Stress oxydant - Institut des Métaux en Biologie de Grenoble

Stress oxydant
I.
II.
III.
IV.
V.
Réactivité de l’oxygène
Oxygène en biologie et stress
oxydatif
Superoxyde Dismutase
Catalase
Peroxydase
I. Réactivité de l’oxygène
I.1 Diagramme d’OM de O2 et de ses
formes réduites
Liaison O=O selon cet axe
z
z
x
y
y
px, py
Où placer les 2 autres électrons?
x
pz
O2 = diradical
O2 stable est un diradical
Forme stable de O2
Autres formes de O2
3O
2
triplet
1O
2
singulet (réactif)
Formes les plus courantes
E
O2 singulet
23 kcal/mol
O2 triplet
Notation: 2S+1O2 où 2S+1 est la multiplicité de spin,
et S le nombre de spin
Triplet: 2 spins parallèles S = ½ + ½ = 1
Singulet: 2 spins antiparallèles S = ½ - ½ = 0
Formes réduites de O2
O2
+ 1 e-
+ 1 e•O2
O2
2- + 1 e
OH• (+ OH-)
E° (NHE) à pH 7, pO2 = 1:
O2 / O2•- = -0.33 V
O2•- / H2O2 = 0.89 V
O2 / H2O2 = 0.28 V
O2 / H2O = 1.23 V
H2O2 / H2O = 1.82 V
Radicaux
I.2 Réactivité de l’oxygène triplet (diradical)
z Pour une réaction rapide: triplet réagissant avec radicaux.
3O
2
(↑↑) + 2R• (↓) → 2RO2• (↑)
radical
radical
Rapide (substrat radicalaire)
radical
Pour plus de commodité on ne représente
plus que le doublet le plus haut en énergie
ou l’électron célibataire dans les produits
Exemple en bio: Peroxydation de lipides
O
O
H
O2
O
O
O
H
z O2 triplet, or la plupart des réactifs sont singulets (non
radicalaires): Réaction concertée généralement lente
(Restriction de spin, non détaillé)
O
Possibilités de réaction de 3O2 avec 1R: directe
3O
2
(↑↑) + 1R (↑↓)
triplet
3O
2
singulet
(↑↑) + 1R (↑↓)
triplet
3RO
2
1R
Coût énergétique pour le
1RO (↑↓) retournement du spin: 25
2
Produit non kcal/mol; De plus collisions
radicalaire intermoléculaire beaucoup plus
rapides que spin-flip. Æ NON
(↑↑)
(↑↓)
3O
2
3RO
2
3R
triplet
(↑↓) + énergie
(↑↑)
(↑↑) + 3R (↓↓)
triplet
Produit
radicalaire
singulet
1RO
2
(↑↑)
1RO
2
(↑↑)
Etat triplet 3RO2 = état excité
typiquement 40-70 kcal/mol
au dessus de l’état
fondamental 1RO2. Energie
d’activation nécessaire bien
trop importante. Æ NON
Energie d’activation
nécessaire bien trop
importante (Cf cas
précédent).
Réduction de l’oxygène
3O
2
(↑↑) + 1R (↑↓)
2O •2
2O •2
(↑) + 2R•+ (↑)
2O •2
2O •2
(↑) + 2R•+ (↓)
1RO
2
(↑) + 2R•+ (↑)
(↑) + 2R•+ (↓) (diffusion)
(↑↓) (recombinaison)
Exemple avec des flavines, mais très rare (nécessite un réducteur fort pour O2)
R
N
N
H
H
N
R
N
O
NH
+ O2
N
H
O
R
N
H
N
N
O
H
O
O
H
O
NH
N
O
NH
+ O2
OH
R
N
N
O
NH
N
O
+ H2O2
Rem: Autoxydation radicalaire
Initiation:
1X (↑↓) → 2X• (↓)
2
2X• (↓) + 1RH (↑↓) → 1RH (↑↓) + 2R• (↓)
Propagation:
2R• (↓) + O (↑↑) → 2ROO• (↑)
2
2ROO• (↑) + 1RH (↑↓) → 1ROOH (↑↓) + 2R •(↓)
Terminaison:
2R• (↓) + 2ROO• (↑) → 1ROOR (↑↓)
I.3 Réactivité des formes réduites de l’oxygène
triplet
2O •- (↑)
2
2O •- (↑)
2
+ 1X (↑↓) → 1O22- (↑↓) + 2X•+ (↑)
+ 2X•+ (↓) → 1XO2 (↑↓)
2HO• (↑) + 1H-X
1X
Formes très
réactives
(↑↓) → H2O + 2X•+ (↑)
(↑↓) + 2O2•- (↑): Exemple de l’oxydation d’hydroquinones
OH
O
+ HO2-
+ O2OH
OH
k = 1.7 x 107 M-1 s-1
(facilitée par transfert de proton
couplé au transfert d’électron)
a) Radical OH•
z1ere étape de la peroxydation de lipides
O
O
H H
2HO•
R ou OH
O
O
H
O
O
H
O2
O
O
O
O
H
H
O
HO
O
H
O
(↑) + R-H (↑↓) → H2O + R• (↑)
zAttaque de l’ADN
Mais aussi oxydation de l’extrémité Nterminale des protéines
b) Peroxyde d’hydrogène H2O2 (↑↓)
zCinétique lente
zEn présence de traces de métal rédoxactif (Cu, Fe) les réactions de H2O2 sont
très rapides:
Fe2+ + H2O2 + H+ → Fe3+ + H2O + HO•
Fe3+ + 1/2 H2O2 → Fe2+ + 1/2 O2 + H+
______________________________________
3/2 H2O2 → H2O + 1/2 O2 + HO•
Espèce active
I.4 Réactivité de O2 singulet
z Durée de vie < 1 μsec en solution aqueuse.
