Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein. Facteurs

Biomarqueurs tissulaires tumoraux.
Cancer du sein. Facteurs pronostiques,
facteurs prédictifs. Quels standards
en 2005 ?
P.-M. Martin
« Toute chose simple est théoriquement fausse,
toute chose compliquée est pratiquement inutilisable. »
Paul Valéry
Le développement des biomarqueurs tissulaires représente le type même de la
recherche biologique de transfert. Le but de cette revue est non d’être exhaustive,
mais de présenter les buts, la démarche actuellement recommandée pour l’évaluation et la validation des marqueurs biologiques tissulaires et de faire un bilan pour
les cancers du sein en 2005.
Ces trente dernières années, une étape a été franchie par le développement sur
le plan national et international d’une standardisation de l’approche thérapeutique
des cancers permettant une évaluation de l’efficacité des protocoles thérapeutiques.
Mais, malgré une augmentation régulière du nombre de protocoles thérapeutiques
et du coût global des traitements liés notamment au développement de la chimiothérapie, le bénéfice en terme de survie n’est pas à la hauteur de nos espérances
(1, 2). Ces succès limités de l’approche clinique actuelle dans les cancers s’expliquent, d’une part, par le fait que les seuls critères anatomo-cliniques classiques standards actuels des protocoles et essais thérapeutiques ne rendent pas assez compte de
l’importante hétérogénéité évolutive des tumeurs et sont de très faibles indicateurs
potentiels de la sensibilité thérapeutique, et, d’autre part, par le manque de molécules ciblées et adaptées au processus fonctionnel individuel de chaque tumeur. Ces
constatations ont transformé en 1998 en challenge pour les directeurs du NIH/NCI
l’hypothèse issue de la recherche fondamentale (3, 4), et émise en 1978 par W. L.
McGuire : la notion de marqueur tumoral doit évoluer vers la définition d’une analyse tissulaire multiparamétrique permettant l’établissement, l’évaluation et validation d’une classification moléculaire des tumeurs humaines. Les récepteurs hormonaux dans les cancers du sein en étaient la première démonstration. Cette classification serait indispensable pour progresser vers des traitements ciblés et efficaces
84 Cancer du sein
(5). L’évolution des connaissances en biologie du cancer, ainsi que les progrès technologiques réalisés à ce jour, permettent d’envisager une meilleure définition moléculaire et fonctionnelle des tumeurs solides, aboutissant au concept de classification
moléculaire des tumeurs humaines et au développement de thérapeutiques innovantes mieux adaptées à la spécificité de chaque tumeur.
Une classification moléculaire des tumeurs associée aux données cliniques et
anatomo-pathologiques devrait contribuer, dès le diagnostic, à l’évaluation du
potentiel métastatique du cancer, isolant les patients à haut risque évolutif, échappant de ce fait à un contrôle thérapeutique loco-régional, et contribuant, en outre,
à la mise en évidence dans le tissu tumoral de marqueurs associés à l’existence
d’une sensibilité ou résistance aux molécules pharmacologiques anticancéreuses.
Ce double but doit permettre la sélection des patients selon leur risque évolutif et
leur sensibilité potentielle aux drogues, évitant les inconvénients des surtraitements et les effets iatrogènes qui peuvent en découler, orientant précocement vers
l’innovation thérapeutique les patients à haut risque évolutif peu ou non sensibles
aux traitements conventionnels. Enfin, cette démarche vers une classification moléculaire des tumeurs doit renforcer la notion de standardisation des protocoles en
considérant de manière objective des groupes homogènes sur le plan biologique
pour l’évaluation de l’efficacité des molécules thérapeutiques. L’étape ultérieure du
développement de ce concept analytique moléculaire concerne l’identification
potentielle du haut risque individuel constitutif afin d’exercer une politique de prévention.
Définition d’un biomarqueur tumoral
Un biomarqueur tumoral est une molécule ou une fonction cellulaire caractéristique d’un cancer (ou d’une personne à haut risque de cancer) par rapport à sa
contre-partie normale (en termes de tissus ou de population). Un marqueur peut
être également une molécule associée à une fonction cellulaire qui caractérise le
potentiel évolutif particulier d’un processus tumoral (invasivité, néo-angiogenèse,
résistance aux thérapeutiques…).
Durant les vingt dernières années, les progrès des connaissances fondamentales
et les progrès technologiques ont permis l’identification d’un très grand nombre de
marqueurs tumoraux putatifs.
En dépit de ces avancées apparentes, dans les tumeurs solides, peu de marqueurs
tumoraux ont été promus et recommandés dans une utilisation clinique courante
faute de stratégie d’évaluation cohérente.
Pour les marqueurs tumoraux, les termes « facteur pronostique » ou « facteur prédictif » sont utilisés dans différents contextes. Spécifiques de la pathologie et du
tissu investigués (par exemple marqueur mesuré dans le tissu tumoral, cellules
tumorales, sérum, fluides pathologiques...). Ces facteurs ont différents potentiels
(ou champs) d’utilisation en clinique parfaitement décrits par G.-S. Ginsburg et
J.-J. McCarthy (6) (figure1).
Les biomarqueurs tumoraux pronostiques sont évalués chez des patients ne recevant aucune thérapie ou des protocoles standards. Ces biomarqueurs pronostiques
Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 85
peuvent être utilisés pour estimer le potentiel évolutif d’un processus tumoral spécifique et sélectionner les patients à haut risque évolutif susceptibles d’être
orientés vers des protocoles thérapeutiques adjuvants.
Les biomarqueurs tumoraux prédictifs d’une réponse ou non à une thérapie
donnée requièrent pour leur évaluation deux groupes de patients, de préférence
randomisés, pour un protocole thérapeutique spécifique par opposition, soit à l’absence de toute thérapie, soit à un protocole standard type. La valeur prédictive des
biomarqueurs est obtenue par l’analyse de tests statistiques évaluant l’interaction
entre le traitement et le statut des biomarqueurs (figure 2).
Figure 1 - De la définition d’une prédisposition, du dépistage au monitorage des protocoles
thérapeutiques.
Figure 2 - Définition des biomarqueurs pronostiques/prédictifs/mixtes. Classification basée
sur l’évaluation de l’évolution pronostique des populations de patients classés en fonction de
la présence (Fact+) ou de l’absence (Fact-) du biomarqueur dans leur tissu tumoral.
Evolution spontanée (A) ou avec un traitement adjuvant ou complémentaire (B).
A : évaluation pour une population sans traitement associé.
B : évaluation pour une population avec traitement associé.
86 Cancer du sein
Les critères finaux d’évaluation clinique des marqueurs pronostiques ou prédictifs peuvent être divers, tels que : la survie globale, la survie spécifique associée à
la pathologie, l’intervalle libre de toute évolution pathologique, le temps à progression. L’évaluation de la réponse tumorale à une thérapie donnée pouvant être la
modification du volume tumoral ou même la modulation d’un biomarqueur étroitement liée au volume tumoral. L’efficacité d’un protocole thérapeutique peut être
exprimée en terme de bénéfice absolu ou relatif. Le bénéfice relatif en termes de
survie est souvent exprimé comme un risque relatif (à savoir le risque de décès dans
le groupe expertisé divisé par le risque de décès dans le groupe central), ou un
« odds ratio » relatif (odds de survie versus de décès dans le groupe expertisé divisé
par l’odds de survie versus décès dans le groupe contrôlé. La probabilité ou « hasard
ratio » obtenu dans les modèles statistiques de régression multiple est souvent utilisé pour estimer le risque relatif.
Les tests statistiques d’évaluation quantitatives et qualitatives des biomarqueurs font appel aux tests statistiques standards habituellement utilisés dans les
évaluations cliniques et biologiques. Mais peu à peu s’est établie une nécessité d’une
évaluation multifactorielle pour ne retenir que les facteurs et marqueurs biologiques individuellement informatifs, éliminant de ce fait des marqueurs redondants, pour répondre à une question clinique donnée telle la sélection des patients
à haut risque ou potentiellement sensibles à une thérapeutique spécifique. La technique la plus généralement adaptée est dérivée d’un modèle d’évaluation de risques
développé pour les assurances : le modèle de Cox. Si ce modèle est actuellement un
standard, il demande une définition exacte des variables étudiées et ne prend pas en
compte la variation de certains paramètres biologiques ou cliniques dans le temps,
entre autres au cours de l’évolution du processus tumoral (4 et l’ensemble de la
revue Breast Cancer Research and Treatment 1992 (22) : 187-293). Des modèles
plus complexes non acceptés comme standards sont utilisés par certaines équipes.
Les approches analytiques multiparamétriques font appel également à des techniques de classification descriptives ou de hiérarchisation pour définir les relations
possibles entre facteurs, ou pour définir des clusters ou ensembles regroupant des
individus proches, si ce n’est pas identiques. Des pathologies tumorales, qui présentent un même profil biologique ou évolutif, se retrouvent ainsi isolées par des techniques analytiques telles les analyses en composantes principales ou analyse factorielle discriminante.
Bases objectives de jugement pour l’évaluation et la pertinence
des biomarqueurs tumoraux
En 1996, devant l’abondance, la dispersion et l’inhomogénéité des travaux et publications évaluant des marqueurs tumoraux potentiels, l’American Society of Clinical
Oncology a réuni un panel d’experts dans le but de poser des bases objectives de
jugement pour l’évaluation et la pertinence des biomarqueurs tumoraux (7-10).
Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 87
Ce groupe d’experts, dans le cadre de l’ASCO, a émis un certain nombre de
remarques et recommandations. Ils attirent l’attention sur le fait que les bases
méthodologiques pour définir des études correctement évaluables sont communes
à toutes les phases de la pratique clinique. Si ces bases sont actuellement bien
admises pour l’évaluation des protocoles thérapeutiques et répondent à des règles
précises pour le développement d’une molécule thérapeutique, phase 1, phases 2, 3,
4, critère de réponse, toxicité, etc., ces mêmes bases méthodologiques sont en
revanche mal connues ou peu utilisées dans le cadre de l’évaluation des biomarqueurs tumoraux.
