table des matires - Thèses

ÉCOLE NATIONALE VETERINAIRE D’ALFORT
Année 2005
CHIMIOTHERAPIE ANTIVIRALE CONTRE LE BORNAVIRUS
THESE
Pour le
DOCTORAT VETERINAIRE
Présentée et soutenue publiquement devant
LA FACULTE DE MEDECINE DE CRETEIL
le……………
par
Romain VOLMER
Né le 30/03/1978 à Charleville-Mézières (Ardennes)
JURY
Président : M.
Professeur à la Faculté de Médecine de CRETEIL
Membres
Directeur : M. ELOIT Marc
Professeur à l’ENVA
Assesseur : M . BOULOUIS Henri-Jean
Professeur à l’ENVA
Remerciements
A Monsieur le Président du jury,
Professeur à la faculté de médecine de Créteil, qui nous fait l’honneur de présider cette thèse.
A Monsieur Eloit,
Professeur à l’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort, Directeur de l’unité de virologie, pour sa
disponibilité et l’aide capitale qu’il m’a apportée au moment où j’ai décidé de m’engager dans
la recherche.
A Monsieur Boulouis,
Professeur à l’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort, pour l’attention qu’il a portée à la
correction de ce manuscrit.
A Monsieur Michel Brahic,
Professeur à l’Institut Pasteur, pour m’avoir accueilli dans son laboratoire et pour sa curiosité
scientifique exemplaire.
A Monsieur Roland Liblau,
Professeur à la faculté de médecine de Toulouse Rangueuil, pour m’avoir permis de
poursuivre mon travail de thèse à Toulouse dans de très bonnes conditions.
A Monsieur Daniel Gonzalez Dunia,
Mon directeur de thèse de sciences, pour son encadrement exceptionnel et pour la confiance
qu’il m’a accordée.
A Monsieur Jeffrey Bajramovic,
Mon plus proche collaborateur lors de ce travail, qui m’a encadré tout au long de cette étude
et qui m’a fourni de précieux conseils.
A mes parents et grands-parents,
Merci pour m’avoir toujours soutenu et pour avoir suivi avec intérêt mon travail.
A Marc, Luz, Léa et Julien
Merci pour tous nos rires et souvenirs.
A Christelle,
Merci pour tout et pour tout ce qui reste à venir.
TABLE DES MATIERES
ABREVIATIONS.................................................................................................................................................. 3
LISTE DES TABLEAUX ..................................................................................................................................... 5
LISTE DES FIGURES ......................................................................................................................................... 7
A) INTRODUCTION ........................................................................................................................................... 9
B) PREMIERE PARTIE : BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................ 11
I. LE BORNAVIRUS......................................................................................................................................... 11
II. ORGANISATION DU GÉNOME................................................................................................................. 11
III. LES PROTÉINES VIRALES....................................................................................................................... 13
1-La nucléoprotéine ....................................................................................................................................... 13
2-La protéine X.............................................................................................................................................. 15
3-La phosphoprotéine .................................................................................................................................... 15
4-La protéine de matrice ................................................................................................................................ 15
5-La protéine d'enveloppe.............................................................................................................................. 16
6-La polymérase ............................................................................................................................................ 16
IV. CYCLE VIRAL ET RÉPLICATION........................................................................................................... 17
1-Réplication et transcription......................................................................................................................... 17
2-Épissage...................................................................................................................................................... 18
V. ÉPIDÉMIOLOGIE ........................................................................................................................................ 18
1-Diagnostic................................................................................................................................................... 18
1.1-Détection d'anticorps dirigés contre le Bornavirus .............................................................................. 18
1.2-Détection d'antigènes du Bornavirus ................................................................................................... 20
1.3-Détection de l'ARN du Bornavirus...................................................................................................... 20
1.4-Détection de virus infectieux............................................................................................................... 20
1.5-Limites des différents tests de diagnostic ............................................................................................ 20
2-Le BDV chez les animaux .......................................................................................................................... 22
3-Le BDV chez l'homme ............................................................................................................................... 25
3.1-Détection des anticorps ....................................................................................................................... 26
3.2-Détection de l'ARN viral par PCR....................................................................................................... 28
3.3-Mise en évidence d'une infection dans le SNC.................................................................................... 30
VI. INFECTION NATURELLE PAR LE BORNAVIRUS ............................................................................... 31
VII. INFECTIONS EXPÉRIMENTALES PAR LE BORNAVIRUS ................................................................ 34
1-Modèle de l'infection du rat Lewis immunocompétent ............................................................................... 34
1.1-Infection du SNC................................................................................................................................. 34
1.2-Immunopathologie associée ................................................................................................................ 35
2-Modèle du rat Lewis infecté à la naissance................................................................................................. 36
2.1-Dissémination dans le SNC................................................................................................................. 36
2.2-Altérations neurodéveloppementales................................................................................................... 37
2.3-Conséquences de l'infection sur la physiologie des cellules du SNC .................................................. 38
2.4-Réponse immunitaire lors de l’infection néonatale ............................................................................. 39
2.5-Altération dans l'expression de gènes.................................................................................................. 40
2.6-Troubles du comportement lors de l’infection néonatale..................................................................... 41
3-Modèle d'infection de la souris ................................................................................................................... 42
4-Modèle d'infection de la gerbille ................................................................................................................ 43
VIII. TRAITEMENT DE LA MALADIE DE BORNA..................................................................................... 44
-1-
C) PROPRIETES ANTIVIRALES D'ANALOGUES NUCLEOSIDIQUES ................................................ 47
I. MATERIELS ET METHODES...................................................................................................................... 47
Cellules et virus ............................................................................................................................................. 47
Réactifs et anticorps....................................................................................................................................... 47
Mesure de la viabilité cellulaire ..................................................................................................................... 48
Immunofluorescence indirecte ....................................................................................................................... 48
Évaluation de la dissémination virale par cytométrie de flux......................................................................... 48
Extraits protéiques et Western-Blot ............................................................................................................... 49
Analyse des ARN par Northern-Blot ............................................................................................................. 49
II. RESULTATS................................................................................................................................................. 50
Méthodologie ................................................................................................................................................. 50
A) Mécanisme d’action de l’ara-C sur le BDV .............................................................................................. 52
1. L'effet antiviral est spécifique d'un dérivé arabinose possédant une base cytosine ........................... 52
2. L'ara-C doit être phosphorylée pour être active contre le BDV......................................................... 52
3. L'effet antiviral de l'ara-C n'est pas lié à une modification des concentrations intracellulaires de
nucléotides................................................................................................................................................. 54
4. L'effet antiviral de l'ara-C est réversé par un excès de nucléosides non modifiés ............................. 54
B) Recherche d’analogues nucléosidiques actifs contre le virus mais moins toxiques .................................. 56
1. Candidats........................................................................................................................................... 56
2. Le 2'-FdC entraîne une rétention nucléaire des RNP virales ............................................................. 56
3. Le 2'-FdC inhibe la transmission virale de cellule à cellule .............................................................. 58
4. Le 2'-FdC limite l'infection des neurones primaires d'hippocampe ................................................... 58
5. Le 2'-FdC inhibe la production d'ARN et des protéines du BDV ...................................................... 60
6. Mesure de la toxicité cellulaire des différents composés................................................................... 62
III. DISCUSSION .............................................................................................................................................. 63
CONCLUSION ................................................................................................................................................... 65
BIBLIOGRAPHIE.............................................................................................................................................. 67
-2-
Abréviations
ADN
ara-A
ara-C
ara-CCl
ara-H
ara-U
ARN
ARNm
BDNF
BDV
C
CMP
CDP
CTL
CTP
CFDA
CPEC
Cy3
dC
dCk
EDTA
ELISA
2'-FdC
FITC
G
GAPDH
GFAP
IF
IgG
kb
kDa
L
M
MAP-2
N
NES
NGF
NLS
NNS
P
PCR
PFA
PBS
RNP
RT
SDS
Acide désoxyribonucléique
9-ß-D-arabinofuranosyladénine
1-ß-D-arabinofuranosylcytosine
5-chloro-1-ß-D-arabinofuranosylcytosine
9-ß-D-arabinofuranosylhypoxanthine
ß-D-arabinofuranosyluracile
Acide ribonucléique
Acide ribonucléique messager
facteur de croissance nerveux dérivé du cerveau
Bornavirus ou virus de Borna
Cytidine
Cytidine monophoshate
Cytidine diphoshate
lymphocyte cytotoxique
Cytidine triphoshate
5-carbofluorescéine diacétate
Cyclopentényl-cytosine
Cyanine 3
Désoxycytidine
Désoxycytidine kinase
Acide éthylène diamino tétratacétique
immunodosage enzymatique
2'-fluoro-2'-désoxycytidine
Fluorescéine isothiocyanate
glycoprotéine
Glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase
protéine gliale acide fibrillaire
Immunofluorescence indirecte
Immunoglobuline G
kilobases
kilodaltons
ARN polymérase ARN dépendante
protéine de matrice
protéine associée au microtubule 2
nucléoprotéine
séquence d’export nucléaire
facteur de croissance nerveux
séquence de localisation nucléaire
négatif non segmenté
phosphoprotéine
réaction de polymérisation en chain
Paraformaldéhyde
Tampon phosphate salin
complexes ribonucléoprotéiques viraux
transcriptase inverse
Sodium dodécyl sulfate
-3-
SNC
SSC
Tm
Tris
TrK
WB
système nerveux central
Citrate de sodium salin
Température de fusion
Tri hydroxy méthyl amino méthane
récepteur à neurotrophine
Western-Blot
-4-
Liste des tableaux
Tableau 1 : Séroprévalence du BDV chez les animaux infectés naturellement................... 23
Tableau 2 : Détection de l'ARN du BDV par PCR chez les animaux infectés naturellement
............................................................................................................................................... 24
Tableau 3 : Séroprévalence du BDV chez l'homme ............................................................ 27
Tableau 4 : Détection de l'ARN du BDV par RT-PCR dans des échantillons de sang
humain................................................................................................................................... 29
Tableau 5 : Détection post-mortem d'antigènes et/ou d'ARN du BDV dans des cerveaux
humains ................................................................................................................................. 30
Tableau 6 : Symptômes de la maladie de Borna chez les espèces animales infectées
naturellement par le BDV ..................................................................................................... 33
Tableau 7 : Effet antiviral des dérivés de l’ara-C ................................................................ 52
Tableau 8 : L'ara-C doit être phosphorylée pour être active contre le BDV........................ 52
Tableau 9 : L'effet antiviral de l'ara-C n'est pas lié à une modification des concentrations
intracellulaires de nucléotides ............................................................................................... 54
Tableau 10 : L'effet antiviral de l'ara-C est réversé par un excès de nucléosides non
modifiés................................................................................................................................. 54
Tableau 11 : Analyse de la dissémination virale dans les cellules Vero.............................. 58
Tableau 12 : Analyse de la dissémination virale dans les cellules ED ................................ 58
-5-
-6-
Liste des figures
Figure 1 : Représentation schématique d’une particule du BDV ......................................... 12
Figure 2 : Organisation génomique du BDV........................................................................ 14
Figure 3 : Structure des analogues nucléosidiques employés .............................................. 46
Figure 4 : Voies métaboliques de phosphorylation des nucléosides dérivés de la cytidine. 46
Figure 5 : Effet des traitements sur la distribution cellulaire de la protéine N du BDV. ..... 51
Figure 6 : Principe de la méthode de quantification de la transmission du BDV de cellule à
cellule……………………………………………………………………………….……... 53
Figure 7 : Mesure par cytométrie en flux de l’effet des traitements sur la dissémination
virale...................................................................................................................................... 53
Figure 8 : Etude comparative de l’effet des traitements par l’ara-C, le 2‘-FdC et la
gemcitabine sur la distribution cellulaire de la protéine N du BDV. .................................... 57
Figure 9 : Effet du traitement par le 2'-FdC et l'ara-C sur l'infection de neurones primaires
d'hippocampe de rat............................................................................................................... 59
Figure 10 : Inhibition de la synthèse des ARN viraux par le 2'-FdC. .................................. 61
Figure 12 : Mesure de la toxicité des analogues nucléosidiques utilisés. ............................ 62
-7-
-8-
A) INTRODUCTION
Le virus de Borna ou Bornavirus (BDV) est un virus à ARN négatif non segmenté,
prototype d'une nouvelle famille de virus animaux au sein de l'ordre des Mononegavirales. Le
BDV est responsable d'infections du système nerveux central chez un large spectre de
mammifères. C'est un pathogène reconnu en médecine vétérinaire, dont l'implication en
pathologie humaine demeure encore incertaine. Aucune prophylaxie vaccinale et aucun
traitement efficace ne sont disponibles actuellement. Des travaux récents du laboratoire ont
cependant permis d'identifier un analogue nucléosidique, la 1-ß-D-arabinofuranosylcytosine
(ara-C), inhibant de façon très efficace le BDV. L'action antivirale de l'ara-C sur le BDV, un
virus à ARN, est surprenante car jusqu'ici l'ara-C n'était connue que pour son inhibition des
synthèses d'ADN.
Au cours de ce travail, j'ai tout d'abord cherché à préciser le mécanisme d'action de
l'ara-C sur le BDV. Nos résultats indiquent que l'effet antiviral est spécifique d'un dérivé
arabinose portant une base cytosine et que l'ara-C doit être phosphorylée pour être active. La
phosphorylation de l'ara-C peut perturber la formation des autres nucléotides dans la cellule,
mais ces altérations métaboliques n'expliquent pas l'action de l'ara-C sur le BDV. Pris dans
leur ensemble, nos résultats suggèrent que l'ara-C triphosphate agit comme un inhibiteur de
l'ARN polymérase virale L par compétition avec la cytidine triphosphate.
La toxicité cellulaire de l'ara-C est un inconvénient majeur pour son utilisation
thérapeutique. Parallèlement au travail précédent, nous avons donc recherché des analogues
nucléosidiques ayant le même potentiel antiviral que l'ara-C sur le BDV, mais une toxicité
réduite. Nous avons ainsi démontré que la 2'-fluoro-2'-désoxycytidine (2'-FdC) était un
inhibiteur très efficace du BDV. Elle bloque la dissémination du virus et inhibe les synthèses
des ARN et des protéines du virus. En outre, sa toxicité cellulaire semble nettement inférieure
à celle de l'ara-C. Le 2'-FdC est donc un candidat intéressant pour le développement d'un
traitement efficace contre le BDV.
J’ai réalisé ce travail dans l’Unité des virus lents dirigée par le Professeur Michel
Brahic à l’Institut Pasteur de Paris. Au cours de mon travail dans cette unité, j’ai été supervisé
par le Docteur Daniel Gonzalez Dunia qui dirige l’équipe de recherche consacrée au
Bornavirus et j’ai travaillé en étroite collaboration avec le Docteur Jeffrey Bajramovic.
-9-
- 10 -
B) Première partie : bibliographie
I. LE BORNAVIRUS
La maladie de Borna est connue depuis plus d'un siècle (Gellert, 1995). Elle a été
décrite à l'origine comme une encéphalite fatale touchant de façon sporadique les chevaux et
les moutons en Allemagne et en Suisse. La maladie tire son nom de la ville de Borna, dans le
sud-est de l'Allemagne près de Leipzig, où une épidémie décima les chevaux d'un régiment de
cavalerie de l'armée prussienne en 1895. Le caractère infectieux de la maladie de Borna a été
démontré au début du vingtième siècle par des expériences de transmission par inoculation
d'homogénats de cerveau d'animaux malades (Zwick, 1939; Zwick and Seifried, 1925).
D'autre part, il a été montré que cet agent était sensible aux détergents, aux solvants
organiques et aux ultraviolets. Ces résultats, ainsi que des expériences de filtration ont
démontré que la maladie de Borna était causée par un virus enveloppé, le Virus de la Maladie
de Borna ou Bornavirus (Borna Disease Virus, soit BDV) (Figure 1) (Danner and Mayr, 1979;
Duchala et al., 1989; Nicolau and Galloway, 1928). Dans les années 90, l’analyse moléculaire
du BDV a permis de le décrire comme étant un virus à ARN négatif, simple brin, non
segmenté (ARN NNS) appartenant à l'ordre des Mononegavirales (Cubitt and de la Torre,
1994; de la Torre et al., 1990; Lipkin et al., 1990; VandeWoude et al., 1990). Le BDV infecte
le système nerveux central (SNC) et il est non cytolytique, aussi bien in vitro qu'in vivo. Il est
le seul virus à ARN NNS animal dont le cycle viral est entièrement nucléaire (Cubitt and de la
Torre, 1994). Ces caractéristiques ont conduit à classer le BDV dans une nouvelle famille de
virus, celle des Bornaviridae dont il est le seul représentant à l’heure actuelle.
Le BDV possède un spectre d'hôte très large. L'infection naturelle par le BDV à été
décrite dans de nombreuses espèces animales, y compris chez le chien et le chat (Ludwig and
Bode, 2000; Lundgren et al., 1995; Rott and Becht, 1995). Expérimentalement, il peut être
transmis à un large spectre d'animaux, qui s'étend des oiseaux et des rongeurs aux primates
(Rott and Becht, 1995). Le BDV persiste dans le SNC, principalement dans les neurones, et
les signes cliniques associés sont extrêmement variables suivant l'espèce, l'âge et le statut
immunologique de l'hôte.
II. ORGANISATION DU GÉNOME
Le séquençage réalisé à partir de deux isolats du BDV révèle une organisation
génomique similaire à celle des autres Mononegavirales (Briese et al., 1994; de la Torre,
1994). Le génome a une longueur d’environ 8,9 kb et possède des extrémités 3’ et 5’
complémentaires entre elles. Au moins six cadres ouverts de lecture ont été caractérisés.
Ceux-ci codent de 5’ en 3’ sur l’antigénome pour les protéines suivantes (Figure 2) : la
nucléoprotéine p38/p40 (N) et la phosphoprotéine p24/p16 (P), constituants majeurs de la
nucléocapside, la protéine de matrice gp18 (M), la glycoprotéine d’enveloppe gp94/gp84 (G)
et l’ARN polymérase ARN dépendante p190 (L). Un cadre de lecture compris dans celui de
la protéine P code pour la protéine p10 (X). Il faut remarquer que la taille du génome est
réduite comparée aux autres virus à ARN NNS malgré un nombre de protéines codées
- 11 -
Figure 1 : Représentation schématique d’une particule du BDV
- 12 -
similaire aux autres Mononegavirales. Afin d'augmenter la capacité de codage de son
génome, le BDV utilise en effet de nombreuses stratégies que nous détaillerons par la suite.
Le BDV est caractérisé par une très grande stabilité génomique. En effet, les deux
souches du BDV dont la séquence complète a été établie, les souches He/80 et V, présentent
une homologie dans la séquence nucléotidique supérieure à 95 %. Ces deux isolats
proviennent pourtant de deux chevaux différents. Leurs séquences sont également très
similaires à celles des souches obtenues directement à partir d'animaux infectés. En outre, la
variation de séquence entre les ARN viraux provenant de prélèvements humains et animaux
n'est que de 3 à 4 %, au niveau nucléotidique (Bode et al., 1996; de la Torre et al., 1996a;
Nakamura et al., 2000; Planz et al., 1999). Cependant, il faut remarquer qu’un nouvel isolat
de BDV provenant d'un cheval infecté en Autriche présentait une variation de plus de 15 %
avec les isolats décrits jusque là (Nowotny et al., 2000). L'étude de cet isolat sera très
importante pour comprendre l'évolution et la stabilité du génome du BDV. Il est intéressant de
noter que la mise en évidence de ce nouvel isolat pose le problème des approches
diagnostiques moléculaires actuelles pour la détection du BDV. En effet, ce variant ne pouvait
pas être détecté par RT-PCR avec les amorces qui sont couramment utilisées dans les
laboratoires.
III. LES PROTÉINES VIRALES
1-La nucléoprotéine
La première phase ouverte de lecture du génome du BDV code pour la nucléoprotéine
N. Il s’agit de la protéine virale la plus abondamment exprimée dans les cellules, les tissus ou
les animaux. Elle s’associe à l’ARN génomique du virus pour former avec la protéine P les
composants majeurs des complexes ribonucléoprotéiques viraux (RNP) (Figure 1). Ces RNP
ont des rôles multiples : elles protégent le génome des RNases cellulaires et participent à la
réplication du génome, ainsi qu’au transport intracellulaire et à l’assemblage des particules
virales. La protéine N du BDV existe sous deux isoformes, l'une d'un poids moléculaire de 40
kDa et l'autre de 38 kDa (p40N et p38N). Ces deux protéines résultent d'une initiation de la
traduction au niveau de deux AUG séparés par 13 acides aminés (Pyper and Gartner, 1997).
