Déterminisme génétique du cancer du côlon, du sein et de l`ovaire
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LA REVOLUTION DU SEQUENCAGE DE NOUVELLE GENERATION (NEW GENERATION SEQUENCING, NGS) Séquençage Sanger sur amplicons : 500 pb X 1 000 000 Exome humain 160,000 exons = 30 Mb (1.2% du génome humain) Profondeur du séquençage 100x 3000 Mb = 3 Gb Génome humain = 3 Gb EXOMES CONSTITUTIONNELS: DONNÉES STABILISÉES Par exome: 34 Mb : 1.2% du génome total 20000 SNV (Single Nucleotide Variation) 500 SNVs rares (fréquence <0.1%) non répertoriés dans les bases de données 1 SNV de novo avec impact biologique Majorité des SNVs à impact biologique survenus < 10000 ans RELECTURE DE LA COMPLEXITE DU DETERMINISME GENETIQUE DES MALADIES HUMAINES Age Mutations rares voire privées 80% 60% Tolérance biologique Risque de maladie 100% Déterminisme monogénique Déterminisme Oligogénique 40% Déterminisme Multigénique // 1 5 Nombre de variations génétiques // 100 RELECTURE DE LA COMPLEXITE DU DETERMINISME GENETIQUE DU CANCER BENEFICE MEDICAL DU DIAGNOSTIC DES FORMES HEREDITAIRES DE CANCER COLORECTAL 1/500 Cancer colon, 62 ans Mutation MSH2 Cancer colon, 32 ans Wt/mt Wt/ Wt Wt/mt Wt/mt Cancer colon, 36 ans Lever une angoisse illégitime et une surveillance médicale injustifiée chez les sujets non porteurs Surveillance adaptée chez les porteurs BENEFICE MEDICAL DU DIAGNOSTIC DES FORMES HEREDITAIRES DE CANCER DU SEIN ET DE L’OVAIRE 1/400 Cancer du sein 35 ans Cancer du sein 50 ans Cancer du sein 67 ans Cancer du sein 27 ans Cancer de l’ovaire 50 ans Cancer de l’ovaire 45 ans Wt/Wt Wt/Wt IRM annuelle Mastectomie prophylactique < 40 ans Annexectomie après tout projet parental Cancer du sein 34 ans Mutation BRCA1 Wt/Mt DÉTERMINISME GÉNÉTIQUE DES FORMES FAMILIALES OU PRECOCES DU CANCER DU COLON ET DU CANCER DU SEIN - OVAIRE I. Optimisation du diagnostic des formes héréditaires de cancer du sein /ovaire du colon - Diagnostic par NGS - Interprétation des variants de signification inconnue des gènes MMR et BRCA II. Etude du déterminisme oligogénique du cancer colorectal III. Contribution des mutations de novo dans les cancers précoces sporadiques I. PLATEFORMES NGS CAEN - ROUEN 2100 patients Gènes Intron MLH1 Introns MSH2 Introns MSH6 Introns PMS2 (exons 6 à 15) Introns APC Introns STK11 Introns MUTYH Introns BMPR1A Introns SMAD4 Introns PTEN Introns TP53 Introns 474 patients OPTIMISATION DU WORKFLOW NGS DIAGNOSTIQUE Robotisation pré- et post-PCR Capture Sure Select et multiplexage avant capture Script d’automatisation des taches Plateforme de Génomique Caen - Dominique Vaur HETEROGENEITE DU DETERMINISME GENETIQUE DES CANCERS DU SEIN ET DE L’OVAIRE NBN NBN BARD1 RAD51B RAD51D CDH1CDH1 MSH6 RAD51C PMS2PMS2 RAD51D MSH6 BARD1 RAD51B RAD51C 1% 1% 1% 1%1%XRCC3 1% 1% 1% 2% 1% 1% XRCC3 1% 1% 2% 1% 1% 1%1% MRE11A MRE11A <1% RAD50 RAD50 2% 2% BRIP1 BRIP1 0%0% 2% 2% 1500 patients BRCA1 BRCA1 28% 28% PMS1 PMS1 2% 2% MSH2 MSH2 2% 2% MLH3 MLH3 3% 3% CHEK2CHEK2 6% 6% 232 mutations délétères 16% TP53 TP53 7% 7% ATM ATM 7% 7% PALB2 PALB2 8% 8% BRCA2 BRCA2 24% 24% Castera et al. Eur. J. Hum. Genet. 