l` antibiogramme
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BURNICHON Nelly TEXIER Anthony DES bactériologie – Semestre été 2003 Exposé du 20 juin 2003 L’ ANTIBIOGRAMME : LA DETERMINATION DES SENSIBILITES AUX ANTIBIOTIQUES L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 1 sur 29 Sommaire I. Introduction II. Bactériostase II.1 Définition II.2 Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) II.3 Détermination de la CMI III. Notion de Sensibilité/Résistance III.1 Définition de la résistance III.2 Détermination des catégories S/I/R III.3 Etablissement des valeurs critiques délimitant les catégories cliniques III.4 Relation avec la CMI IV. Notion de spectre V. Méthodes d’études in vitro V.1 Antibiogramme V.1.1 Principe V.1.2 Techniques classiques V.1.3 Standardisation V.1.4 Résultats V.1.5 Autres techniques V.1.6 Limites de l’antibiogramme V.2 Autres méthodes V.2.1 Recherche des bêta-lactamases V.2.2 Recherche de la méticillino-résistance chez les staphylocoques V.2.3 Recherche des bêta-lactamases à spectre étendu (BLSE) V.2.4 Apport de la biologie moléculaire VI. Cas particulier de l’antibiogramme automatisé VII. Conclusion Annexe : Epreuves de synergie L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 2 sur 29 L’antibiogramme : La détermination des sensibilités aux antibiotiques I. Introduction Le but de la réalisation d’un antibiogramme est de prédire la sensibilité d’un germe à un ou plusieurs antibiotiques dans une optique essentiellement thérapeutique. Il sert également : - À la surveillance épidémiologique de la résistance bactérienne ; - À l’identification bactérienne par la mise en évidence de résistances naturelles. Sa réalisation est laissée à l’initiative du biologiste. Il doit être pratiqué en raison de la qualité, de la densité de l’espèce ou des espèces isolées, soit de l’état clinique du patient ou du siège de l’infection sur les espèces susceptibles d’engendrer un processus infectieux (arrêté du 30 juillet 1997-J.0. du 12 août 1997 fixant la nomenclature des actes de biologie médicale). Il faut garder à l’esprit qu’en pratique, on étudie l’effet des antibiotiques in vitro le plus souvent et dans des conditions normalisées de culture. Ainsi, il faut déterminer des corrélations afin de présumer de l’efficacité in vivo de l’antibiotique et donc de la réussite (ou de l’échec) du traitement sur la base de données biologiques in vitro. II. Bactériostase II.1 Définition La bactériostase correspond à un ralentissement de la croissance d’une population bactérienne, pouvant aller jusqu'à l'arrêt de la croissance. Ceci ne vaut que si la bactérie était en phase de croissance avant le contact. Dans le cas contraire une absence de développement peut aussi correspondre à une augmentation très prononcée du temps de latence. La bactériostase peut être étudiée en milieu liquide par exemple par un suivi photométrique de la croissance des microorganismes en présence de concentrations variées d'antibiotiques. II.2 Concentration Minimale Inhibitrice = CMI Le paramètre le plus souvent utilisé pour évaluer l’effet d’un antibiotique est la CMI. Elle correspond à la concentration minimale d’antibiotique qui inhibe la croissance visible du germe en 24H. La CMI explore donc l’effet bactériostatique seulement, ce qui n’est pas limitatif sachant qu’en bactériologie clinique, le but le plus souvent recherché est l’inhibition de la prolifération bactérienne, dans la mesure où l’organisme est capable de se défendre contre les bactéries (notons que son emploi n’est pas justifié chez un malade immunodéprimé). On note de bonnes corrélations biologico-cliniques de l'emploi de la CMI, qui, après plusieurs dizaines d'années d'expérience s’avère être un bon prédicateur de l'efficacité de la thérapeutique antibiotique : Quand elle excède une certaine valeur l'échec thérapeutique est habituel : quand elle est inférieure à une autre valeur le succès est pratiquement assuré. Entre les deux valeurs précédentes, la prédiction est impossible. L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 3 sur 29 II.3 Détermination de la CMI La CMI n'est pas, pour une bactérie donnée, une constante biologique. Elle est définie par le Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CA-SFM) comme étant la plus faible concentration d’une gamme de dilutions d’antibiotique de demi en demi qui entraîne l’inhibition de toute croissance bactérienne visible. La méthode par dilution successive en milieu solide est la méthode de référence pour déterminer la sensibilité bactérienne aux antibiotiques. Cette détermination exige une standardisation rigoureuse du protocole expérimental (influence de l'inoculum, du délai séparant ensemencement et observation, milieu de culture), toute modification des conditions expérimentales rendant l’interprétation difficile. D’autres méthodes sont applicables : dilutions successives en milieu liquide (croissance bactérienne appréciée par l’apparition d’un trouble) ; E-Test (bandelettes imprégnées d’un gradient d’antibiotique). III. Notion de Sensibilité / Résistance III.1 Définition de la résistance La résistance des bactéries aux antibiotiques est soit naturelle, soit acquise. La résistance naturelle d’une espèce ou d’un genre est : - Une caractéristique propre, concernant l’ensemble des souches de l’espèce ou du genre ; - Portée par un chromosome donc toujours transmissible à la descendance : transmission verticale ; - Un caractère permettant de définir le phénotype sauvage ou sensible de l’espèce ; - Une aide à l’identification d’une espèce. La résistance acquise, pour sa part : - Ne concerne qu’une proportion plus ou moins importante, variable dans le temps, de souches d’une espèce ; - Résulte d’une modification génétique par mutation ou par acquisition de plasmides ou transposons, (résistance extra chromosomique) transmissible horizontalement, parfois entre espèces différentes ; - Définit des phénotypes « résistants ». Les résistances croisées s’expriment, elles, au sein d’une même classe d’antibiotiques et sont dues au même mécanisme de résistance. III.2 Détermination des catégories S/I/R A la suite des recommandations du Comité d'Experts de Standardisation biologique de l'OMS (1979), la Société Française de Microbiologie a créé un Comité de l'Antibiogramme (CA-SFM) chargé de déterminer les valeurs critiques qui délimitent les catégories cliniques et de proposer un guide pour la détermination de la sensibilité des bactéries aux antibiotiques. Les valeurs critiques définies pour les concentrations et les diamètres des zones d'inhibition, ainsi que les recommandations spécifiques à certaines espèces ou à certains groupes d'antibiotiques sont publiées dans un communiqué annuel par le CA-SFM. L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 4 sur 29 Trois catégories cliniques ont été retenues pour l'interprétation des tests de sensibilité in vitro : Sensible (S), Résistant (R) et Intermédiaire (I). • Les souches catégorisées S sont celles pour lesquelles la probabilité de succès thérapeutique est forte dans le cas d'un traitement par voie systémique avec la posologie recommandée dans le résumé des caractéristiques du produit (RCP). • Les souches catégorisées R sont celles pour lesquelles il existe une forte probabilité d'échec thérapeutique quels que soient le type de traitement et la dose d'antibiotique utilisée. Les souches catégorisées I sont celles pour lesquelles le succès thérapeutique est imprévisible. Ces souches forment un ensemble hétérogène pour lequel les résultats obtenus in vitro ne sont pas prédictifs d'un succès thérapeutique. • En effet, ces souches : - Peuvent présenter un mécanisme de résistance dont l'expression in vitro est faible, avec pour conséquence leur classement dans la catégorie S. Cependant, in vivo, une partie de ces souches apparaît résistante au traitement ; - Peuvent présenter un mécanisme de résistance dont l'expression n'est pas