Contôle génétique et épigénétique du développement du pancréas
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Contrôle génétique et épigénétique du développement du pancréas chez la souris et maladies humaines associées Cécile Haumaitre CNRS UMR 7622 / INSERM ERL 969 Laboratoire de Biologie du développement Université Pierre et Marie Curie, IFR83 9, quai St Bernard - 7ème étage Paris Recrutement en CR2 (Chargé de Recherche) à l’INSERM en 2009 CNRS UMR 7622 / INSERM ERL 969 - Université Pierre et Marie Curie Equipe du Dr Silvia Cereghini • 2001- 2005 : Thèse de Génétique du Développement Université Paris VI INSERM U423 / CNRS UMR 7622, Paris. Equipe du Dr Silvia Cereghini “ Organogenèse précoce chez la souris et maladies génétiques associées” •2005 - : Post-doctorat (CDD INSERM depuis octobre 2005) INSERM U845, Centre de Recherche “Croissance et Signalisation” Faculté de Médecine Necker, Paris. Equipe du Dr Raphaël Scharfmann “ Développement normal et pathologique des organes endocrines” Le pancréas Le pancréas mature est composé de 2 types de tissus : - exocrine : cellules acinaires et canalaires enzymes digestives - endocrine : îlots hormones régulant l’homéostasie glucidique îlot de Langerhans Cellules β productrices d’insuline Pourquoi s’intéresser au pancréas ? - Comprendre comment un organe complexe se forme (Recherche en Biologie du Développement) - Contribuer au développement de stratégies de thérapie du diabète (Recherche Médicale) Le diabète : diminution de la masse fonctionnelle des cellules β qui produisent l’insuline - type 1 : destruction des cellules β - type 2 : résistance à l’insuline A l’heure actuelle, on sait soigner mais on ne sait pas guérir les patients diabétiques Développement de nouvelles approches thérapeutiques pour fournir une masse de cellules β fonctionnelles - thérapie cellulaire - approches régénératives Pour cela, il faut comprendre comment les cellules pancréatiques, les cellules endocrines et les cellules β sont formées au cours du développement Et pouvoir reproduire cette différenciation (à partir de cellules souches embryonnaires ou adultes ou d’autres types cellulaires (trans-différenciation)) Développement du pancréas et régulation génétique Endocrine Arx α PP δ Progéniteurs Pdx1 Facteurs de transcription Ngn3 Exocrine Pax4 β canaux acini vHNF1 “variant Hepatocyte Nuclear Factor 1” / HNF1β / TCF2 Domaine de liaison à l’ADN vHNF1 1 A B Dim. POUS 32 Homéodomaine Liaison 93 C nls Dimerisation Domaine de transactivation 187 203 207 DAIII DAII POUH DAI Q-S-P 287 420 486 531 vHnf1-/- : létalité embryonnaire vers E6, due à une absence d’endoderme viscéral (EV), épithélium extra-embryonnaire au rôle trophique et source de signaux pour l’embryon Profil d’expression de vHNF1 : endoderme viscéral, tube neural, intestin primitif, foie, pancréas, reins, gonades p E13.5 vHNF1-LacZ Rôle de vHNF1 au cours de l’organogenèse ? Objectif : Surmonter la létalité embryonnaire précoce et caractériser la fonction de vHNF1 au niveau du pancréas, du foie et du rein Technique des chimères d’agrégation tétraploïdes electrofusion L’embryon dérive exclusivement des cellules ES mutantes et les cellules tétraploïdes sauvages sont restreintes au lignage extra-embryonnaire 4n + 4n E 2.5 +/+ 2n 2n 2n2n E 1.5 +/+ 4n blastocyste E 3.5 Cellules ES 2n vHnf1-/- embryon 2n vHnf1-/- Endoderme viscéral 4n Surmonte la létalité embryonnaire due à des défauts d’annexes extra-embryonnaires Défaut de développement du pancréas vHnf1+/+ vHnf1+/+ vHnf1-/- vHnf1-/- Défaut de développement du foie Défaut de bourgeonnement du bourgeon urétéral vHnf1+/+ vHnf1-/- vHnf1+/- vHnf1-/- vHNF1 a un rôle prépondérant en amont de la cascade de différenciation pancréatique vHNF1 HNF6 Ihh Shh Cellules intestinales Pdx1 Cellules exocrines Ptf1a Cellules endocrines L’absence de vHNF1 conduit à une agénésie pancréatique : vHNF1 est requis pour la spécification