Le rôle de ces deux protéines dans le cycle de réplication et de transcription virale n'est pas
connu. Cependant, différentes données suggèrent que la protéine N est primordiale pour la
localisation nucléaire du complexe ribonucléoprotéique (Kobayashi et al., 1998). La protéine
p38 est amputée de la séquence de localisation nucléaire (NLS) 3PKRRLVDDA11, qui se
trouve dans la partie N-terminale de la protéine p40 (Kobayashi et al., 1998). Cependant, ces
deux isoformes sont retrouvées dans le noyau des cellules infectées, suggérant que la p38
rentre dans le noyau par interaction avec d'autres protéines virales. Récemment, il a été
démontré que la protéine N du BDV possède également une séquence d'export nucléaire
(NES) constitué de la séquence canonique 128LTELEISSIFSHCC141 (Kobayashi et al., 2001).
Il est intéressant de noter que la séquence NES chevauche le site d'interaction décrit entre les
protéines N et P. En conséquence, l'export nucléaire de la protéine N est bloqué lorsque la
protéine P est coexprimée. Ces résultats confirment le rôle primordial que semble jouer la
protéine N dans le transport nucléocytoplasmique des RNP virales.
- 13 -
Figure 2 : Organisation génomique du BDV.
- 14 -
2-La protéine X
Le transcrit de 0,8 kb est le plus petit du génome viral. Il est bicistronique et code pour
la protéine X de 10 kDa et la protéine P. La phase ouverte de lecture de la protéine X
commence 49 nucléotides en amont de celle de P et chevauche sur 71 acides aminés la partie
N-terminale de la protéine P, qui se trouve dans un autre cadre de lecture.
Dans les cellules infectées, la protéine X présente une localisation nucléaire.
Cependant, lorsqu'elle est exprimée seule après transfection sa localisation est cytoplasmique.
La protéine X interagit avec les protéines P et N, ce qui expliquerait sa localisation nucléaire
lors de l'infection (Malik et al., 2000; Wolff et al., 2000). Cependant, le rôle exact de cette
protéine est toujours inconnu.
3-La phosphoprotéine
Le transcrit de 0,8 kb code également pour la phosphoprotéine P de 24 kDa. La
protéine est phosphorylée par la protéine kinase Cε et la caséine kinase II, mais il n'y a pas de
démonstration claire du rôle de la P (Schwemmle et al., 1997). Il est postulé que la P aurait les
mêmes fonctions que les phosphoprotéines des autres virus à ARN NNS dans le cycle viral,
c’est-à-dire un rôle de cofacteur essentiel de la polymérase virale. La protéine P possède un
NLS bipartite. Le NLS est composé de deux motifs uniques riches en proline, l’un situé en
amino-terminal, 29PRPRKIPR36, et l’autre en carboxy-terminal, 181PPRIYPQLPSAPT193
(Shoya et al., 1998). Différentes analyses de mutagenèse ont démontré que les résidus proline
sont essentiels à la localisation nucléaire de la protéine P.
Dans la même phase ouverte de lecture que la P, il a été montré récemment qu'une
autre protéine de 16 kDa appelée P' pouvait être transcrite (Kobayashi et al., 2000). P' a été
détectée aussi bien dans les cellules infectées en culture que dans le cerveau des animaux
infectés. La traduction de cette protéine de 16 kDa est initiée au niveau du second AUG se
trouvant dans le cadre ouvert de lecture de la protéine P. Au sein du transcrit de 0,8 kb du
BDV, il y a donc trois codons AUG fonctionnels, ce qui suggère un mécanisme de "leaky
scanning" dans la traduction de l'ARN. Il est intéressant de noter que la protéine P' a perdu les
deux résidus phosphorylés par la protéine kinase Cε mais elle conserve en revanche les sites
phosphorylés par la caséine kinase II (S70 et S86) (Schwemmle et al., 1997). Il se pourrait donc
que la protéine P' ait des rôles différents de ceux joués par la protéine P.
4-La protéine de matrice
Le BDV possède une protéine de matrice traduite à partir du transcrit initié en S3 dont
le poids moléculaire est prédit à 18 kDa (p18). Les premiers travaux concernant la protéine M
semblaient indiquer qu'elle était glycosylée, la distinguant des protéines M des autres virus à
ARN NNS. Cependant, il a récemment été démontré que la protéine M est en fait une protéine
non glycosylée, qui est située sous l'enveloppe virale (Kraus et al., 2001). La protéine M du
BDV semble donc avoir le même rôle que chez les autres virus à ARN NNS, où la protéine de
matrice est associée à la couche interne de la membrane plasmique et joue un rôle dans
l'assemblage et dans le bourgeonnement des virions.
- 15 -
5-La protéine d'enveloppe
Les glycoprotéines des virus à ARN NNS sont des protéines d'enveloppe exprimées à
la surface du virion. Tout comme la protéine M, les glycoprotéines sont impliquées dans la
maturation, l'assemblage et le bourgeonnement des particules virales. Les glycoprotéines sont
essentielles pour l'infection d'une nouvelle cellule par le virus en permettant la fixation du
virus à un récepteur se trouvant sur la membrane cellulaire (Bajramovic et al., 2003). Dans le
cas du BDV le récepteur reste encore indéterminé. Les glycoprotéines sont les seuls
composants viraux à être exposés au milieu extérieur et sont par conséquent sensibles à
l'apparition d'anticorps neutralisant l'interaction entre la protéine G et son récepteur
membranaire.
La protéine G du BDV est transcrite à partir du site d'initiation S3 qui code pour une
glycoprotéine d'un poids moléculaire prédit à 56 kDa. Après glycosylation, cette protéine
présente un poids moléculaire apparent de 84 kDa. Il a été montré que la glycosylation était
nécessaire à la stabilisation de la protéine.
La glycoprotéine est clivée par une protéase cellulaire, la furine donnant une molécule
de 43 kDa (gp43) qui correspond à la région C-terminale de la protéine (Gonzalez-Dunia et
al., 1997a; Richt et al., 1998). La gp84 s'accumule préférentiellement au niveau du réticulum
endoplasmique, alors que la gp43 est retrouvée à la surface cellulaire. Curieusement, ces deux
protéines sont pourtant présentes dans l'enveloppe des virions. Les deux isoformes de la
protéine semblent posséder des propriétés bien distinctes. La gp84 pourrait être impliquée
dans la fixation du virus au récepteur cellulaire. La gp43, quant à elle, jouerait un rôle dans les
phénomènes de fusion entre les membranes provoquées par l'acidification des endosomes,
conduisant à la libération du complexe ribonucléique viral dans le cytosol (Gonzalez-Dunia et
al., 1998; Richt et al., 1998). En accord avec cette hypothèse, il a récemment été montré que
l'extrémité N-terminale de la glycoprotéine G était suffisante pour l'entrée du virus dans la
cellule (Perez et al., 2001).
6-La polymérase
Grâce à sa position et à l'homologie de séquence avec les autres virus à ARN NNS,
l'extrémité 3' de l'antigénome du BDV est prédite comme codant pour la polymérase virale
dépendante de l'ARN. L’expression de la polymérase L du BDV est dépendante d’un
phénomène d’épissage qui fusionne un petit morceau du cadre ouvert de lecture de la protéine
G avec l'extrémité 5' du cadre ouvert de lecture de la protéine L (Walker et al., 2000). Le
transcrit codant pour la protéine L du BDV représente la majeure partie du génome et code
pour une protéine de 190 kDa. Un autre transcrit a été détecté dans des cellules infectés de
différents types et provenant d’espèces variées : celui-ci code pour une protéine dont la masse
est prédite à 165kDa. La fonction de la protéine p165 est inconnue mais elle pourrait
correspondre à une isoforme de la polymérase.
Le mode de fonctionnement précis de la polymérase du BDV reste peu connu, mais il
semble proche de celui des autres virus à ARN NNS. Ces polymérases ARN dépendantes
possèdent de nombreuses activités. Elles présentent une activité polymérase ARN dépendante,
qui permet de synthétiser les ARN messagers (ARNm) en utilisant les signaux d’initiation et
de terminaison de la transcription situé sur l’ARN génomique de polarité négative. Elles
transforment aussi l'ARN génomique non codant en un ARN antigénomique de polarité
positive qui servira à l’amplification du génome du virus. Ces protéines présentent également
une activité topoisomérase et hélicase.
- 16 -
Cependant il faut souligner que à l’opposé des autres virus à ARN NNS infectant les
animaux, la réplication et la transcription du génome du BDV se déroulent dans le noyau de la
cellule infectée. La polymérase virale doit donc également être localisée dans le noyau. La
séquence en acides aminés de la L contient deux motifs (189VSKNAKWPPV197 et
943WYKVRKVT950) très similaires à ceux retrouvés dans la polymérase d'un virus de plante
appartenant à la famille des Nucléorhabdoviridae (sonchus yellow net virus) dont le cycle est
également nucléaire. Ces deux motifs pourraient être impliqués dans la régulation de l'import
nucléaire de la polymérase L, bien que cela ne soit pas formellement démontré dans le cas du
BDV. En outre, une autre étude a montré que la séquence en acides aminés
844RVVKLRIAP852 était nécessaire et suffisante pour la localisation nucléaire de la
polymérase L (Walker et al., 2000).
IV. CYCLE VIRAL ET RÉPLICATION
1-Réplication et transcription
Le mode de réplication et de transcription du BDV est proche de celui des autres
Mononegavirales, mais du fait de la localisation nucléaire et de la petite taille de son génome,
le BDV possède de nombreuses particularités que nous allons détailler dans cette partie.
Le génome du BDV contient au moins trois régions d'initiation de la transcription
riches en uracile reconnues par la polymérase L (S1, S2 et S3) et cinq signaux de terminaison
(T1, T2, T3, T4 et t6). Dans le cas du BDV, les sites d'initiation contiennent un motif unique
qui n'est pas retrouvé chez les autres virus à ARN NNS. En revanche, les motifs de
terminaison sont similaires à ceux des virus à ARN NNS (Figure 2).
De nombreux chevauchements des sites de terminaison de la transcription avec le site
d'initiation de la transcription du messager suivant sont présents dans le génome du BDV.
Ainsi, le signal d'initiation de la transcription (S2) du second transcrit (ARN de 0,8 kb) est
localisé 18 nucléotides en amont du site de terminaison (T1) du premier transcrit (ARN de
1,2kb). De plus, le second signal de terminaison (T2) est complètement englobé dans le
troisième signal d'initiation (S3) (Figure 2). Ce chevauchement des unités de transcription est
particulier au BDV. Il implique un franchissement des sites de terminaison lors de la
transcription de certains ARN subgénomiques, comme par exemple le franchissement des
sites de terminaisons T3 et t6 indispensable pour l'expression de la polymérase L.
Les transcrits du BDV sont tous polyadénylés et coiffés (Briese et al., 1994; Cubitt et
al., 1994a). Parmi les six protéines différentes du BDV, la protéine N est la seule à être
traduite à partir d'un transcrit monocistronique, tous les autres transcrits sont polycistroniques.
Chez la plupart des virus à ARN NNS, la transcription du génome viral se produit selon
un gradient transcriptionnel décroissant de 3' en 5'. Ce phénomène peut s'expliquer par le fait
que plus le transcrit est éloigné de l'extrémité 3', moins la réinitiation de la polymérase est
efficace. La transcription du BDV semble obéir également à cette règle. Cependant, il est
probable que le chevauchement des unités de transcription module aussi l'efficacité de
transcription des différents gènes.
- 17 -
2-Épissage
L'épissage est une stratégie très efficace pour produire différentes protéines à partir
d'un même transcrit. Comme la transcription du génome a lieu dans le noyau, le BDV peut
utiliser la machinerie cellulaire d’épissage pour réguler et augmenter le répertoire des
protéines virales. Le génome contient deux sites donneurs d'épissage (SD1 et SD2) et trois
sites accepteurs d'épissage (SA1, SA2 et SA3) (figure 2) (Cubitt et al., 2001; Cubitt et al.,
1994b; Schneider et al., 1994; Tomonaga et al., 2000). Les motifs des séquences d'épissage
sont similaires aux sites consensus décrits chez les mammifères. Trois introns ont été décrits
dans le génome du BDV : l'intron I, des nucléotides 1932-2025 ; l'intron II des nucléotides
2410-3703 et l'intron III des nucléotides 2410-4559. Les transcrits qui conservent l'intron I
sont utilisés pour traduire la protéine M, et ceux qui conservent l'intron II codent pour la
glycoprotéine d'enveloppe. Les transcrits ne possédant pas les deux introns servent de
messager pour la polymérase. D'autre part, les transcrits issus de l'épissage de l'intron III
pourraient donner naissance à une nouvelle protéine de BDV, qui n'a pas encore été détectée
dans des cellules infectées en culture.
Il est intéressant de noter que les introns II et III partagent le même site d'épissage en
5', laissant suggérer l'existence d'un épissage alternatif dans les ARN pré-messagers du BDV.
Cet épissage alternatif pourrait être régulé par un signal de terminaison alternatif et un
élément suppresseur d'épissage d'exon agissant en cis (ESS) (Tomonaga et al., 2000). Des
études plus détaillées devraient permettre de clarifier le rôle exact de l'épissage alternatif dans
la réplication du BDV.
V. ÉPIDÉMIOLOGIE
1-Diagnostic
L’épidémiologie de la maladie de Borna demeure mal connue et les données varient
beaucoup en fonction de la méthode diagnostique utilisée. Il n’existe à l’heure actuelle pas de
méthode diagnostique fiable et standardisée malgré les efforts intenses de nombreux
laboratoires. Cette difficulté peut s'expliquer par certaines caractéristiques propres au
Bornavirus. En particulier, le BDV se réplique peu dans l'organisme, induit des réponses
sérologiques très limitées, et est retrouvé à de très faibles taux dans les excrétions des
animaux infectés. À ce jour, le seul test standard permettant de diagnostiquer avec certitude
une infection par le BDV est une analyse post mortem des tissus cérébraux.
Dans ce chapitre, j'énumèrerai les principales techniques développées pour la détection
du BDV. Puis, je discuterai des difficultés rencontrées dans l'analyse des résultats.
1.1-Détection d'anticorps dirigés contre le Bornavirus
La recherche d'anticorps dans le sérum ou le liquide céphalo-rachidien est le moyen le
plus utilisé pour mettre en évidence une infection par le BDV. Les virus enveloppés
disséminent sous forme de particules virales exprimant à leur surface les glycoprotéines
d'enveloppe, qui sont la cible de la réponse anticorps de l'hôte. Dans le cas du BDV, les
- 18 -
connaissances actuelles suggèrent que la présence de virus enveloppés circulant dans le sang
est rare et que la dissémination du virus a lieu principalement par contact cellulaire. De plus,
le BDV est un virus non cytolytique et il infecte le cerveau qui est une structure relativement
protégée du système immunitaire. Ces caractéristiques propres au BDV peuvent expliquer le
faible niveau d'anticorps dirigés contre le virus chez les animaux infectés, et par la même les
difficultés de leur détection. Ainsi, des chevaux naturellement infectés atteints d'une maladie
de Borna clairement identifiable cliniquement présentent un taux d'anticorps faible, avec un
titre de l'ordre de 1 : 40, alors que les antigènes viraux sont abondants dans le cerveau. De
même, les rats infectés expérimentalement ne présentent pratiquement pas d'anticorps dirigés
contre le BDV, malgré l'injection d'une quantité importante de virus par voie intracrânienne.
Ces observations soulignent les contraintes imposées aux techniques sérologiques de
détection du BDV, à savoir un haut niveau de sensibilité, qui permettrait la mise en évidence
d'un faible niveau d'anticorps.
Le test d'immunofluorescence indirecte (IF) a été la première technique sérologique
mise au point pour le BDV (Amsterdam et al., 1985; Rott and Becht, 1995). Le test consiste
en l'utilisation de cellules infectées de façon persistante par le BDV sur lesquelles est incubé
le sérum à tester. Du fait de sa réplication et de sa transcription nucléaires, la présence
d'anticorps anti-BDV est révélée lorsque l'immunomarquage en fluorescence fait apparaître
des structures punctiformes dans le noyau.
Par la suite, il a été développé des tests d'immunomarquage sur membrane, ou
"Western Blot" (WB), à l'aide d'extraits protéiques de cellules infectés ou de protéines
recombinantes. Le WB présente l'avantage de pouvoir distinguer les différentes protéines
virales reconnues par les anticorps (Waltrip II et al., 1995). Ceci lui confère une spécificité
supérieure à celle de l'IF. Enfin, des tests ELISA ("enzyme-linked immunosorbent assay")
utilisant des protéines recombinantes du BDV sont en cours d'évaluation dans différents
laboratoires.
La difficulté de mettre en évidence une infection par le BDV à l'aide de techniques
classiques a conduit à la mise au point de deux tests plus élaborés. Il a été suggéré que les
protéines N et P, qui sont abondamment retrouvées dans les tissus infectés, pourraient être
relarguées dans le sang et séquestreraient les anticorps spécifiques présents dans le sérum. Les
protéines N et P agiraient alors comme des leurres immunologiques. Basé sur cette hypothèse,
certains auteurs ont développé une approche centrée sur la détection de complexes immuns
formés entre les anticorps et les protéines N et P du BDV circulant dans le sang (Bode et al.,
2001). La sensibilité de cette technique est dix fois supérieure à celle des méthodes
sérologiques traditionnelles. Ce test semble donner des résultats encourageants, mais il est
extrêmement sensible et pose des problèmes de spécificité. À ce jour, ce test est en cours de
validation. La mise au point et la validation de cette technique permettraient de posséder un
test sérologique standard utilisable par tous les laboratoires.
Une seconde approche, visant à détecter des anticorps de faible avidité, repose sur une
technologie de "peptide array". Elle consiste en l'établissement d'une banque de peptides
chevauchants d'une longueur de 15 acides aminés, qui recouvrent la totalité des séquences
protéiques de la N et de la P. Il est ainsi possible de purifier les anticorps de faible avidité
présents dans un sérum avec une bonne spécificité. Cependant, cette technique ne met en
évidence que les anticorps reconnaissants les épitopes linéaires des protéines N et P et non
ceux reconnaissants les épitopes conformationnels (Billich et al., 2002).
- 19 -
1.2-Détection d'antigènes du Bornavirus
L'immunohistochimie réalisée sur des coupes de cerveaux est la seule qui permet avec
certitude de diagnostiquer une infection par le BDV. (Caplazi and Ehrensperger, 1998; de la
Torre et al., 1996b; Gosztonyi and Ludwig, 1984). Les antigènes viraux sont détectés à l'aide
d'un sérum polyclonal reconnaissant toutes les protéines du BDV, ou à l'aide d'anticorps
spécifiques d'une seule protéine du BDV. De même, la présence de protéine virale dans
différents tissus infectés peut être mise en évidence par WB.
1.3-Détection de l'ARN du Bornavirus
Au début des années 90, le clonage et le séquençage du génome du BDV a permis de
développer de nouvelles techniques plus sensibles reposant sur la détection de l'ARN du
Bornavirus dans le sang circulant. Les ARN messagers des protéines N et P étant les plus
représentés (Briese et al., 1994; Cubitt et al., 1994a), la majorité des approches développées
repose sur leur détection.
Sur la base de résultats obtenus à partir de sang périphérique de rats infectés
expérimentalement, il a été montré qu'environ 1 cellule sur 105 à 106 présentait de l'ARN viral
(Sauder and de la Torre, 1998). Du fait de cette faible quantité d'ARN viral présent dans le
sang périphérique, des approches de RT-PCR nichées ont été développées. Elles permettent
d'améliorer la sensibilité de la RT-PCR classique, en réalisant deux cycles séquentiels
d'amplification à l'aide de deux couples d'amorces différents (Sauder and de la Torre, 1998;
Sierra-Honigmann et al., 1993). Ces approches présentent l'avantage d'être très sensibles et de
pouvoir détecter de 10 à 100 copies de génome viral par échantillon.
Enfin, la technique de l'hybridation in situ permet la détection d'ARN viraux sur des
coupes de tissus (Carbone et al., 1991a; de la Torre et al., 1996b; Nakamura et al., 1999b;
Stitz et al., 1998a). À l'opposé de la RT-PCR, cette technique présente peu de risques de
contamination, mais sa sensibilité est beaucoup plus faible que la RT-PCR.
1.4-Détection de virus infectieux
La technique de choix pour le diagnostic de l'infection par le BDV est l'isolement du
virus infectieux à partir du sujet malade. Cependant, le BDV étant un virus très associé aux
cellules, il est difficile d'isoler du virus infectieux à partir des sécrétions nasales, de la salive
ou du sang. En général, l'isolement du BDV se fait par inoculation d'homogénats de cerveau
sur des cellules indicatrices ou par des tests in vivo (test d'infectivité sur animaux). Les lignées
cellulaires couramment utilisées pour mettre en évidence le virus sont les lignées de cellules
C6, issus d'un glioblastome de rat et les cellules OL provenant d'un oligoblastome humain
(Bode et al., 1996; Carbone et al., 1993). Les animaux utilisés pour les tests d'infectivité sont
le rat et le lapin (Katz et al., 1998; Rott et al., 1991).
