Étude des effets d`un extrait de peptides du lait sur la réponse
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Étude des effets d’un extrait de peptides du lait sur la réponse immune chez la souris saine Mémoire Maëlle Rajaonary Maîtrise en sciences et technologie des aliments Maître ès Sciences (M.Sc.) Québec, Canada © Maëlle Rajaonary, 2014 Résumé Un isolat de protéines de lactosérum commercial hydrolysé enzymatiquement (IPL-H), contenant le peptide β-LG f96-99, a été administré à des souris saines pendant 3, 7 et 14 jours selon 3 doses (0, 10 ou 20 mg) pour évaluer son effet au niveau intestinal. Les taux d’IgA sériques ont augmenté significativement uniquement au jour 14 avec 10 mg. Les taux d’IgA fécales ont augmenté considérablement au jour 3. Ces taux ont triplé avec la dose 20 mg comparé au groupe contrôle. Aucune différence significative n’a été observée aux jours suivants pour les taux IgA fécales, ni pour l’expression du gène TGF-β au jour 3. L’IPLH induirait une réponse rapide et locale via la production d’IgA au niveau intestinal et une réponse lente et faible dans le sérum. Le peptide β-LG f96-99 présent dans cet hydrolysat pourrait être associé aux effets observés. III Table des matières RÉSUMÉ ........................................................................................................................................................... III TABLE DES MATIÈRES .................................................................................................................................... V LISTE DES TABLEAUX ................................................................................................................................... VII LISTE DES FIGURES ....................................................................................................................................... IX LISTE DES ABREVIATIONS ............................................................................................................................ XI REMERCIEMENTS ......................................................................................................................................... XIII AVANT-PROPOS .............................................................................................................................................XV INTRODUCTION ................................................................................................................................................ 1 CHAPITRE I : REVUE DE LITTERATURE ........................................................................................................ 3 1. 2. 3. Structure et fonctions biologiques des protéines du lactosérum ................................................. 5 1.1. β-lactoglobuline ....................................................................................................................... 5 1.2. α-lactalbumine......................................................................................................................... 6 1.3. Glycomacropeptide ................................................................................................................. 7 1.4. Immunoglobulines ................................................................................................................... 8 1.5. Albumine sérique bovine ......................................................................................................... 8 1.6. Lactoferrine ............................................................................................................................. 8 1.7. Lactoperoxydase ..................................................................................................................... 9 Système immunitaire........................................................................................................................ 10 2.1. Immunité innée...................................................................................................................... 10 2.2. Immunité spécifique .............................................................................................................. 11 2.3. Rôle des cytokines dans la réponse immunitaire .................................................................. 15 2.4. Méthodes d’analyses immunologiques ................................................................................. 18 Activités immunomodulantes des peptides issus de l’hydrolyse des protéines du lactosérum .................................................................................................................................................. 22 3.1 Hydrolysats enzymatiques et fractions peptidiques issus des protéines du lactosérum ............ 22 3.2. Peptides issus de la β-lactoglobuline .................................................................................... 26 3.3 Peptides issus de l’α-lactalbumine............................................................................................. 27 HYPOTHESE ET OBJECTIFS ......................................................................................................................... 31 V CHAPITRE II : EFFECT OF A HYDROLYZED WHEY PROTEIN ISOLATE ON THE IMMUNE SYSTEM OF HEALTHY MICE ............................................................................................................................................... 31 RÉSUMÉ .......................................................................................................................................................... 33 ABSTRACT ...................................................................................................................................................... 34 1. Introduction....................................................................................................................................... 35 2. Material and methods ....................................................................................................................... 37 3. 2.1. Materials ............................................................................................................................... 37 2.2. Preparation of WPI hydrolysate ............................................................................................ 37 2.3. Chemical analyses ................................................................................................................ 38 2.4. Mice protocol ......................................................................................................................... 39 2.5. IgA determination in serum and feces ................................................................................... 39 2.6. RNA extraction ...................................................................................................................... 40 2.7. Determination of genes expression ....................................................................................... 40 2.8. Immunohistochemistry .......................................................................................................... 40 2.9. Fluorescence microscope analysis ....................................................................................... 41 2.10. Effect of H-WPI on J774 cells ............................................................................................... 41 2.11. Statistical analyses................................................................................................................ 42 Results and discussion.................................................................................................................... 43 3.1. Composition of the H-WPI..................................................................................................... 43 3.2. Immunomodulatory effects of H-WPI .................................................................................... 46 CONCLUSION .................................................................................................................................................. 55 CONCLUSION GÉNÉRALE ............................................................................................................................. 57 BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................................................................. 59 VI Liste des tableaux Tableau 1 : Teneur en protéines et peptides du lactosérum bovin. ....................................................... 5 VII Liste des figures CHAPITRE I : Revue de littérature Figure 1 : Structure 3D d’un monomère du variant A de la β-lactoglobuline ...................................... 6 Figure 2 : Structure 3D de l’α-lactalbumine........................................................................................ 7 Figure 3 : La réponse immunitaire innée. ......................................................................................... 11 Figure 4 : La réponse immunitaire acquise....................................................................................... 12 Figure 5 : Différenciation des cellules T. .......................................................................................... 16 Figure 6 : Action des cytokines dans la différenciation et la conversion des Th ............................... 17 Figure 7 : Principe du test sandwich ELISA ..................................................................................... 18 Figure 8 : Principe de l'immunofluorescence directe........................................................................ 20 CHAPITRE II : Effect of a hydrolyzed whey protein isolate on the immune system of healthy mice Figure 1: SDS-PAGE profiles (Tris-Tricine gel)................................................................................ 44 Figure 2: Reversed phase-high performance liquid chromatography (RP-HPLC) profile of hydrolyzed-whey protein isolate (H-WPI).......................................................................... 45 Figure 3: IgA levels in serum and feces of mice after the gavage during 3, 7 and 14 days with PBS or two doses of the hydrolyzed-whey protein isolate (10, 20 mg) ..................................... 48 Figure 4: Genes expression of TGF-β, AID, TSLP and BAFF as determined by RT-qPCR on mice Peyer’s patches RNA after gavage during 3 days with PBS or two doses of the hydrolyzed-whey protein isolate (10, 20 mg). ................................................................... 50 IX Liste des abréviations Ac : anticorps ACE : angiotensin converting enzyme ADNc : ADN complémentaire Ag : antigène AID : activation-induced cytidine deaminase ARNm : ARN messagers BAFF : facteur d’activation des cellules B BSA : bovine serum albumin (albumine sérique bovine) CMH : complexe majeur d’histocompatibilité ConA : concanavaline A CPA : cellules présentatrices de l’antigène CPL : concentré de protéines de lactosérum CSR : class-switch recombination (ou commutation de classe) CTL : LT cytotoxique E.coli : Escherichia coli ELISA : enzyme-Linked Immunosorbent Assay EU : endotoxin units GMP : glycomacropeptide HMS : hypermutation somatique H-WPI : hydrolyzed whey protein isolate Ig : immunoglobuline IL : interleukine IPL : isolat de protéines de lactosérum IPL-H : isolat de protéines de lactosérum hydrolysé kDa : kilo daltons LAL : limilus amebocyte lysate LB : lymphocytes B LC-MS : liquid chromatography–mass spectrometry LF : lactoferrine LP : lactoperoxydase LPS : lipopolysaccharides LT : lymphocytes T XI NK : natural killer PAMPs : pathogen-associated molecular patterns PBS : phosphate-buffered saline PRR : pattern recognition receptor qPCR : polymerase chain reaction (PCR) quantitative en temps réel RP-HPLC : reverse-phase high-performance liquid chromatography SDS-PAGE : sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis sIgA : IgA sécrétoires TGF-β : transforming growth factor beta (facteur de croissance de transformation β) Th : T helper (ou auxiliaire) Treg : T régulateur TSLP : lymphopoïétine stromale thymique UF : ultrafiltration WP : whey proteins WPI : whey protein isolate α-LA : α-lactalbumine β-LG : beta-lactoglobuline XII Remerciements La réalisation de ce mémoire n’aurait pas été possible sans la contribution de plusieurs personnes à qui je souhaite adresser ma reconnaissance. Je tiens tout d’abord à remercier la Dre Sylvie Gauthier, ma directrice de recherche, pour m’avoir confié ce projet et m’avoir soutenue à travers toutes les étapes de ce mémoire. Sa patience, sa rigueur et sa disponibilité m’ont guidé pendant ces deux dernières années. Je souhaite exprimer toute ma gratitude envers le Dr Yvan Boutin, mon codirecteur de recherche, pour son encadrement, sa confiance et ses conseils éclairés. Je remercie le Dr Jean-Christophe Vuillemard pour avoir accepté d’effectuer la pré-lecture de ce mémoire. Je tiens à remercier tout particulièrement Diane Gagnon, pour son incroyable dévotion accordée à son travail et pour m’avoir accompagnée tout au long de mes expériences et ce, malgré les nombreuses difficultés rencontrées. Je remercie tous mes collègues de laboratoire, notamment Fred, Nassim et Gabriel, ainsi que toute l’équipe du secteur biologie de chez TransBioTech, en particulier Marie-Josée et Elodie, pour leur générosité et leur support moral et intellectuel tout au long de ma démarche. Merci à Vincent Tellier, pour avoir réalisé les essais animaliers. Je n'oublie pas ma famille pour m’avoir soutenue tout au long de mes études, avoir cru en moi et m’avoir donné la chance de partir à l’étranger. Mes remerciements s’adressent également à Nolwenn, Dinh, Raphaël et Aubéri pour leur amitié et soutien inestimable. Enfin, ce projet n’aurait pas pu avoir lieu sans le soutien financier du Conseil de Recherches en Sciences naturelles et en Génie du Canada (CRSNG). XIII Avant-propos Ce mémoire porte sur l’étude de l’effet de l’ingestion orale d’un hydrolysat de protéines de lactosérum sur le système immunitaire chez la souris saine. Une introduction générale vient présenter le contexte du projet de recherche. Le mémoire est ensuite divisé en deux chapitres. Le premier chapitre est une revue de littérature abordant les caractéristiques du lactosérum et ses composés, notamment la β-lactoglobuline. Elle présente également les notions d’immunologie nécessaires à la compréhension du projet. Elle résume ensuite les travaux de la littérature portant sur les effets immunomodulateurs des protéines et peptides du lactosérum ainsi que