Optique instrumentale Alexandra FRAGOLA Samuel GRESILLON Plan I. Introduction: propagation d’une onde électromagnétique, filtrage spatial II. Système optique standard : le Microscope classique III. Microscopie de fluorescence Filtrage spectral IV. Méthodes d’Imagerie contemporaines Microscopie confocale, illumination structurée V. Vaincre la limite de résolution Super-résolution et champ proche Le domaine électromagnétique Propagation-Diffraction Propagation d’une onde électromagnétique • Développement en ondes planes = spectre angulaire • Propagation= filtre passe bas des fréquences spatiales • Instrument d’Optique est caractérisé par sa fonction de transfert optique (FTO) i(x,y)= o(x,y) !h(x,y) I(u,v)= O(u,v) . FTO(u,v) Limite de résolution II. Un instrument d’optique standard : le microscope classique 1. 2. 3. 4. 5. L’œil Microscopie, principe Historique Fréquence spatiale et résolution Contrastes spécifiques: phases et interférences Exemple d’association de système optique : l’oeil Oeil = système optique complexe, comprenant : • ensemble de milieux transparents constituant un système convergent • un diaphragme d ’ouverture variable : la pupille • un système de mise au point en fonction de la distance : le cristallin • un récepteur sensible à la lumière : la rétine rétine muscles ciliaires procès ciliaires iris macul a lutea axe visuel zonul e pupille cristallin cornée humeur aqueuse procès ciliaires iris axe optique ou géométrique vitré zonule nerf optique muscles ciliaires Que peut-on voir à l’oeil nu ? B " A d "min = 5.10-4 rad (limite angulaire de résolution) dmin = 250 mm (distance minimale d’accommodation) ABmin = 125 !m # nécessité d’un instrument optique qui grossit II. Un instrument d’optique standard : le microscope classique 1. 2. 3. 4. 5. L’œil Microscopie, principe Historique Fréquence spatiale et résolution Contrastes spécifiques: phases et interférences Règles de construction géométrique B F O F’ A’ A Image réelle: située après le système optique Projetable et visible sur un écran B’ B B’ F’ A A’ O F Image virtuelle: située avant le système optique visible à l’oeil - Un rayon passant par le centre de la lentille n’est pas dévié - Un rayon parallèle à l’axe optique sort de la lentille en passant par le foyer image F’ - Un rayon passant par le foyer objet F sort en parallèle à l’axe optique. - Si deux points sont conjugués, tout rayon issu d’un de ces points passe par l’autre point. Microscope optique classique : aspects généraux Structure du microscope Microscope = 1 objectif + 1 oculaire distants de $ Structure du microscope • objectif L1 : diamètre et longueur focale f1 très petits, quelques millimètres • oculaire L2 : diamètre et longueur focale f2 de quelques centimètres • distance F1’ F2 : de l’ordre de 20 cm • microphotographie : objectif photographique placé après l’oculaire qui forme sur l’émulsion placée dans son plan focal une image réelle • échantillon déposé sur une lame ou entre lame et lamelle Grossissement B A Gmicroscope = " 250 mm !' A1B1 1 g y objectif . AB 1 AB / f 'oculaire = . = . g y objectif . ! f 'oculaire ! f 'oculaire ! ! Gmicroscope = g y objectif .Goculaire Objectif Oculaire B A1 A’B’% "’ A B1 II. Un instrument d’optique standard : le microscope classique 1. 2. 3. 4. 5. L’œil Microscopie, principe Historique Fréquence spatiale et résolution Contrastes spécifiques: phases et interférences Histoires brèves Premières lentilles : antiquité (Ninive) Lunettes de vue, loupes : XIIIe siècle (Musée de Besançon) fin du XVIe siècle : regarder « à la loupe » une image agrandie 1615 : Galilée (1564-1642) utilise un instrument à deux lentilles pour observer de petits objets 1625 : l’Accademia dei Lincei, à Rome, propose le mot microscopium Microscope de Hooke (~1670) A partir de 1660 : progrès notables avec Antoine van Leeuwenhoek (1632-1723), « microscope simple » (gros problèmes d'aberrations), et Robert Hooke (1635-1702), « microscope composé » Correction de l’aberration chromatique (à partir de 1757) 1850 Principes de base de la microscopie classique 1930 Microscope Moderne 1998 II. Un instrument d’optique standard : le microscope classique 1. 