Peu spécifique. Obtenu par irradiation ou
chimiquement:
R
1O
2
O
hν
R
1
O2
O
R
3O
2
R
z Supposé être le principal agent responsable
de l'effet néfaste du rayonnement UVA:
O
N
N
ADN
H
N
1
NH
N
O2
O
NH
O
N
NH2
ADN
N
NH2
Exemple de réaction de O2 singulet
généré par photoxydation
zUtilisation en biologie: Photodécontamination des produits sanguins,
traitement photothérapique de cancers.
zEn chimie:
II. Oxygène en biologie et stress
oxydatif
• Air = 21% de dioxygène.
• Dioxygène nécessaire aux
animaux, plantes et bactéries
aérobes pour la production
d’énergie, métabolisme,
détoxification ...
Energie
Glycolyse en conditions anaérobies:
Glucose + 2ADP + 2Pi Æ Lactate + 2ATP + 2H2O
Glycolyse aérobie: O2 est l’accepteur final d’électron:
Glucose + 6O2 + 36ADP + 36Pi Æ 6CO2 + 36ATP + 6H2O
Remarquez la différence d’efficacité (potentiel O2 grand)
Energie
II. Oxygène en biologie et stress
oxydatif
• Air = 21% de dioxygène.
Dommages
• Dioxygène nécessaire aux
animaux, plantes et bactéries
aérobes pour la production
d’énergie, métabolisme,
détoxification ...
• Paradoxe: Dioxygène est aussi
très toxique à toutes les formes de
vie.
• La vie existe car les organismes
disposent de systèmes de défense
(anti-oxydants) ou de réparation
des dégâts oxydatifs.
Défences
z Radicaux libres produits
naturellement en faible
quantité et utiles aux
organismes à dose
raisonnable.
z Dans des conditions
normales la production
est maîtrisée et
adaptive
II.1 Radicaux primaires et secondaires
z Primaires: Espèces à proprement parler
radicalaires (issues de la réduction du
dioxygène triplet ou de l’oxygène singulet)
z Secondaires: Radicaux formés par réaction des
radicaux primaires avec des molécules
biologiques.
z Précurseurs: Espèces non radicalaires issues de
la réduction du dioxygène (type H2O2)
z Toutes ces espèces sont appelées Espèces
Réactives de l’Oxygène (ROS en anglais)
Radicaux primaires et précurseurs
Espèces réactives de l’oxygène
H2O2
RO2H
ROO•
NO•
ONO2•
O2•1O
2
RO•
OH•
Espèces très
réactives
Radicaux primaires et précurseurs
II.2 Production naturelle de radicaux
Electrons circulants sont très réducteurs
Æ 2-5% sont perdus de la chaîne et vont
réduire O2 en O2•- très toxique
+ énergie
H2O
Pyruvate
O2
O2
O2•-
Fonctionnement anormal
Fonctionnement normal
Lutte anti-infectieuse
Macrophage activé: Production d’un
mélange très toxique de superoxyde O2•-,
OH•, H2O2 …
Implique une réduction de O2 par la
NADPH oxydase pour produire O2•-, puis
action d’une superoxyde dimutase pour
produire H2O2.
Résultat: Lyse des cellules phagocytées.
Phagocytose de 2 globules rouges par un macrophage
OH• peut résulter d’une mauvaise régulation
de la concentration en métaux cellulaires
Mn+ = Cu+, Fe2+ (milieu cellulaire est plutôt réducteur)
Autres sources (non naturelles)
Rayonnement ionisant
Rayonnement UV
Pollution
Cigarette
1015 radicaux (NO• et NO2•) inhalés à chaque aspiration
II.3 stress oxydatif
A l’état de santé : Equilibre entre les radicaux libres et/ou espèces
réactives de l’oxygène (toxiques) et nos défences. Tout
déséquilibre entraîne un état de stress oxydatif (agression).
Protection
defence
ROS
Dommages
Le stress oxydatif est reconnu aujourd'hui comme l'explication essentielle
des phénomènes du vieillissement
Le stress oxydatif est un indicateur du réel état de santé.