Les experts rappellent dans ce cadre que :
– les études d’évaluation, comme pour les études cliniques protocolaires, doivent
être basées sur des hypothèses clairement établies, répondre et prendre en compte
une définition exacte des populations étudiées, des différentes sous-populations,
des analyses, des techniques de dosage, avec mise en évidence de techniques analytiques répondant aux critères d’assurance de qualité et contrôle de qualité ;
– les études doivent clairement identifier les problèmes éthiques et légaux associés à
l’accès aux échantillons tissulaires individuels, aux informations du dossier
médical des patients pour lesquels l’expertise tissulaire est effectuée et permettre
une évaluation claire du ratio coût-bénéfice, coût-efficacité.
Le travail du groupe d’experts a débouché sur la proposition d’un système d’évaluation des biomarqueurs « Tumor Marker Utility Grading System » (TMUGS), qui
repose sur :
– des recommandations pour la conduite des phases d’évaluation ;
– les deux principes de base suivants : le concept d’utilité et le degré d’évidence.
Recommandations pour la conduite des phases d’évaluation d’un paramètre biologique
Ceci peut se décomposer en quatre phases :
– phase 1 : issue d’une hypothèse ou évidence biologique, une cible moléculaire est
définie, une méthode analytique adaptée à la caractérisation et à la mesure de cette
cible dans les tissus pathologiques permettant une étude de faisabilité ;
– phase 2 : au sein d’un laboratoire maîtrisant la technique analytique, une étude
pilote est conduite sur un échantillonnage clinique précis. Le rôle du laboratoire
expert est de faire évaluer la standardisation de la méthode analytique et la mise
en route de contrôle de qualité pour que cette méthode analytique soit accessible
à un réseau de laboratoires, enfin d’établir une étude multifactorielle qui positionne le nouveau biomarqueur par rapport aux facteurs classiques ou déjà évalués, montrant les corrélations possibles et la valeur indépendante de ce facteur ;
– phase 3 : cette phase utilise les outils mis au point en phase 2. Un réseau de laboratoires associé aux groupes cliniques ayant constitué des banques tissulaires
conduit plusieurs études rétrospectives permettant une méta-analyse sur l’utilité
clinique du ou des facteurs prédictifs ou pronostiques ;
88 Cancer du sein
– phase 4 : mise en route et analyse d’un essai clinique prospectif dédié, déterminant
la valeur pronostique et la valeur prédictive des biomarqueurs tumoraux dans un
contexte d’utilisation prospective.
Le concept d’utilité
Le concept d’utilité définit la puissance relative des biomarqueurs pronostiques et
débouche sur une échelle d’utilité clinique.
Facteurs pronostiques (figure 3)
Figure 3 - Le concept d’utilité pour les facteurs pronostiques.
Concept d’utilité basé sur la différence du risque évolutif ∆RR entre deux populations de
patientes ayant la présence ou non dans leur tumeur primitive du biomarqueur pronostique.
L’évaluation pour chaque population du risque propre RRr (1 et 2) par rapport à une population référente permet de calculer secondairement le ∆RR, RR1-RR2.
Il repose plus sur la différence de risque relatif ∆RR, comme nous l’avons précisé,
que sur la signification statistique, la « p-value » dépendant, entre autres, de la taille
de l’échantillon.
Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 89
Dans le cadre de toute pathologie tumorale pour évaluer le concept d’utilité des
nouveaux paramètres pronostiques, les patients peuvent être divisés à partir des facteurs cliniques et anatomiques classiques en trois classes d’évaluation pronostique,
en l’absence de toute thérapeutique systémique adjuvante.
Par exemple, dans le cancer du sein :
- classe de très bon pronostic avec moins de 10 % de décès à dix ans ;
- classe de pronostic intermédiaire avec entre 10 et 50 % de décès à dix ans ;
- classe de très mauvais pronostic avec plus de 50 % de décès à dix ans.
La relative puissance d’un biomarqueur pronostique peut être définie comme
sa capacité à reclasser les patients définis sur des critères anatomo-pathologiques
standards (figure 4).
Figure 4 - Définition de la puissance relative des facteurs pronostiques. A : % de survie à dix
ans en l’absence de toute thérapeutique.
Exemple : un facteur pronostique puissant est celui qui sépare par sa présence ou non deux
populations de patientes à pronostic excellent et à pronostic le plus péjoratif.
Les classes d’évolution clinique (pronostic excellent, pronostic moyen, pronostic
péjoratif) découlent des études anatomo-cliniques historiques.
La puissance d’un biomarqueur s’évalue à l’importance de déplacement du pronostic prévu à partir des seuls éléments anatomo-cliniques :
- un facteur pronostique puissant déplace les patients à travers les trois classes standards d’un très bon pronostic ou pronostic le plus péjoratif (ou inversement) ;
- un facteur pronostique moyen déplace les patients entre deux classes classiques
contiguës : de très bon à moyen ou de moyen à très péjoratif ;
- enfin, un facteur pronostique faible déplace les patients au sein d’une même classe
standard ne modifiant pas le stade pronostique pré-établi.
90 Cancer du sein
Facteurs prédictifs (figure 5)
Il prend en compte la valeur prédictive (VPR) qui différencie le risque relatif (RR)
dans un groupe homogène de patients sans ou avec traitement spécifique, les
groupes homogènes étant isolés sur la présence ou l’absence du facteur prédictif
évalué. La puissance du concept d’utilité clinique du facteur prédictif est établie
entre une très forte VPR > 4 et une faible VPR entre 1 et 2.
Le concept d’utilité des facteurs pronostiques et prédictifs débouche sur une
échelle d’utilité clinique, échelle évoluant pour les facteurs présentant une utilité
potentielle de + à +++.
Figure 5 - Le concept d’utilité pour les facteurs prédictifs.
Deux populations de patientes sont caractérisées par la présence (m+) ou l’absence (m-) d’un
marqueur prédictif dans leurs tumeurs primitives.
La différence d’évolution ∆RR d’une même population avec ou sans traitement ∆RR m+,
∆RR m- permet de calculer le coefficient d’utilité de marqueur prédictif VPR.
+ Le biomarqueur a une signification biologique dans le processus tumoral, mais
ne peut être utilisé dans une décision clinique pour trois raisons :
- le biomarqueur proposé est corrélé à un marqueur dont le test est déjà établi et
l’avantage du nouveau biomarqueur n’est pas démontré ;
- le biomarqueur apporte une information indépendante, mais n’apporte pas la
preuve d’une utilité quelconque pour une décision clinique ;
- les résultats préliminaires sont encourageants, mais ne sont pas informatifs
concernant le niveau d’évidence d’utilité clinique.
Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 91
++ Le biomarqueur apporte une information indépendante et nouvelle, utile dans
la décision clinique, mais, s’il ne peut être utilisé isolément, il peut et doit être pris
en considération dans des conditions spécifiques.
+++ Le biomarqueur peut être utilisé comme un critère spécifique dans la décision
clinique et doit être introduit comme standard dans la pratique clinique.
Le concept de niveau d’évidence
Le degré d’évidence (Level Of Evidence, LOE) découle d’une analyse des différentes
expertises disponibles pour un marqueur donné et, de ce fait, doit être réévalué
régulièrement (6-9).
À terme, la conduite d’expertises selon les phases décrites permet l’évaluation
du niveau d’évidence d’utilité clinique des biomarqueurs tumoraux (cf. D. F.
Hayes) (Level Of Evidence = LOE) (figure 6).
Figure 6 - Déroulement d’une expertise des biomarqueurs prédictifs ou pronostiques.
Niveau III / LOE III – niveau le plus bas d’évidence : confirmation d’une hypothèse biologique par une large étude rétrospective. Les propositions thérapeutiques
et le suivi des patients peuvent être ou non déterminés de façon prospective. Mais
l’analyse statistique d’évaluation des marqueurs qui se fait de façon rétrospective ne
répond pas à des critères pris en compte de façon prospective lors du descriptif du
ou des protocoles thérapeutiques (objectif principal ou secondaire de l’étude).
92 Cancer du sein
Niveau II / LOE II : utilisation d’une technique analytique répondant au critère
d’assurance qualité et contrôle de qualité. Analyse de protocoles cliniques prospectifs où l’étude du marqueur est un objectif secondaire tant sur le plan du descriptif
du protocole que de l’étude statistique.
Niveau I / LOE I – niveau le plus élevé d’évidence : l’évaluation de l’activité clinique du biomarqueur tumoral fait l’objet d’une importante méta-analyse positive
ou compilation positive et concordante des études de niveaux II et III. Validation
par un protocole clinique prospectif « ad hoc » ou l’évaluation du biomarqueur
tumoral est l’objectif principal de l’étude dans son descriptif et analyse statistique.
Protocole incluant des groupes homogènes de patients sur les plans cliniques et thérapeutiques, ou, de façon idéale, un protocole clinique prospectif idéal pour l’évaluation des biomarqueurs. Protocole prospectif randomisé dans lequel le diagnostic
et les décisions cliniques thérapeutiques sont déterminés dans un bras en partant
sur les bases des résultats d’analyse des biomarqueurs. Dans le bras contrôle, le diagnostic et les décisions thérapeutiques sont, en revanche, indépendants des résultats
de l’analyse des biomarqueurs.
L’enjeu pour le développement d’un panel de biomarqueurs est clairement
démontré par l’analyse de l’ensemble des conférences de consensus sur la prise en charge
des cancers du sein, notamment sans envahissement ganglionnaire (No) (11-15).
Une classification idéale reflèterait parfaitement les données épidémiologiques
et cliniques qui montrent que seuls 30 % des cancers No évoluent à dix ans, nécessitant de ce fait un traitement systémique adjuvant. La conférence de consensus de
Saint-Gallen (14-15), établie uniquement sur des critères cliniques et anatomiques,
préjuge des indications justifiées de traitement systémique pour 90 % des patientes
No entraînant, de ce fait, un sur-traitement et l’exposition à des effets iatrogènes liés
à celui-ci (figure 7). Il en est de même pour les autres conférences de consensus établies à ce jour.