2014, in press VARIABILITE DU GENOME HUMAIN Next generation sequencing (NGS) Impact in Medical Genetics Patient Variations Interpretation INTERPRÉTATION DES VARIANTS DE SIGNIFICATION INCONNUE Syndrome de Lynch Hereditary Non Polyposis Colorectal Cancer Cancer du sein et de l’ovaire 1/500 1/400 BRCA genes (BRCA1, BRCA2) MMR genes (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2) Variants de signifIcation inconnue Neutral variation? Pathogenic mutation? Targeted therapies Genetic counseling Appropriate clinical follow-up MMR : Colonoscopy, Hysteroscopy BRCA : Breast MRI, Mastectomy, Adnexectomy e.g.: anti-PARP for BRCA deficient patients II. IMPACT DES VARIANTS DE SIGNIFICATION INCONNUE SUR L’EPISSAGE Mutations Exon + ~50 nt intronic sequence 3’ss 5’ss 5’ss 3’ss A GU PyPyPy AG ISS + ESE Branch site - 5’ss 3’ss A GU ESS PyPyPy AG ISS ISE Poly-Py tract Branch Poly-Py site tract ESE, exonic splicing enhancer ESS, exonic splicing silencer ISE, intronic splicing enhancer ISS, intronic splicing silencer Inserm U1089, Alexandra Martins THE MINIGENE SPLICING ASSAY PCR Minigene preparation Cloning Sequencing Analysis of minigene’s transcripts Transfection human cells RNA extraction & RT-PCR Electrophoresis Tournier et al., Hum Mutat. 2008 Bonnet et al., J Med Genet. 2008 Vezain et al., Hum Mutat. 2010 Gaildrat et al., J Med Genet. 2010 Gaildrat et al., Methods Mol Biol. 2010 Théry et al., Eur J Hum Genet. 2011 Vezain et al., Hum Mutat. 2011 Gaildrat et al., J Med Genet. 2012 Di Giacomo et al., Hum Mutat. 2013 WT mut Inserm U1079 Gel purification Sequencing IMPACT SUR L’EPISSAGE DES VARIANTS DE SIGNIFICATION INCONNUE DES GENES MMR 259 VSI des gènes MSH2, MLH1 et MSH6 Réseau français des laboratoires d’oncogénétique Pascaline Gaildrat Alexandra Martins Stéphanie Baert-Desurmont Julie Tinat SR 25 VSI (10%) avec effet partiel AG + hnRNP Inhibitor GU ESE 71 VSI (28%) avec effet sur l’épissage 46 VSI (18%) avec effet majeur 18% des VSI reclassés en mutations délétères d’épissage Base de données MMR INCa 188 VSI (72%) sans effet sur l’épissage IMPACT SUR L’EPISSAGE DES VARIANTS DE SIGNIFICATION INCONNUE DES GENES BRCA 174 VSI des gènes BRCA Etude Nationale Réseau français des laboratoires d’oncogénétique SR 21 VSI (12%) avec effet partiel AG 50 VSI (29%) 29 VSI (17%) avec effet majeur avec effet sur l’épissage 17% des VSI reclassés en mutations délétères d’épissage Base de données BRCA INCa + hnRNP Inhibitor GU ESE 124 VSI (71%) sans effet sur l’épissage IMPORTANCE INSOUPCONNEE DES MUTATIONS D’EPISSAGE: L’EXEMPLE DE L’EXON 7 DE BRCA2 BRCA2 exon 7 Total number of variants=36 missense nonsense synonymous small ins/del 24 2 5 5 Splicing mutations: Creation 5’ss ………………………… 1 Destruction 3’or 5’ss ………….3 Splicing regulation ……………..11 15 (42%) Inserm U1079 Di Giacomo et al., Hum Mutat. 2013 IMPORTANCE INSOUPCONNEE DES MUTATIONS D’EPISSAGE: L’EXEMPLE DE L’EXON 7 DE BRCA2 BRCA2 exon 7 n=36 89 88 39 81 64 81 41 73 71 71 72 52 45 exon inclusion (%) 11 splicing regulatory mutations (31%) Inserm U1079 Di Giacomo et al., Hum Mutat 2013 PREDICTION BIOINFORMATIQUE DES MUTATIONS D’EPISSAGE BASE SUR L’ESR SEQ SCORES (Ke et al. 2011) ESRseq (hexamers) ESRseq Score* Total Score Score Change WT 3 ESE WT +0.266 1 ESS -1.115 c.617C>G c.617C>G exon skipping Inserm U1079 -0.849 2 ESS Di Giacomo et al., Hum Mutat 2013 CORRELATION DES SCORES ESRSEQ TOTAUX ET DES DONNEES FONCTIONNELLES No increase in exon 7 skipping (n=21) Total ESRseq Score Change Increase in exon 7 skipping (n=11) Inserm U1079 Di Giacomo et al., Hum Mutat 2013 BILAN DE L’INSTITUT NATIONAL DU CANCER 10 ans d’activité des laboratoires