1.5-Limites des différents tests de diagnostic
La technique d'IF pour détecter les anticorps dirigés contre le BDV présente l'avantage
d'être rapide et facile d’utilisation. Cependant, le marquage punctiforme du noyau, qui est le
critère de séropositivité, n'est pas assez spécifique. En effet, les titres d'anticorps anti-BDV
sont si bas que la dilution des sérums à tester est très faible (1:5 ou 1:10). Dans ces conditions,
une fixation non spécifique des anticorps peut apparaître. Il a également été montré que les
- 20 -
sérums pouvaient contenir des anticorps reconnaissant des structures cellulaires, conduisant à
l'apparition de résultats faussement positifs. Ceci est particulièrement vrai si l'on essaie
d'établir un lien entre l'infection par le BDV et les troubles du comportement. En effet, il est
apparu que les patients psychiatriques présentaient plus fréquemment des autoanticorps
reconnaissant des structures nucléaires (Legros et al., 1985; Sirota et al., 1991).
Les tests ELISA, bien que généralement reconnus pour leur grande sensibilité, n'ont
permis de détecter des anticorps anti-BDV que chez une espèce (rat) mais pas chez d'autres
(chevaux, lapin) (Horimoto et al., 1997; Katz et al., 1998). Ceci représente une importante
limitation de l'utilisation de cette technique pour la détection d'anticorps chez l'homme.
Les derniers tests développés récemment et mentionnés précédemment semblent être
prometteurs (Billich et al., 2002; Bode et al., 2001). Cependant, le test de détection des
complexes immuns présente une sensibilité extrême, et cette sensibilité a pour conséquence
de diminuer fortement la spécificité du test. Par exemple, les premiers résultats décrits
mentionnent que 30 % des patients témoin sont considérés comme positifs. En revanche, le
test du peptide array est lui très spécifique et on devrait accorder plus de confiance aux cas
positifs identifiés par cette méthode diagnostique.
La détection des ARN viraux par la technique de RT-PCR nichée présente également
des inconvénients. Cette technique est tellement sensible qu'elle peut également aboutir à
l'apparition de faux positifs par contamination. Dans de nombreux cas, l’étude de la variabilité
génétique entre l’échantillon à tester et le contrôle positif peut être utilisée pour s'assurer d'une
absence de contamination. Cependant, les variations de séquence des souches de BDV
provenant de sources différentes sont dans la très grande majorité des cas très limitées, de
l'ordre de 5 %. En outre, les séquences des virus "humains" ne varient pas ou très peu des
virus isolés chez les animaux. Il est donc, à ce jour, difficile de pouvoir distinguer les souches
étudiées en laboratoire des souches sauvages et à l'heure actuelle l'analyse des données
obtenues est réellement compliquée par les problèmes éventuels de contamination. Une autre
limitation de la technique de diagnostic par RT-PCR a été récemment mise en évidence par la
découverte d’une nouvelle souche virale isolée d'un cheval, en Autriche. La séquence d'ARN
de cette souche, No/98, varie de 15 % par rapport aux souches équines décrites jusqu'à présent
(Nowotny et al., 2000), et a été très difficilement amplifiable par les approches de RT-PCR
standard. Ces résultats indiquent que les amorces utilisées jusqu'à présent ne permettent pas la
détection de toutes les souches du BDV.
Un autre phénomène renforce la difficulté de l'analyse. Il a été montré que la détection
d'anticorps et la détection d'ARN viral ne sont pas toujours concordantes. En effet, certains
animaux présentent des anticorps sans présenter d'ARN détectable, ou l’inverse. Ces résultats
s'expliquent principalement par la différence de sensibilité et de spécificité existant entre les
deux techniques, mais ils peuvent être aussi la conséquence de particularités liées à la
physiopathologie de l’infection. En effet, les résultats peuvent être positifs pour une seule
technique utilisée en fonction du statut immunitaire de l’hôte ou du stade de la maladie.
L'isolement de virus infectieux reste la meilleure preuve d'une infection par le BDV.
Cependant, suivant le titre viral présent dans l'homogénat inoculé, les preuves d'une infection
peuvent être rapides (un fort titre viral est détectable en culture de cellules par la mise en
évidence de l'expression des antigènes viraux en 24 heures) ou très lentes (l'inoculation d'un
faible titre viral à l'animal aboutit à une maladie plusieurs mois après l'infection). Les limites
de cette technique sont le faible taux de réplication du BDV chez de nombreuses espèces
(probablement chez l'homme également) et la restriction de réplication du virus à certains
tissus in vivo du fait de son caractère neurotrope. Cette technique permettra certainement
d'isoler de nouvelles souches du BDV, mais elle ne pourra que très difficilement être utilisée
en routine comme test de diagnostic.
- 21 -
En conclusion, il n'existe à ce jour toujours pas de test standard permettant de
diagnostiquer avec certitude l'infection par le BDV, que se soit par détection d'anticorps ou
d'ARN viral. Les seules techniques unanimement reconnues et acceptées sont l'hybridation in
situ pour détecter l’ARN viral et l’immunohistochimie sur coupes de cerveau post mortem,
ainsi que l'isolement de virus infectieux. Dans l'état actuel des connaissances de la biologie
moléculaire du BDV et du fait de l'extrême conservation du génome, les techniques de
détection de l'ARN viral par RT-PCR ou RT-PCR nichée ne semblent pas encore
suffisamment au point pour déterminer de façon certaine si il y a une infection par le BDV.
Les tests de diagnostic s'orientent donc vers des techniques de sérologie. L'utilisation
combinée des deux techniques récemment développées que sont le « peptide array » et la
détection des immuns complexes pourrait aboutir à un test fiable de détection du BDV.
2-Le BDV chez les animaux
Historiquement, le BDV a été décrit comme étant une maladie associée à une
inflammation du tissu nerveux. Durant de longues années, il était admis qu'une infection par
le BDV conduisait systématiquement à l'apparition d'une méningo-encéphalite. Cependant,
plus récemment il a été mis en évidence que de nombreux animaux cliniquement sains
présentaient des anticorps anti-BDV (Herzog et al., 1994). Ces résultats indiquent que
l'infection naturelle pourrait en fait être majoritairement asymptomatique.
L'infection naturelle est rencontrée principalement chez les chevaux et les moutons. Elle
apparaît sporadiquement, avec une incidence apparemment plus élevée au printemps et au
début de l'été, saisons caractérisées par une activité plus importante des petits rongeurs.
L'hypothèse d'un vecteur rongeur qui pourrait transmettre le BDV aux chevaux et aux
moutons a été formulée (Dürrwald and Ludwig, 1997; Rott and Becht, 1995). Cependant, il ne
semble pas exister de relation clairement prouvée entre l'apparition de la maladie et la
présence de rongeurs dans ces mêmes régions. Des études réalisées au Japon sur des rats
sauvages n'ont pas pu mettre en évidence d'infections naturelles chez ces animaux (Hagiwara
et al., 2001). Le rôle des rongeurs en tant que vecteur ou réservoir n'est donc pas établi et il
faut réaliser d'autres études avant de se prononcer définitivement.
Différentes études épidémiologiques suggèrent que le spectre d'hôte du BDV ainsi que
sa distribution géographique sont beaucoup plus larges que suspecté au départ. La région
d'endémie initialement décrite pour le BDV est située en Europe centrale, en particulier
l'Allemagne, la Suisse, l'Autriche et la principauté du Lichtenstein (Bilzer et al., 1996;
Dürrwald and Ludwig, 1997; Ludwig et al., 1985; Nowotny et al., 2000; Waelchli et al., 1985;
Weissenbock et al., 1998b). En dehors de cette région, le taux de prévalence du BDV est
nettement moins élevé. Cependant, une nouvelle région d'endémie semble se dessiner au
Japon (Tableau 1 et 2), ou de nombreux cas d'infection par le BDV ont été décrits ces
dernières années. Quelques cas d'infection isolés de chevaux ont également été diagnostiqués
en Europe du Nord, aux Etats-Unis, en Iran et en Israël (Tableau 1 et 2) (Herzog et al., 1997;
Kao et al., 1993; Nakamura et al., 1995). Le BDV est considéré comme un agent infectieux
retrouvé chez les chevaux et les moutons, mais certaines données épidémiologiques indiquent
que de nombreuses autres espèces animales peuvent également être infectées naturellement
par le virus. En effet, l’infection a pu être mise en évidence chez d'autres animaux d'élevage
(les bovins et les lapins) (Caplazi and Ehrensperger, 1998; Hagiwara et al., 1996), de zoo (le
lama et les singes) (Richt et al., 1997b; Rott and Becht, 1995), sauvage (lynx, le renard)
(Dauphin et al., 2002) et mêmes certains animaux de compagnie,
- 22 -
Tableau 1 : Séroprévalence du BDV chez les animaux infectés naturellement
Espèce
animale
Cheval
Pays
Prévalence (%)
Méthode de
Malade
Non malade détection
Allemagne
100
Etats-Unis
Japon
29
28,6
IF, WB
IF
8,8
16,7
2,7
WB
WB
IF
66,7
16,7
60,9
Iran
Suède
Mouton
Bovins
Chat
57,7
Références
(Richt et al., 1993)
(Vahlenkamp et al.,
2000)
(Kao et al., 1993)
(Kao et al., 1993)
(Kao et al., 1993)
WB
(Hagiwara et al., 1997b)
ELISA, WB (Takahashi et al., 1997)
WB
(Hagiwara et al., 2002)
18,1
WB
24,5
ELISA
(Bahmani et al., 1996)
(Berg et al., 1999)
Chine
75
ELISA, WB (Hagiwara et al., 2001)
Japon
26,8
ELISA, WB (Hagiwara et al., 1997a)
Allemagne
16
Chine
50
Japon
20,3
Chine
0
IF
(Vahlenkamp et al.,
2000)
ELISA, WB (Hagiwara et al., 2001)
WB
(Hagiwara et al., 1996)
ELISA, WB (Hagiwara et al., 2001)
Suède
45,8
16,7
IF
(Lundgren et al., 1993)
Allemagne
12,5
6,9
IF
(Lundgren et al., 1993)
8,4
WB
WB
(Nakamura et al., 1996)
(Nakamura et al.,
1999b)
5,9
ELISA
Japon
66,7
RoyaumeUni
35,3
Rongeurs Japon
0
Chine
0
- 23 -
(Reeves et al., 1998)
ELISA, WB (Tsujimura et al., 1999)
ELISA
(Hagiwara et al., 2001)
Tableau 2 : Détection de l'ARN du BDV par PCR chez les animaux infectés naturellement
Espèce
animale
Cheval
Pays
Allemagne
Prévalence (%)
Échantillon
Malade Non malade
100
20
Cerveau
PBMC
(Bilzer et al., 1995)
(Vahlenkamp et al., 2000)
29,8
PBMC
Cerveau
(Nakamura et al., 1995)
(Hagiwara et al., 1997b)
Iran
23,6
PBMC
(Bahmani et al., 1996)
Japon
17,9
PBMC
(Hagiwara et al., 1997a)
4
PBMC
(Vahlenkamp et al., 2000)
Japon
28,6
66,7
Mouton
Références
Allemagne
Bovins
Japon
10,8
PBMC
(Hagiwara et al., 1996)
Chat
Japon
13,3
PBMC
PBMC
(Nakamura et al., 1996)
(Nakamura et al., 1999b)
80
0
PBMC
(Reeves et al., 1998)
33,3
33,3
Cerveau
(Reeves et al., 1998)
53,3
RoyaumeUni
PBMC : cellules mononucléaires du sang périphérique
- 24 -
en particulier les chiens et les chats (Berg et al., 1998; Lundgren et al., 1995; Reeves et al.,
1998; Weissenbock et al., 1998a). Le BDV possède donc un spectre d’hôte extrêmement
large, ce qui a été confirmé par les études d’infections expérimentales réalisées sur un nombre
très élevé d’espèces animales. Cependant, plusieurs classes d’espèces animales peuvent être
définies en fonction du nombre d’infections par le Bornavirus décrites (Tableau 1 et 2) :
infections fréquemment décrites (équins, ovins), infections occasionnellement décrites
(félins), infections rarement décrites (canins, bovins). Pour les autres espèces animales,
l’infection semble être exceptionnelle.
Une étude récente réalisée par un laboratoire vétérinaire a mis en évidence la présence
d'animaux positifs pour l'ARN du BDV sur le territoire français, en utilisant la technique de la
RT-PCR nichée. Pour cette étude, 171 échantillons de cerveaux d'animaux (chevaux, renards,
chiens, bovins et moutons) et 25 échantillons sanguins de chevaux ont été analysés. L'ARN
viral a été retrouvé dans le cerveau de 3 chevaux, d'une vache et de 6 renards (Dauphin et al.,
2002). Cette étude est la première à mettre en évidence l'infection du renard par le BDV. Le
renard pourrait être un vecteur du virus ou même un réservoir. Par conséquent, il serait
intéressant de réaliser une étude plus complète sur la séroprévalence des renards pour le BDV.
À ce jour, le mode de transmission du virus est encore mal compris. Les données
expérimentales suggèrent que l'infection par le BDV s'opère par transmission horizontale. En
effet, un animal sain vivant au contact d'un animal infecté peut contracter la maladie.
Cependant, les modalités de la transmission ne sont pas définies. Comme le virus a pu être
détecté par PCR dans les sécrétions nasales, salivaires et les liquides conjonctifs, la voie
olfactive a été proposée comme mode de transmission (Nowotny et al., 2000), tout comme la
voie orale (Bilzer et al., 1996). Une étude récente a étudié en détail le mode de transmission
entre des rats infectés à la naissance et des rats receveurs (Sauder and Staeheli, 2003). Les rats
infectés à la naissance présentent des forts taux viraux et lorsque la maladie progressent du
virus peut-être retrouvé dans la majorité des organes et des sécrétions. Le virus présent à des
taux élevés dans l’urine fraîche des animaux infectés de façon persistante a pu infecter la
majorité des receveurs et le virus a atteint le cerveau des receveurs par la voie olfactive.
Un cas de transmission verticale du BDV a été reporté chez une jument (Hagiwara et
al., 2000). Cette jument présentait une hyperthermie, un appétit réduit et une parésie. Le
cerveau présentait de multiples sites de dégénérescence neuronale, de nécrose et
d'hémorragie. Le cerveau de la mère ainsi que celui du fœtus étaient positifs pour l'ARN du
BDV par PCR. Ces données semblent indiquer qu'une transmission verticale du BDV est
également possible. Très récemment, la transmission verticale du BDV a été confirmée
expérimentalement chez la souris (Okamoto et al., 2003).
En conclusion, le BDV est un virus neurotrope qui peut infecter un très large spectre
d'animaux. Le BDV a été retrouvé chez certains animaux domestiques et d'élevage, qui sont
en contact direct avec la population humaine. Ces résultats posent la question, qui n'est
toujours pas résolue, du BDV comme agent zoonotique potentiel.
3-Le BDV chez l'homme
L'utilisation comme modèle expérimental de l'infection du rat adulte par le BDV
conduit à l'apparition de troubles comportementaux divers. De nombreux travaux réalisés sur
ce modèle ont mis en évidence un ensemble de troubles comportementaux qui présentaient
- 25 -
certaines similitudes avec ceux que l'on peut observer chez certains patients souffrant de
troubles psychiatriques, et plus particulièrement de schizophrénie (Fish et al., 1992). Plus
récemment, l'étude de l'infection du rat nouveau né par le BDV a montré que les animaux
infectés présentaient également des troubles comportementaux comparables à ceux rencontrés
dans certains cas d'autisme. En outre, le déficit dans la maturation du SNC observé chez le rat
infecté est à rapprocher de l'hypothèse d'une altération neurodéveloppementale associée à
certains cas d'autisme (Campbell et al., 1993).
L'ensemble de ces données a abouti à la recherche d'une association éventuelle entre
l'infection par le Bornavirus et certains troubles neurologiques chez l'homme, par détection de
différents marqueurs de l'infection. Cette question n'est toujours pas résolue. Néanmoins, il a
été démontré que l'homme peut être infecté par le BDV, même si aucune étude n'a mis en
évidence de lien étiologique clair entre l'infection par le BDV et l'apparition de la maladie
chez l'homme.
3.1-Détection des anticorps
Le tableau 3 récapitule les différentes études menées chez l'homme pour détecter des
anticorps anti-BDV et indique les données de séroprévalence qui en résultent. En 1985, la
première étude effectuée chez l'homme a identifié une proportion significative de patients
psychiatriques qui présentaient des anticorps dirigés contre les antigènes du BDV
(Amsterdam et al., 1985; Rott et al., 1985). Chez les contrôles, le titre d'anticorps était
beaucoup plus faible. À partir de ces études est née l'hypothèse de l'implication possible du
BDV dans les maladies psychiatriques humaines. Des études ultérieures ont montré des
résultats identiques, en utilisant d'autres méthodes sérologiques (Bechter et al., 1992; Bode et
al., 1992b; Bode et al., 1988; Chen et al., 1999b; Fu et al., 1993; Gonzalez-Dunia et al.,
1997b; Sauder et al., 1996; Takahashi et al., 1997). Au vu de ces résultats, il est tentant
d'associer l'infection par le BDV à l'apparition de troubles du comportement.
Malheureusement, ces résultats ne sont pas reproductibles d'un laboratoire à l’autre,
soulignant l'urgence d'obtenir un test standard. Une autre difficulté apparaît pour
l'établissement des critères de séropositivité. En effet, les WB réalisés à l'aide de protéines
recombinantes du BDV montrent que les sérums humains ne reconnaissent parfois qu'un des
deux antigènes majeurs du BDV, que sont la nucléoprotéine et la phosphoprotéine,
contrairement aux animaux dont les sérums reconnaissent en général les deux protéines (Chen
et al., 1999b; Fu et al., 1993; Iwahashi et al., 1997; Sauder et al., 1996). Il reste à déterminer
si ces différences proviennent des limites des tests utilisés ou si elles sont le reflet des
caractéristiques de la réplication virale chez l'homme.
Une autre observation est aussi à prendre en compte. Récemment, il a été montré que
les anticorps anti-BDV détectés chez l'homme étaient de faible avidité. En effet, l'interaction
entre les anticorps et les antigènes peut être facilement dissociée après un traitement avec de
l'urée. Des phénomènes de réactions croisées sont souvent responsables de la faible avidité
des anticorps. Il a donc été suggéré que la réponse anticorps observée provenait d'une réaction
immune dirigée contre des agents pathogènes différents du BDV, ou contre des autoantigènes
(Allmang et al., 2001). Cependant, grâce à la technique du peptide array, le même groupe de
recherche a ultérieurement mis en évidence que ces anticorps de faible avidité reconnaissaient
bien les antigènes du BDV (Billich et al., 2002). Ces résultats soulignent une fois encore la
difficulté de détection des anticorps spécifiques au BDV.
- 26 -
Tableau 3 : Séroprévalence du BDV chez l'homme
Origine du
donneur
Groupe
Nombre Prévalence Méthode
d'individus
en %
de
détection
Références
Allemagne
Troubles psychiatriques variés
Volontaires sains
694
95
0,6
0
IF
(Rott et al., 1985)
Allemagne
Troubles psychiatriques variés
Patients en chirurgie
1003
133
6,8
3,5
IF
(Bechter et al., 1987)
Allemagne
Troubles psychiatriques variés
Patients en chirurgie
2377
569
5,9
3,5
IF
(Bechter et al., 1992)
Allemagne
Dépression majeure
Troubles bipolaires
Schizophrènes
Autres patients en psychiatrie
Patients atteints de sclérose en
plaque
Maladies cérébrospinales
Autres maladies neurologiques
65
8
27
28
19
3,1
0
0
0
0
IF
(Deuschle et al., 1998)
14
69
7,14
0
Europe
SIDA
VIH positifs asymtomatiques
Donneurs de sang VIH
négatifs
244
1024
118
13,99
7,1
2,5
IF
(Bode et al., 1992b)
Etats-Unis
Troubles dépressifs majeurs
Volontaires sains
265
100
4,5
0
IF
(Amsterdam et al., 1985)
Etats-Unis
Dépression majeure
Contrôles sains
550
365
2,2
2,2
IF
(Bode et al., 1992a)
Etats-Unis,
Allemagne,
Japon
Patients psychiatriques
Patients de l'hopital
5000
1000
4,7
1
IF
(Rott and Frese, 1983)
Allemagne
Troubles psychiatriques variés
Patients en chirurgie
416
203
9,6
1,4
WB
(Sauder et al., 1996)
Etats-Unis
Dépression majeure
Contrôles sains
138
117
6,5
0,85
WB
(Fu et al., 1993)
Etats-Unis
Schizophrènes
Contrôles sains
90
20
14,4
0
WB
(Waltrip II et al., 1995)
Japon
Schizophrènes
Personnel hospitalier
67
26
45
0
WB
(Iwahashi et al., 1997)
Japon
Patients psychiatriques
Volontaires sains
89
210
0
0
WB
(Tsuji et al., 2000)
SIDA
VIH positifs asymtomatiques
Donneurs de sang non infectés
67
60
103
17,9
15
2,5
ELISA
Thaïlande
- 27 -
(Auwanit et al., 1996)
Origine du
donneur
Japon
Japon
Groupe
Nombre Prévalence Méthode
d'individus
en %
de
détection
Donneurs de sang vivant
proche d'une ferme
Donneurs de sang
428
2,6-14,8
100
1
Schizophrènes
Troubles de l'humeur
Autres désordres
psychiatriques
Maladies neurologiques
Maladies oculaires
Patients multitransfusés
Donneurs de sang
VIH positifs
Syndrome de fatigue
chronique
Épilepsie
Maladies autoimmunes
Lèpre
845
251
366
3,08
3,59
0,55
114
1393
66
917
85
75
0
1,36
4,55
1,09
1,18
0
214
50
17
1,4
0
0
Références
ELISA
(Takahashi et al., 1997)
ECLIA
(Yamaguchi et al., 1999)
ECLIA : "Electrochemiluminescence immunoassay"
3.2-Détection de l'ARN viral par PCR
Les premières études démontrant la présence d'ARN viral (Bode et al., 1995) et de
virus infectieux (Bode et al., 1996) dans les cellules mononucléaires du sang périphérique de
patients psychiatriques ont été réalisées au milieu des années 90. Depuis, de nombreuses
études par PCR ont été entreprises et celles-ci sont présentées dans le tableau 4. Ces études
ont analysé des échantillons de patients atteints de schizophrénie, de troubles de l'humeur ou
du syndrome de fatigue chronique provenant d'Autriche, d'Allemagne, du Japon, de la Corée,
de la Suède, de Taiwan et des Etats-Unis. La plupart des études sont réalisées sur des patients
souffrant de troubles nerveux et des individus sains. Les résultats varient considérablement
d'une étude à l'autre, rendant difficile toute conclusion définitive. En effet, la prévalence se
situe entre 0 et 66 % pour les patients, contre 0 à 57 % pour les contrôles. Par ailleurs, cinq
études n'ont pas mis en évidence d'infection par le BDV dans les cellules mononucléaires du
sang périphérique (Tableau 4) (Bachmann et al., 1999; Evengard et al., 1999; Kim et al.,
1999; Lieb et al., 1997; Richt et al., 1997a). La variabilité des résultats pourrait s'expliquer par
l'utilisation de techniques de RT-PCR différentes ou par des contaminations aléatoires dans
certains laboratoires.
