan métabolique
(Lamouliatte et al., 1992; Megraud, 1992). Sa culture exige des milieux de
cultures enrichis additionné de sang ou de sérum (Fauchère et Rosenau,
1991; Sobhani et al., 1995).
Pour son isolement, nous avons utilisé un milieu au sang non sélectif à base de
la gélose Columbia (annexe) et un milieu sélectif à base de Wilkins Chalgren
(annexe ) (Megraud, 1994a , 1994b). Ce dernier contient un mélange spécifique
d’antibiotique destiné à inhiber la croissance d’éventuel contaminants (Fauchère
et Rosenau, 1991;
Lozniewski, 1996). Le milieu sélectif « la gélose pylo
bioMerieux » prêt à l’emploi et présenté en boites de Petri a également été
utilisé dans certains cas selon sa disponibilité.
78
Matériels et Méthodes
I-5-3-3 Isolement
La biopsie est broyée dans 1 ml de bouillon cœur- cervelle (BHIB) (annexe) ou
bouillon Brucella (annexe) à l’aide d’un mortier stérile ou d’un disperseurhomogénéiseur type Ultra-TURRAX (à l’aide d’un micro-pilon) pendant
quelques secondes de manière à libérer les bactéries. Le broyage ne doit pas
durer trop longtemps, sous peine de détruire les bactéries, mais la suspension
doit tout de même être homogène. Ensuite, le broyat est ensemencée sur 2 boites
Pétri contenant respectivement milieu non sélectif la gélose au chocolat et
milieu sélectif le milieu pylori (bioMerieux) ou le milieu à base de Wilkins
Chalgren. Les boites sont incubées aussitôt ensemencées dans une jarre en
atmosphère microaérobie à 37°C pendant 3 à 7 jours, voire 10 jours
(Lamouliatte et al, 1992; Megraud, 1994a, 1994b, 1996a). L’atmosphère est
renouvelée au moins tous les deux jours pour avoir une croissance optimale
(Megraud, 19890; Fauchère et Rosenau, 1991; Megraud, 1994b).
Les primocultures doivent être examinées à partir du 3 ème jour.
Toutefois, certaines cultures dégénèrent rapidement, il convient donc de
démarrer les subcultures des que les colonies sont visibles. La croissance est
plus rapide en subculture (2 à 4 jours).
Il est à signaler que l’on peut conserver le reste du broyat dans un microtube à
congélation et le stocker à – 20 °C pour la PCR.
I-5-3-4 Identification
L’identification est basée sur la détermination des caractères morphologiques et
biochimiques (Megraud, 1994a; Lamouliatte et al, 1992; Megraud, 1996a).
I-5-3-4-1 Examen macroscopique
L’aspect des colonies et leur dimensions sont étudiées à partir des cultures
bactériennes obtenues sur les milieux de culture (Lamouliatte et al, 1992;
Fauchère et Rosenau, 1991).
79
Matériels et Méthodes
I-5-3-4-2 Examen microscopique
Il a été effectué sur un frottis bactérien, préparé à partir des colonies suspectes
en cultures pures, puis fixé et coloré par la méthode de Gram (Megraud, 1994b).
I-5-3-4-3 Etat frais
Il consiste à déposer sur une lame, une goutte de la suspension bactérienne,
préalablement préparée, qui sera par la suite recouverte par une lamelle.
La préparation est observée au grossissement (x 40) (Marchal et al., 1991)
I-5-3-4-4 Tests Biochimiques
L’étude des caractères biochimiques est basée essentiellement sur la recherche
de l’oxydase, de la catalase et de l’uréase. Car leurs positivités confirment qu’il
s’agit bien de H. pylori (Fauchère et Rosenau, 1991; Lamouliatte et
al., 1992 ; Sobhani et al., 1995).
Les trois tests biochimiques (oxydase, catalase, uréase) s’effectuent sur une lame
porte-objet à partir des colonies suspectes apparues sur les milieux en utilisant
respectivement le disque d’oxydase, eau oxygénée (H2O2) et le milieu
Urée-indole (annexe). La lecture des résultats se fait immédiatement.
Toutes les souches de H. pylori ainsi isolées et identifiées seront
antibiogrammées et conservées à long terme à – 80°C.
I-5-4 Antibiogramme
La sensibilité des souches de H. pylori isolées aux antibiotiques habituellement
utilisés dans la thérapie a été testée par deux techniques, la méthode de disques
en utilisant les antibiotiques suivants : (tétracycline TE, Rivampin RA,
Levofloxacin LVX) et le E-test en utilisant la clarithromycine (CH),
le métronidazole (MZ) et l’amoxicilline (AMX).
80
Matériels et Méthodes
A partir d’une culture de 48 h sur les milieux d’isolement, une suspension
bactérienne dense contenant (109 CFU/ml) est préparée en bouillon Brucella
(4 ml). Ensuite, le milieu Muller-Hinton additionné de 10% de sang de mouton
(annexe) est ensemencé par inondation de la suspension bactérienne. L’excès de
la suspension est ensuite éliminé en respectant les mesures de sécurité
nécessaires et les boites sont mises à sécher environ 10 mn. Puis, on dépose sur
chaque boite les disques ou les bandelettes E-test correspondants aux
antibiotiques à tester. Après 72 h d’incubation à 37° C en microaérobiose.
La lecture des résultats s’effectue par la mesure des diamètres de zone
d’inhibition
autour des disques d’antibiotiques ou par la détermination de
la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) (Amhis et al., 2001).
En cas de E-test, on observe une ellipse d'inhibition. Au point d'intersection
entre la zone d'inhibition et la bandelette, la concentration en antibiotique
correspond à la CMI de la souche étudiée.
Les antibiotiques testés ainsi que leurs valeurs de sensibilité et résistance sont
illustrés dans le tableau 8.
I-5-5 Conservation
La conservation à long terme se fait dans 0.5 ml de milieu glycérol peptonée
(annexe) dans des microtubes. A l’aide d’un écouvillon, on prépare
une suspension bactérienne très riche de la souche de H. pylori dans 0.5 ml de
milieu glycérol peptonée. Les microtubes ou les eppendorfs ainsi préparés sont
conservés dans des boites à congélation dans le congélateur à – 80 °C.
81
Matériels et Méthodes
Tableau 8 : Valeurs des antibiotiques utilisés (Institut Pasteur)
Antibiotiques
Clarithromycine CH
E-Test (mg/l)
Disque (mm)
≥ 1 Résistant
Résistant < 17
0,5 et 1 Intermédiaire
Sensible ≥ 19
< 0,5 Sensible
Amoxicilline AMX
≥ 1 Résistant
0,25 et 0,5 Intermédiaire
Résistant < 17
Sensible ≥ 20
< 1 Sensible
Métroridazole MZ
Tétracycline TE
Levofloxacin LVX
Rivampin RA
> 8 Résistant
Résistant < 17
≤ 8 Sensible
Sensible ≥ 19
> 8 Résistant
Résistant < 17
≤ 4 Sensible
Sensible ≥ 19
> 2 Résistant
Résistant < 17
≤ 1 Sensible
Sensible ≥ 20
> 16 Résistant
Résistant < 14
≤ 4 Sensible
Sensible ≥ 19
82
Matériels et Méthodes
I-5-6 Application de la technique PCR en temps réel
La PCR en temps réel sur biopsies gastriques ou sur les colonies permettrait de
façon fiable de détecter à la fois Helicobacter pylori et d’éventuelles mutations
de résistance à la clarithromycine (Raymond et al., 2010).
Effectivement, la mise en évidence de H. pylori à partir des biopsies gastriques a
été confirmée par la technique moléculaire « PCR en temps réel ».
D’autre part, cette technique a été utilisée pour identifier les souches de H.
pylori isolées et détecter d’éventuelle mutation à la clarithromycine.
Cette technique a été pratiquée au niveau de la faculté de Bordeaux (France).
Pour réaliser cette technique, l’ADN bactérien est extrait soit de la culture
bactérienne, soit directement des biopsies gastriques.
La biopsie gastrique doit alors passer par deux étapes importantes: la digestion
et l’extraction de l’ADN.
a- Digestion
La digestion se fait à partir de broyat de la biopsie gastrique congelée à -20°C de
la manière suivante :
Transférer dans un tube conique à bouchon les ¾ de broyat de la biopsie
décongelée. Centrifuger 30 min à 14000 rpm. Enlever le surnageant et traiter le
culot avec le kit Qiagen 180ul de tampon de lyse ATL et 20ul de protéinase K.
Votrexer. Incuber 3h ou Overnight à 56°C, sous agitation dans un appareil
thermomixer compact.
Quant il s’agit d’une culture bactérienne, récupérer les bactéries de H.pylori
cultivées à l’aide d’un écouvillon stérile et les déposer dans un tube de 1.5ml
contenant 1ml d’eau physiologique stérile.
Centrifuger 5 min à 6000 rpm afin de culotter les bactéries. Enlever
le surnageant et traiter le culot avec 180ul de tampon ATL et vortexer.
Ajouter 20ul de protéinase K et vortexer. Incuber 3h ou overnight à 56°C, sous
agitation. Après l’incubation, faire un pulse de centrifugation de 10 secondes.
83
Matériels et Méthodes
b- Extraction d’ADN
Ajouter 200 ul de tampon AL (DNA stool) et vortexer 15 secondes. Incuber 10
min à 70°C. Faire un pulse de centrifugation de 10 sec.
Ajouter 200 ul d’éthanol absolu au lysat. Vortexer 15. Faire un pulse de
centrifugation.
Marquer la colonne (+bouchon) et la placer dans un tube de 2ml.
Transférer la solution dans la colonne du kit. Centrifuger 1min à 14 000 rpm.
Conserver la colonne et la placer dans un nouveau tube collecteur du kit et jeter
le filtrat.
-Ajouter 500 ul de tampon AW1 sur la colonne et centrifuger 1min à 14000 rpm.
-Conserver la colonne et la mettre dans un nouveau tube collecteur.
-Ajouter 500 ul de tampon AW2 et centrifuger 3min à 14000 rpm.
-Placer la colonne dans un tube de 1.5ml.
-Ajouter 100 ul d’eau chauffée à 70°C. Laisser 5min à température ambiante.
-Centrifuger 2min à 14000 rpm. Récupérer l’ADN dans le tube de 1.5 ml
étiqueté.
c- Technique de la PCR en temps réel
Une fois l’ADN de H. pylori est extrait, nous passons à la réalisation de la
technique PCR en temps réel.
Les différentes étapes de la PCR sont : la dénaturation de l’ADN, l’hybridation
et l’élongation. Ces étapes se font simultanément de la manière suivante :
-Pré-PCR
Préparation du mélange réactionnel qui contient les amorces 23S, les sondes
fluorescentes et l’enzyme polymérase (annexe). Cette opération se fait sous
l’hôte.
84
Matériels et Méthodes
Pré-PCR- Dépôt
La répartition du mélange préparé dans des capillaires (7.2 µl dans chaque
capillaire) (annexe).
L’addition de 0.8 µl d’ADN (test ou témoin) dans chaque capillaire (annexe)
puis vortexer.
Les capillaires sont ensuite bouchés, placé dans un centrifuge appelé Carousel
puis centrifugé à 3000 rpm pendant 1 mn.
Enfin, Les capillaires sont placés dans un appareil appelé LightCycler, combiné
à un système optique de précision et un ordinateur puis analysés.
d- Expression des résultats
Après validation technique, les résultats sont enregistrés dans la base de données
du système informatique et interprété par un thermocycleur
L’utilisation de l’appareil de PCR quantitative le LightCycler
permet de
développer un test où la présence de H. pylori et sa sensibilité à
la clarithromycine peuvent être détectées en 3-4 heures.
85
Matériels et Méthodes
II- Isolement et caractérisation des lactobacilles
II-1 Provenances des échantillons du lait
Les échantillons de lait cru de chèvre ont été collectés auprès d’une ferme
d’élevage privé localisé dans la région d’Es-Senia à ORAN. Les prélèvements
ont été effectués dans des conditions d’hygiène parfaites. Après lavage du pis de
la chèvre à l’eau savonneuse, rinçage à l’eau javellisée puis séchage avec une
lingette stérile, le lait a été recueilli dans des flacons stériles (100 ml / flacon)
dés les premiers jets puis placés dans une glacière (+ 4°C), ensuite transportés
immédiatement au laboratoire pour analyse microbiologique.
La souche de référence Lactobacillus delbrueckii sp. bulgaricus CNRZ 449
(LBDB CNRZ) est fourni par l’INRA (France).
II-2 Milieux de culture
Les bactéries lactiques sont relativement exigeantes sur le plan nutritionnel et
ces exigences varient d’une souche à l’autre. Pour la culture des lactobacilles,
nous avons utilisé le milieu de culture MRS acidifié (pH 5,4) liquide ou solide
présentés en annexe.
II-3 Isolement et identification des lactobacilles
II- 3-1 Isolement
Les analyses microbiologiques sont faites après enrichissement des échantillons
du lait par incubation à 30°C et à 45°C, jusqu’à coagulation pour activer la flore
endogène mésophile et thermophile.
L’isolement sélectif des lactobacilles par culture sur MRS gélosé acidifié (pH
5.4) (De Man et al., 1960) a été réalisé selon les méthodes décrites par la
Fédération Internationale du Lait (FIL, 1996). Après dilution décimales (10-1 à
10-9) des échantillons dans une solution de Ringer au ¼ stérile, 100 µl de
86
Matériels et Méthodes
la dilution est ensemencé en profondeur dans le milieu. Les boites de Petrie sont
ensuite incubées en microaérobiose dans une jarre d’anaérobiose à 30 et à 45°C
pendant 48h pour l'isolement des lactobacilles mésophiles et thermophiles
respectivement.
II-3-2 Identification des lactobacilles
II-3-2-1 Caractérisation morphologique
Des colonies typiques de lactobacilles à savoir leur apparence macroscopique
(aspect de la colonie: forme, taille, couleur, contour) sont prises au hasard, à
partir de boites de MRS contenant entre 30 et 300 colonies et sont ensuite
repiquées dans le bouillon MRS acidifié et incubées à 30+ °C. Après incubation,
les colonies sont réensemencées et purifiées dans du MRS solide. Les souches
seront examinées pour leur coloration de Gram et le test de catalase.
Les bactéries Gram positives et catalase négatives, de forme bacillaire sont
présumées des lactobacilles et seront conservées sur MRS incliné à 4°C pour
une identification ultérieure. La conservation à long terme est effectuée à -20°C
dans du lait écrémé à l’extrait de levure (LEY) supplémenté de 30% de glycérol
(Schillinger et Lucke, 1987; Samelis et al., 1994).
II-3-2-2 Détermination des isolats
Les isolats sont identifiés en genres par des tests préliminaires morphologiques
(macroscopique et microscopique) et physiologiques en se basant sur les tests
décrits par Harrigan et McCance (1976), Sharpe (1979), Kandler et Weiss
(1986), Falsen et al., (1999) et Klein (2001).
Pour une identification au niveau de l’espèce et sous espèces, l’étude du profile
fermentaire des souches s’avère nécessaire.
87
Matériels et Méthodes
II-3-2-3 Détermination du genre
II-3-2-3-1 Température
Ce test permet de distinguer les bactéries lactiques (lactobacilles) mésophiles
des bactéries lactiques (lactobacilles) thermophiles. Après inoculation
de
la souche bactérienne isolée en bouillon MRS, les tubes sont incubés pendant
sept à dix jours à 15 °C et pendant 24 à 48 heures à 45 °C. La croissance
bactérienne est évaluée par une turbidité dans le bouillon MRS.
Les bactéries pouvant croître à 45°C et non pas à 15°C, sont considérées comme
étant des lactobacilles thermophiles, celles ne pouvant pas pousser à 45°C mais
croitre à 15°C sont considérées comme étant des lactobacilles mésophiles
(Bourgeois et Larpent, 1996).
II-3-2-3-2 Type fermentaire
Ce test permet d’apprécier le type de métabolisme par lequel le substrat carboné
est transformé, il consiste à mettre en évidence la production du CO2 et de
savoir ainsi le type fermentaire des souches isolées (hétéro ou homolactiques).
L’ensemencement des souches s’effectue dans le bouillon MRSG (Bouillon
MRS +glucose) contenant au préalable une cloche de Durham, suivi par une
incubation à 30°C pendant 24 à 48 h, La production du gaz dans la cloche
indique que la souche est hétérofermentaire, dans le cas contraire elle est
homofermentaire (Harrigan et Mc Cance, 1976).
II-3-2-3-3 Hydrolyse de l’arginine
La recherche de l’arginine dihydrolase (ADH) est étudiée sur le milieu Moeller,
qui renferme l’arginine, le glucose et un indicateur de pH (pourpre de
Bromocresol) (annexe). L’ensemencement de la suspension bactérienne dans
le milieu est réalisé en anaérobiose en recouvrant la surface du milieu d’huile de
paraffine stérile. Le milieu Moeller sans arginine sert comme témoin.
L’incubation se fait à 37°C pendant 48h. Les lactobacilles fermente le glucose et
88
Matériels et Méthodes
les milieux s’acidifient provoquant ainsi le virage de l’indicateur au jaune
(réaction négative). Dans le deuxième cas, la production éventuelle de l’enzyme
(ADH) conduit à l’alcalinisation du milieu, ce qui provoque le virage de
l’indicateur du jaune au violet (réaction positive) (Moeller, 1955).
II-3-2-3-4 Utilisation du citrate
L’utilisation du citrate en présence de glucose est étudiée sur milieu KMK
(annexe) (Kempler et Mc Kay, 1980). Ce milieu contient une solution de
ferricyanide de potassium et une solution de citrate ferrique. La présence du
citrate dans le milieu inhibe la réaction entre l’ion ferrique et le potassium
ferricyanide. Après 18 h à 72 h d’incubation, Les colonies qui fermentent
le citrate permettent la réaction entre ces ions il en résulte la formation de
colonies bleues ou ayant un centre bleu (cit+). Les colonies incapables de
fermenter le citrate restent blanches (cit-).
II-3-2-3-5 Hydrolyse de l’esculine
L’hydrolyse de l’esculine a été effectuée selon la méthode de Milliere et al.,
(1989). Elle se traduit par le noircissement du milieu MRS gélosé modifié
contenant 0,5 % d’esculine et 0,05 % de citrate ferrique ammoniacal (annexe).
Après une incubation à 30°C pendant 24 h à 48 h, La lecture se fait, par rapport
à un témoin non ensemencé. Les tubes sont examinés jusqu’a une semaine.
L’hydrolyse de l’esculine libère du glucose et l’esculétine. La fonction phénol
de cette dernière réagit avec les sels de fer donnant une coloration noire dans
le milieu due à la formation d’un complexe métallique.
II-3-2-4 Détermination de l’espèce
Afin de déterminer les espèces, nous avons recours à l’étude du profil
fermentaire des souches isolées. Ce test est basé sur la fermentation des sucres
en utilisant le bouillon MRS (sans le glucose et l’extrait de viande) additionné
89
Matériels et Méthodes
de 40 mg/l de pourpre de bromocrésol comme indicateur de pH (MRS-BCP) et
supplémenté de 1% des sucres suivants : arabinose, cellobiose, gluconate,
lactose, mannitol, mélézitose, mélibiose, raffinose, rhamnose, ribose, sucrose,
tréhalose, sorbitol, xylose (Samelis et al., 1994).
La culture bactérienne de 18 heures de la souche à tester est centrifugée à 4000
tr/mn pendant 10 min. Le culot ainsi récupéré est additionné de 2 ml de tampon
phosphate puis recentrifugé aux mêmes conditions pour obtenir un culot
cellulaire, qui est ensuite additionné au milieu MRS-BCP. Les conditions
d’anaérobiose sont assurées par l’addition d’une couche mince d’huile de
paraffine stérile à la surface du milieu de culture.