suffisante pour justifier un classement dans la catégorie R, mais suffisante pour favoriser l'apparition d'une résistance in vivo en cours de traitement ; - Peuvent présenter un mécanisme de résistance dont l'expression n'est pas suffisante pour justifier un classement dans la catégorie R, mais suffisamment faible pour espérer un effet thérapeutique dans certaines conditions (fortes concentrations locales ou posologies accrues) ; la catégorie intermédiaire est aussi une zone tampon qui tient compte des incertitudes techniques et biologiques. III.3 Etablissement des valeurs critiques délimitant les catégories cliniques Les concentrations critiques des antibiotiques sont établies sur la base des concentrations sériques obtenues après administration d’une posologie « usuelle » (concentration critique inférieure c) et de la posologie maximale tolérée (concentration critique supérieure C). Le calcul de c et C met en œuvre une formule incluant le pic sérique, la concentration au bout d’une demi-vie, la concentration après 4h et le taux de liaison aux protéines plasmatiques, respectivement après administration de la posologie normale ou élevée. Chaque antibiotique a ses concentrations critiques propres. La méthode par diffusion réalise le classement en utilisant la relation entre CMI et diamètre d’inhibition autour d’une source d’antibiotique, la lecture est donc relativement directe. Pour une bactérie et un antibiotique donnés, le diamètre d’inhibition mesuré est comparé aux diamètres critiques : - En dessous d’un diamètre critique inférieur d, la souche est classée R. Au dessus du diamètre critique supérieur D, la souche est classée S. Les diamètres critiques d et D correspondent respectivement aux concentrations critiques hautes C et basses c. Les valeurs des concentrations et des diamètres critiques définies pour chaque antibiotique L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 5 sur 29 sont établies en tenant compte de plusieurs paramètres : • La distribution des concentrations minimales inhibitrices (CMI) pour des populations de souches définies et appartenant à chacune des espèces bactériennes impliquées en pathologie humaine ; • Les concentrations humorales et tissulaires qui sont obtenues avec les posologies recommandées dans le résumé des caractéristiques du produit (RCP) rédigé par l'Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé (AFSSAPS) ; • La confrontation des résultats obtenus in vitro et des résultats obtenus in vivo (essais cliniques) ; • La variabilité statistique des méthodes utilisées pour mesurer les CMI et les diamètres des zones d'inhibition. III.4 Relation avec la CMI Aux regards des concentrations et des diamètres critiques sont considérées comme : • Sensibles (S), les souches pour lesquelles la CMI de l'antibiotique testé est inférieure ou égale à la concentration critique basse (c), ce qui équivaut à un diamètre supérieur ou égal au diamètre critique D; • Résistantes (R), les souches vis-à-vis desquelles la CMI de l'antibiotique testé est supérieure à la concentration critique haute C, correspondant à un diamètre inférieur au diamètre critique d; • De sensibilité intermédiaire (I), les souches vis-à-vis desquelles la CMI de l'antibiotique testé et du diamètre correspondant sont compris entre les deux concentrations critiques et les deux diamètres critiques. Catégories CMI (mg/L) Diamètre (mm) CMI ≤ c Diamètre ≥ D Sensible Diamètre < d Résistant CMI > C Intermédiaire c < CMI ≤ C d ≤ Diamètre < D L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 6 sur 29 IV. Notion de spectre À chaque antibiotique est associée une liste d'espèces bactériennes qui constitue le "spectre d'activité" de la molécule. Le spectre naturel, établi dans les premières études avant tout emploi en thérapeutique, reste stable par définition puisqu'il ne prend pas en compte la proportion de bactéries ayant acquis une résistance à l'antibiotique après son utilisation. Cette proportion augmente au cours du temps parce que l'emploi de l'antibiotique exerce la pression de sélection nécessaire à l'émergence de mutants ou de souches porteuses de facteurs extrachromosomiques de résistance. Cette notion doit être connue du clinicien car elle explique des situations d'apparence paradoxale : par exemple, le spectre naturel de la pénicilline G comprend Staphylococcus aureus alors que 90% des souches sont actuellement résistantes par production de pénicillinase. Pour faciliter le choix d'un traitement antibiotique, les espèces bactériennes ont été réparties en 3 classes : - Espèces Habituellement Sensibles ; Espèces Modérément Sensibles ; Espèces Résistantes. - Les espèces habituellement sensibles : il s'agit d'espèces répondant à la répartition suivante : 90% ou plus des souches sont caractérisées par des CMI < c. Moins de 10 % des souches sont résistantes ou de sensibilité diminuée. Ex : pénicilline G et streptocoque A - Les espèces modérément sensibles : il s'agit d'espèces dont la sensibilité naturelle n'a pas été modifiée par la résistance mais qui sont habituellement classées I par l'antibiogramme : 90% et plus des souches se situent dans la catégorie I. Le classement ne dépend pas d'un mécanisme de résistance acquis (dont la fréquence peut évoluer), mais d'un caractère propre à l'espèce. Ex : macrolides et Haemophilus influenzae L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 7 sur 29 - Les espèces résistantes : il s'agit d'espèces pour lesquelles plus de 50% des souches sont résistantes. Cette résistance peut être naturelle ou acquise. L'antibiogramme ne fait que confirmer la résistance s'il s'agit d'une résistance naturelle ; il permet de suivre son évolution s'il s'agit d'un mécanisme acquis. Ex : pénicilline G et S. aureus / aminosides et streptocoques NB : la catégorie « Espèces Inconstamment Sensibles » a été supprimée fin 1999. La nomenclature officielle oblige à classer les bactéries de cette catégorie dans la catégorie « espèces sensibles » en mentionnant le pourcentage de résistance acquise. Ex : penicilline G et pneumocoque. Le spectre de l'antibiotique pour les diverses classes d'espèces bactériennes est publié régulièrement, en France dans le Dictionnaire Vidal. V. Méthodes d’étude in vitro V.1 Antibiogramme V.1.1 Principe L'antibiogramme a pour but de déterminer la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) d'une souche bactérienne vis-à-vis de divers antibiotiques. La détermination de cette valeur est peu précise, mais elle est consacrée par l'usage et elle bénéficie d'une masse importante d'informations recueillies à son sujet. V.1.2 Techniques classiques • Méthodes de dilution Les méthodes de dilution sont effectuées en milieu liquide ou en milieu solide. Elles consistent à mettre un inoculum bactérien standardisé au contact de concentrations croissantes d'antibiotiques selon une progression géométrique de raison 2. En milieu liquide (figure 1), l'inoculum bactérien est distribué dans une série de tubes (méthode de macrodilution) ou de cupules (méthode de microdilution) contenant l'antibiotique. Après incubation, la CMI est indiquée par le tube ou la cupule qui contient la plus faible concentration d'antibiotique où aucune croissance n'est visible. L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 8 sur 29 Figure 1 : Détermination de la CMI par dilution en milieu liquide. La CMI de la souche testée est de 2 µg/mL (premier tube dans lequel aucune croissance n'est visible à l'œil nu). Technique en milieu liquide couramment utilisée : La détermination de la sensibilité peut se réaliser en milieu liquide en testant la sensibilité de la souche bactérienne vis-à-vis des concentrations critiques supérieures et inférieures des différents antibiotiques ou uniquement vis-à-vis des concentrations critiques inférieures. Ces méthodes simplifiées sont commercialisées, ce qui les rend accessibles aux laboratoires de diagnostic. L'inoculation des galeries