Figure 7 - Reconnaissance et isolement des populations de patientes présentant un cancer du
sein No classé en maladie locale ou maladie systémique selon une classification idéale en
accord parfait avec l’évolution clinique (A) et selon les critères de la Conférence de consensus
de Saint-Gallen (B).
Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 93
Bilan 2005 des biomarqueurs pronostiques ou prédictifs dans
les cancers du sein
Dans les cancers du sein, durant ces vingt dernières années, un très grand nombre
de biomarqueurs tumoraux tissulaires ont été étudiés par des techniques biochimiques, ELISA ou immuno-histochimiques (tableau 1) (16-18).
Cependant, un très petit nombre de ceux-ci ont été retenus dans les recommandations (figure 8) (10, 18, 19).
Parmi les marqueurs évalués comme ayant un niveau d’évidence I, les récepteurs
hormonaux RO_ et RP, ainsi que HER2, se retrouvent plutôt comme facteurs prédictifs. Les biomarqueurs pronostiques de niveau LOE I+++ sont UPA et PAI1, qui
n’avaient pas été pris en compte dans l’analyse du panel d’experts de l’ASCO (2000,
update). Ce, entre autres, du fait d’une série importante de publications entre 20002003 (figure 8).
Niveau
d’évidence
Paramètres
Pronostiques
(échelle d’utilité)
I
ROα/RP
HER 2
UPA + PAI I
+++
+/+++
+++
+++
?
II
Prolifération
(Phase S)
++
++
TK
++
+++
+
transcriptome
Mutations P53
MdR (induction)
TS
Topo II
Cyclin D1
Angiogenèse
ROβ
Bcl2/Bax
IGF1/AKT
Transcriptome
(L. Vant’Veer)
+
++
+
?
+
?
?
?
?
++
+
++
+
?
?
?
+
?
III
Prédictifs
(échelle d’utilité)
Tt endocriniens (AE)
Herceptin®
AE/Chimiothérapie
Antimétabolites
Anthracyclines
Anthracyclines
Taxane
Antimétabolites
Antracyclines
Tt. endocriniens
Figure 8 - Marqueurs biologiques dans les cancers du sein LOE et échelle d’utilité/Niveau
d’évidence (évaluation 2002). Tableau publié par le GETNA (OSMO) Magdelenat H., van
t’Veer L.
Classification réactualisée en 2003 d’après les références 10 et 18.
94 Cancer du sein
Biomarqueurs pronostiques LOE I/+++ dans le cancer du sein
UPA/PAI1
(8) :
Les facteurs de risque de dissémination métastatique infraclinique (tableau 1) les
plus étudiés sont les protéases et inhibiteurs. Les plus performants dans les analyses
multiparamétriques sont l’activateur du plasminogène type urokinase (uPA) et les
inhibiteurs des activateurs du plasminogène (PAI1 et PAI2). À titre d’exemple, dans
le cancer du sein, la population No représente globalement une classe de faible
risque dans laquelle cependant 20 % des patientes ont une évolutivité à six ans, 30 %
à dix ans. Les taux tissulaires élevés d’UPA et PAI1 se sont révélés, dans des études
conduites sur le plan européen, comme les paramètres les plus efficaces pour sélectionner cette sous-population à évolution rapide au sein d’une population de
malades à risque classique clinique faible (20-24) (figure 9).
Figure 9 - Évolution des marqueurs pronostiques de LOE I +++ des cancers du sein (19912002).
Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 95
Tableau 1 - liste des biomarqueurs pronostiques et prédictifs étudiés dans le cancer du sein.
Tumor characteristics
1. Histological features : type, grade, number of blood vessels, vascular invasion, necrosis.
2. Stage (tumor, node, metastasis), bone marrow micrometastases.
3. Steroid receptors : ER, PgR, AR, vitamin-D receptor ; steroid receptor coactivators
and coinhibitors.
4. Membrane receptors for hormones and growth factors.
LHRH
Prolactin receptor
IGF1 – IGFII
Insulin receptor
EGFR – herceptin family receptors (HER2/HER3/HER4)
TGFβ – family receptors
SSR family receptors
VEGF – family receptors
FGF – family receptors
Urokinase receptors
5. Enzymes, proteins and other cytoplasmatic factors
Plasminogen activator expression, (urokinase and tissular types).
Plasminogen activator inhibitors (PAI1,PAI2).
Cathepsin D, B, and L
Metalloproteases/collagenases (MMP4-9-8..), tissue inhibitor metalloprotease (TIMP1,2)
PSA (kallicrein)
Thymidine kinase activity
Thymidine Synthase activity
Growth factor content (EGF, TGF_ and _, IGF1, Amphiregulin)
Tyrosine kinase activities
Heat shock proteins (MSP 27-70-90).
Aromatase activity (CYP 19)
Haptoglobin-related protein (Hpr) epitope expression
Adhesion factors (integrin, E cadherin)
Glutathione –S-transferase 3
Human milk fat globule antigens (HMFG-1)
Prostaglandin levels
Cox2 activity
Hypoxia-inducible factor-1_
Breast cancer resistance protein
Multidrug-resistance-associated protein
Bcar1/p130 as protein
6. Chromosomal abnormalities
Cytogenetic
Ploidy
Amplification, (over)expression of oncogenes (c-myc, HER2/neu/c-erbB2, int2, ras)
Deletion or mutation of suppressor genes (P53, RB, nm23)
BRCA1/2 mutations
7. Cell proliferation indices
Labeling index
S-phase fraction
Ki-67 antigen (RB1)
8. Clonogenicity
9. Immunological phenotypes
(revue réactualisée 2003 d’après J. A. Foekens et J.G. M. Klijn (16-18).
96 Cancer du sein
À l’inverse, dans des populations de cancer du sein avec envahissement ganglionnaire (N+), les taux tissulaires faibles de ces mêmes paramètres (UPA, PAI1) définissent une sous-population représentant des cancers à évolution lente, répondant
parfaitement aux thérapeutiques. Cette sous-population représente, en fait, des cancers à évolution lente, mais diagnostiqués après un délai d’évolution important. La
démarche analytique mise en place dans le cadre de réseaux européens pour les cancers du sein (EORTC, Biomed I) a permis une évaluation dans le cadre d’analyses
multiparamétriques et une validation dans des essais prospectifs permettant d’atteindre le LOE I+++, uPA et PAI 1 (figure 10) où ils sont actuellement pris en
compte comme facteurs de sélection des patientes pour des essais thérapeutiques en
cours (25-29) (figures 11 et 12).
Figure 10 - Etude du RBG/EORTC : méta-analyse des dosages des récepteurs UPA/PAI1 dans
les tumeurs primitives de 8 377 regroupant 15 laboratoires – équipes cliniques européennes
ayant permis avec le suivi des patientes sur dix ans (RFS : survie sans évolution clinique) dans
des études rétrospectives de calculer le risque relatif dans chaque population.
Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 97
Essai prospectif de niveau 1 permettant d'évaluer la valeur
pronostique et prédictive de uPA/PAI 1 (Chemo NO)
(Thomssen C et Jänicke F, Eur. J. Cancer (2000) 36 : 293-306,
Jänicke et al., JNCI (2001) 93 : 913-20
pre-and
Postmenopausal
receptor-positive
uPA and PAI-1 low
ca. 55 % of all patients
ca. 45 % of pts.
uPA and/or
PAI-1 high
Randomisation
Inclusion criteria :
node-negative, MO
1 cm, 5 cm
Stratification
Study design
Observation (A)
Observation (B 1)
CMF x 6
(B 2)
Figure 11 - Cancer du sein NO. Protocole européen Biomed I.
Promoteurs : Pr F. Janicke, Pr M. Schmidt, université de Munich, 1995.
Figure 12 - Résultat du protocole Biomed I versus l’étude Pilot ayant justifié la mise en route
du protocole Biomed I. Arrêt à la demande du comité d’éthique à la cinquième année devant
la confirmation du risque déterminé par la mesure de UPA PAI1, ce qui rendait inéthique le
bras randomisé non traité.
98 Cancer du sein
Figure 13 - Positionnement de la classification biologique associée à la mesure UPA/PAI1
par rapport à la classification idéale (A) et les critères de Saint-Gallen (B) (figure 7).
Dans le cancer du sein, l’utilisation des paramètres tissulaires UPA PAI1 permet
une sélection biologique des patientes No d’un groupe ne nécessitant pas de thérapeutique systémique (60 %), et d’une population nécessitant une thérapeutique
adjuvante (40 %), ces pourcentages étant proches de la réalité clinique (70 % -30 %)
(figure 13).
Le rôle majeur pronostique de UPA/PAI 1 peut s’expliquer par leur activité
physio-pathologique. Dans le phénomène cancéreux, les activités protéolytiques
mises en jeu sont la conséquence d’un réseau complexe et interactif de plusieurs systèmes protéolytiques. Les systèmes impliqués incluent les métalloprotéases, les
sérines protéases, dont la plasmine générée à partir du plasminogène par un système
d’activation spécifique, les cystines protéases, ainsi que d’autres enzymes extracellulaires (30-34).
Ces différents systèmes enzymatiques interagissent non seulement dans le but
d’activation de « pro-enzymes » et enzymes actifs, mais également certains enzymes
partagent les mêmes substrats (35-39) et interagissent dans le processus d’invasivité,
de migration et de néo-angiogenèse.
Le système d’activation du plasminogène est un système protéolytique complexe
capable de produire de grandes quantités de plasmine (enzymes actifs à partir de
son précurseur, le plasminogène). Le plasminogène est une prosérine protéase de
90kDa produite par le foie et sécrétée dans le système vasculaire à très haute concen-
Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 99
tration (1,5 à 2 mM). Le plasminogène peut également être trouvé dans les compartiments extra-vasculaires (30, 40). De ce fait, cette pro-enzyme plasmatique et tissulaire est disponible de façon importante pour une activation par des systèmes spécifiques (le système d’activation du plasminogène PA).