La fermentation des sucres est appréciée après 24 à 48h d’incubation à 30°C par
le virage du milieu du pourpre au jaune au jaune.
II-3-2-4-1 Identification des espèces en utilisant le système API 50 CHL
Les profils biochimiques ont également été étudiés en utilisant le système API
50 CHL (Ref 50410, BioMérieux, France).
API 50 CHL est un système standardisé associant 50 tests biochimiques
permettant l’étude du métabolisme des hydrates de carbone des lactobacilles.
La galerie est formée de 50 microtubes, permettant l’étude de la fermentation
des substrats correspondant à la famille des glucides et leurs dérivés
(hétérosides, polyalcools, acides uroniques). Le premier tube sans principe actif
sert de témoin négatif. La fermentation des 49 sucres se traduit par un virage de
la couleur du milieu au jaune.
L’utilisation de cette galerie API 50 CHL consiste à
la préparation de
l’inoculum, la préparation et l’inoculation des galeries puis l’incubation à 30 C°.
90
Matériels et Méthodes
a- Préparation de l’inoculum
Le culot obtenu de la culture bactérienne de 18 h (expliqué précédemment) est
suspendu dans 1 ml d’eau physiologique stérile. Un nombre de gouttes (n) de
cette suspension est introduit dans 5 ml d’eau physiologique stérile de façon à
obtenir une opacité de 2 sur l’échelle de Mc Farland. On prélève alors à l’aide
d’une pipette Pasteur 2n gouttes de la suspension initiale (1ml) dans 10 ml de
milieu API 50 CHL (Ref 50410, BioMérieux).
b- Préparation des galeries
10 ml d’eau distillée sont réparties dans les alvéoles du fond de la boîte de
la galerie formée de 5 bandes comprenant chacune 10 tubes numérotés (0-9, 1019, 20-29, 30-39, 40-49). La galerie est inoculée par la suspension bactérienne à
l’aide d’une pipette Pasteur. Les cupules sont remplies avec de l’huile de
paraffine stérile, puis, la galerie est incubée à 30 C°.
c- Lecture et interprétation
La lecture des résultats des galeries est réalisée après 24 et 48 h en les
comparant aux profiles standards en utilisant le logiciel PIBWIN. La
fermentation des sucres se traduit par le virage de l’indicateur du pH au jaune.
II-3-3 Conservation des souches :
La conservation des souches des lactobacilles est faite à court et à long terme.
La conservation à court terme est effectuée sur milieu MRS incliné à +4°C et
leur renouvellement se fait par repiquage toute les 4 semaines.
Par ailleurs, La conservation à long terme des souches est réalisée à -20°C ou à 80°C dans une solution contenant 70% de lait écrémé (enrichie par 0.5g/l
d'extrait de levure et 0.5g/l de glucose) et 30% de glycérol (Samelis et al., 1994).
A partir d’une culture jeune (18-24h) sur bouillon MRS, les cellules sont
récupérées par centrifugation à 4000 t / min pendant 10 min, ensuite le milieu de
91
Matériels et Méthodes
conservation est rajouté sur le culot obtenu. Avant leur utilisation, les bactéries
sont revivifiées par une ou deux subcultures dans des bouillons MRS à 30 °C
pendant 18 à 24 h.
III- Mise en évidence des inhibitions des lactobacilles et H. pylori
La mise en évidence d’éventuel antagonisme, existant entre les lactobacilles vis
à vis de H. pylori est réalisée selon deux méthodes directes et indirectes.
Les souches de lactobacilles isolées du lait de chèvre ainsi que la souche de
référence Lb. delbrueckii sp. bulgaricus CNRZ 449 (LBDB CNRZ) ont été
testées pour leur activité antimicrobienne vis à vis des souches pathogènes de
H. pylori isolés des biopsies gastriques ainsi que et les souches de références H.
pylori
J99
(HP4)
et
H.pylori
26695
(HP5).
La culture des souches de lactobacilles est faite sur milieu MRS acidifié
(annexe) alors que la culture des souches de H. pylori est préparée dans le milieu
cœur cervelle que ce soit liquide (bouillon BHIB) (annexe) additionné de 10%
sérum de cheval ou solide BHI-agar (annexe) (Sgouras et al., 2004).
III-1 Méthode directe
L’inhibition de la croissance de H. pylori par les lactobacilles est déterminée
suivant la méthode décrite par Geis et al. (1983), qui consiste à ensemencer
les souches de lactobacilles testées (culture de 16 h) (supposées être inhibitrices)
en touches (5µl) sur milieu MRS gélosé. Après séchage à température ambiante,
les boites de Pétri ainsi ensemencées sont incubées pendant 18h à 37°C en
microaérobiose. Ensuite, les souches pathogènes de H. pylori (indicatrices) sont
ensemencées en masse en couvrant la culture des lactobacilles avec 7 ml de la
gélose cœur cervelle BHI-agar molle (0,7 % agar) préalablement ensemencé par
0.1 ml d’une culture jeune de la souche de H. pylori (10 7 ufc.ml-1) .
Après solidification du milieu, les boites de Pétri sont réincubées en
microaérobiose (sachet Campy pak) pendant 72 h à 37°C. L’inhibition se
92
Matériels et Méthodes
révèlera par la présence d’un halo clair autour des souches ensemencées en
touche. La lecture des résultats est faite par la mesure du diamètre des zones
d’inhibitions apparues autour des colonies exprimées en mm (ayant un diamètre
égale ou supérieure à 2 mm sont considérées comme positive) (Gonzalez et al.,
2007; Pulsani et al., 1979).
III-2 Méthode indirecte
L’inhibition de la croissance de H. pylori par le surnageant des lactobacilles a
été testée par la méthode dite la méthode de puits, décrite par Wendakoon et al.
(1998), qui permet de mettre en contacte le surnageant de la souche lactique
productrice de substance antimicrobienne avec la souche test (H. pylori).
Le choix des souches indicatrices et inhibitrices est basé sur les résultats du test
de la mise en évidence des inhibitions en milieu solide par la méthode directe.
Les souches de lactobacilles testées sont cultivées dans le bouillon MRS et
incubées à 30°C pendant 18h. Après incubation, le milieu est centrifugé (4000
tr/mn pendant 10 min) à 4 °C. Le surnageant est récupéré, puis filtré avec des
filtres Millipore 0,45µm. Dans une boite de Pétri contenant le milieu gélosé
BHI-agar et préalablement ensemencé en masse par la suspension bactérienne de
la souche test de H. pylori (108 cfu /ml), des puits sont réalisés à l’aide d’une
cloche de Durham stérile, remplis par la suite avec 70 µl du surnageant de
la souche lactique. Les boites de Pétri ainsi préparées sont pré-incubées pendant
2 à 4 heures à + 4 °C, afin de permettre la diffusion radiale de l’agent inhibiteur
(Simova et al., 2008 ; Allouche et al., 2010), suivit par une incubation à 37°C
pendant 72 h en microaérobiose (sachet de Campy pak). La lecture de l’activité
inhibitrice se fait par la mesure du diamètre des zones d’inhibitions apparues
autour des puits.
Le milieu MRS est utilisé comme témoin négatif. L’amoxicilline (1mg/ml) est
utilisé comme témoin positif.
93
Matériels et Méthodes
III-3 Détermination de la nature de l’agent inhibiteur.
Les lactobacilles sont connus par leur capacité à produire des substances
antibactériennes particulièrement l’acide lactique et les bactériocines.
Afin de déterminer la nature de la substance inhibitrice produite, Un certain
nombre de tests doit donc être réalisé pour les souches bactériennes lactiques
présentant les plus grands halos d’inhibition.
La recherche de la nature de l’agent inhibiteur a été réalisée en milieu solide en
se basant sur l’élimination d’un constituant au profit de l’autre par la méthode
indirecte des puits expliqué précédemment. La lecture des résultats consiste à
mesurer le diamètre des halos d’inhibition apparue autour des puits.
III-3-1 Inhibition due au peroxyde d’hydrogène
Certaines bactéries lactiques produisent du peroxyde d’hydrogène (H2O2) au
cours de leur métabolisme, qui est considéré comme un inhibiteur de
la croissance bactérienne. Cet agent peut être dégradé par la catalase, présente
chez certaines bactéries (Cogan et al., 1981 ; Juillard et al., 1987).
Pour détecter l’effet éventuel du peroxyde d’hydrogène sur l’inhibition de H.
pylori, les surnageants de Lactobacillus sp. obtenus sont traités par 1mg/ml de
catalase (Sigma) (0.2 M tampon phosphate, pH 6.5), filtrés, puis incubée à 37°C
pendant 2 heure. Le filtrat est ensuite testé sur H. pylori par la méthode des
puits. Les filtrats non traités à la catalase ont été utilisés comme témoin (Simova
et al., 2008).
III- 3-2 Inhibition due à l’acide lactique
L’acide lactique produit par les bactéries lactiques est un facteur majeur dans
les inhibitions bactériennes. Ce test a pour but d’étudier l’effet de l’abaissement
du pH sur le développement des souches indicatrices (H. pylori). Cette méthode
a été réalisée en neutralisant le surnageant des lactobacilles par la soude NaOH
1N de façon à obtenir un pH de 6,5. Le surnageant est ensuite filtré, puis testé
vis-à-vis des souches de H. pylori par la méthode de puits (Noonpakdee et
al., 2009 ; Allouche et al., 2010).
94
Matériels et Méthodes
III-3-3 Inhibition due aux bactériophages
Les phages peuvent être l'origine des inhibitions de la croissance bactérienne.
Pour détecter une éventuelle activité inhibitrice due à la présence de
bactériophages virulents, une portion de la gélose prise dans la zone d'inhibition
est découpée avec une pipette Pasteur, puis suspendu dans 1 ml du bouillon
MRS contenant 20 µl de chloroforme. Après agitation, on laisse décanter 5 min,
puis 0,5 ml du milieu est prélevé, ensuite centrifugé à 6000 trs/mn (pour
éliminer les débris cellulaires ou la gélose). 300 µl de surnageant est ajouté à
7 ml de gélose molle de BHI-agar contenant la souche indicatrice (H. pylori).
Le mélange est coulé dans une boite de Pétri puis incubé à 48 h à 37°C sous les
conditions de la microaérobiose. La présence de plages de lyse indique
la présence de phages (Lewis et al., 1991).
III- 3-4 Inhibition due aux bactériocines
La recherche des bactériocines comme étant substance inhibitrice nécessitent
la détermination de
la nature protéique de ces substances éventuellement
élaborées par les lactobacilles. La sensibilité aux enzymes protéolytiques est un
critère principal dans leur caractérisation.
Pour ce faire, nous avons utilisé les enzymes protéolytiques suivantes: la pepsine
(Sigma), l’alpha-chymotrypsine (Sigma ) et la trypsine (Sigma). Chaque enzyme
est dissoute dans du tampon phosphate (0,2 M/L, pH 7.0) et stérilisée par
filtration sur filtre millipore de 0,45 µm. Ainsi, 200 ul de filtrat obtenu des
lactobacilles est traité par 20 ul d’enzyme à une concentration finale de 1 mg/ml,
puis incubé à 37°C pendant 2 heure (Coventry et al., 1997 ; Noonpakdee et
al., 2003, Ten brink et al., 1994).. L’action de ce filtrat est testée par la méthode
des puits sur le milieu BHI-agar préalablement ensemencé par H. pylori et
incubé à 37°C pour 48 h à 72h en microaérobiose (sachet Campy pak).
95
Matériels et Méthodes
III-3-5 Effet de la température
Les substances antimicrobiennes ont été testées pour leur résistance à
la température et la conservation de leur activité vis-à-vis de H. pylori après
le traitement thermique. Les filtrats de culture des souches lactiques sont traités
par différentes températures à 100°C pendant 10 mn et 120°C pendant 20 mn,
Après refroidissement, l’activité des filtrats est vérifiée vis-à-vis de H. pylori
par la méthode des puits. Des filtrats non traités sont utilisés comme contrôle
(Casla et al., 1996 ; Coventry et al., 1997, Noonpakdee et al., 2003).
La levée de l’inhibition désigne la sensibilité de l’agent inhibiteur au traitement
thermique effectué.
III-4 Mesure de l’acidité titrable
L’évaluation de l’acidité produite par les souches de lactobacilles sélectionnées
pour leur pouvoir inhibiteur élevé est réalisée par titrimétrie et pH-métrie.
Le pH est mesuré à l’aide d’un pH mètre type Orion Research à électrode
combinée. Le titrage de l’acidité est effectué selon la méthode Dornic, à l'aide
d'une solution de soude NaOH à N/9 et de phénolphtaléine en solution
alcoolique à 1% employée comme indicateur. Les souches de lactobacille sont
ensemencées dans 10ml de lait écrémé stérile (10% p/v). Après incubation à
30°C pendant 24 h, 1% d’inoculum est transvasé stérilement dans des tubes
contenant 10 ml de lait écrémé stérile. La cinétique d’acidification et du pH sont
réalisées simultanément aux intervalles de temps réguliers suivants : 0h, 1h, 2,
3h, 4h, 5h, 6h, 7h et 24h.
III-4-1 Dosage de l’acidité
On prélève 10 ml de lait en le transférant dans une fiole conique de100 ml.
On y ajoute cinq gouttes de phénolphtaléine et on verse la soude goutte à goutte
jusqu'à obtenir une couleur rose pale persistante. On note alors le volume de
la soude en ml utilisé en dixièmes de millilitres, correspondant au degré Dornic.
96
Matériels et Méthodes
(Acidité en degré Dornic = n x 10) c'est-à-dire 1 °D correspond à 0,1 g d’acide
lactique par litre de lait (0,1 g/l) n est le volume de la solution sodique utilisée
pour titrer 10 ml de lait (Guiraud, 1998).
III-5 Mise en évidence des inhibitions en milieu liquide
Ce test permet d’étudier le comportement des souches indicatrices (H. pylori)
en présence de filtrat de la souche lactique inhibitrice (lactobacille) en milieu
liquide, et de déterminer également l’effet inhibiteur de l’acide lactique sur
la croissance de H. pylori.
Dans cette partie expérimentale, nous nous sommes basés sur les résultats
obtenus par les tests de la mise en évidence des inhibitions en milieu solide,
c'est-à-dire que nous avons retenus dans les cas où l’inhibition a été nettement
observée en milieu solide raison pour laquelle la souche Lb. rhamnosus (LBR1)
a été sélectionnée et testée vis-à-vis de la souche H. pylori1 (HP1) et H. pylori2
(HP2).
En premier temps, la culture de H. pylori suspendue dans le bouillon BHIB est
ensemencée avec un volume de 50% de filtrat de Lb. rhamnosus à son pH
native (4.5) (Sgouras et al., 2004), et en deuxième temps, la croissance de H.
pylori est suivie en présence de l’acide lactique (60 mM) dans le tampon
phosphate (PBS) à un pH 3.5 (Midolo et al., 1995 ; Tsai et al., 2004).
Les cultures de H. pylori en milieu BHIB ont été utilisées comme contrôle.
Après incubation à 37°C sous les conditions de la microaérobiose, la viabilité de
H. pylori est évaluée toute les 12 heures pendant 72h par la détermination des
cellules viables de H. pylori (CFU) sur le milieu BHI-agar (Sgouras et al.,
2004).
97
Matériels et Méthodes
III-6 Effet inhibiteur des lactobacilles sur les bactéries pathogènes
Les souches lactiques sont également testées pour leur pouvoir inhibiteur à
l’égard de certaines bactéries pathogènes, permettant ainsi de déterminer leur
spectre d’activité en utilisant la méthode directe précédemment expliquée (Geis
et al., 1983). En effet, nous avons testé l’effet inhibiteur des Lactobacillus sp.
sélectionnés vis-à-vis des bactéries Gram positive et Gram négative, qui sont
représentées dans les espèces suivantes : Staphylococcus aureus (ATCC 25923),
Escherichia coli ATCC 25921, Pseudomonas aeruginosa ATCC 2785,
Klebsiella pneumoniae, Salmonella enteritidis, provenant du laboratoire médical
du CHU Oran et Bacillus subtilis obtenu du laboratoire de recherche Mascara.
Pour cette étude, nous avons suivi les mêmes étapes que celles utilisées dans
le cas de la mise en évidence des inhibitions entre les lactobacilles et H. pylori,
sauf que les souches pathogènes sont incubées en aérobiose à 37°C pendant 24h.
L’inhibition se traduit par la formation d’une zone autour de la souche de
lactobacille ensemencée en touche (considérée inhibitrice), témoignant
la présence d’une activité antagoniste vis-à-vis des bactéries pathogènes testées
(considérées indicatrices). La lecture des résultats consiste à mesurer le diamètre
de la zone d’inhibition apparue autour de la colonie de lactobacille.
98
Résultats
I-Mise en évidence de H.pylori
La démonstration du rôle pathogène de H.pylori
dans les maladies
gastroduodénales rend la recherche de cette bactérie nécessaire (Bruley des
Varannes, 1996). Cette recherche a été réalisée par des tests invasifs, en
identifiant la bactérie par un examen anotomopathologique, un examen
cytologique et une culture, en exploitant sa production importante de l’uréase
par un test rapide à l’urée , ou par la tecchnique moléculaire PCR en temps réel
(Lozniewski, 1996; Megraud, 1996a).
I-1 Examen cytologique
La coloration de Gram du frottis gastrique montre la présence des formes de
bacilles souvent incurvées ou spiralées. Elles apparaissent Gram négatif et ont
tendance à se trouver nombreuses dans certaines zones du frottis (fig. 31).
I-2 Test rapide à l’urée
La recherche, directement au niveau de la biopsie, d’une activité uréasique
rapide et intense est un argument majeur en faveur de la présence de H. pylori.
Le test a l’urée, réalisé à partir de la biopsie gastrique, utilisant le milieu uréeindole donne une réaction positive qui est traduite par un virage de l’indicateur
du pH vers le rose (fig. 32). Le virage survient le plus souvent au moins de 20
minutes.
Pour le CLO test, il se révèle positif par virage de l’indicateur de sa couleur
jaune initiale a une couleur rouge (fig. 33). Le changement de la couleur du
milieu est dû à l’alcalinisation du milieu par la transformation de l’urée en
ammoniac sous l’influence de l’uréase.
Le test à l’urée donne parfois une réaction négative car le nombre de bactéries
est trop faible dans le fragment biopsique (il faut un nombre supérieur a 105
dans la biopsie pour faire virer l’indicateur).
98
Résultats
H. pylori
Fig. 31: Observation microscopique d’une empreinte biopsique après coloration
de Gram (x 1000)
1
2
Fig. 32: Test rapide à l’uréase
Fig. 33: Test rapide à l’urée en utilisant le CLO test
99
Résultats
I-3 Examen anatomopathologique
L’observation microscopique des coupes histologiques des biopsies gastriques
par l’anatomopathologiste , a montré la présence de bacilles incurvés ou en S
dans les cryptes et à la surface de la muqueuse gastrique. Cette observation
renseigne également sur l’état de la muqueuse gastrique (fig. 34).
I-4 Isolement et identification
L’isolement de H. pylori à partir des biopsies gastriques a permis d’obtenir des
colonies. Leur identification est basée sur la détermination des caractères
morphologiques (macroscopique et microscopique) et biochimiques.
I-4-1 Aspect macroscopique
La culture de la biopsie gastrique sur les milieux d’isolement a révélé
l’apparition de petites colonies, de 1 mm de diamètre. Elles sont grisâtres ou
transparentes, luisantes, discrètement bombées, rondes et de contour régulier
(fig. 35, 36,37). Cet aspect est rencontré chez H. pylori.
I-4-2 Aspect microscopique
La coloration de Gram, réalisée a partir des colonies apparues, montre
la présence de bactéries Gram négatif. Elles se présentent sous la forme de
bacille qui peut être droit, incurvé, en virgule, en forme de C, de V ou de S, aux
contours réguliers (fig. 38). Cette morphologie est différente de celle observée
sur le frottis de la biopsie. Les bactéries apparaissent plus grosses et moins
spiralées. Les bactéries évoluent rapidement au cours des repiquages vers des
formes d’aspect coccoïde .