Définit un état intermédiaire, où la personne ne présentant
pourtant pas encore de maladie avérée, n'est plus tout à fait en
bonne santé, en quelque sorte un 'état de rupture plus ou
moins passager de l'état de santé'.
Cette période liée à un stress, à des contraintes nouvelles ou
anormales, à un déséquilibre momentané entre agressions et
défenses, expose l'individu à une agression oxydative
importante, synonyme à terme de maladies, et quoiqu'il en soit
d'un vieillissement accéléré.
II.4 Dégâts aux cellules
Attaque par les espèces réactive de l’oxygène de
tous les constituants cellulaires
a) Lipides
b) ADN
O
N
HN
N
H2N
N
H
O
N
HN
H2N
N
N
H
NH2
N
N
N
N
H
O
N
HN
O
HN
O
N
H
H2N
N
N
H
c) Acides aminés
Conséquences à long terme (maladies)
Cataracte
CHD
Maladies
Respiratoires
Athéroscléroses
Pb rénaux
Dysfonctions hormonales
Maladies de la peau
Cancer
Maladies
inflammatoires
Diabètes
Obesité
Infections
Viellissement
II.5 Défenses contre le stress oxydatif
Coopération entre différents systèmes
Flavonoides,
Carotenoides
Ubiquinol
Induction de la synthèse
de protéines de
stockage de métaux
Antioxydants
Enzymes du stress oxydant
Gluthation
Vitamines (C, E)
OH
HO
O
O
OH
Ubiquinol
O
Vitamine E
Spécificités des systèmes
a) Antioxydants
=
E307
Vitamine E
=
α-Tocophérol (haut)
Acide ascorbique (bas)
Vitamine C
E300, E301
Même molécule !!!
Propriétés communes aux antioxydants
Formes oxydées à 1 électrons stables
O
Glutathion
O
-O2C
N
H
NH3+
H
N
CO2-
-O2C
-e-
N
H
S
O
SH
O
-O2C
Acide ascorbique
HO
HO
O
HO
Vit E oxydée
NH3+
HO
O
OH
O
-e-
HO
O
HO
O
NH3+
H
N
CO2O
Dimère non radicalaire
(donc stable)
S
N
H
H
N
CO2-
O
Radical stabilisé (délocalisé)
OH
O
O
O
O
O
O
O
O
O
Ex de cascade de réactions:
Vit E
Vit C
Ici Vit C régénère la Vit E,
mais peut aussi régénérer
le glutathion ou réagir
directement avec le
radical
LH: Lipid molecule, LOOH: Lipid peroxide, LOO+: Lipid Peroxide radical, a-Toc-OH: α-Tocopherol, a-Toc-O+:
α-Tocopherol radical, GSH: Glutathione, Vitamin C+: Vitamin C radical, GS+: Glutathione radical, GSSG:
Oxidized glutathione, NADPH: Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADP+: Oxidized
nicotinamide adenine dinucleotide phosphate.
HO
O
+R
-RH
O
O
Vitamine E, appelée aussi α-Tocopherol, Æ bloque la peroxydation des lipides.
Utilisée pour empêcher le rancissement
du beurre (E 307)
b) Induction de la synthèse de protéines
de stockage de métaux
z OH• peut résulter d’une mauvaise régulation de
la concentration en métaux cellulaires:
Mn+ = Cu+, Fe2+ (milieu cellulaire est plutôt réducteur)
z Induction de la synthèse de:
{ Ferritine, transferrine pour le fer
{ Cerruloplasmine, albumine pour le cuivre
c) Systèmes enzymatiques : Catalase,
peroxydase et Superoxyde Dismutase
III. Superoxyde Dismutase
2 O2•- + 2 H+ Æ H2O2 + O2
Dismutation du superoxyde
En fait cette équation est une équation bilan dont les
demi-réactions rédox sont:
E à pH physiologique
O2•- + 1 e- + 2 H+ Æ H2O2
O2•- Æ O2 + 1 e-
+0.89 V
-0.33 V
La réaction de dismutation est
donc thermodynamiquement
favorable !
Æ Conditions requises pour la catalyse: Avoir une espèce
(catalyseur) dont le potentiel rédox est compris entre +0.89 et 0.33 V (baisse du ΔG° des réactions élémentaires)
Rem: E°(Cu2+/Cu+) aqueux = 0.34 V et E°(Fe3+/Fe2+) = 0.77 V Æ Ces deux métaux libres
catalysent également la dismutation du superoxyde (moins bien que la SOD)
Différentes classes de SOD:
z CuZn-SOD (SOD1) dans le cytoplasme, noyau
z Mn-SOD (SOD2) dans les mitochondries
z CuZn-SOD (SOD3) extracellulaire (capte le
superoxyde libéré par les cellules)
Les CuZn-SOD sont les plus abondantes chez l’être humain
z Chez les bactéries: Mn-SOD et/ou Fe-SOD
(structures assez similaires)
La structure des SOD varie selon leur classe
Calculated rate constant, M-1sec-1
CuZnSOD
MnSOD
Sans enzyme
pH
kcat pour CuZn-SOD = 109 M-1.s-1!! La plus grande
constante de vitesse du monde vivant. La réaction
n’est limitée que par la diffusion du superoxyde
III.1 CuZn-SOD
z Dimere de MW = 2 x 16 kDa
z 151 aa/monomère (bovin), 153 aa/monomère (humain)
z Chaque monomère contient 1 Cu + 1 Zn
Cu et Zn
CuZn-SOD
z Hétérobimétallique: Rôle de chacun des métaux ?