français d’oncogénétique CRC CRC < 61 ans Taux de détection de mutations : 15% CRC < 51 ans Rendement mutationnel faible Situations cliniques ne répondent pas à un modèle monogénique simple Colon < 61 ans Rectum 65 ans III. ÉTUDE DOCC : DÉTERMINISME OLIGOGÉNIQUE DU CANCER COLORECTAL Patients • au moins deux apparentés liés au 1er degré présentant un CCR dont l’un avant 61 ans (ou adénome colorectal à haut risque avant 51 ans) • ou un cas sporadique de CCR avant 51 ans (ou adénome colorectal à haut risque avant 41 ans), ou • ou un cas index avec tumeurs colorectales primitives multiples, la première avant 61 ans Exclus : syndrome de Lynch, polyposes adénomateuse (>10 adénomes), et hamartomateuse Contrôles (Centre d’Investigation Clinique, CHU de Rouen) • âgés de 45 à 60 ans • sans antécédent personnel de CCR • sans antécédent familial de CCR au 1er degré SNPs ÉTUDIÉS PAR SNaPSHOT 8q23.3 rs16892766, EIF3H 8q24.21 rs6983267, TCF4 15q13.3 rs4779584, GREM1 18q21.1 rs4939827, SMAD7 rs58920878/Novel1 10p14 rs10795668 Tomlinson et al., Nat Genet 2007; Zanke et al., Nat Genet 2007 Tomlinson et al., Nat Genet 2008; Tenesa et al., Nat Genet 2008 Middeldorp et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2009 Jaeger et al., Nat Genet 2008; Broderick et al., Nat Genet 2007 Song et al., PLoS One 2012; Pittman et al., Genome Res 2009 1029 PATIENTS INCLUS • 412 hommes et 617 femmes • Âge moyen au diagnostic du CCR : 43.1 ans 363 avec CCR chez 2 apparentés au 1erdegré dont l’un avant 61 ans 887 avec CCR <51 ans (ou adénome avancé <41 ans) 44 avec CCR primitifs multiples, le 1eravant 61 ans Centres participants Stéphanie Baert-Desurmont, Françoise Charbonnier Estelle Houivet, Jacques Benichou INTÉRÊT MÉDICAL DU GÉNOTYPAGE DES SNPS DANS LE CANCER COLORECTAL 1. Réplication de l’association du risque de CCR avec 3 SNPs 1. Odds ratios >> OR des études d’association pangénomiques 2. Impact cumulé de l’association des SNPs 3. OR>2 : intérêt médical Déterminisme Oligogénique du Cancer Colorectal IV. MUTATIONS DE NOVO ET CANCERS SPORADIQUES Taux mutations De novo chez l’homme : 1.18x10-8 / base Mutation de novo pre-zygotique Mutation de novo post-zygotique Entre 0 et 2 mutations de novo par exome Mosaïque Tumeur âge précoce Contribution des mutations de novo rares aux formes précoces de cancer de présentation sporadique ? ANALYSE EXOMIQUE DE TRIOS Stratégie : Analyse Exomique Soustractive « analyse de trios » Vissers et al. Nat Genet. 2010 Exome Variants de l’enfant Exome Variants du père Variants de la mère Exome Variants de novo Identification des mutations de novo (0-2 par exome) Identification de nouvelles voies moléculaires Inserm U1079 Isabelle Tournier PARADIGME DU CANCER DE L’OVAIRE Cystadénocarcinome séreux bas grade ovarien (FIGO IV) 21 ans - Métastases péritoine - Métastases colon - Métastases pancréas - Métastases utérus Pr Jean-Christophe Sabourin - Criblage BRCA1 / BRCA2 : négatif 52 ans 56 ans - Criblage TP53 : négatif - CGH-array haute résolution : négatif 21 ans Mutation de novo hétérozygote ? Stratégie : analyse exomique soustractive STRATÉGIE DE FILTRATION DES VARIANTS 15715 - Qualité >Q30 - Profondeur >10x - Fréquence AF <0.001 (EVS, 1000G) 306 Filtre “de novo” 46 Coutant et al., BMC, 2012 Filtration des artefacts 9 Détection sur moins de 20 % des reads 1 1 mutation de novo: INHBA, Inhibin βA Inserm U1079 