Une donnée qui reste fortement débattue est l'étrange conservation de la séquence des
ARN viraux détectée chez l'homme avec celles des différents isolats viraux étudiés en
laboratoire. Il est facile d'argumenter la présence d'ARN du BDV chez l'homme par une
contamination des échantillons avec un virus de laboratoire (Staeheli et al., 2000). Cependant,
la stabilité de séquence du BDV retrouvée chez les différentes espèces animales est telle qu'il
semble possible que les mêmes souches soient capables d'infecter l'homme.
- 28 -
Tableau 4 : Détection de l'ARN du BDV par RT-PCR dans des échantillons de sang humain
Origine du
donneur
Symptômes associés
Prévalence du
BDV
Gène viral
analysé
Type de
cellules
Références
Allemagne
Symptômes variés
Contrôles sains
4/6
0/10
N, P
PBMC
(Bode et al., 1995)
Japon
Symptômes variés
Contrôles sains
22/60 (36,7%)
8/172 (4,6%)
P
PBMC
(Kishi et al., 1995a;
Kishi et al., 1995b)
Japon
Schizophrènes
Dépressifs
Contrôles sains
5/49 (10,2%)
1/6 (16,7%)
0/36 (0%)
P
PBMC
(Igata-Yi et al., 1996)
Allemagne
Symptômes variés
Contrôles sains
13/26 (50%)
0/23 (0%)
N, P
PBMC
(Sauder et al., 1996)
Japon
Schizophrènes
Personnel hospitalier
6/61 (9,8%)
0/26 (0%)
P
Japon
Symptômes variés
Contrôles sains
2/106 (1,9%)
0/12 (0%)
P
Allemagne
Symptômes variés
0/159 (0%)
N
Etats-Unis,
Allemagne
Symptômes variés
0/52 (0%)
N, P
PBMC
(Richt et al., 1997a)
Contrôles sains
0/14 (0%)
2/49 (4,1%)
3/77 (3,9%)
2/84 (2,4%)
P
PBMC
(Iwata et al., 1998)
1/1
N
Japon
Schizophrènes
Troubles de l'humeur
Contrôles sains
Allemagne
Schizophrènes
Troubles de l'humeur
Contrôle sains
Taïwan
Schizophrènes
Patients
psychiatriques
Contrôle sains
Sang total (Iwahashi et al., 1997)
PBMC
(Kubo et al., 1997)
Sang total (Lieb et al., 1997)
Granulocy (Planz et al., 1999)
tes
2/2
0/3 (0%)
10/74 (13,5%)
7/45 (15,5%)
N, P
PBMC
(Chen et al., 1999a)
1/69 (1,4%)
Corée du Sud Symptômes variés
0/81 (0%)
P
PBMC
(Kim et al., 1999)
Suisse
Symptômes variés
0/27 (0%)
N
PBMC
(Bachmann et al., 1999)
Japon
Syndrome de fatigue
chronique (2 familles)
6/10 (60%)
P
PBMC
(Nakaya et al., 1999)
Suède
Syndrome de fatigue
chronique
0/18 (0%)
N, P
PBMC
(Evengard et al., 1999)
Autriche
Syndrome de fatigue
chronique
1/1
N, P, M
PBMC
(Nowotny and
Kolodziejek, 2000)
- 29 -
Tableau 5 : Détection post-mortem d'antigènes et/ou d'ARN du BDV dans des cerveaux
humains
Origine du
donneur
Etats-Unis
Symptômes associés
Troubles variés
Etats-Unis, Schizophrènes
Europe
Troubles bipolaires
Dépression
Troubles variés
Contrôles sains
Japon
Prévalence
du BDV
Gène viral
analysé
Références
4/5 (80%)
N
(de la Torre et al.,
1996b)
9/17 (52,9%)
P
(Salvatore et al., 1997)
P
(Haga et al., 1997a;
Haga et al., 1997b)
2/5 (40%)
0/6 (0%)
0/37 (0%)
0/10 (0%)
Schizophrènes
3/9 (33,3%)
Maladie de Parkinson
Contrôles sains
1/6 (16,7%)
2/31 (6,5%)
Allemagne
Sclérose de l'hippocampe
Troubles variés
Contrôles sains
3/4 (75%)
0/86 (0%)
0/52 (0%)
N, P
(Czygan et al., 1999)
Japon
Schizophrènes
Contrôles sains
1/4 (25%)
0/2 (0%)
N, P
(Nakamura et al., 2000)
3.3-Mise en évidence d'une infection dans le SNC
Comme présenté dans le tableau 5, les antigènes ou l'ARN du BDV ont été également
détectés dans des échantillons d'autopsie de cerveaux humains provenant d'individus qui
présentaient divers troubles nerveux. La première mise en évidence de la présence d'ARN de
BDV dans le cerveau humain a été décrite en 1996 (de la Torre et al., 1996b). Par hybridation
in situ et par détection de protéines en immunohistochimie, l'ARN et la protéine N ont été
retrouvés dans le cerveau de 4 patients sur 5 qui présentaient une gliose et une sclérose au
niveau de l'hippocampe.
Une étude réalisée sur 75 échantillons de cerveaux venant des États-Unis et d'Europe,
regroupant des individus sains et des individus présentant des désordres neurologiques divers,
a permis de détecter le transcrit de la protéine P dans 10 échantillons provenant de personnes
schizophrènes et d'un cas de troubles bipolaires (Salvatore et al., 1997). Un article plus récent
a décrit la présence de BDV dans le cerveau d'un patient japonais schizophrène (Nakamura et
al., 2000). L'ARN viral a été détecté par RT-PCR et par hybridation in situ dans trois régions
du cerveau (l'hippocampe, le pons et le cervelet). Plusieurs neurones de l'hippocampe
présentaient également un marquage pour les antigènes viraux. En outre, les auteurs ont pu
isoler du virus infectieux après injection intracrânienne d'un extrait du cerveau de ce patient
chez des gerbilles nouveau nées (Nakamura et al., 2000).
- 30 -
L’isolement de virus infectieux et la mise en évidence directe du virus à partir
d’échantillons humains indiquent que le BDV est bien capable d’infecter l’homme. Les études
ont été réalisées sur des tissus prélevés chez des patients souffrant de troubles psychiatriques
ce qui permet de suggérer que l’infection par le BDV pourrait en effet conduire à l’apparition
de troubles nerveux chez l’homme.
Il ressort clairement de l'analyse de la situation actuelle que les approches utilisées
pour la détection de l'ARN viral ou des anticorps anti-BDV chez l'homme ne sont pas
unanimement acceptées. Par conséquent, certains des résultats publiés sont critiquables.
Cependant, quel que soit le laboratoire menant les investigations, quelle que soit la technique
employée, les résultats montrent toujours une séroprévalence accrue pour le BDV chez les
patients atteints de maladies psychiatriques. En conclusion, nous pouvons dire qu'il n'existe
pas de lien formellement démontré entre une infection par le BDV et l'apparition de troubles
comportementaux chez l'homme. Cependant, au vu de la quantité de résultats accumulés
depuis une dizaine d'années, la corrélation entre les patients présentant des troubles
neurologiques et la présence d'anticorps anti-BDV dans leur sérum ne peut être le simple fait
du hasard et mérite d'être prise en considération.
VI. INFECTION NATURELLE PAR LE BORNAVIRUS
L'infection par le BDV a été pour la première fois décrite au XVIIIe siècle dans un traité
de médecine vétérinaire allemand (Von Sind, 1781). On la décrivait alors comme une
"maladie inflammatoire de la tête" (hitzige Kopfkrankheit). Le nom de maladie de Borna est
apparu au XIXe siècle lorsque de nombreux chevaux d'un régiment de cavalerie stationné près
de la ville de Borna (Saxe – Allemagne) ont succombé à cette maladie.
Les deux principaux hôtes naturels du BDV sont les chevaux et les moutons, mais
l'infection naturelle a également été décrite chez l'âne, le chat, la chèvre, les bovins et le chien
((Ludwig and Bode, 2000; Lundgren and Ludwig, 1993; Weissenbock et al., 1998a)). Il faut
remarquer que les cas d'infection naturelle par le BDV chez ces animaux ont essentiellement
été trouvés dans la zone d'endémie qui est l'Europe centrale (Allemagne, Suisse, Autriche,
Liechtenstein), mais aussi au Japon où les recherches sont intenses.
Les manifestations cliniques de la maladie de Borna sont très proches chez le cheval et
le mouton, mais la maladie a été plus précisément étudiée chez le cheval. Je décrirai donc
essentiellement les symptômes de l'infection chez le cheval. Les signes cliniques chez le
mouton et le chat sont exposés dans le tableau 6. Très peu de données sont disponibles pour
les autres espèces naturellement infectées par le Bornavirus (bovins, canins) car le diagnostic
de l’infection par le Bornavirus a été le plus souvent effectué post-mortem.
L'infection du cheval par le BDV peut conduire à un tableau clinique très varié, allant
d'une maladie suraigue à une absence de symptômes. Il est désormais reconnu que l’infection
est très souvent asymptomatique ou qu’elle ne s’accompagne que de modifications
comportementales légères et épisodiques. En effet, les études épidémiologiques semblent
indiquer une prévalence non négligeable du BDV chez des chevaux sains. Une étude réalisée
au Japon sur des chevaux ne présentant aucun symptôme de la maladie de Borna a révélé que
- 31 -
ces chevaux étaient séropositifs et qu'ils présentaient de l'ARN viral détecté par hybridation in
situ sur des coupes de cerveaux (Hagiwara et al., 1997b).
Cependant, la forme de la maladie la plus étudiée en médecine vétérinaire est la maladié
de Borna classique, décrite dès le XIXe siècle, et qui correspond à la forme aigue de
l’infection. Dans la forme aigue, les signes cliniques initiaux correspondent à des troubles
comportementaux (Richt and Rott, 2001). Des problèmes de déglutition, ainsi qu'une fièvre
récurrente font également partie des premiers symptômes. Les troubles nerveux s'aggravent
rapidement pour conduire soit à une hyperexcitabilité associée à une agressivité et à une
hyperactivité motrice, soit au contraire à une léthargie. On observe fréquemment des postures
anormales. Lors des stades plus avancés de la maladie, le cheval a la tête renversée en arrière
et présente une baisse des réflexes spinaux associée à une hypoesthésie avec troubles de la
proprioception. Les symptômes suivants se développent ensuite progressivement : perte
d'équilibre, ataxie, bruxisme, dysphagie. Le cheval peut également convulser et réaliser des
poussées au mur qui peuvent traduire une augmentation de pression du liquide céphalorachidien.
Quand la maladie progresse, un torticolis d'origine nerveuse peut apparaître ainsi qu'une
démarche circulaire. La dysphagie s'aggrave également et l'ingestion d'aliments et d'eau peut
même cesser totalement. Une paralysie totale est également fréquemment rencontrée chez le
cheval. L'issue est fatale chez 80% des animaux atteints et la mort a généralement lieu entre
une et quatre semaines après le début des symptômes (Dürrwald and Ludwig, 1997).
Si l'animal survit la phase aiguë de la maladie, la maladie peut devenir chronique et
certains symptômes tels que la dépression associée à une apathie, une somnolence et un
comportement craintif peuvent persister pendant toute la vie de l'animal (Richt et al., 1997b).
Il est intéressant de noter que du virus infectieux peut-être isolé à partir des animaux en phase
chronique de la maladie indiquant que l’infection est persistante et que les symptômes
observés ne sont pas uniquement dus aux lésions induites lors de la phase aigue de la maladie.
Plusieurs hypothèses peuvent être avancées pour expliquer la diversité des symptômes
rencontrés lors de l’infection par le Bornavirus. Des paramètres tels que la souche virale, la
voie d’entrée du virus ou la résistance de l’hôte liée à des facteurs génétiques méritent de
recevoir une attention particulière.
Les lésions caractéristiques de l'infection par le BDV sont principalement observées au
niveau du SNC. L'analyse histopathologique a pu mettre en évidence une méningite associée à
une infiltration des cellules du système immunitaire dans le cerveau (méningo-encéphalite).
Cette infiltration se caractérise par l'apparition de manchons périvasculaires, constitués
principalement de macrophages, de lymphocytes CD3+ et de quelques lymphocytes B ainsi
que de cellules plasmatiques (Bilzer et al., 1995; Stitz et al., 1993; Stitz et al., 1995). On
observe également un infiltrat diffus dans tout le parenchyme cérébral, ainsi qu'une activation
astrocytaire dans les régions de forte inflammation.
- 32 -
Tableau 6 : Symptômes de la maladie de Borna chez les espèces animales infectées
naturellement par le BDV
Principales espèces infectées par le Bornavirus :
Cheval
Forme aiguë
Phase précoce
Phase tardive
Forme
chronique
si survie à la
forme aiguë
Forme
asymptomatique
Mouton
Forme aiguë
persistance de modifications comportementales ou non
éventuellement légères modifications comportementales
Phase précoce
Phase tardive
Forme
asymptomatique
modifications comportementales, dépression ou excitation
troubles sensorimoteurs d’origine centrale
hyperkinésie, ataxie
torticolis, poussé au mur
paralysie et mort dans 80% des cas de paralysie
modifications comportementales
troubles sensorimoteurs d’origine centrale
tremblements, ataxie, poussé au mur
paralysie et mort ou chronicité
éventuellement légères modifications comportementales
Espèce infectée occasionnellement par le Bornavirus :
Chat
Modifications comportementales
Tremblements du chat ou « staggering disease »
- 33 -
anxiété, anorexie, hyperesthésie
tremblements, ataxie
paralysie
VII. INFECTIONS EXPÉRIMENTALES PAR LE BORNAVIRUS
Expérimentalement un large spectre d'hôtes peut être infecté par le BDV. Le rat
(Hirano et al., 1983; Narayan et al., 1983a), la souris (Hallensleben et al., 1998; Kao et al.,
1984; Rubin et al., 1993), le hamster (Anzil et al., 1973), la gerbille (Watanabe et al., 2001),
le lapin (Zwick, 1939), le poulet (Zwick, 1939), le tupaïa (Sprankel et al., 1978) et le macaque
rhésus (Stitz et al., 1980), sont tous susceptibles à l'infection par le BDV. Néanmoins, la
progression de la maladie, la période d'incubation, la mortalité et la sévérité des signes
cliniques associés à l'infection varient en fonction des espèces, et aussi en fonction des lignées
à l'intérieur d'une même espèce. Par exemple, l'infection du lapin par le BDV induit des
syndromes neurologiques sévères et une mortalité importante, alors que l'infection chez le
tupaïa n'est associée qu'à des troubles de l'interaction sociale. Les souris ont pendant
longtemps été considérées comme résistantes à l'infection par le BDV (Kao et al., 1984).
D'autres études ont néanmoins démontré que certaines lignées murines étaient sensibles à
l'infection par le BDV (Hallensleben et al., 1998; Rubin et al., 1993). De même, toutes les
lignées de rat ne présentent pas la même susceptibilité à l'infection par le BDV (Herzog et al.,
1991). Ainsi, les rats Lewis sont les plus sensibles à l'infection et il s’agit de la souche la plus
étudiée en laboratoire. Des résultats obtenus chez la souris et chez le rat semblent suggérer
l'existence de facteurs de susceptibilité génétique impliqués dans l'apparition de la maladie.
Le modèle expérimental le plus utilisé pour étudier la pathologie associée à l'infection par le
BDV est celui du rat. Je présenterai dans ce chapitre le modèle du rat infecté par le BDV et
plus brièvement celui de la souris et de la gerbille.
1-Modèle de l'infection du rat Lewis immunocompétent
1.1-Infection du SNC
L'infection expérimentale du rat par voie nasale a permis d'étudier de façon précise la
dissémination du BDV dans le SNC (Carbone et al., 1987; Morales et al., 1988). Après
infection et réplication virale dans les cellules nerveuses de l'épithélium olfactif, le virus
infecte les cellules mitrales, périglaciaires, granulaires et les neurones à petits axones de la
couche granulaire interne du bulbe olfactif. À la suite de l'invasion de ces structures, le virus
atteint les cibles efférentes du bulbe olfactif telles que le noyau olfactif antérieur, le cortex
prépiriforme, le tubercule olfactif et le cortex entorhinal. De là, il dissémine dans le
diencéphale et le télencéphale en utilisant de nombreuses connexions nerveuses.
L'injection du virus dans la patte arrière du rat conduit également à l'infection du SNC,
ce qui souligne le très fort neurotropisme du BDV. Le virus atteint le SNC par l'intermédiaire
du nerf sciatique (Carbone et al., 1987). Une fois dans le SNC, le BDV présente un tropisme
préférentiel pour le système limbique, en particulier l'hippocampe. Cette région présente la
plus forte charge virale, même si le virus est présent dans tout le cerveau (Carbone et al.,
1991a; Gosztonyi and Ludwig, 1995; Morales et al., 1988). Au niveau cellulaire, les antigènes
viraux s'accumulent dans le noyau, le périkaryon et les prolongements neuronaux (Gosztonyi
and Ludwig, 1984). Les noyaux des neurones infectés présentent des corps d'inclusions
nucléaires typiques, dits corps de Joest-Degen.
En plus des neurones, le virus peut infecter les astrocytes, les oligodendrocytes, les
cellules épendymales ainsi que les cellules de Schwann au niveau du système nerveux
- 34 -
périphérique. Il est probable que les cellules gliales soient infectées secondairement par le
BDV, au travers de leurs contacts avec les neurones infectés.
1.2-Immunopathologie associée
Le rat infecté par le BDV à l'âge adulte développe une maladie biphasique médiée par
la réponse immunitaire. L'étude de l'infection du singe rhésus a été la première à montrer
l'importance de la réponse immune dans la pathologie associée à l'infection par le BDV. En
effet, les singes ayant subit une ablation de la rate avant l'infection par le BDV présentaient
des signes cliniques moins sévères (Stitz et al., 1980). Au milieu des années 80, le modèle du
rat immunocompétent a confirmé ces premiers résultats. Les rats adultes infectés par le BDV
présentent une forte réaction inflammatoire au niveau du SNC. En revanche, les rats
immunosupprimés ou thymectomisés ne présentaient pas de réponse inflammatoire massive
(Herzog et al., 1984; Herzog et al., 1985; Narayan et al., 1983a; Stitz et al., 1991a; Stitz et al.,
1991b; Stitz et al., 1989). Pourtant, la quantité d'ARN viral et d'antigènes viraux retrouvée
dans le cerveau est la même dans les deux populations (Carbone et al., 1987; Herzog et al.,
1985; Narayan et al., 1983a; Narayan et al., 1983b; Stitz et al., 1991a; Stitz et al., 1991b). Par
conséquent, la maladie de Borna se révèle un modèle extrêmement intéressant pour l'étude de
l'immunopathologie médiée par les lymphocytes T au niveau du système nerveux central.