et la lecture des résultats peuvent se réaliser manuellement ou à l'aide d'automates : technique en 24h (à 2 dilutions, c et C) ou en 4h (1 ou 2 dilutions possibles). En milieu solide (figure 1bis), l'antibiotique est incorporé dans un milieu gélosé coulé en boîtes de Petri. La surface de la gélose est ensemencée avec un inoculum des souches à étudier. Après incubation, la CMI de chaque souche est déterminée par l'inhibition de la croissance sur le milieu contenant la plus faible concentration d'antibiotique. La méthode de dilution en milieu gélosé, réalisée avec une gamme de concentrations en progression géométrique de raison 2 est la méthode de référence. Figure 1bis : Détermination de la CMI par dilution en milieu gélosé. Une boîte de Petri permet de tester jusqu’à 30 souches différentes. Dans l'exemple présenté ci-dessus, le nombre de souches est limité à quatre. La CMI de la souche 3 vis-à-vis de l'antibiotique incorporé à la gélose est de 1µg/mL. La CMI de la souche 2 est de 2 µg/mL. Les déterminations des CMI des souches 1 et 4 nécessiteraient de tester des concentrations plus fortes en antibiotique. L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 9 sur 29 Les techniques de dilution en milieu gélosé permettent également de mesurer la concentration inhibitrice 99% (concentration qui inhibe la croissance de 99% des cellules d'une souche bactérienne) ou la concentration inhibitrice 50% (concentration qui inhibe la croissance de 50% des cellules d'une souche bactérienne). Les déterminations des concentrations inhibitrices 99% et 50% sont plus précises que la détermination des CMI puisque les écarts-types moyens sont respectivement de 0,3 log base 2 et de 0,07 log base 2 contre 0,7 log base 2 pour la CMI. Dans la pratique courante, les méthodes de dilution sont de mise en œuvre délicate et/ou onéreuses et elles sont réservées à des laboratoires spécialisés. • Méthodes de diffusion : antibiogramme standard Les méthodes de diffusion ou antibiogrammes standards sont les plus utilisées par les laboratoires de diagnostic. Des disques de papier buvard, imprégnés des antibiotiques à tester, sont déposés à la surface d'un milieu gélosé, préalablement ensemencé avec une culture pure de la souche à étudier. Dès l'application des disques, les antibiotiques diffusent de manière uniforme si bien que leurs concentrations sont inversement proportionnelles à la distance du disque. Après incubation, les disques s'entourent de zones d'inhibition circulaires correspondant à une absence de culture. Lorsque la technique est parfaitement standardisée, les diamètres des zones d'inhibition dépendent uniquement de la sensibilité du germe. À la limite des zones d'inhibition, il existe dans la gélose des concentrations d'antibiotiques égales aux CMI. Les méthodes de diffusion ne permettent pas de chiffrer directement ces valeurs. Toutefois, il existe une relation simple entre les diamètres des zones d'inhibition et les log base 2 des CMI mesurées par les techniques de dilution. Ces relations, appelées droites de concordance ou droites de régression (figure 2), ont été établies par des laboratoires spécialisés travaillant dans des conditions standardisées. À condition de respecter un protocole identique, ces courbes sont utilisables par un laboratoire de diagnostic. En théorie, les mesures des diamètres des zones d'inhibition et leurs reports sur les courbes de concordance donnent les valeurs des CMI en µg/mL. Dans la pratique, les résultats de la technique des disques doivent être considérés comme uniquement qualitatifs en raison de la variabilité expérimentale des diamètres et de l'erreur sur les valeurs de la pente et de l'ordonnée à l'origine des droites de régression. Ces droites de concordance sont tracées expérimentalement à l'aide de nombreuses souches. En général, on utilise un minimum de 100 souches appartenant au moins à quatre genres bactériens différents. Une droite de concordance n'est valable que pour un disque contenant une quantité déterminée d'un antibiotique donné. L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 10 sur 29 Figure 2 : Droite de concordance établie pour l'amoxicilline avec un disque chargé à 25 µg. V.1.3 Standardisation La fiabilité des résultats d'un antibiogramme est influencée par de nombreux paramètres qui doivent être rigoureusement contrôlés. La standardisation est régie par des documents émanant de l'O.M.S. et des divers comités nationaux (pour la France, le Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie). Selon les pays, il peut exister des variations techniques et il est important de respecter une technique identique à celle utilisée pour l'établissement des courbes de concordance. Parmi les principales recommandations, on peut citer les points suivants : Ø Le milieu de culture doit permettre la croissance de nombreuses bactéries et il ne doit pas contenir d'inhibiteurs des antibiotiques. Le milieu retenu pour la majorité des espèces bactériennes est celui de Mueller-Hinton. La gélose de Mueller-Hinton est enrichie de 5% de sang de mouton pour les streptocoques et les campylobactéries, de 10% de sang de cheval pour Helicobacter pylori ou de 5 % de sang de cheval hémolysé pour l'étude de la sensibilité des streptocoques vis-à-vis du cotrimoxazole. Pour Haemophilus influenzae et Neisseria gonorrhoeae, le milieu de Mueller-Hinton est remplacé par une gélose chocolat PolyVitex® et pour les bactéries anaérobies par une gélose Wilkins Chalgren additionnée de 5% de sang de mouton (ou une gélose Brucella contenant 1 mg/L de vitamine K1 et 5% de sang). Dans le cas particulier de la recherche de la résistance à la méticilline de Staphylococcus aureus subspecies aureus, il est possible d'utiliser un milieu de Mueller-Hinton hypersalé. Ø Les teneurs en calcium et en magnésium doivent être contrôlées, car des concentrations trop élevées inhibent l'action des aminosides (réduction de la fixation sur la membrane externe de certaines bactéries à Gram négatif), des tétracyclines (chélation) et des polymyxines. L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 11 sur 29 Ø La teneur en thymidine doit être fixe, car elle nuit à l'activité des sulfamides. Ø Le pH influence l'activité de plusieurs antibiotiques (les aminosides et les macrolides sont plus actifs en milieu alcalin, alors que les tétracyclines sont plus actives en milieu acide) et il doit être compris entre 7,2 et 7,4 (valeur qui permet une bonne croissance bactérienne et qui réalise un compromis pour l'activité des antibiotiques). Ø Pour les méthodes de diffusion, la source d'antibiotique est en fait constituée par le disque et le cylindre de gélose sous-jacente. L'épaisseur de la gélose va donc conditionner la concentration de la source d'antibiotique et elle doit être de 4 mm. Ø Les antibiotiques, ainsi que les disques doivent être standardisés. Cette standardisation est effectuée par les fabricants et le laboratoire a pour unique responsabilité de stocker les disques dans des conditions optimales et de ne pas utiliser des disques périmés. Avant utilisation, les disques doivent être amenés à température ambiante. Toute cartouche ouverte doit être utilisée dans les cinq jours. Ø La densité de l'inoculum bactérien est un élément primordial et elle doit être ajustée à l'aide d'un photomètre ou par comparaison avec un étalon d'opacité (échelle de McFarland). En France, l'antibiogramme par diffusion est réalisé avec une suspension contenant environ 106 bactéries par mL. Pour certaines bactéries, l'inoculum doit être plus important : 107 bactéries par mL pour les streptocoques, 108 pour Neisseria gonorrhoeae et 109 pour Helicobacter pylori. Pour les méthodes de dilution en milieu gélosé, les spots doivent renfermer environ 104 bactéries et ce nombre est porté à 105 pour les Campylobacter ou pour les bactéries anaérobies et à 106 pour Neisseria gonorrhoeae. Ø Une phase de pré-diffusion des antibiotiques