100
Résultats
H. pylori
Fig. 34 : Examen anatomopathologique de la biopsie gastrique (x 1000)
Colonies
H. pylori
Fig. 35 : Aspect macroscopique de H. pylori sur milieu pylori
101
Résultats
colonies
H. pylori
contaminant
Fig. 36: Aspect macroscopique de H. pylori sur milieu au sang non
sélectif
Fig. 37 : Aspect macroscopique de H. pylori sur milieu au sang
après purification
102
Résultats
Fig. 38 : Observation microscopique de H.pylori après coloration
de Gram (x 1000)
103
Résultats
I-4-3 Etat frais
Les bactéries examinées à l’état frais apparaissent très mobiles par des
mouvements spiralés et de rotation.
I-4-4 Etude biochimique
L’identification est complétée par la recherche des caractères biochimiques
(catalase, oxydase et uréase). Nous avons noté la présence d’une oxydase, d’une
catalase et d’une uréase très puissantes (fortement positive). Les résultats sont
représentés dans le tableau 9. La positivité de ces trois tests confirme qu’il s’agit
bien de H. pylori. Sur la base des résultats obtenus, nous avons pu isoler et
identifier trois souches de H. pylori (Hp1, Hp2, Hp3).
Tableau 9 : Caractérisation biochimique des différentes souches de H.pylori isolées
des biopsies gastriques (Hp1, Hp2, Hp3)
Souches
Uréase
Catalase
Oxydase
Hp1
+
+
+
Hp2
+
+
+
Hp3
+
+
+
104
Résultats
I-5 Antibiogramme
L’étude de la sensibilité des souches de H.pylori testés aux antibiotiques
habituellement utilisés dans le choix thérapeutique, par la technique du E-test et
la méthode de diffusion (disque) a montré l’excellente activité de la plupart des
antibiotiques utilisés vis-à-vis de H. pylori.
En effet, toute les souches de H.pylori (HP1, HP2, HP3) sont sensible à
la clarithromycine (fig. 39) et l’amoxicilline (fig. 40) dont la concentration
Minimale Inhibitrice CMI est inférieure à 0.5 mg/et 1 mg/l respectivement,
De même, les souches testées ont montré une sensibilité à la tétracyline, à
la rifampicine et levofloxacine dont le diamètre de la zone d’inhibition est
supérieur ou égale à 19 mm (fig. 42). La résistance à la levofloxacine n’a été
observée que chez la souche HP1 (DI inférieur à 17 mm).
Toutefois, les souches de H. pylori (HP1, HP3) ont montré une résistance
remarquable au métronidazole ou la CMI est supérieur à 8mg/l alors que
la souche HP2 est sensible à l’antibiotique (fig. 41).
Les résultats cités sont illustrés dans les tableaux 10 et 11
105
Résultats
Fig. 39: Sensibilité de H. pylori à la clarithromycine
Fig. 40: Sensibilité de H. pylori à l’amoxicilline
106
Résultats
Fig. 41: Sensibilité de H. pylori au métronidazole
1
2
3
1 : Tétracycline
2 : Rivampin
3 : Levofloxacin
Fig. 42: Sensibilité de H. pylori à la Tétracycline, Rivampin et Levofloxacin par la
méthode de diffusion
107
Résultats
Tableau 10: Détermination de la CMI (E-test), et du diamètre de la zone
d’inhibition (méthode de disques) des souches de H. pylori
Souches Abréviation
HP1
HP2
HP3
Antibiotiques
Clarithromycine (mg/l)
CH
0,016
0,19
0,023
Amoxicilline (mg/l)
AMX
0,25
0,125
0,047
Metronidazole (mg/l)
MZ
32
4
64
Tétracycline (mm)
TE
38
46
32
Rivampin (mm)
RA
22
26
32
LVX
06
26
32
Levofloxacin(mm)
Tableau 11: Sensibilité et résistance des souches de H. pylori vis à vis
des antibiotiques
Souches
Abréviation
HP1
HP2
HP3
CH
S
S
S
Amoxicilline (mg/l)
AMX
S
S
S
Metronidazole (mg/l)
MZ
R
S
R
Tétracycline (mm)
TE
S
S
S
Rivampin (mm)
RA
S
S
S
LVX
R
S
S
Antibiotiques
Clarithromycine (mg/l)
Levofloxacin(mm)
S : sensible; R : resistant
108
Résultats
I-6 Mise en évidence de H. pylori par la PCR en temps réel
La technique moléculaire de la PCR en temps réel permet de façon fiable de
détecter à la fois H. pylori et d’éventuelle mutation de résistance à
la clarithromycine à partir des biopsies gastriques ou de la colonie (PCRcolonie). Le système de la PCR en temps réel est basé sur l’émission de
la fluorescence à partir des sondes (marqueur) fluorescentes spécifiques.
Des thermocycleurs particulier sont nécessaires pour la lecture continue de
la fluorescence émise.
Les résultats obtenus de la détection de H. pylori par ce type de PCR sont
représentés graphiquement sous formes de courbes. Chaque courbe correspond à
un échantillon. La lecture de la PCR en temps réel correspond à la variation de
la fluorescence en fonction de la température. Cette température appelée
température de fusion (Tm) est représenté par un pic unique sur la dérivé.
Les courbes de fusion obtenues sont comparées par celles du témoin négatif
(absence d’ADN) et des témoins positifs comprenant ADN sauvage, ADN muté
en position A21422C (dite position C) et ADN muté en position A2412/2143G
(dite position G) qui correspond à la résistance à la clarithromycine (fig. 43).
En effet, les souches isolées de H. pylori (HP1, HP2, HP3), traitées par
la technique de la PCR en temps réel ont révélé une conformité à l’Helicobacter
pylori (ADN positif) où la température de fusion (Tm) correspond à celle
d’ADN sauvage (témoin positif) (fig. 44). Il s’agit donc de souche de H. pylori
dite sauvage. Ces souches de H. pylori testées ne présentent donc aucune
mutation de résistance à la clarithromycine (position G), ni mutation en position
C. Alors que la souche de référence possède un ADN muté resistant à la
clarithromycine (séquence d’ADN muté en position A2412/2143G ou dite en
position G) où la Tm est moins faible par rapport à celle de l’ADN sauvage (fig.
44)
109
Résultats
.
Témoin négatif (T. NEG)
G (sequence mutée en position A 2412/2143G)
C (sequence mutée en position 2142C)
WT (séquence d’ADN sauvage)
Fig. 43 : Témoins (négatif et positifs) utilisés dans la PCR en temps réel
110
Résultats
:
souche de reference muté en position G (resistance à la clarithromycine)
souche HP1 sauvage (WT)
souche HP2 sauvage (WT)
souche HP3 sauvage (WT)
Fig. 44 : Cas positif de la PCR à partir des culture de H. pylori testés et la souche
de référence
111
Résultats
Quant aux échantillons des biopsies gastriques (cinq choisis), ayant montré
une absence de H. pylori par la culture, la PCR en temps réel a également révélé
l’absence de H. pylori dans les trois biopsies gastriques (fig. 45), conformémant
au résultats de la culture (négatif).
Tandis que cette technique moléculaire a detecté la presence des souches
de H. pylori dite sauvage (ADN positif sauvage) dans les deux autres biopsies
gastriques testées ayant montré une negativité de H. pylori par la culture
(fig. 46).
On peut donc constater que la culture peut parfois donner des resultats
faussenent négatif en raison de sa extreme sensibilité et que la PCR reste
la technique la plus fiable pour la mise en evidence de H. pylori à partir
des biopsies gastriques.
112
Résultats
Fig. 45: Cas négatif de la PCR des 3 biopsies gastriques
113
Résultats
biopsie 4 (HP sauvage WT)
biopsie 5 (HP sauvage WT)
Fig. 46 : Cas positif de la PCR à partir de deux biopsies gastriques
114
Résultats
II Isolement et identification des lactobacilles
L’isolement des lactobacilles à partir du lait cru de chèvre nous a permis d’isoler
42 souches de lactobacilles. Ces isolats ont été identifiés au stade du genre et
espèce voire sous espèce dans certains cas en se basant sur leur morphologie
cellulaire, et leur caractères biochimiques et physiologiques (tableau12).
En effet, nous avons procédé en premier lieu à une pré-identification des
colonies apparues sur le milieu MRS sur la base de leur caractère macrospique,
microscopique, ainsi que le test de la catalase.
Tous les isolats Gram positif, de forme bacillaire, ne possédant pas de catalase
sont retenues et présumées de lactobacilles.
II.1 Examen morphologique
L’étude macroscopique des cultures permet de décrire l'aspect des colonies
obtenues sur milieu MRS (forme, taille, couleur) et de retrouver les critères
relatifs aux colonies de lactobacilles. Ces dernières sont de petite taille d'environ
1mm de diamètre, de couleur blanchâtre à crémeuse, de forme circulaire et
régulière avec une surface lisse (Fig. 47).
L’observation microscopique après la coloration de Gram révèle la présence de
bactéries Gram positive, de forme bacillaire, plus ou moins longue, isolées, en
paires, ou en chaînettes typiques des lactobacilles (Fig. 48).
II.2 Caractères physiologiques et biochimiques
Les résultats des tests physiologiques et biochimiques permettent de classer
les isolats dans le genre de lactobacille.
115
Résultats
Tableau 12: Code des espèces de lactobacilles isolées à partir du lait de chèvre
Code des
Nom des espèces
espèces
LBDB
Lactobacillus delbrueckii sp. bulgaricus
LBDL
Lactobacillus delbrueckii sp. lactis
LBH
Lactobacillus helveticus
LBS
Lactobacillus salivarius
LBP
Lactobacillus plantarum
LBR
Lactobacillus rhamnosus
LBCC
Lactobacillus casei sp. casei
LBCR
Lactobacillus casei sp. rhamnosus
LBPP
Lactobacillus paracasei sp. paracasei
LBPS
Lactobacillus pentosus
LBB
Lactobacillus brevis
LBF
Lactobacillus fermentum
116
Résultats
Fig. 47: Aspect macroscopique des colonies de lactobacilles sur milieu MRS
Fig. 48 : Aspects microscopiques des lactobacilles après coloration de Gram (x 1000)
117
Résultats
Le premier test biochimique effectué chez les lactobacilles permettant son
appartenance au groupe de bactéries lactiques est celui de la catalase.
Tous les isolats de lactobacilles sont dépourvus de catalase, caractère connu
chez les bactéries lactiques mais ils peuvent produire une pseudocatalase quand
le milieu contient une concentration élevée de glucose (Carr et al., 2002).
Le test du type fermentaire nous a également permis de différencier les souches
homofermentaires des souches hétérofermentaires. Or, nous avons pu isoler 06
lactobacilles
hétérofermentaires
et 36
lactobacilles
homofermentaires.
La présence de gaz dans la cloche de Durham indique un métabolisme
hétérofermentaire, alors que le test de croissance à différentes températures a
classé les souches de lactobacilles isolées en bactéries thermophiles pouvant
croître à 45°C et non pas à 15°C, et des bactéries mésophiles ne pouvant pas
pousser à 45°C mais croitre à 15°C.
De plus, l’hydrolyse de l’arginine est un caractère connu chez les lactobacilles.
Certaines espèces de Lactobacillus sp. possèdent l’enzyme arginine dihydrolase
(ADH) qui en dégradant l’arginine produisent l’ammoniac (Hugenholtz
et
al., 1993, Mannu et al., 2000).
D’autre part, l’hydrolyse de l’esculine par les lactobacilles se traduit par
le noircissement du milieu gélosé à l’esculine, indiquant la libération de
l’esculétine.
Le métabolisme du citrate, sucre fermentescible par les lactobacilles est en
relation étroite avec l’activité aromatique. La détection de cette propriété sur
milieu KMK (Kemper et Mckay., 1980) a montré la capacité de certaines
souches de Lactobacillus sp. à utiliser le citrate (fig. 49).
La figure 50 rassemble certains tests biochimiques préliminaires pour
l’identification des lactobacilles.
118
Résultats
1
Citrate -
4
2
Citrate +
3
1 : Lb. helveticus; 2 : Lb. brevis; 3 : Lb. plantarum; 4: Lb. rhamnosus
Fig. 49: Utilisation du citrate sur milieu Kempler et Mc Kay (KMK)
1
2
1
2
1
2
2
1 : témoin
2 : test
A
1
2
1
2
1
2
1 : témoin
2 : test
B
Fig. 50: tests biochimiques préliminaires des lactobacilles
(type fermentaire, test ADH, test esculine)
119
A : lactobacilles hétérofermentaire (Lb. brevis)
B : lactobacilles homofermentaire (Lb. plantarum)
Résultats
Sur la base de différentes températures de croissance, de l’hydrolyse de
l’arginine et du type fermentaire, les lactobacilles isolés sont classés selon
Carr et al. (2002) en trois groupes (I, II et III) qui représentent respectivement
les bactéries homofermentaires thermophiles, homofermentaires mésophiles et
hétérofermentaires
mésophiles.
Ces
dernières
font
partie
du
groupe
Betabacterium, les homofermentaires thermophiles celui de Thermobacterium
alors que le groupe Streptobacterium renferme les homofermentaires mésophiles
(Tableau. 13). Or, nous avons révélé la prédominance des lactobacilles du
groupe II (19 souches) ayant un taux de 45.23% parmi les lactobacilles isolées
suivi par les lactobacilles du groupe I (17 souches) avec un taux de 40.47 %, et
enfin les lactobacilles du groupe III (6 souches) avec un taux de 14.28 %
(fig. 51).
L’emploi des tests cités ci-dessus nous a permis de faire une préidentification
des lactobacilles, qui sont ensuite identifiés au stade de l’espèce par l’étude de
leur profil fermentaire en utilisant 14 sucres (tableau 14). Cette identification est
faite en confrontant les profils obtenus des isolats avec ceux des souches de
référence trouvés dans la clé d'identification de Bergey (Lopez et Mayo, 1994;
Mathara et al., 2004; Lee et al., 2006).
La détermination des propriétés fermentaires a été confirmée par l’emploi de
la galerie API 50 CHL notamment chez les souches de lactobacilles (tableau 15)
(fig. 52) sélectionnés
pour leur activité antimicrobienne vis-à-vis de
H. pylori comme on le verra ultérieurement.
120
Résultats
Tableau 13 : Caractéristiques des lactobacilles isolées
Souches
Co2 du
glucose
LBDB1
LBDB2
LBDB3
LBDB4
LBDB5
LBDB6
+
+
+
+
+
+
LBDB7
LBDL1
LBDL2
LBDL3
LBDL4
LBH1
LBH2
LBH3
LBH4
LBS1
LBS2
LBP1
LBP2
LBP3
LBP4
LBP5
LBR1
LBR2
LBR3
LBCC1
LBCC2
LBCC3
LBCC4
LBCR1
LBCR2
LBCR3
LBPP1
LBPP2
LBPS1
LBPS2
LBB1
LBB2
LBB3
LBB4
LBF1
LBF2
15°C 45 °C Hydrolyse
Arginine
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Hydrolyse
esculine
Hydrolyse
citrate
Pré-identification
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Lactobacillus (groupe I)
121
THERMOBACTERIUM
Lactobacillus (groupe II)
STREPTOBACTERIUM
Lactobacillus (groupe III)
BETABACTERIUM
Résultats
122
Résultats
Tableau 14: Profils fermentaires des lactobacilles isolés
sucre
soucheLBF1
LBF2
LBDB1
LBDB2
LBDB3
LBDB4
LBDB5
LBDB6
LBDB7
LBDL1
LBDL2
LBDL3
LBDL4
LBH1
LBH2
LBH3
LBH4
LBS1
LBS2
LBP1
LBP2
LBP3
LBP4
LBP5
LBR1
LBR2
LBR3
LBCC1
LBCC2
LBCC3
LBCC4
LBCR1
LBCR2
LBCR3
LBPP1
LBPP2
LBPS1
LBPS2
LBB1
LBB2
LBB3
LBB4
1--
2--
3+
+
-
4+
+
+
5--
6--
7+
+-
8+
+-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
123
9--
10
+ 11
+ 12
+ 13
+
--+ +- +
- +
- +
- +
- +
- +
+ + + +
+ + + +
+
- +
+
+ + +
+ + +
- + + + +
- + + + +
- + + + +
- + + + +
- + + + +
+ + + + +
+ + + + +
+ + + + +
+
- +
+
- +
+ + + +
+ + + +
+ + + +
+ + + +
+ + + +
+ +
+
+ +
+
+
+ +
+ +
+ -
14
--
Résultats
Tableau
15: Profils
fermentaires
des lactobacilles
par6:galerie
API 50
1: Arabinose,
2: Cellobiose,
3: Gluconate;
4: Lactose, 5: isolés
Mannitol,
Mélezitose,
7: CHL
Mélibiose, 8: Raffinose, 9 : Rhamnose, 10: Ribose, 11: Sucrose, 12 : Tréhalose, , 13: Sorbitol,
14: Xylose. ; +: réaction positive, -: réaction négative,
sucre
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
souche
LBDB
LBH
LBS
LBP
LBR
LBCC
LBCR
LBB
+
+
+
+
+
+
v
-
+
+
+
v
+
+
+
+
+
+
v
+
+
+
+
+
v
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
V
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
v
-
124
Résultats
37
38
39
40
41
-
-
-
+
+
-
+
+
-
+
-
+
-
+
-
42
43
44
45
46
47
48
49
-
-
-
+
-
+
-
+
+
-
+
+
-
+
-
Sucres: 0: CONTROL; 1:
GLYcerol; 2: ERYthritol; 3: D ARAbinose;
4: L ARAbinose; 5: RIBose; 6: D XYLose; 7 L XYLose; 8 ADOnitol;
9 Methyl-D-Xyloside; 10 GALactose; 11 GLUcose; 12 FRUctose ; 13 MaNnosE ;
14 SorBosE; 15 RHAmnose; 16 DULcitol; 17 INOsitol; 18 MANnitol; 19 SORbitol;
20 -Methyl-D-Mannoside; 21 -Methyl-D-Glucoside; 22 N-Acetyl-Glucosamine;
23 AMYgdalin; 24 ARButin; 25 ESCulin; 26 SALicin; 27 CELlobiose; 28 MALtose;
29 LACtose; 30 MELibiose; 31 Sucrose; 32 TREhalose; 33 INUlin; 34 MeLeZitose;
35 RAFfinose; 36 Starch; 37 GLYcoGen; 38 XyLiTol; 39 GENtiobiose;
40: D TURanose; 41: D LYXose ; 42: D TAGatose ; 43 D FUCose ; 44 L FUCose;
45 D ARabitoL; 46: L ARabitoL; 47: GlucoNaTe ; 48: 2-Keto-Gluconate;
49: 5-Keto-Gluconate.
Souches:
LBDB : Lb. delbrueckii sp. bulgaricus ; LBH: Lb. helveticus ;
LBS : Lb. salivarius ;
LBP: Lb. plantarum ; LBR : Lb. rhamnosus ;
LBCC : Lb. casei sp. casei ; LBCR : Lb. casei sp. rhamnosus ; LBB: Lb. brevis.