L'infection du rat adulte immunocompétent conduit à une maladie biphasique
caractérisée par des symptômes neurologiques sévères semblables à ceux des chevaux
naturellement infectés (Carbone et al., 1991b). Les premiers symptômes de la maladie aiguë
apparaissent 25 à 30 jours après injection intracrânienne. Les rats sont d'abord hyperactifs et
agressifs. Ils présentent des réponses exagérées à divers stimuli. Des troubles de la
coordination motrice, ainsi qu'une désorientation peuvent également apparaître. 40 jours postinfection, les rats présentent une constante agitation de la tête, un rétrocollis et une faiblesse
musculaire intense. L'apparition des signes cliniques coïncide avec l'invasion du SNC par les
cellules immunitaires, conduisant à une forte réaction inflammatoire au niveau du cerveau, et
plus particulièrement au niveau du système limbique, du cortex et du bulbe olfactif. Cette
inflammation est suivie d'une destruction neuronale (Bilzer and Stitz, 1994; Planz et al., 1993;
Sobbe et al., 1997; Stitz et al., 1991a). Aux stades tardifs, une grande proportion du tissu
nerveux est détruit, tout particulièrement le cortex.
Les animaux qui survivent à la phase aiguë entrent alors dans la phase chronique de la
maladie. Celle-ci apparaît généralement 60 jours post-infection intracrânienne et est
caractérisée cliniquement par une apathie, une somnolence et une dépression. L'entrée dans la
phase chronique provient de la diminution progressive de la réaction inflammatoire qui a lieu
malgré une réplication virale toujours intense. Les mécanismes impliqués dans la régression
spontanée de la réponse inflammatoire ne sont toujours pas bien connus.
Depuis plusieurs années, la compréhension des phénomènes impliqués dans
l'immunopathologie associée à l'infection par le Bornavirus, et plus particulièrement la
caractérisation des cellules effectrices, a été un champ d'investigation très intense. L'analyse
histologique de cerveaux de rats infectés par le BDV montre la présence de cellules T CD8+
autour des lésions. Les cellules T CD4+ sont quant à elles retrouvées dans tout le SNC sans
localisation précise. Sur la base de ces résultats, de nombreuses études ont tenté de préciser le
rôle exact des cellules T CD4+ et CD8+ dans l'immunopathologie.
Les lymphocytes ont été isolés directement à partir de cerveaux de rats malades. Après
avoir caractérisé leur phénotype par cytométrie de flux et leur activité par des tests de
cytotoxicité, les lymphocytes T CD8+ ont été utilisés pour effectuer des expériences de
transfert adoptif (Sobbe et al., 1997). Le transfert adoptif de ces lymphocytes T CD8+ dans
- 35 -
des rats infectés immunosupprimés et non malades conduit à l'apparition de lésions dans le
cerveau. Ces lésions se caractérisent par une vacuolisation du neuropile et une dégénérescence
des neurones. La présence d'un nombre prédominant de cellules CD8+ par rapport aux cellules
CD4+ dans le parenchyme cérébral à proximité des lésions indique que les CD8+ jouent un
rôle primordial dans la destruction des cellules neuronales infectées (Sobbe et al., 1997). Cette
hypothèse est renforcée par la présence d'une activité cytotoxique médiée par le CMH I chez
les lymphocytes isolés du cerveau de rats infectés. De plus, la destruction des cellules
neuronales est corrélée à la présence d'ARN messager de la perforine, molécule impliquée
dans la lyse induite par les cellules CD8+. Cette étude n'a pas mis en évidence de rôle direct
des cellules T CD4+ dans la destruction du cerveau. De plus, le profil de distribution des
cellules CD4+ et CD8+ confirme le rôle effecteur des cellules CD8+.
Une étude réalisée par le même groupe a permis de mieux cerner le rôle des
lymphocytes T CD4+ (Noske et al., 1998). Cette étude repose sur l'injection de cellules T
CD4+ spécifiques pour le BDV avant infection par le Bornavirus. Les rats injectés avec les
cellules CD4+ spécifiques du BDV avant infection présentent peu d'inflammation au niveau
du SNC et le virus n'est plus retrouvé dans le cerveau. L'injection de cellules T CD4+
permettrait un recrutement plus rapide des cellules T CD8+ au niveau du SNC. Les cellules T
CD8+ retrouvées présentent une activité cytotoxique et sont donc capables d'éliminer le virus.
Ce recrutement rapide des cellules T CD8+ est associé à une légère et brève inflammation,
alors que les rats non traités présentent une inflammation massive du SNC. Il semblerait donc
que le recrutement plus précoce des cellules T CD8+ permette de contenir plus rapidement la
dissémination du virus dans le SNC.
La maladie de Borna chez le rat est une maladie immunopathologique où les cellules T
sont responsables à la fois de la destruction des cellules infectés et de l'élimination du virus.
2-Modèle du rat Lewis infecté à la naissance
L'infection du rat nouveau né par le BDV conduit à la persistance du virus dans le
SNC tout au long de la vie de l'animal. Ces rats ne présentent pas de signes cliniques évidents,
à l'exception d'une perte de poids et d'un retard de croissance qui ne peuvent pas être imputés
à une prise alimentaire réduite ou à des taux anormaux d'hormone de croissance (Bautista et
al., 1994). Cependant, les rats infectés à la naissance sont atteints de troubles cognitifs et
émotionnels et présentent des altérations neurodéveloppementales (Bautista et al., 1995;
Bautista et al., 1994; Dittrich et al., 1989). Il faut souligner que l'infection néonatale se
caractérise par l'absence de réaction inflammatoire. Ce modèle permet donc d'étudier les
effets directs du BDV sur la physiologie nerveuse sans l'intervention du système immunitaire.
2.1-Dissémination dans le SNC
L'infection des rats nouveau nés s'effectue dans les 24 premières heures après la
naissance, par inoculation intracrânienne ou intranasale. Dans les premiers jours suivant
l'infection, les antigènes viraux sont retrouvés au niveau du bulbe olfactif, de l'hippocampe
(dans les régions 3 et 4 de la corne d’Ammon), dans le cortex frontal et dans le noyau profond
du cervelet. Après 10 jours d'infection, le marquage anti-BDV est particulièrement intense
dans les corps cellulaires des neurones de l'hippocampe, du cortex et du cervelet (Bautista et
al., 1995; Gonzalez-Dunia et al., 2000; Hornig et al., 1999; Sauder and de la Torre, 1999).
Trois semaines post-infection, le virus est présent dans l'ensemble des structures du SNC.
L'intense marquage des corps cellulaires fait alors place à un marquage beaucoup plus diffus
- 36 -
dans le neuropile. Après infection des neurones, le virus infecte les astrocytes, les
oligodendrocytes et les cellules de Schwann du système nerveux périphérique. Il faut
remarquer que la charge virale présente tardivement dans le cerveau des rats infectés à la
naissance est sensiblement la même que celle retrouvée chez les rats adultes atteints de la
maladie aiguë.
Aux stades tardifs de l'infection néonatale, le BDV dissémine de façon centrifuge dans
tout l'organisme en suivant les voies nerveuses et tous les tissus recevant une innervation
périphérique ou centrale peuvent être infectés par le BDV (Stitz et al., 1998a). Cette invasion
tardive des organes périphériques peut s'expliquer par l'absence d'anticorps neutralisants lors
de l'infection néonatale, alors que les anticorps neutralisants limitent la dissémination du virus
au système nerveux lors de l'infection du rat adulte. En effet, le transfert de sérum de rats
adultes immunocompétents infectés à des rats infectés à la naissance a montré que l'infection
virale se concentrait uniquement au niveau du cerveau et était absente des organes
périphériques (Stitz et al., 1998a).
2.2-Altérations neurodéveloppementales
L'infection néonatale par le BDV perturbe particulièrement la formation des structures
présentant un développement postnatal important (Carbone et al., 1991a; Carbone et al.,
1991b; Rubin et al., 1999). Il en résulte au niveau du SNC une perte du gyrus denté au niveau
de l'hippocampe, mais aussi des altérations dans le cervelet et le cortex. Ces pathologies du
SNC conduisent à des troubles comportementaux, comme l'hyperactivité locomotrice, une
faible capacité d'apprentissage et de mémorisation ainsi qu'un comportement social anormal.
2.2.1-Au niveau de l'hippocampe
Les neurones de l'hippocampe, et particulièrement ceux des régions 3 et 4 de la corne
d'Ammon, sont les premiers à être infectés. Malgré l'intense réplication virale, aucune
destruction de la corne d'Ammon n'est observée. En revanche, il y a une perte progressive des
neurones du gyrus denté qui a totalement disparu six semaines après l'infection (Carbone et
al., 1991a; Carbone et al., 1991b). Plusieurs études ont montré que la dégénérescence de ces
neurones s'effectuait par apoptose (Hornig et al., 1999). Néanmoins, les causes de cette
apoptose neuronale ne sont toujours pas élucidées.
La grande majorité (>85 %) des neurones granulaires du gyrus denté sont générés
après la naissance (Gould and McEwen, 1993). Cette propriété pourrait expliquer leur
vulnérabilité sélective à la suite de l'infection néonatale par le BDV. Le virus pourrait
interférer avec les cascades de signalisation importantes pour la maturation et la survie des
neurones du gyrus denté conduisant ainsi à une mort progressive des neurones.
2.2.2-Au niveau du cervelet
Le cervelet se caractérise par un développement postnatal extrêmement important. En
effet, dans les trente premiers jours de la vie de l'animal, la taille du cervelet augmente de plus
de vingt fois et il acquiert son arborisation laminaire caractéristique. Ce développement
postnatal est associé à une prolifération intense et à une migration radiale des cellules
granulaires du cervelet, de la couche granulaire externe vers la couche granulaire interne. De
même, les cellules de Purkinje, qui sont générées aux alentours du quatorzième jour du stade
embryonnaire, poursuivent leur maturation et leur différenciation après la naissance
(Goldowitz and Hamre, 1998). On peut donc s'attendre à ce que toute interférence dans ces
- 37 -
processus de prolifération, de différenciation et de migration neuronales ait des effets négatifs
sur le développement postnatal du cervelet.
L'hypoplasie du cervelet est une des caractéristiques morphologiques majeures des
altérations neurodéveloppementales observées chez les rats infectés à la naissance par le
BDV. Cette hypoplasie est associée à la dégénérescence massive des cellules de Purkinje, qui
s'accompagne d'une perte discrète et secondaire des cellules granulaires du cervelet. Les
cellules de Purkinje sont impliquées dans la multiplication, la maturation, et la migration des
cellules granulaires. Il est donc possible que la dégénérescence des cellules de Purkinje
induise ultérieurement une perte des cellules granulaires. Il est intéressant de noter que
l'infection des rats au quinzième jour après la naissance conduit toujours à l'infection des
cellules de Purkinje, sans pour autant induire leur dégénérescence ou d'hypoplasie
cérébelleuse. Ces données mettent en évidence la différence de vulnérabilité des cellules de
Purkinje à l'infection par le BDV, en fonction du stade du développement du cerveau.
Le mécanisme à l'origine de l'hypoplasie cérébelleuse des rats infectés à la naissance
par le BDV est encore inconnu, mais il est cependant clairement différent de celui rencontré
dans d'autres infections virales. À la différence du Parvovirus, le BDV est non lytique et il
infecte préférentiellement les neurones matures. D'autre part, l'hypoplasie cérébelleuse
rencontrée dans les infections par le virus de la chorioméningite lymphocytaire et par le
Reovirus de type III est médiée par la réponse immunitaire, alors que l'infection néonatale par
le BDV ne conduit pas à une encéphalite.
2.2.3-Au niveau du cortex
L'infection du rat nouveau-né par le BDV conduit à une atrophie du cortex (Bautista et
al., 1994; Hornig et al., 1999; Weissenbock et al., 2000). La taille du cortex commence à
diminuer deux semaines après l'infection, et des noyaux apoptotiques sont retrouvés 3
semaines post infection au niveau du cortex cérébral. De plus, une analyse morphométrique
réalisée 45 jours après infection a démontré une perte de 30 % des neurones corticaux
(Gonzalez-Dunia et al., 2000). La mort des neurones corticaux est également inexpliquée.
2.3-Conséquences de l'infection sur la physiologie des cellules du SNC
Les altérations développementales induites par le BDV pourraient être liées au
dérèglement de fonctions spécialisées du neurone ou des cellules gliales. En effet, des
perturbations de la physiologie neuronale pourraient conduire à un défaut de maturation et à la
mort des neurones. En particulier, le phénomène de plasticité synaptique joue non seulement
un rôle primordial dans les processus d'apprentissage et dans le raffinement des connexions
neuronales, mais elle participe aussi au développement des structures du SNC.
La protéine associée aux cônes de croissance (GAP-43) et la protéine synaptophysine
sont deux marqueurs de plasticité neuronale. GAP-43 est une phosphoprotéine présynaptique
qui s'accumule dans les cônes de croissance. La synaptophysine est une protéine présente sur
la membrane des vésicules synaptiques. Une étude semi quantitative du niveau d'expression
de ces marqueurs à différents temps après l'infection par le BDV a mis en évidence une
diminution sélective de l'expression de GAP-43 et de la synaptophysine au niveau de
l'hippocampe et du cortex (Gonzalez-Dunia et al., 2000).
Peu d'études ont jusqu'à présent étudié les conséquences directes de l'infection par le
BDV sur le fonctionnement cellulaire. L'utilisation de lignées cellulaires dérivées de neurones
ou de cellules gliales ont permis d'apporter les premières réponses. Il a été ainsi montré que
les neurotrophines et en particulier le facteur de croissance nerveux (NGF) favorisent la
- 38 -
réplication du BDV dans les cellules C6 dérivées d'astrocytes (Carbone et al., 1993).
L'utilisation de cultures primaires d'astrocytes félins a révélé une inhibition de la réabsorption
du glutamate par les cellules infectées, proposant ainsi un mécanisme de la neurotoxicité
rencontrée in vivo (Billaud et al., 2000). Plus récemment, des travaux réalisés au laboratoire
sur un modèle cellulaire de différenciation neuronal utilisant la lignée cellulaire PC12 a
permis de mettre en évidence une inhibition de la différentiation induite par le NGF dans les
cellules infectées par le BDV (Hans et al., 2001). Cet effet est lié à une perturbation de la voie
de transduction du signal induite par le NGF et plus précisément par une activation
constitutive des kinases ERK1/2. Il est intéressant de noter qu'une inhibition de la voie de
signalisation ERK1/2 conduit à une inhibition de la réplication virale (Planz et al., 2001).
Un nouveau modèle d'étude des conséquences de l'infection par le BDV sur le
fonctionnement cellulaire a très récemment été mis en place au laboratoire. Il consiste en
l'étude des effets du BDV sur des cultures primaires de neurones d'hippocampe de rats.
L'hippocampe étant la cible privilégiée du virus in vivo, ce modèle est très adapté à l'étude de
la physiopathologie de l'infection par le BDV. L'infection des neurones d'hippocampe par le
BDV est très rapide comparée aux lignées cellulaires étudiées jusqu'ici et elle ne
s'accompagne pas d'effet cytopathique. Le traitement des neurones par le facteur de croissance
nerveux dérivé du cerveau (BDNF) a montré que les neurones infectés présentaient un sévère
défaut de réponse à cette neurotrophine (Hans et al., 2004). Ce défaut se traduit par une
absence de synaptogénèse induite par le BDNF et il est lié lui aussi à une inhibition de la voie
de signalisation ERK1/2. Il est intéressant de noter que comme dans le cas des cellules C6
traitées au NGF, le traitement des neurones d'hippocampe au BDNF favorise la multiplication
virale (Carbone et al., 1993; Hans et al., 2001).
Ces
résultats
confortent
l'hypothèse
selon
laquelle
les
troubles
neurodéveloppementaux rencontrés dans l'infection par le BDV pourraient être dus à un
défaut de réponse des neurones aux neurotrophines. Ils mettent également en avant les
conséquences de la persistance virale sur la physiologie neuronale. En effet, les neurones
infectés par le BDV semblent tout à fait normaux, mais les conséquences de l'infection
apparaissent seulement après certains stimuli cruciaux pour le fonctionnement normal du
neurone.
2.4-Réponse immunitaire lors de l’infection néonatale
À l'opposé de l'infection des rats adultes, l'infection néonatale se caractérise par une
absence d'encéphalite. Les causes précises de l'absence d'infiltration de cellules immunes dans
ce modèle ne sont pas complètement élucidées. Néanmoins, il a été suggéré que le virus
pourrait infecter très précocement le thymus de l'animal. Il en résulterait une sélection
négative des clones T réactifs contre le BDV (Rubin et al., 1995). Cependant, aucune preuve
directe ne permet d'étayer cette hypothèse à ce jour.
2.4.1-L'astrocytose et la microgliose
Malgré l'absence de réponse immune spécifique dans le SNC des rats infectés, le BDV
induit l'activation des cellules gliales résidentes, comme les astrocytes et la microglie.
L'activation des astrocytes, ou astrocytose, est généralement définie par une
augmentation du nombre et de la taille des cellules exprimant un marqueur spécifique des
cellules gliales, la protéine gliale acide fibrillaire (GFAP). Dans le modèle du rat infecté à la
naissance par le BDV, l'expression de la GFAP est augmentée dès 3 jours p.i. (Bautista et al.,
- 39 -
1995). Par la suite, l'expression augmente continuellement surtout dans les zones du cerveau
présentant une perte neuronale importante, comme le gyrus denté de l'hippocampe, le cervelet
et le cortex (Bautista et al., 1995; Gonzalez-Dunia et al., 1996; Stitz et al., 1995). De plus, on
observe également une forte activation de la microglie (Sauder and de la Torre, 1999).
Les astrocytes jouent un rôle primordial de support dans la migration neuronale durant
le développement, et sont également impliqués dans l'élimination des neurotoxines, ainsi que
dans la production de facteurs solubles (Eddleston and Mucke, 1993). Les fonctions
astrocytaires sont essentielles pour le neurone et l'activation astrocytaire et microgliale peut
interférer avec certaines fonctions neuronales. Une étude récente a montré que des souris
transgéniques exprimant la protéine P du BDV spécifiquement dans les astrocytes
présentaient des modifications comportementales, telles que de l’agressivité et des troubles de
la mémoire spatiale (Kamitani et al., 2003). Il est intéressant de noter que dans cette étude, les
souris transgénique pour la phosphoprotéine P du BDV n’ont pas développé de gliose ou de
dégénérescence neuronale. La protéine P du BDV semble donc interférer spécifiquement avec
des fonctions des astrocytes essentielles à la communication neuronale.
2.4.2-Expression des cytokines et chimiokines
Les astrocytes et la microglie activés ont la capacité de produire différents facteurs
solubles, comme des cytokines et des chimiokines, qui peuvent moduler le fonctionnement
neuronal (Rothwell and Hopkins, 1995).
Les rats infectés à la naissance présentent un niveau élevé d'expression de cytokines
proinflammatoires dans le SNC. En effet, au niveau du cervelet et de l'hippocampe
l'interleukine 6, le facteur de nécrose tumoral α (TNF-α), l'interleukine 1α et l'interleukine 1β
sont détectés dès une semaine après l'infection (Hornig et al., 1999; Sauder and de la Torre,
1999). L'expression de ces ARN messagers est retrouvée dans les régions du SNC présentant
une forte activation astrocytaire et microgliale. De plus, deux semaines après l'infection
néonatale, le niveau d'expression de certaines chimiokines (IP-10 et RANTES) est également
élevé dans le SNC (Sauder et al., 2000). La chimiokine IP-10 est particulièrement
surexprimée au niveau de la glie de Bergmann du cervelet.
En résumé, l'infection des rats Lewis à la naissance conduit à la persistance du BDV
dans le SNC de l'animal en l'absence de réponse immune spécifique. Néanmoins, cette
persistance est associée à l'activation des astrocytes et de la microglie qui produisent un
nombre important de facteurs solubles. Il est très important de noter que l'expression de ces
différents facteurs n'apparaît qu'après le début de la perte des cellules neuronales.
2.5-Altération dans l'expression de gènes
Les neurotrophines sont impliquées dans la prolifération, la migration, la
différenciation et la survie neuronale. Elles sont extrêmement importantes pour le
développement normal du SNC (Huang and Reichardt, 2001; McAllister, 2001).
Deux études ont montré que les rats infectés à la naissance par le BDV présentaient
une baisse de l'expression de l'ARN messager du BDNF, de la neurotrophine 3 et du NGF
dans l'hippocampe. Il en est de même pour les récepteurs des neurotrophines TrkB et TrkC
dans l'hippocampe mais pas dans le cervelet (Hornig et al., 1999; Zocher et al., 2000).
Ces études réalisées in vivo présentent cependant deux inconvénients majeurs. D'une
part, la quantification de l'expression des différents gènes par protection à la RNAse a été
réalisée sur l'ensemble de l’hippocampe. Il est donc impossible de comparer le niveau
- 40 -
d'expression de ces gènes entre les cellules infectées et non infectées. Pour ce faire, la
technique de l'hybridation in situ aurait été plus judicieuse. D'autre part, les différences
d'expression n'apparaissent qu'après 3 et 4 semaines d'infection, selon l'étude. Or, une forte
proportion des neurones de l'hippocampe commence à dégénérer aux alentours de la troisième
semaine après infection. Il reste donc à déterminer si le défaut d'expression observé est réel ou
s'il ne reflète que la perte des neurones exprimant les neurotrophines dans l'hippocampe.