2. 3. 4. 5. L’œil Microscopie, principe Historique Fréquence spatiale et résolution Contrastes spécifiques: phases et interférences 1 Notion de fréquences spatiales d’un objet La distribution de transmission (ou de réflexion) d’un objet quelconque peut se décomposer en une somme de distributions sinusoïdales de fréquences et amplitudes différentes (principe de décomposition de Fourier). Diffraction d’une onde plane (longueur d’onde &) par un objet de transmission sinusoïdale p " " ! = n sin " p Notion de fréquences spatiales d’un objet La distribution de transmission (ou de réflexion) d’un objet quelconque peut se décomposer en une somme de distributions sinusoïdales de fréquences et amplitudes différentes (principe de décomposition de Fourier). Diffraction d’une onde plane par un objet de transmission sinusoïdale p " " Système optique = Filtre passe-bas de fréq. spatiale maximum Fmax. = (n sin !) / " = N.A. / " Fonction de transfert des fréquences spatiales Contraste C éclairage avec laser éclairage avec lampe blanche, soleil… 1/P 1 ON = pc ! La résolution dépend de l’éclairage Résolution latérale Eclairage type laser : limite de résolution période pc 1 = n sin U / ! pc Eclairage type lampe : pi 1 = 2n sin U / ! pi ! ! < résolution < 2 ON ON Résolution axiale : profondeur de champ Définition de la profondeur de champ : Plus grande distance d, comptée suivant l’axe optique, pour laquelle la netteté des détails perçus dans l’espace objet reste acceptable. Profondeur de champ Exemple : "z = n ! 2 ON 2 & = 600 nm, ON = 0.7 dans l’air (n = 1) $ z = 0.6 !m La profondeur de champ est généralement très faible en microscopie III. Microscopie de fluorescence 1. Emission de fluorescence 2. Filtrage spectral et microscopie 3. Applications Pourquoi un tel succès de l’imagerie de fluorescence en biologie ? • Performances résolution spatiale < 10 !m technique très sensible Cellule en culture Puce ADN signal de fond de fluorescence photoblanchiment adsorption non spécifique Chromosomes humains en métaphase • Marquage spécifique couplage fluorophore - biomolécule CA1 pyramidal neuron in a hippocampal slice • Limites Les fluorophores • fluorophores endogènes substances présentes dans la préparation biologique et spontanément fluorescentes (porphyrines, chlorophylle, NADH...) • fluorophores exogènes colorants organiques fluorescéine, coumarines... fluorescents : rhodamine, matériaux inorganiques : verres dopés, nanoparticules de semi-conducteurs... Diagramme de Jablonski S2 Transferts non radiatifs S1 T1 Absorption Emission de fluorescence Phosphorescence S0 Efluo < Eabs "fluo > "exc S2 Spectre d’absorption S0 Emission de fluorescence Absorption S1 Spectre d’émission Spectres d’absorption / d’émission Le microscope de fluorescence • microscope classique • lumière d’excitation filtrée UV, bleu ou vert source : lampe filtrée, laser Sources d’excitation Lampe Laser Le microscope de fluorescence • filtrage de l’émission de fluorescence : miroirs dichroïques, filtres colorés, filtres interférentiels Séparation spectrale : utilisation de filtres Utilisation pour la détection de fluorescence DiO Imagerie multi couleurs DAPI Cy3 Marquage spécifique Fluorophores comme sondes de l’environnement Fluorescence emission spectra of the 2-mercaptoethanol adduct of badan in: 1) toluene, 2) chloroform, 3) acetonitrile, 4) ethanol, 5) methanol and 6) water. Each solution contains the same concentration of the adduct. Photoblanchiment temps IV. Méthodes d’imageries contemporaines 1. Microscopie confocale 2. Illumination structurée Imagerie de fluorescence : problématique objectif de microscope plan de mise au point Détection de la lumière provenant des plans hors du plan de mise au point réaliser une coupe optique Microscopie confocale Objectif améliorer la résolution axiale ou réaliser une « coupe optique » de l’échantillon Microscope confocal : principe et intérêt Microscope confocal : système d’imagerie à balayage