125
Résultats
A
B
Fig. 52 : Profil fermentaire par le système API 50 CHL
chez Lb. rhamnosus (A), Lb. plantarum (B)
II-3 Répartition des espèces de lactobacille
126
Résultats
Les résultats obtenus lors de la fermentation des carbohydrates des lactobacilles
permettent de les répartir en 10 espèces
(fig. ). Le groupe 1 (groupe des
lactobacilles thermophiles homofermentaires) est constitué de 11 isolats de
Lactobacillus delbrueckii dont 07 isolats de Lactobacillus delbrueckii sp.
bulgaricus, espèce prédominante dans ce groupe avec un taux de 17%, et 04
isolats de Lactobacillus delbrueckii sp. lactis (9.5%), suivie par Lactobacillus
helveticus représentés par 04 isolats (9.5%) et Lactobacillus salivarius avec
deux isolats (5%). Ces espèces sont caractérisées par la transformation des
hexoses exclusivement par voie homofermentaire en produisant du lactate, ils ne
fermentent ni les pentose ni les gluconate. Ce sont des thermophiles, qui se
développent à 45° C mais pas à 15°C. Leur température de croissance optimale
est de 42°C. Les lactobacilles du groupe II (groupe des lactobacilles mésophiles
hétérofermentaires facultatifs) sont représentés en majorité par Lactobacillus
plantarum (05 souches) (12%), puis Lactobacillus casei dont 04 isolats de
Lactobacillus casei sp. casei (9.5%) et 03 isolats de Lactobacillus casei sp.
rahmnosus (7%), suivi par Lactobacillus rhamnosus (03 souches) (7%).
Ces bactéries métabolisent le rhamnose. Les Lactobacillus paracasei subsp.
paracasei (02 isolats) et Lb. pentosus (02 isolats) sont également rattachés dans
ce groupe avec un taux de 5% respectivement. Ces espèces fermentent les
hexoses en produisant du lactate par voie homofermentaire et les pentoses par
voie hétérofermentaire. Ce sont des mésophiles, qui se développent à 15 °C.
Leur température optimale de croissance se situe entre 30°C et 37°C.
Quant aux
Lactobacillus
brevis (04 isolats) (9.5 %) et Lactobacillus
fermentum, (2 isolats) (5%), ils font partie du groupe III (groupe des
lactobacilles hétérofermentaires stricts). Les bactéries appartenant à ce groupe
fermentent les pentoses et les hexoses par voie hétérofermentaire en lactate,
en acétate et/ou en éthanol et CO2. Leur température de croissance diffère selon
les espèces, elle varie de 30 à 45°C.
127
Résultats
Fig. 53 : Répartition des espèces de lactobacilles isolées du lait de chèvre
128
Résultats
III Production des substances antimicrobiennes
L'interaction entre les Lactobacilles sp. et H. pylori constitue un critère
important de sélection des souches lactiques, utilisées comme probiotique pour
le traitement de l’infection de H. pylori. Cette partie concerne les méthodes
permettant de mettre en évidence l’antagonisme sur milieu solide et liquide qui
pourrait exister entre les souches de Lactobacillus sp. isolées du lait cru de
chèvre et les souches pathogènes de H. pylori isolées des biopsies gastriques.
La détermination de la nature de l’agent inhibiteur a également été recherchée.
III-1 Mise en évidence des inhibitions entre les Lactobacillus sp. et H. pylori
L’étude de l’activité antimicrobienne des Lactobacillus sp. sur la croissance de
H. pylori a été effectuée par la méthode directe de diffusion sur milieu solide
(Geis et al., 1983). Les souches de lactobacilles ont été testées vis-à-vis de
H. pylori où une souche est considérée comme inhibitrice (lactobacille) et l’autre
indicatrice (H. pylori). L’inhibition se traduit par la formation d’une zone autour
de la souche ensemencée en touche (lactobacille), témoignant ainsi la présence
d’une activité antagoniste vis-à-vis de H. pylori. La lecture des résultats consiste
à mesurer le diamètre de cette zone d’inhibition apparue autour de la colonie de
lactobacille. Les 42 souches de lactobacilles isolées ainsi que la souche de
référence Lb. delbrueckii sp. bulgaricus CNRZ 449 (LBDB CNRZ) ont été
testées pour leur activité antimicrobienne vis à vis de H. pylori isolés (HP1,
HP2, HP3) et les souches de références H. pylori J99 (HP4) et H. pylori 26695
(HP5). Les lactobacilles isolés testés sont représentés par les espèces suivantes:
Lb. plantarum; Lb. rhamnosus; Lb. casei; Lb. paracasei; Lb. pentosus;
Lb. salivarius; Lb. delbrueckii; Lb. helveticus; Lb brevis et Lb. fermentum.
129
Résultats
L’ensemble des inhibitions est illustré dans les tableaux (16, 17) et dans
les figures 54, 55, 56 montrant des spectres d’activité variable des lactobacilles.
En effet, d’après les résultats obtenus, il en ressort que la plupart des souches de
lactobacilles prouvent une activité antimicrobienne contre H. pylori testés,
démontrée par
l'apparition de zone d’inhibition avec des diamètres variés.
Or, nous avons constaté que les espèces Lb. delbrueckii sp. bulgaricus,
Lb. plantarum, Lb.rhamnosus, Lb brevis, Lb. helveticus, Lb salivarius, Lb casei
(Lb. casei sp. casei et Lb casei sp. rhamnosus) ont montré un effet inhibiteur
élevé avec une zone d’inhibition importante dont le diamètre varie d’une souche
à l’autre. C’est le cas par exemple de l’espèce Lb. delbrucekii sp. bulgaricus ou
les souches (LBDB1, LBDB3, LBDB5) ont révélé une activité antagoniste
remarquable vis-à-vis de la souche H. pylori2 (HP2) dont le diamètre
d’inhibition dépasse 14 mm (fig. 54) et des diamètres de 10 mm et 12 mm pour
les
souches
LBDB3,
et
LBDB5
vis-à-vis
de
H.
pylori1
(HP1).
En revanche, les souches de Lb. plantarum (LBP1, LBP3) présentent
une activité inhibitrice contre la souche H. pylori2 (HP2) avec un diamètre
d’inhibition de 12mm et 9mm respectivement (fig. 54) et un diamètre de 8 mm
et
10
mm
pour
la
souche
LBP3
et
LBP4
vis-à-vis
de
HP1.
De même, les souches de Lb. rhamnosus (LBR1, LBR2) ont prouvé une
inhibition importante contre H. pylori2 avec des diamètres de 19,83 et 10 mm
respectivement (fig. 54).
De plus, les souches de Lb. salivarius (LBS1, LBS2) (fig. 55) et les souches de
Lb. helveticus (LBH1, LBH2) (fig. 55) ainsi que Lb. brevis (fig. 55) ont
également révélé une activité antagoniste contre HP2 ou les diamètres des zones
d’inhibition oscillent entre 7 et 11 mm.
130
Résultats
1: LBDB1
1
2: LBDB3
4
5
3: LBDB5
2
3
4: LBDB6
5: LBDB7
1 : LBP1
1
2 : LBP3
2
3 : LBP4
4
4 : LBP5
3
3
1 : LBR1
1
4
2 : LBR2
2
3 : LBR3
4 : LBP2
3
Fig. 54: Mise en évidence de l’effet inhibiteur de Lactobacillus sp. sur la croissance de
H. pylori (HP2) ensemencé dans la masse
131
Résultats
1
1 : LBPP1
4
2
2 : LBPP2
3 : LBS1
3
4 : LBS2
1 : LBH1
2
2 : LBH2
1
3
3 : LBH3
4 : LBH4
4
1 : LBB1
1
2
2 : LBB2
3 : LBB3
4
3
4 : LBB4
Fig. 55 : Mise en évidence de l’effet inhibiteur de Lactobacillus sp. sur H. pylori (suite)
132
Résultats
De plus, l’espèce Lb. delbruekii sp. lactis (LBDL) montre certaine inhibition
mais qui varie d’une souche à l’autre (fig. 56).
Cependant, certaines souches n’ont présenté qu’un faible pouvoir inhibiteur,
voire nul vis-à-vis des souches de H. pylori. En effet, nous avons enregistré
des zones d’inhibition avec des diamètres ne dépassant pas 3 mm, parfois nul
expliquant ainsi une absence totale de cette inhibition. C’est le cas Lb. pentosus
(LBPS) et Lb. fermentum (LBF) (fig. 56).
Le tableau 7 rassemble les résultats de l’activité antimicrobienne des souches de
lactobacilles vis-à-vis de H. pylori.
D’après les résultats obtenus, nous avons remarqué que la souche Lb. rhamnosus
(LBR1) a prouvé un pouvoir inhibiteur le plus élevé, et représente l’espèce
la plus inhibitrice pour la majorité des souches de H. pylori testés.
Quant aux souches de H. pylori testées, nous avons constaté que la souche
H. pylori 2 (HP2) est la souche la plus inhibée et la plus sensible au pouvoir
inhibiteur des lactobacilles testés.
Les résultats obtenus ont parfois montré des différences de comportement des
souches lactiques d’une même espèce vis-à-vis des souches pathogènes de
H. pylori comme par exemple le cas de la souche LBP4 qui présente un pouvoir
inhibiteur contre la souche HP1, alors que la souche LBP5 ne montre aucune
inhibition vis-à-vis de HP1 ou le diamètre d’inhibition est nul.
Le tableau 16 et 17 récapitulent les résultats de l’activité antimicrobienne
des lactobacilles sur H. pylori.
133
Résultats
1
1 : LBDL1
2 : LBDL2
2
4
3 : LBDL3
4 : LBDL4
3
1
1 : LBPS1
2
2 : LBPS2
3 : LBF1
3
4 : LBF2
4
1
1: LBDB CNRZ
2: LBCC2
2
4
3: LBCC3
4: LBCC4
3
Fig. 56 : Mise en évidence de l’effet inhibiteur
de Lactobacillus sp. sur H. pylori
134
Résultats
Tableau 16: Activité antimicrobienne des Lactobacillus sp. sur H. pylori
Souches
Lb.
delbrueckii
sp.
bulgaricus
Lb.
delbrukuii
code
pH
HP1
HP2
HP3
HP4
HP5
LBDB1
4.04
5
14.5
7
10
6
LBDB2
4.75
2.1
2.5
3
1.5
2
LBDB3
4.95
10
15.9
2.5
1.9
6
LBDB4
5.20
0
5
4.1
5
4.5
LBDB5
5.45
12
12
3.4
7
4
LBDB6
4.57
4
10
0
5
0
LBDB7
4.18
4.2
10
5
3.5
5.5
LBDL1
4.27
3
3
0
4.5
2.1
LBDL2
3.97
0
0
0
5
3.1
LBDL3
5.36
0
0
2.4
0
0
LBDL4
4.94
2.5
3
1.5
3
2.8
LBH1
4.24
5
7.1
6
2.3
0
LBH2
4.03
3.2
8
7
3
4
LBH3
4.9
3
2.9
2.5
0
3
LBH4
4.5
0
0
3
0
0
LBS1
5.21
4.1
11
4.2
4.5
3.2
LBS2
4.83
5,8
10.3
3.1
4.4
4.1
LBP1
4.99
4.5
12
5
6
5.1
LBP2
5.98
3
2.8
6.4
3
2.5
LBP3
4.69
8.1
9
1.5
5
4.3
LBP4
4.50
1.2
3
0
3.5
0
LBP5
5.90
0
4
2.4
0
0
sp. lactis
Lb.
helveticus
Lb.
salivarius
Lb.
plantarum
135
Résultats
LBR1
4.95
12
19.2
5
10
9.1
LBR2
5.90
2.1
10
2.8
3
4.1
LBR3
4.50
1.9
2.8
2.5
0
3
LBCC1
4.76
2.1
8
3.5
5
4.2
Lb. casei sp. LBCC2
casei
LBCC3
5.88
0
4
7.5
2
5
6.62
3.5
0
2.4
2
1.9
LBCC4
6.13
0
3
2.6
0
0
LBCR1
3.73
5.5
10
3
6
4.5
Lb. casei sp. LBCR2
rhamnosus
4.27
2.9
9
2.4
2
3
LBCR3
4.50
0
3
6.5
0
2.4
LBB1
4.99
3
5.2
2.9
3
3
LBB2
5.98
6
4
0
2
4.5
LBB3
4.91
3
2.5
0
0
0
LBB4
5.88
0
3
3.8
3.5
0
LBF1
6.53
0
0
0
0
0
LBF2
4.12
1.5
0
0
0
0
LBPS1
6.23
0
0
0
1.5
2
LBPS2
6.53
0
0
0
0
0
LBPP1
Lb.
paracasei sp.
paracasei
3.86
2
3
2.4
2.5
0
4.1
1.2
2
0
0
0
4.04
4.5
6.2
2.5
6
4.1
Lb.
rhamnosus
Lb. brevis
Lb.
fermentum
Lb. pentosus
LBPP2
LBDB
Lb.
delbruekii sp. 449
bulgaricus
CNRZ 449
136
Résultats
Tableau 17: Inhibition de H. pylori par les souches de lactobacilles
H. pylori
HP1
HP2
HP3
HP4
HP5
LBDB1
++
++
++
++
++
LBDB2
++
++
++
+
+
Lactobacilles
LBDB3
++
++
++
+
++
LBDB4
-
++
++
++
++
LBDB5
++
++
++
++
++
LBDB6
++
++
-
++
-
LBDB7
++
++
++
++
++
LBDL1
++
++
-
++
++
LBDL2
-
-
-
++
++
LBDL3
-
-
++
-
-
LBDL4
++
++
+
++
++
LBH1
++
++
++
++
-
LBH2
++
++
++
++
++
LBH3
++
++
++
-
++
LBH4
-
++
++
++
-
LBP1
++
++
++
++
++
LBP2
++
++
++
++
++
LBP3
++
++
+
++
++
LBP4
+
++
-
++
-
LBP5
-
++
++
-
-
LBR1
++
++
++
++
++
LBR2
++
++
++
++
++
LBR3
+
++
++
-
++
LBCC1
++
++
++
++
++
LBCC2
-
++
++
+
++
LBCC3
++
-
++
+
+
LBCC4
-
++
++
++
-
LBCR1
++
++
++
++
++
LBCR2
+
++
++
++
++
LBCR3
-
++
++
-
++
LBB1
++
++
++
++
++
LBB2
++
++
-
+
++
LBB3
++
++
-
-
-
LBB4
-
++
++
++
-
LBF1
-
-
-
-
-
LBF2
+
-
-
-
-
LBS1
++
++
++
++
++
LBS2
++
++
++
++
++
LBPS1
-
-
-
+
+
LBPS2
-
-
-
-
-
LBDB CNRZ
++
++
++
++
++
+ : Halo inférieur 2mm; ++: Halo supérieur 2mm; -: pas d’inhibition
137
Résultats
Ce pouvoir inhibiteur, exercés par les lactobacilles, qui diffère d’une souche à
l’autre reflète la capacité de ses souches lactiques de produire des substances
antimicrobiennes inhibant la croissance de la souche pathogène H. pylori.
En effet, L’effet inhibiteur des lactobacilles peut avoir plusieurs origines parmi
lesquelles, nous pouvons mentionner la production d’acides organiques, de
peroxyde d’hydrogène, de bactériocines et les phages (Moreno et al., 1999;
Navarro et al., 2000; Rodriguez et al., 2002; Maldonado et al., 2003; Todorov
et Dicks, 2005).
Afin de déterminer la nature de l'agent inhibiteur, nous avons sélectionné
les souches lactiques fortement inhibitrices (ayant une zone d’inhibition élevée)
parmi les 43 souches de lactobacilles étudiées, et testées leur pouvoir acidifiant.
Le choix et la sélection de 14 souches de lactobacilles a donc été réparti comme
suit : Lb. delbrueckii sp. bulgaricus (LBDB1, LBDB3, LBDB5), Lb. plantarum
(LBP1, LBP3), Lb.rhamnosus (LBR1, LBR2), Lb brevis (LBB1), Lb. helveticus
(LBH1, LBH2), Lb salivarius (LBS1, LBS2), Lb casei sp. casei (LBCC1),
Lb casei sp. rhamnosus (LBCR1).
Ce choix est basé sur les travaux de Hosono et al., (1977) qui établit que le tri
doit se faire à partir des souches qui présentent le plus grand effet inhibiteur.
138
Résultats
III-2 Pouvoir acidifiant
L’évaluation du pouvoir acidifiant des lactobacilles a été réalisée par la mesure
du degré Dornic, qui correspond à la quantité d’acide lactique produite.
Les résultats obtenus ont révélé que la majorité des 14 souches de lactobacilles
étudiées ont un pouvoir acidifiant important, qui diffère selon l’espèce et même
au sein de la même espèce. Effectivement, La souche Lb. rhamnosus (LBR1) a
montré une activité acidifiante plus élevée, qui atteint 69°D en 24h, suivi par les
souches Lb. delbrueckii sp. bulgaricus (LBDB1, LBDB3) et Lb. plantarum
(LBP1) dont le taux d’acidité est de 65°D. De même, les souches LBR2, LBP3,
LBS1, LBS2, LBDB5 ont présenté un pouvoir acidifiant important, qui varie
entre 60 et 64°D après 24 d’incubation. Quant aux souches de Lb. helveticus
(LBH1, LBH2), Lb. brevis (LBB1), ainsi que l’espèce Lb. casei (LBCR1,
LBCC1) ont montré
des taux d’acidification moyen qui varient entre 52 et
59 °D en 24 h. Les résultats de l’acidité sont illustrés dans les figures 57, 58, 59.
En parallèle, le suivit de la variation du pH montre que La souche Lb.
rhamnosus 1 (LBR1) a baissé le pH jusqu'à 4.2 en 24h, suivi par la souche Lb.
delbruecki subsp. bulgaricus (LBDB1, LBDB3) ainsi que Lb. plantarum (LBP1)
dont le pH a atteint 4.4. Quant aux souches LBR2, LBP3, LBDB5, LBS1, LBS2,
les valeurs du pH varient de 4,5 à 4,8 alors que les valeurs du pH obtenues par
les souches LBH1, LBH2, LBB1, LBCR1, LBCC1 sont plus élevées par rapport
à celles des autres souches, compris entre 5.4 et 5.8 après 24 h d’incubation
(fig. 57,58,59). Par conséquent, nous avons remarqué que la baisse du pH dans
le milieu est en relation étroite avec le pouvoir acidifiant exercé par les souches
de lactobacilles. D’après les résultats obtenus, nous avons constaté que
les souches de lactobacilles retenues pour leur pouvoir inhibiteur face au H.
pylori,
possèdent
dans
l’ensemble
un
pouvoir
acidifiant
important.
De plus, la souche Lb. rhamnosus (LBR1) s’est avérée la plus performante non
seulement pour son pouvoir antibactérien, mais également pour son pouvoir
acidifiant.
139
Résultats
Fig. 57 : Evolution de l’acidité et du pH en fonction du temps chez LBCR1, LBCC1, LBH1, LBH2, LBB1.
140
Résultats
82
Résultats
Fig. 58: Evolution de l’acidité et du pH en fonction du temps chez LBP1, LBP3, LBS1, LBS2.
141
Résultats
Fig. 59 : Evolution de l’acidité et du pH en fonction du temps chez LBR1, LBR2, LBDB1, LBDB3, LBDB5.
142
Résultats
III-3 Détermination de l’agent inhibiteur :
L’effet inhibiteur des lactobacilles sur la croissance de H. pylori pourrait être
principalement dû à deux facteurs. Le premier est la production des acides
organiques essentiellement l’acide lactique, un des caractéristiques connu chez
les lactobacilles, alors que le deuxième facteur est la production de substance
protéique inhibitrice appelée bactériocine (Larsen et al., 1993; Anderssen et
al., 1998; Oyetayo et al., 2003; Avila et al., 2005). De plus, d’autres facteurs tels
que la production de peroxyde d’hydrogène et les phages pourraient également
être responsables de cette inhibition. Pour cela, certains tests s’avèrent
nécessaires, permettant de déterminer le ou les facteurs impliqués dans cet
antagonisme.