La plasmine est une protéase relativement non spécifique qui peut, directement
ou à travers sa capacité d’activer des prométallo-protéases, dégrader la plupart des
constituants de la matrice cellulaire (41-44). De plus, la plasmine active divers systèmes tels que les facteurs de croissance (à titre d’exemple, le TGFβ) (45-46), qui
peuvent secondairement moduler les interactions intervenant entre tumeur et environnement, et, entre autres, le développement des phénomènes de néo-angiogenèse
et de migration cellulaire (47-50). Récemment, il a été mis en évidence que la néoangiogenèse peut par ailleurs être fortement inhibée par un fragment du plasminogène (l’angiotensine) (51-52).
L’activation du plasminogène est catalysée par deux types d’activateurs différents, les activateurs de type urokinase (uPA) et de type tissulaire (tPA).
Récemment, il a également été montré que le facteur XIIa était également un activateur physiologique du plasminogène (53).
De très nombreux arguments suggèrent un rôle majeur de l’activation du plasminogène par uPA durant l’invasivité tumorale. De nombreuses études utilisant
l’immuno-histochimie et l’hybridation in situ ont montré que l’uPA et uPAR sont
surtout exprimés dans les foyers tumoraux invasifs, que ce soient des tumeurs expérimentales ou des cancers humains. Certains modèles cellulaires sont connus pour
exprimer à la fois uPA et uPAR. Dans d’autres cas, les cellules cancéreuses aux foyers
d’invasivité tumorale n’expriment que uPAR et ce sont les cellules stromales adjacentes aux cellules tumorales invasives qui produisent l’uPA (ce qui a été démontré,
entre autres, dans les adénocarcinomes du côlon) (54-55). Par ailleurs, plusieurs
modèles expérimentaux ont montré un retard à la croissance, que ce soient des
tumeurs primitives ou des métastases, lorsque l’activité uPA est inhibée (56-64).
Dans un modèle de souris transgénique uPA-/-, il a été montré que la transformation maligne et la croissance des tumeurs mélaniques chimiquement induites
étaient réduites (65).
Le rôle de PAI1 dans le développement tumoral n’est, à ce jour, pas clairement
élucidé. Il joue probablement des rôles différents et variables selon le type de cancer.
Quatre hypothèses différentes peuvent être proposées quant au rôle de PAI1 dans la
progression tumorale :
- PAI1 protège l’ensemble du stroma tumoral de l’autodégradation secondaire à la
plasmine activée par l’uPA ;
- PAI1 joue un rôle dans l’établissement de l’invasivité et la dissémination des cellules tumorales, en réduisant l’adhésion cellulaire par un déplacement de l’uPAR
ou des intégrines de leur interaction avec la vitronectine ;
- PAI1 est lié à la néo-angiogenèse. Exprimé dans les capillaires borgnes, il est de ce
fait un marqueur de l’intensité de la pénétration de la néo-vascularisation dans la
tumeur ;
- PAI1 ne serait qu’un marqueur d’une phase aiguë inflammatoire associé à certaines croissances tumorales.
100 Cancer du sein
Biomarqueurs prédictifs LOE.I +++ dans les cancers du sein/Récepteurs
hormonaux HER2
Récepteurs hormonaux (figures 8 et 14)
Biomarqueur facteur préditif
LOE / Niveau d'évidence I
Récepteurs d'hormones ROα + RP
Pronostic (I/II)
Prédictif (I/II)
+
+++ (hormonothérapie)*
• NSABP
• SWOG
• ·FNCLCC
• RBG/EORTC
• EBCTCG
• DBCG
Figure 14- Etudes cliniques majeures ayant permis d’évaluer la valeur prédictive ou pronostique de la mesure des récepteurs hormonaux Roα RP.
Les premiers dosages des récepteurs ont été développés en 1972 (66) pour sélectionner les patientes susceptibles de répondre à une endocrinothérapie de castration
qui était alors la seule thérapeutique accessible avec l'hormonothérapie à dose pharmacologique dans le cadre d'un traitement palliatif (67-70).
De très nombreuses études, réalisées sur des séries importantes de patientes, ont
mis en évidence, depuis, l'étroite corrélation entre la présence de récepteurs hormonaux et la réponse à l'hormonothérapie anti-estrogénique et/ou à des protocoles de
chimiothérapie type CMF. Par ailleurs, la durée de réponse est corrélée aux taux des
récepteurs (71-72).
L'utilisation systématique de ces dosages et l'étude de la survie des patientes à la
fin des années soixante-dix ont ensuite permis au groupe de W L McGuire de montrer leur valeur pronostique. Cependant, l'interférence des protocoles de thérapeutique adjuvante n'avait pas été prise en compte dans cette analyse princeps.
L'utilisation des R.Oα. seuls permet une prédiction de la réponse au traitement
dans environ 75 % des cas. Le manque de précision de la prédiction de la réponse
est principalement dû à l'absence de réponse de certaines tumeurs R.Oα.+. Ceci
peut provenir de l'hétérogénéité d'expression des R.Oα. dans les cellules tumorales
ou à la présence d'un R.Oα. dépourvu d'action biologique. Le récepteur de progestérone (RP) (71-73), ou PS2 (74) dont la synthèse est induite par le R.Oα., ont été
proposés secondairement pour améliorer la valeur prédictive des R.Oα.
Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 101
La détection des récepteurs hormonaux a été dans un premier temps réalisée par
des méthodes biochimiques (75-78) dont la fiabilité a été largement validée. Dans le
bilan, il est précisé que seule cette technique a fait l’objet d’une évolution et une validation, avec mise en place de protocoles méthodologiques standardisés et de
contrôles de qualité (76-90). Cette approche a permis l'établissement de seuils spécifiques précis au-delà desquels on peut escompter une réponse clinique ou établir
un pronostic (67-69, 91-94).
Les méthodes biochimiques-biologiques impliquent la préparation d'un extrait
tissulaire après homogénéisation du tissu. La production d'anticorps anti-récepteurs a ouvert de nouvelles perspectives techniques, dosages immuno-enzymatiques
ou détection sur des coupes histologiques. Une bonne corrélation en terme de positivité est généralement rapportée entre les techniques biochimiques et immuno-histochimiques. L’insuffisance majeure de l’immuno-histochimie réside dans le
manque d’une expression quantitative objective du contenu en récepteur. Or une
efficacité supérieure des thérapeutiques endocriniennes a été démontrée lorsque les
taux en récepteurs sont plus élevés (67-68, 95-96). Les deux approches méthodologiques sont en fait complémentaires, chacune ayant ses avantages relatifs (97-99).
L'importance clinique des récepteurs a été établie à une époque où seuls les
dosages biochimiques traditionnels étaient disponibles. On a ainsi montré l'évolution péjorative des patientes dont les tumeurs étaient dépourvues de récepteurs
(100-101). Il est cependant difficile, d'après les études initiales incluant des patientes
ayant reçu divers protocoles thérapeutiques, de distinguer leur valeur pronostique
propre de leur valeur d'indicateur thérapeutique (10, 67-72). Dans les études univariées, les estimations de risque relatif sont de l'ordre de 1,5 à 2, et elles sont souvent
inférieures dans les études multivariées. Un apparent paradoxe a été décrit concernant les tumeurs en post-ménopause ayant des taux très élevés de ROα. Ces
tumeurs évoluent spontanément relativement rapidement, mais répondent extrêmement bien aux protocoles d'hormonothérapie, suggérant une stimulation de ces
tumeurs par des facteurs endocriniens endogènes, associés à une activité aromatase
tissulaire péritumorale (102-104).
En 1996, un deuxième récepteur (ROβ), situé sur le chromosome 14, a été isolé
(Kuiper et al. 1996). Le premier, localisé sur le chromosome 6, a donc été rebaptisé
ROα. Ils se distinguent par un faible degré d’homologie dans le domaine A/B et
dans le domaine de liaison aux estrogènes (régions DEF). Une étude récente par RTPCR montre que les deux types peuvent coexister dans les cancers du sein (105). La
détection classique des RO dans le cytosol des tumeurs par radio-ligand permettait
d’évaluer les présences des deux types de récepteurs dans la tumeur. Par contre, il est
possible que le dosage immuno-enzymatique, fait avec les anticorps commercialisés,
ne permette pas d’évaluer la quantité des deux RO avec la même sensibilité. Ce
dosage mis au point pour quantifier la concentration du ROα est considéré comme
un facteur de bon pronostic et de sensibilité au traitement hormonal.
Les récepteurs continuent à jouer un rôle central dans la décision d'un traitement hormonal. Le consensus actuel dans le cancer du sein est donc que les récepteurs hormonaux sont des paramètres corrélés en premier lieu à la réponse thérapeutique et ne sont liés à l'évolutivité des patientes que secondairement, à savoir que
102 Cancer du sein
leur évolutivité est influencée par la mise ou non en route de protocoles thérapeutiques. De ce fait, les récepteurs hormonaux sont plutôt des facteurs prédictifs que
pronostiques (paramètres de sélection et de réponse et liés à la réponse aux thérapeutiques). La limite de prédictivité parfaite d’hormono-sensibilité liée à la seule
détermination des récepteurs hormonaux telle que nous l’avons décrite a conduit
depuis 1992 a proposé plusieurs hypothèses et expertises complémentaires, afin de
mieux cerner le pourcentage de tumeurs primitives ROα+, certes, mais répondant
mal aux protocoles d'hormonothérapie.
Dans ce cadre, il a été suggéré :
- RO+, certes, mais une hétérogénéité cellulaire avec ROα- secondaire à un temps
de doublement rapide associé à cette fraction cellulaire tumorale. Ceci nécessite,
pour certains auteurs, la détermination séquentielle des RH au niveau de la
tumeur primitive, mais également des métastases, pour mieux ajuster les protocoles thérapeutiques à la biologie réelle des récidives et métastases (105-106) ;
- la détection des mutations des ROα ont été recherchées telles celles décrites dans
des lignées cellulaires, mais les tumeurs exprimant des ARNm mutés, codants
pour une protéine tronquée, sont rares (107) ;
- une meilleure compréhension de la biochimie moléculaire des récepteurs prenant
en compte l’expression des facteurs de régulation : co-activateurs, co-inhibiteurs,
associés à l’évaluation des différentes isoformes des récepteurs estrogéniques
(ROα et ROβ entre autres) devrait fournir des éclaircissements sur leurs mécanismes de régulation et leur réponse aux thérapies (107-112). Une revue générale
récente a été faite au Congrès de la Société française de sénologie (« 25 ans d’évolution ». Récepteurs hormonaux et pathologie mammaire, Marseille, 1980.