peut conduire à l'obtention de zones d'inhibition plus importantes. Selon les pays, une pré-diffusion est ou non préconisée. En France, la technique du "Comité de l'Antibiogramme de la SFM" ne prévoit pas de prédiffusion. La température et la durée d'incubation doivent être fixes. Pour la majorité des bactéries l'incubation est effectuée à 35-37 °C durant 18-24 heures dans une atmosphère normale. Pour les streptocoques, Neisseria meningitidis et Neisseria gonorrhoeae, l'incubation est réalisée dans une atmosphère contenant 5% de dioxyde de carbone. Pour les Campylobacter l'incubation est effectuée en micro-aérophilie ou en anaérobiose. La durée de l'incubation, effectuée dans une atmosphère dépourvue d'oxygène, est portée à 48 heures pour les bactéries anaérobies et à 72 heures (dans une atmosphère micro-aérophile) pour Helicobacter pylori. Ø Dans le cas particulier de la recherche de la résistance à la méticilline de Staphylococcus aureus subspecies aureus, il est possible d'utiliser soit une gélose de Mueller-Hinton hypersalée incubée à 37 °C, soit une gélose de Mueller-Hinton incubée à 30 °C. Dans ce dernier cas, la durée de l'incubation peut être de 48 heures. Ø La technique doit être régulièrement contrôlée avec des souches de référence. Les souches les plus couramment utilisées sont la souche ATCC 25922 (= CIP 76.24 = DSM 1103 = NCIB 12210 = JCM 5491) de Escherichia coli, la souche ATCC 27853 ( = CIP 76.110 = DSM 1117 = LMG 6395) de Pseudomonas aeruginosa et la souche ATCC 25923 (= CIP 76.25 = DSM 1104 = JCM 2413 = NCTC 12981) de Staphylococcus aureus subspecies aureus. L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 12 sur 29 La mise en place d'un contrôle de qualité interne a fait l'objet de recommandations de la part du Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie. Lors de sa première mise en œuvre par un laboratoire, la technique de diffusion doit être réalisée quotidiennement 8 à 10 jours de suite afin de la maîtriser, avec les souches de référence et les antibiotiques suivants : pénicilline G, oxacilline, amoxicilline, amoxicilline/acide clavulanique, ticarcilline, pipéracilline, céfalotine, céfotaxime, ceftazidime, imipénème, gentamicine, tobramycine, amikacine, acide nalidixique, péfloxacine, ciprofloxacine, triméthoprime/sulfaméthoxazole, érythromycine, lincomycine, pristinamycine, rifampicine, acide fusidique, fosfomycine, colistine, vancomycine et teicoplanine. Le maintien de la qualité est ensuite vérifié au minimum une fois par mois. Si des résultats corrects ne sont pas obtenus, des mesures correctives sont mises en place, impliquant alors de revenir à la première étape du contrôle de qualité. V.1.4 Résultats • Expression des résultats (figure 3) En pratique, les laboratoires ne disposent pas des courbes de concordance, mais de bandelettes de lecture sur lesquelles sont reportés les diamètres correspondant aux concentrations critiques. Si le diamètre mesuré est inférieur au diamètre correspondant à la concentration critique supérieure, la souche est résistante. Si le diamètre mesuré est supérieur au diamètre correspondant à la concentration critique inférieure, la souche est sensible. Si le diamètre mesuré est compris entre les diamètres correspondant aux deux concentrations critiques, la souche est de sensibilité intermédiaire. Figure 3 : Bandelettes de lecture. Les résultats quantitatifs (CMI en mg/L) sont le plus souvent interprétés par les laboratoires en terme de possibilité thérapeutique. Cette interprétation consiste à comparer les valeurs des CMI avec les concentrations critiques établies pour chaque antibiotique. L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 13 sur 29 • Lecture interprétative de l'antibiogramme La lecture interprétative de l'antibiogramme est fondée sur la connaissance des phénotypes de résistance. Elle a pour principal but de transformer un résultat catégorisé "sensible" en un résultat "intermédiaire" ou "résistant" en raison d'un risque d'échec thérapeutique. La lecture interprétative nécessite une identification correcte de la souche et une méthode d'antibiogramme parfaitement standardisée. La mise en évidence de phénoypes de résistance hautement improbables compte tenu de l'identification de la souche doit conduire à vérifier l'identification bactérienne, à contrôler la pureté de l'inoculum et à contrôler la technique de l'antibiogramme. Actuellement, il existe des systèmes informatisés d’aide à la validation des résultats : les systèmes experts qui permettent la recherche de résultats anormaux. Ce contrôle de validation vise à : - Vérifier la cohérence germe/antibiogramme - Détecter les phénotypes de résistance impossibles - Détecter l’absence d’une résistance associée - A reconnaître des phénotypes anormaux pouvant correspondre à de nouvelles modalités de résistance. Rq : Généralisation des résultats à des antibiotiques non testés : Le choix des antibiotiques testés repose avant tout sur l'identification du germe et sur la connaissance de sa résistance naturelle. Ce choix dépend également du site de l'infection. Parmi les antibiotiques susceptibles d'être utilisés en thérapeutique, toutes les molécules ne sont pas prises en compte. En effet, la connaissance des familles d'antibiotiques et des mécanismes de résistance croisée permet de ne faire figurer dans l'antibiogramme qu'un nombre restreint de molécules représentatives. V.1.5 Autres techniques • Technique en milieu gélosé : le Etest® La détermination précise de la CMI par la méthode de référence est difficilement utilisable en pratique quotidienne. La commercialisation d'une technique rapide et simple, le Etest® (AB Biodisk) permet à un laboratoire une estimation indirecte de la CMI, tirée de la CID (figure 4). L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 14 sur 29 Figure 4 : Le Etest®. Le Etest® permet de déterminer la CMI grâce à l'utilisation de bandelettes imprégnées d'un gradient exponentiel continu de l'antibiotique à tester. Ce gradient couvre une zone qui, en fonction des molécules, va de 0,016 à 256 mg/L ou de 0,002 à 32 mg/L. Le Etest® associe les caractéristiques des méthodes de diffusion et de dilution en milieu solide. Les bandelettes (supports inertes, hydrophobes, de 5 mm de largeur et de 50 mm de longueur) sont appliquées sur la surface d'un milieu gélosé préalablement ensemencé avec un inoculum de la souche à étudier. Après incubation, l'inhibition de la croissance se traduit par une ellipse d'inhibition dont les points d'intersection avec la bandelette définissent la CMI. Une échelle de lecture, imprimé sur la bandelette, permet une interprétation rapide. Le milieu de culture (Mueller-Hinton ou milieux plus adaptés pour les bactéries à croissance lente et pour les anaérobies) est ensemencé par la technique de Kirby-Bauer, soit par inondation, soit par écouvillonnage (l’écouvillonnage permet de mieux fixer les bactéries à la gélose). La technique de Kirby-Bauer est conseillée pour les bactéries à croissance lente et pour les anaérobies. L'inoculum doit être standardisé et les boîtes doivent être parfaitement séchées avant le dépôt des bandelettes. Ce dépôt est un temps délicat, il est impératif de ne pas déplacer les bandelettes sur la surface de la gélose, car l'antibiotique diffuse dans le milieu en quelques secondes. Lorsque la zone d'inhibition est nette et parfaitement symétrique, la lecture ne pose aucun problème. Dans tous les autres cas, une interprétation est nécessaire : - Une zone de décrochage (dip) dans la zone de lecture impose de lire la CMI en extrapolant la courbe de l'ellipse ; - La présence de colonies "squatter" doit être analysée (résistance hétérogène, émergence de mutants résistants, mélange bactérien) ; - La présence d'une croissance en ligne le long de la bandelette n'est pas prise en compte et résulte certainement d'un séchage insuffisant de la surface du milieu ; L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 