2.6-Troubles du comportement lors de l’infection néonatale
2.6.1-Troubles sensori-moteurs
Les troubles moteurs observés chez les rats infectés à la naissance sont une
conséquence probable des altérations du développement postnatal du cervelet. Arrivés à l'âge
adulte (12 à 76 semaines environ) les rats infectés présentent une légère ataxie, une spasticité
des pattes arrière et une diminution de la capacité à se suspendre (Hornig et al., 1999).
2.6.2-Troubles cognitifs
Le système limbique dans son ensemble, et plus particulièrement l'hippocampe, est
connu pour être impliqué dans les processus d'apprentissage et de mémoire (Rolls, 2000).
L'hippocampe étant une des cibles principales du virus, les phénomènes d'apprentissage et de
mémoire des rats infectés à la naissance ont été étudiés de façon extensive.
Une des premières études comportementales effectuée sur le rat afin d'étudier
l'apprentissage de la situation d'un objet dans l'espace repose sur la performance des rats dans
le labyrinthe en Y et la planche à trous (Dittrich et al., 1989). Dans le test du labyrinthe en Y,
les rats sont entraînés à différencier les deux bras symétriques du Y où de la nourriture a été
disposée à l'extrémité d'un seul des deux bras. De même, le test de la planche à trous permet
d'analyser la capacité d'un animal à mémoriser l'information spatiale. Les rats sont habitués à
chercher de la nourriture placée en diagonale dans différents trous. Les tests ont montré que le
nombre d'erreurs chez les rats infectés était beaucoup plus élevé que celui des animaux
contrôle, et que le temps mis par les rats infectés pour effectuer cette tâche était également
plus long (Dittrich et al., 1989).
Le test du labyrinthe aquatique de Morris est un test classique pour étudier
l'apprentissage spatial et la mémoire qui repose sur l’utilisation de repères visuels
(Eichenbaum et al., 1990). Ce test est couramment utilisé car contrairement à la marche, la
nage ne dépend pas de l'intégrité du cervelet, et permet donc d'étudier spécifiquement l'effet
de lésions de l'hippocampe sur l'apprentissage (Petrosini et al., 1998). Le rat est placé dans un
bassin rempli d'eau opaque. Une plate-forme invisible, car recouverte d'eau, est située à un
endroit bien précis. Cette plate-forme permet au rat de se reposer et d'échapper à la nage
forcée. Le rat ne présentant pas d'altérations de l'hippocampe apprend rapidement où se trouve
la plate-forme, et dans les tests suivants la retrouve directement.
Les tests réalisés sur des rats infectés, âgés de 72 jours, ont montré qu'ils présentaient
un déficit dans leur capacité à apprendre l'emplacement de la plate-forme, qui se traduit par
une incapacité à réduire le temps de nage avant de trouver la plate-forme (Rubin et al., 1999).
2.6.3-Altérations du comportement social
Pletnikov et collaborateurs ont étudié les effets de l'infection périnatale par le BDV sur
le comportement social du rat en utilisant le test dit du rat "résidant/intrus". Le rat "résidant"
- 41 -
est isolé pendant une semaine, afin d'augmenter son envie de relation sociale, et un rat non
familier (l'intrus) est alors introduit dans la cage du rat résidant. Cela conduit à une interaction
sociale entre les deux rats mis ensemble, qui se caractérise par des scènes de jeux. L'analyse
comportementale des rats a montré que les rats infectés avaient beaucoup moins tendance à
entrer en relation avec l'intrus que les rats contrôles (Pletnikov et al., 1999).
En résumé, l'infection néonatale des rats par le BDV conduit à l'apparition de
multiples troubles de l'apprentissage et du comportement, vraisemblablement corrélés aux
altérations neurodéveloppementales de l'hippocampe et du cervelet. Cependant les structures
du cerveau qui restent présentes sont elles aussi infectées et la persistance du virus dans ces
neurones pourrait également contribuer aux troubles comportementaux de l'animal infecté.
3-Modèle d'infection de la souris
La souris est un modèle animal très utilisé. Elle présente l'avantage d'être facilement
manipulable et permet l'utilisation d'animaux génétiquement modifiés. La souris serait donc
un bon modèle pour comprendre les facteurs immunologiques impliqués dans l'apparition de
la maladie de Borna. De même, ce modèle permettrait une étude génétique de la susceptibilité
à l'infection par le BDV en fonction des lignées, conduisant à l'identification d'éventuels
gènes de résistance.
Depuis une dizaine d'années, de nombreux efforts ont été réalisés pour développer un
modèle souris d'infection par le BDV. Les premières études portant sur le développement d'un
modèle animal murin ont échoué (Kao et al., 1984; Rubin et al., 1993), car en dépit de la
persistance virale au niveau du SNC, aucune lésion histologique et aucun trouble
comportemental n’ont été détectés par les méthodes mises en œuvre dans ces études. À la fin
des années 90, le groupe de P. Staeheli en Allemagne a utilisé une autre approche. En effet,
alors que les premières études étaient concentrées sur l'infection de souris adultes, P. Staeheli
et ses collaborateurs se sont intéressés à l'infection néonatale de souris. Parmi de nombreuses
lignées de souris testées, il s'est avéré que les plus susceptibles à l'infection par le BDV étaient
les souris MRL. Contrairement aux résultats trouvés dans le modèle du rat, l'infection de
souris nouveaux nées se traduit par une maladie aiguë médiée par la réponse immune
inflammatoire, dans 80 % des animaux (Hallensleben et al., 1998). Ce modèle récemment mis
au point semble être prometteur pour une étude fine de l'immunopathologie associée à la
maladie de Borna, du fait de l'existence de lignées murines invalidées pour les différents
acteurs de la réponse immunitaire. Cependant, le taux d'apparition de la maladie reste assez
faible (au mieux 80 % pour la lignée MRL). Par conséquent, ce modèle demande l'utilisation
de nombreux animaux. D'autre part, les animaux ne développent des symptômes cliniques que
trente jours après infection. Du fait de ces limitations, il semble que les expériences de
comparaison entre souris non-traitées et traitées par divers agents, ou l'utilisation de souris
invalidées pour un gène spécifique seront très délicates à entreprendre. Il sera en effet difficile
de tirer des conclusions de résultats provenant d'une lignée de souris qui ne présente pas
d'homogénéité dans l'apparition des signes cliniques. D'autre part, la maladie induite dans ce
modèle d'infection reste éloignée de celle qui est observée chez les animaux infectés
naturellement, ou chez les autres modèles animaux.
L'analyse histopathologique des coupes de cerveaux de souris infectées à la naissance
montre une forte inflammation au niveau du SNC avec infiltration de lymphocytes. Tout
- 42 -
comme chez le rat immunocompétent, l'apparition des signes cliniques est corrélée à
l'apparition de lymphocytes infiltrants dans le SNC ainsi qu'à la production d'anticorps
spécifiques dirigés contre le BDV (Hallensleben et al., 1998). Curieusement, l'apparition des
signes cliniques est, dans le cas de la souris, inversement proportionnelle à la quantité d'ARN
viral retrouvée dans le cerveau. Autrement dit, les signes cliniques de la maladie neurologique
sont d'autant plus sévères que la charge virale est faible. L'utilisation de souris n'exprimant
pas la β2-microglobuline, une protéine essentielle pour l'expression des molécules du CMH I,
et qui par voie de conséquence n'ont pas de cellules T CD8+ fonctionnelles, a également
démontré que dans ce modèle les lymphocytes T CD8+ étaient nécessaires pour l'apparition
de la maladie aiguë (Hallensleben et al., 1998). D'autre part, la susceptibilité des souris MRL
semble être déterminée par l'haplotype H2k et par d'autres traits génétiques non encore
identifiés. L'épitope immunodominant reconnu spécifiquement par les CTL de ces souris
MRL est la séquence peptidique 129TELEISSI136 retrouvée dans la nucléoprotéine virale N
(Schamel et al., 2001). Ce modèle souris permettra de mieux comprendre les mécanismes
immunopathologiques associés aux infections virales du SNC.
4-Modèle d'infection de la gerbille
La gerbille est un modèle animal fréquemment utilisé pour la propagation de virus
neurotropes. Par exemple, les virus de l'encéphalite équine occidentale (Hayles, 1972), de la
fièvre de la vallée du Rift (Anderson et al., 1988) et celui de l'encéphalite transmise par les
tiques (Suss et al., 1997) ont été propagés à l'aide de ce modèle. Sur cette base, le modèle
d'infection de la gerbille par le BDV a été développé (Nakamura et al., 1999a). La gerbille
infectée à la naissance par le BDV se distingue par une apparition très rapide des signes
cliniques. Les animaux développent une maladie neurologique aiguë et fatale, qui se
caractérise par des troubles locomoteurs en absence d'altération neuroanatomique du cerveau.
Aux alentours du vingtième jour après infection, les gerbilles présentent une paralysie des
pattes arrière et une perte de poids. Aucun des animaux présentant des signes cliniques ne
parvient à survivre et la mort survient après quarante jours d'infection (Watanabe et al., 2001).
L'analyse histopathologique effectuée trente jours après l'infection révèle une infection
importante du tronc cérébral et des cellules de Purkinje. D'autre part, le cerveau de ces
animaux ne présente pas d'infiltration de cellules T. De même, au niveau neuroanatomique
l'hypoplasie du cervelet et la dégénérescence des neurones du gyrus denté ne sont pas
retrouvées chez la gerbille. De plus, il n'a pas été mis en évidence de mort neuronale par
apoptose (Watanabe et al., 2001).
Le modèle de la gerbille infectée à la naissance reste peu décrit à l'heure actuelle. De
nombreuses questions restent en suspens. Par exemple, quelle est la cause de la mort de ces
gerbilles ? Pourquoi présentent-elles une paralysie des pattes arrière ?
Cependant, cette étude a montré que la gerbille était beaucoup plus susceptible à
l'infection par le BDV que le rat. Par conséquent, ce modèle animal pourrait être utilisé
comme outil pour l'amplification de virus à partir d'échantillons cérébraux provenant de
patients possiblement infectés par le BDV (Nakamura et al., 2000).
- 43 -
VIII. TRAITEMENT DE LA MALADIE DE BORNA
La reconnaissance du BDV comme agent pathogène en médecine vétérinaire et son
implication possible dans des maladies neuropsychiatriques humaines ont poussé plusieurs
groupes à rechercher un traitement antiviral efficace. La première molécule identifiée comme
possédant une effet antiviral est l'amantadine (Bode et al., 1997). Son effet antiviral a été
étudié in vitro, mais aussi in vivo chez des humains possédant des troubles psychiatriques et
infectés par le BDV selon les auteurs. L'amantadine a été par la suite utilisée dans plusieurs
essais cliniques chez des patients présentant des troubles psychiatriques (Dietrich et al.,
2000a; Dietrich et al., 2000b; Ferszt et al., 1999). Cependant, plusieurs groupes n'ont pas pu
confirmer l'activité antivirale de l'amantadine (Cubitt and de la Torre, 1997; Hallensleben et
al., 1997; Stitz et al., 1998b). Les résultats concernant le pouvoir antiviral de l'amantadine
sont donc très controversés. L'amélioration clinique des patients souffrant de troubles
psychiatriques traités par l'amantadine pourrait être due à son activité pharmacologique
antagoniste des récepteurs au glutamate de type NMDA (N-methy-D-aspartate) (Huber et al.,
1999).
Plus récemment, la ribavirine, un analogue nucléosidique à large spectre antiviral, a
été décrite par deux équipes comme ayant un effet inhibiteur du BDV (Jordan et al., 1999;
Mizutani et al., 1998). Le traitement par la ribavirine de cellules infectées de façon persistante
permet de réduire la production de virus libre et des transcrits d'ARN viraux, mais les effets
sont modestes. Le mécanisme d'action de la ribavirine sur le BDV n'est pas connu. Cependant
les effets antiviraux de la ribavirine ont été décrits pour d'autres virus (Gilbert and Knight,
1986). Sous sa forme monophosphate, la ribavirine inhibe la synthèse de la guanosine
monophosphate au niveau de la conversion de l'inosine monophosphate en xanthine
monophosphate. Elle inhibe les polymérases de virus à ARN comme le virus de la grippe ou
le virus de la stomatite vésiculaire. La ribavirine agit également sur le virus de la grippe en
inhibant la formation de la coiffe des ARNm. Des travaux récents ont également montré que
le pouvoir mutagène de la ribavirine sur le poliovirus (Crotty et al., 2000). La ribavirine a
également été testée in vivo sur des rats infectés par le BDV. L'injection intracrânienne de
ribavirine a permis de diminuer les signes cliniques sans toutefois réduire le titre viral ou le
niveau d'acide nucléique. L'effet de la ribavirine sur les signes cliniques est en fait indirect :
elle agirait sur la prolifération microgliale plutôt que directement sur la réplication du BDV
(Solbrig et al., 2002).
Récemment, des travaux du laboratoire ont montré que la 1-ß-Darabinofuranosylcytosine (ara-C), un analogue de la cytidine, était très efficace contre le
BDV (Bajramovic et al., 2002). Le traitement des cellules infectées avec de l'ara-C à une
concentration de 2 µM entraîne une diminution de la production virale d'un facteur 1000,
alors que la ribavirine utilisée à une concentration dix fois supérieure ne réduit la production
virale que d'environ 25 %. L'ara-C inhibe également la transmission du virus de cellule à
cellule et bloque la synthèse des ARN et des protéines du virus. L'effet antiviral semble
spécifique au BDV puisque l'ara-C n'a aucun effet sur des virus proches comme les virus de
la grippe ou de la rougeole. Le virus de la rougeole fait en effet partie de l'ordre des
Mononegavirales et possède une ARN polymérase ARN dépendante de structure proche de
celle du Bornavirus (Walker et al., 2000). Le virus de la grippe est un virus à ARN négatif
segmenté et il possède comme le BDV un cycle de réplication nucléaire. Finalement,
l'activité de l'ara-C a été confirmée in vivo chez le rat. Un traitement prophylactique à l'ara-C
- 44 -
avant infection par le BDV permet de prévenir l'infection et empêche le développement de
signes cliniques.
Ces résultats sont surprenants, car il s'agit de la première mise en évidence de l'effet
inhibiteur de l'ara-C sur un virus à ARN. En effet, l'ara-C est un analogue nucléosidique bien
connu pour son effet inhibiteur des synthèses d'ADN et elle est utilisée dans le traitement des
leucémies aiguës et des lymphomes (Grant, 1998). Pour être active, l'ara-C doit être
phosphorylée en ara-C triphosphate (ara-CTP) et la phosphorylation de l'ara-C en ara-C
monophosphate (ara-CMP), réalisée par la désoxycytidine kinase (dCk), est l'étape limitante
pour la formation de la molécule d'ara-C active (Figures 3 et 4). L'ara-CTP entre en
compétition avec la désoxycytidine triphosphate (dCTP) pour l'intégration dans l'ADN et se
comporte non seulement comme un inhibiteur compétitif des ADN polymérases α et ß
cellulaires (Grant, 1998), mais aussi des ADN polymérases virales telles que celle du virus de
l'herpès simplex de type 1 (Bubley et al., 1986). L'ara-C agit également comme inhibiteur de
la topoisomérase I (Pourquier et al., 2000). L'effet sur la synthèse d'ADN est à l'origine de la
cytotoxicité importante de l'ara-C, propriété utilisée en chimiothérapie anticancéreuse, mais
qui représente une limite importante à son utilisation en thérapeutique antivirale. L'inhibition
de la synthèse d'ADN et la toxicité cellulaire qui en découle ne peuvent pas à eux seuls
expliquer l'effet antiviral de l'ara-C car d'autres inhibiteurs des ADN polymérases α et ß, ou
de la topoisomérase I n'ont pas d'effet sur la réplication du BDV (Bajramovic et al., 2002).
- 45 -
Figure 3 : Structure des analogues nucléosidiques employés
Figure 4 : Voies métaboliques de phosphorylation des nucléosides dérivés de la cytidine
- 46 -
C) PROPRIETES ANTIVIRALES D'ANALOGUES NUCLEOSIDIQUES
Sur la base des résultats récents obtenus au laboratoire concernant l’inhibition du
BDV par l’ara-C (Bajramovic et al., 2002), les objectifs de mon travail étaient doubles.
Dans un premier temps, nous avons réalisé une série d'expériences afin de mieux
comprendre le mécanisme de l'action antivirale de l'ara-C sur le BDV. L'ara-C ayant été
jusqu'ici décrite comme un analogue nucléosidique agissant uniquement sur les synthèses
d'ADN, il était en effet important de décrire par quel moyen elle pouvait inhiber le BDV, un
virus à ARN.
L'ara-C est un puissant antiviral contre le BDV mais il possède une toxicité cellulaire
élevée. Cette toxicité constitue un obstacle à son utilisation thérapeutique. Nous avons donc
recherché d'autres analogues nucléosidiques possédant un effet inhibiteur du BDV mais une
toxicité cellulaire réduite. Grâce aux résultats provenant de la description du mécanisme
d'action de l'ara-C, nous avons déterminé plus précisément quelle structure devait posséder
les analogues susceptibles d'inhiber le BDV. Nous avons ensuite sélectionné les analogues à
tester en fonction des connaissances actuelles concernant leur métabolisme intracellulaire et
leur toxicité.
I. MATERIELS ET METHODES
Cellules et virus
Les cellules de rein de singe (Vero), dermiques équines (ED) et d'astrocytome humain
(U373) proviennent de l'American Type Culture Collection (ATCC). Les cellules sont
cultivées dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco supplémenté en Glutamax (Gibco) et
contenant 10 % de sérum de veau fœtal. Les cellules Vero-BDV, ED-BDV et U373-BDV
sont des cellules infectées de façon persistante par le BDV. Le taux d'infection de 100 % de
ces cellules a été vérifié par détection de la protéine N du BDV par immunofluorescence
indirecte.
J'ai également réalisé des cultures primaires de neurones d'hippocampe de rat. Les
neurones sont cultivés dans du milieu Neurobasal (Gibco) complété par 25 mM de ßmercaptoéthanol, 0.5 mM de glutamine, 2 % de supplément B-27 (Gibco) et 2 % de SVF. Un
jour après la mise en culture des neurones, les inhibiteurs mitotiques 5-fluoro-2'désoxyuridine (Sigma ; 10µg/ml) et uridine (Sigma ; 25µg/ml) sont ajoutés au milieu de
culture afin de limiter la croissance des cellules gliales contaminantes. Il faut préciser que ces
composés n'ont aucun effet inhibiteur sur le BDV. L'infection des neurones par le BDV est
réalisée en ajoutant du virus préparé à partir de cellules Vero-BDV (Hans et al., 2001).
Réactifs et anticorps
Les réactifs suivants ont été obtenus chez Sigma : 9-ß-D-arabinofuranosyladénine
(ara-A), 1-ß-D-arabinofuranosylcytosine (ara-C), 5-chloro-1-ß-D-arabinofuranosylcytosine
(ara-CCl), 9-ß-D-arabinofuranosylhypoxanthine (ara-H), ß-D-arabinofuranosyluracile (araU) et 2'-fluoro-2'-désoxycytidine (2'-FdC). La gemcitabine est un don des laboratoires LillyFrance, le cyclopentényl-cytosine (CPEC) est un don du National Cancer Institute (USA). La
5'-désoxy-1-ß-D-arabinofuranosylcytosine (5'-désoxy-ara-C) a été synthétisée par S. Pochet
(Laboratoire de chimie organique, Institut Pasteur) (Figure 4). Tous les réactifs sont mis en
- 47 -
solution dans l'eau stérile, à l'exception de l'ara-A et de l'ara-H qui sont dilués dans l'éthanol à
50 %. Les traitements sont réalisés pendant 5 jours, en ajoutant au milieu de culture les
solutions contenant les réactifs concentrés.
Nous avons utilisé les anticorps primaires suivants : les anticorps polyclonaux de
lapin anti-nucléoprotéine (N) et anti-phosphoprotéine (P) du BDV préparés au laboratoire
(Hans et al., 2001), un anticorps monoclonal de souris anti-microtubule-associated protein 2
(MAP-2) (Sigma). Les anticorps secondaires utilisés sont : Immunoglobuline G (IgG) de
chèvre anti-lapin couplée au FITC (Jackson ImmunoResearch), IgG de chèvre anti-souris
couplée au Cy3 (Interchim), IgG de mouton anti-lapin couplée à la peroxydase (Amersham),
IgG de chèvre anti-lapin biotinylée et streptavidine couplée à la R-phycoérythrine (Southern
Biotechnology Associates).
Mesure de la viabilité cellulaire
La viabilité cellulaire suite aux différents traitements est évaluée par la méthode
colorimétrique Uptiblue d'Interchim. Il s'agit d'une réaction d'oxydoréduction d'un composé
de l'Uptiblue se traduisant par un changement de couleur du milieu de culture. Le
changement de couleur est proportionnel à l'activité métabolique des cellules et donc à la
viabilité cellulaire. Après 4 jours de traitement, l'Uptiblue est dilué au dixième dans le milieu
de culture et les cellules sont remises à l'incubateur pendant 10 heures. L'absorbance du
milieu est ensuite mesurée aux longueurs d'onde de 570 nm et 600 nm. La viabilité cellulaire
est calculée en appliquant la formule donnée dans le protocole. Les résultats sont exprimés en
pourcentage de viabilité par rapport aux cellules non traitées.