Hormones et sein, Paris, 1990. Sein, hormones et anti-hormones, Nancy, 2004.
26es Journées de la Société française de sénologie et de pathologie mammaire,
Nancy, novembre 2004, p. 22-45).
La liaison des estrogènes à leurs récepteurs induit une modification conformationnelle caractéristique amenant la dimérisation du récepteur, sa liaison à l’ADN au
niveau de régions spécifiques, appelées élément de réponse aux estrogènes (ERE),
situées dans la région promotrice de gènes dont ils vont moduler l’expression (108).
L’action transcriptionnelle du RO nécessite sa liaison à d’autres protéines
nucléaires, appelées adapteurs ou co-activateurs, qui vont servir de facteurs transcriptionnels intermédiaires (109).
Le rôle de ces protéines en tant que modulateurs de l’activité transcriptionnelle
des récepteurs nucléaires a pu être mis en évidence sur des gènes témoins, soit par
transfection transitoire de cellules de mammifères, soit dans le système de la levure.
Le développement récent de travaux expérimentaux et cliniques suggèrent que,
dans une cellule donnée, la balance entre co-activateurs et co-répresseurs pourrait
rendre compte de la capacité de certains anti-estrogènes à bloquer ou non l’action
des estrogènes.
Deux études ont montré que la surexpression du co-facteur SRC-1, capable de
lier l’extrémité carboxyl terminal du RO, entraîne une stimulation de l’activité agoniste du 4-OHTam, mais est incapable d’inhiber l’action antagoniste de l’anti-estro-
Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 103
gène (110). Par contre, les mêmes auteurs ont montré que SMRT était capable de
diminuer l’activité agoniste du 4-OHTam sans affecter l’activité en présence d’estradiol. Un travail récemment publié (111) présente, dans le cadre d’une cohorte des
patientes ménopausées traitées par tamoxifène, l’expertise rétrospective de 27 corégulateurs de ROα dans les tumeurs primitives du sein RH+. Cette étude montre
que l’expression forte du co-répresseur NCOR1 est un facteur prédictif de la
réponse à l’hormonothérapie et devrait, de ce fait, être plus largement expertisé.
La prise en compte du taux des ROβ dans les cancers du sein, et non de son
variant ROβcx, serait un élément complémentaire pour mieux prédire la résistance
au tamoxifène (113). Par ailleurs, une étude récente confirme que la mise en évidence de la phosphorylation du ROα sur la sérine 118 serait associée à une
meilleure sensibilité au tamoxifène, confirmant les résultats obtenus sur des
modèles pré-cliniques (114).
Enfin, d’autres études des voies de résistance aux anti-estrogènes font appel à
l’activation de voie signalitique des facteurs de croissance, à la famille des herégulines, aux voies métaboliques de la biosynthèse des bases pyrimidiques (TK entre
autres) et de contrôle du cycle cellulaire (cyclines et protéine kinase associée dont la
cycline D1, P53…). Mais ces facteurs n’ont pas franchi toutes les étapes d’évaluation
et de validation pour une utilisation clinique, à l’exception de HER2.
HER2 – cerbB2/neu
L’oncogène HER2 est l’un des marqueurs moléculaires les plus étudiés ces dernières
années. c-erbB-2 code pour une glycoprotéine transmembranaire de 185 KDa
(p185) qui est un récepteur de facteur de croissance avec une activité tyrosine kinase
et dont la partie extra-cellulaire présente une homologie avec celle du récepteur de
l’epidermal growth factor (EGFR). La surexpression de HER2 conduit à une activation de la transcription de gènes régulant la progression dans le cycle cellulaire.
L’évaluation et la validation de la détermination de HER2 comme facteur LOE
I+++ (prédictif > pronostique) est exemplaire (figure 15) depuis la description
princeps faite par D. Salmon en 1987, reliant la surexpression de HER2 à une amplification, un nombre très important de travaux, tant sur le plan fondamental que sur
l’évaluation clinique, portant sur l’amplification et surexpression de HER2, est parfaitement présenté dans l’ouvrage édité par Y. Yarden (115). Une application des travaux de recherche fondamentale portant sur HER2 a débouché sur la mise au point
d’un anticorps bloquant efficacement en clinique humaine le trastuzumab
(Herceptine).
104 Cancer du sein
Figure 15 - Données actuelles sur la valeur prédictive ou pronostique des techniques de caractérisation de HER2.
Une revue générale en 1997 (116) des études séparées portant sur 22 616 patients
montre que, dans les cancers du sein, la présence de c-erbB2 est en moyenne
retrouvée dans 26 % des cancers (avec une échelle de 5 % à 55 %). Cette revue générale associée à d’autres bilans (18-116) montre qu’une majorité des études publiées
sur le sujet conclue à une signification pronostique péjorative de la sur-expression
(Allred, 1992) ou de l’amplification de c-erbB-2, essentiellement dans les cancers du
sein avec envahissement ganglionnaire (Tandon, 1989). Plusieurs études ont montré
qu’une amplification ou qu’une sur-expression de c-erbB-2 est également corrélée à
une résistance à une hormonothérapie par tamoxifène, en phase adjuvante ou métastatique (Borg, 1994 ; Carlomagno, 1996 ; Wright, 1992). Elledge (1998), dans une
série rétrospective de patientes RE positives, n'a pas retrouvé cette tendance.
Cependant, la plupart de ces études ont utilisé des méthodes immuno-histochimiques, avec des conditions techniques et des anticorps différents, ce qui rend les
comparaisons difficiles (Press 1994, Têtu, 1994).
Plusieurs points sont cependant importants à rappeler dont, entre autres, la relation claire entre amplification de HER2 et perte ou dissociation de l’expression des
récepteurs hormonaux (RO, RP).
Dans les cancers du sein de patientes ménopausées (117), les tumeurs négatives
(RO- et RP) ont le taux de HER2 amplifié le plus élevé (47 %) ; a contrario, les
tumeurs très fortement positives RO++ (≥ 200 fentomole) et RP++ (> 100 fentomole) ont le pourcentage HER2 amplifié le plus faible (6 %). Entre ces deux
Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 105
extrêmes, les tumeurs RO+ et RP+ ont un pourcentage HER2 amplifié moyen de
22 %. Par contre, les tumeurs dissociées (RO-RP+ et RO+RP-) ont un taux d’amplification de HER2 proche des tumeurs négatives, soit 40 %.
Les cancers du sein canalaires infiltrants ont une fréquence de positivité à HER2
supérieure aux cancers in situ et les pourcentages de HER2 les plus élevés sont associés au grade histopronostique et nucléaire III, à l’aneuploïdie et au taux de prolifération intratumorale le plus élevé (quelle que soit la méthode de détermination).
Le développement d’un dosage analytique quantitatif pour l’expression de
HER2 permet de définir une répartition de la sur-expression non homogène avec
une répartition, en fait, bimodale. Ceci permet d’isoler 12 % des tumeurs sur-exprimant très fortement HER2 et qui sont RO- (ou RO très faible ou associé à RP-) et
présente, par ailleurs, un taux très important de HER2 phosphonylé (Y-1248-P) ; ce
sont enfin les tumeurs les plus résistantes aux thérapeutiques anti-estrogéniques ou
chimiothérapiques (CMF entre autres) (118).
En 1998, un travail de S. Koscielny attire l’attention sur une signification péjorative associée à certains taux très faibles d’expression de HER2. Ceci a fait l’objet
d’une controverse argumentée car ce fait paradoxal n’a pas été retrouvé par d’autres
auteurs (116-119).
Par contre, le groupe de D F Hayes et I C Henderson en 2001 (120) démontre la
signification péjorative d’un sous-groupe de patients sur-exprimant HER2, mais
dont on peut détecter dans le sérum la présence du domaine extracellulaire (ECD)
de HER2. Cette forme circulante du ECD/ HER2 ou S HER2 peut être due au relargage après protéolyse par des métallo-protéases spécifiques. Ce clivage du domaine
extracellulaire, bloqué, entre autres, par l’anticorps Herceptin®, a pour conséquence
la libération et l’activation du domaine intracellulaire. L’ensemble de ces raisons,
associé à un mauvais pronostic avec l’activation de HER2 et la facilité de détermination de ces paramètres sériques, devrait prendre une place précise dans l’évaluation des patientes.
L’évaluation rapide des degrés d’évidence LOE I associée à la détermination de
HER2 (cf. figure 15) est liée au développement des essais protocolaires thérapeutiques, qui démontrent l’efficacité de la détermination d’une amplification de HER2
comme test prédictif de sensibilité à une thérapeutique spécifique utilisant un anticorps anti-HER2 (trastazumab).
Dans ce cadre, les résultats des protocoles MO 648 g-MO 649 g-MO 650 g sont
exemplaires (ASCO 2001). Dans le protocole MO 648 g incluant 469 patientes, une
augmentation du bénéfice clinique liée au trastuzumab chez les patientes traitées
par chimiothérapie ou chimiothérapie et trastuzumab est démontrée chez les
patientes sélectionnées par FISH où le bénéfice se traduit par un RR = 0,71.
Dans les études MO 649 g/MO 650 g (336 patientes incluses dans les deux études
IHC Dako 2+/3+).
Le taux de réponse au trastuzumab (en ce qui concerne les réponses complètes,
partielles ou stabilisation > huit mois) en fonction de la détermination de l’amplification de HER2 par technique FISH, est dans le protocole MO 649 g pour les
patientes FISH + de 24 %, alors que les patientes FISH ne présentent aucune
106 Cancer du sein
réponse ; dans le protocole MO 650 g, les patientes FISH + ont un taux de réponse
de 48 % ; en revanche, les patientes FISH- présentent un taux de réponse de 10 %.