leurs hydrolysats. Elle est suivie de l’hypothèse et des objectifs de recherche. Le second chapitre est écrit en anglais et présenté sous la forme d’un article scientifique. Il décrit les effets d’un hydrolysat de protéines de lactosérum au niveau intestinal dans un modèle murin in vivo. Il décrit les protocoles expérimentaux ainsi que les résultats obtenus et leur interprétation. Les données expérimentales ont été obtenues par l’auteur, assistée par des professionnels de recherche. L’interprétation des résultats et la rédaction du mémoire ont également été réalisées par l’auteur avec l’aide de la Dre Sylvie Gauthier, directrice du projet et coauteur de l’article ainsi que du Dr Yvan Boutin, codirecteur et coauteur de l’article. Ce chapitre est suivi d’une conclusion générale présentant les perspectives de recherche possibles à la suite de ces travaux. Le mémoire se termine par une bibliographie listant l’ensemble des références citées. XV Introduction Le lait est un aliment reconnu pour sa richesse en protéines, lipides et lactose ainsi qu’en nutriments comme le calcium, phosphore et certaines vitamines. Ses propriétés nutritives sont d’autant plus intéressantes que le lait contient des composés bioactifs ayant des effets sur la santé. C’est en effet l’unique aliment nécessaire pour répondre aux besoins du nouveau-né. Il permet de soutenir sa croissance rapide et contient des composés stimulant le développement de son système immunitaire pour répondre aux diverses agressions de l’environnement ainsi que des composés anti-inflammatoires (Blewett et al., 2008). Depuis une dizaine d’années, les consommateurs prennent de plus en plus conscience du rôle que l’alimentation peut jouer sur leur bien-être et leur santé. L’intérêt pour les nutraceutiques et les aliments fonctionnels est grandissant. De ce fait, de nombreuses recherches sont effectuées pour mieux comprendre les bienfaits des composantes alimentaires sur la santé humaine. C’est pourquoi plusieurs études ont été réalisées sur le lait et ses protéines. En outre, les protéines du lactosérum sont reconnues non seulement pour leur excellente qualité nutritionnelle et leur bonne digestibilité (de Wit, 1998), mais aussi pour les effets physiologiques variés qu’elles initient dans l’organisme suivant leur ingestion. De plus, certains peptides contenus dans la séquence primaire de ces protéines ont été associés à diverses activités biologiques : opioïde, antihypertensive, antithrombotique, antimicrobienne, antivirale, antioxydante, insulinotropique et immunomodulatrice (Madureira et al., 2010). Les effets des protéines de lactosérum, de leurs hydrolysats enzymatiques ou de peptides issus de ces protéines sur la modulation du système immunitaire ont été mis en évidence dans de nombreux travaux (Miyauchi et al., 1997 ; Wong et al., 1998 ; Mahmud et al., 2004 ; Mercier et al., 2004 ; Prioux et al., 2004 ; Biziulevicius et al., 2006 ; Saint-Sauveur et al., 2008, 2009a ; Saint-Sauveur, 2009b ; Jacquot et al., 2010 ; Hébert-Leclerc, 2011). Par exemple, Saint-Sauveur et al. (2008) ont démontré que certaines fractions peptidiques, isolées par focalisation isoélectrique d’un hydrolysat enzymatique d’isolat de protéines de lactosérum (IPL), stimulaient la prolifération de splénocytes murins de même que la sécrétion de cytokines de type Th1. D’autres travaux ont démontré que ces fractions peptidiques permettaient d’accroître les niveaux d’IgA dans le sérum sanguin chez des souris infectées ou non par Escherichia coli O157:H7 (SaintSauveur et al., 2009a). Les peptides potentiellement responsables des effets observés ont été identifiés et caractérisés par spectrométrie de masse, mettant en évidence différents modes d’actions (Saint-Sauveur, 2009b). En outre, les fragments β-LG f9-14 et β-LG f96-99 stimulent la sécrétion de cytokines antiinflammatoires (réponse de type Th2) tandis que le peptide β-LG f146-148 favoriserait la sécrétion de 1 cytokines pro-inflammatoires (réponse de type Th1) (Saint-Sauveur, 2009b). Enfin, une étude in vivo chez des souris saines a montré que l’ingestion orale du peptide β-LG f96-99 sous forme purifiée induisait une augmentation significative des quantités d’IgA dans les fèces, de même qu’un accroissement de la production d’IL-4 dans une culture de splénocytes (Hébert-Leclerc, 2011). Ces travaux suggèrent donc que le peptide β-LG f96-99 a un effet stimulateur sur la réponse immune adaptative. Toutefois, ces résultats ont été obtenus à partir d’un peptide de synthèse et des travaux devaient donc être réalisés afin de valider les effets immunomodulateurs de ce peptide dans des mélanges complexes, ces derniers offrant un meilleur potentiel commercial à titre d’ingrédient nutraceutique. Le présent travail de recherche visait donc à démontrer que l’ingestion d’un hydrolysat enzymatique de protéines de lactosérum, contenant la séquence β-LG f96-99, permettrait d’accroître les effets immunomodulateurs associés à la réponse immune adaptative et ce, dans un modèle animal de souris saines. 2 CHAPITRE I : REVUE DE LITTERATURE 3 1. Structure et fonctions biologiques des protéines du lactosérum Les protéines du lactosérum représentent seulement 20% des protéines du lait (Madureira et al., 2010). Le Tableau 1 présente la composition en protéines et peptides du lactosérum. Les principales protéines sont la β-lactoglobuline (β-LG), l'-lactalbumine (-LA), l'albumine sérique bovine (BSA) et les immunoglobulines (Igs). La β-LG et l'-LA représentent 70 à 80% des protéines du lactosérum (Chatterton et al., 2006). Ce sont donc les protéines les plus importantes. On retrouve des protéines moins abondantes comme la lactoferrine, des enzymes, des facteurs de croissance ainsi que des peptides issus de la dégradation enzymatique des caséines tels le glycomacropeptide et les protéose-peptones. Il faut cependant noter que les concentrations des protéines du lactosérum peuvent varier selon la source laitière (bovine, caprine, ovine), l’alimentation de l’animal, le type de fabrication fromagère (lactosérum doux ou acide) et la qualité de la transformation du lait en fromage (Madureira et al., 2007). Tableau 1 : Teneur en protéines et peptides du lactosérum bovin. Protéine / Peptide β-lactoglobuline -lactalbumine Glycomacropeptide Immunoglobulines Albumine sérique bovine Lactoferrine Lactoperoxydase Concentration (g/L) 1,3 1,2 1,2 0,7 0,4 0,1 0,03 Tiré de Madureira et al. (2007), de Wit (1998) et Korhonen & Pihlanto (2006). 1.1. β-lactoglobuline La β-LG est absente dans le lait humain (Chatterton et al., 2006). Dans le lait bovin, elle représente environ 58% des protéines du lactosérum, ce qui en fait la protéine dominante (Madureira et al., 2007). Dans le lait, la β-LG est présente sous forme de dimères identiques. Un monomère est constitué d’une chaîne de 162 résidus d’acides aminés et sa masse molaire est de 18,6 kDa. Ce monomère est stabilisé par deux ponts disulfures intra-chaînes (Cys 66–Cys 160 et Cys 106–Cys 119). Un groupement thiol libre est positionné sur le résidu 121 (Sakurai et al., 2009) et ce groupement permet de stabiliser la structure tertiaire de la β-LG grâce à des liaisons hydrogène (Burova et al., 1998a ; 1998b). La structure secondaire de la β-LG est majoritairement constituée de feuillets β. On retrouve une hélice α à trois tours à l'extrémité C-terminale, suivie de huit feuillets β anti-parallèles (A à G) formant un calice hydrophobe au centre de la molécule 5 (Figure 1). Un neuvième feuillet β (I) est présent en position C-terminale de la molécule, lequel est impliqué dans la formation des dimères (Kontopidis et al., 2004). La β-LG possède plusieurs variants génétiques dont le plus commun est le variant A (Madureira et al., 2007). Figure 1 : Structure 3D d’un monomère du variant A de la β-lactoglobuline (Oliveira et al., 2003). La structure tridimentionnelle de la β-LG est proche de celle des lipocalines. Cela lui confère la capacité de se lier à de petits ligands hydrophobes et lui donne un rôle potentiel de transporteur de molécules (Sawyer & Kontopidis, 2000 ; Jameson et al., 2002). Les fonctions biologiques de la β-LG ont surtout été attribuées à des peptides issus de son hydrolyse enzymatique. Les propriétés répertoriées jusqu’à ce jour sont : inhibition de l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACE), activité antibactérienne, antivirale, opioïde, anti-cancérigène, inhibition de l'adhésion de pathogènes et activité hypocholestérolémiante (Chatterton et al., 2006 ; Hernández-Ledesma et al., 2008). 1.2. α-lactalbumine L’-LA est la deuxième protéine en importance dans le lactosérum. Elle représente 20% des protéines totales (Madureira et al., 2007). Elle est composée de 123 résidus d’acides aminés et sa masse molaire est de 14,1 kDa. La structure secondaire est composée d’un domaine composé de quatre hélices α et d’un domaine en feuillet β (Figure 2) (Pike et al., 1996). Sa structure globulaire compacte est stabilisée par quatre ponts disulfures (Edwards et al., 2009). Une boucle, présente entre les deux domaines, permet de stabiliser la structure native de la protéine et on y retrouve un site de liaison du calcium de haute affinité 6 (Kuwajima et al., 1986). Trois variants génétiques de l’-LA ont été identifiés, soient les variants A, B et C (Fox, 1989). Figure 2 : Structure 3D de l’α-lactalbumine (tiré de : http://www.intechopen.com/books/milkprotein/). L’-LA est une métalloprotéine pouvant fixer le calcium, mais aussi le zinc et d’autres ions métalliques (Permyakov & Berliner, 2000). Elle participe, à titre de coenzyme, à la biosynthèse du lactose (de Wit, 1998). Sa structure montre des similarités avec le lysozyme, mais l’-LA ne possède pas de propriétés bactéricides (Jouan, 2002). Néanmoins, elle possède de nombreuses propriétés biologiques associées aux peptides libérés lors de son hydrolyse enzymatique. On compte parmi ses propriétés : inhibition de l'ACE, activité anti-cancérigène, antimicrobienne, opioïde, anti-stress, amélioration des capacités cognitives et amélioration du sommeil (Chatterton et al., 2006). 1.3. Glycomacropeptide Le glycomacropeptide (GMP), ou caséinomacropeptide, est un peptide et représente environ 20% des protéines du lactosérum. Il s’agit du fragment 106-109 de la κ-caséine. Il contient 64 résidus d’acides aminés et a un poids moléculaire d’environ 8 kDa. Il est libéré par hydrolyse des caséines κ lors de la fabrication du fromage (Jelen, 2004). Le GMP possède la capacité de se lier aux toxines du choléra et aux entérotoxines d’E. coli, de réduire l’adhésion des bactéries et des virus de même que leur colonisation, d’inhiber la production des sécrétions gastriques et de réguler la pression sanguine (Thomä-Worringer et al., 2006). 7 1.4. Immunoglobulines Les immunoglobulines (Igs) représentent 10% du total des protéines du lactosérum bovin. La structure de base des Igs est constituée de 2 chaînes lourdes de 53 kDa chacune et de 2 chaînes légères identiques de 23 kDa qui sont liées par des ponts disulfures. La masse molaire totale est supérieure à 150 kDa. Les sites de fixation des antigènes sont constitués des parties N-terminales d’une chaîne lourde et d’une chaîne légère. Le lait bovin contient majoritairement 3 classes d’immunoglobulines : les IgG, IgM et IgA. Les IgG1 constituent 75% des immunoglobulines du lactosérum. Les fonctions reconnues des IgG sont des fonctions d’opsonisation, de fixation du complément et de neutralisation de l’attachement des microorganismes ou toxines à leurs cibles. Les IgM ont sensiblement les mêmes fonctions mis à part l’opsonisation. Dans le cas des IgA, elles neutralisent les toxines virales et bactériennes, induisent une agglutination des antigènes et inhibent l’adhésion des bactéries pathogènes aux cellules épithéliales de la muqueuse intestinale. Les IgA sont résistantes à l’action protéolytique des enzymes digestives (Korhonen et al., 2000). 1.5. Albumine sérique bovine L’albumine sérique bovine (BSA) représente 8% des protéines totales du lactosérum (Farrell et al., 2004). Elle est également présente dans le sérum sanguin. Elle contient 582 résidus d’acides aminés pour un poids moléculaire de 66 kDa. Elle présente une homologie de 76% avec l’albumine sérique humaine. La BSA peut se lier aux acides gras libres, à d’autres lipides et aux composés aromatiques. Elle participe ainsi à la synthèse des lipides. Elle possède des propriétés anti-oxydantes et anti-cancérigènes (Madureira et al., 2007). 1.6. Lactoferrine La lactoferrine (LF) représente environ 1% des protéines du lactosérum bovin. Il s’agit d’une protéine constituée d’une chaîne polypeptidique de 691 résidus d’acides aminés. Son poids moléculaire est de 80 kDa (Legrand et al., 2008). La LF est une glycoprotéine globulaire faisant partie des transferrines. Elle présente donc la capacité de lier les atomes de fer. Elle est présente dans la plupart des fluides corporels comme le lait, les larmes, la salive et les mucus (Farrell et al., 2004). Les propriétés biologiques de la LF sont vastes, incluant des activités antimicrobiennes contre les bactéries, virus, moissisures et parasites, ainsi que des activités anti-cancérigènes et anti-inflammatoires. Cela est dû à sa capacité à se lier tant aux cellules hôtes qu’aux cellules pathogènes (Legrand et al., 2008). 8 1.7. Lactoperoxydase La quantité de lactoperoxydase (LP) dans le lactosérum est inférieure à 1% (Madureira et al., 2007). Sa chaîne polypeptidique contient 612 résidus d’acides aminés et sa masse molaire est de 78 kDa. Elle contient un groupement hème lié à son centre catalytique et sa conformation est stabilisée par un ion calcium (Boots & Floris, 2006). La LP est surtout utilisée dans les procédés de conservation en industrie agroalimentaire. Elle possède en effet un pouvoir antimicrobien induit par les produits de la catalyse du thiocyanate et du peroxyde d’hydrogène par cette même protéine (Kennedy et al., 2000). 