Réaction catalysée de type rédox or seul Cu peut
exister à 2 états rédox dans la fenêtre de potentiel
accessible aux systèmes biologiques: Le cuivre est
impliqué dans la réaction.
z Forme active: Cu2+ ou Cu+ ?
O2•- / H2O2
+0.89 V
E°CuII/CuI = 0.065 vs AgCl/Ag dans SOD
O2•- / O2
-0.33 V
z En fait les 2 formes Cu2+ et Cu+ sont actives:
O2•- / H2O2
O2•- / O2
+0.89 V
CuII-SOD
H2O2
-0.33 V
H+
O2•-
CuI-SOD
O2•O2
E°CuII/CuI = 0.065 vs AgCl/Ag dans SOD
Mécanisme catalytique « ping pong »:
Cu2+ + O2Cu+ + O2- + 2 H+
2 O2- + 2H+
Cu+ + O2
Cu2+ + H2O2
O2 + H2O2
Æ Un seul métal, le cuivre, est impliqué dans la catalyse
Comment expliquer la constante de
vitesse gigantesque?...
O2O2-
O2-
O2-
O2-
O224 Å
Thr 56
5Å
-
10 Å
+
Arg 141
Glu 131
Thr 135
4Å
+
Cu
Pas accessible
au solvant
Zn
Attraction électrostatique du
substrat !!!
Monomère:
IV: Zn-binding loop
VII: Electrostatic loop (contient
des résidus chargés dont l’Arg
essentielle à l’activité)
IV et VII définissent un canal
entre la surface et le site actif
… Conséquences de l’attraction
électrostatique…
z Spécificité du substrat (anion de taille
convenable)
z Forte accélération de l’accès au site actif: O2•circule plus rapidement dans le canal qu’en
solution (barrière de la diffusion). L’accès au site
n’est pas le facteur limitant.
z Preuve indirecte: Diminution de la constante de
vitesse lorsque la force ionique augmente
Mécanisme
1ere étape
CuII-SOD
H2O2
H+
O2•-
CuI-SOD
2eme étape
O2•O2
1ere étape: Réduction de la SOD
Forme oxydée
NH
NH
H2N
H2N
NH2
O
O
H2O
Cu
2+
N
N
Zn
H2O
Espèce neutre
donc non retenue
NH
NH2
H2N
NH2
Forme réduite
H+
O
O
Cu
O
O
2+
N
N
Zn
Cu
+
HN
N
Zn
Réaction: Transfert
d’électron sphère interne
très rapide
Rappel sur l’hémocyanine et la Galactose Oxydase qui fixent O2:
Le cuivre catalytique est Cu(I), mais il est obligatoirement oxydé en
Cu(II) pour pouvoir coordiner O22- ou O2•-
Rem: Noter que l’histidine est
complètement déprotonée
Coordination sur Cu2+
avant réaction
z L’enzyme n’est jamais saturée en conditions standards
O2•- + SOD = SOD-O2•- Æ SOD réduite + O2
SOD-O2•- ne s’accumule jamais
Conséquence de la réduction du cuivre:
Structure des formes oxydées/réduites
Reduced (Cu+) yeast CuZnSOD
Æ Le cuivre se déplace de 1 Ǻ suite à
la protonation de l’His
Oxidized (Cu2+) human CuZnSOD
6.2 Ǻ
Changement de géométrie:
Æ Cu(II) initial adopte sa géométrie préférentielle (pentacoordiné en bipy trigonale)
Æ Le Cu(I) adopte sa géométrie préférentielle qui est tricoordiné trigonale
Rem: Le Cu(I) est dans la même géométrie que dans l’hémocyanine (3 His
coordinées)
2eme étape: Oxydation de la SOD
Espèce neutre
donc non retenue
Forme réduite
NH
H2N
H2N
NH2
O
O
Cu
NH
NH
HN
N
Zn
NH2
H2O
H+
O
O
Cu
+
H2N
NH2
H
H2O
+H
N
N
Zn
Cu
O
O
H
Forme oxydée
2+
N
N
Zn
Réaction: Transfert
d’électron très rapide
Rappel sur l’hémocyanine et la Galactose Oxydase qui fixent O2:
Le cuivre catalytique est Cu(I), mais il est obligatoirement oxydé en
Cu(II) pour pouvoir coordiner O22- ou O2•-
O2•- n’est pas fixé par Cu+, il est simplement maintenu près du Cu+ par
liaisons H avec l’Arg et l’His (pour qu’il y ait transfert d’électron)
Rôle du zinc ?