Un intérêt particulier supplémentaire à la détermination HER2 dans ces
tumeurs a été soulevé par la publication à l’ASCO 2000 d’une étude démontrant
une réponse favorable des patientes HER2 aux protocoles de chimiothérapie comportant des anthracyclines. En fait, l’amplification de HER2 dans le bras long du
chromosome 17 fait partie d’un Amplicon associant ou non l’amplification de la
topoï-isomérase II, et une étude (2002) démontre la sensibilité aux protocoles comportant des anthracyclines chez les patientes HER2+ amplifiées si celle-ci est associée à une amplification de la topoïsomérase II (121). Mais ce résultat reste à
confirmer. Les résultats présentés à l’ASCO 2005 concernant les protocoles associant chimiothérapie/Herceptin® dans les cancers du sein confirment le niveau
LOEI/I prédictifs du statut HER2.
Une étude récente du Southwest Oncology Group Study (Clin, vol. 10, n° 17
5670) met en évidence, dans les tumeurs du sein évoluées RO_ positives proposées
pour une thérapeutique par tamoxifère, l’intérêt de la prise en compte de l’expression de HER2 pour être associé à une amplification et de l’expression de HER1 pour
prédire l’évolution clinique et la sensibilité à la thérapeutique.
Biomarqueurs de niveau LOEII et LOEIII (figure 8)
Le récepteur de l’EGF (LOEIII)
Le récepteur de l’EGF (EGFR/HER1) est une glycoprotéine transmembranaire de
170 kD exprimée dans une grande variété de types cellulaires. La surexpression de
EGFR a été mise en évidence dans les tumeurs mammaires humaines. Elle est corrélée positivement au grade histo-prognostique de Scarff Bloom Richardson et à
l’absence des récepteurs stéroïdiens. La valeur pronostique de EGFR dans les cancers du sein est l’objet de controverses. Cependant, une méta-analyse compilant
quarante études séparées et regroupant 5 232 patients montre que le pourcentage de
positivité à l’EGF-R est en moyenne de 45 %, avec une variabilité très grande (de 14
à 91 %) en fonction des techniques utilisées (122). Neuf des quinze études montrent
une association négative entre le taux d’EGF-R et les courbes de survie actuarielles
en analyse univariée. Deux autres études montrent une tendance non significative
dans le même sens. Sept études ont utilisé une approche analytique multivariée.
Deux démontrent clairement la valeur pronostique indépendante de l’EGF-R
comme facteur péjoratif (123, 124). Les autres études montrent la même tendance,
mais avec une valeur statistique plus faible. Par contre, toutes les études ayant pris
en compte un traitement hormonal montrent une association importante de l’EGFR avec l’hormono-résistance (125, 126). Cependant, dans chaque étude, la surexpression d’EGF-R est associée négativement avec le taux des récepteurs hormonaux.
Le faible taux de ceux-ci doit être pris en compte dans l’analyse de l’hormono-résistance (127).
Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 107
La signification pronostique est plus controversée selon les études et aucune
série d’études d’importance comparable à celles conduites pour HER2 n’a été
publiée à ce jour concernant le bénéfice possible lié aux blocage de l’activité tyrosine kinase associée à HER1. Des protocoles d’évaluation sont actuellement en cours
dans d’autres pathologies tumorales, peu dans les cancers du sein.
La thymidine kinase (LOEII) (figure 8)
La thymidine kinase (TK) a un rôle majeur dans la synthèse de l’ADN. Elle recycle
la thymidine issue du catabolisme de l'ADN cellulaire. Ce rôle de sauvetage est particulièrement augmenté dans les cellules tumorales mammaires. La conversion de la
thymidine (dT) en déoxythymidine monophosphate (dTMP) met en jeu une
enzyme spécifique, la déoxythymidine kinase (TK). Deux iso-enzymes ont été
décrites pour la TK : la TK1, la TK2. La TK2 mitochondriale est une activité
constante non régulée par le cycle cellulaire. La TK1 est une iso-enzyme cytosolique
initialement décrite dans le foie fœtal, puis mise en évidence dans les tissus à prolifération rapide (128). Dans les cellules eucaryotes, les taux de TK1 sont extrêmement élevés en phase G1-S, mais ils sont à la limite de la détection dans les autres
phases du cycle. Dans les cancers du sein, l'activité de la TK1 est liée à la composante
tumorale, et les taux élevés ont une valeur pronostique péjorative (129-137). La TK1
est un facteur pronostique indépendant chez les patientes pré-ou post-ménopausées, chez les patientes N- sans traitement adjuvant et chez les patientes N+ ayant
reçu des protocoles de thérapie incluant le protocole de chimiothérapie adjuvante
CMF et FAC (138-139). Une corrélation inverse a été rapportée entre les taux de TK
et la durée de survie sans récurrence chez ces patientes. Des travaux réalisés par
notre groupe montrent que des taux tumoraux élevés de TK sont associés à une
non-réponse au tamoxifène (140). Il n’existe actuellement aucun inhibiteur direct
spécifique de la TK1.
Marqueurs associés à la néo-angiogenèse (LOEII/LOEIII)
Depuis une dizaine d’années, sur les plans fondamental et expérimental, mais également clinique, une notion importante a pris corps : la relation entre la tumeur et
son micro-environnement. Dans ces interactions complexes, de multiples facteurs
paracrines entrent en jeu et sous-tendent le développement tumoral, mais également le processus d’invasion de métastases (141). Au centre de ces interactions,
nous retrouvons les protéases et facteurs de croissance qui concourent au développement et à l’organisation de la néo-angiogenèse tumorale indispensable à la croissance tumorale et facteur indispensable au processus métastatique.
Le VEGF a été un des facteurs biologiques les plus étudiés à ce jour pour sa
valeur pronostique, entre autres dans les tumeurs sans envahissement ganglionnaire
N0 (142-146). L’analyse d’une approche histo-pathologique avec comptage des néocapillaires apporte également une valeur pronostique, mais avec une réelle dispersion entre les différentes études liées au problème technique (comptage direct ou
immuno-histochimie, large du champ d’observation, localisation de ce
champ…) (147).
108 Cancer du sein
La prise en compte de la néo-angiogenèse tumorale apporte, en fait, un éclairage
important dans le profil biologique des tumeurs et a permis d’argumenter l’hétérogénéité d’évolution et d’agressivité de certaines tumeurs versus d’autres.
L’ensemble des facteurs biologiques permettant de mieux cerner la dynamique
propre de chaque tumeur, isolant de ce fait à un stade clinique identique des
tumeurs très agressives prises précocement de tumeurs plus lentement évolutives de
pronostic évolutif plus favorable pris à un stade plus tardif de leur évolution chronologique (146-149).
D’autres facteurs associés à l’angiogenèse font l’objet d’études récentes : expression HIF1α, CD31, CD105, TGFβ… Ceux-ci semblent être des facteurs intéressants,
mais sont loin d’être totalement évalués et validés.
Tyrosines kinases (LOEIII)
La prolifération cellulaire normale ou maligne est associée à la stimulation de cascades de transmission du signal impliquant la phosphorylation/déphosphorylation
de résidus tyrosine de certaines protéines cibles, et ceci en réponse à la stimulation
par les facteurs de croissance (150) de certains récepteurs spécifiques portés par la
cellule, ou comme expression de certains oncogènes (151). Sur l’ensemble des tyrosines-kinases décrites à ce jour, la dérégulation d’une trentaine environ est associée
au processus tumoral (« oncogénique », tyrosine-kinase = OKT) (152). Les activités
tyrosines-kinases (PTK) impliquées dans les cascades de transmission du signal
sont, soit cytosoliques, soit associées à la membrane plasmique, en particulier sous
la forme de domaines catalytiques de protéines trans-membranaires, tels EGFR,
IGFR et c-erbB2 dont la présence a été rapportée dans les cancers du sein. De nombreux oncogènes codent pour des PTK ou pour des protéines intervenant dans la
régulation de leur activité. Les mutations et les amplifications affectant ces oncogènes aboutissent à une augmentation et à une dérégulation des activités PTK
membranaires ou cystoliques. Si, dans les lames du sein, la mesure spécifique des
facteurs de croissance, de leurs récepteurs et de l’activité tyrosine-kinase associés
peuvent être utilisés dans le ciblage thérapeutique spécifique, en revanche, la valeur
pronostique de ces paramètres fait l’objet de controverses (153-158).
Cycline D1 (LOE.III)
Les cyclines jouent un rôle important dans les différentes phases du cycle cellulaire.
La cycline D1 joue un rôle capital dans le passage du point de restriction de la phase
G1. La perte de l’expression de P16 (159, 160) et la perte de fonctionnalité de la protéine Rb sont associées à une progression tumorale incontrôlée. Par contre, l’amplification et la sur-expression de la cycline D1, également associée à la sur-expression
de CDK4, sont un facteur de non-contrôle du cycle cellulaire lié à la progression
tumorale. Récemment, l’amplification de la cycline D1 a été associée à une insensibilité aux molécules anti-estrogéniques (161).
Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 109
Oncogènes – gènes suppresseurs de tumeur (LOE III), hyperméthylation des promoteurs
Depuis 1985, l’altération de plusieurs oncogènes, dont cMyc-Int2-cerbB2, fait
l’objet de multiples travaux pour en évaluer la valeur pronostique de façon isolée ou
concomitante (162).
CMyc (chromosome 8) : l’amplification de cMyc est diversement reportée : 1-56
% des cancers du sein, avec une moyenne de 20 % (163). La valeur pronostique
associée à l’amplification de cMyc a été reportée dès 1992 (164-165). Une méta-analyse publiée en 2000 confirme l’amplification de cMyc dans 15,7 % en moyenne des
cancers du sein et une valeur pronostique associée à l’amplification avec un risque
de récidive (RR = 2,05) et d’évolutivité péjorative (RR = 1,74) de décès par cancer.