9 2. Système immunitaire L’organisme met en place des systèmes de défense complexes afin de se protéger des différents pathogènes présents dans l’environnement. Les pathogènes doivent d’abord affronter des barrières physiques telles que la peau et les muqueuses. L’organisme se protège aussi grâce à diverses sécrétions (sueur, larmes, salive, etc.) qui contiennent des composés antimicrobiens. La flore commensale, c’est-à-dire la flore normale des organes tels que le tube digestif, entre en compétition avec les pathogènes en empêchant leur fixation au niveau du site visé. Lorsque ces défenses sont insuffisantes, les pathogènes peuvent être détruits par le système immunitaire. Il existe deux catégories de réponse : l’immunité innée ou non spécifique et l’immunité spécifique ou adaptative. L’immunité innée est la première ligne de défense mise en place lors de l’infection par un pathogène. Sa réponse est rapide, mais il n’y a pas d’amélioration après des contacts répétés avec le pathogène. L’immunité spécifique, quant à elle, va réagir rapidement lors de contacts avec des antigènes déjà rencontrés. Elle est donc plus lente à se développer, mais elle permet une réponse ciblée. Ces deux systèmes travaillent conjointement pour protéger l’organisme. 2.1. Immunité innée L’immunité innée est non spécifique et donc polyvalente. Présente dès la naissance, sa réponse est rapide dès le contact avec l’agent pathogène quel qu’il soit : virus, bactérie ou parasite. Son mode d’action est toujours similaire ; il est basé sur la reconnaissance du soi et du non-soi. Les récepteurs PRRs (Pattern Recognition Receptors) sont présents sur les macrophages, les cellules dendritiques, les cellules NK (Natural Killer), les polynucléaires, les mastocytes et certaines cellules épithéliales. Ces PRRs reconnaissent des motifs moléculaires appelés PAMPs (Pathogen-Associated Molecular Patterns) qui sont associés aux pathogènes. Une fois l’interaction PRR-PAMP effectuée, un signal est émis et enclenche la sécrétion de cytokines et de facteurs solubles induisant la réponse inflammatoire. Ces facteurs solubles permettent de recruter et activer des cellules du système immunitaire. La sécrétion de ces molécules induit une réponse inflammatoire aigüe, laquelle est régulée par les cytokines anti-inflammatoires. Les chimiokines permettent d’attirer les phagocytes par chimiotactisme. Ces derniers vont ingérer le pathogène par endocytose pour le détruire (Figure 3). Ces phagocytes peuvent être des macrophages, des cellules dendritiques ou des polynucléaires. 10 Figure 3 : 2.2. La réponse immunitaire innée. Certains leucocytes, les granulocytes dans le sang et les macrophages dans les tissus, phagocytent et digèrent les pathogènes et rejettent ensuite leurs débris. (tiré de : http://crdp.ac-amiens.fr/enviro/air/air_maj3_detail_p1_1.htm). Immunité spécifique L’immunité spécifique a besoin de plus de temps que l’immunité innée pour répondre à l’infection par un pathogène. Elle est caractérisée par des réactions spécifiques à un antigène (Ag) et donc par la diversité de ses réponses, mais aussi par la mémoire immunologique. Un premier contact avec l’antigène nécessite plusieurs jours pour entraîner une réponse tandis qu’au deuxième contact, la réponse sera plus rapide et plus importante. L’immunité adaptative fait intervenir les lymphocytes qui sont porteurs de récepteurs leur permettant de reconnaître certains Ag spécifiques. Cela permet une réponse spécifique à l’Ag. La reconnaissance d’un motif moléculaire pathogène par un lymphocyte entraîne l’expansion clonale, c’est-à-dire la prolifération des lymphocytes porteurs des récepteurs spécifiques de l’Ag. Ainsi, des clones de ces lymphocytes spécifiques sont produits pour lutter contre l’Ag. On distingue les lymphocytes B (LB) et les lymphocytes T (LT). Ils sont produits dans la moelle osseuse et leur maturation se fait dans la moelle osseuse et dans le thymus, respectivement. On compte deux souspopulations de LT. Les LT cytotoxiques (CTL) expriment des marqueurs de surface CD8 et détruisent les cellules infectées par un virus et les cellules tumorales. Les LT auxiliaires ou « helper » (Th) expriment le CD4 et aident les cellules B dans leur croissance et leur différenciation. Les LT reconnaissent l’antigène que lorsqu’il a été capturé, transformé et présenté par des cellules spécialisées que l’on nomme cellules présentatrices de l’antigène (CPA). Parmi ces cellules, on compte les cellules dendritiques et les macrophages. Ces cellules expriment les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH II) à leur surface. Les CPA capturent l’antigène par phagocytose et le digère. Les peptides générés suite à cette digestion s’installent dans la niche peptidique des molécules du CMH afin d’être présentés à la surface de la cellule. C’est alors que les LT sont capables de reconnaître les peptides antigéniques. La présentation de l’Ag aux LT naïfs entraîne l’émission de différents signaux qui vont induire leur différenciation (Figure 4). 11 Les LT activés vont alors aider les LB à produire leurs anticorps. L’immunité spécifique comprend deux types de mécanismes, soient l’immunité humorale et l’immunité cellulaire, lesquels seront décrits ci-après. Figure 4 : 12 La réponse immunitaire acquise. Les macrophages présentent à leur surface des fragments peptidiques du pathogène endocyté précédemment. Ces peptides sont reconnus par les lymphocytes T, dont les LT4 et LT8. Les LT4 et LT8 spécifiques de l’antigène sont sélectionnés et prolifèrent. Les LT4 spécifiques se différencient en LT auxiliaires ou helper et sécrétent des interleukines qui vont recruter d’autres lymphocytes tels que les LT cytotoxiques (CTL). Ces CTL produisent de la perforine qui attaque les membranes des cellules infectées par l’antigène. D’autre part, les lymphocytes B spécifiques reconnaissent directement l’antigène et se multiplient. Certains se différencient en plasmocytes qui vont libérer des anticorps circulants. Cette différenciation est stimulée par l’interleukine. Les anticorps produits se lient à l’antigène pour former des complexes immuns qui seront reconnus et phagocytés par les macrophages (tiré de : http://crdp.acamiens.fr/enviro/air/air_maj3_detail_p1_1.htm). 2.2.1. Immunité humorale L’immunité humorale peut être transférée d’un individu immunisé à un individu non immunisé grâce aux anticorps (Ac) sériques. Elle est activée par l'interaction des lymphocytes B avec un antigène spécifique suivie de leur prolifération et différenciation en plasmocytes, puis de la sécrétion d’Ac. Les plasmocytes vont sécréter différents types d’immunoglobulines (Igs) : les IgM, IgG, IgE, IgA et IgD. Cette sécrétion est dépendante des signaux qu’auront reçu les LB de la part des LT. Les IgM sont les premiers anticorps produits par les LB. Lorsqu’ils sont présents à la surface de ces molécules, ils agissent comme récepteur pour les Ag. Ils sont également présents dans le sang sous forme de molécule soluble. Les IgM peuvent se lier avec une très grande efficacité aux antigènes et ce, jusqu’à ce que les IgG aient été produits en quantité suffisante. Les IgG sont le type d’immunoglobulines le plus abondant dans le sang. Elles ont un rôle d’opsonines et facilitent ainsi la reconnaissance des antigènes par les phagocytes. Ce sont les seules Igs à pouvoir traverser la barrière placentaire et fournir au fœtus l’immunité humorale passive. Les IgE jouent un rôle significatif dans le renforcement de l’inflammation aigüe, la protection contre les parasites et la réaction d’hypersensibilité de type I. Elles se lient aux basophiles, mastocytes et éosinophiles en présence d’antigène. Les IgA sont synthétisées au niveau des glandes mammaires et salivaires, mais aussi au niveau des tractus respiratoires, gastro-intestinaux et génito-urinaires. Il faut noter que plus de 80% des cellules productrices d’immunoglobulines sont situés dans les intestins, qui de ce fait constituent le principal organe effecteur de l’immunité humorale. Les IgA sont par ailleurs les anticorps les plus abondants dans les muqueuses. Leur rôle est donc primordial au niveau intestinal. A ce niveau, les lymphocytes B IgA+ vont produire des IgA sécrétoires (sIgA). La synthèse se fait dans les plaques de Peyer, les follicules lymphoïdes isolés et la lamina propria. Les sIgA ont un rôle important dans la sélection et le maintien de la flore normale. Ce rôle dans l’homéostasie de la flore est essentiel pour prévenir une stimulation excessive du système immunitaire. Dans les muqueuses, les sIgA vont prévenir l’interaction des antigènes avec l’épithélium et faciliter leur élimination grâce à des mouvements péristaltiques et au système muco-ciliaire. Cela limite ainsi la pénétration des bactéries sous la couche épithéliale intestinale. Ce mécanisme est nommé exclusion immune. Aussi, dans la lamina propria, les IgA polymériques vont se lier aux antigènes ayant franchi la barrière intestinale, traverser la couche épithéliale par transcytose et ré-excréter les antigènes dans la lumière intestinale (Corthésy et al., 2002 ; Suzuki & Fagarasan, 2009 ; Brandtzaeg, 2010). 13 Les IgD sont utilisées comme récepteurs pour les antigènes par les LB. Elles agissent en collaboration avec les IgM. Les anticorps n’éliminent pas directement l’antigène. Cette destruction se fait via différents mécanismes comme l’opsonisation, la neutralisation, l’agglutination et l’activation du complément. Ces mécanismes favorisent la phagocytose des antigènes, l’inhibition de l’activité biologique de l’antigène et des toxines et la dégradation de la membrane du pathogène. L’immunité humorale met donc en jeu les lymphocytes B et la production d’immunoglobulines pour reconnaître et éliminer les pathogènes par une réponse spécifique. L’activation de LB mémoire va permettre une réponse immunitaire secondaire. 2.2.2. Immunité à médiation cellulaire L’immunité cellulaire peut être transférée d’un individu immunisé à un individu non immunisé grâce aux lymphocytes T de l’individu immunisé. Elle est induite par les lymphocytes T auxilliaires (Th) et les lymphocytes T cytotoxiques (CTLs) activés après contact avec l’antigène. L’immunité cellulaire intervient dans la lutte contre les pathogènes intracellulaires (virus et certaines bactéries) se trouvant soit dans des cellules hôtes, soit dans des phagocytes les ayant endocytés et présentés. Ce type d’immunité joue un rôle dans les réactions de rejet de greffe, d’hypersensibilité retardée et de destruction des cellules cancéreuses. Les Th (CD4+) reconnaissent les antigènes liés au CMH de type II présent sur les macrophages, les cellules dendritiques et les LB. Dans le cas des CTL (CD8+), ils reconnaissent les peptides liés aux molécules du CMH de type I. La reconnaissance des peptides de l’antigène déclenche un signal pour la transcription des gènes codant pour les cytokines et leurs récepteurs. Les CTL effectuent une cytolyse grâce aux mécanismes de nécrose et d’apoptose. La nécrose est effectuée par les perforines et granzymes sécrétées par les CTL. L’apoptose, ou signal de mort programmée, est déclenchée suite à la sécrétion de Fas-ligand qui se lie au Fas de la cellule infectée. Les macrophages et les cellules NK sont également impliqués dans l’immunité cellulaire. Certains LT naïfs CD4 se différencient en Th1 après contact avec les CPA. En présence d’un signal co-stimulateur, les Th1 sécrètent des IFN-γ qui vont activer les macrophages. Ils sécrètent également de l’IL-2. L’IFN-γ et l’IL-2 activent alors les cellules NK qui vont-elles même sécréter de l’IFN-γ pour activer les macrophages. Les macrophages ainsi activés sécrètent des composés permettant la destruction des pathogènes dans les phagosomes. 14 Certaines sous-populations de Th sont impliquées dans l’hypersensibilité retardée. Au premier contact avec l’antigène, certains Th sont alors sensibilisés à cet antigène spécifique. Après la deuxième exposition, les Th1 activent les macrophages ce qui cause la production de cytokines inflammatoires. Des cellules inflammatoires non spécifiques vont aussi être recrutées. Les Th2 vont sécréter de l’IL-4 et IL-5 et activer les éosinophiles. 2.3. Rôle des cytokines dans la réponse immunitaire Les lymphocytes Th ont un rôle clé dans la défense immunitaire. En effet, tout comme les lymphocytes T (CD8), les cellules NK, les lymphocytes B et les cellules non lymphoïdes, ils sécrètent des cytokines pouvant agir sur les cellules les ayant sécrétées elles-mêmes ainsi que sur d’autres cellules immunitaires afin de moduler leurs réponses (Kindt et al., 2008). Les cytokines sont des molécules de faible poids moléculaire. Elles peuvent induire la croissance, la différenciation, le chimiotactisme et l’activation et/ou l’augmentation de la cytotoxicité. Certaines cytokines peuvent avoir des effets similaires et une cytokine peut être produite par différents groupes de cellules. Elles jouent donc un rôle clé dans la communication entre les différentes cellules immunitaires dans le but de réguler la réponse. Après contact avec l’antigène, les lymphocytes T CD4+ naïfs vont être activés et vont se différencier, entre autres, en cellules Th. Ces cellules sont classées en trois catégories principales: Th1, Th2 et Th17. Il existe aussi un groupe de LT CD4+ qui ont une capacité de régulation des réponses immunes. Ces LT régulateurs (Treg) représentent un groupe hétérogène de cellules. Ces lymphocytes expriment différents facteurs de transcription et transcrivent des gènes différents (Zhu & Paul, 2010) (Figure 5). Les cellules Th1 sont caractérisées par leur production d’IFN-γ, mais elles sécrètent aussi de l’IL-2, IL-3 et du TNF-α. Elles sont capables d’activer et recruter les cellules T et les macrophages sur le site d’infection. Elles sécrètent aussi le GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) et certaines chémokines qui vont induire la différenciation des Th1 en macrophages. L’IL-3 augmente la production et la libération de monocytes par la moelle osseuse. Les cytokines des Th1 sont généralement associées à une inflammation anormalement importante. La différenciation en Th1 est favorisée par l’IL-12 et l’IFN-γ. Les cellules Th2 sécrètent principalement de l’IL-4, mais également de l’IL-5, IL-6 et IL-10. Elles encouragent la prolifération des lymphocytes B et la production d’anticorps, notamment d’IgA et IgE (Zhu et al., 2010). L’IL-4 induit la différenciation des cellules Th vers le Th2. A partir d’un certain seuil de présence, la voie Th2 est préférée à la voie Th1 (Mosmann & Subash, 1996). Les Th2 sont liées aux réactions allergiques. Il faut noter que les cytokines des groupes Th1 et Th2 ont des effets antagonistes. 