z Important dans la 2eme étape i.e. réoxydation
du Cu(I), c’est-à-dire la réduction du
superoxyde.
z Structural:
1. Orienterait l’imidazole, qui coordine alors le Cu(II)
2. Imidazole orienterait l’hydroperoxyde et l’empêcherait
de coordiner fortement (départ facilité de H2O2)
NH
H2N
NH2
H
H2O
Cu
O
O
H
2+
N
N
Zn
III.2 Autres SOD: FeSOD et MnSOD
z Fe: bactéries, chloroplastes, et peut être chez les eucaryotes
z Mn: bactéries, mitochondries
z Rôle: Mn: protection de l’ADN spécifiquement, Fe plutôt protection
du stress environnemental.
z Fe-SOD: moins sensible à l’inactivation par le peroxyde que les MnSOD
z Dimères (pro-) ou tétramères (eucaryotes)
z Monomère = 22 kDa pour Fe-SOD
z Quelques organismes peuvent utiliser indifféremment le fer ou le
manganèse dans une SOD: cambialistiques (cas particuliers)
Fe-SOD et Mn-SOD très proches d’un point de vue
structural
Chez E. Coli 40 % d’homologies de séquence, et
structure tridimensionnelle similaire
(A) Dimer structure of FeSOD T.elongatus.
(B) Monomeric subunit of FeSOD
(C) Dimer structure of MnSOD Anabaena sp.
(D) Monomeric MnSOD.
Structure du site actif des Fe-SOD et Mn-SOD
Æ Un métal par sous-unité, par opposition aux CuZnSOD
Site actif de la
Mn(III)SOD d’E.coli
Une sous unité du dimère de FeSOD
z Coordination par 3 His et un Asp. 3eme ligand: OH- (dur) pour
M3+, H2O (un peu moins dur) pour M2+
z Sites actifs identiques (1ere sphère de coordination) que le
métal soit Mn ou Fe
z Métal inaccessible directement au solvant (doit
emprunter un tunnel)
z Site actif des Fe-SOD entouré d’une couche de
résidus aromatiques: Protection de la protéine
vis-à-vis des O2•Réaction: Ar + O2•- Æ Ar•+ + O22- (protons omis)
Ar•+ par son caractère aromatique aura une
durée de vie suffisante pour que sa réduction
soit possible par un second équivalent de
substrat : Ar•+ + O2•- Æ Ar + O2
Catalyse par les Fe ou Mn-SOD
Forme oxydée
Mécanisme
de type
« ping-pong »
Forme réduite
Etape 1: Réduction à un électron du métal de la SODox
Etape 2: Oxydation à un électron du métal de la SODred
Catalyse par les Fe-SOD et Mn-SOD
Transfert de proton couplé au
transfert d’électron, eau = base
O
Liaisons H en vert
O C
N H
H
O
H
O
H
His MII
His
O
O
His
O2O
O
H
His
H
O
MII
His
O
H+
O
H
O
O
O
His MIII
His
His
His
H2O2
H
H
HN
N
O
M
N
N
H
O
H
O
N
NH
Catalyse par les Fe-SOD et Mn-SOD
- Libération de H2O2 est limitante comme
la protonation
- Fe-SOD inactivée à pH 9, soit pH ≈
pKa(Tyr) et pKa(hydroxyde lié) par
rupture des réseaux de liaison H et
l’impossibilité de transférer des protons
au site actif.
O C
N H
H
O
H
H
HN
N
O
M
N
N
H
O
H
O
N
NH
Comment expliquer que Fe-SOD et MnSOD travaillent au même potentiel?
z Couple M(III)/M(II) : Fe(H2O)6 = 0.77 V
Mn(H2O)6 = 1.51 V
z Potentiel des SOD ≈ 0 – 0.3 V (Mn ou Fe!)
z Comment expliquer cette similitude ?
Site actif de la
Mn(III)SOD d’E.coli
Sites actifs identiques
Une sous unité du dimère de FeSOD
Comment expliquer que Fe-SOD et MnSOD travaillent au même potentiel?