Immunofluorescence indirecte
Les cellules cultivées sur des lamelles de verre sont fixées pendant 30 minutes dans
de la paraformaldéhyde (PFA) à 4 %. Elles sont ensuite perméabilisées pendant 10 minutes
dans un mélange de méthanol:acétone (1:1). Les cellules sont ensuite lavées dans du tampon
phosphate salin (PBS), puis elles sont incubées dans du PBS contenant 2 % de sérum de
chèvre pendant une heure afin de bloquer les sites antigéniques non spécifiques. Le marquage
est effectué en incubant pendant 1 heure avec l'anticorps anti-N du BDV dilué 1000 fois, puis
après lavage au PBS, pendant 1 heure avec l'anticorps secondaire couplé au FITC dilué 500
fois. Après lavage au PBS, les lamelles sont montées sur lame de verre avec une goutte de
Vectashield (Vector Laboratories) et elles sont observées au microscope.
Le marquage des neurones primaires d'hippocampe est réalisé en utilisant l'anticorps
anti-N du BDV dilué 1000 fois et l'anticorps de souris anti-MAP-2 dilué 800 fois. Les
anticorps secondaires utilisés sont l'anticorps anti-lapin couplé au FITC et l'anticorps antisouris couplé au Cy3, tous deux dilués 500 fois. Les autres étapes du marquage sont les
mêmes que celles qui sont décrites au-dessus.
Évaluation de la dissémination virale par cytométrie de flux
Les cellules Vero (ou ED) sont cultivées jusqu'à 70% de confluence, puis incubées
pendant 45 minutes à 37°C dans du milieu de culture contenant 5 µM de 5-carbofluorescéine
diacétate (CFDA ; Molecular Probes). Le CFDA est un marqueur fluorescent qui pénètre
dans les cellules. Il est transformé par une modification enzymatique en un composé qui ne
- 48 -
peut plus diffuser dans les cellules voisines. Après le marquage, les cellules sont lavées trois
fois avec du milieu sans CFDA. Des cellules Vero-BDV (ou ED-BDV) sont ajoutées aux
cellules Vero (ou ED) marquées, à un rapport de 1:1. Une heure plus tard, on ajoute les
différents agents inhibiteurs à tester dans le milieu de culture. Après 5 jours de traitement, les
cellules sont récoltées par trypsination, puis elles sont fixées pendant 15 minutes dans la PFA
à 4 %. Après la fixation, les cellules sont perméabilisées en incubant deux fois 10 minutes
dans le mélange réactionnel constitué de PBS contenant de la sérum albumine bovine à 1 %
et 0,5 % de saponine, puis pendant 45 minutes dans le mélange réactionnel contenant en plus
7 % de sérum de chèvre afin de bloquer les sites antigéniques non spécifiques. Les cellules
sont incubées pendant 1 heure avec l'anticorps anti-N du BDV dilué 1500 fois dans le
mélange réactionnel. Elles sont ensuite lavées trois fois avec le mélange réactionnel, puis
incubées 1 heure avec l'anticorps anti-lapin biotinylé dilué 100 fois dans le mélange
réactionnel. Les cellules sont lavées trois fois avec le mélange réactionnel, puis incubées 1
heure avec la streptravidine couplée à la R-phycoérythrine diluée 100 fois dans le mélange
réactionnel. Après de nombreux lavages dans le mélange réactionnel, les cellules sont mises
en suspension dans du PBS et analysées avec un cytomètre FACScalibur (Becton Dickinson).
Le taux de dissémination virale est calculé en divisant le nombre de cellules à la fois
marquées par le CFDA et positives en immunomarquage pour la protéine N du BDV par le
nombre total de cellules marquées par le CFDA (Figure 6). Une valeur de 100% est attribuée
aux cellules cocultivées sans aucun traitement. Une valeur de 0 % est attribuée au contrôle
négatif, constitué de cellules Vero (ou ED) et de cellules Vero-BDV (ou ED-BDV) cultivées
séparément et mélangées seulement après fixation.
Extraits protéiques et Western-Blot
Les extraits protéiques sont obtenus par lyse des cellules dans un tampon contenant
10 mM de Tris-HCl pH 6.8, 50 mM de NaCl, 1 % de Triton X-100, 30 mM de Na4P2O7, 50
mM de NaF, 50 mM de ZnCl2, 100 mM de Na3VO4, 1mM de dithiothréitol (DTT) et un
mélange d'inhibiteurs de protéases (Complete, Mini, EDTA-free ; Roche). La concentration
de protéines des différents extraits est mesurée en utilisant la méthode de Bradford. Les
échantillons (4 µg de chaque) sont séparés par électrophorèse en gel de polyacrylamide
dénaturant (10 % Bis-Tris, Novex) et transférés par électrotransfert semi-sec sur membrane
de nitrocellulose (Hybond-C extra ; Amersham). Afin de bloquer les sites non spécifiques, la
membrane est incubée deux fois 10 minutes dans une solution (blotto), contenant 30 mM de
Tris pH 7.5, 100 mM de NaCl, 0.1 % de Tween 20 et 5 % de lait écrémé. La membrane est
ensuite incubée pendant 1 heure avec les anticorps anti-N et anti-P du BDV dilués 20000 fois
dans du blotto. La membrane est lavée trois fois 5 minutes dans du blotto et incubée pendant
1 heure avec l'anticorps anti-lapin couplé à la peroxydase, dilué 1000 fois dans du blotto. La
membrane est lavée trois fois 5 minutes dans du blotto sans lait. L'activité peroxydase est
révélée avec un substrat chimioluminescent de l'enzyme (Super Signal ; Pierce). L'acquisition
et la quantification de la chimioluminescence sont réalisées à l'aide de l'imageur LAS-1000+
(Fuji).
Analyse des ARN par Northern-Blot
Les cellules sont homogénéisées dans une solution contenant du phénol et de
l'isothiocyanate de guanidine (TriReagent ; Molecular Research Center). Les ARN sont
extraits et précipités à l'isopropanol, lavés à l'éthanol 70 % et solubilisés dans de la
- 49 -
formamide. Pour chaque échantillon, 10 µg d'ARN ont ensuite été séparés par électrophorèse
dans un gel d'agarose à 1 % en présence de formaldéhyde 2.2 M. Les ARN sont transférés
par capillarité avec du citrate de sodium salin concentré 20 fois (20x SSC) sur une membrane
de nylon chargée positivement (Magnagraph ; Osmonics) et fixés par exposition aux
ultraviolets. La membrane est ensuite hybridée durant 2 heures 30 minutes dans le tampon
Quikhyb (Stratagene) contenant 20 µg/ml d'ADN de sperme de saumon et la sonde marquée
au [α32P] dCTP. Pour les sondes du BDV de polarité spécifique (génomique ou messager),
on utilise un mélange d'oligonucléotides complémentaires qui sont marqués au [α32P] dCTP
à leur extrémité 3', en utilisant l'enzyme terminale transférase (Roche). L'hybridation et les
lavages se font dans ce cas à une température inférieure de 5 °C au Tm des oligonucléotides.
Pour la sonde GAPDH et la sonde ambisens du BDV, nous disposons au laboratoire des
ADN complémentaires correspondants qui ont été utilisés comme matrices pour des réactions
de marquage au [α32P] dCTP par la technique d'amorçage aléatoire (Prime-it II ; Stratagene).
Les hybridations et les lavages se font ici à 65 °C. Dans tous les cas, les lavages ont été
d'abord effectués à faible stringence (2X SSC, 0.2 % SDS) puis à forte stringence (0.2X SSC,
0.2 % SDS). La quantification des hybridations est réalisée par exposition à l'aide d'un
Phosphorimager. Après chaque hybridation, les sondes radiomarquées sont décrochées en
faisant bouillir la membrane dans deux bains d'une solution contenant de l'EDTA 2 mM, du
Tris 5 mM pH 7.5 et 0.1 % de SDS. Ainsi, la membrane peut être réutilisée.
II. RESULTATS
Méthodologie
Afin d'évaluer l'activité antivirale des différents composés, nous avons utilisé deux
approches permettant d'évaluer et de quantifier de façon rapide leur pouvoir inhibiteur. La
première est la détection par immunofluorescence de la protéine N du BDV. Dans les cellules
infectées de façon persistante, la protéine N est normalement détectée dans le noyau et le
cytoplasme (Figure 5). Lors du traitement par l'ara-C, nous avions observé que l'inhibition
virale se traduisait par une accumulation dans le noyau des constituants de la RNP virale,
dont la protéine N (Bajramovic et al., 2002). Cette accumulation nucléaire semble liée à la
diminution de l'ARN génomique viral induite par le traitement à l'ara-C. Une fois synthétisée,
la protéine N du BDV entre en effet dans le noyau et s'associe à l'ARN génomique pour
former les RNP. Les RNP formées sont ensuite exportées du noyau. Si moins d'ARN
génomique est disponible, moins de RNP sont formées et la N déjà synthétisée reste alors
dans le noyau. Nous pourrons donc apprécier l'effet des différents traitements sur la
répartition intracellulaire de la protéine N grâce à l'immunofluorescence. Cette méthode
permet également d'observer les changements de morphologie et de densité cellulaire liés à la
toxicité des produits employés. La deuxième approche consiste en une quantification de la
dissémination virale de cellule à cellule par une méthode de cytométrie de flux développée au
laboratoire (Figure 6). Le Bornavirus est très étroitement associé aux cellules et l'étude de la
transmission de cellule à cellule est un meilleur indicateur de l'inhibition virale que le titrage
du virus libre. Grâce à ces deux approches, nous avons pu préciser le mécanisme d'action de
l'ara-C.
- 50 -
Figure 5 : Effet des traitements sur la distribution cellulaire de la protéine N du BDV.
- 51 -
A) Mécanisme d’action de l’ara-C sur le BDV
1.
L'effet antiviral est spécifique d'un dérivé arabinose possédant une base cytosine
Nous avons dans un premier temps testé si d'autres analogues nucléosidiques
possédant un cycle arabinose avaient le même effet antiviral que l'ara-C. Nous avons utilisé
l'ara-A, l'ara-U, l'ara-H et l'ara-CCl. L'ara-H possède une base azotée hypoxanthine qui
constitue un intermédiaire dans le métabolisme des bases puriques. L'ara-CCl possède un
atome de chlore sur la base cytosine.
Après 5 jours de traitement, nous avons observé par immunofluorescence que seule
l'ara-C était capable d'entraîner une accumulation de la protéine N au niveau nucléaire. Les
autres analogues n'ont aucun effet sur la répartition intracellulaire de la protéine N du BDV,
même lorsqu'ils sont utilisés à très forte dose (Figure 5 et résultats non montrés). On
remarque cependant que tous les analogues testés à l'exception de l'ara-U, une base qui ne
s'incorpore pas dans l'ADN, ont un effet cytotoxique.
L'analyse de la dissémination virale mesurée par cytométrie donne les mêmes
résultats, c'est-à-dire un effet inhibiteur observé seulement pour l'ara-C (Figures 6 et 7,
Tableau 7).
Tableau 7 : Effet antiviral des dérivés de l’ara-C
Traitement
Dissémination
Non
traité
100 %
ara-C
4 µM
0,3 %
ara-CCl
100 µM
85 %
ara-A
50 µM
115 %
ara-A
100 µM
106 %
ara-H
100 µM
107 %
ara-U
100 µM
104 %
Ici encore, la toxicité des produits utilisés, à l'exception de l'ara-U, se traduit en
cytométrie par une répartition plus hétérogène des cellules en taille et granulosité,
conséquence des altérations morphologiques engendrées par les traitements (Figure 7 et
résultats non montrés).
2.
L'ara-C doit être phosphorylée pour être active contre le BDV
Afin de déterminer si la phosphorylation de l'ara-C est une étape indispensable à son
activité antivirale, nous avons utilisé la 5'-désoxy-ara-C, une molécule d'ara-C modifiée qui
ne porte pas de groupe hydroxyle en 5' et qui ne peut donc pas être phosphorylée (Figure 3).
La 5'-désoxy-ara-C n'a aucun effet sur la répartition intracellulaire de la protéine N du BDV
en immunofluorescence (résultats non montrés). Elle n'a pas d'effet non plus sur la
dissémination virale comme le montrent les résultats de l'analyse par cytométrie (Tableau 8).
Tableau 8 : L'ara-C doit être phosphorylée pour être active contre le BDV
Non traité
Traitement
Dissémination
100 %
ara-C
4 µM
0%
- 52 -
5'-désoxy-ara-C
50 µM
81 %
Figure 6 : Principe de la méthode de quantification de la transmission du BDV de cellule à
cellule.
Figure 7 : Mesure par cytométrie en flux de l’effet des traitements sur la dissémination
virale.
- 53 -
3.
L'effet antiviral de l'ara-C n'est pas lié à une modification des concentrations
intracellulaires de nucléotides
L'ara-C interfère avec les voies de phosphorylation des bases pyrimidiques et entraîne
un déséquilibre dans le contenu intracellulaire de nucléotides (Figure 3) (Grant, 1998).
L'effet antiviral de l'ara-C sur le BDV pourrait donc simplement être une conséquence de la
diminution de la concentration intracellulaire en CTP. L'effet antiviral causé par la baisse de
la concentration intracellulaire en CTP a déjà été décrit pour de nombreux virus (De Clercq
et al., 1991). Afin de tester cette hypothèse, nous avons utilisé le CPEC, un analogue de la
cytidine, qui provoque une baisse de la concentration en CTP par inhibition de la CTP
synthase (Figures 3 et 4). En immunofluorescence, nous avons observé que le CPEC n'avait
pas d'effet sur la répartition intracellulaire de la protéine N quelle que soit la dose utilisée et
qu'il entraînait dès la dose de 0,5 µM une toxicité cellulaire très importante (résultats non
montrés) indiquant que son manque d’effet antiviral n’est pas lié à un défaut d’entré dans la
cellule. L'étude de la dissémination virale par cytométrie montre que le CPEC possède un
léger effet inhibiteur (Tableau 9). Cet effet semble non spécifique, car il n'est pas dose
dépendant et reste nettement inférieur à celui de l'ara-C.
Tableau 9 : L'effet antiviral de l'ara-C n'est pas lié à une modification des concentrations
intracellulaires de nucléotides
Non traité
Traitement
Dissémination
100 %
ara-C
4 µM
0%
CPEC
0,5 µM
23 %
CPEC
10 µM
20 %
CPEC
20 µM
21 %
L'inhibition du BDV par l'ara-C ne peut donc pas être seulement attribuée à un effet
indirect sur la baisse de la concentration intracellulaire en CTP.
4.
L'effet antiviral de l'ara-C est réversé par un excès de nucléosides non modifiés
Afin de tester si l'effet antiviral de l'ara-C pouvait être compensé par compétition avec
la cytidine (C), nous avons traité les cellules simultanément avec l'ara-C et un excès de C.
Nous avons observé que ceci conduisait à une distribution normale de la protéine N, même
en présence d'ara-C. Cependant, les effets toxiques de l'ara-C sur les cellules étaient encore
visibles (résultats non montrés). L'analyse en cytométrie révèle que l'ajout de C avec l'ara-C
restaure partiellement la dissémination du virus (Tableau 10).
Tableau 10 : L'effet antiviral de l'ara-C est réversé par un excès de nucléosides non modifiés
Traitement
Dissémination
Toxicité
Non traité
ara-C 4 µM
100 %
-
6,8 %
++
ara-C 4 µM
C 20 µM
52 %
++
ara-C 4 µM
dC 20 µM
99 %
-
Dans la cellule, le CDP peut être réduit en dCDP par la ribodinucléotide diphosphate
réductase (Figure 3). La C ajoutée en excès pourrait donc conduire à la formation de dCDP.
Pour s'assurer que la réversion observée est bien liée à la C, nous avons inhibé la
ribodinucléotide diphosphate réductase en traitant les cellules avec 10 µM d'hydroxyurée
(Figure 3) (Bhalla et al., 1991). Ceci n'a aucun effet sur la réversion observée avec la C seule
- 54 -
(résultats non montrés). En outre, l'ara-C conserve sa toxicité, preuve de sa présence sous
forme triphosphorylée dans la cellule. La C est donc capable d'inhiber spécifiquement l'effet
antiviral de l'ara-C et cette inhibition a probablement lieu au niveau de la polymérase virale
par compétition entre l'ara-CTP et le CTP.
Enfin, le traitement simultané par l'ara-C et la désoxycytidine (dC) entraîne une
inhibition à la fois de l'effet antiviral de l'ara-C et de son effet toxique sur la cellule (Tableau
10). L'absence de toxicité cellulaire indique que l'ara-C n'est plus présente sous forme
triphosphorylée. Il semble donc que l'excès de dC conduit à un défaut de phosphorylation de
l'ara-C.
- 55 -
B) Recherche d’analogues nucléosidiques actifs contre le virus mais moins toxiques
L’ara-C exerce un effet antiviral certain contre le BDV, mais la toxicité de cet
analogue rend difficile son utilisation pratique comme traitement des infections par le
Bornavirus. Nous avons donc recherché d’autres analogues nucléosidiques possédant les
mêmes propriétés antivirales, mais une cytotoxicité réduite.
1.
Candidats
Les résultats précédents ont permis de définir quel type de molécule pourrait
présenter une activité antivirale contre le BDV. Nous avons recherché un analogue de la
cytidine (C) présentant une homologie de structure avec l'ara-C, en particulier une
modification à la position carbone 2’ du cycle pentose. Parmi les différents candidats
envisagés, deux molécules répondaient à ces critères : le 2'-fluoro-2'-désoxycytidine (2'-FdC)
et la gemcitabine. Tout comme l'ara-C, ces deux molécules présentent uniquement des
modifications au niveau du carbone 2' sur le sucre pentose (Figure 3). Pour être actif,
l'analogue doit également être phosphorylé de façon efficace dans la cellule. Le 2'-FdC et la
gemcitabine ont une très grande affinité pour la dCk et ils sont phosphorylés de manière plus
efficace encore que l'ara-C (Kierdaszuk et al., 1999; Shewach et al., 1992). Enfin, nous
souhaitions disposer d'un composé moins toxique que l'ara-C. Malheureusement, la
gemcitabine est très toxique pour les cellules en division. En revanche, le 2'-FdC ne semble
pas avoir de toxicité cellulaire démontrée. Le candidat retenu est donc le 2'-FdC. Nous avons
cependant testé en parallèle l'effet antiviral de ces deux molécules et nous avons comparé
leur activité à celle de l'ara-C.
2.
Le 2'-FdC entraîne une rétention nucléaire des RNP virales
Nous avons dans un premier temps étudié l'effet du 2'-FdC sur la localisation
intracellulaire de la protéine N du BDV par immunofluorescence. Dans ce cas, nous avons
utilisé non seulement les cellules Vero-BDV, mais aussi les cellules dermiques équines ED et
les cellules U373, cellules dérivées d'un astrocytome humain, toutes deux infectées de façon
persistante par le BDV (ED-BDV et U373-BDV) (Figure 8). De façon surprenante, l'ara-C
semble moins efficace dans les cellules ED et U373 que dans les cellules Vero. Le traitement
quotidien par 5 µM d'ara-C n'entraîne qu'une relocalisation nucléaire très modérée de la
protéine N dans les cellules ED-BDV et U373-BDV comparée à celle obtenue dans les
cellules Vero-BDV. La toxicité cellulaire suite au traitement avec l'ara-C est quant à elle bien
visible dans les trois types cellulaires, indiquant que l’ara-C pénètre bien dans ces cellules et
est correctement phosphorylée. En revanche, le traitement des cellules pendant 5 jours avec
le 2'-FdC entraîne une nette accumulation nucléaire de la protéine N dès la dose de 5 µM,
aussi bien dans les cellules Vero-BDV que dans les cellules ED-BDV et U373-BDV. On
remarque d'autre part que la morphologie et la densité cellulaire sont peu altérées. Enfin, le
traitement à la gemcitabine est sans effet sur la localisation intracellulaire de la protéine N du
BDV et il entraîne une toxicité cellulaire très importante dès la dose de 0,25 µM.
- 56 -
Figure 8 : Etude comparative de l’effet des traitements par l’ara-C, le 2‘-FdC et la
gemcitabine sur la distribution cellulaire de la protéine N du BDV.
- 57 -
3.
Le 2'-FdC inhibe la transmission virale de cellule à cellule
Nous avons ensuite mesuré l'effet des différents traitements sur la dissémination
virale par l'analyse en cytométrie dans les cellules Vero (Tableau 11) puis dans les cellules
ED (Tableau 12).