15 Les cellules Th17 produisent les cytokines IL-17A et F ainsi que les IL-21 et IL-22. Elles jouent un rôle important dans la protection contre l’entrée des pathogènes dans le tractus gastro-intestinal et dans l’inflammation. Le TGF-β et l’IL-23 induisent la différenciation des Th en Th17. Les cellules Treg sécrètent de manière importante le TGF-β et l’IL-10. Elles sont essentielles dans le maintien de la tolérance immunologique et l’inhibition de réponses immunitaires excessives. Figure 5 : Différenciation des cellules T. Chaque sous-population de Th possède un patron de production de cytokine caractéristique et leur différentiation est déterminée par le profil cytokinique de l’environnement (Korzenik & Podolsky, 2006). La différenciation des Th est donc influencée par les cytokines présentes dans l’environnement. Chaque cytokine caractéristique de la catégorie de Th qu’elle représente va exercer un rétrocontrôle positif sur la sous-population qui la sécrète et va exercer un rétrocontrôle négatif sur l’autre sous-population. Ces cytokines vont aussi permettre d’atteindre un équilibre entre les différentes populations de Th. On parle d’homéostasie immunitaire (Figure 6) et un déséquilibre trop important pourrait causer certaines maladies. 16 Figure 6 : Action des cytokines dans la différenciation et la conversion des Th. Grâce à l’effet des cytokines, les sous-populations de Th s’équilibrent jusqu’à atteindre l’homéostasie immunitaire. Dans certaines situations, une sous-population peut se convertir en une autre (pointillés verts) afin de favoriser la réponse immunitaire désirée (Wan & Flavell, 2009). Le profil cytokinique de l’environnement influence donc la différenciation des cellules Th. Les cytokines représentent ainsi des marqueurs clés de la réponse immunitaire. 2.3.1. Production d’IgA mucosales Les IgA peuvent être produites dans les muqueuses par le phénomène de commutation de classe. On parle de commutation de classe ou class-switch recombination (CSR) lorsque l’exon Cµ d’un IgH est remplacé par un autre exon CH, ce qui permet de créer des IgG, IgE et IgA. Ce mécanisme est habituellement sous le contrôle de cytokines produites par les LT (Cerruti & Rescigno, 2008 ; Cerruti, 2008). Ainsi, le TGF-β (facteur de croissance de transformation β), produit par les LT présents dans les plaques de Peyer est l’un des facteurs les plus importants dans le mécanisme de CSR conduisant à la production d’IgA dans l’intestin. D’autres molécules comme l’AID (activation-induced cytidine deaminase) sont requises pour le CSR et l’hypermutation somatique (HMS). L’HMS apparaît lorsqu’une mutation ponctuelle est présente dans la région variable des exons, améliorant leur affinité pour l’antigène. La cytokine TSLP (lymphopoïétine stromale thymique) active les cellules dendritiques et induit ainsi la production de cytokines telles que TGFβ1 qui induisent la production d’IgA par les cellules T CD4+. 17 Toutefois, plusieurs études ont montré que la production d’IgA pouvait également être indépendante de l’action des LT. Ainsi le BAFF (facteur d’activation des cellules B) et APRIL (ligand induisant la prolifération), produits principalement par les cellules dendritiques, induisent la CSR chez les LB. 2.4. Méthodes d’analyses immunologiques 2.4.1. Méthode ELISA La méthode ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) permet de déterminer la présence et la concentration d’un antigène spécifique ou d’un anticorps spécifique à un antigène. C’est une méthode simple, rapide et sensible. Le DAS ELISA ou Double Antibody Sandwich ELISA sera décrit (Figure 7). Deux anticorps spécifiques reconnaissant des épitopes différents de l’antigène sont utilisés. La première étape consiste à fixer l’anticorps de capture sur le support, c’est-à-dire un puits de microtitration. L’échantillon possédant l’antigène est ensuite ajouté au puits. Il est ainsi fixé par l’anticorps de capture. Un anticorps de détection conjugué à la biotine est déposé et se fixe à l’antigène recherché. L’enzyme streptavidine-HRP (horseradish peroxydase), qui présente une forte affinité pour la biotine, est ensuite ajoutée au puits. Entre chaque étape, un lavage du puits est effectué afin d’éliminer tout composé non fixé. Une solution révélatrice de TMB (tetramethylbenzidine), substrat de la peroxydase, est enfin déposée. Le produit de réaction est soluble et coloré. L’intensité de la coloration peut être quantifiée par spectrophotométrie et la concentration peut être déterminée grâce à une courbe étalon. Dans le cadre de notre étude, la méthode ELISA a été utilisée pour quantifier les IgA sériques et fécaux. Figure 7 : 18 Principe du test sandwich ELISA (tiré de : http://www.epitomics.com/). 2.4.2. Immunofluorescence de coupes histologiques Les techniques d’immunofluorescence reposent sur la visualisation d’un antigène dans des cellules ou des coupes de tissus en le liant à un anticorps spécifique, lequel est conjugué à un colorant fluorescent tel que l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC). Ces colorants ne modifient pas la spécificité des anticorps auxquels ils sont liés. La fluorescence peut être quantifiée grâce à différentes techniques. Il existe deux méthodes principales d’immunofluorescence : l’immunofluorescence directe et indirecte. L’immunofluorescence directe est moins fréquemment utilisée, mais elle présente l’avantage d’avoir des temps de coloration des échantillons plus courts et des procédures de marquage double et triple plus simples (Robinson et al., 2010). On parle d’immunofluorescence directe lorsque l’anticorps lui-même est marqué par le colorant fluorescent et appliqué directement sur les cellules étudiées (Figure 8). Les échantillons colorés sont ensuite examinés par microscopie à fluorescence. La lumière émise par le complexe antigène-anticorps peut être visualisée et quantifiée sous une certaine longueur d’onde. L’image obtenue montre ainsi les différentes régions où les anticorps marqués se sont liés aux antigènes. Il est alors possible d’étudier plusieurs anticorps en même temps et ce, en leur associant des molécules fluorescentes différentes. Dans notre étude, cette technique a été utilisée afin de déterminer l’expression quantitative et qualitative des IgA dans les muqueuses intestinales (Audigié et al., 1992 ; Robinson et al., 2010). 19 Figure 8 : 20 Principe de l'immunofluorescence directe (tiré de : http://www.di.uq.edu.au/directif). 2.4.3. Expression des gènes par qPCR La qPCR (PCR quantitative en temps réel) est actuellement la méthode la plus sensible pour détecter et quantifier les ARN messagers (ARNm) d’un organe, tissu ou cellule. Ils sont en effet présents en trop faible quantité pour pouvoir être détectés par Northern Blot. D’autant plus que cette technique ne permet pas de quantification précise de l’expression génique. La qPCR permet un suivi en temps réel car des sondes fluorescentes tels que SYBR Green sont utilisées. Cette sonde se fixe à l’ADN double brin et la fluorescence émise est quantifiée à chaque cycle. Plus l’ADN est amplifié, plus le signal fluorescent sera important. Un seuil d’amplification est défini dans la phase exponentielle de la réaction. Il correspond à une augmentation significative de la fluorescence et permet d’obtenir un numéro de cycle seuil ou Ct (SABiosciences, 2014). Les ARN totaux sont dans un premier temps extraits des tissus étudiés après lyse et homogénéisation. Les ARN sont soumis à une transcription inverse et l’ADN complémentaire (ANDc) est ainsi synthétisé. Une PCR quantitative en temps réel (qPCR) est effectuée sur l’ADNc en utilisant des amorces spécifiques aux gènes recherchés. Les conditions de qPCR sont les mêmes pour tous les gènes, soit A) 95°C, 10 minutes, 1 fois B) 95°C, 15 secondes et ensuite 60°C, 1 minute, 42 fois, et C) protocole de dissociation pour s’assurer de l’absence de dimères d’amorces. Le niveau d’expression relatif des gènes est déterminé par la méthode comparative du delta-delta Ct (ΔΔCt) : les valeurs de Ct du gène d’intérêt sont normalisées grâce à un contrôle endogène puis comparées à celles d’un gène de référence. ∆ ∆ Ct = ∆ Ct échantillon - ∆ Ct réference Puisque les cytokines sont synthétisées suite à la transcription de certains gènes, la technique PCR en temps réel a donc été utilisée dans le cadre de notre étude pour mesurer leur expression au niveau des muqueuses intestinales. 21 3. Activités immunomodulantes des peptides l’hydrolyse des protéines du lactosérum issus de 3.1 Hydrolysats enzymatiques et fractions peptidiques issus des protéines du lactosérum Plusieurs travaux ont étudié les effets immunomodulateurs d’hydrolysats enzymatiques de protéines du lactosérum lors d’études in vitro ou in vivo. La majorité des hydrolysats étudiés ont été préparés à l’aide d’enzymes gastro-intestinales telles la pepsine, trypsine ou chymotrypsine. Dans certains de ces travaux, les hydrolysats ont été séparés en fractions peptidiques par focalisation isoélectrique, une méthode permettant la séparation des peptides sur la base de leur point isoélectrique. Les effets immunomodulateurs de ces fractions peptidiques ont également été mesurés en vue de déterminer si certaines caractéristiques des peptides pouvaient être associées aux effets observés. De façon générale, les variables mesurées lors de ces études étaient : la prolifération cellulaire, la sécrétion de cytokines et/ou d’immunoglobulines. 3.1.1 Etudes in vitro Saint-Sauveur et al. (2008) et Mercier et al. (2004) ont étudié les effets immunomodulateurs d’hydrolysats enzymatiques (trypsine+chymotrypsine) issus d’isolats de protéines de lactosérum (IPL), fabriqués par microfiltration ou par chromatographie d’échange ionique (CEI), de même que de fractions peptidiques obtenues à partir de ces hydrolysats par focalisation isoélectrique. Les effets de ces produits ont été évalués sur des splénocytes murins en absence et en présence de concanavaline A (ConA). Ces auteurs ont montré que l’IPL microfiltré et son hydrolysat stimulaient la prolifération des splénocytes en absence et en présence de ConA. Cependant, à forte concentration et en présence de ConA, l’hydrolysat de cet IPL avait un effet inhibiteur sur la prolifération des splénocytes (Saint-Sauveur et al., 2008). Dans le cas des fractions peptidiques, elles stimulaient toutes, peu importe leur pH (acide, neutre ou basique), la prolifération des splénocytes en absence et en présence de ConA. Au niveau de la sécrétion de cytokines par les splénocytes, les auteurs ont montré que l’hydrolysat d’IPL microfiltré stimulait la production d’IFN-γ en présence de ConA, alors qu’aucun effet n’a été observé en absence de mitogène. Les fractions peptidiques ont, quant à elles, stimulé la sécrétion de cytokines de type Th1 (IL-2, IFN-γ), les plus efficaces étant les fractions acide et neutre (Saint-Sauveur et al. 2008). D’autre part, Cross & Gill (1999) ont démontré qu’un hydrolysat pepsine+pancréatine, préparé à partir d'un concentré de protéines du lactosérum (CPL) enrichi en GMP (35%), n’avait aucun effet sur la prolifération de splénocytes murins en présence de ConA ou de lipopolysaccharides (LPS), mais avait un effet inhibiteur sur la sécrétion de certaines cytokines (IL-4, IFN-γ) en présence de ConA. 22 Iskandar et al. (2013) ont étudié un isolat de protéines de lactosérum traité par hautes pressions, lequel a été hydrolysé à l’aide de la pepsine puis d’un mélange trypsine-chymotrypsine-peptidase ; l’hydrolysat ainsi obtenu a ensuite été séparé par ultrafiltration (UF) sur une membrane de 10 kDa afin d’éliminer les protéines/peptides de hautes masses moléculaires. Les auteurs ont démontré que le permeat UF, composé de peptides ayant une masse inférieure à 1 kDa, avait un effet inhibiteur sur la sécrétion d’IL-8 par des cellules épithéliales respiratoires stimulées par des lipopolysaccharides. De plus, les résultats ont montré que le traitement de pressurisation exacerbait les propriétés anti-inflammatoires de l’IPL. Une précédente étude avait également démontré qu’un IPL, aussi traité par hautes pressions puis digéré à l’aide de la pepsine suivi d’une digestion par un mélange trypsine-chymotrypsine, augmentait sa capacité à inhiber la sécrétion d’IL-8 par les cellules épithéliales intestinales (Piccolomini et al., 2012). Dans le cas des hydrolysats enzymatiques de protéines de lactosérum, le choix des enzymes utilisées pour leur fabrication aurait donc un impact important sur la prolifération cellulaire et la sécrétion de cytokines. Néanmoins, la nature du produit hydrolysé, surtout sa composition en protéines du lactosérum, serait un autre facteur pouvant influencer les effets observés. En outre, certains travaux se sont intéressés à mesurer les effets immunomodulateurs de fractions protéiques purifiées du lactosérum et ont montré des résultats contradictoires. Mercier et al. (2004) ont démontré que des hydrolysats trypsine+chymotrypsine de protéines purifiées du lactosérum (β-LG, α-LA, LF) n’avaient pas d’effet sur la prolifération des splénocytes murins. Prioult et al. (2004) ont toutefois démontré que des fractions peptidiques isolées d’un hydrolysat trypsine+chymotrypsine de β-LG stimulait la prolifération des splénocytes murins, mais uniquement à forte concentration. Ces auteurs ont également montré qu’un hydrolysat de β-LG, préparé à partir des protéases de Lactobacillus paracasei, n’influençait pas la prolifération des splénocytes murins ni la sécrétion des cytokines IFN-γ et IL10 par ces cellules, alors qu’il avait un effet inhibiteur sur la production d’IL-4. Par contre, la séparation de cet hydrolysat par focalisation isoélectrique a permis d’obtenir une fraction peptidique acide ayant un effet inhibiteur sur la prolifération des splénocytes murins et sur la sécrétion d'IFN-γ et d'IL-4, alors qu’un effet stimulateur a été observé dans le cas de la sécrétion d’IL-10. Ces résultats ont donc conduit les auteurs à conclure que cette fraction acide pouvait induire une tolérance orale envers la β-LG. Aussi, Wong et al. (1998) ont démontré qu’un hydrolysat trypsique de β-LG stimulait la prolifération et la production d’IgM par les splénocytes murins. Les travaux de Mahmud et al. (2004) ont, pour leur part, montré que des hydrolysats de β-LG préparés à l’aide de différentes enzymes digestives (pepsine, trypsine, chymotrypsine ou pancréatine) stimulaient tous la prolifération des splénocytes murins. 23 Enfin, Miyauchi et al. (1997) ont démontré qu’un hydrolysat pepsique de LF stimulait la prolifération des splénocytes murins et la production d'IgM, IgG et IgA, et ce, en présence ou en absence de mitogènes. Les résultats obtenus pour les IgA ont été confirmés au niveau des plaques de Peyer. Par contre, dans la même étude, un hydrolysat trypsique de LF n’a pas permis d’observer les mêmes effets stimulateurs. Ces travaux montrent à nouveau que l’ampleur de la stimulation des splénocytes murins et les effets sur la sécrétion de cytokines varient selon les types d’enzymes utilisées pour la fabrication des hydrolysats, de même qu’en fonction du pH des fractions peptidiques isolées à partir des hydrolysats (Saint-Sauveur et al., 2008 ; Mercier et al., 2004 ; Prioult et al., 2004 ; Mahmud et al., 2004 ; Miyauchi et al., 1997). 