Similitude liée à l’énergie associée à la réaction : M3+--OH- + e- +
H+ Æ M2+--OH2 et donc au transfert de proton couplé au
transfert d’électron (réseau de liaisons H)
La mutation de ce résidu
conservé dans la Fe-SOD
augmente le potentiel (+600 mV
pour le mutant Glu)
Différence entre Fe et Mn? Conséquence
du remplacement de Fe par Mn:
Malgré que l’environnement soit identique,
Fe(Mn)SOD* est inactive. Idem lorsque Mn
est remplacé par Fe dans les Mn-SOD
FeSOD (blanc),
Fe(Mn)SOD (gris)
[+ mutants Q69H-FeSOD (vert) et
Q69E-FeSOD (jaune)]
*Fe(Mn)SOD: Fe-SOD ou Fe est remplacé par Mn
Explication: Potentiels de travail
Potentiel idéal
Mn-SOD
Fe-SOD
Fer
Fe-SOD
Fe(Mn)-SOD
Manganese
Mn-SOD
Mn(Fe)-SOD
Sauf pour les SOD cambialistiques
Fe remplacé par
Mn et vice-versa
IV. Peroxydases et catalases
z Protéines à fer héminique
z Site actif proche de l’hémoglobine ou des
cytochromes
z Réaction primaire avec H2O2 dans les 2 cas
z Réaction globale différente:
{Peroxydase: AH2 + H2O2 Æ A + 2 H2O
{Catalase: 2 H2O2 Æ 2 H2O + O2
z Il existe des catalases-peroxydases chez les
procaryotes et les eucaryotes inférieurs.
IV. 1 Catalase
z Réaction: 2 H2O2 → O2 + 2H2O
(dismutation de H2O2) kcat jusqu’à 40 000 000 M-1.s-1
z Chez tous les pro- et eucaryotes aérobes, et aussi
certains anaérobes facultatifs.
z Cette enzyme est utilisée pour l'identification des
bactéries par mise en contact d’une colonie avec H2O2.
L’effervescence (dégagement de O2) signale la présence
d'une catalase.
catalase empoisonnée
catalase active
Localisation chez l’humain:
z Dans le cytosol,
mitochondries, mais surtout
dans des peroxysomes
z ≈ taille lysosomes, entourés
d’une membrane,
contiennent une multitude
d’enzymes impliquées dans
l’oxydation d’acides gras
(foie)
Thermodynamique de la réaction
Réaction catalysée:
H2O2 Æ 2 H2O + O2
Demi-réactions rédox:
H2O2 Æ H2O: Réduction à 2 électrons
H2O2 Æ O2: Oxydation à 2 électrons
H2O2 / H2O
O2 / H2O2
+1.82 V
E° (NHE) :
O2 / O2•- = -0.33 V
O2•- / H2O2 = 0.89 V
O2 / H2O2 = 0.28 V
H2O2 / H2O = 1.82 V
Æ La réaction bilan est
favorable, mais lente
0.28 V
Suffisamment stable
pour être stocké
Structure générale
z Tétramères dont chaque monomère est α/β
z Chaque monomère : ≈ 500 amino-acides et un hème
(site actif)
z La plupart des catalases ont un hème b comme
groupement prosthétique; Quelques catalases
bactériennes et fongiques contiennent un hème d
z Existence d’un domaine de fixation de NAD(P)H à 20 Ǻ
de l’hème
b
d
Accessibilité au site actif
Canal de 20 Ǻ de long
hème
Protéine en coupe
Structure du site actif (conservé)
z Globalement structure proche de celle de
l’hémoglobine/myoglobine SAUF le résidu proximal
Hy
dro
Ser99
ph
o
Poche
hydrophobe pour
gaz
be
Distal
Trop loin pour
coordination
Proximal
Arg339
Micrococcus lysodeikticus catalase
Hème dans l’hémoglobine/myoglobine
Mécanisme catalytique
2 H2O2 Æ 2 H2O + O2
Red
Ox-O
Type « Ping Pong »:
Alcools aliphatiques peuvent réagir aussi
Ces 3 résidus sont essentiels
(quand mutés perte totale
d’activité): Impliqués dans la
catalyse
Mécanisme catalytique: Rappels sur la
fixation du dioxygène par la myoglobine
N
H2O
N
Fe(II)
(hs) HN
Fe
N
O2
H2O
N
N
H
N
H
N
N
HN
O2 H2O
N
H
N
O
O
N
N
Fe(II)
O
Fe
N
HN
δ ≈ 0.5 mm/s
O
N
N
Fe(II)
Fe
N
HN
N
N
Fe(II)
HN
O
O
O
O
Fe
N
N Fe N
N
N
HN
HN
Fe(III)-O2•(bs)
Différences entre hémoglobine et catalase
Composé I
Ox-O
Forme active = Fe(III) hs
N Fe N
O
Catalase
Stabilisation du fer(III)
par compensation de
charge Æ Domaine
d’existence de Fe(III)
augmente Æ E(FeIII/II) ↓
N Fe N
N
N
H
Globine
O
NH
Pas de δ- sur l’His:
Stabilisation du Fer(III)
moins importante:
E(FeIII/II) ↑
Donc:
z Etat d’oxydation du fer avant réaction:
+II dans l’hémoglobine
+III dans les peroxydases
z Substrat:
Dioxygène dans l’hémoglobine
Forme réduite du dioxygène (H2O2) dans les
peroxydases
Degré d’oxydation Æ spécificité pour O2 ou H2O2
Pourquoi ? O2 doit être « activé » pour être utilisé (fixé). Cette
activation est une réduction par le métal (qui est donc à bas
degré d’oxydation). Une simple déprotonation (par l’His
distale) suffit à fixer H2O2 (sous forme HO2-, O dur comme
Fe(III)).