15 sur 29 - Une asymétrie des points d'intersection de l'ellipse avec la bandelette conduit à lire la CMI au niveau le plus élevé. • Cas particulier des mycobactéries Une fois la mycobactérie isolée, il faut compter 3 à 4 semaines pour obtenir la réponse de l’antibiogramme. Les techniques utilisées sont particulières à ce type de bactéries. - Méthode des proportions La détermination de la sensibilité n’est pas fondée sur la détermination des CMI. On considère les souches sensibles si, pour une concentration donnée d’antibiotique, la population ne comporte une proportion trop importante de mutants résistants, définie pour chaque antibiotique et chaque concentration (proportion critique). Elle consiste à répartir des quantités égales d’inoculum bactérien sur des milieux contenant les antibiotiques à tester (Milieux Lowenstein-Jensen, Middlebrook 7H10 ou 7H11). On ensemence 0,1 mL des dilutions 10-2 à 10 -5 sur des milieux de contrôle tandis que 0,1 mL des dilutions 10-2 et 10-4 est réparti en parallèle sur des milieux contenant des concentrations critiques des antibiotiques à tester. La proportion de bactéries résistantes à une concentration donnée est déterminée par comparaison du nombre de bactéries viables qui se sont développées à celui obtenu sur les boites contrôle après 4 semaines. Pour chaque antibiotique, un pourcentage de résistance est toléré pour déterminer si la souche est S ou R. Ce pourcentage est appelé « proportion critique » et varie selon le milieu utilisé et l’antibiotique. - Méthode radiométrique Dans cette méthode les bactéries métabolisent l’acide palmitique marqué au carbone 14 en bouillon Middlebrook 7H12. La croissance bactérienne est évaluée chaque jour par la mesure du 14C-CO2 libéré dans le milieu et capturé par un détecteur qui exprime ensuite un indice de croissance variant de 1 à 999. V.1.6 Limites de l'antibiogramme • Limites techniques La réalisation d'un antibiogramme est soumise au respect de conditions techniques qui sont parfois incomplètement et insuffisamment respectées. Un antibiogramme doit obligatoirement être effectué sur une culture pure et identifiée. Cette dernière condition permet d'ajuster la densité de l'inoculum, de choisir judicieusement les antibiotiques à tester et de pratiquer une lecture interprétative. Un antibiogramme réalisé de manière non standardisée et sur un mélange de germes non identifiés est dépourvu de sens. Tout laboratoire devrait vérifier la validité de sa technique en testant, au moins une fois par mois, la sensibilité des souches de référence et vérifier que les diamètres des zones d'inhibition obtenues vis-à-vis des divers antibiotiques sont conformes aux valeurs publiées par le Comité de l'Antibiogramme. Les techniques de l'antibiogramme ont été standardisées uniquement pour les bactéries cultivant rapidement sur milieux usuels. Lorsque la souche isolée ne rentre pas dans ce cadre, l'interprétation est parfois délicate : L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 16 sur 29 Ø Les bactéries appartenant aux genres Haemophilus, Brucella, Pasteurella, Campylobacter, Nocardia... requièrent l'emploi de milieux et de conditions de culture adaptés à leurs exigences de croissance. D'une manière générale, on considère que la résistance est sans ambiguïté, mais que la sensibilité n'est qu'apparente et devrait être confirmée par des techniques de dilution ; Ø En raison de la petite taille des colonies et de la durée d'incubation souvent longue, la méthode de diffusion en milieu gélosé est inadaptée pour les mycoplasmes. Ø Les espèces des genres Chlamydia, Rickettsia... sont des parasites intracellulaires obligatoires et l'étude de leur sensibilité aux antibiotiques nécessite le recours à des techniques particulières rarement effectuées en routine. Ø L'antibiogramme ne permet pas de déterminer la sensibilité des mycobactéries à croissance lente et pour les espèces à croissance rapide, on doit avoir recours à des méthodes de dilution (E-Test possible aussi). Ø Les techniques de diffusion appliquées aux anaérobies ont été critiquées, car elles ne peuvent être appliquées ni à toutes les espèces ni à tous les antibiotiques. Elles sont peu reproductibles et les résultats diffèrent souvent de ceux obtenus par dilution. Ces techniques sont cependant utilisées pour détecter des résistances inhabituelles : résistance au métronidazole ou aux associations bêta-lactamines inhibiteurs des bêta-lactamases chez Bacteroides fragilis ; résistance à la pénicilline chez les clostridies. La technique des disques s'applique mal à l'évaluation de la sensibilité à des molécules qui diffusent peu dans la gélose, ce qui est le cas des polymyxines ou des glycopeptides et toute résistance devrait être confirmée par la mesure de la CMI. • Limites dans l'interprétation des résultats Ø Incertitude sur l'étiologie de l'infection L'antibiogramme ne peut apporter une aide que dans la mesure où il est effectué sur la bactérie véritablement responsable de l'infection. Parmi les bactéries isolées d'un prélèvement, le laboratoire doit faire un choix et n'effectuer l'antibiogramme que sur l'espèce ou les espèces susceptibles de jouer un rôle étiologique. Ce choix n'est possible que dans la mesure où le bactériologiste possède des connaissances en pathologie infectieuse. Ø Évaluation de l'intensité d'action d'un antibiotique L'antibiogramme ne renseigne que sur l'activité bactériostatique. L'étude du pouvoir bactéricide d'un antibiotique sur la souche isolée nécessite d'autres tests. Ø Association d'antibiotiques D'une manière générale, l'antibiogramme ne permet pas la mise en évidence des interactions éventuelles entre deux agents antimicrobiens et l'étude des synergies ou antagonismes nécessite des tests complémentaires. L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 17 sur 29 Aminosides (entérobactéries) L'observation des phénotypes gentamicine "résistant", tobramycine "sensible", nétilmicine "résistant" et amikacine "sensible" ou gentamicine "sensible", tobramycine "résistant", nétilmicine "résistant" et amikacine "sensible" ou gentamicine "sensible", tobramycine "sensible", nétilmicine "résistant" et amikacine "résistant" ou gentamicine "sensible", tobramycine "résistant", nétilmicine "sensible" et amikacine "résistant" doivent conduire à vérifier l'identification et l'antibiogramme car de tels phénotypes sont improbables. Aminosides (entérocoques, Streptococcus sp. à l'exception de Streptococcus pneumoniae) Seuls des disques fortement chargés en streptomycine, kanamycine et gentamicine doivent être utilisés pour les entérocoques et pour les streptocoques, car ces bactéries sont naturellement résistantes à bas niveau vis-à-vis des aminosides. Ils permettent de détecter une résistance acquise de haut niveau qui abolit l'effet synergique bactéricide de l'association des aminosides concernés avec les pénicillines. Les autres aminosides restent utilisables en association. Diamètre supérieur ou égal à 14 mm pour la streptomycine ou la kanamycine, diamètre supérieur ou égal à 17 mm pour la gentamicine : synergie possible avec les pénicillines en cas de sensibilité à ces antibiotiques. Diamètre inférieur à 12 mm pour la streptomycine : la streptomycine ne peut être utilisée. Diamètre inférieur à 10 mm pour la kanamycine : la kanamycine, l'amikacine et l'isépamycine ne peuvent être utilisés. Diamètre inférieur à 11 mm pour la gentamicine : la gentamicine, la kanamycine, la tobramycine, la dibékacine, l'amikacine, la sisomycine, la nétilmicine et l'isépamicine ne peuvent être utilisés. Aminosides (Providencia sp.) Les résultats gentamicine "sensible", tobramycine "sensible" et nétilmicine "sensible" doivent être interprétés comme "intermédiaires" (résistance naturelle). Ampicilline (entérobactéries) Interprétation valable pour la bacampicilline, la métampicilline et la pivampicilline. Ampicilline (entérocoques) La sensibilité des