3.1.2. Etudes in vivo Des travaux in vivo ont évalués les effets de l’ingestion orale d’hydrolysats de protéines du lactosérum sur le système immunitaire. Pacheco & Sgarbieri (2005) ont alimenté pendant 7 semaines des souris avec une diète composée de 20% d’un CPL hydrolysé par la pancréatine, l’alcalase ou le Protamex. Leurs travaux ont démontré un effet positif sur les taux de glutathion dans le foie des souris. Selon les auteurs, ces hydrolysats pourraient avoir un effet stimulateur sur la détoxification des réactifs intermédiaires du métabolisme oxydatif. D’autre part, il est connu que le glutathion joue un rôle primordial dans l’activation et le fonctionnement des lymphocytes B et T (Wong & Watson, 1995). Les travaux de Shimizu et al. (2006) ont démontré que l’ingestion orale chez la souris pendant 6 semaines d’une ration composée à 50% d’un hydrolysat enzymatique de protéines de lactosérum, permettait de diminuer des lésions cutanées induites par Dermatophagoides preronyssinus de même que les taux d’Esélectine. Incorporé à des formules lactées spécifiques, ce type d’hydrolysat pourrait donc avoir un effet bénéfique chez les nourrissons souffrant de dermatite atopique. Saint-Sauveur et al. (2009a) ont étudié les effets de l’ingestion orale pendant 7 jours d’un hydrolysat trypsine+chymotrypsine d’IPL et de ses 3 fractions peptidiques (acide, F1 ; neutre, F2 ; basique, F3) chez des souris Balb/c saines ou infectées par E. coli O157:H7. Chez les souris saines, l’hydrolysat et les fractions peptidiques ont stimulé les niveaux sériques d’IgA. De plus, la fraction F2 (neutre) a stimulé la sécrétion d’IFN-γ dans le sang, alors que la fraction F1 (acide) l’a au contraire inhibée. Chez les souris infectées, seule la fraction F3 (basique) a permis d’accroître la production des IgA sériques en plus d’induire une augmentation de la sécrétion de TGF-β1 et ce, tant chez la souris saine que la souris infectée. Cette fraction peptidique basique (F3) pourrait donc favoriser la vigilance immunologique lors d’une infection. Chez un modèle murin souffrant d’asthme, l’ingestion d’un extrait de protéines de lactosérum enrichi en TGF-β a permis de diminuer l’inflammation des voies aériennes, des IgE sériques ainsi que la production de 24 cytokines de type Th2, alors qu’une stimulation de la production de cellules Treg a été observée (Chen et al., 2013). Kume et al. (2012) ont administré pendant 14 jours une formule contenant des protéines de lactosérum et des produits laitiers fermentés à des souris par voie entérale, avant d’induire une hépatite par la concanavaline A. Cette diète a permis d’obtenir des concentrations en TNF-α, IL-6 et IFN-γ dans le plasma, en TNF-α et IFN-γ dans le foie et en IL-6 et IFN-γ dans la rate significativement plus faibles que pour le groupe contrôle. Au niveau intestinal, Yasumatsuya et al. (2012) ont étudié l’effet de diètes contenant du lait écrémé, du lactosérum ou du lactosérum+lait écrémé chez des veaux noirs japonais durant 60 jours à compter du 3ème jour après la naissance du veau. La diète comprenant des protéines de lactosérum a permis de stimuler, de manière significative, la production d’IgA fécales après 14 jours, ce qui serait dû à une stimulation des IgA au niveau des muqueuses intestinales. Chez le rat souffrant de désordres du petit intestin, Kume et al. (2014) ont démontré que l’ingestion orale pendant 14 jours d’une diète contenant des peptides de lactosérum et des produits laitiers fermentés avait un effet protecteur. Les auteurs ont en effet observé une diminution de la formation d’ulcères et des concentrations plus faibles en IL-6 que le groupe contrôle au niveau des tissus de l’iléon. Vinderola et al. (2007) ont, quant à eux, étudié les effets de l’ingestion de lait fermenté par le Lactobacillus helveticus R389 à pH 6 pendant 2, 5 et 7 jours au niveau des muqueuses intestinales de souris BALB/c saines. Pour toutes les durées d’administration, une augmentation du nombre de cellules productrices IgA, IL-10, IL-2 et IL-6 a été démontrée. La production des sIgA totaux dans la lumière du petit intestin a été stimulée chez les souris ayant reçu le produit pendant 2 jours, de même que la production d’IL-6 par les cellules épithéliales du petit intestin après 7 jours d’ingestion. Chez le porcelet prématuré, différentes diètes composées de concentrés de protéines de lactosérum ont permis d’aider à la maturation de leur intestin, c’est-à-dire au développement de leur structure intestinale ainsi que de leur capacité à digérer et absorber les nutriments (Li et al., 2013). Quelques travaux ont aussi étudié les effets in vivo d’hydrolysats enzymatiques de protéines de lactosérum purifiées. Par exemple, l’étude de Biziulevicius et al. (2006) a démontré une augmentation de la phagocytose par les macrophages péritonéaux chez des souris BALB/c, et ce, après l’ingestion pendant 5 jours d’hydrolysats de β-LG fabriqués à partir de la pepsine, trypsine, chymotrypsine ou pancréatine. Aussi, Wang et al. (2000) ont étudié les effets de l’ingestion orale d’un hydrolysat pepsique de LF. Ce régime a été administré pendant 3 jours à des souris souffrant d’un cancer du côlon. Les auteurs ont observé une augmentation importante des cellules NK, des LT CD4+ et CD8+ et des LB IgA+ et IgM+ au niveau des tissus lymphoïdes et de la lamina propria de l’intestin grêle. L’ingestion de l’hydrolysat de LF aurait donc un effet immunomodulateur au niveau de la muqueuse intestinale. 25 Globalement, ces études in vivo semblent démontrer que l’ingestion orale d’hydrolysats enzymatiques de protéines de lactosérum ou leurs fractions peptidiques a bien des répercutions tant sur l’immunité innée (Biziulevicius et al., 2006) que l’immunité adaptative (Pacheco & Sgarbieri, 2005 ; Wang et al., 2000 ; Shimizu et al., 2006 ; Saint-Sauveur et al., 2009a). 3.2. Peptides issus de la β-lactoglobuline Peu d’études in vitro ou in vivo ont évalué les effets immunomodulateurs de peptides issus des protéines majeures du lactosérum, essentiellement de la β-LG et l’α-LA. Les travaux de Jacquot et al. (2010) ont étudié les effets in vitro de séquences peptidiques de la β-LG sur la prolifération de splénocytes murins et la sécrétion de cytokines en présence ou en absence de ConA. Il a été démontré que les peptides β-LG f1520, f55-60, f84-91, f92-105 et f139-148 stimulent la croissance des splénocytes murins en absence de ConA, mais seuls les fragments f15-20, f55-60 et f139-148 stimulent aussi la prolifération de ces cellules en présence de ConA. Par contre, les fragments f102-105 et f104-108 ont montré un effet inhibiteur sur la prolifération cellulaire. D’autre part, les peptides β-LG f15-20, f55-60 et f139-148 modifient le profil des cytokines sécrétées de manière très variée. La séquence β-LG f15-20 stimule la production d’IL-4 et IFN-γ en absence de ConA. En présence du mitogène, aucun effet significatif n’a été observé. En absence de ConA, le fragment f55-60 inhibe la production d’IFN-γ tandis qu’en présence de ConA, il inhibe celles de l’IL-4 et IL-2. Enfin, le peptide f139-148 favorise la synthèse d’IFN-γ en absence et en présence de mitogène ainsi que la production d’IL-4 en présence de ConA. Saint-Sauveur (2009b) a caractérisé par LC-MS les peptides contenus dans les fractions issues d’un hydrolysat trypsine+chymotrypsine d’IPL, lesquelles avaient précédemment montré un effet stimulateur sur la prolifération des splénocytes murins et la sécrétion de certaines cytokines (Saint-Sauveur et al., 2008). Cinq peptides issus de la β-LG ont ainsi été identifiés et étudiés de façon plus spécifique dans un modèle de splénocytes murins ex vivo. Les résultats ont démontré que les fragments β-LG f9-14, f96-99, f146-148 et f139-141 stimulent la prolifération des splénocytes, tandis que le peptide β-LG f33-40 l’inhibe. De plus, les peptides β-LG f9-14 et β-LG f96-99 stimulent la sécrétion de cytokines anti-inflammatoires (réponse de type Th2), alors que le fragment β-LG f146-148 induit la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires (réponse de type Th1). Le peptide β-LG f96-99 semble donc associé à des effets anti-inflammatoires. Une étude ultérieure a donc été réalisée chez des souris saines (Hébert-Leclerc, 2011) afin d’évaluer les effets immunomodulateurs de ce peptide, sous forme purifiée, suivant son ingestion orale pendant 7 jours selon 3 doses (0,1, 0,25 et 0,5 mg par jour). Aux doses 0,1 et 0,5 mg par jour, ce peptide a entrainé une augmentation significative des quantités d’IgA mesurées dans les fèces, sans toutefois modifier les niveaux d’IgA sériques. De plus, la production d’IL-4 par les splénocytes a été stimulée pour la dose de 0, 25 mg/j, alors qu’aucun changement significatif n’a été observé dans le cas de l’IL-2, IL-17 et IFN-γ. Le peptide β-LG 26 f96-99 administré oralement aurait donc un effet stimulant sur la réponse immunitaire adaptative de souris saines. Enfin, les travaux de Pecquet et al. (2000) ont montré que certaines fractions peptidiques présentes dans un hydrolysat de β-LG induisaient une tolérance humorale, mucosale et cellulaire après leur ingestion orale chez la souris. Les auteurs ont identifié deux fractions, la première riche en peptides β-LG f84-91, f9299,100 et f125-138 et l’autre fraction riche en f(61,62-69):S–S:(149-162). Ces deux fractions entraînaient l’inhibition de la production d’IgE sériques anti-β-LG, la prolifération de splénocytes spécifiques à la β-LG, ainsi qu’une réponse de type hypersensibilité retardée. Les auteurs ont donc suggéré que ces fractions induisaient la tolérance orale envers la β-LG et réduisaient son potentiel allergénique. Ces diverses études montrent donc que différentes séquences peptidiques dans la β-LG peuvent présenter des effets très variables sur la réponse immunitaire. 3.3 Peptides issus de l’α-lactalbumine Différents peptides issus de l’α-LA ont été identifiés et caractérisés pour leurs effets sur le système immunitaire dans le cadre d’études in vitro ou in vivo. En outre, les peptides α-LA f18-19, f50-51 (Tyr-Gly) et f18-20 (Tyr-Gly-Gly) augmenteraient de manière significative la prolifération de lymphocytes sanguins humains stimulés par la ConA (Kayser & Meisel, 1996). D’autre part, les travaux de Jacquot et al. (2010) ont démontré que le peptide α-LA f10-16 stimulait la prolifération des splénocytes murins avec et sans ConA, tandis que le peptide f104-108 avait un effet inhibiteur sur la prolifération des mêmes cellules (Jacquot et al., 2010). Le fragment α-LA f51-53 (Gly-Leu-Phe) permettrait d’amplifier l’adhérence des macrophages et la phagocytose des hématies sénescentes sur des cellules humaines (Gattegno et al., 1988), en plus d’encourager la production d’anion superoxide par les neutrophiles dans un modèle murin in vitro (MiglioreSamour et al., 1992). Dans le cadre d’études in vivo, Berthou et al. (1987) ont démontré que le même peptide (α-LA f10-16) permettait à des souris de mieux résister à une infection par Klebsiella pneumoniae et d’augmenter la phagocytose par les macrophages péritonéaux in vitro. En fait, il semble que ce peptide possède des récepteurs spécifiques sur les neutrophiles et monocytes humains (Jaziri et al., 1992). Enfin, Tsuruki & Yoshikawa (2005) ont démontré que chez des rats nouveau-nés, ce fragment prévient l’alopécie induite par l’étoposide, agent anticancéreux, suite à son administration par injection ou ingestion orale. Ces études démontrent que les différents peptides contenus dans l’α-LA présentent des effets intéressants sur le système immunitaire aussi bien in vitro qu’in vivo. 27 Hypothèse et objectifs Des travaux antérieurs ont démontré que chez la souris saine, la stimulation de la réponse immune adaptative suite à l’ingestion du peptide β-LG f96-99 sous forme purifiée semble moins importante que lorsque des mélanges peptidiques complexes sont administrés. Le but de ce travail de recherche était donc de démontrer que l’ingestion d’un hydrolysat enzymatique de protéines de lactosérum, contenant la séquence β-LG f96-99, permettra d’accroître les effets immunomodulateurs associés à la réponse immune adaptative et ce, dans le même modèle animal (souris saines). L’hypothèse de recherche à la base de ce travail de recherche était la suivante : Chez la souris saine, l’ingestion orale d’un hydrolysat enzymatique (trypsine+chymotrypsine) d’un isolat de protéines de lactosérum contenant le peptide β-LG f96-99, stimulera la sécrétion d’IgA et l’expression de certains gènes (TGF-β, AID, TSLP et BAFF) par la muqueuse intestinale. Pour vérifier l’hypothèse de recherche et atteindre le but de ce projet, les objectifs suivants ont été définis : - Fabriquer, à l’échelle pilote, un hydrolysat enzymatique d’un isolat de protéines de lactosérum à l’aide d’un mélange trypsine+chymotrypsine. - Caractériser la composition en peptides de l’hydrolysat, notamment sa concentration en peptide βLG f96-99. - Évaluer l’effet de l’ingestion orale de l’hydrolysat sur la réponse immune chez des souris saines, et ce, par la mesure des IgA sériques, fécaux et dans la muqueuse intestinale, de même que l’expression de certains gènes (TGF-β, AID, TSLP et BAFF) par la muqueuse intestinale. 29 CHAPITRE II : EFFECT OF A HYDROLYZED WHEY PROTEIN ISOLATE ON THE IMMUNE SYSTEM OF HEALTHY MICE Rajaonary, M., Gauthier, S.F., Boutin, Y. Ce chapitre, rédigé sous la forme d’un article scientifique en langue anglaise, sera soumis à International Dairy Journal. 31 Résumé Un isolat de protéines de lactosérum (IPL) commercial a été hydrolysé avec un mélange trypsine:chymotrypsine. L’IPL hydrolysé final (IPL-H), contenant le peptide β-LG f96-99, a été administré par voie orale chez 90 souris BALB/c selon 3 doses (0, 10 ou 20 mg) pour des durées de 3, 7 et 14 jours. Les taux d’IgA sériques n’étaient pas significativement différents, excepté au jour 14 où la dose de 10 mg a généré une réponse plus élevée que le groupe contrôle. Cependant, les taux d’IgA fécales étaient significativement plus élevés au jour 3. En effet, la dose 20 mg a doublé les taux d’IgA fécales (397 mg mL– 1) comparé à la dose 10 mg (187 mg mL–1) et les a triplé comparé au groupe contrôle (133 mg mL–1). Dans les tissus intestinaux, une dose d’IPL-H plus élevée semblait également stimuler l’activation des cellules productrices d’IgA. Aucune différence significative n’a été observée aux jours 7 et 14 pour les taux IgA fécales ni pour l’expression du gène TGF-β au jour 3. Ces résultats suggèrent que l’IPL-H induit une réponse rapide et locale via la production d’IgA au niveau intestinal, alors que cette réponse est lente et faible dans le sérum. La présence du peptide β-LG f96-99 dans cet hydrolysat pourrait être associée aux effets observés. 