Plateforme de Génomique de Rouen Isabelle Tournier, Françoise Charbonnier, Sophie Coutant INHBA P.N386S ALTÈRE LE RATIO ACTIVINES/INHIBINES HEK293F Transfection transitoire Immuno-assays - 28 % WT p.N386S Sécrétion d’Inhibine A Inhibine A(ng/mL) Activine A (ng/mL) Sécrétion d’Activine A + 44 % WT p.N386S p.N386S favorise la production d’Inhibine A et réduit la production d’Activine A Inserm U1079 IDENTIFICATION D’UNE MUTATION DU GÈNE INHA Séquençage Sanger du gène INHBA 14 patientes françaises cancer épithélial ovarien avant 40 ans 35 patientes américaines cancer épithélial ovarien avant 40 ans BRCA1/BRCA2 négatives CLCC François Baclesse Division of Medical Genetics University of Washington Pas d’autre mutation détectée Séquençage Sanger du gène INHA 14 patientes françaises cancer épithélial ovarien avant 40 ans INHA : 1 mutation hétérozygote c.179G>T p.R60L Non répertoriée dans les bases de données IDENTIFICATION DE VARIANTS RARES DES INHIBINES Séquençage Sanger des gènes INHBA et INHA 62 patientes françaises cancer épithélial ovarien avant 40 ans BRCA1/BRCA2 négatives Département de Génétique Institut Gustave Roussy Département de Génétique Institut Curie βA α INHBA : 1 mutation hétérozygote c.839G>A p.G280E Non répertoriée dans les bases de données Détection de plusieurs variants rares non-synonymes des gènes des Inhibines Inserm U1079 ENRICHISSEMENT DES CAS EN VARIANTS RARES DES INHIBINES Analyse statistique Variants rares non-synonymes des gènes INHA et INHBA 76 patientes (cohorte de réplication) 154 femmes Caucasiennes 1000 genomes project COLLAPSING (overall burden) S 4300 Caucasiens EVS dataset AGGREGATING (weighted burden) BI-DIRECTIONAL (variance test) S1 S2 S3 S4 S5 S1 S2 S3 S4 S5 S S ENRICHISSEMENT DES CAS EN VARIANTS RARES DES INHIBINES Analyse statistique Variants rares non-synonymes des gènes INHA et INHBA 76 patientes (cohorte de réplication) 154 femmes Caucasiennes 1000 genomes project CAST CMC WSS C-ALPHA SKAT 1000G controls (n=154) Empirical p-value p-value 0.0025 0.0043 0.0031 0.0012 0.0029 <0.0001 0.0017 0.0016 0.0030 4300 Caucasiens EVS dataset EVS controls (n=4300) Empirical p-value p-value 0.0065 0.0050 0.0100 0.0011 0.0095 0.0129 0.0188 0.0204 0.0167 Enrichissement en variants rares non-synonymes des gènes INHA and INHBA dans la cohorte de patientes Camille Charbonnier, Inserm U1079 IMPLICATION DES MUTATIONS CONSTITUTIONNELLES DES INHIBINES DANS LE DÉTERMINISME GÉNÉTIQUE DES FORMES PRÉCOCES DE CANCER DE L’OVAIRE I- Identification d’une mutation de novo de INHBA (chaîne β) II- Impact fonctionnel démontré de cette mutation III- Détection d’une mutation de INHA (chaîne α) IV- INHA, gène suppresseur de tumeurs avec spécificité gonadique V- Enrichissement en variants rares des inhibines dans la cohorte de patientes avec cancer de l’ovaire précoce Altération du ratio activines / inhibines Inserm U1079 Alteration du cross-talk entre cellules de la granulosa et cellules épithéliales Tournier et al., Human Mutation 2014 PROJET ONCOGENETIQUE I. Optimisation du diagnostic des formes héréditaires de cancer du sein /ovaire du colon - Fast track diagnosis - Plate-forme d’Interprétation des variants de signification inconnue II. Contribution des mutations de novo dans les cancers précoces sporadiques III. Traitements personnalisés: inhibiteurs de PARP, immunothérapie, chimiothérapies non génotoxiques