Tableau 11 : Analyse de la dissémination virale dans les cellules Vero
Traitement
Dissémination
Non
traité
100 %
2'-FdC
ara-C
Gemcitabine
4 µM
1 µM
5 µM
10 µM
20 µM
0,5 µM
2 µM
20 µM
0%
19 %
4,9 %
5,7 %
2,3 %
189 %
95 %
42 %
Tableau 12 : Analyse de la dissémination virale dans les cellules ED
Traitement
Dissémination
ara-C
Non
traité
4 µM 20 µM
100 % 102 % 31 %
2'-FdC
Gemcitabine
5 µM
10 µM
20 µM
0,05 µM
2 µM
20 µM
43 %
15 %
6,2 %
98 %
66 %
102 %
Cette analyse confirme les résultats obtenus en immunofluorescence. Ici encore, l'araC semble moins active dans les cellules ED et il faut utiliser une concentration de 20 µM
pour observer un effet inhibiteur clair. Le 2'-FdC possède quant à lui un fort pouvoir
inhibiteur de la dissémination virale dans les deux types cellulaires et son efficacité est dose
dépendante. Enfin, les résultats obtenus avec la gemcitabine sont inconstants, mais quelle que
soit la dose utilisée, la dissémination virale reste supérieure à 42 %. La gemcitabine a donc
un effet limité sur la dissémination virale.
4.
Le 2'-FdC limite l'infection des neurones primaires d'hippocampe
Le BDV est très majoritairement neurotrope in vivo et il infecte et persiste dans
les neurones du système limbique (Ludwig and Bode, 2000). Nous avons donc testé l'effet du
2'-FdC sur l'infection de cultures primaires de neurones d'hippocampe. Les neurones ont été
infectés à une faible multiplicité d'infection deux jours après avoir été mis en culture. Comme
les neurones primaires sont fragiles, nous avons traité les neurones une seule fois à un jour
post-infection avec des doses d'analogues n'entraînant pas de mort neuronale en culture : 2
µM d'ara-C et 5 µM de 2'-FdC. Les neurones sont fixés 7 jours après infection et ils sont
analysés par immunofluorescence en utilisant l'anticorps anti-N du BDV et l'anticorps antiMAP-2, un marqueur des neurones (Figure 9). Cette analyse révèle que environ 90 % des
neurones non traités sont infectés par le BDV. Dans les cultures traitées avec le 2'-FdC et
l'ara-C, seuls quelques neurones sont marqués par l'anticorps dirigé contre la protéine N du
BDV. L'inhibition du virus obtenue dans les neurones primaires d'hippocampe traités avec le
2'-FdC est aussi efficace qu'avec l'ara-C.
- 58 -
Figure 9 : Effet du traitement par le 2'-FdC et l'ara-C sur l'infection de neurones primaires
d'hippocampe de rat.
- 59 -
5.
Le 2'-FdC inhibe la production d'ARN et des protéines du BDV
Nous avons ensuite étudié l'effet du 2'-FdC sur la synthèse des ARN viraux en analysant par
Northern-Blot l'ARN total extrait de cellules Vero-BDV traitées pendant 5 jours (Figure 10).
L'hybridation réalisée avec la sonde ambisens révèle une baisse de la totalité des ARN viraux
lors du traitement avec l'ara-C et avec le 2'-FdC. Nous avons utilisé des sondes de polarité
spécifique afin de déterminer si l'inhibition s'exerçait spécifiquement sur la réplication (sonde
spécifique de l'ARN génomique) ou sur la transcription (sonde spécifique des ARN
messagers) du virus. Le traitement avec le 2'-FdC et avec l'ara-C entraîne une baisse
importante à la fois de l'ARN génomique et des ARN messagers. En revanche, les autres
composés testés n'ont pas d'effet inhibiteur sur le virus. Le traitement au CPEC conduit par
exemple à des résultats aberrants probablement liés à sa toxicité : on observe à la fois une
baisse de l'ARN messager de 1,9 kb et une augmentation de l'ARN génomique.
L'analyse par Western-Blot révèle que l'expression des protéines virales N et P est
également très fortement diminuée par le traitement avec le 2'-FdC (Figure 11). Le traitement
avec 4 µM de 2'-FdC ou avec 4 µM d'ara-C entraîne une inhibition d'environ 90 % de la
synthèse de ces protéines. Les autres composés sont inactifs et l'on observe même une
augmentation de l'expression de la N après traitement au CPEC. Cette augmentation est non
spécifique et provient probablement de la forte toxicité cellulaire du CPEC.
- 60 -
Figure 10 : Inhibition de la synthèse des ARN viraux par le 2'-FdC.
Figure 11 : Inhibition de la synthèse des protéines virales par le 2'-FdC.
- 61 -
6.
Mesure de la toxicité cellulaire des différents composés
Jusqu'à présent, les données concernant la toxicité cellulaire des différents
composés provenaient de l'analyse de la morphologie et de la densité des cellules après
traitement. Afin de comparer la toxicité de l'ara-C à celle du 2'-FdC de façon plus précise,
nous avons tout d'abord évalué l'effet des traitements sur la croissance cellulaire. Des cellules
Vero ont été cultivées pendant 5 jours en présence de doses d'ara-C et de 2'-FdC inhibant de
façon très efficace le virus (ara-C à 5 µM ; 2'-FdC à 5 µM et 10 µM). Comme contrôle, nous
avons également traité les cellules avec 20 µM de CPEC et 20 µM de gemcitabine. Les
cellules sont ensuite récoltées et comptées (Figure 12A). Les résultats montrent que l'ara-C
inhibe 95 % de la croissance cellulaire, inhibition également trouvée avec le CPEC et la
gemcitabine. En revanche, le 2'-FdC exerce une plus faible inhibition de la croissance
cellulaire : 30 % pour le 2'-FdC utilisé à 5 µM et 50 % pour le 2'-FdC utilisé à 10 µM. Nous
avons ensuite mesuré de façon indirecte la viabilité cellulaire par la méthode Uptiblue
(Figure 12B). Nous avons observé que la viabilité cellulaire était diminuée de plus de 50 %
dès la dose de 0,8 µM d'ara-C. En revanche quelle que soit la dose de 2'-FdC utilisée, la
viabilité cellulaire est supérieure à 84 %.
Figure 12 : Mesure de la toxicité des analogues nucléosidiques utilisés.
- 62 -
III. DISCUSSION
La première partie de ce travail a consisté à préciser le mécanisme d'action antiviral de
l'ara-C sur le BDV. Les résultats récents du laboratoire indiquaient qu'il n'était pas la
conséquence de certains effets connus de l'ara-C sur la cellule hôte (Bajramovic et al., 2002).
D'autres inhibiteurs des ADN polymérases α et ß, ou de la topoisomérase I, étaient par
exemple sans effet sur le BDV (Bajramovic et al., 2002). L'effet antimitotique de l'ara-C n'est
pas non plus responsable de l'inhibition virale. Il semble au contraire que l'arrêt de la division
cellulaire provoqué par des antimitotiques conventionnels ou la privation de sérum conduise
à une activation de la réplication virale (Mizutani et al., 1999). Confirmant cette hypothèse,
nous avons observé que le traitement avec l'ara-A conduisait à une augmentation de la
dissémination virale (Tableau 7). Dans ce travail, nous avons montré que l'activité antivirale
de l'ara-C est spécifique d'un dérivé arabinose portant une base cytosine (Tableau 7) et que
l'ara-C doit être phosphorylée pour être active contre le virus (Tableau 8). D'après ces
résultats, deux hypothèses peuvent être avancées pour expliquer l'effet antiviral de l'ara-C.
Premièrement, la phosphorylation de l'ara-C pourrait agir indirectement sur le virus par le
biais d'une déplétion du CTP intracellulaire. Nous avons écarté cette hypothèse en montrant
que le CPEC, un inhibiteur de la CTP synthase, n'inhibait pas le BDV (Tableau 9).
Deuxièmement, puisque aucun des effets connus de l'ara-C sur la cellule ne peut expliquer
son pouvoir antiviral, on peut donc postuler que cette molécule agit directement sur la
polymérase virale. Comme il est possible de réverser spécifiquement l'effet antiviral de l'araC par un excès de cytidine (Tableau 10), notre hypothèse est donc que l'ara-C se comporte
comme un inhibiteur compétitif de la polymérase L du BDV. Il faut préciser que les résultats
de réversion obtenus en présence d'un excès de dC doivent être interprétés différemment car
l'ara-C perd à la fois son effet antiviral et son effet toxique. La dC fournie en excès étant
préférentiellement phosphorylée par la dCk, la dCTP produite exerce un rétrocontrôle négatif
sur la dCk qui empêche la phosphorylation de l'ara-C (Galmarini et al., 2001). Afin de
confirmer que l'ara-C agit directement sur la polymérase L du BDV, nous envisageons
maintenant d'utiliser une ara-C marquée portant un groupement réactif (synthétisée par le
laboratoire de chimie organique de l'Institut Pasteur) qui pourrait former un couplage
covalent avec la protéine L. Nous pourrions ensuite isoler les complexes RNP des cellules
infectées afin de démontrer la liaison de ce composé sur la protéine L.
Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons recherché d'autres analogues inhibant le
BDV mais possédant une toxicité réduite. Le 2'-FdC semblait être un bon candidat de par son
homologie de structure avec l'ara-C (Figure 3). Nous avons montré par immunofluorescence
et par analyse de la dissémination virale que le 2'-FdC inhibait le BDV (Figure 8 et Tableaux
5 et 6). Comme l'ara-C, il exerce une inhibition de la synthèse des protéines et des ARN du
virus (Figures 10 et 11). De plus, les expériences réalisées dans des types cellulaires variés
montrent que le 2'-FdC est plus efficace que l'ara-C dans les cellules ED et U373. Ceci
pourrait s'expliquer par la plus grande affinité du 2'-FdC pour la dCk entraînant une meilleure
phosphorylation dans les cellules possédant un taux plus faible de dCk (Kierdaszuk et al.,
1999). Dans la suite de ce travail, nous envisageons de tester si l'action antivirale du 2'-FdC
est spécifique du BDV. Les études réalisées précédemment avec l'ara-C indiquaient que son
action antivirale ne s'appliquait pas à des virus proches du BDV, comme les virus de la
grippe et de la rougeole. Cependant, le spectre d'activité du 2'-FdC pourrait être plus large,
car il possède une forte homologie structurale avec la 2'-fluoro-2'-désoxyguanosine, un
analogue nucléosidique actif contre le virus de la grippe (Tisdale et al., 1995). Finalement,
nous avons également montré que le 2'-FdC a une toxicité réduite par rapport à l'ara-C. Le 2'FdC est donc un antiviral prometteur pour le traitement de la maladie de Borna d'autant plus
- 63 -
qu'actuellement aucune prophylaxie vaccinale et aucun traitement efficace ne sont
disponibles.
- 64 -
CONCLUSION
Le BDV est un virus à ARN de polarité négative non segmenté qui appartient à l'ordre
des Mononegavirales. A la différence des autres virus de cet ordre, les étapes de réplication
et de transcription du génome du BDV ont lieu dans le noyau de la cellule infectée. Cette
particularité a conduit à la classification du BDV dans la nouvelle famille virale des
Bornaviridae. Le BDV possède un neurotropisme très fort et il est capable d'infecter un très
grand nombre d'espèces de mammifères, dont l'homme. Cependant les hôtes principaux du
BDV sont les chevaux et les moutons. L'infection par le BDV se traduit par une atteinte
neurologique, la maladie de Borna, qui peut prendre plusieurs formes. La forme classique de
la maladie de Borna correspond à une méningoencéphalite, le plus souvent mortelle.
L'infection par le BDV peut également se traduire par des symptômes plus discrets, comme
des modifications comportementales, ou elle peut être totalement asymptomatique.
Actuellement il n'existe aucune prophylaxie et aucun traitement efficace contre le
BDV. La ribavirine a été décrite comme inhibant le BDV, mais son pouvoir antiviral est
faible. Des travaux récents du laboratoire ont permis d'identifier un analogue nucléosidique,
l'ara-C, qui possède quant à lui un très fort pouvoir antiviral contre le BDV. Cet analogue
nucléosidique était jusque là décrit comme agissant uniquement sur les synthèses d'ADN,
c'est pourquoi nous avons entrepris de décrire le mécansime d'action de l'ara-C sur le BDV,
un virus à ARN.
L'effet antiviral est spécifiquement lié à la base cytosine portée par le groupement
arabinose. En effet, aucun autre dérivé arabinose n'est capable d'inhiber le virus alors que
certains analogues possédant un cycle arabinose, comme l'ara-A, possèdent un effet
cytotoxique, preuve que leur absence d'effet antiviral n'est pas due à un défaut d'entrée dans
la cellule ou à un défaut de métabolisation. Grâce à l'utilisation de la 5'-désoxy-ara-C, un
dérivé de l'ara-C qui ne peut pas être phosphorylé, nous avons pu montré que l'ara-C doit être
phosphorylée dans le cellule pour être active contre le virus. La phosphorylation de l'ara-C
pourrait, par compétition avec les kinases cellulaires, entraîner un déséquilibre dans le
contenu intracellulaire de nucléotides et notamment provoquer un défaut de CTP qui
inhiberait de façon indirecte la réplication virale. Cependant le CPEC, un inhibiteur de la
CTP synthase qui provoque une baisse de la concentration intracellulaire en CTP, ne possède
aucun effet sur la réplication virale. L'ara-C semble donc agir directement sur le virus. L'effet
antiviral de l'ara-C peut par ailleurs être aboli par l'ajout simultané d'un excès de cytidine.
L'ara-C entre donc en compétition avec la cytidine pour inhiber le virus. L'ensemble de ces
résultats indique que l'ara-C agit sous forme phosphorylée, probablement sous forme d'araCTP, et que l'ara-CTP entrerait en compétition avec la CTP directement au niveau d'une cible
virale. Bien que nous ne disposions pas à l'heure actuelle de données expérimentales
permettant de l'affirmer, la cible privilégiée de cet analogue nucléosidique semble être la
polymérase virale L. L'ara-C est un analogue décrit jusqu'ici comme agissant uniquement sur
les synthèses d'ADN, mais pourtant il inhibe le BDV, un virus à ARN. L'étude comparative
de la séquence en acides aminés de la polymérase L du BDV et d'autres Mononegavirales a
révélé que celle du BDV possédait une résidu spécifique au niveau d'un des sites catalytiques
de la polymérase impliqué dans la sélection des nucléotides et normalement très conservé au
sein de cet ordre viral. Nous tenterons de déterminer si cette mutation permet d'expliquer la
sensibilité particulière du BDV à l'ara-C.
Les résultats précédents permettent de mieux comprendre comment l'ara-C exerce son
effet antiviral. Ce travail était nécessaire pour la recherche de nouveaux candidats antiviraux
possédant un mode d'action analogue à l'ara-C mais une toxicité plus faible, compatible avec
l'utilisation en thérapeutique de la molécule. Nous avons recherché des analogues de la
- 65 -
cytidine ayant une structure proche de l'ara-C et la capacité d'être très efficacement
phosphorylés dans la cellule. Il était également important de sélectionner uniquement des
analogues nucléosidiques à faible toxicité cellulaire. Nous avons ainsi identifié le 2'-FdC, un
analogue nucléosidique de structure proche de celle de l'ara-C et qui est décrit comme un très
bon substrat de la dCk. Le 2'-FdC inhibe le virus dès la dose de 5µM dans les trois types de
lignées cellulaires testées, comme en témoigne la relocalisation nucléaire de la protéine N
détectée par immunofluorescence. Les expériences de quantification de la dissémination
virale par cytométrie de flux ont confirmé que le 2'-FdC possède un fort pouvoir inhibiteur et
que son effet est dose dépendant. Utilisé à la dose de 1µM, il inhibe 81% de la dissémination
virale dans les cellules Vero, alors qu'il inhibe la dissémination virale à 95% lorsqu'il est
utilisé à la dose de 5µM. Dans les cellules ED il faut utiliser le 2'-FdC à la dose de 10µM
pour obtenir 85% d'inhibition de la dissémination virale, mais il faut noter que dans ce type
cellulaire le 2'-FdC semble plus efficace que l'ara-C. Nous avons également montré que le 2'FdC bloque la dissémination virale dans des cultures de neurones primaires d'hippocampe.
L'effet antiviral du 2'-FdC se traduit par une inhibition des synthèses des ARN et des
protéines du BDV. Le 2'-FdC semble donc être une molécule prometteuse pour le traitement
de l'infection par le BDV, d'autant plus que sa toxicité cellulaire est très réduite par rapport à
celle de l'ara-C. L'étape suivante de ce travail consistera à compléter ces études in vitro par
une évaluation de l'efficacité du 2'-FdC dans le modèle du rat, à la fois en traitement
prophylactique et curatif du BDV.
- 66 -
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ÉCOLE NATIONALE VETERINAIRE D’ALFORT
CHIMIOTHERAPIE ANTIVIRALE CONTRE LE BORNAVIRUS
VOLMER Romain
Résumé :
Le virus de Borna ou Bornavirus (BDV) est un virus à ARN négatif non segmenté
responsable d’infections du système nerveux central chez un très grand nombre d’espèces de
mammifères. C’est un pathogène reconnu en médecine vétérinaire, notamment chez les équins
et ovins. Aucun traitement efficace n’est disponible actuellement. Des travaux récents ont
permis de montrer le fort pouvoir antiviral de la 1-ß-D-arabinofuranosylcytosine (ara-C)
contre le Bornavirus. Ces résultats sont inattendus car l’effet inhibiteur de l’ara-C ne s’exerce
habituellement que sur les polymérases à ADN. L’effet antiviral de l’ara-C sur le BDV
constitue la première description de l’effet inhibiteur de l’ara-C sur un virus à ARN.
Au cours de ce travail, j’ai tout d’abord cherché à préciser le mécanisme d’action antiviral de
l’ara-C sur le BDV. Les résultats obtenus montre que l’effet antiviral est spécifique de l’ara-C
car d’autres dérivés arabinose n’ont pas d’effet sur le BDV. L’ara-C agit sous forme
phosphorylée et entre en compétition avec la cytidine triphosphate. L’ensemble de ces
données suggère que l’ara-C agit directement sur la polymérase virale par compétition avec la
cytidine.
La toxicité cellulaire élevée de l’ara-C est un obstacle pour son utilisation thérapeutique.
Parallèlement à ce travail, nous avons recherché si d’autres analogues nucléosidiques moins
toxiques possédaient un pouvoir antiviral équivalent sur le BDV. Nous avons ainsi identifié la
2’-fluoro-2’-désoxycytidine (2’-FdC) qui inhibe le virus de façon efficace, mais qui possède
une toxicité cellulaire réduite. Le 2’-FdC est donc un candidat intéressant pour le
développement d’une chimiothérapie contre le Bornavirus.
Mots clés : virus de Borna, Mononegavirales, antiviraux, polymérase, chimiothérapie ara-C,
2’-fluoro-2’-désoxycytidine
Jury :
Président : Pr.
Directeur : Pr. ELOIT Marc
Assesseur : Pr. BOULOUIS Henri-Jean
Adresse de l’auteur : 43 rue des fontaines
Appartement A44
31300 Toulouse
ÉCOLE NATIONALE VETERINAIRE D’ALFORT
ANTIVIRAL CHEMOTHERAPY AGAINST BORNAVIRUS
VOLMER Romain
Summary :
Borna Disease Virus (BDV) is a nonsegmented, negative-stranded RNA virus that causes
neurological diseases in a variety of warm-blooded animal species. It is a recognized
pathogen in veterinary medicine, mainly in sheep and horses. Recently, we showed that the
nucleoside analog 1-ß-D-arabinofuranosylcytosine (ara-C) was a potent inhibitor of BDV.
This finding was surprising for an RNA virus, since ara-C is a DNA polymerase inhibitor.
The antiviral effect of ara-C on BDV is the first description of the inhibitory effect of ara-C
on an RNA virus.
Thus, I sought to better define the mechanism of action of ara-C on BDV. Here, I show that
this effect is specific for an arabinoside ring carrying a cytosine base, it requires
phosphorylation of the nucleotide, and it can be reversed by an excess of cytidine. These data
provide evidence suggesting that ara-C may act as a competitive inhibitor of the BDV
replication complex.
However, ara-C's cytotoxic side effects are a major obstacle for its therapeutic use. Therefore
we sought to identify other less toxic nucleoside analogs that still exhibited a potent antiviral
effect against BDV. Herein, we demonstrate that the nucleoside analog 2'-fluoro-2'deoxycytidine (2'-FdC) exhibits potent antiviral activity against BDV. Importantly, 2'-FdCassociated cytotoxicity is negligible, indicating 2'-FdC as an excellent candidate for the
development of antiviral therapy against BDV.
Keywords : Borna Disease Virus, Mononegavirales, antiviral, polymerase, chemotherapy,
ara-C, 2’-fluoro-2’-deoxycytidine
Jury :
President : Pr.
Director : Pr. ELOIT Marc
Assessor : Pr. BOULOUIS Henri-Jean
Author’s address:
43 rue des fontaines
Appartement A44
31300 Toulouse
FRANCE
VOLMER R.
CHIMIOTHERAPIE ANTIVIRALE CONTRE LE BORNAVIRUS
2005