Réaction de type hémoglobine dans la
Catalase ?
RCO3H + catalase Æ RCO2H + Composé
Composé I
Après addition de peracide
?
≈ Cyt P450 (rappel: thiolate proximal)
δ = 0.07 mm/s ΔEQ = 1.47 mm/s
δ= 0.03 mm/s ΔEQ = 2.29 mm/s
δ≈ 0.5 mm/s pour hémoglobine
Æ FeIV-OH
Catalase
Æ FeIV=O diamagnétique
Composé I
1ere étape: Mécanisme de formation du
composé I
Asn133 participe aussi à la fixation
du substrat (non montré)
Réduction de H2O2
Composé I
Modèle de la fixation du substrat
Réseau de liaisons H pour
maintenir le substrat en place
Rôle = maintenir le substrat
Structure RX d’un complexe cyt c peroxydase oxydé avec H2O2 (attention
H2O2 ne peut pas réduire le composé I de la cyt c peroxydase ≠ catalase)
2eme étape: Régénération de l’état initial
zOxydation de H2O2 par le composé I (FeIVporph•)
zConduit à du fer(III): Réduction directe à 2
électrons de l’hème
Composé I
z Existence d’un domaine de fixation de NAD(P)H à 20
Ǻ de l’hème
z Dans certaines conditions (substrat précurseur de
radical de petite taille), absence de NADPH un
composé II (FeIV-porph) peut être vu. En présence de
NADPH il est non observé
z Il semblerait que le NADPH
empêche cet intermédiaire de
se former. De plus la poche
hydrophobe stabiliserait la
porph• et limiterait l’accès au
site (effet stérique)
IV.2 Peroxydases
z Nombreuses et fonctions pas très bien comprises, se trouvent dans
pro- et eucaryotes (30 isoenzymes dans le radis noir)
z AH2 + H2O2 Æ A + 2 H2O
z Réaction en 2 temps:
{ Réduction de H2O2 (comme la catalase)
{ Oxydation d’un substrat AH2 (≠ catalase)
OH
O
AH2 = gaïacol
(incolore sous forme réduite)
O
-O2C
N
H
H
N
O
SH
AH2 = glutathion
NH3+
CO2-
HO
HO
O
HO
O
OH
AH2 = acide ascorbique
Jaunissement des légumes
en présence de H2O2 et
gaïacol (coloré sous forme
oxydée)
Structure de la peroxydase de radis noir
(la plus connue)
Hème protégé, accès solvant
uniquement par un côté de l’hème
Structure du site actif
z L'hème et le substrat se trouvent dans une poche hydrophobe (sauf
His distale/proximale).
z FeIII établit 6 liaisons de coordinence:
{ 4 N d’une protoporphyrine IX (idem hémoglobine)
{ 1 N de l’His proximale
{ 1 OH2 (champ faible) Æ Fer haut spin
z Trp dans la poche autour de l’hème
z His 42 (distale) située est trop loin pour établir la sixième
coordinence.
Fortes
homologies
Ascorbate peroxydase
Horseradish peroxydase
Hémoglobine
Forme active: Fe(III) ou Fe(II)?
N Fe N
δ- N
N
H
O
Peroxydase
Stabilisation du
fer(III) par
compensation de
charge
O
N Fe N
Globine
N
N
H
O
NH
Pas de δ- sur l’His:
Stabilisation du Fer(III)
moins importante:
E(FeIII/II) ↑
Effet de seconde sphère de coordination = Comme pour les
catalases E(FeIII/II) ↓ et la forme active est Fe(III)
E(FeIII/II) = 0.170 V (hémoglobine)
E(FeIII/II) = 0.046 V (myoglobine)
E(FeIII/II) = -0.220 V (HRP)
Mécanisme catalytique
z H2O2 est attiré dans la zone
polaire de la crevasse au
voisinage de His 42, Arg 38 et du
FeIII
z His 42, Arg 38 et His 170 sont
conservés dans les différentes
peroxydases
z La mutation de His 42 diminue
toujours l'affinité de l'enzyme pour
H2O2 et ralentit la réaction.
z La mutation de Arg 38 (polaire)
par Leu (apolaire) diminue
également l'affinité de l'enzyme
pour H2O2 et surtout pour le 2ème
substrat.
Hème protégé, accès solvant
uniquement par un côté de l’hème
Accès H2O2
z Déplacement des
molécules d'eau distales
z Fixation du peroxyde sur
le centre métallique et
déprotonation par H42
z La mutation de Asn 70 en
Val diminue Vmax de
90%: Une liaison
hydrogène ne peut
s'établir entre Val 70 et
His 42. Cette perte
diminuerait la réactivité
de His 42 et changerait
sa position dans l'espace.