33 Abstract A commercial whey protein isolate (WPI) was hydrolyzed with a trypsin:chymotrypsin mixture. The resulting hydrolyzed WPI (H-WPI), containing the β-LG f96–99 peptide, was orally fed to 90 BALB/c mice at 3 doses (0, 10 or 20 mg) during 3, 7 and 14 days. IgA serum levels were not significantly different, except at day 14 where the 10 mg dose generated a stronger response than the control group. However, IgA fecal levels were significantly higher at day 3. Indeed the 20 mg dose doubled the IgA fecal levels (397 mg mL–1) compared to the 10 mg dose (187 mg mL–1) and tripled them compared to the control group (133 mg mL–1). In the intestinal tissues, a higher H-WPI dose also seemed to stimulate the activation of IgA-producing cells. No significant difference was observed at day 7 and 14 neither for IgA fecal levels nor for the expression of the TGF-β gene at day 3. These results suggest that the H-WPI induce a rapid and local immune response via the production of IgA at intestinal level, while this response is slow and weak in serum. The presence of the peptide β-LG f96–99 in H-WPI could be associated to the observed effects. 34 1. Introduction Whey proteins (WP) are known for their nutritional value and high digestibility (de Wit, 1998). WP also contain in their primary sequences many peptides that have been associated with various biological activities such as opioid, antihypertensive, antithrombotic, antimicrobial, antiviral, antioxidant, insulinotropic and immunomodulatory effects (Gauthier et al., 2006 ; Madureira et al., 2010). These bioactive peptides can be released from the whole protein sequence by enzymatic hydrolysis. Immunomodulatory effects of whey proteins, their hydrolysates and peptides have been demonstrated in numerous studies (Miyauchi et al., 1997; Wong et al., 1998; Mahmud et al., 2004; Mercier et al., 2004; Prioult et al., 2004; Biziulevicius et al., 2006; Saint-Sauveur et al., 2008, 2009a; Saint-Sauveur, 2009b; Jacquot et al., 2010; Hébert-Leclerc, 2011). For example, β-LG hydrolysate and its peptidic fractions can stimulate the proliferation of murine spleen cells in vitro (Wong et al., 1998; Mahmud et al., 2004; Prioult et al., 2004). WP can also modulate the cytokine response. Miyauchi et al. (1997) showed that a lactoferrin hydrolysate not only stimulated the murine splenocyte proliferation but also increased the production of IgM, IgG and IgA. The increase of IgA levels has also been observed in Peyer’s patches. Different hydrolyzed pressurized WPIs had an inhibitory effect on IL-8 secretion by intestinal epithelial cells and respiratory epithelial cells stimulated by LPS, suggesting anti-inflammatory effects (Piccolomini et al., 2012; Iskandar et al., 2013). In vivo, hydrolyzed WP have been shown to improve gluthation levels in mice liver (Pacheco & Sgarbieri, 2005), which plays a key role in the activation of LB and LT (Wong & Watson, 1995). The ingestion of WP enriched with TGF-β can reduce airway inflammation, serum IgE, Th2-type cytokines and increase the production of Treg cells (Chen et al., 2013). Kume et al. (2014) also showed that the oral ingestion of whey peptides and fermented dairy products had a protective effect on rat small intestines as fewer ulcers appeared and IL-6 levels were reduced in the ileum. The oral ingestion of fermented milk and whey proteins in mice can also stimulate the IgA production in the intestinal mucosa and the IgA levels in feces (Yasumatsuya et al., 2012; Vinderola et al., 2006, 2007). Saint-Sauveur et al. (2008) showed that three peptide fractions (acid, neutral and basic) separated by isoelectric focusing from a trypsin:chymotrypsin hydrolysate of a WPI enhanced IgA serum levels in both healthy and Escherichia coli-infected mice after being orally fed 3 mg per day during 7 days. The basic peptide fraction also significantly increased TGF-β1 serum levels. IgA serum levels decreased back to baseline levels after the mice stopped being fed with the fractions for a week. Bioactive peptides were identified and characterized to study each of their effects. For instance, β-lactoglobulin peptides fragments f9-14 and f96-99 stimulated an anti-inflammatory response by producing Th2-type cytokines while β-LG 35 f146-148 peptide stimulated a pro-inflammatory response by producing Th1-type cytokines. The previous basic peptide fraction was shown to contain the β-LG f96–99 peptide (Saint-Sauveur, 2009b). Hébert-Leclerc (2011) further evaluated the effect of oral ingestion of 0.1, 0.25 and 0.5 mg of pure β-LG f9699 peptide during 7 days in healthy mice on their immune response. The peptide had no effect on IgA serum levels but induced an increase in IgA fecal levels with the 0.1 and 0.5 mg doses. In a murine splenocyte culture, this peptide stimulated the production of IL-4 with the 0.25 mg dose. Those studies suggest that the β-LG f96-99 has a stimulatory effect on mice immune system. However, those results were obtained from a synthesized peptide and its immunomodulatory effect has yet to be demonstrated in complex hydrolysates as they offer a better potential as nutraceutical ingredients. In the present study, mechanisms of mucosal IgA-induced production by H-WPI, containing the peptide β-LG f96-99, were further investigated in order to better characterize the modes of action of whey peptides on the intestinal immune system. 36 2. Material and methods 2.1. Materials Commercial whey protein isolate (WPI, BiPRO™, 94.3 % protein, dry basis) was supplied by Davisco Foods International Inc. (Le Sueur, MN, USA). Alpha-lactalbumine (-La, purity of 90 %) and β-lactoglobulin (-Lg, purity > 85 %) from bovine milk were obtained from Sigma-Aldrich (St-Louis, MO, USA). Peptide -Lg f96– 99 (purity of 94.5 %) was custom-synthetized by AnaSpec (Fremont, CA, USA). Peptide purity and identity were confirmed by analytical reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) and mass spectrometry (MS). Bovine pancreas trypsin VI (2820 USP Units mg–1 of trypsin activity and 414 USP Units mg–1 of chymotrypsin activity) and bovine pancreas chymotrypsin XI (1365 UPS Units mg –1 of chymotrypsin activity and 1360 UPS Units mg–1 of trypsin activity) were bought from Neova Technologies Inc. (Abbotsford, BC, Canada). Beta-mercaptoethanol was obtained from Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA). Orthophthaldialdehyde, D-L-leucine, sodium tetraborate decahydrate were from Sigma-Aldrich. Bio-Rad Polypeptide SDS-PAGE Molecular Weight Standards were at 26.625, 16.950, 14.437, 6.512, 3.496, and 1.423 kDa. All other chemicals were of analytical grade. For RP-HPLC analysis, HPLC-grade water (PureLab Ultra, Elga Labwater, Marlow, UK) was used to prepare the buffers and mobile phases, which were filtered through 0.2 µm nylon membranes (Whatman, Dassel, Germany). Sterile phosphate-buffered saline (PBS) was from Sigma-Aldrich. Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets were from Roche Diagnostics (Indianapolis, IN, USA). J774A.1 monocyte/macrophage cells from BALB/c mouse and Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with 4 mM L-glutamine (DMEM-10) modified to contain 4.5 g L–1 glucose and 1.5 g L–1 sodium bicarbonate, supplemented with 10 % fetal bovine serum were obtained from American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). 2.2. Preparation of WPI hydrolysate WPI was solubilized overnight in water (10 % w/w, protein basis) added with 0.01 M CaCl2 under stirring at 4°C. The next day, the temperature of the solution (100 kg) was raised at 42°C then the pH was adjusted to 8.0 with a mixture of 2 N NaOH:KOH (1:2). The hydrolysis reaction was started by adding a mixture of trypsin VI:chymotrypsin XI (1:1) in order to obtain a final enzyme:substrate ratio of 1:200 (wt/wt). During the reaction, the solution was maintained at pH 8.0 by adding 2 N NaOH:KOH until a DH of 6 % was reached according the pH-stat technique (Adler-Nissen, 1977). Thereafter, caustic addition was stopped and DH was 37 measured by osmometry in order to limit the total amount of salt in the hydrolysate. Osmolality was measured using an Advanced™ Micro-Osmometer (model 3300, Advanced Instrument Inc, MA, USA). When DH reached a stable value (8.5 %), enzymes and non-hydrolyzed proteins were separated at 50 °C and 4.14 bars using a pilot ultrafiltration (UF) system (GE Niro, Hudson, WI, USA) equipped with a polyethersulfone spiral-wound membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 10 kDa (Osmonics, Vista, CA, USA). The retentate was concentrated to a 2X volume concentration factor and the UF-permeate, so called hydrolyzed WPI (H-WPI), was freeze-dried. 2.3. Chemical analyses Total solids, moisture and ash contents were determined in triplicate (AOAC, 1990, No. 927.05 and 930.30). Fat content was measured in triplicate using the Mojonnier gravimetric extraction method (AOAC, 1990, No. 989.05) and the lactose content was determined in triplicate by HPLC (IDF 198:2007). Total nitrogen content of WPI and its hydrolysate were determined in duplicate by the Dumas combustion method using a Truspec N (Protein) (Leco Corporation, MI, USA). A nitrogen conversion factor of 6.38 was used to calculate the total protein content. Proteins/peptides profiles of WPI and H-WPI were analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) using a Tris-Tricine Precast Gel 10–20 % (Bio-Rad Laboratories Inc.). Diluted samples (10 µL) were loaded onto the gel at the following concentrations: H-WPI (2.5, 5.0, 10 mg mL–1), WPI (2.5 mg mL–1), α-La and β-Lg (1 mg mL–1) and MW Standards (5 µl of a 1:20 dilution). Migration, staining (Coomassie-blue) and destaining were performed according to standard procedure (LaemmLi, 1970). 2.3.1. Reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis H-WPI was analyzed by RP-HPLC using an Agilent 1100 Series system (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) consisting of an auto-sampler (G1329A), two pumps (bin G1379A), and a UV-Vis detector (G1314A) adjusted at 214 nm. H-WPI sample was analyzed with a Luna 5 µm C18(2) column (2 i.d. × 250 mm, Phenomenex, Torrance, CA). Solvent A was composed of 0.1 % (v/v) trifluoroacetic acid (TFA) in water and solvent B consisted of 90 % (v/v) acetonitrile and 0.1 % (v/v) TFA in water. H-WPI was solubilized in solvent A (1 mg mL–1) and 50 µL were injected onto the column. The sample was eluted at a flow rate of 0.2 mL min–1 using a linear gradient of solvent B ranging from 0 to 1 % for 1 min, 1 to 40 % from 1 to 90 min, 100 % from 90 to 125 min, and 100 to 0 % from 125 to 150 min for re-equilibration of the column. Data were acquired with Chem Station software (B.01.03, Agilent Technologies). 38 The presence of β-lg f96-99 in H-WPI was confirmed by spiking the sample using the synthetized peptide. Concentration of this peptide in H-WPI was determined by extrapolating the area of its peak from a eightlevel calibration curve prepared with the pure peptide (0.02 to 0.28 mg mL–1). 2.3.2. Endotoxin measurement Endotoxins in the H-WPI were measured with Limilus Amebocyte Lysate (LAL) PYROGENT™ Single test Vials and E. coli O55:B5 Endotoxin as positive control from Lonza (Walkerville, MD, USA). Analyses were performed in triplicate following the supplier’s instructions. 2.4. Mice protocol Specific-pathogen-free, 8 to 9-week-old female BALB/c mice were obtained from Charles River (StConstant, QC, Canada). All animal procedures were performed or supervised by qualified technicians following standard operation methods established by the Canadian Council on Animal Care (CCAC). The experimental protocols were accepted by the Comité de protection des animaux du Cégep de Lévis Lauzon accredited by the CCAC. The mice were housed in group of four in ventilated cages with a 12 h light/dark cycle in a temperature-controlled environment (22 ± 2°C). They were fed ad libitum with a standard whey protein free rodent chow (LabDiet® JL Rat and Mouse/Auto 4F 5K54, Ren's Feed & Supply Ltd., Aberfoyle, ON, Canada) and had free access to water throughout the experiment. After four days of acclimatization, 90 mice were randomLy assigned to one of the nine experimental groups defined by a combination of two factors: dose and time. Mice received by gavage either 0.3 mL of sterile PBS (control) or 10 mg or 20 mg per day of the H-WPI suspended in 0.3 mL of sterile PBS during 3, 7 or 14 days. Thus, 10 mice were randomLy assigned to each dose × time combination. At the end of the gavage period (days 3, 7, and 14), mice were anaesthetized with IsoFlo isofluorane and 0.6 mL of blood was withdrawn via cardiac puncture. Blood was centrifuged (1000 × g, 4°C, 10 min) and serum was stored at – 80°C until analysis. Peyer’s patches were collected and transferred in RNA later® (LifeTechnologies, Carlsbad, CA, USA). Samples were incubated 18 to 24 hours at 4°C, then supernatant was removed and Peyer’s patches were stored at –80°C. Feces were withdrawn from the colon, weighed and frozen at –80°C. Frozen feces were lyophilized by speed-vac and suspended in 1 mL sterile PBS supplemented with protease inhibitor. Samples were kept at room temperature for 15 min then centrifuged at 15 700 × g, 4°C during 15 min. Supernatants were collected and frozen at –80°C. 2.5. IgA determination in serum and feces Total IgA in serum and feces were measured by sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) using Mouse IgA ELISA Quantitation Set provided by Bethyl Laboratories inc. (Montgomery, AL, USA). The 39 analysis was performed following the supplier's instructions. Plates were washed with Tecan Hydrospeed (Grödig, Austria, EU). Serum and feces samples were diluted 1:1000. All samples were analyzed in triplicate and mean values were used. IgA concentrations were extrapolated from a standard curve (15.6 to 1000ng mL–1). Absorbance of each sample was measured at 450 nm using Infinite M1000 spectrophotometer plate reader (Tecan). The detection limit was 15.6 ng mL–1. 