Pour la recherche de la nature de l’agent inhibiteur sur milieu solide, nous avons
testé les 14 souches de lactobacilles sélectionné pour leur pouvoir inhibiteur
élevé précedemment mentionnés (Lb. delbrueckii sp. bulgaricus (LBDB 1,
LBD3, LBD5), Lb. plantarum (LBP1, LBP3), Lb. rhamnosus (LBR1, LBR2),
Lb brevis (LBB1), Lb. helveticus (LBH1, LBH2), Lb. salivarius (LBS1, LBS2),
Lb casei sp. casei (LBCC1), Lb casei sp. rhamnosus (LBCR1).
Quant aux H. pylori testés, la souche H. pylori 2 (HP2) s’avère la souche la plus
sensible au pouvoir inhibiteur des lactobacilles, raison pour laquelle HP2 est
choisie comme souche indicatrice.
Dans ce contexte, nous avons procédé à la méthode indirecte dite méthode des
puits (Wendakoon et al., 1998), qui consiste à mettre au contact la souche
pathogène de H. pylori (HP 2) ensemencé en masse avec les surnageants
obtenus des lactobacilles testés et par la suite visualiser l’apparition des zones
d’inhibition autour des puits.
143
Résultats
III-3-1 Effet de la production d’acide lactique :
L’acide lactique est, depuis longtemps, reconnu comme un agent majeur de
l'activité antimicrobienne des bactéries lactiques en particulier celle des
lactobacilles. Pour détecter l’effet de l’acide sur H. pylori, nous avons neutralisé
le surnageant des souches de lactobacilles test avec le tampon phosphate à pH 7
afin de minimiser sa production. L’évaluation des résultats obtenus avec
un surnageant non traité (témoin) nous permettra de déterminer si la production
d’acides est un facteur actif des inhibitions observées.
Or, nous avons remarqué que l’inhibition est levée chez 13 souches parmi les 14
souches choisies. C’est le cas de Lb. delbrucekii sp. bulgaricus (LBDB 1,
LBD3, LBD5), Lb. rhamnosus (LBR1, LBR2), Lb. helveticus (LBH1, LBH2),
Lb. salivarius (LBS1, LBS2), Lb. plantarum (LBP1, LBP3), Lb. Casei
sp. rhamnosus (LBCR1), Lb. casei sp. casei (LBCC1) (tableau 18). Ces souches
lactiques testées sont capable d’inhibé H. pylori à leur pH natif, mais cette effet
disparait une fois le surnagent est ajusté à la neutralité, indiquant ainsi l’effet des
acides organiques produits. Ceci est expliqué par l’absence totale des zones
d’inhibition autour des puits contenu le surnageant traité comparativement avec
le témoin non traité. Par contre, l’intensité de l’inhibition pour la souche restante
Lb. brevis (LBB1), est diminuée comparativement au témoin. Ce résultat montre
qu’en plus de l’acidité, un autre facteur est impliqué dans cette inhibition.
Le milieu MRS utilisé comme contrôle négatif n’a pas été inhibé par
les lactobacilles. Par contre, une zone d’inhibition a été observée autour de
l’amoxicilline, comme étant un contrôle positif avec un diamètre de 9 mm.
Ce test réalisé nous a permis de montrer que les inhibitions sont en majorité dues
à l’acidité puisqu’elles ont été soit partiellement soit totalement levées.
Nous pouvons également dire que les souches lactiques inhibent les souches
cibles qu’elle rencontre de façon différentes. Pour le cas où l’inhibition a été
partiellement levée, nous pouvons donc dire que l’acidité n’est pas la cause
majeure de l’inhibition chez Lb. brevis testé.
144
Résultats
Tableau 18: Effet de la production d’acides et du peroxyde d’hydrogène sur H. pylori
Souches
code
pH
SR
SR N
SRC
Lb. delbrueckii
LBDB1
4.04
11
0
11
sp. bulgaricus
LBDB3
3.95
14
0
14
LBDB5
4.75
10
0
10
LBR1
3.76
15
0
15
LBR2
3.73
8
0
8
LBH1
4.24
5
0
5
LBH2
4.03
6
0
6
LBS1
3.71
7
0
7
LBS2
3.50
8
0
8
LBP1
3.27
10
0
10
LBP3
3.69
7
0
7
LBCC1
4.02
5
0
5
LBCR1
4.5
7
0
7
LBB1
4.9
5
3
5
Lb. rhamnosus
Lb. helveticus
Lb. salivarius
Lb. plantarum
Lb. casei
Lb. brevis
SR : surnageant à pH natif ; SRN: surnageant neutralisé à pH 7;
SRC: surnageant traité à la catalase; zone d’inhibition exprimée en mm.
145
Résultats
III-3-2 Effet du peroxyde d’hydrogène
Le peroxyde d'hydrogène produit par les lactobacilles est parmi les facteurs
majeurs dans l’inhibition des espèces bactériennes.
Les bactéries lactiques sont généralement dépourvues de catalase mais certaines
souches peuvent accumuler le peroxyde d'hydrogène lorsqu’elles sont cultivées
en aérobiose. Pour cette raison, nous avons testé un autre facteur antimicrobien
qui est le peroxyde d’hydrogène, impliqué probablement dans cette inhibition.
Pour ce faire, Le surnageant des lactobacilles est traité par la catalase pour
éliminer l’effet éventuel du peroxyde d’hydrogène. Cependant, l’inhibition n’a
pas été levée chez toutes les souches lactiques testées, au contraire elle persiste
avec l’apparition d’un halo d’inhibition dont le diamètre est similaire à celui du
témoin (tableau 18), Ce qui exclut donc l’effet inhibiteur du peroxyde
d’hydrogène sur la croissance de H. pylori.
III-3-3 productions de phage lysogène
Une des caractéristiques de l'effet antibactérien des phages virulents est que
chaque cellule bactérienne infectée et lysée donne naissance à des dizaines ou
des centaines de nouveaux phages qui sont libérés dans le milieu et pourront
déclencher de nouveaux cycles lytiques. Par conséquent, l'effet antibactérien se
propage d'une bactérie à l'autre en s'amplifiant.
Afin d'éliminer la possibilité de la présence de phages, nous avons utilisé
la méthode de Hardy ou le résultat s’est révélé négatif pour l’ensemble des
souches lactiques testées, aucune plage de lyse n’est apparue après incubation.
L’obtention d’un tapis bactérien signifie que l'effet inhibiteur ne peut pas se
propager d'une bactérie à l'autre et donc qu'il n'est pas dû à la présence de
bactériophages.
146
Résultats
III-3-4 Effet de la bactériocine
Puisque les bactériocines sont par définition des substances protéiniques, elles
doivent être sensibles au moins à une protéase. La sensibilité aux enzymes
protéolytiques est un critère principal dans leur caractérisation
En effet, les réponses obtenues après l’action des enzymes protéolytiques
(pepsine, trypsine et α-chymotrypsine) nous permettra d’identifier les substances
antibactériennes comme étant des bactériocines. Si l’halo d’inhibition disparait
en présence de l’action d’une enzyme protéolytique, l’agent inhibiteur est de
nature protéique mais, s’il persiste après l’action des trois enzymes utilisées, il y
a une forte probabilité pour que l’agent ne soit pas de nature protéique c'est-àdire qu’il ne s’agit pas d’une bactériocine (Callewaert et de Vuyst, 2000; Aslim
et al., 2005).
Or, nous avons remarqué qu’après le traitement des surnageant des lactobacilles
par les trois enzymes protéolytiques, aucune inactivation n’est constaté chez
les 13 souches testées (LBDB 1, LBD3, LBD5, LBR1, LBR2, LBH1, LBH2,
LBS1, LBS2, LBP1, LBP3, LBCR1, LBCC1) (tableau 19). Ceci se traduit par
la persistance de la zone d’inhibition autour des puits, indiquant ainsi que
la substance antimicrobienne n’est pas de nature protéique et confirmant l’effet
inhibiteur de l’acide lactique.
Cependant, chez la souche Lb. brevis (LBB1), l’inhibition est partiellement
levée comparativement au témoin avec une diminution de l’halo d’inhibition
après le traitement de surnageant bactérien par la pepsine. Alors, aucune
inactivation n’est constatée chez la souche LBB1en présence de trypsine et
alpha-chymotrypsine (tableau 19). Des zones d’inhibitions sont détectées après
mise en présence de ces enzymes dont le diamètre est identique à celui du
témoin (surnageant non traité). Puisque les bactériocines sont sensible à au
moins à une protéase, critère principal dans leur caractérisation, il y a
une probabilité pour que l’agent inhibiteur soit de nature protéique.
147
Résultats
Tableau 19: Effet de la production de la bactériocine
Souches
code
SR
SRAC
SRT
SRP
Lb. delbrueckii
LBDB1
11
+
+
+
sp. bulgaricus
LBDB3
14
+
+
+
LBDB5
10
+
+
+
LBR1
15
+
+
+
LBR2
8
+
+
+
LBH1
5
+
+
+
LBH2
6
+
+
+
LBS1
7
+
+
+
LBS2
8
+
+
+
LBP1
10
+
+
+
LBP3
7
+
+
+
LBCC1
5
+
+
+
LBCR1
7
+
+
+
LBB1
5.5
+
+
-
Lb. rhamnosus
Lb. helveticus
Lb. salivarius
Lb. plantarum
Lb. casei
Lb. brevis
SR : surnageant non traité ; SRAC : surnageant traité par alpha chymotrypsine;
SRT: surnageant traité par la trypsine ; SRP : surnageant traité par la pepsine ;
+ : présence de la zone d’inhibition ; - : diminution de la zone d’inhibition
148
Résultats
La substance antibactérienne contenu dans le surnageant de la souche LBB1 est
sensible à la pepsine mais l’inactivation n’est pas totale et résistante
complètement aux deux autres enzymes protéolytiques testées. Sa structure
chimique pourrait donc être probablement complexe, contenant en plus du
groupement protéique ou peptidique des entités de nature lipidique ou
polysaccharidique, ou autre structure. D’autre part, le traitement thermique de
surnageant de la souche LBB1 a révélé la sensibilité de surnageant de la souche
LBB1 à la chaleur (filtrat chauffé à 100°C et 120°C). L’activité anti-H. pylori
n’est donc pas retenue après un traitement thermique. Ceci est expliqué par
l’absence de zone d’inhibition autour des puits, montrant ainsi que la substance
contenu dans le surnageant n’est pas thermostable. Sachant que les bactériocines
éventuellement produites par Lb. brevis sont généralement connu par leur
sensibilité aux enzymes protéolytiques et
par leur résistance au traitement
thermique. La figure 60 montre l’effet des surnageants traités de Lb.brevis et
Lb. rhamnosus sur la croissance de H. pylori.
A
B
2
2
3
1
1
3
4
4
1 : filtrat+trypsine
2 : filtrat+pepsine
3 : filtrat+chymotrypsine
4 : MRS (témoin négatif)
1 : filtrat non traité
2 : filtrat + catalase
3 : filtrat tamponné
4 : MRS (témoin négatif)
Fig. 60: l’effet de surnageant de Lb. brevis (A) traité par les enzymes, et le surnageant
tamponné de Lb. rhamnosus (B) sur la croissance de H. pylori ensemencé en mase
149
Résultats
III-4 Effet de surnageant de lactobacille sur H. pylori en milieu liquide
La recherche des inhibitions a également été entamée en milieu liquide.
Le but de cette expérience est de voir d’une part si la souche de lactobacille a
également un pouvoir inhibiteur en milieu liquide, comme celui démontré en
milieu solide, et d’autre part, de montrer si la substance antimicrobienne
éventuellement produite a un effet bactéricide ou bactériostatique sur
la croissance de H. pylori testé.
Pour ce faire, il suffit de suivre l’évolution de la concentration en bactérie
indicatrice viable de H. pylori dans le milieu de culture. La viabilité de la souche
H. pylori incubée à 37°C en présence de surnageant de lactobacille à son pH
natif et de l’acide lactique est mesurée en fonction du temps.
Une stabilité de la concentration en bactérie viable est indicatrice d’un effet
bactériostatique alors qu’une baisse de cette concentration indique un effet
bactéricide.
Dans cette expérience, la souche Lb. rhamnosus (LBR1) est choisie comme
souche inhibitrice pour son pouvoir inhibiteur élevé vis-à-vis de H. pylori
Quant aux souches indicatrices, H. pylori1 (HP1) et H. pylori2 (HP2) ont été
retenus pour leur grande sensibilité à l’effet inhibiteur de Lb. rhamnosus.
En effet, dans le cas ou les souches de H. pylori (HP1, HP2) sont inoculées à
une concentration initiale de 105 CFU/ml dans le surnageant de Lb. rhamnosus ,
la population bactérienne de H. pylori dans les deux cultures restent stables
durant les 12 h d’incubation comparativement au témoin (culture de H. pylori).
Cependant, après cette période, une diminution progressive en concentration des
cellules viables de H. pylori est observée après 24 d’incubation qui atteint à la
moyenne de 103 CFU/ml. Cette baisse de la population bactérienne se poursuit
jusqu' une absence totale en cellules viables à 72h chez H. pylori1 (HP1), et à
60h chez H. pylori2 (HP2) (fig. 61).
De même, l’inoculation des souches de H. pylori (HP1, HP2) dans l’acide
lactique entraine une baisse rapide en cellule de H. pylori dans les deux cultures
150
Résultats
Fig. 61 : Viabilité de H. pylori (HP1, HP2) en présence de surnageant de Lb.
rhamnosus (LBR1) et de l’acide lactique
151
Résultats
dans les 12 d’incubation ou le taux de H. pylori a diminué de 105 à 103 CFU/ml,
ensuite un déclin dramatique est observé dans le nombre cellulaire de H. pylori à
24h notamment chez la souche H. pylori2 , suivi par une absence de croissance à
48 h chez H. pylori1 et à 36 h d’incubation chez H. pylori2 (fig. 61).
Les résultats obtenus montrent d’une part que l’inhibition provoquée par Lb.
rhamnosus est maintenue en milieu liquide additionnée de surnageant et d’autre
part, que le surnageant de Lb. rhamnosus1 contient une substance
antibactérienne ayant une action bactéricide active vis-à-vis de H. pylori qui est
bien l’acide lactique, confirmant ainsi le pouvoir inhibiteur que peut exercer Lb.
rhamnosus contre les souches pathogènes de H. pylori.
De plus, nous avons remarqué que La souche (HP2) montre une sensibilité
élevée par rapport à la souche H. pylori (HP 1) vis-à-vis du surnageant de Lb.
rhamnosus1 (LBR1) et de l’acide lactique.
III-5 Inhibitions des bactéries pathogènes par les Lactobacillus sp.
Les souches lactiques sont testées pour leur pouvoir inhibiteur à l’égard de
différentes bactéries pathogènes, permettant ainsi de déterminer leur spectre
d’activité en utilisant la méthode directe expliquée précédemment (Geis et
al., 1983). En effet, nous avons testé l’effet inhibiteur des Lactobacilus sp.
sélectionnés vis-à-vis des espèces bactériennes Gram positive (Staphylococcus
aureus, Bacillus subtilis), et Gram négative (E. coli, Klebsiella pneumoninae,
Salmonella enteritidis, Pseudomonas aeruginosa).
Sur la base des résultats obtenus, il en ressort que les souches de lactobacilles
testées exercent également une activité antagoniste contre les bactéries
pathogènes et présentent un spectre d’activité large renfermant les bactéries
Gram positive et les bactéries Gram négative. Cet effet antagoniste est variable,
dépend d’une part de la souche indicatrice cible et d’autre part de la souche
lactique inhibitrice.
152
Résultats
En effet, toutes les souches lactiques montrent une activité importante vis à vis
de E. coli et de St. aureus (fig. 62) dont les diamètres des zones d’inhibition
varient entre 9 et 30 mm. De même, les lactobacilles présentent une activité
inhibitrice remarquable sur la souche B. subtilis avec une zone d’inhibition
allant de 8 et 24 mm (tableau 20).
De plus, On a remarqué que les espèces de Ps. aeruginosa et S. enteritidis,
Kl. pneumoninae ont également été inhibées par la majorité des souches de
lactobacilles testées. De plus, nous avons constaté que les bactéries pathogènes
n’ont pas le même comportement face aux lactobacilles. Ceci renseigne sur les
capacités de résistance de ces bactéries aux agents produits par les souches
lactiques.
D’autre part, certaines souches lactiques montrent une différence dans leur
comportement face aux bactéries pathogènes, au niveau d’une même espèce.
C’est l’exemple de la souche LBH1 et LBH2 vis-à-vis de Ps. aeruginosa
(tableau 20). Alors que les souches de Lb. rhamnosus (LBR1, LBR2) inhibent
toutes les souches pathogènes testées, qu’elles soient Gram positive ou Gram
négative. Ces bactéries lactiques ont donc une forte potentialité d’inhibition visà-vis
des
bactéries
pathogènes
y
compris
l’Helicobacter
pylori.
En revanche, nous avons également constaté que l’inhibition des bactéries
pathogènes Gram positive par les lactobacilles est plus importante à celle des
bactéries Gram négative dont la zone d’inhibition est plus grande.
L’inhibition des bactéries pathogènes s’explique par la capacité des lactobacilles
de produire de substances antibactériennes, responsable de cet effet antagoniste
tel que l’acide lactique, le peroxyde d’hydrogène et les bactériocines.
Les bactériocines sont surtout active sur les pathogènes gram+.
Le tableau 20 récapitule les résultats des inhibitions des bactéries pathogènes par
les lactobacilles.
153
Résultats
A
B
1
2
4
1
3
2
4
3
1 : LBS1; 2 : LBS2; 3 : LBDB1; 4 : LBDB3
Fig. 62: Effet antimicrobien des lactobacilles sur les bactéries pathogènes
(A : E. coli ; B : St. aureus)
154
Résultats
Tableau 20 : Activité antimicrobienne des Lactobacillus sp. vis-à-vis des bactéries pathogènes.
Souches cibles
E. coli
Kl.
pneumoniae
St. aureus
S.
enteritidis
Ps.
aeruginosa
B. subtilis
LBDB1
17
9.5
14
14
15
22
LBDB3
15
10
8
12
12
14.5
LBDB5
15
0
12
9.5
8.4
10
LBR1
29
20
25
12
10.5
24
LBR2
18
17
19
20.3
8.3
15
LBH1
10
0
23.5
15.6
15
17.5
LBH2
8
0
15.5
0
0
10
LBS1
9.5
19
9
0
22.5
21
LBS2
10
0
10
10
19
14
LBP1
19.4
20
19
13
15
20
LBP3
10
0
20
14.5
2
8.5
LBCR1
11
14
26
11
0
23
LBCC1
9
0
21
0
14
20
LBB1
16
14
10
6
0
8.2
Souches test
ST: souches ensemencées en touches; SC: souches ensemencées en masse;
Zone d’inhibition exprimée en mm
155
Discussion
Discussion
Récemment, l’attention est portée sur l’interaction entre H. pylori et les bactéries
lactiques essentiellement les lactobacilles (Sgouras et al., 2004). H. pylori,
bactérie
pathogène
chez
l’homme
est
impliqué
dans
les
affections
gastroduodénales (Megraud, 2007). Cette infection est répandue dans le monde
entier et affecte plus de 50% de la population (Dunn et al., 1997; Perez-Perez et
al., 2004). La trithérapie est le traitement actuel le plus recommandé et le plus
efficace (Malfertheiner et al., 2002). Cependant, l’échec de l’éradication de
H. pylori constitue un problème majeur dans la santé (Borody et al., 1996 ;
Megraud, 2007 ;). Par conséquent, la recherche des méthodes alternatives serait
indispensable (Rokka et al., 2006 ; Pinchuk et al., 2001;).
Les lactobacilles, hôte naturel des intestins de l’homme ont des propriétés
nutritionnelles et thérapeutiques aujourd’hui reconnu (Tannok, 1999). Ils sont
considérés comme des probiotiques en raison de leur innocuité chez l’homme et
leur propriétés antagonistes contre les bactéries pathogènes y compris H. pylori
(Sgouras et al., 2004).