Ce paramètre semble significatif en lui-même car il présente une très faible association avec l’envahissement ganglionnaire et le statut négatif des récepteurs hormonaux (165-166).
Int2 : l’amplification de cet oncogène est associée à un amplicon situé en 11 q 13
comprenant Int2/FGF3 ; hst-2/FGF4 ; bcl-1 ; PRAD1, cycline D EMS-1, GST-pi.
Cette amplification a été reportée de façon diverse (9 à 23 % des cancers du sein)
(167).
Une association forte existe entre amplification Int2 et statut des récepteurs hormonaux positifs. La signification pronostique de Int2 est controversée car souvent
associée à d’autres facteurs et, quoi qu’il en soit, inférieure à l’amplification de cMyc
ou c-erbB2.
CerbB2 : nous avons déjà reporté les résultats concernant cet oncogène dans le
chapitre des facteurs prédictifs LOEI+++.
p53 : ce gène code pour une protéine facteur de transcription. Dans les cellules
normales non stressées, p53 est inactive ; elle est maintenue à un faible niveau par
son association avec MDM2, qui provoque son transport du noyau vers le cytoplasme et sa dégradation par la voie dépendante de l’ubiquitine.
Les stress génotoxiques déclenchent des voies de signalisation qui aboutissent à
la stabilisation de la protéine p53, causant son accumulation dans le noyau et son
activation comme facteur de transcription. Cette activation conduit à l’arrêt du
cycle cellulaire et à l’induction de l’apoptose en cas d’altération génomique non
réparable, p53 apparaît comme un gène capital dans le contrôle du cycle cellulaire,
la réparation de l’ADN, l’apoptose, la différenciation cellulaire, la sénescence et l’angiogenèse. De ce fait, son altération dans les cancers a justifié un très grand nombre
d’études sur la valeur pronostique de ce facteur. Une revue générale de plus cinquante études montre des résultats identiques à ceux reportés dans la référence 18,
à savoir une très grande dispersion de la signification pronostique liée en grande
partie aux techniques analytiques. Les techniques liées à la mise en évidence et à
l’accumulation de la protéine sont peu fiables sur le plan pronostique, tant par technique immuno-histochimie (18) que par technique ELISA (168-169). Cependant,
110 Cancer du sein
les études de recherche directe de mutation par séquençage sont plus rares ou
concordantes (170-174) tant sur le plan pronostique que sur celui d’une mauvaise
réponse à la chimiothérapie (anthracycline) ou à l’hormonothérapie (tamoxifène)
(175). Une revue récente fait un lien possible entre angiogenèse, hypoxie de la
tumeur et altérations des oncogènes dont nous venons de voir la valeur pronostique
comme biomarqueurs tissulaires pronostiques ou prédictifs (176-177). Une étude
récente démontre que l’expression de p53 pourrait être un facteur pronostique pour
les cancers du sein inflammatoires (178).
BCAR1 : une étude récente du groupe de Rotterdam a évalué la valeur pronostique de BCAR1 dans les cancers primitifs du sein (179).
Hyperméthylation des promoteurs de gènes spécifiques : une nouvelle
approche analytique permet de comprendre la perte de fonction de certains gènes
par blocage de leur transcription et hyperméthylation de leur promoteur. L’étude
systématique de l’hyperméthylation de promoteur de gène sensible permet de
mettre en évidence un ciblage sélectif non randomisé dans les cancers du sein (180).
Par ailleurs, l’hyperméthylation des promoteurs sensibles définit des patterns de
perte d’expression associés à des classes distinctes de cancers du sein (181). Enfin,
une approche technique permettrait d’étudier l’hyperméthylation des promoteurs
de certains gènes suppresseurs dans le sérum de patientes porteuses de cancers du
sein (182). L’approche analytique de l’hyperméthylation des promoteurs semble
être une voie de très haut intérêt pour déterminer un diagnostic moléculaire précoce du cancer du sein, entre autres dans les lésions frontières, et permettre de
mieux définir certaines classes de cancers du sein.
Réflexion-bilan 2005 sur le transfert et la pratique clinique
La biochimie analytique, la biologie moléculaire, la biologie expérimentale et la
génétique ont apporté des contributions importantes à la connaissance précise des
mécanismes moléculaires de la cancérogenèse. Cependant, à ce jour, l’utilisation des
données biologiques qui considèrent l’évolutivité moléculaire fonctionnelle des
tumeurs n’est pas suffisamment prise en compte. Dans l’approche clinique actuelle,
cette situation est essentiellement due à un défaut de standardisation dans l’évaluation des marqueurs tumoraux biologiques et à une confrontation clinico-biologique insuffisante, alors que depuis plus de trente ans le concept de marqueur
tumoral existe et a fait l’objet d’un nombre très important de travaux et de publications.
Il a fallu vingt ans (1969-1989) pour que le concept de récepteurs hormonaux
(ROα RP) mis en évidence soit progressivement utilisé, validé et devienne un gold
standard LOEI avec utilisation de sa détermination dans la stratégie thérapeutique
de façon systématique. Des progrès sont actuellement possibles et à faire pour incrémenter et affiner la seule classification plus ou moins utilisée actuellement en
termes de facteurs prédictifs.
Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 111
Il a fallu dix ans (1987-1997) pour faire de HER2 un marqueur prédictif LOEI
associé à une thérapeutique spécifique ciblée. Il en est de même du délai pour UPA
PAI1 entre la publication princeps de Duffy (1987) et le premier essai européen
BIOMED 2 NNBC2 promu par le groupe AGO (Dr Thomssen, Dr Jänicke) prenant
en compte leur utilisation dans la stratification des patientes atteintes d’un cancer
du sein No qui se poursuit actuellement par le protocole NNBC3. Ceci est dû à la
nécessité d’obtenir le niveau d’évidence I entraînant la valorisation de toutes les
étapes de ce processus, avec obtention d’un outil diagnostique robuste, fiable, reproductible, validé, faisant l’objet de contrôles de qualité. Il s’agit d’un outil complémentaire de ceux disponibles actuellement, utilisé dans des conditions optimales,
ainsi qu’une motivation des équipes cliniques pour bousculer leurs habitudes en
introduisant l’innovation dans le cadre d’essais thérapeutiques, puis dans leur pratique courante.
Le changement dans la pratique clinique ne doit pas se faire au détriment des
patients et cela explique la lenteur de la mise en place et de l’utilisation des marqueurs, lenteur relative qui est un juste milieu entre frilosité et pari risqué dû à l’impatience ou l’enthousiasme des innovants prêts « à accélérer » les étapes de validation.
Le procédé d’évaluation-validation est multidisciplinaire (biologique-technique) et fait également appel à des méthodes spécifiques de bio-informatique et
statistique. Ce dernier point particulièrement important a fait l’objet de multiples
travaux et publications et, entre autres, d’une mise au point quant aux étapes et
études nécessaires pour l’application de méthodes statistiques de validation non critiquables (183). L’introduction des marqueurs biologiques dans les essais thérapeutiques est une nécessité pour leur validation, mais également pour mieux analyser
l’efficacité ou non de protocoles thérapeutiques à partir de groupes de patients biologiquement et cliniquement homogènes.
Enfin, la nécessité d’une approche analytique ciblée et innovante peut se révéler
plus complexe qu’une autre déjà validée dans un domaine proche, comme il est
apparu entre détermination de la sur-expression, amplification HER2 pour l’efficacité du trastazumab (Herceptine®) et analyse du REGF pour l’efficacité du gefritinib
(Iressa®), où l’analyse doit prendre en compte, non seulement la sur-expression,
mais également la présence de mutation spécifique.
Seule une coordination motivée entre groupes clinique et biologiste de transfert
permet, en fait, une avancée coordonnée et régulière.
En 2005, des outils sont disponibles et utilisables dans le cadre d’essais thérapeutiques et en pratique clinique quotidienne.
Évolution des biotechnologies analytiques. Approches futures
Les méthodes biochimiques
Les méthodes biochimiques d'étude des protéines ont été les premières utilisées
pour l'analyse des facteurs pronostiques et de réponse thérapeutique. Elles impli-
112 Cancer du sein
quent la préparation d'un extrait tissulaire après homogénéisation du tissu. Elles
peuvent mettre en évidence une fonction de ou des protéines étudiées (liaison,
métabolisme…), de leur statut d’activation (phosphorylation..), de la coopérativité
entre différentes structures macromoléculaires.
Avantages
Elles font, entre autres, pour les récepteurs hormonaux, l'objet de contrôles de qualité européens dans le cadre de l'EORTC depuis plus de quinze ans. Elles ont l’avantage d’être réellement quantitatives.
Limites
Les méthodes biochimiques actuelles, de part la quantité de tissus qu'elles exigent,
ne permettent qu’une approche parciparamétrique dans tous les cas et sont parfois
même impossibles pour de très faibles cellularités.
Évolution future
Amélioration de la sensibilité et spécificité de la direction par utilisation de la spectrométrie de masse, isolement des macromolécules informatives au sein de milieux
complexes (cytosol, fluides biologiques…) par technique de capture, désorption
laser, puis identification par analyse par spectrométrie de masse (technique
MALDI-TOF/ SELDI-TOF) : elles sont en cours d’évaluation, mais semblent être
une voie analytique sensible, robuste, applicable à la clinique. Elles rendent possibles
des études réellement multiparamétriques dans le cadre des évaluations post-génomiques du protéome. Elles peuvent prendre en compte tous les marqueurs biologiques protéiques déjà évalués et validés, mais également participer à la caractérisation et l’isolement de nouveaux marqueurs, tant sur le plan pronostique ou prédictif
qu’en tant que cible thérapeutique. L’isolement des nouveaux marqueurs se fait à
partir de profils globaux, avec une caractérisation tant sur le plan bio-informatique,
avec des techniques comparatives et de hiérarchisation, que par l’association de
multiples techniques d’isolement plus lourdes (micro-séquençage). L’approche protéomique analytique cerne au plus près la réalité biologique et bio-pathologique du
processus tumoral par un accès direct aux structures macromoléculaires fonctionnelles.