entérocoques aux pénicillines est appréciée à l'aide d'un disque d'ampicilline chargé à 10 µg. Pour Enterococcus faecalis, l'interprétation est valable pour la pénicilline G, l'amoxicilline, la pipéracilline et l'imipénème. Le traitement des infections sévères dues à des souches de Enterococcus sp. ampicilline S/I nécessite des doses élevées d'une pénicilline associée à un aminoglycoside pour obtenir une activité bactéricide. Amoxycilline + acide clavulanique L'observation d'un phénotype amoxicilline "sensible" et amoxicilline + acide clavulanique "résistant" révèle une mauvaise conservation des disques d'antibiotique. Céfalotine (entérobactéries) Réponse valable pour toutes les céphalosporines de première génération. Chloramphénicol (Acinetobacter sp., entérobactéries, entérocoques, aeruginosa, staphylocoques, Stenotrophomonas maltophilia, streptocoques) Réponse valable pour le thiamphénicol. Pseudomonas Clindamycine (anaérobies) L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 18 sur 29 La lecture doit être effectuée après 48 heures d'incubation car après 24 heures d'incubation les souches peuvent apparaître faussement sensibles. Colistine Réponse valable pour les autres polymyxines. Colistine (Proteus sp., Providencia sp., Serratia sp.) L'observation d'un phénotype colistine "sensible" doit conduire à vérifier l'identification et l'antibiogramme, car un tel phénotype est improbable. Érythromycine (entérocoques, staphylocoques, streptocoques) Réponse valable pour l'azithromycine, la clarithromycine, la dirithromycine et la roxithromycine. Gentamicine (staphylocoques) Interprétation valable pour la nétilimicine. Les souches résistantes à la gentamicine sont résistantes à l'ensemble des aminoglycosides (sauf streptomycine). Kanamycine (entérobactéries) Réponse valable pour la néomycine, la framycétine et la paromomycine. Kanamycine (staphylocoques) Interprétation valable pour la néomycine, la framycétine, la paromomycine, l'amikacine et l'isépamycine. Métronidazole (anaérobies) Réponse valable pour l’ornidazole. Certaines souches apparaissent faussement résistantes si l'anaérobiose n'est pas correcte. Oxacilline (staphylocoques) Les souches résistantes à l’oxacilline (résistance homogène ou résistance hétérogène) doivent être considérées comme résistantes à toutes les pénicillines (associées ou non à un inhibiteur des bêtalactamases), aux céphalosporines et aux carbapénèmes, même s’il existe une sensibilité apparente in vitro. Les souches pénicillines résistantes - oxacilline sensibles sont sensibles aux associations pénicilline - inhibiteur de bêta-lactamase, aux céphalosporines et aux carbapénèmes. Il n'est pas utile de tester ces molécules en routine. Le test doit être effectué dans des conditions permettant la détection de la résistance hétérogène : milieu de Mueller-Hinton hypersalé incubé à 37 °C ou milieu de Mueller-Hinton incubé à 30 °C. La résistance hétérogène se traduit par la présence de microcolonies dans la zone d'inhibition. Pénicilline G (staphylocoques) La résistance à la pénicilline G par production de pénicillinase se traduit par la présence de grosses colonies en bordure de la zone d'inhibition ainsi que par l'éventuelle présence de colonies "squatters" dans la zone d'inhibition. La réponse "résistant" est valable pour la pénicilline G et pour les autres pénicillines sensibles aux pénicillinases (pénicilline V, aminopénicillines, carboxypénicillines, uréidopénicillines). Seule la pénicilline G doit être testée et lorsque le diamètre correspond à une souche sensible, l'absence de production de pénicillinase devrait être recherchée. L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 19 sur 29 Pénicilline G (streptocoques sauf Streptococcus pneumoniae) La sensibilité des streptocoques à la pénicilline G est appréciée avec un disque d'oxacilline chargé à 5 µg. Si le diamètre est supérieur ou égal à 21 mm la souche est sensible à la pénicilline G et cette interprétation est valable pour les autres bêta-lactamines incluant les streptocoques dans leur spectre. Si le diamètre est inférieur à 21 mm la souches est résistante ou de sensibilité intermédiaire à la pénicilline G. Devant toute souche dont le diamètre est inférieur à 21 mm, il y a lieu de déterminer la CMI de l'ampicilline, de l'amoxicilline ou du céfotaxime. Quinolone de première génération (entérobactéries) Réponse valable pour toutes les quinolones de première génération. Spiramycine (staphylocoques) Interprétation valable pour la josamycine et la midécamycine. Tétracycline (entérobactéries, entérocoques, Pseudomonas aeruginosa, staphylocoques, streptocoques) Réponse valable pour l'oxytétracycline et la doxycycline. Tétracyclines (coques à Gram positif) L'observation d'un phénotype tétracycline "sensible" et minocycline "résistant" doit conduire à vérifier l'identification et l'antibiogramme car un tel phénotype est improbable. Triméthoprime-sulfaméthoxazole Réponse valable pour les autres associations triméthoprime-sulfamide. Il existe toutefois deux cas particuliers où l'antibiogramme est apte à donner des indications sur les associations : o La résistance aux macrolides, lincosamides et streptogramines (résistance MLS), par synthèse d'une méthylase inductible, peut être détectée en plaçant un disque d'érythromycine en regard d'un disque de lincomycine. L'érythromycine déclenche la synthèse de la méthylase inductible et une image d'antagonisme est visible en face du disque de lincomycine. o Un disque unique est utilisé pour les associations bêta-lactamine-inhibiteurs des bêta-lactamases ou pour les associations triméthoprime-sulfamides. Ø Cas particulier des streptocoques et des entérocoques La détermination de la sensibilité des streptocoques et des entérocoques aux aminosides permet au clinicien de prédire l'effet d'une association aminoside-bêta-lactamine. Les streptocoques et les entérocoques sont naturellement résistants à de faibles concentrations d'aminosides, car ces antibiotiques pénètrent difficilement dans le cytoplasme. L'association avec une bêta-lactamine qui altère la biosynthèse de la paroi facilite la pénétration. Cette association est cependant inefficace si la souche de streptocoques ou d'entérocoques a acquis une résistance aux aminosides par mutation ou par synthèse d'enzymes altérant l'antibiotique. Ce haut niveau de résistance est détecté en utilisant des disques fortement chargés en streptomycine, en gentamicine ou en kanamycine. En pratique, la réponse streptocoque ou entérocoque résistant à un aminoside signifie que son association avec une bêta-lactamine n'est pas souhaitable. Inversement, la réponse L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 20 sur 29 sensible signifie que l'aminoside pourra être utilisé, mais uniquement en association avec une bêta-lactamine et à condition que la souche soit sensible aux bêta-lactamines. Ø Absence de parallélisme entre les situations in vitro et in vivo. L'antibiogramme ne peut prédire le comportement d'un antibiotique in vivo. Celui-ci est fonction de multiples facteurs : o Choix d'un schéma posologique ; o Diffusion au site de l'infection ; o Pénétration dans les cellules ce qui est important à considérer pour les infections dues aux bactéries intracellulaires (les antibiotiques pénétrant bien dans les cellules sont les tétracyclines, le chloramphénicol, la rifampicine) ; o Influence des facteurs physiologiques ou pathologiques sur la pharmacocinétique de l'antibiotique ; o Transformation de la molécule in vivo ; o Inactivation de l'antibiotique par chélation (tétracyclines) ou par fixation sur des débris cellulaires (polymyxines) ; o Effets du pH (les aminosides sont inactifs à pH acide) ; o Etat physiologique de la bactérie au sein du foyer infectieux (les bactéries « au repos » sont insensibles aux antibiotiques qui interfèrent avec la biosynthèse du peptidoglycane et il en va de même pour les formes L qui sont des mutants