Microscopies optiques innovantes
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Microscopies optiques innovantes Applications à la biologie Jacques DEROUARD Laboratoire Interdisciplinaire de Physique (LIPhy) La préhistoire Van Leeuwenhoek (1623-1723) La préhistoire La préhistoire Microscope composé 18ème siècle L’Histoire Microscope Zeiss (1885) NB Collaboration Abbe Schott - Zeiss Microscope optique début du 21ème siècle Microscopie optique • Imagerie morphologique d’objets biologiques transparents observés en transmission Milieu inhomogénéité d’indice δn – contraste de phase épaisseur e: – contraste interférentiel déphasage 2π δn.e λ – coloration (membrane, noyaux…) de cellules « fixées », c’est-à-dire mortes! Microscope optique Microscopie optique • Contraste de phase (Zernike, 1935) Image transmission normale (cellules de l’épithelium de la bouche) Contraste de phase Microscopie optique • Contraste interférentiel (Nomarski, 1955) Microscopie optique • Imagerie morphologique d’objets transparents • Imagerie « fonctionnelle » – détection, localisation et comportement de molécules impliquées dans le fonctionnement cellulaire – cf protéines, ADN, Ca++... – nécessité de « marquage » par objet visible avec une grande sensibilité Microscopie optique • Marquage par objet « visible » – Molécule colorée, ou particule, spécifiquement attachée ou sensible à molécule ciblée • Détection par – fluorescence – lumière diffusée ou échauffement local Microscopie optique • Marquage par objet « visible » – Molécule colorée, ou particule, spécifiquement attachée ou sensible à molécule ciblée • Détection par – fluorescence – lumière diffusée ou échauffement local Microscopie de fluorescence • La fluorescence est extrêmement sensible et permet dans certains cas la détection de molécules individuelles. Microscopie de fluorescence • Il existe des quantités de marqueurs fluorescents commerciaux synthétisés chimiquement – Doivent être introduits dans les cellules – Doivent être non toxiques pour observation de cellules vivantes • Cas des protéines fluorescentes Le prix Nobel de chimie 2008 (R. Tsien, M. Chalfie, O. Shimomura) • Molécule « Green Fluorescent Protein » présente naturellement chez certaines méduses Protéines fluorescentes et génie génétique • Organismes peuvent être génétiquement modifiés pour fabriquer des protéines « fusionnées » avec cette protéine fluorescente Protéines fluorescentes et génie génétique • Organismes peuvent être génétiquement modifiés pour fabriquer des protéines « fusionnées » avec cette protéine GFP Microscope optique de fluorescence « Cube » séparateur Lumière de fluorescence très peu intense / illumination -> « Cube » séparateur Spectres d’absorption et de fluorescence d ’un colorant fluorescent Filtre d’excitation Filtre d’arrêt Miroir dichroïque Immuno-fluorescence à plusieurs couleurs: détection simultanée de plusieurs types de molécules Microscopie de fluorescence • Très souvent lampe d’excitation est remplacée par un laser – imagerie plein champ si faisceau défocalisé – ou au contraire image point par point obtenue en balayant le faisceau focalisé sur l’objet étudié. • -> simple photodétecteur plutôt que caméra • -> montage confocal pour limiter profondeur de champ Objectif Fluorescence excitée par absorption d’1 photon Microscopie confocale: trou de filtrage placé devant photodétecteur Microscopie confocale: trou de filtrage placé devant photodétecteur + miroir mobile pour balayer le faisceau Conchello et Lichtman 2005 Résolution latérale de l’image Dépend essentiellement de la taille du spot du laser focalisé par l’objectif Optique des faisceaux laser « gaussiens »: Diamètre du spot laser focalisé ≈ 0,38 λ ON Résolution longitudinale de l’image: meilleure qu’avec une image éclairée plein champ Plein champ Confocal Application à l’imagerie 3D par « section optique » Reconstitution 3D