Dans ce présent travail, nous avons procédé, en premier temps, à mettre en
évidence H. pylori chez des patients atteints de maladies gastro-duodénales par
des méthodes invasives nécessitant la réalisation des biopsies gastriques lors de
la fibroscopie. Ces méthodes incluent le test rapide à l’uréase, l’examen
cytologique, l’examen histologique, la culture et l’amplification génique (PCR).
La mise en évidence de l’uréase dans les biopsies gastriques par les tests rapides
à l'urée (C.L.O test ou Urée-indole), constitue un point important indiquant la
présence de la bactérie (Dorval, 1992). Cette enzyme, caractéristique essentielle
de H. pylori hydrolyse l'urée normalement présente dans l'estomac en ammoniac
et gaz carbonique. L'ammoniac Libéré neutralise le micro-environnement de
la bactérie en la protégeant de l'acidité gastrique (Leclerc et Vincent, 1991 ;
Lamouliatte et al., 1992; Bretagne, 1996 ).
156
Discussion
Selon plusieurs auteurs, la rapidité et l’intensité de la réaction sont en fonction
du temps du virement et de la densité bactérienne (Sobhani et al, 1991; Souquet,
1995; Megraud, 1996a).
D’après nos résultats, le temps de virement obtenu varie selon les cas de 20 mn,
30 mn voire 1h. Delchier (1996b) observe un virage sur des biopsies infectées
dans la première demi-heure sur environ 80% des cas étudiés. De même,
(Lamouliatte et al., 1992; Megraud, 1992; Fennerty, 1994) ont obtenus des
réactions positives en 20 minutes chez des patients souffrants d’une affection
gastroduodénale et d’après ces chercheurs, la rapidité de la réaction rend ce test
d’une spécificité excellente. Tout résultat positif est donc présumé en rapport
avec l’infection à H. pylori en raison de la forte activité uréasique de cette
bactérie mais à condition de proscrire la lecture tardive du test à 24h, à ce
moment il ne s’agit plus d’un diagnostic rapide car certaines bactéries
uréasiques contaminantes provenant notamment de la bouche comme
Staphylococcus, Streptococcus, voire Klebsiella, Proteus peuvent être à l'origine
des faux positifs (Sobhani et al., 1991; Lamouliatte et al., 1992; Lozniewski,
1996; Megraud, 1996a ; de Korwin, 2003).
De plus, la positivité du test dépend aussi du nombre des bactéries présent dans
la biopsie qui est de l'ordre de 105 bactéries (Lamouliatte et al., 1992; Megraud,
1992; Missonier et Dorval, 1994 ; de Korwin, 2003 ). Ceci explique les faux
négatifs de ce test, qui pourraient être du à un inoculum de départ trop faible, ou
à la répartition hétérogène de H. pylori à la surface de la muqueuse gastrique
(Riachi et Colin, 1995; Lozniewski, 1996 ). Il parait donc préférable de placer 2
biopsies dans le milieu pour augmenter la densité microbienne (de Korwin,
2003).
D’après des données littéraires, l'uréase chez H. pylori est un facteur
d’adaptation partiel lui permettant la colonisation et la survie dans un
environnement acide particulièrement hostile aux autres bactéries (Lamouliatte
et al., 1992 ; Vincent et Leclerc, 1991). Ce rôle a été démontré par Eaton et
157
Discussion
al., (1991) en utilisant des mutants uréase négatif de H. pylori qui ne peuvent
coloniser l'estomac du porcelet, meilleur modèle d’infection à H. pylori.
D’autre part, Marshall et al. (1988) rapporte que H. pylori est également
sensible à l'acidité gastrique que Campylobacter jejuni , mais en présence de
l'urée, H. pylori reste viable à un pH < 3,5.
Cependant, nous ne pouvons pas nous contenter du test à l'uréase pour établir
formellement la recherche de l'infection à H. pylori. Cette recherche doit être
donc complétée par d’autres tests (Delchier, 1994).
L'examen cytologique d’un frottis biopsique, nous a permis de repérer
les Helicobacter par leur morphologie caractéristique (Fauchére et Rosenau,
1991). Il s’agit de bacilles gram négatif incurvés ou légèrement spiralés. La
présence de ces formes dans les empreintes biopsiques a déjà été signalée par
(Cassel-Béraud et al., 1996; Megraud, 1992; Lamouliatte et al, 1992; Megraud,
1996a). Ces auteurs confirment l'intérêt de ce test puis qu’il informe sur
la présence ou l'absence de la bactérie dans l’échantillon.
Par ailleurs, l'examen histologique effectué par l'anatomopathologiste a révélé
dans la plupart des cas la présence des formes incurvées ou spiralées de
H. pylori dans les cryptes et l’épithélium de surface. Cet examen détecte
la présence de H. pylori selon sa morphologie caractéristique et sa localisation
particulière (Megraud, 1994a; De Mascarel et Merlio, 1989). L’intérêt de cette
technique a été confirmé par (de Korwin, 2003; Megraud, 1994a; De Mascarel et
Merlio, 1989). De plus, La présence de H. pylori au niveau de l’épithélium
gastrique met en évidence les rapports de contact entre cette bactérie et les
cellules épithéliales gastriques, site préférentiel de H. pylori et confirme son
appartenance aux bactéries du mucus digestif (Fauchére, 1994a; Lamouliatte et
al., 1992; Missonier et Dorval, 1991).
Toutefois, cette méthode est parfois prise en défaut notamment du fait de
la distribution irrégulière de la bactérie dans l'antre (Bruley Des Varannes, 1996;
Souquet, 1995). Pour cela, la réalisation de biopsies multiples (au moins deux)
158
Discussion
diminue le risque de résultats faussement négatifs sur les biopsies (de Korwin,
2003).
Les méthode morphologiques laissent parfois un doute contrairement à la culture
qui seule permet une identification certaine de la bactérie (Lamouliatte et
al., 1992; Souquet, 1995; Bruley Des Vanannes, 1996). La culture est donc une
méthode diagnostic la plus spécifique et constitue le test de référence le plus
fiable pour affirmer la présence de H. pylori et tester la sensibilité aux
antibiotiques, mais elle nécessite une attention particulière (de Korwin, 2003).
Dans ce contexte, nous avons procédé à l’isolement de H. pylori. Cependant, H.
pylori est une bactérie fragile, difficile à cultiver. Elle est microaérophile,
sensible à la dessiccation et exigeante sur le plan métabolique (Lamouliatte et
al., 1992; Megraud, 1992; Lozniewski, 1996). Son isolement exige une
atmosphére microaerobie (système de Campy-pack) et un milieu de culture
enrichi par le sang, le sérum ou l'amidon (Sobhani et al., 1991 ; Fennerty, 1994 ;
Sobhani et al., 1995). La croissance de H. pylori est favorisée en particulier par
l'apport du sang dans le milieu. Ceci a été démontré par l'équipe de Graham en
utilisant un milieu gélosé, enrichi avec 7% de sang de cheval pour traiter
les biopsies gastriques (Hachem et al., 1994). Pour cela, nous avons utilisé des
milieux d’isolement additionnés de sang comme celui de la gélose au chocolat.
De plus, l'utilisation d’un milieu sélectif (milieu pylori) nous a également permis
un isolement sélectif de la bactérie (Megraud, 1989, 1994a).
Une fois la bactérie isolée, nous avons procédé à l’'identification des souches,
qui
est
fondée
sur
des
caractères
morphologiques
(macroscopique,
microscopique) et biochimiques (Lamouliatte et al., 1992; Megraud, 1992 ;
1994a, 1996a). L’aspect particulier de H. pylori facilite son identification
(Megraud, 1992) et ces caractères spécifient l’espèce de H. pylori (Megraud,
1989, 1994a, 1996a, 1996b). Effectivement, les souches de H. pylori isolées
forment de petites colonies grisâtres ou transparentes, luisantes et bombées
rondes et régulières.
159
Discussion
Ces caractères macroscopiques spécifie l’espèce de H. pylori (Medouakh et
Bensoltane, 2010; Medouakh et al., 2010 ; 2006, 2008 ; Megraud, 1989, 1994a,
1996a). De plus, les souches de H. pylori ont montré une mobilité par l’examen
direct à l’état frais. Il s’agit donc de bactéries mobiles et d’après certains auteurs
(Lamouliatte et al., 1992; Monteiro, 1995) cette mobilité est due d’une part à sa
forme spiralée, d’autre part à la présence des flagelles polaires. Cette propriété
permet à H .pylori de se mouvoir dans le mucus gastrique (Lamouliatte et
al., 1992; Fauchére et Roseneau, 1991; Fauchére, 1994a).
D’autre part, le caractère Gram négatif des souches obtenues permet de les
classer parmi les bactéries Gram négative (Megraud, 1994a). De plus, les
souches isolées possèdent des formes cellulaires variables (incurvés, en virgules,
en forme de C, de V ou de S), morphologie particulière de H. pylori (Fauchére,
1994a; Megraud, 1994b).
Quant à l'identification biochimique, les souches de H. pylori isolées possèdent
une oxydase, une catalase et une uréase extrêmement intense. La positivité de
ces trois caractères biochimiques confirment qu’il s’agit bien de H. pylori
(Fauchére, 1994a; Medouakh et Bensoltane, 2010; Medouakh et al, 2010, 2006,
2008; Megraud, 1989; Megraud, 1994a;
Sobhani et al., 1991; Yousfi et
al., 1997).
D’après les tests effectués et les résultats obtenus, nous avons pu isoler trois
souches de H. pylori (HP1, HP2, HP3) alors qu’il y’ a des cas où de nombreuses
bactéries sont vues sur frottis coloré au Gram ou sur coupes histologiques, mais
qu’aucune colonie ne pousse sur la gélose. C’est le cas d’une étude qui a été
réalisée à Madagascar où Quinze souches (10,7 %) seulement de H. pylori ont
pu être isolées parmi 140 biopsies malgré la positivité des autres tests de
diagnostic (l’examen cytologique, l’examen cytologique, test à l’uréase)
(Cassel-Béraud, 1996).
L'échec de la culture dans ces conditions peut être traduit selon (Lozniewski,
1996 ; Megraud, 1996a; Yousfi et al., 1997) par la sensibilité de la technique
160
Discussion
extrêmement dépendante des conditions de transport, de stockage et de culture
fournies au laboratoire (mode de culture des prélèvement, milieux spéciaux,
atmosphére microaérobie). En effet, la croissance de H. pylori semble limiter par
la température, le contact avec l'oxygène, la dessiccation, le milieu de transport
et le laps de temps avant de traiter les biopsies (Megraud, 1994g, 1996a; Yousfi
et al., 1997). De plus, la distribution irrégulière de la bactérie dans la muqueuse
gastrique peut influencer l'apparition des colonies dans les milieux de culture et
peut donc contribuer à des résultats faussement négatifs (Yousfi et al., 1997).
Pour cela, certains auteurs ont recommandés la réalisation de plusieurs biopsies
à des sites différents de la muqueuse gastrique, améliorant ainsi le rendement de
la culture (Megraud, 1994a; Yousfi et al., 1997).
En outre, la culture permet de tester la sensibilité de H. pylori aux antibiotiques
(de korwin, 2003 ; Megraud, 2007). Effetivement, les résultats obtenus de
l’antibiogramme des souches de H. pylori isolées vis-à-vis des antibiotiques
habituellement utilisé en thérapie ont révélé la sensibilité de la majorité des
souches
aux
antibiotiques
notamment
l’amoxicilline,
la
tétracycline,
la clarithromycine et la résistance au métronidazole a été observée chez la
plupart des souches étudiées. La sensibilité et la résistance de H. pylori à ces
antibiotiques ont été signalées par plusieurs auteurs (Adeyemi et al., 1999;
Cayla, 1996 ; Fellous, 2009 ; Megraud, 1994c ; 2007; Raymond et al., 2010).
L’étude réalisée en Tunisie chez des enfants infectés par H. pylori a montré une
absence de résistance de H. pylori à l’amoxicilline, un taux de résistance moyen
à la clarithromycine et un taux de résistance élevé au métronidazole (Mazigh et
al., 2005). En Algérie, la résistance de H. pylori à la clarithromycine et au
métronidazole a été évaluée de 12% et 37% respectivement (Burucoa, 2009).
De même, l’étude de la sensibilité de 530 souches de H. pylori collectées à Paris
et à Poitiers a révélé une absence totale de résistance à l’amoxicilline et à la
tétracycline, 26% (138 cas) de résistance à la clarithromycine et 61% (324 cas),
de résistance au métronidazole (Raymond et al., 2010).
161
Discussion
Le chercheur Mégraud a également présenté des résultats similaires au cours
d’une étude européenne sur la résistance de H. pylori aux antibiotiques
(Burucoa, 2009).
La résistance au métronidazole et parfois à la clarithromycine pose de nombreux
problèmes à l’inverse de l’amoxicilline et de la tétracycline, ces antibiotiques ne
donnant qu’exceptionnellement des résistances (de Korwin, 2003).
Cette résistance aux antibiotiques généralement recommandés en thérapie
constitue le principal facteur d’échec des traitement d’éradication, elle doit donc
inciter les gastrologues à ne traiter les malades infectés par H. pylori qu’en
fonction des résultats de test de sensibilité classique (antibiogramme) ou
moléculaire (PCR) et ceci pour un traitement d’éradication efficace de
l’Helicobacter pylori (Burucoa, 2009 ; Fellous, 2009 ; Raymon et al., 2010).
C’est dans le même contexte que s’est développé la recherche de H. pylori par
la PCR en temps réel. Cette technique moléculaire est une innovation dans
le diagnostic de H. pylori car elle permet non seulement une détection rapide et
précise de H. pylori mais également la détection d’éventuelles mutations de
résistance à la clarithromycine (Megraud, 2007).
Effectivement, l’application de cette technique nous a permis d’une part de
confirmer l’identité des souches de H. pylori isolées par la culture et montrer
d’autre part son appartenance à des souches sauvages (Hp sauvage) sans aucune
mutation de résistance à la clarithromycine conformément au résultat de
l’antibiogramme qui ont montré la sensibilité des souches isolée à
la clarithromycine.
Par ailleurs, cette technique a détecté la présence de H. pylori à partir de
biopsies gastriques ayant montré une absence de H. pylori par la culture.
Cette discordance entre les résultats a également été signalée par Tankovic et
al. (2007) entre les deux Techiques utilisés l’histologie et la PCR en temps
réel. Ces auteurs ont mis en lumière l’intérêt d’utiliser en routine la PCR en
temps réel qui permet de tester facilement la sensibilité à la clarithromycine ou
162
Discussion
ils ont trouvé une prévalence très élevé à la résistance à la clarithromycine
(30%).
De même, l’application de la technique PCR en temps réel par une équipe
espagnole sur 63 biopsies d’enfants, a permis une meilleure détection
de
la présence de H. pylori et des mutations qui lui confère la résistance à
la clarithromycine (Burucoa, 2009).
Le test moléculaire PCR en temps réel rend désormais accessible
une détermination rapide et facile de la sensibilité à H. pylori aux antibiotiques.
Il représente une alternative fiable de l’antibiogramme (Buruora, 2009).
Toutefois, l’amplification génique en temps réel n'est pas utilisée en pratique
courante pour l'instant en raison de son coût et de sa complexité, mais elle sera
sans aucun doute la méthode diagnostic du futur (Megraud, 2007 ; Buruora,
2009).
Les discordances constatées, au cours de notre étude entre les résultats des
méthodes de recherches utilisées ont également été observées par Lage et
al. (1995); Cassel-Béraud (1996) ; Cellini et al. (1996); Tonkovic et al. (2007).
Ceci peut être expliqué par l'existence des faux négatifs (absence de
visualisation du germe alors que l'infection est présente), car les méthodes
applicables sur des prélèvements biopsiques sont toutes soumises à l'erreur de
l'échantillonnage du fait de la répartition inégale de H.pylori dans la muqueuse
gastrique (Megraud, 1996c; Altman et al., 1995; Yousfi et al., 1997). Pour cette
raison, il est recommandé de faire plusieurs biopsies à des sites différents de
la muqueuse gastrique (Megraud, 1996c; Yousfi et al., 1997). Certains auteurs
ont proposé de faire un brossage plutôt qu’une biopsie afin d’étudier une plus
grande surface gastrique (Megraud, 1994a). La sensibilité de la technique
utilisée comme celle de la culture peut également fausser les résultats (exliqué
précédemment). De plus, il peut exister des faux positifs (la positivité du test
alors que l'infection est absente) due probablement à une contamination
extérieure.
163
Discussion
La
deuxième
partie
de
ce
présent
travail
concerne
l’isolement
et
la caractérisation des lactobacilles à partir du lait cru de chèvre collecté.
Le lait cru constitue une source intéressante des souches de bactéries lactiques,
dotées de potentialités fermentaire intéressant les industries alimentaires et
pharmaceutiques. Les lactobacilles représentent une part importante dans ce
groupe lactique (Poisson, 2000; Saidi, 2002).
L’isolement de bactéries lactiques essentiellement les lactobacilles du lait cru de
vache, de chèvre et de brebis collectés dans la région de l’Ouest algérien a fait
l’objet de plusieurs travaux de recherche (Cheriguene, 2008; Cheriguene et
al., 2006; 2007 ; Chograni, 2008 ; Kacem et al., 2002, Saidi, 2002, 2007).
A travers cette étude, nous nous sommes intéressés à isoler des lactobacilles du
lait de chèvre. Il est donc important de développer des conditions adéquates qui
permettront d’isoler les lactobacilles. Il s’agit de bactéries exigeantes sur le plan
nutritionnelle et métabolique, leur isolement nécessite des milieux de culture
spécifiques et une atmosphère anaérobie (Deguchi et al., 1992).
En pratique, les techniques d’identification des lactobacilles basées sur
les caractères phénotypiques restent d’une grande utilité (Badis et al., 2005 ;
Khedid et al., 2006). Les résultats obtenus de l’identification des souches de
lactobacilles, basé sur les analyses morphologiques, biochimiques et
physiologiques nous ont permis de caractériser 42 souches de lactobacilles
isolées du lait de chèvre. Ces isolats ont été identifiés au stade du genre et
espèces conformément aux méthodes décrites par (Kandler et Weiss, 1986;
Sharpe, 1979). En outre, cette identification a révélé la présence d’une diversité
en espèces dans le genre de lactobacilles répartie essentiellement entre
Lactobacillus delbrueckii (sp. bulgaricus et sp. lactis ); Lactobacillus
helveticus; Lactobacillus salivarius ; Lactobacillus plantarum ; Lactobacillus
casei (sp. casei et sp. rahmnosus) ; Lactobacillus rhamnosus ; Lactobacillus
paracasei ; Lb. pentosus ; Lactobacillus brevis et Lactobacillus fermentum.
164
Discussion
Ces espèces sont fréquemment isolées des animaux tels que les bovins, les ovins
et les caprins. L’environnement et le climat où vivent ces animaux peuvent jouer
un très grand rôle dans cette diversité (Badis et al., 2005 ; Cheriguene, 2008 ;
Cheriguene et al., 2007; Picque et al., 1992).
Plusieurs auteurs décrivent l’isolement et la caractérisation des lactobacilles à
partir du lait cru et des produits laitiers. En effet, Cheriguene et al. (2007) ont
révélé la présence de lactobacilles (29,40%) parmi 153 souches de bactéries
lactiques isolées du lait de chèvre algérien, renfermant des espèces variés telles
que Lb.
delbrueckii sp. bulgaricus, Lb helveticus, Lb. salivarius, Lb.
rhamnosus, Lb paracasei, Lb plantarum, Lb pentosus, Lb. fermentum et Lb
brevis, espèces rencontrées également dans notre présente étude.
Les mêmes chercheurs (2006) ont pu caractériser 28 souches de lactobacilles
parmi 120 bactéries lactiques isolées du lait cru de chèvre collecté dans l’ouest
algérien, et montrer également une diversité en espèces des lactobacilles.