2.6. RNA extraction Peyer’s patches were homogenized using Precellys soft tissue CK14 tubes and a Precellys®24 at 5000 rpm, 2 x 5 sec (Bertin Technologies, Montigny-le-Bretonneux, France, EU). RNA was extracted using Rneasy© Mini Kit supplied by Qiagen (Germantown, MD, USA). The analysis was performed according to the supplier’s instructions. Concentration and 260/280 nm and 260/230 nm ratios were determined using the Nanodrop Spectrophotometer ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA). Quality of the extracted RNA was analyzed using Agilent RNA 6000 Nano Reagents Part I for use with Agilent 2100 Bioanalyzer following Agilent RNA 6000 Nano Assay Protocol (Agilent Technologies). 2.7. Determination of genes expression RNA was transcribed into cDNA using Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Quantitative PCR (qPCR) was performed on the cDNA previously obtained. Primers for housekeeping genes HPRT, GUS B, HMBS, PPIA, and genes TGF-β, TSLP, AID, BAFF were obtained from Qiagen. GUS B was chosen as reference gene. The analysis was done using RT² SYBR® Green qPCR Mastermix (Qiagen) on Stratagene Mx3000P Multiplex quantitative PCR system (Agilent Technologies). Procedures from the supplier were followed. Data were analyzed using the RT² Profiler PCR Array Data Analysis version 3.5 by Qiagen (http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php). 2.8. Immunohistochemistry Intestinal tissues were wrapped in Optimal Cutting Temperature (OCT) in cryostat and frozen at –80°C. Tissues were sliced into 5 µm cuts with cryostat between –15 to –23°C. Cuts were mounted on SuperFrost++ slides (two cuts per slide for negative control). Slides were stored at –80°C. Cuts were let drying and adhering for 30 min at room temperature and rinsed with a Signet 1X+0.1% Tween-20 buffer. They were then fixed with 10 % cold neutral Formaline (4°C) for 8 min, rinsed with the Signet 1X+0.1% Tween-20 buffer and incubated 2 × 5 min in the buffer for rehydratation. Peripheries of cuts were dried with KimWipes and 70 µL of Goat pAb to Ms IgA (Biotin) antibody (Abcam, Cambridge, UK) diluted 1/600 in Signet 1X+BSA buffer (0.5 g BSA fraction V in 10 mL Signet 1X buffer) was added. Slides 40 were incubated 2 hours at room temperature then rinsed with Signet 1X+0.1 % Tween-20 buffer and incubated 3 × 5 min in the buffer. Peripheries of cuts were dried with KimWipes and 70 µL of Streptavidine Alexa Fluor 555 conjugate (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) diluted 1/500 in Signet 1X+BSA buffer (0.5 g BSA fraction V in 10 mL Signet 1X buffer) was added. Slides were incubated 30 min in the dark. Peripheries of cuts were dried with KimWipes and slides were mounted with 30 µL of Prolong Gold+DAPI (Invitrogen). Slides were let drying in the dark overnight before their microscopic analysis. 2.9. Fluorescence microscope analysis Slides were analyzed with Zeiss Axio Observer.Z1 inverted microscope with Apotome Optical Sectioning and Zen pro 2012 software. Pictures were taken with the AxioCamMR3 camera and EC Plan-Neofluar 40X/0.75 M27 objective (Zeiss, Oberkochen, Germany). DAPI was measured at an excitation wavelength of 353 nm and emission wavelength of 465 nm. Streptavidine was measured using the Rhodamine filter at 553/568 nm. Pictures of the entire cuts were taken via tiling. Pictures were processed with stitching. Automatic count was done on DAPI-marked cells and Streptavidine-marked cells. 2.10. Effect of H-WPI on J774 cells 2.10.1. Seeding and activation of cells J774A.1 cells were harvested by scraping and brought to a 1.5 × 105 cells mL–1 solution in DMEM-10 cell medium. Cell suspension (500 µL) was dispensed into wells of a 48-well plate and incubated 24 hours at 37°C, 5 % CO2. Wells were then emptied of the medium by aspiration. H-WPI was dissolved in DMEM-10 in 6 concentrations ranging from 0.32 µg mL–1 to 1 mg mL–1. Each concentration was distributed in triplicate into the plate. LPS solution (100 ng mL–1) was used as positive control and DMEM-10 as blank. Plate was incubated 24 hours at 37°C, 5 % CO2. Plate was centrifuged 10 min at 200 × g and supernatants were transferred to a new 48-well plate and kept at –80°C. 2.10.2. IL-6 determination in supernatants Total interleukin 6 (IL-6) in supernatants was measured by sandwich ELISA using DuoSet® ELISA Development kit for mouse IL-6 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). The analysis was performed following the supplier's instructions. Plates were washed using a Tecan Hydrospeed. Samples were analyzed at their original concentration and at a 1:10 dilution. All samples were analyzed in triplicate and mean values were used. IL-6 concentrations were extrapolated from a standard curve (15.6 to 1000 pg mL– 1). Absorbances of each sample were measured at 450 nm using Infinite M1000. Results were under the detection limit (15.6 pg mL–1). 41 2.11. Statistical analyses Results are presented as mean values ± standard error of the mean (SEM). Data were analyzed by one way analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey-Kramer’s multiple comparisons. Statistical analyses were performed using SAS 9.3. RT-PCR results were first analyzed with the ROUT (Robust regression and Outlier removal) method (Q=1%) using GraphPad Prism 5 to identify outliers. Three mice were excluded from the analysis. Results are expressed as mean values ± SEM and a p < 0.05 was considered significantly different. 42 3. Results and discussion 3.1. Composition of the H-WPI Table 1 presents the chemical composition of the H-WPI, which is essentially composed of proteins (peptides) and ash. H-WPI contained very low amount of fat and lactose which reflected those in WPI. Its high content in ash resulted from the adjustment of pH with 2 N NaOH:KOH during the hydrolysis followed by UF separation of the hydrolysate at the end of the reaction. Ash and peptides passed through the membrane and reached the UF permeate. The degree of hydrolysis of the H-WPI was determined at 8.5% using the combination of the pH-stat and osmometry techniques, which indicates that whey proteins were moderately hydrolyzed. Table 1: Chemical composition of hydrolyzed-whey protein isolate (H-WPI) on dry solids basis (wt/wt). Component Composition (%)1 Protein 88.90 ± 0.11 Fat < LD2 Lactose 0.03 ± 0.00 Ash 7.62 ± 0.02 Total solids 96.55 ± 0.01 1 2 Values are means ± SD of triplicate measurements, except for protein content which was measured in duplicate. LD = Limit of detection SDS-PAGE profile of the WPI and H-WPI (Figure 1) shows no intact protein remained in the hydrolysate since no protein band appeared onto the gel in H-WPI wells (D, E and F) even at the highest concentration tested for the hydrolysate (10 mg mL–1). In fact, β-lactoglobulin and α-lactalbumin, which are the two main proteins observed in the WPI (well G) used for the preparation of the hydrolysate, are absent in H-WPI (wells D, E, and F). In addition, we observed that H-WPI probably contained very short peptides since no peptide band appeared in the region of the lowest molecular weight standards (6.5 and 3.4 kDa). UF separation of the hydrolysate using a membrane with a MWCO of 10 kDa could explain the absence of protein and large peptide in the H-WPI. 43 kDa 26.6 16.9 14.4 6.5 3.4 A B C D E F G Figure 1: SDS-PAGE profiles (Tris-Tricine gel) of A) molecular weight standard, B) β-lactoglobulin (1 mg mL–1), C) α-lactalbumin (1 mg mL–1), D) hydrolyzed-whey protein isolate (H-WPI, 2.5 mg mL–1), E) H-WPI (5 mg mL–1), F) H-WPI (10 mg mL–1), and G) WPI (2.5 mg mL– 1). Figure 2 shows the RP-HPLC profile of the H-WPI. The peak corresponding to the peptide β-LG f96-99 was identified by spiking using the same peptide that was chemically synthesized (purity of 94.5%). As expected, the peptide β-LG f96-99 eluted at the beginning of the chromatogram because its hydrophilic amino acids composition (Asp96–Thr–Asp–Tyr99). From the calibration curve, the concentration of the peptide in H-WPI was estimated at 1.96% (wt/wt). Therefore the dose at 10 mg of H-WPI contains 0.196 mg of β-LG f96-99 while 0.392 mg of the peptide is present in the dose at 20 mg. 44 Area 60000 R = 0.99991 50000 40000 30000 20000 10000 0 0 0,1 0,2 β-LG f96-99 (mg mL–1) 0,3 β-Lg f96-99 Figure 2: Reversed phase-high performance liquid chromatography (RP-HPLC) profile of hydrolyzed-whey protein isolate (H-WPI). The peak corresponding to the peptide β-LG f96-99 was identified by spiking using the same sequence chemically synthesized, which was also used to prepare the calibration curve (insert) used for the quantification of the peptide in H-WPI. 45 3.2. Immunomodulatory effects of H-WPI The immunomodulatory effects of H-WPI were tested in mice at three oral doses (0, 10 or 20 mg) per day for 3, 7 or 14 days. Using the revisited dose translation formula from animal to human (Regan-Shaw et al., 2008), doses at 10 mg and 20 mg per day of H-WPI for the mice is equivalent to 2.8 g and 5.7 g per day for a 70 kg human, respectively. These H-WPI doses are relatively low compared to those suggested by whey protein powder-producing companies. For example, the WPI serving size suggested on some companies web site is 22 g for BiPro (BiPro USA, 2012) and 10 g for Immunocal (Immunotec, 2014). Immunocal is a WPI formulated to maintain the immune system. A study showed that the ingestion of 20 g a day of Immunocal improved gluthatione status in young adults with cystic fibrosis (Grey et al., 2003). Throughout the gavage period, no significant difference was measured in mice body weight between peptide dose treatments and PBS control (data not shown). Also, no other difference was observed in behaviour or health state of mice between groups during the gavage period. Since LPS endotoxins in H-WPI could influence the immune response, their concentration in H-WPI was determined at 0.48 EU mL–1 (or 24 EU g–1) using Limilus Amebocyte Lysate (LAL) test and E. coli O55:B5 Endotoxine as positive control. This value is very low compared those found in commercial products. For instance, Townsend et al. (2007) showed that endotoxin levels in powdered infant milk formula ranged from 40 to 5.5 104 EU g–1. In addition, the allowable endotoxin limit for sterile and non-sterile water for injection is 0.25 EU mL–1 and the limit for bacteriostatic water for injection is 0.5 EU mL–1 (USP-NF, 2014). Nevertheless, as the immune system is sensitive to endotoxins (Martich et al., 1993; Copeland et al., 2005), we analyzed the effect of the H-WPI on the IL-6 production by J774A.1 cells in order to confirm the LAL test results (data not shown). J774A.1 cells are macrophage type cells from BALB/c mice that produce IL-6 when activated by LPS (Martin & Dorf, 1990). The H-WPI had no effect on the IL-6 secretion (results not shown). Therefore the quantity of LPS found in the H-WPI was not important enough to activate macrophages. The observed effect of the H-WPI on the immune system of mice was thus theoretically not related to its LPS concentration but rather to its peptide content. 3.2.1. Effect of H-WPI on IgA levels in serum and feces Figure 3 shows the total IgA levels in serum (Figure 3A) and feces (Figure 3B) measured after 3, 7 or 14 days of gavage with the three H-WPI doses tested (0, 10, 20 mg). For the 0 mg dose (control), only PBS was administered. Three days of H-WPI ingestion did not significantly increase IgA levels in serum compared to the control group. However, a tendency can be noted as the difference between the control group and the 20 mg group is close to significance level (p=0.0797). No significant difference was observed 46 in IgA serum levels at day 7, while a significant increase (p<0.05) in IgA secretion was observed between PBS group and the 10 mg dose at day 14. Saint-Sauveur et al. (2009a) previously showed that healthy mice fed by gavage for 7 days with 3 mg of a whey peptide fraction containing the β-LG f96-99 peptide had their IgA serum levels doubled compared to the control group. Seven days after the ingestion of the peptidic fraction, IgA levels in serum were back to baseline levels. A similar effect has been observed on mice infected by E. coli O157:H7 after a 7-day gavage with the same whey peptide fraction (Saint-Sauveur, 2009a). One and seven days after the infection, IgA levels were also significantly increased in serum. As the concentration of β-LG f96-99 in the fraction was not measured by Saint-Sauveur et al. (2009a), it is difficult to compare our results to those of these authors and explain why no significant difference was observed on day 7 even though our hydrolysate doses were higher. In Saint-Sauveur et al. (2009a) study, the protein substrate was a WPI obtained by membrane process whereas in our study, the WPI was obtained by ionic exchange. Their protein profiles were different, in particular in GMP concentration, even though both hydrolysates were obtained in similar conditions. For instance, both hydrolysis were started using the same enzyme:substrate ratio of 1:200 (w/w) and stopped when DH reached a stable value measured by osmometry, indicating that the substrates had been hydrolyzed to their maximum. Nevertheless, the other whey peptides present in the fraction may have a great influence on the intensity of the immune response as Saint-Sauveur (2008) found that two other whey peptide fractions, not containing the β-LG f96-99 peptide, also increased the IgA serum levels in healthy mice. On the other hand, the oral ingestion 0.1, 0.25 and 0.5 mg of pure β-LG f96-99 for 7 days in healthy mice had no incidence on IgA serum levels (HébertLeclerc, 2011), which is consistent with our results since our H-WPI doses contains almost equivalent quantity of β-LG f96-99 (0.196–0.392 mg) compared to the Hébert-Leclerc’s study. The ingestion of the HWPI thus seems to induce a slow and weak response on IgA serum levels. Regarding IgA fecal levels (Figure 3B), a three-day gavage induced a very strong increase in IgA fecal levels. At day 3, the 20 mg dose doubled the IgA levels in feces (397 µg mL–1) compared to the 10 mg dose (187 µg mL–1; p<0.01) and tripled them compared to the control group (133 µg mL–1; p<0.001). The 20 mg dose after a 3-day gavage gave a significantly stronger response from all doses after a 7-day gavage and from the 20 mg dose after a 14-day gavage (p<0.01, results not shown). No significant difference was observed between the control group and the two doses of peptides at day 7 and day 14. Hébert-Leclerc (2011) though noted a significant increase in IgA fecal levels with a 7-day gavage of 0.1 and 0.5 mg of pure β-LG f96-99 per day in healthy mice. The interaction of other peptides in our H-WPI could explain why we did not get similar results on day 7. Our results indicate that the H-WPI effect was fast (3 days) with a high peptide dose (20 mg) and that its efficiency decreased when the gavage period is extended. The fact that differences were observed in IgA fecal concentration and not in IgA serum concentration can be explained 47 by the fact that rapid and local immune response observed in gut often does not induce a systemic immune response (Cerruti & Rescigno, 2008). Yasumatsuya et al. (2012) also noted an effect of whey proteins on IgA production at the intestinal level. Japanese Black calves were fed a diet with whey proteins for 60 days from their birth. After 14 days, IgA fecal production was significantly increased which should be linked to a stimulation of IgA producing cells in intestinal mucosa. Although the whey proteins used were not hydrolyzed, their pancreatic digestion should theoretically lead to the release of the β-LG f96-99 peptide. -1 IgA concentration (ug mL ) 800 A) 0 mg 10 mg 600 20 mg 400 200 0 800 -1 IgA concentration (ug mL ) * p=0.0797 3 7 Days 14 0 mg B) 10 mg 600 *** ** 20 mg 400 200 0 3 7 Days 14 Figure 3: IgA levels in A) serum and B) feces of mice after the gavage during 3, 7 and 14 days with PBS (control group 0 mg) or two doses of the hydrolyzed-whey protein isolate (10, 20 mg). Values are the means ± SEM (n=10). Significant differences (* p<0.05, ** p<0.01 and *** p<0.001) between groups are indicated. 