dépourvus de paroi) ; o Émergence d'une résistance au cours du traitement ; o Effets de l'antibiotique à concentration sub-inhibitrice sur le pouvoir pathogène (les quinolones et les tétracyclines inhibent, au moins partiellement, la synthèse des facteurs d'adhésion et une concentration insuffisante pour inhiber la croissance peut avoir une certaine efficacité in vivo). V.2 Autres méthodes V.2.1 Recherche des bêta-lactamases Les enzymes inactivant les bêta-lactamines peuvent être détectées par une méthode chromogénique : Le principe repose sur l'utilisation d'une céphalosporine changeant de coloration après hydrolyse. La molécule la plus utilisée est la nitrocéfine qui, après action d'une bêtalactamase, vire du jaune au rouge. Des disques de papier imprégnés de nitrocéfine sont commercialisés : Test Céfinase. V.2.2 Recherche de la méticilino-résistance chez les staphylocoques Dans les conditions standard de l’antibiogramme, seule une fraction de la population exprime la résistance aux pénicillines M. seules des conditions plus drastiques (incubation à 30°C ; milieu MH hyper salé) permettent une meilleure expression de la résistance. On dépose un disque d’oxacilline à la surface du milieu. La lecture se fait à 24 puis 48H. Une résistance hétérogène se manifeste par la présence de colonies de taille variable autour du disque. La forte présence de SARM en milieu hospitalier rend leur recherche indispensable. L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 21 sur 29 V.2.3 Recherche des bêta-lactamases à spectre étendu (BLSE) La technique par diffusion est également utilisée dans le cadre de la recherche de Bêtalactamase à Spectre Etendu (BLSE). Pour cela on dispose sur la surface d'une gélose des disques de ceftazidime (et/ou de cefotaxime, et/ou de céfépime, et/ou de cefpodoxime, et/ou d'aztréonam) et d'amoxicilline-acide clavulanique à 3cm l'un de l'autre.Les BLSE sont des Bêtalactamases et sont donc inhibées par l'acide clavulanique. On observe alors une synergie d'action entre les deux antibiotiques, appelée "bouchon de champagne". En cas de présence de BLSE, on rendra sur l'antibiogramme sensibilité intermédiaire aux C3G et à l'aztréonam. Cette technique permet de différencier une bactérie hyper productrice de céphalosporinase d'une bactérie produisant une BLSE dans la famille des Entérobactéries par exemple. V.2.4 Apport de la biologie moléculaire Se référer pour ce chapitre à l’exposé « BIOLOGIE MOLECULAIRE EN ROUTINE AU LABORATOIRE DE BACTERIOLOGIE » DES BACTERIOLOGIE semestre hiver 2002/2003 disponible sur le site. VI. Cas particulier de l’antibiogramme automatisé L’automatisation de l’antibiogramme s’est développée pour pallier aux inconvénients de cette technique manuelle, manquant de standardisation et dont la réalisation est lente. Actuellement, ce terme est utilisé pour désigner des appareils effectuant la lecture et l’interprétation de tests faits manuellement. Ces appareils fonctionnent selon 2 grands principes : - Ils miment les tests conventionnels d’étude de la sensibilité des bactéries aux antibiotiques (technique la plus courante : dilution en milieu liquide en plaque de microtitration avec lecture en point fixe par un photomètre) - Ou bien ils comparent la croissance d’un témoin à celle observée en présence d’une ou plusieurs concentrations d’antibiotiques. Les systèmes étudient la croissance bactérienne soit en présence d’une seule concentration d’antibiotique (concentration permettant de discriminer les bactéries sensibles des bactéries résistantes) soit en effectuant une analyse cinétique de la croissance. L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 22 sur 29 Les méthodes d’étude de la croissance des bactéries font appel à des méthodes optiques directes : - Analyse de l’image recueillie par une caméra ; - Turbidimètrie (D.O. d’une suspension proportionnelle à la masse des particules en suspension) ; - Néphélémétrie (mesure de la lumière diffractée). En règle générale, la néphélémétrie a une sensibilité supérieure mais un domaine de linéarité plus étroit que la turbidimètrie. La plupart des instruments utilisés ne détectent un trouble que si la densité bactérienne atteint au mieux 107 bactéries/mL (la turbidimètrie nécessite elle 108 à 109 bactéries/mL). L’équipement maximum et représenté par : - Un dispositif optique permettant la standardisation de l’inoculum ; - Un système de répartition de l’inoculum - Un incubateur - Un dispositif de lecture des tests - Un système informatique qui effectue l’interprétation des résultats - Des extensions éventuelles : identification, système expert. Exemples d’automates utilisés dans les laboratoires de bactériologie locaux : Nom Système ATB Expression Biomérieux Vitek IBiomérieux Phoenix – Becton Dickinson Principe 1 ou 2 concentrations d’ATB Lecture en point fixe Turbidimétrie Analyse cinétique Photométrie Antibiogramme pour Entérobactéries, nonfermentants, staphylocoques, entérocoques, strepto B, pneumocoques Lecture en point fixe sur 5 points de gamme en moyenne Colorimétrie Délai 24 ou 4h Extension Identification Système expert 4h-18h Identification 6h-11h Identification Système expert Utilisateurs HEH X ROUSSE CARDIO CHLS CLB BELLEVUE CHLS CLB HEH X ROUSSE CARDIO Lecteur automatisé : Sirscan – i2a Automatisation de la lecture des antibiogrammes réalisés en gélose. Lecture en 18 à 24h. L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 23 sur 29 VII. Conclusion L’antibiogramme a pour but de prédire la sensibilité d’un germe à un ou plusieurs antibiotiques dans le but d’adapter au mieux l’antibiothérapie dans un contexte infectieux. Cette étude a lieu in vitro et il convient de considérer d’autres caractéristiques des antibiotiques, pharmacocinétiques par exemple, afin de d’avoir le maximum de chances de guérison pour le malade. Les techniques de réalisation des antibiogrammes n’ont cessé d’évoluer depuis une vingtaine d’années avec les progrès de l’automatisation. Ceci a permis de diminuer les temps d’attente dans une optique d’optimisation de la qualité des soins, mais également de standardiser au mieux les antibiogrammes. Toutefois, les anciennes techniques n’ont pas disparu, car les techniques automatisées ne sont pas parfaites : les bactéries anaérobies et à croissance lente poussent mal dans le cadre de techniques en milieux liquides. Ceci tend à prouver qu’un laboratoire de bactériologie devrait posséder deux techniques pour réaliser les antibiogrammes : une automatique (choix d’un automate parmi ceux sur le marché) et une manuelle, afin d’obtenir une complémentarité maximale entre ces techniques. Bibliographie « Manuel de bactériologie clinique » 2e édition – volume 1 HANSEN W. Editions Elsevier – p. 413-464. FRENEY J. RENAUD F. « Précis de bactériologie clinique » FRENEY J. RENAUD F. HANSEN W. BOLLET C. Editions ESKA Février 2000 - p.709-714 ; p.1071-1095. « De l’antibiogramme à la prescription » JEHL F. CHOMARAT M. GERARD A. Editions Biomérieux Février 2000. Site internet : http://www.bacterio.cict.fr/bacdico/atbq.sensibilite.htlm. « Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie » - Communiqué 2003 – Edition de janvier 2003 – http://www.sfm.asso.fr « Bactériologie médicale » - Sous la direction de Jean-Pierre FLANDROIS - Collection Azay p.73-100. L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 24 sur 29 ANNEXE : Épreuves de synergie • Introduction. L'utilisation d'une association d'antibiotiques est justifiée dans quatre cas : Ø Élargir le spectre d'activité dans les cas d'infections à germes multiples ; Ø Traiter en urgence une infection grave non diagnostiquée ; Ø Prévenir la sélection de mutants résistants lors des traitements de longue durée ; Ø Obtention d'un effet synergique. La prévention de la sélection de mutants résistants (par exemple, lors d'infections à mycobactéries ou à brucelles) et l'obtention d'un effet synergique avec, si possible, une action bactéricide