En outre, Badis et al., (2005) ont montré une variétés d’espèces appartenant au
genre Lactobacillus , isolées du lait cru de chèvre de deux population caprines
algériennes . Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus dans notre
recherche.
D’autre part, des études menées ont montré que les espèces que nous avons
identifiées sont fréquemment isolées du lait cru de vache (Bekhouche et
Boulahraf, 2005), du lait cru de brebis (Chograni, 2008) et du lait cru de
chamelle (Khedid et al., 2006). Ces espèces sont adapté à croitre dans le lait et
les produits laitiers et elles sont généralement importantes dans la production du
lait fermenté et du fromage (Khedid et al., 2006; Kandler and Weiss, 1986).
D’autre part, nous avons noté une présence majoritaire des lactobacilles
mésophiles homofermentaires avec un taux de 45,23% dans les échantillons du
lait traité, Cette constatation a également été faite par Cheriguen et al. (2007)
dans le lait de chèvre étudié. Ceci pourrait être expliqué
par le faite que
les animaux à partir desquelles ces bactéries ont été isolées sont plus adaptées au
165
Discussion
condition climatique de ces
régions (Khedid et al., 2006 ; Cheriguen et
al., 2007 ; Cheriguene, 2008).
Toutefois, la présence de lactobacilles hétérofermentaire obligatoire représenté
par Lb. brevis et Lb. fermentum dans le lait de chèvre est faible avec un taux de
14,28%. Tornadijo et al., (1995) ont reporté des résultats similaires dans le lait
de chèvre. De même, cette faible présence de ces lactobacilles a été constaté par
Khedid et al., (2006) dans le lait de chamelle collecté au Maroc.
En résumé, Les résultats obtenus lors de cette étude montrent que la majorité des
espèces des lactobacilles isolées sont présentes dans le lait cru de chèvre bien
qu’il pourrait exister des différences au niveau quantitatif et qualitatif, très
probablement en relation avec la différence de la composition physicochimiques du lait traité (Jenness, 1982 ; Remeuf et al., 1991 ; Badis et al.,
2005).
Les bactéries lactiques essentiellement les lactobacilles sont connues pour leur
rôles bénéfiques pour la santé humaine en raison de leur propriétés antagonistes
contre les bactéries pathogènes y compris l’Helicobacter pylori.
L’effet antagoniste constitue une des propriétés majeures des microorganismes
probiotiques (Bouzaine, 2004). Les lactobacilles sont donc capables de produire
lors de leur croissance des substances antimicrobiennes, pouvant ainsi inhiber
le développement des bactéries nuisibles (Piard et Desmazeaud, 1992 ;
Daeschel, 1993). La production d’acide lactique est le caractère le plus exploité
dans ce domaine, mais d’autres produits de métabolisme tels que le peroxyde
d’hydrogène sont également des agents antimicrobiens. Certaines bactéries
lactiques sont par ailleurs susceptibles de synthétiser des substances de natures
protéiques appelées bactériocine (Tagg et al., 1976 ; Dortu et Thonart, 2009
Castro et al., 2010).
Récemment, il est rapporté que les lactobacilles peuvent inhiber la croissance de
H. pylori in vitro et in vivo. Dans cette optique, Nous avons testé in vitro
le pouvoir antimicrobien des souches de lactobacilles isolées du lait de chèvre
166
Discussion
vis-à-vis des souches pathogènes de H. pylori isolées des biopsies gastriques en
utilisant la méthode de la diffusion sur gélose.
En effet, sur la base des résultats obtenus, nous avons remarqué que la majorité
des 42 isolats de lactobacilles ainsi que la souche de référence présentent
une activité antagoniste vis-à-vis des souches pathogènes cliniques de H. pylori,
(H. pylori 1, H. pylori 2, H. pylori 3) et des souches de références HP4 et HP5.
Ceci est expliqué par l’apparition de zones d’inhibition plus ou moins
importante sur le milieu MRS solide. Cependant, le comportement des
lactobacilles testés vis-à-vis de H. pylori varie en fonction des souches.
Des résultats similaires obtenus par Allem et al. (2007) au cours d’une étude
portant sur l’effet antibactérien des souches lactiques sur H. pylori in vitro, ont
montré qu’il existe parfois des différences dans l’activité inhibitrice des souches
lactiques de la même espèce vis-à-vis de H. pylori, ceci peut être du à une faible
homologie de leur acide nucléique.
De même, Ryan et al. (2008) ont montré que parmi 28 souches de Lb. salivarius
testés vis-à-vis de H. pylori, 9 souches seulement ont exprimé leur pouvoir
inhibiteur. D’autre part, les mêmes auteurs ont testé l’activité antibactérienne de
la souche probiotique Lb. salivarius UCC119 contre 6 souches cliniques de
H. pylori et montré que UCC119 capable d’inhiber la croissance toutes
les souches de H. pylori testées (6/6 H. pylori), mais le degré de cette inhibition
varie d’une souche à l’autre.
Bhatia et al. (1989) ont été les premiers à observer l’effet antagoniste des
souches de Lactobacillus contre H. pylori. Depuis, plusieurs études ont été
menées sur le pouvoir inhibiteur des souches de Lactobacillus face aux H. pylori
c’est le cas de Lb. acidophilus (Lorca et al, 2001.), Lb. salivarius (Ryan et al.,
2008); Lb. plantarum (Rokka et al., 2006), Lb. casei (Sgouras et al., 2004.);
Lb. rhamnosus GG (Goldin et al., 1992) et Lb. gasseri (Armuzzi et al., 2001).
Les lactobacilles sont largement utilisés dans la fabrication des produits
fermentés et sont présents en grande quantité dans la flore normale
167
Discussion
gastro-intestinale humaine et animale (Tsai et al., 2004). Ils sont connus, depuis
longtemps pour leurs rôles probiotiques sur la santé humaine et animale parmi
lesquels l’interaction avec le microbiote (flore intestinale) et notamment
l’inhibition de nombreux pathogènes Gram positif et Gram négatif. H. pylori fait
parti de ce groupe de bactéries (Fuller, 1991 ; Sgouras, 2004).
Sgouras et al. (2004) ont montré, in vitro l’effet inhibiteur de la souche
probiotique Lb. casei Shirota, isolée du lait fermenté Yakult (Japan) sur
la souche H. pylori SS1 (Sydney Strain1) et neuf autres souches cliniques de
H. pylori où les diamétres d’inhibition varient de 12,7 à 15,7 mm .
De même, Midolo et al. (1995) ont trouvé 6 souches de Lb. acidophilus ayant
une activité inhibitrice vis-à-vis de H. pylori.
Plusieurs études ont montré l’effet inhibiteur de certaines souches lactiques sur
H. pylori. En effet, des inhibitions ont été constatées par la méthode de diffusion
sur gélose avec les souches de Streptococcus thermophilus, Lb. bulgaricus et Lb.
acidophilus et Bifidobacterium longum ou les diamètres de zone d’inhibition
varie entre 5 mm et 14 mm (Allem et al., 2007).
En outre, l’étude de l’activité antibactérienne de 17 souches de Lactobacillus
appartenant aux différentes espèces contre 10 souches de H. pylori a montré la
capacité de toutes les souches lactiques à inhiber la croissance de H. pylori in
vitro. Rokka et al. (2006) ont également montré in vitro le pouvoir
anti-Helicobacter des souches de Lb. plantarum testées.
Le pouvoir inhibiteur, exercés par les lactobacilles reflète la capacité de ses
souches lactiques de produire des substances antimicrobiennes inhibant la
croissance du pathogène H. pylori. L’effet inhibiteur des lactobacilles pourrait
être principalement dû à deux facteurs. Le premier est la production des acides
organiques essentiellement l’acide lactique, qui est le caractère le plus exploité
dans ce domaine, alors que le deuxième facteur est la production de substance
protéique inhibitrice appelée bactériocine (Larsen et al. 1993; Anderssen et
al., 1998; Avila et al., 2005). De plus, d’autres facteurs tels que la production
168
Discussion
de peroxyde d’hydrogène et les phages pourraient également être responsables
de cette inhibition.
Afin de déterminer la nature de l'agent inhibiteur, nous avons sélectionné
les souches fortement inhibitrices (ayant une zone d’inhibition élevée) parmi
les 43 lactobacilles étudiés, et testé leur pouvoir acidifiant. Ce n’est qu’à partir
des résultats obtenus de la mise en évidence des inhibitions, que nous avons
pu sélectionner les souches inhibitrices. Le choix et la sélection de 14 souches
de lactobacilles a donc été répartit comme suit : Lb. delbrueckii sp.
bulgaricus (LBDB1, LBDB3, LBDB5), Lb. plantarum (LBP1, LBP3),
Lb.rhamnosus (LBR1, LBR2), Lb brevis (LBB1), Lb. helveticus (LBH1, LBH2),
Lb salivarius (LBS1, LBS2), Lb casei sp. casei (LBCC1), Lb casei sp.
rhamnosus (LBCR1). Ce choix est basé sur les travaux de Hosono et al. (1977)
qui établit que le tri doit se faire à partir des souches qui présentent le plus
grand effet inhibiteur. D’autre part, la souche de H. pylori2 (HP2) s’est révélé
la souche la plus sensible au pouvoir inhibiteur des lactobacilles, raison pour
laquelle HP2 est choisie comme souche indicatrice.
Le pouvoir acidifiant des souches sélectionnées de lactobacilles est évalué par
la mesure du degré Dornic, qui correspond à la quantité d’acide lactique
produite.
En effet, Les résultats obtenus ont révélé que la majorité des 14 souches de
lactobacilles ont un pouvoir acidifiant important, mais qui varie selon les
espèces et parfois au sein de la même espèce. Le taux d’acidité est légèrement
variable d’une souche à l’autre appartenant à la même espèce. Nos résultats
concordent avec ceux obtenus par Accolas et al. (1980), Cheriguene (2008) et
(Chograni, 2008). Durlu-Ozkaya et al. (2001) ont également montré que
les souches de Lactobacillus diffèrent dans leur capacité à réduire le pH initial
du lait. Il existe une relation étroite entre le pH et le degré Dornic, le pH diminue
169
Discussion
au fur et à mesure que la quantité d’acide lactique augmente, ce qui a été
constaté dans nos résultats.
En revanche, la souche Lb. rhamnosus1 (LBR1) a montré une activité
acidifiante plus élevée, par rapport aux autres espèces de Lactobacillus testées.
Cette constatation a également été signalée par Cheriguene (2008) montrant
ainsi que la souche Lactobacillus rhamnosus 9S3, est parmi les lactobacilles isolée
du lait de chèvre ayant un taux d’acidité le plus élevé. En outre, les résultats obtenus
par Bouzaine (2004) ont montré que les souches appartenant à l’espèce Lb. rhamnosus,
isolées de la microflore intestinale de poulet représentent les souches les plus
acidifiantes produisant une quantité d’acide lactique qui atteint 19g/100 ml.
Ceci nous a mené à penser que le pouvoir acidifiant important exprimé par Lb.
rhamnosus1 (LBR1) pourrait être
corrélé à son pouvoir inhibiteur élevé
vis-à-vis de H. pylori.
Les lactobacilles ont généralement un pouvoir d’acidification important
comparativement aux autres genres lactiques tels que les lactocoques (Ayad et
al., 2004; Cogan et al., 1997; Cheriguene, 2008). Cette activité constitue d’une
part un
critère technologique essentiel pour la coagulation du lait et donc
la fabrication des produits laitier et d’autre part provoque l’inhibition de
la croissance des germes indésirables.
Dans ce contexte, nous avons déterminé la nature de l’effet inhibiteur des
souches de lactobacilles sélectionné vis-à-vis du pathogène H. pylori. Or, nous
avons remarqué que l’effet antagonique est du dans la majorité des cas à l’acide
lactique produit, facteur responsable de l’inhibition de H. pylori.
En effet, le pouvoir inhibiteur de la plupart des souches de Lactobacillus. sp
testés contre la souche H. pylori a disparu après la neutralisation des surnageants
obtenus des cultures des lactobacilles, ceci a été démontré par la levée totale des
zones d’inhibition, indiquant ainsi l’effet de l’acide produit par cette bactérie.
Cependant, la souche Lb. brevis (LBB1) a montré une diminution de la zone
d’inhibition comparativement au surnageant non traité (témoin). Ceci indique
170
Discussion
qu’un autre facteur autre que l’acide lactique pourrait être impliqué dans cette
inhibition.
Les
bactéries
lactiques
ont
un
métabolisme
fermentaire,
principale
caractéristique commune qui sont capables, en métabolisant le lactose de
produire des quantités importantes d’acide lactique, abaissant ainsi le pH et
créant un environnement défavorable au développement des bactéries
pathogènes.
La capacité de produire de l’acide lactique par les bactéries lactiques qui agirait
comme inhibiteur et empêcherait la croissance d’autres bactéries indésirables a
été mis en évidence par plusieurs auteurs (Budde et al., 2003; Cabo et al., 2002).
De même plusieurs travaux ont lié cet effet inhibiteur des bactéries lactiques
vis-à-vis de H. pylori à la production d'acide lactique (Allem et al, 2001, Lorca
et al., 2001; Kabir et al., 1997., Tabak et al., 2007). Ces résultats sont en accord
avec ceux obtenus dans notre étude.
Par ailleurs, d’autres mécanismes d’antagonisme, telles que la production de
bactériocines et le peroxyde d’hydrogène pourrait être impliqué dans l’inhibition
de H. pylori (Vandenbergh, 1993; Coconnier et al., 1998; Hamilton-Miller,
2003). En effet, l’addition de la catalase au surnageant bactérien n’élimine pas
l’inhibition exercée par les lactobacilles. Le peroxyde d’hydrogène n’est donc
pas responsable de l’antagonisme. D’après des auteurs, le peroxyde d’hydrogène
est partiellement responsable de l’antagonisme (Saidi, 2002). En plus, il est
probable que la possession de la catalase chez H. pylori, élimine l’effet de
peroxyde d’hydrogène produit (Allem et al., 2007).
D’autre part, l’effet inhibiteur des lactobacilles n’est pas du à la présence de
bactériophages. Par ailleurs, certains lactobacilles produisent une substance
antimicrobienne de nature protéique appelée bactériocine. il est donc probable
que l’activité antimicrobienne soit une conséquence de la production de
bactériocines (Jack et al., 1995; Piard et Desmazeaud, 1992). La sensibilité aux
171
Discussion
enzymes protéolytiques est un critère principal dans leur caractérisation
(Barefoot et Klaenhammer, 1983; Mehta et al., 1984; Klaenhammer, 1988).
Dans notre cas, l’action des enzymes protéolytique sur les surnageants
bactériens de 13 lactobacilles testés (LBDB1, LBDB3, LBDB5, LBR1, LBR2,
LBH1, LBH2, LBS1, LBS2, LBP1, LBP3, LBCR1, LBCC1) ne lève pas
l’inhibition mais au contraire elle persiste. Ce résultat montre d’une part que
la substance antimicrobienne n’est pas de nature protéique, donc il ne s’agit pas
de bactériocine, d’autre part il confirme que l’acide lactique est le seul facteur
responsable de l’inhibition de H. pylori.
Cependant, chez la souche Lb. brevis (LBB1), l’inhibition est partiellement
levée après le traitement de surnageant bactérien par la pepsine, alors qu’elle
persiste en présence de trypsine et alpha-chymotrypsine.
Puisque les bactériocines sont sensible à au moins à une protéase, il y a une
probabilité pour que l’agent inhibiteur soit de nature protéique, c'est-à-dire une
bactériocine. La substance antibactérienne contenu dans le surnageant de
la souche LBB1 est sensible à la pepsine mais l’inactivation n’est pas totale et
résistante aux deux autres enzymes protéolytiques testées (trypsine et
chymotrypsine). En outre, le deuxième critère qui caractérise généralement
les bactériocines est la thermorésistante. Cependant, le traitement thermique de
surnageant de la souche LBB a révélé la sensibilité de la substance contenu dans
le surnageant entrainant ainsi la perte de l’activité antimicrobienne.
Les bactériocines produites par l’espèce Lb. brevis sont généralement connu
pour leur sensibilité à la majorité des enzymes protéolytiques et leur résistance
au traitement thermique et présente un spectre d’activité centré sur les espèces
phylogénetiquement proche du microorganisme producteur. C’est le cas par
exemple de la brévicine 9296, qui est inactivée par toutes les enzymes
protéolytiques, elle est thermostable et son spectre d’activité est limité sur
les bactéries Gram positive y compris Listeria monocytogenes, par contre
les germes Gram négatif ne sont pas affecté par cette substance inhibitrice.
172
Discussion
Les caractéristiques de la bactériocine produite par Lb. brevis ne correspondent
pas à celles de la substance produite par la souche LBB1. Ceci nous permettra
de conclure qu’il ne s’agit pas de bactériocine. Il est donc possible que
la structure chimique de cette substance pourrait être probablement complexe,
contenant en plus du groupement protéique des
entités de nature
polysaccharidique ou lipidique ou, ou autre structure. Cette substance est
produite au cours de la fermentation par Lb. brevis, bactérie hetérofermentaire.
D’après Tagg et al., (1976), le spectre d'activité des bactériocines des bactéries à
Gram+, bien qu'il puisse être variable suivant les souches, ne touche pas
les bactéries à Gram-. La résistance des bactéries Gram- est attribuée
à
la barrière que représenterait leur membrane externe (Kalchayanand et al., 1992;
Dortu et Thonart, 2009). Dans le cas où la membrane externe est rendue
perméable, soit par un traitement physique (Kalchayanand et al., 1992), soit par
un traitement chimique (Stevens et al., 1992), les bactéries Gram négatives
deviennent sensibles aux bactériocines. Cette incapacité des bactériocines
d'inhiber
les bactéries à Gram négatives a déjà été rapportée
(Broadbent et al., 1989; Chung et al., 1989). D’après Castro et al., (2010),
Coventry et al., (1997) et Noonpakdee et al., (2003), les bactériocines sont
surtout active sur
les pathogènes Gram positif alors qu’ils ne sont
pas efficaces contre les bactéries Gram négatives.
H. pylori fait partie des bactéries à Gram négatif raison pour laquelle il n’est pas
affecté par les bactériocines. Ceci a été démontré par plusieurs études montrant
que les bactériocines produites par Lb. plantarum sont active contre plusieurs
bactéries qui lui sont rapproché comme Lactobacillus, Pediococcus,
Leuconostoc, et certains pathogènes tels que Bacillus, Stapphylocoque,
Enterococcus et Listeria, mais elles ne sont actives contre les bactéries Gram
négative comme exemple E. coli et Salmonella. De même, Roka et al., (2006)
ont montré que l’activité anti-Helicobacter de la souche de Lb. plantarum
(MLBPL1) n’est pas due à une bactériocine, mais à une substance active dont
173
Discussion
le poids moléculaire varie entre 3 et 10 KDa. Michetti et al. (1999) qui ont
étudié Lb. acidophilus La1 ont remarqué qu'une autre substance sécrétée non
déterminée, en plus de l'acide lactique a contribué à l'effet inhibiteur observé
chez H. pylori.
D’autre part, une étude réalisé sur l’effet de Lb. salivarius sur H. pylori a révélé
que H. pylori n’est pas sensible aux bactériocine ou bactériocine-like peptides
produites par Lb. salivarius mais à d’autre composé sécrété en petites quantité
(Ryan et al., 2008). Ces résultats rejoignent ceux obtenus dans notre présent.