48 3.2.2. Effect of H-WPI on cytokines expression As previous results only demonstrated a strong response in fecal IgA levels at day 3, only mice that received the H-WPI for 3 days were used to further investigate its impact on the immune system at the intestinal level. Figure 4 shows the expression of the genes coding for TGF-β, AID, TSLP and BAFF as determined by RT-qPCR on mice Peyer’s patches RNA after a 3 day gavage period with 0, 10 or 20 mg of the H-WPI. Results are expressed as foldchange compared to baseline. Foldchange values greater than one indicate an up-regulation while foldchange values less than one indicate a down-regulation. Transforming growth factor β (TGF-β) is a cytokine present in Peyer’s patches inducing IgA class-switch recombination (CSR) and the differentiation of B cells into IgA+ B cells (Cerruti & Rescigno, 2008). CSR replace the IgH Cµ exon with another CH exon allowing the creation of IgG, IgE and IgA (Cerruti, 2008). Although IgA fecal levels were significantly higher after 3 days of gavage with the 20 mg dose (Figure 3B), no significant difference was observed for the expression of TGF-β (Figure 4A). Saint-Sauveur et al. (2009a) observed a significant increase in TGF-β1 levels in serum after a 7-day gavage with a whey protein fraction containing the peptide β-LG f96-99 and 7 days after the end of gavage. The difference in those results may be explained by the fact that Saint-Sauveur measured the TGF-β1 levels in the serum by sandwich ELISA while we measured the expression of the TGF-β gene in Peyer’s patches. The expression of the TGF-β gene may have been stimulated when the H-WPI was first ingested and reached a sufficient level in the gut. Indeed, after the day 3, mean values for each dose are lower to 1, meaning that TGF-β gene expression has been down-regulated. Activation-induced cytidine deaminase (AID) is an enzyme required in CSR and somatic hypermutation (SHM). SHM brings point mutations into the variable region of exons increasing the affinity of the variant to the antigen (Cerutti, 2008). Concerning AID gene, the 20 mg dose induced a superior up-regulation than the 10 mg dose (p<0.05) (Figure 4B). Thymic stromal lymphopoietin (TSLP) is a cytokine derived from epithelial cells that activates dendritic cells (DCs) thus induce CD4+ T cells to produce IgA-inducing cytokines such as TGF-β1 (Cerrutti, 2008). For TSLP gene, a tendency can be observed in which a higher dose seem to induce a stronger expression of the gene. Moreover the 20 mg dose of H-WPI stimulate a significantly stronger expression than the 10 mg dose (p<0.05) (Figure 4C). Finally B-cell activating factor (BAFF) is released by DCs (Cerrutti, 2008). No significant difference was observed in the expression of BAFF gene for each dose (Figure 4D). Since no significant difference has been noted on the expression of the TGF-β gene it is not surprising to see close to no effect of the H-WPI on AID, TSLP and BAFF expression as they are all involved in TGF-β production. The effects on gene expression probably appear before 3 days and possibly in the first 24 hours, which is why less significant results have been noted. Also, the effects might have been higher if doses were more important. 49 1.5 2.5 A) B) * 1.0 Foldchange Foldchange 2.0 0.5 1.5 1.0 0.5 0.0 2.0 0 mg C) 10 mg 0 mg 10 mg 20 mg 0 mg 10 mg 20 mg D) * Foldchange Foldchange 1.5 p=0.0991 1.5 1.0 0.5 0.0 0.0 20 mg 0 mg 10 mg 20 mg 1.0 0.5 0.0 Figure 4: Genes expression of A) TGF-β, B) AID, C) TSLP and D) BAFF as determined by RT-qPCR on mice Peyer’s patches RNA after gavage during 3 days with PBS (control group) or two doses of the hydrolyzed-whey protein isolate (10, 20 mg). Values are the means ± SEM (PBS, n=10; 10 mg, n=7; 20 mg, n=10). GUS B gene was chosen as reference gene. Significant differences (* p<0.05) between groups are indicated. 50 3.2.3. Effect of H-WPI on IgA-producing cells IgA-producing cells and total cells were automatically counted on intestinal tissues cuts using immnunohistochemistry and fluorescence microscopy (Figure 5). The number of repetitions between groups was different (PBS, n=7; 10 mg, n=9; 20 mg, n=9) because some OCT blocks were not exploitable for analysis but results could still be analyzed. Results were expressed as a ratio and suggest that a higher H-WPI dose tends to stimulate the activation of IgA cells in the gut but are not statistically significant (Figure 6). This coincides with previous results showing that a higher dose leads to a higher IgA concentration in feces (Figure 3B). Vinderola et al. (2007) studied the ingestion of milk fermented by Lactobacillus helveticus R389 at pH 6 for 2, 5 and 7 days. The authors observed an increase of IgA, IL-10, IL-2 and IL-6 producing cells in intestinal mucosa for all administration times. In the small intestine lumen, total sIgA production was stimulated after 2 days as well as IL-6 production by epithelial cells for mice that received the product for 7 days. A previous study by the same authors also showed that the ingestion of milk fermented by kefir microflora stimulated the differentiation of B cells into IgA+B cells and the IgA production in both the small and large intestine (Vinderola et al., 2006). This confirms that dairy peptides can have a fast and local response in the intestine by stimulating the activation of IgA+B cells. 51 A) B) A A C) A Figure 5: Examples of intestine cuts analyzed by immunochemistry and fluorescence microscopy of A) PBS control group, B) 10 mg group, C) 20 mg group. All cells were marked by DAPI in blue (353/465 nm). IgA producing cells were marked by streptavidine in orange (553/568 nm). Magnification 40X. 52 IgA cells/total cells ratio 20 p=0.3882 15 10 5 0 0 mg 10 mg 20 mg Figure 6: Streptavidine-marked cells (IgA+ cells) on DAPI-marked cells (total cells) ratio measured on mice intestinal tissues cuts by fluorescence analysis after gavage during 3 days with PBS (control group) or two doses of the hydrolyzed-whey protein isolate (10, 20 mg). Ratios are expressed as means ± SEM (PBS, n=7; 10 mg, n=9; 20 mg, n=9). 53 Conclusion Results suggest that the H-WPI has an impact on the mice immune system at intestinal level by stimulating an anti-inflammatory response via IgA production. The H-WPI had a very strong and fast effect in the gut, especially at a high dose by increasing the IgA fecal levels. This was supported by the fact that a high H-WPI dose seemed to increase the number of activated IgA-producing B cells in the intestinal tissues. However, the expression of the TGF-β gene and other genes involved in TGF-β production showed no significant differences even at the highest dose (20 mg). The H-WPI seemed less efficient when taken on a long period. In the serum, the IgA response was very slow and became significantly different compared to the control only after 14 days. Further investigations are needed to maximize the effect of the H-WPI in the intestine by testing higher doses and shorter gavage periods. Doing the study again using the same conditions with the administration of the pure peptide β-LG f96–99 would confirm if the effects seen in our study are directly linked to this peptide or if other peptides in the H-WPI had an impact. If the β-LG f96–99 peptide is directly linked to the IgA levels increase, it would be interesting to concentrate the peptide by nanofiltrating the H-WPI, as suggested by Demers-Mathieu et al. (2013), in order to evaluate the potency of this concentrate. 55 Conclusion générale L’objectif de ce travail de recherche était d’évaluer, dans un modèle murin in vivo, l’effet de l’ingestion orale d’un hydrolysat enzymatique (trypsine+chymotrypsine) d’isolat de protéines de lactosérum, contenant le peptide β-LG f96-99, sur le système immunitaire au niveau intestinal. Cet objectif était basé sur des travaux antérieurs (Hébert-Leclerc, 2011) ayant démontré que ce peptide, sous forme purifiée, induisait une augmentation de la concentration des IgA fécales ainsi que l’expression de certaines cytokines jouant un rôle clé dans le contrôle de la réponse immunitaire dont l’IL4 suivant son ingestion orale pendant 7 jours chez des souris saines. Ces travaux étaient également basés sur ceux de Saint-Sauveur et al. (2009a), qui ont montré que chez des souris saines, l’ingestion orale pendant 7 jours d’une fraction peptidique de lactosérum contenant le peptide β-LG f96-99, doublait leur concentration d’IgA dans le sérum. Cette augmentation sérique a aussi été notée chez des souris infectées par E. coli O157:H7, un et sept jours après l’infection. Le présent travail visait donc à confirmer que des effets similaires pouvaient être observés si le peptide était présent dans un mélange peptidique complexe (hydrolysat), mais aussi à vérifier l’effet de la durée des gavages (3, 7 et 14 jours) sur les effets observés. Les travaux effectués dans le cadre de ce mémoire ont permis de confirmer, en partie, l’hypothèse de départ qui visait à démontrer que l’hydrolysat stimulerait la sécrétion d’IgA et l’expression de certains gènes (TGF-β, AID, TSLP et BAFF) au niveau intestinal. En fait, il a été démontré que l’ingestion orale de hydrolysat chez des souris saines induisait une réponse forte et rapide de type anti-inflammatoire au niveau intestinal, confirmée par une augmentation significative de la concentration des IgA fécales en fonction de la dose d’hydrolysat ingéré (0, 10 et 20 mg/jour), et ce, après seulement 3 jours ; cet effet disparaissait toutefois après 7 et 14 jours. L’accroissement des IgA fécales était accompagné par une légère augmentation du nombre de cellules B productrices d’IgA dans la muqueuse intestinale, aussi en fonction de la dose d’hydrolysat ingéré. D’autre part, l’expression du TGF-β, cytokine ayant un rôle clé dans la production d’IgA, n’a pas été modifiée de même que celle du BAFF, également impliqué dans la production d’IgA. Les expressions des cytokines AID et TSLP n’ont augmenté qu’à la dose 20 mg. Enfin, l’hydrolysat a eu un effet faible et tardif sur les taux IgA sériques, corroborant les résultats obtenus par Hébert-Leclerc (2011) qui démontraient que le peptide β-LG f96-99 sous forme purifiée, administré pendant 7 jours à des doses équivalentes (0.1-0.5 mg/jour) à celles de notre étude (0.196-0.392 mg/jour), n’avait aucun effet sur les IgA sériques. Nous pouvons donc conclure que l’hydrolysat étudié dans le cadre de ce travail influence la réponse immunitaire adaptative chez la souris saine via la production d’IgA au niveau intestinal, alors qu’il n’a pas ou peu d’effet au niveau sérique. Bien que les effets observés semblent associés à la présence du peptide β-LG 57 f96-99 dans l’hydrolysat, d’autres travaux seraient nécessaires afin de confirmer son rôle exact et surtout, le dissocier des effets des autres peptides présents dans l’hydrolysat. Une approche fastidieuse mais intéressante qui pourrait être envisagée serait de comparer les effets du même hydrolysat, avant et après une étape d’élimination du peptide β-LG f96-99 dans le produit par chromatographie en mode préparatif. Ainsi, il serait possible de comparer les effets du peptide purifié, de l’hydrolysat complet et du même hydrolysat sans le peptide β-LG f96-99. Cette étude permettrait alors d’isoler l’effet du peptide seul sur la réponse immunitaire adaptative, mais aussi de mieux comprendre l’impact des autres peptides présents dans l’hydrolysat. D’autres travaux pourraient également être réalisés en vue d’étudier des durées d’ingestion plus courtes, de même que des doses d’hydrolysat plus élevées. En effet, il est possible que le TGF-β ait été synthétisé pendant les premières 24 heures suivant l’ingestion de l’hydrolysat, ce qui expliquerait le manque de réponse observée. De plus, l’augmentation des doses permettrait possiblement d’obtenir des différences plus significatives entre les groupes. Par ailleurs, l’hydrolysat pourrait aussi être enrichi en peptide β-LG f96-99 par nanofiltration. Enfin, étant donné le potentiel immunomodulateur de l’hydrolysat, il serait pertinent d’étudier son efficacité dans un modèle pathologique d’inflammation intestinale chez la souris. 58 Bibliographie Adler-Nissen, J., 1977. Enzymatic hydrolysis of food proteins. Process Biochemistry, 12, 18–24. AOAC, 1990. Official Methods of Analysis, 15th ed. Association of Official Analytical Chemists, Washington, DC., No. 927.05. AOAC, 1990. Official Methods of Analysis, 15th ed. Association of Official Analytical Chemists, Washington, DC., No. 930.30. AOAC, 1990. Official Methods of Analysis, 15th ed. Association of Official Analytical Chemists, Washington, DC., no 989.05. Audigié, C., Dupont, G., Zonszain, F., 1992. L’immunofluorescence. 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![Suggested translation[1] He learned[2] to dress tastefully. He moved](http://s1.studylibfr.com/store/data/005385129_1-269daba301ff059de68303e1bc025887-300x300.png)