La sensibilité des techniques biochimiques permet de les associer avec la microdissection tissulaire (type laser microcapture) (177) elle permet aussi de mieux
cibler les compartiments cellulaires d’intérêt au sein d’un tissu hétérogène, normal
ou pathologique. Ces techniques analytiques (MALDI-TOF/SELDI-TOF) sont
applicables au fluide biologique avec efficacité telles les aspirations-lavages des
sécrétions ductales mammaires (184).
L’accessibilité des techniques analytiques protéomiques multifactorielles est en
décalage par rapport aux techniques de biologie moléculaire, mais ce décalage, du
moins dans le cadre de la biologie de transfert, se réduit rapidement par l’établisse-
Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 113
ment de laboratoires experts et par la mise en place de réseaux coopératifs sur ce
type de technologies.
Les méthodes de biologie moléculaire
Parmi les méthodes de biologie moléculaire, à l’heure actuelle, pour une analyse
multiparamétrique, l'étude de l'expression des ARN messagers (ARNm) est une
alternative rendue possible par un développement technologique rapide. Parmi les
techniques de biologie moléculaire permettant l'analyse de transcriptome, le développement technologique analytique à grande échelle et informatique appliqué a
rendu possible, d’une part, le séquençage complet du génome humain, d’autre part,
la mise au point d’une approche analytique globale, entre autres, dans l’expression
des gènes (transcriptome), et ce dans des situations particulières et comparatives
dont font partie le cancer et son micro-environnement tissulaire.
Pour ce faire, il existe deux approches majeures :
- Les puces ARN/ADN
- La technique de PCR quantitative en temps réel
Puces ARN/ ADN
Les puces ADN/ARN constituent des outils d’analyse moléculaire parallèle capables
de fournir une information biologique sur un temps et un espace considérablement
réduits par rapport aux méthodes conventionnelles de biologie moléculaire.
On distingue deux types d’applications principales :
– les profils d’expression génique ;
– l’analyse d’altérations structurales (SNP, mutations).
Puces d’expression
Des systèmes se développent dans ce domaine pour permettre l’analyse simultanée
de l’expression (ARNm) d’un très grand nombre de gènes.
On peut distinguer deux types de puces :
– les systèmes généralistes, pièces à haute densité de type Affymetrix (puces silicium) ou Clontech (membrane), qui proposent l’analyse d’un très grand nombre
de gènes ou EST prédéterminés : 5 000, 10 000, 25 000. Le coût unitaire d’analyse
est actuellement très élevé pour une application médicale individuelle. L’analyse
peut être, soit quantitative absolue, soit, le plus souvent, quantitative relative,
c’est-à-dire que le résultat consiste en un niveau d’expression par rapport à une
référence « normale ». La sensibilité reste très moyenne (20 d’ARN total, de très
bonne qualité) et la technique elle-même demande toute une série de contrôles de
qualité tant de la puce elle-même que du système de détection. L’exploitation des
données obtenues à demander le développement d’outils statistiques et de bioinformatique, outils de classification, association et hiérarchisation entre autres,
permettant de gérer l’ensemble des informations obtenues. Les problèmes réels
114 Cancer du sein
liés au développement et à l’exploitation de telles technologies ont fait l’objet
d’une série de recommandations (185), sur le plan du développement technique,
que des publications issues des travaux utilisant ces techniques en développement
dans le cadre de programmes de recherche fondamentale ou de transfert avec
nécessité d’information minimale concernant les données expérimentales
(MIAME, minimal information about a micro-arrays experiment) (186).
Par ailleurs, sur un exemple précis, des équipes coopérant au projet du NIH font un
bilan et également des recommandations sur la faisabilité et l’application des techniques utilisant les puces ARN pour l’expertise de tissus pathologiques avec l’association de microdissections, pour capture des plages de tissus d’intérêt, l’expertise
des variations des gènes par technique single nucleotide polymorphism (SNPS), mais
également étudiant la transcription alternative au splicéome (187-189) ;
– les puces « façonnables » avec spotters à pointe sèche ou piège électrique permettent l’analyse d’un nombre limité de gènes sélectionnés par l’utilisateur.
Il s’agit d’une technologie encore en développement, avec de nombreux problèmes de préparation des sondes de capture, de reproductibilité, ce qui la situe
encore dans le domaine de la recherche préclinique. Les puces sont intéressantes
si l’on souhaite avoir des profils d’expression comportant de nombreux gènes
(> 80-100), mais demandent la mise au point synchrone au développement des
puces d’un outil informatique analytique de gestion et d’évaluation. Dans ce
domaine, certaines compagnies proposent des puces, faites à la demande, soit
dédiées à une application clinique avec un nombre de gènes limités (100 à 250),
mais avec des techniques de détection originales augmentant la sensibilité et une
assurance qualité dans la préparation. Mais les recommandations et guide-lines
déjà évoqués pour les puces généralistes sont également nécessaires.
Des expertises comparatives ont été menées entre puces généralistes et façonnables,
ainsi qu’entre les différents types de puces pour une même pathologie, afin d’apprécier leurs valeurs réciproques.
Évaluation actuelle des approches analytiques moléculaires
De nombreuses publications (190-201) présentent le travail actuel effectué dans le
cadre du cancer du sein. Partant d’une analyse par puce d’expression haute densité,
les études pour une évaluation et une classification pronostiques retiennent entre 25
et 75 gènes décisionnels. Il est à noter par ailleurs que les gènes exprimés à fort pouvoir discriminatoire et, de ce fait, retenus, ne recouvrent aucun des biomarqueurs
tumoraux macromoléculaires UPA PAI1 déjà évalués comme de niveau d’évidence
I à l’exception des RO. Cependant, si la sélection par ce type d’analyse semble prometteuse, toute la démarche d’évaluation et validation que nous avons précédemment décrite reste à faire.
La méthodologie de l’expertise bio-informatique et statistique associée au développement des techniques analytiques multifactorielles est en pleine expansion. Une
approche critique des résultats actuels a été faite récemment et attire l’attention sur
l’importance d’une conduite raisonnée des utilisations et développements pour
Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 115
obtenir des résultats comparables, si ce n’est identiques, à travers différentes techniques analytiques du transcriptome (202-204).
Puces ADN
Pour l’analyse d’altération structurale, les puces ADN sont des outils qui peuvent
fonctionner dès maintenant dans les laboratoires de biologie médicale de transfert.
Le système Affymetrix est déjà utilisé (Aarhus University Hospital, Danemark) pour
l’analyse des mutations p53 et la polymorphisme individuel des enzymes du métabolisme oxydatif CYP. Toutefois, l’investissement est extrêmement lourd, la sensibilité absolue est moyenne, la sensibilité relative est faible, le contingent tumoral ne
devant pas représenter moins de 50 % de la cellularité du prélèvement.
Comme les autres méthodes, sa précision n’est pas absolue (des faux positifs ont
été détectés dans l’évaluation actuelle). Cependant, des progrès technologiques
d’automatisation et de détection font que plusieurs compagnies concurrentes
entrent dans ce champ d’expertise à visée clinique.
Technologie de PCR en temps réel
La technologie de PCR en temps réel présente, par rapport aux méthodes standards
de PCR, les avantages scientifiques et techniques suivants :
– elle permet l'enregistrement de la cinétique d'amplification en temps réel. La
quantification est réalisée au seuil initial de l'amplification et présente une excellente reproductibilité. Dans les méthodes standards de PCR, la quantification se
fait à des temps extrapolés à partir d'études préliminaires, ce qui peut être à l'origine d'erreurs importantes et imprévisibles, car on préjuge d’une réaction enzymatique que l’on ne maîtrise pas ;
– la spécificité de la sonde pour la séquence amplifiée entre les deux amorces choisies informe sur la spécificité du produit amplifié et permet d'éviter les étapes fastidieuses de séparation des produits de réaction (électrophorèse en gel, transfert
sur membrane) et de marquage radioactif des produits ;
– le développement de toutes ces techniques ayant une visée d’évaluation et de validation pour une application clinique diagnostique doit être fait dans le cadre des
pratiques et notions de qualité du Guide de bonne exécution des analyses (GBEA)
et faire appel à un appareillage compatible avec celles-ci. Dans le cadre d’une utilisation fréquente et multi-manipulateurs, la PCR quantitative en temps réel est la
technique de PCR qui met à l’abri d’un minimum de contaminations accidentelles du fait de son développement, jusqu’à la phase analytique en milieu clos et
peut faire, de ce fait, l’objet d’une certification CE IVD (In Vitro Diagnostic). De
nombreuses publications ont évalué le potentiel technique et les limites de la PCR
quantitative et ont établi des recommandations pour une utilisation fiable et
reproductible (188). Cette technique, contrairement aux puces ARN, pourrait
éventuellement être utilisée non seulement pour des échantillons cryopréservés,
mais également pour du matériel archivé en paraffine. Cependant, cette utilisation
doit être encadrée par de multiples contrôles et assurances qualité pour être réel-
116 Cancer du sein
lement évaluée. Enfin, dans les prélèvements pauci-cellulaires, inférieurs à
5 000 cellules, la PCR quantitative se révèle la seule technique utilisable.
Conclusion
Dans l’évolution potentielle à partir de tests LOEI « gold standards » actuels vers des
tests pluriparamétriques, soit protéomiques, soit de biologie moléculaire, il est
important de rappeler que toutes les étapes d’évaluation et validation que nous vous
avons exposées en début de cette revue générale sont, en fait, à franchir en ce qui
concerne la validation de ces nouvelles approches analytiques.
En effet, les résultats obtenus par techniques biochimiques/protéomiques que
nous avons exposés en partie ne sont pas transposables pour préjuger ou sélectionner des marqueurs de biologie moléculaire. Si les protéines sont effectivement
les acteurs directs des fonctions cellulaires normales ou pathologiques, les taux
d’ARN ne sont pas corrélés linéairement au taux de protéines dans un très grand
nombre de cas, ceci étant dû au temps de turn-over spécifique de chaque ARN, au
rendement de traduction, de processus de maturation, de sauvegarde de stockage
intermédiaire de certains ARN.
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