Sur la base des résultats obtenus, il en ressort que l’inhibition de H. pylori par
les souches de lactobacilles testées sur milieu solide est majoritairement due à
la production de l’acide lactique. Cet effet inhibiteur a également été testé en
milieu liquide sur la souche Lb. rhamnosus1(LBR1), choisie pour son pouvoir
inhibiteur élevé. Effectivement, le surnageant de la souche LBR1 s’est avéré
actif sur H. pylori, ceci s’explique par l’action de la substance inhibitrice
produite par LBR1, contenu dans le surnageant, qui est à l’origine de
la diminution de la viabilité cellulaire de H. pylori. Pour s’assurer que l’agent
inhibiteur soit l’acide lactique, comme il a été démontré en milieu solide,
l’addition de L- acide lactique dans la culture bactérienne de H. pylori a eu
conséquence d’une diminution rapide de la viabilité de H. pylori jusqu'à
l’absence totale de cellules viables. Ceci confirme l’effet inhibiteur de l’acide
lactique, principal composé de surnageant de Lb. rhamnosus. Cette espèce
possède une activité antibactérienne contre des germes pathogènes et non
pathogènes et elle est parmi les souches acidifiantes, produisant une quantité
d’acide lactique de type L (+), qui atteint 19/100ml (Bouzaine, 2004; Narayanan
et al., 20004). Ceci peut expliquer l’effet inhibiteur de Lb. rhamonosus sur
les bactéries pathogènes. Le pouvoir acidifiant important de Lb. rhamnosus
démontré dans notre présente étude pourrait ainsi être lié à l’effet inhibiteur
remarquable de cette souche vis-à-vis de H. pylori.
174
Discussion
Plusieurs études ont attribuées l’activité anti-Helicobacter des lactobacilles à
la production de l’acide lactique (Aiba et al., 1998; Alakomi et al., 2000; Kabir
et al., 1997). En effet, Sgouras et al. (2004) ont montré que le surnageant de la
souche Lb. casei Shirota est capable d’inhiber la viabilité de H. pylori et que
l’acide lactique contenu dans le surnageant est un composé majeur déterminé
par HPLC, et est la cause de cette inhibition. En outre, les mêmes auteurs ont
démontré que l’acide lactique contenu dans le surnageant est capable d’inhiber
l’activité uréasique de H. pylori mais le mécanisme d’inhibition n’est pas encore
clair. Bhatia et al. (1989) ont proposé que l'acide lactique produit sécrété
extracellulairement par Lb. acidophilus soit responsable de l'inhibition de H.
pylori. Des résultats similaires ont rapporté l’inhibition de H. pylori par 17
souches de lactobacilles et montré également que cette inhibition est liée à la
production de l’acide lactique et que 60 mM est suffisante pour inhiber la
croissance de H. pylori (Lorca et al., 2001), ces résultats sont comparables avec
ceux obtenus dans notre présente étude.
De même, Michetti et al. (1999) ont trouvé qu’un surnageant de culture de Lb.
acidophilus est aussi actif que les lactobacilles vivants, un des composé
importants de surnageant est l’acide lactique qui inhibe fortement la croissance
de H. pylori.
Midolo et al. (1995) ont également rapporté l’inhibition de la croissance de H.
pylori par des acides organiques et inorganiques (Acide lactique, acétique et
hydrochlorique) et que l'acide lactique a prouvé la plus grande inhibition. Cette
inhibition est due au pH et la concentration qui sont importants dans l’inhibition
de H. pylori par l’acide lactique in vitro.
En générale, Le degré d’inhibition de H. pylori par le surnageant des
lactobacilles est généralement corrélé à la concentration de L-acide lactique.
Cette concentration de L-acide lactique produit par 12 probiotiques testés
compris les lactobacilles varie de 50 à 156 mmol l-1. (Midolo et al., 1995).
175
Discussion
L'acide lactique est produit en grande quantité au cours du métabolisme des
glucides des lactobacilles inhibe le métabolisme oxydatif et entraine la
diminution du pH intracellulaire, lié aux ions H + important dans l'inhibition de
H. pylori in vitro (Piard et Desmazeaud, 1991).
Par ailleurs, Midolo et al. (1995) ont suggérer qu’il peut exister d’autres
composés extracellulaires produits par ces microorganismes ayant un pouvoir
inhibiteur contre H. pylori. Coconnier et al. (1998) ont montré qu’une substance
thermostable sécrétée par Lb. acidophilus est active contre H. pylori.
Cependant, l’effet de l’acide lactique ou autre agent inhibiteur produit par les
probiotiques dans la muqueuse gastrique reste à élucider.
De plus, il a été démontré que d’autre bactéries probiotiques telles que
Enterococcus faecium (Tsai et al., 2004), Cl. butyricum (Takahashi et al., 2000)
et Bacillus subtilis (Pinchuk, 2001) ont également un pouvoir inhibiteur vis-àvis de H. pylori in vitro et in vivo.
Les souches de lactobacilles testées exercent également une activité antagoniste
contre les bactéries pathogènes et présentent un spectre d’activité large
renfermant les bactéries Gram positive telles que St. aureus et B. subtilis et les
bactéries Gram négative comme E. coli, Klebsiella pneumoninae, Salmonella
enteritidis, Pseudomonas aeruginosa. Ce phénomène a déjà été démontré par de
nombreuses études signalant que les bactéries lactiques en générale, et les
lactobacilles en particulier présentent une activité antagoniste intéressante
(Bouzaine, 2004; Dalache, 2006; Bey, 2009 ; Allouche et al., 2010; Anes et al.,
2010; Hwanhlem et al., 2011; Belarbi, 2011). L’inhibition des bactéries
pathogènes s’explique par la capacité des lactobacilles de produire de substances
antibactériennes, responsable de cet effet antagoniste tel que les acides
organiques, le peroxyde d’hydrogène et les bactériocines (Bareffot et
Klahenmmer, 1983; Vandenbergh, 1993; Dambélé et al., 1998).
Les bactéries pathogènes présentent une grande sensibilité pour l’acide lactique
et le peroxyde d’hydrogène. En effet, L’effet antagoniste des lactobacilles contre
176
Discussion
les bactéries pathogènes est attribué d’après plusieurs auteurs à la production de
H2O2 et les acides organiques (Eschenbach et al., 1989; Brashears et al., 1998 ;
Ouwehand, 1998 ; Brashears et Durre, 1999; Malakar et al., 1999).
D’autre part, cette inhibition est due à la forte acidité produite par les
lactobacilles comme observé par Adams et Nicolaides (1997) ; Byaruhanga et
al. (1999) et Hwanhlem et al. (2011), alors que l’effet inhibiteur par les
bactériocines s’exerce surtout sur les bactéries Gram positive (Castro et al.,
2010; Coventry et al., 1997; Piard et Desmazeaud, 1999; Noonpakdee et
al., 2003). Le pouvoir inhibiteur des lactobacilles vis-à-vis des bactéries
pathogènes constitue une des propriétés importantes des probiotiques.
Les lactobacilles sont connus pour leur grande résistance aux pH acides (jusqu’a
un pH voisin de 3.5). Contrairement aux autres genres bactériens qui sont plus
sensibles (Adams et Hall, 1988; Wong et Chen, 1988). Ils peuvent résister à des
concentrations élevées de l’acide et sont parmi certaines bactéries qui peuvent
adhérer et survivre dans l’estomac humain (Goldin et al., 1992).
Les lactobacilles sont alors considérer comme des probiotiques, non seulement
parce qu’ils ont un effet antagoniste vis-à-vis des bactéries pathogènes, une des
propriétés majeures des microorganismes probiotiques, mais également parce
qu’ils sont résistants au stress causé par les sucs gastrique et biliaire lors de leur
passage dans le tractus gastrointestinal. En outre, les lactobacilles présentent
certaine
propriété
d’adhésion,
qui
en
rentrant
en
compétition
avec
les pathogènes in vivo par la production des composés inhibiteurs, colonisent
la surface de la muqueuse épithéliale, raison pour laquelle leur application
fréquente dans la prévention et le traitement des infections bactériennes
(Tannock, 1999 ; Armuzzi et al., 2001; Lorca et al., 2001 ; Bouzaine, 2004;
Tsai, 2004). Plusieurs études ont montré que l’administration d’un lait fermenté
contenant de lactobacilles (Lb. acidophilus) entraine une diminution du taux de
H. pylori et exerce à long terme un effet partiel sur l’éradication de l’infection
à H. pylori (MRDA et al., 1998 ; Michetti et al., 1999; Sgouras et al., 2004).
177
Discussion
L’activité anti-Helicobacter des souches de lactobacille, utilisées dans
les produits laitiers a été rapporté dans plusieurs études in vitro et les résultats
cliniques sont encourageants in vivo (Hamilton-Miller, 2003).
Par conséquent, les lactobacilles pourraient être exploités et utilisés comme un
potentiel agent adjuvant thérapeutique pour l’éradication de l'infection à
H. pylori après l’échec du traitement par les antibiotiques. La consommation des
probiotiques pourrait donc être une alternative thérapeutique au traitement de
l’infection à H. pylori dans le futur proche.
178
Conclusion
Conclusion
Récemment, l’attention est portée sur l’interaction entre H. pylori et les bactéries
lactiques, particulièrement les lactobacilles, qui sont reconnus pour leur rôle
probiotique en raison de leur innocuité chez l’homme et leur propriété
antagoniste contre les bactéries pathogènes y compris l’Helicobacter pylori.
Le but de ce présent travail est de tester in vitro le pouvoir inhibiteur des
lactobacilles isolés de lait cru de chèvre vis-à-vis de H. pylori isolés des biopsies
gastriques.
La mise en évidence de H. pylori a été effectuée par des méthodes invasives
nécessitant la réalisation des biopsies gastriques humaines, parmi lesquelles,
nous citons le test rapide à l’uréase, l’examen cytologique, l’examen
histologique, la culture et l’amplification génique PCR en temps réel.
Quoique, nous avons parfois remarqué une discordance entre les résultats.
Ceci est éventuellement du à l’erreur de l’échantillonnage ou à la sensibilité de
la technique utilisée.
La culture reste la méthode diagnostic de référence car elle permet d’une part un
isolement de H. pylori et une identification précise et certaine de la bactérie, et
d’autre part l’étude de la sensibilité aux antibiotiques pour un traitement efficace
permettant l’éradication de H. pylori. Cependant, la sensibilité de cette
technique est extrêmement dépendante des conditions de transport des biopsies
et de culture fournis au laboratoire.
La PCR en temps réel est une innovation dans le diagnostic de H. pylori
parce qu'elle permet non seulement une détection rapide et précise de H. pylori
mais également la détection des mutations qui sont associées à la résistance aux
antibiotiques sans demander des conditions strictes de transport. Elle représente
une alternative fiable de l’antibiogramme et reste une méthode d’avenir.
En revanche, l’identification des lactobacilles isolés du lait de chèvre a été faite
sur la base de leurs caractères morphologiques, biochimiques, et physiologiques.
179
Conclusion
Les critères phénotypiques restent encore importants aujourd’hui pour la
classification des lactobacilles.
Les lactobacilles sont connus depuis des décennies pour leur capacité à protéger
l’homme contre les bactéries pathogènes. Ce pouvoir antimicrobien exercé par
les lactobacilles est généralement due à la production des substances
antimicrobiennes telles que les 'acides organiques, le peroxyde d'hydrogène, et
les bactériocines.
Il a été démontré in vitro, que la majorité des Lactobacilles testés ont un pouvoir
antimicrobien vis à vis de la bactérie pathogène H. pylori et que l’agent impliqué
dans cette inhibition est majoritairement du l’acide lactique.
En effet, les lactobacilles peuvent résister à des concentrations élevées de l’acide
et sont parmi peu de bactéries qui peuvent adhérer et survivre dans l’estomac
humain, site généralement hostile aux bactéries et préférentiel aux Helicobacter,
et exercer ainsi leur pouvoir inhibiteur sur H. pylori, raison pour laquelle leur
utilisation comme probiotique est recommandée dans la prévention de
l’infection à H. pylori.
Les lactobacilles pourraient donc être exploité et utilisé comme un agent
adjuvant thérapeutique pour éradiquer l'infection à H. pylori après l’échec du
traitement par les antibiotiques.
180
Perspectives
Perspectives
Les résultats de notre recherche permettent d’ouvrir de nouvelles perspectives
notamment :
-Développement des moyens diagnostiques non invasifs comme le test
respiratoire pour le dépistage de l’infection à H. pylori et le contrôle
de l’éradication de H. pylori après la thérapie.
-Développement de la biologie moléculaire (PCR) qui représente un examen
d’appoint important en infectiologie moderne sans recours à la fibroscopie et
qui permettrait la détection des souches résistantes de H. pylori.
-Identification moléculaire des souches de lactobacilles isolées.
-Mise en évidence de l’acide lactique par chromatographie HPLC.
-Etude du potentiel probiotique des souches de lactobacilles isolées,
particulièrement la souche Lb. rhamnosus.
-Application des essais cliniques par l’administration des lactobacilles à
des sujets infectés par H. pylori.
181
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214
Annexe
Annexe
Milieu MRS (MAN, ROGOSA et SHARPE, 1962)
Peptone
10 g
Extrait de viande
10 g
Extrait de levure
5g
Acétate de sodium
5g
K2HPO4
2g
Citrate d’ammonium 2 g
0,2 g
MgSO4 7H2O
MnSO4, 4H2O
0,05 g
Glucose
20 g
Tween 80
1 ml
Eau distillée
1000 ml
(+15g agar si le milieu gélosé).
pH = 6,2
Solution de Ringer (g/l)
NaCl
2.25 g
CaCl2
0.12 g
KCl
0.105 g
0.5 g
NaCO3
pH= 7
Lait écrémé (Milieu de conservation)
Lait en poudre
12.5 g
Eau distillée
100 ml
Glycérol
15 ml
Répartir dans des tubes a raison de à.10 ml et autoclaver à 121°C pendant 10 min.
Eau physiologique
Chlorure de sodium
9g
Eau distillée
1000 ml
Autoclavage à 120°C pendant 20 mn.
Milieu de Kempler et Mc.Kay (1980)
Extrait de levure
3g
Peptone
10 g
Glucose
5 g
Agar
15 g
Eau distillée
1000 ml
pH = 6,6
215
Annexe
Le milieu est repartit à raison de 100 ml par flacon, puis autoclavé 20 mn à 120° C, au moment
de l’emploi en ajoute :
1 ml d’une solution aqueuse de ferrocyanure de potassium à 10%.
1 ml d’une solution aqueuse à 2,5 % de citrate ferrique et citrate de sodium.
Ces deux solutions stérilisées par filtration sont conservées à l’obscurité à 4° C.
Gélose à l’esculine (g/l) (Guiraud, 1998)
Peptone trypsique de caséine
10
Extrait de levure
5
Acétate de sodium
5
Tween 80
1
Sulfate de manganèse
0.05
Sulfate de magnésium
0.2
Esculine
5g
Citrate de fer ammoniacal
0.5g
Agar 15g
Eau
pH 6.5
Moeller (décarboxylases-bouillon) (Guiraud, 1998)
Peptone
5g
Extrait de viande de bœuf
5g
Pourpre de bromocrésol
0.1g
Rouge de crésol
5mg
Pyridoxal
5mg
Glucose
0.5
pH 6.0
Mettre en suspension 10.5 g de poudre dans 1L d’eau distillée. Ajouter 1 ml à 1% de L-arginine.
Si nécessaire, réajuster le ph après l’addition des acides aminés. Préparer des tubes sans aminoacide qui serviront de contrôle.
1- Milieu Urée-indole : milieu commercialisé, prêt à l’emploi (Marchal et al., 1991).
L-tryptophane
3g
Phosphate monopotassique
1g
Phosphate bipotassique
1g
NaCl
5
Urée
20g
Rouge de phénol à 1%
0.025g
Alcool à 95%
10ml
Eau distillée
1000ml
pH 6,7
Campylobacter microaerophilic system : DIFCO (Marchal et al., 1991).
Ce système est utilisé pour la génération de H2 et CO2 dans une jarre d’anaérobiose standard
Chaque enveloppe de Campy pack contient des comprimés de borohydride de sodium, acide
216
Annexe
tartarique et bicarbonate de sodium, produisant une atmosphère contenant approximativement 5%
d’oxygène et 10% de CO2. Couper l’angle du sachet générateur d’H2 et CO2. Le placer en
position verticale à l’intérieur de la jarre. Introduire 10 ml d’eau dans l’enveloppe. Mettre le
couvercle en place et placer la jarre à l’étuve.
Milieu gélose au sang (gélose chocolat) (Marchal et al., 1991)
Le milieu Columbia de base pour gélose au sang est commercialisé déshydraté ou prêt à l’emploi
(bioMerieux). Il convient à la culture des germes exigeants. Sa formule est la suivante :
Infusion de cœur et de muscle
Bio-Thione
Chlorure de sodium
Grélose
Eau distillée
pH
7.3
375g
10g
5g
15g
1000ml
Mettre le milieu de base à fondre au bain-marie bouillant jusqu’à la liquéfaction complète du
milieu. Refroidir le milieu à 45-50°C. Additionner 10% de sang de cheval ou de mouton
défribriné stérile à la gélose fondue. Après homogénéisation par rotation, les flacons sont portés à
10min au bain-marie à 75-80°C, tout en agitant, jusqu’à l’obtention d’une teinte chocolat. Couler
en boite de Pétri.
Milieu sélectif à base de Wilkins Chalgren (Marchal et al., 1991).
La gélose de Wilkins Chalgren, commercialisée sous forme déshydratée (Oxoid), permet la
croissance de bactéries exigeantes. Sa formule (en g/l) est la suivante :
Tryptone
Peptone de gélatine
Extrait de levure
Glucose
Chlorure de sodium
L-arginine
Pyruvate de sodium
Ménadione
Hémine
Gélose
pH 7.1
10
10
5
1
5
1
1
0.0005
0.0005
10
Mettre en suspension 43g de poudre dans un litre d’eau distillée. Porter à ébullition jusqu’à
dissolution complète puis autoclaver 15min à 120°C, puis additionner les antibiotiques
(10mg/l de Vancomycine, 5mg/l de cefsulodine, 100mg/l de cycloheximide ) et 10% de sang de
cheval ou de mouton stérile ou. Le milieu est homogénéisé avant d’être coulé dans les boites de
Pétri stériles.
217
Annexe
Bouillon cœur-cervelle (BHIB) (Marchal et al., 1991)
Ce milieu est particulièrement adapté à la croissance des germes exigeants. Sa composition (en
g/l) est la suivante :
Infusion de cervelle de veau
12.5
Infusion de cœur de bœuf
5
Peptone trypsique
10
Chlorure de sodium
5
Phosphate disodique
2.5
Glucose
2.0
pH
7.4
cœur-cervelle gélosé (BHI-agar)
Il s’agit du milieu précédent (BHIB) contenant 15 g/l d’agar.
Bouillon Brucella
Tryptone
Peptone pepsique de viande
Extrait de viande
Glucose
Chlorure de sodium
Bisulfite de sodium
pH 7
10
10
2
1
5
0.1
Mueller-Hinton (pour l’antibiogramme) (Marchal et al., 1991).
Extrait de viande
2
Hydrolysat acide de caséine
17,5
Amidon
1.5
Gélose
10
PH 7.4
Bouillon glycérol peptone (conservation de H. pylori)
Glycérol
50 ml
Peptone
2g
NaCl
1g
Eau distillée
150 ml
pH 7.2
218
Annexe
Détection AND 23S Helicobacter pylori par PCR en temps réel
Mélange réactionnel
Eau
MgCl2
HpyA (20µM
HpyS (20 µM)
HpyRED (20µM)
Anchor FL (20µM)
Enzyme
5.28
0.64
0.16
0.16
0.08
0.08
0.80
Volume final
7.2 µl
ADN
0.8 µl
HpyA et HpyS: Amorces 23S
HpyRED et Anchor FL : Sondes fluorescentes
Enzyme : Taq polymérase
ADN : échantillon de l’ADN de H. pylori (test) ou échantillon de l’ADN témoin (positif ou
négatif)
2 témoins positifs : séquence ADN sauvage et séquence d’ADN muté (résistant à la
clarithromycine)
Témoin négatif : absence d’ADN
219