2 molécules d’eau
Asn70
Asn70
NH2
NH2
O
O
H
His42
N
H
NH
His42
N
N
H OOH
Fe3+
H OOH
Fe3+
1ere étape commune aux catalases et
peroxydases
z Réaction: formation d'eau et d'un
hème radical FeIV=O (métal basspin)
z FeIV=O très oxydant:
E(composéI/composéII) = 0.90
V, E(composéII/composéIII) =
0.87 V
z Rem: Peroxydase à Fer:
Coupure hétérolytique
z Fe2+ en solution (Fenton):
Coupure homolytique de la
liaison O-O. Génération de
radicaux OH• très toxiques
Asn70
Asn70
NH2
O
NH2
O
H
NH
His42
N
H O OH
Fe3+
H
HN
NH2
N H
Arg38
His42
N
N
H
OH
O
Fe 4+
The catalytic pathway of horseradish peroxidase at high resolution, G. I. Berglund et
al., Nature 417, pp. 463-468 (2002)
z Le 2ème substrat intervient. Chez
la Glutathion peroxydase il s’agit
du glutathion, chez l’ascorbate
peroxydase l’ascorbate, la
peroxydase de radis noir une
multitude de substrats … etc …
z H2O2 peut aller jusqu’au site actif,
mais pas les substrats organiques
z Ces substrats restent à l’extérieur
(oxydation sphère externe)
Asn70
NH2
O
H
HN
NH2
N H
Arg38
His42
N
N
H
OH
O
Fe 4+
OH
O
Produit de réaction avec le 2eme substrat:
Substrat
O
-O2C
N
H
Produit
O
NH3+
H
N
CO2-
-O2C
N
H
O
SH
S
O
GSH (glutathion)
-O2C
Glutathion Peroxydase:
2 GSH + H2O2 → GSSG + 2 H2O
2 GSH + ROOH → GSSG + ROH + H2O
O
S
O
O
OH
Acide ascorbique
H
N
CO2-
O
GSSG (glutathion oxydé)
La Glutathion Réductase permet
de repasser à GSH
HO
HO
HO
CO2-
N
H
NH3+
Ascorbate Peroxydase:
2Asc + H2O2 → 2Asc• + 2 H2O
HO
NH3+
H
N
HO
O
HO
O
OH
Asc•
Mécanisme de réduction: 2 électrons transférés
simultanément (catalase) ou par étapes?
O
-O2C
N
H
NH3+
H
N
O
CO2-
-O2C
N
H
O
SH
NH3+
H
N
CO2-
O
SH
O
FeIV
O
FeIII
O
FeIV
O
FeIV
O
-O2C
N
H
NH3+
H
N
S
O
CO2-
-O2C
N
H
O
O
-O2C
S
O
-O2C
NH3+
CO2O
NH3+
H
N
N
H
NH3+
H
N
S
CO2O
Ex: Asc peroxydase
S
N
H
+ H2O
Intermédiaire porphyrine
FeIV=O non radicalaire
H
N
CO2-
O
Ex: Glutathion peroxydase
Mécanisme de réduction (HRP)
Asn70
NH2
Asn70
O
H
H2N
NH2
N H
Arg38
O
His42
O
N
H
OH
O
Fe 4+
H2N
H2N
O
O
O
O
O
N
H
H
H O
His42
N
N
H
O
Fe 4+
N H
O
NH2
Arg38
HO
Asn70
O
O
O
O
HO
O
O
O
O
H2N
O
O
O
O
H2N
N H
Arg38
NH2
H
H
H O
H
His42
N
Etat initial
N
H
O
Fe 4+
O
O
O
O
+ H2O
Rôle de l’Arg: Ascorbate peroxydase
HO
HO
O
HO
O
Asn70
OH
O
O
O
O
O
H2N
H2N
N H
Arg38
NH2
H
H
H O
H
His42
N
N
O
Fe 4+
Modélisation du site de fixation du substrat (ascorbate
peroxydase) et mécanisme catalytique proposé (horseradish
peroxydase): Remarquer le rôle primordial de l’arginine dans
les 2 cas malgré que le substrat soit différent
e-
Cyt c peroxydase
Un cas particulier
Réaction:
2 Cyt c red + H2O2 → 2 Cyt c ox + 2 H2O
Transfert d’électrons à l’hème ferreux du Cyt c.
Dans la chaîne respiratoire, mais transfert aussi
des électrons au Cyt b5, sulfite oxydase (animaux),
cyt c peroxydase (levures)…
Ascorbate peroxydase
Cyt c peroxydase
Un tryptophane (W191) est près du centre héminique
Cyt c peroxydase
2 H2O
H2O2
Le radical est généré non pas sur la porphyrine mais sur ce
Tryptophane (W191) !!!
Cyt c peroxydase
Respiration
Raison ? Il semblerait que l’équivalent radical Trp• soit plus
près de la surface en contact avec le Cyt c = Transfert
d’électron plus rapide au cytochrome soluble.