rapide constituent les raisons essentielles de l'utilisation d'une association. La plus grande efficacité thérapeutique de certaines associations a été démontrée expérimentalement et/ou confirmée par l'expérience clinique. L'interaction de deux antibiotiques peut produire quatre effets principaux : Ø Indifférence : l'activité d'un antibiotique n'a aucune influence sur l'activité de l'autre ; Ø Addition : l'effet de l'association est égal à la somme des effets produits par chacun des antibiotiques pris isolément ; Ø Synergie : l'effet de l'association est supérieur à la somme des effets produits par chacun des antibiotiques pris isolément ; Ø Antagonisme : l'effet de l'association est inférieur à la somme des effets produits par chacun des antibiotiques pris isolément. • Mécanismes des associations synergiques Ø Facilitation de la pénétration La pénétration d'un antibiotique dans la bactérie peut être facilitée par une autre molécule. Ce mécanisme est observé lors de l'association d'un antibiotique inhibant la synthèse de la paroi avec un aminoside. Ainsi, les bêta-lactamines ou la vancomycine facilitent la pénétration des aminosides en augmentant la perméabilité de la paroi. Cet effet synergique a été démontré pour les entérocoques, les streptocoques, Staphylococcus aureus subsp. aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, mais il n'est pas constaté pour toutes les souches de ces espèces. Ø Inhibition séquentielle d'une même voie métabolique Les associations triméthoprime-sulfamides sont synergiques, car il y a inhibition séquentielle de la dihydroptéroate synthétase et de la dihydrofolate réductase qui sont deux enzymes impliquées dans la synthèse des folates. Ø Inhibition de la synthèse de la paroi Un effet synergique séquentiel se produit lors de l'association de la vancomycine avec une bêta-lactamine. L'association de deux bêta-lactamines se fixant sur des PLP différentes peut également avoir un effet synergique. Les PLP ou Protéines Liant les Pénicillines constituent les cibles d'action des bêta-lactamines. L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 25 sur 29 Ø Inhibition des bêta-lactamases Une synergie par compétition d'affinité pour une bêta-lactamase peut être observée lors de l'association pénicilline G (ou ampicilline) avec la cloxacilline. L'association d'un inhibiteur des bêta-lactamases, tel que l'acide clavulanique, avec l'amoxicilline permet à ce dernier antibiotique de conserver une efficacité sur des souches productrices de certaines bêta-lactamases. • Mécanismes des associations antagonistes Ø Association d'un antibiotique bactériostatique et d'une bêta-lactamine Les antibiotiques bactériostatiques comme les tétracyclines, les macrolides ou les phénicolés diminuent l'activité bactéricide des bêta-lactamines, car celles-ci ne sont actives que sur les bactéries en phase de multiplication. Cet antagonisme a été démontré in vitro et in vivo. Ø Associations d'antibiotiques actifs sur la sous-unité 50 S des ribosomes Les associations macrolides-chloramphénicol ou macrolides-lincosamides ou macrolides-macrolides conduisent à une compétition pour la fixation sur la sous-unité 50 S des ribosomes ce qui produit un effet antagoniste. Ø Inhibition du transfert actif des aminosides In vitro, l'association d'un aminoside avec un phénicolé ou une tétracycline inhibe le mécanisme de transfert actif nécessaire à la pénétration de l'aminoside dans la cellule bactérienne. Ø Induction de bêta-lactamases L'association de deux bêta-lactamines peut être antagoniste si l'une d'elles est inductrice de bêta-lactamases. Exemples : associations pipéracilline-céfotaxime (ou ceftazidime ou imipénème) ; associations céfoxitine-céfamandole (ou ceftazidime ou carbénicilline). • Réalisation des épreuves de synergie L'activité d'une association d'antibiotiques est variable en fonction des espèces bactériennes et pour une même espèce selon les souches. En théorie, il est donc nécessaire de vérifier l'activité de l'association envisagée sur chaque souche isolée. Il existe de nombreuses méthodes pour étudier les effets d'une association, mais aucune d'elles n'est standardisée et elles sont généralement de mise en œuvre complexe. Le choix d'une méthode dépend donc des possibilités du laboratoire. L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 26 sur 29 Ø Technique simplifiée utilisant une méthode de dilution en milieu liquide (figure 5) Figure5 : Schéma triangulaire de répartition (pour quatre antibiotiques) A : Témoin inoculum (de haut en bas) : Inoculum pur Dilué à 10-1 Dilué à 10-2 Dilué à 10-3 Dilué à 10-4 C : Antibiotiques associés (de haut en bas) . A + B : 0,01 % de survivants, synergie . A + C : 0,01 % de survivants, synergie B : Antibiotiques isolés (de haut en bas) . A + D : 0,01 % de survivants, synergie : . B + C : 100 % de survivants, . Antibiotique A : 0,1 % de survivants antagonisme . Antibiotique B : 1 % de survivants . B + D : 0,1 % de survivants, synergie . Antibiotique C : 1 % de survivants (mais l'association est insuffisamment . Antibiotique D : 10 % de survivants bactéricide) . C + D : 0,1 % de survivants, synergie (mais l'association est insuffisamment bactéricide) Une même quantité de bouillon, ensemencé avec la souche bactérienne à étudier (106 bactéries / mL), est répartie dans une série de tubes disposés selon un "schéma triangulaire". Dans chaque tube, l'adjonction de disques pour antibiogramme permet de réaliser les concentrations désirées des antibiotiques à étudier, soit seuls, soit en associations. Ces concentrations sont comprises dans les limites des concentrations sériques efficaces établis pour chaque antibiotique. Après 24 heures d'incubation, chaque tube ne présentant pas de culture visible sert à effectuer la numération des survivants réalisée en milieu gélosé. Le pourcentage de germes survivants est déterminé par comparaison de la densité des colonies avec un témoin inoculum. L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 27 sur 29 Ø Technique par diffusion Deux techniques qualitatives permettent une évaluation, théoriquement simple, des effets bactériostatiques des associations : o Le placement rapproché de deux disques, à la surface d'un milieu gélosé, permet de détecter les synergies ou les antagonismes les plus nets (figure 6). Figure 5 Epreuve de synergie Avant d'effectuer le test d'association, on mesure le rayon de chacune des zones d'inhibition. Dans le test proprement dit, la distance entre les disques sera égale ou légèrement supérieure à la somme de ces rayons. L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 28 sur 29 o La disposition à angle droit de deux bandes de papier filtre imprégnées des solutions d'antibiotique permet, après observation de l'angle formé par la rencontre des deux zones d'inhibition, de déterminer l'effet de l'association (figure 7). Figure 7 : Disposition à angle droit. Ø Technique par diffusion avec transfert sur cellophane. Deux bandes de papier filtre imprégnées d'une solution d'antibiotique sont disposées à angle droit sur un milieu gélosé non ensemencé. Après diffusion des antibiotiques, les bandes sont enlevées et on dispose sur la gélose une cellophane préalablement ensemencée avec la souche bactérienne. Au cours de l'incubation, les bactéries se multiplient directement sur la cellophane, sauf dans les endroits où les concentrations en antibiotiques inhibent la croissance. Il est ainsi possible d'observer l'effet bactériostatique de l'association sur la souche bactérienne. La cellophane est ensuite transférée sur une gélose dépourvue d'antibiotique et après une nouvelle période d'incubation, on note la croissance des bactéries survivantes. La croissance ou l'absence de croissance dans les zones de diffusion et d'intersection après transfert permet d'évaluer l'activité bactéricide de chaque antibiotique et de leur association. L’antibiogramme DES bactério / été 2003 Page 29 sur 29