de l’endoderme pancréatique vHNF1 régule l’expression d’HNF6 dans l’endoderme pancréatique • Haumaitre C, Barbacci E, Jenny M, Ott MO, Gradwohl G, Cereghini S. (2005) PNAS • Poll A, Pierreux C, Lokmane L, Haumaitre C, Achouri Y, Jacquemin P, Rousseau G, Cereghini S, Lemaigre F. (2006) Diabetes Chez l’homme : Les mutations hétérozygotes de vHNF1 / HNF1β / TCF2 sont associées à un diabète de type II d’apparition précoce de type MODY 5 (Maturity Onset Diabetes of the Young) Et une maladie rénale sévère identifiée comme le syndrôme RCAD (Renal cysts and Diabetes) Caractéristiques de la pathologie humaine MODY5 / RCAD? Objectif : Identifier de nouvelles mutations hétérozygotes de vHNF1 chez l’homme et analyse de la pathologie foetale associées aux mutations de vHNF1 Pathologie humaine associées aux mutations hétérozygotes de vHNF1 Identification et caractérisation moléculaire de mutations de vHNF1 HDAC-1 PCAF CBP PCAF Dim. vHNF1/HNF1β 1 POUS 32 A 88 Transactivation POUH B 557 311 178 231 C Q-S-P nls Q243fsdelC Y352fsins Stop 352 Q382X P328 L329fsdel CCTCT Q454fsdelAG Stop 357 Stop 549 L329X R276X R295H R112P A263fsinsGG Stop 264 Q136E L264FfsdelAG Q147X Stop 292 S151P K164Q R165H R177X nouvelles mutations de vHNF1 associées à des atrophies pancréatiques, des kystes rénaux et des anomalies du tractus génital Barbacci E, Chalkiadaki A, Masdeu C, Haumaitre C, Lokmane L, Loirat C, Cloarec S, Talianidis I, Bellanne-Chantelot C, Cereghini S (2004) Hum Mol Genet Pathologie humaine associées aux mutations hétérozygotes de vHNF1 HDAC-1 PCAF CBP PCAF Dim. vHNF1/HNF1β 1 POUS 32 A 88 Transactivation POUH B 557 311 178 231 Q-S-P C nls R112fsdel8bp ATGCTCAG Stop 112 Q243fsdelC Y352fsins Stop 352 P472fsins8pb Q382X P328 L329fsdel CCTCT Q454fsdelAG Stop 357 Stop 549 L329X R276X R295H R112P A263fsinsGG Stop 264 Q136E L264FfsdelAG Q147X Stop 292 S151P K164Q R165H R177X Identification de 2 nouvelles mutations chez 2 foetus de 27 et 31 semaines Pathologie humaine associées aux mutations hétérozygotes de vHNF1 Caractéristiques phénotypiques de la pathologie foetale MODY5 / RCAD Identification de 2 nouvelles mutations chez 2 foetus de 27 et 31 semaines - reins dysplasiques multikystiques - pancréas hypoplasique - anomalie du tractus génital Haumaitre C, Fabre M, Cormier S, Baumann C, Delezoide AL, Cereghini S (2006) Hum Mol Genet Place de vHNF1 dans la hiérarchie des facteurs de transcription et identification of nouveaux réseaux de régulation Impliqués dans le développement et la fonction de différents épithélia vHNF1/HNF1β/TCF2 : un acteur majeur de l’organogenèse De la souris… Effet de l’absence de vHnf1: - agénésie pancréatique - développement rénal anormal … à l’Homme Pathologie associées aux mutations hétérozygotes de vHNF1 : - hypoplasie pancréatique et MODY5 - dysplasie multikystique rénale Régulation épigénétique de la cascade de différenciation pancréatique Endocrine Facteurs de transcription Arx α PP δ Progéniteurs Ngn3 Pdx1 Pax4 Exocrine β canaux acini Histone Désacétylases : HDACs = régulateur de transcription Transcription, Différenciation Hyperacétylation des histones Hypoacétylation des histones HDACs Traitement d’explants pancréatiques avec des inhibiteurs des HDACs Pancréas dorsal de rat à E13.5 Culture des explants pancréatiques sur filtre flottant à l’interface air/milieu milieu insuline / amylase VPA, MS275 Traitement aux HDACi (inhibitors) TSA, NaB membrane Cellules pro-endocrines Ngn3+ Expression de l’insuline le traitement HDACi accroît le pool de progéniteurs endocrines et augmente le pool de cellules β productrices d’insuline • Haumaitre C*, Lenoir O, Scharfmann R. (2008) Mol. Cell. Biol. *corresponding author • Haumaitre C*, Lenoir O, Scharfmann R. (2009) Cell Cycle. *corresponding author • Lauréat PNRD 2007 (25 000 euros pour frais de fonctionnement) • Brevet International PCT/EP2009/054588. “Methods for obtaining Ngn3-expressing cells and insulin producing-beta cells”. • Prix AREDIC Diabète 2009 - Jeune Chercheur Perspectives I - Processus découplé de régionalisation de l’intestin primitif et de spécification de l’endoderme pancréatique Question : Comment l’endoderme pancréatique est spécifié de manière intrinsèque? Objectif : Déterminer la fonction unique de vHnf1 dans l’endoderme pancréatique Invalidation conditionnelle de vHnf1 dans l’endoderme pancréatique vHNF1 Ihh Shh Intestin X Pdx1 Ptf1a Pancréas X souris Pdx1-Cre x souris vHnf1 floxées Cre -recombinase pancréatique loxP X loxP vHNF1 Caractérisation des réseaux de régulation qui déterminent l’acquisition d’un destin pancréatique II- Réseau de régulation en amont des progéniteurs endocrines Ngn3 : Rôle de vHNF1 dans le contrôle du pool de progéniteurs endocrines Question : Comment est régulé le pool de progéniteurs endocrines à l’origine des cellules β productrices d’insuline? Objectif : déterminer le rôle de vHNF1 dans la génération et/ou le maintien des progéniteurs endocrines Effet de la sur-expression de vHnf1 sur le pool de cellules pro-endocrine? - dans l’endoderme pancréatique (avec Pdx1-Cre) - dans les cellules canalaires, cellules proposées comme source de progéniteurs endocrines: (avec CAII-Cre inductible au tamoxifène) - à l’âge adulte dans un modèle de régénération (streptozotocine, CAII-Cre Tm) Effet de l’invalidation de vHnf1 sur le pool de cellules pro-endocrine? - invalidation de vHnf1 dans les cellules canalaires (souris vHnf1 floxées x CAII-CreER Tm) III- Régulation épigénétique du lignage endocrine Question : Comment est régulé le pool de progéniteurs endocrines à l’origine des cellules β productrices d’insuline? Objectif : déterminer le rôle des HDACs dans la régulation du lignage endocrine Analyse moléculaire du promoteur Ngn3 : Acétylation et liaison de différents HDACs par Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) Role des HDACs dans le développement et la fonction du pancréas : Hdac1, Hdac2, Hdac3 Invalidation conditionnelle double de Hdac1&-2, et de Hdac3 souris Hdac1 et Hdac2 floxées et souris Hdac3 floxées (Souris floxées d’ E. Olson, UT Southwestern Medical Center, Dallas, USA) X souris Pdx1-Cre Identification d’acteurs du contrôle moléculaire de la génération et /ou du maintien du pool de progéniteurs endocrines Intérêt: Manipulation des progéniteurs endocrines dans un cadre thérapeutique IV- Modèle murin de la maladie MODY5/RCAD Domaine de dimérisation Exon 1 Domaine de transactivation Domaine de liaison à l’ADN Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6 Exon 7 Exon 8 Exon 9 IVS2nt+1G>T IVS2nt+1G>A IVS2nt+2delAAGT IVS2nt+2insT Mutation d’épissage Allèles hypomorphes de vHNF1 générés par introduction d’une mutation d’épissage dans le site donneur de l’exon 2 Modèle de la maladie validé pour les kystes rénaux Analyse du phénotype pancréatique : - morphogenèse pancréatique (hypoplasie?) - défaut de maturation des cellules β? - désorganisation des îlots ? Etudes métaboliques après la naissance - glycémie - intolérance au glucose - insulino-résistance - masse des cellules β - prolifération - marqueurs des cellules β Causes d’apparition du diabète précoce MODY5 Recherche à intérêt fondamental (développement & différenciation) et thérapeutique (diabète & médecine régénérative) CNRS UMR 7622 /INSERM ERL U969 Equipe du Dr Silvia Cereghini “ Organogenèse précoce chez la souris et maladies génétiques associées” (Ludmilla Lokmane, Mélanie Fabre) INSERM U845 Equipe du Dr Raphaël Scharfmann “ Développement normal et pathologique des organes endocrines” (Olivia Lenoir) Collaborateurs : - Dr Sylvie Schneider-Maunoury, CNRS UMR7622 / INSERM ERL U969 - Dr Gérard Gradwohl, IGBMC - Dr Anne-Lise Delezoide, Foetopathologie, Hopital Robert Debré - Dr Frédéric Lemaigre, Université Catholique de Louvain, Belgique - Dr Eric Olson, UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA
