Lire l'article complet

Dossier :
Génomique, recherche et thérapie en endocrinologie
Les apports de la transgenèse
dans la recherche biomédicale
L.M. Houdebine*
✎ Le séquençage complet des génomes
humains et murins offre des possibilités
sans précédent pour étudier le rôle des
gènes in vivo via la transgénèse.
✎ Les éléments qu’il faut ajouter dans
une construction pour obtenir une expression fiable du transgène sont de mieux
en mieux connus (introns, isolateurs, amplificateurs, stabilisateurs d’ARNm, etc.).
✎ Il est de plus en plus possible de cibler
l’intégration d’un gène et d’obtenir une
expression conditionnelle du transgène
contrôlé par des agents inducteurs
n’agissant pas sur les gènes de l’animal.
✎ L’interférence de l’ARN est utilisée
chez la drosophile et Caenorhabditis
elegans à la place de l’inactivation des
gènes par recombinaison homologue.
Ce protocole est actuellement étendu à
la souris et à d’autres vertébrés.
L’
étude des fonctions biologiques a commencé avec la description des organes,
de leur rôle, de leurs sécrétions, etc. Ces
approches étaient essentiellement physiologiques. Au fur et à mesure que cela a été possible, l’analyse des mécanismes qui contrôlent les fonctions biologiques a été faite au
niveau moléculaire.
* Unité de biologie du développement et
biotechnologies, Institut national de la
recherche agronomique, Jouy-en-Josas.
✎ L’inactivation systématique de tous les
gènes de la souris a été entreprise.
✎ La technique de clonage des embryons
par transfert de noyau a permis d’inactiver des gènes par recombinaison
homologue chez le mouton, la souris et
le porc. Cela devrait devenir possible
chez le lapin, le rat et quelques autres
espèces chez lesquelles le clonage sera
maîtrisé.
✎ Il existe des structures qui permettent
un examen systématique des souris,
notamment en utilisant les techniques
d’imagerie in vivo.
✎ La transgenèse permet d’utiliser le lait
comme source abondante de protéines
recombinantes pour en étudier les propriétés ou les utiliser à des fins thérapeutiques.
Les techniques du génie génétique apparues
dans les laboratoires il y a bientôt vingt ans
ont commencé à modifier la manière dont les
biologistes ont abordé l’étude des mécanismes
de régulation des fonctions. Il est en effet
devenu alors possible d’isoler quelques
gènes, ceux qui étaient les plus abondamment
exprimés ou dont on connaissait les protéines
pour lesquelles ils codaient. La simple description de la structure des gènes permet
d’établir des corrélations entre la structure
primaire de l’ADN et ainsi des protéines correspondantes et parfois avec l’activité bio-
logique de ces dernières. D’autres techniques,
permettant de procéder in vitro à des mutations de gène puis à réintroduire des mutants
dans des cellules, ont fait franchir un fossé
considérable entre la chimie des molécules
du vivant et leurs activités dans une cellule ou
un organisme entier.
Dans ce concert, le transfert de gène à un
organisme entier devait très logiquement
prendre une place essentielle. La transgenèse,
réussie pour la première fois chez les animaux en 1980, offre en effet la possibilité de
modifier précisément le patrimoine génétique
d’un organisme entier. Un pas supplémentaire a été franchi lorsqu’il est devenu possible non seulement d’ajouter une information génétique à un génome, mais aussi de
remplacer très précisément un de ses gènes
par un autre, qui peut être un mutant actif ou
inactif mais aussi bien un tout autre gène.
Cette opération a été réussie pour la première
fois en 1989.
Ces expériences pionnières ont indiqué sans
ambiguïté que les biologistes étaient sortis de
l’obligation de devoir attendre des mutations
spontanées pour pouvoir les étudier. Cette
approche a été et reste très fructueuse chez
les micro-organismes, les végétaux et certains animaux comme la drosophile dont la
reproduction est rapide et bien contrôlée. La
mutagenèse induite par des agents chimiques
est également très pratiquée chez ces espèces.
Elle augmente la fréquence des mutations et
offre donc un plus grand choix au biologiste
bien que celles-ci restent tout aussi aléatoires.
La mutagenèse induite par des agents chimiques a commencé à être appliquée à grande
échelle chez la souris. Cela n’a de sens que
parce que les moyens ont progressé. Les
chercheurs disposent d’animaleries très performantes qui permettent d’élever de très
nombreuses souris. Des méthodes d’investigation faisant appel, en particulier, à l’imagerie in vivo, permettent de faire un examen
systématique des mutants et d’orienter des
recherches approfondies par des laboratoires
spécialisés dans l’étude des fonctions ainsi
modifiées par la mutation. Une troisième
condition, tout aussi essentielle, est également
240
Act. Méd. Int. - Métabolismes - Hormones - Nutrition, Volume V, n° 6, novembre-décembre 2002
Dossier :
Génomique, recherche et thérapie en endocrinologie
satisfaite. La cartographie puis la séquence
du génome de souris ont été établies. Ces
données permettent au biologiste, dans le
meilleur des cas, d’établir une corrélation
entre l’effet phénotypique d’une mutation et
la structure mutée d’un gène. Ainsi peuvent
être identifiés des gènes impliqués dans le
déclenchement de maladies retrouvées chez
l’homme.
La transgenèse suit dans une certaine mesure
un parcours un peu semblable. Les souris
transgéniques sont de plus en plus soumises
à de multiples examens destinés à déterminer
les effets physiologiques des mutations apportées par le transfert de gène. Des projets en
cours visent à inactiver un maximum de
gènes de souris (et d’autres animaux expérimentaux comme la drosophile et un ver, le
Caenorhabditis elegans) pour dresser un
inventaire le plus complet possible du rôle
des gènes. Ces approches sont bien évidemment guidées par l’espoir de définir de nouvelles substances d’intérêt thérapeutique.
Les biologistes sont donc en train de vivre
une nouvelle révolution, après celle qu’a
constituée l’utilisation artisanale du génie
génétique dans les laboratoires. Cette révolution a pour fondement la rencontre de la
cartographie et du séquençage des génomes
d’une part ; la détermination du patron d’expression des gènes grâce à l’utilisation des
puces à ADN d’autre part et, enfin, l’obtention de mutants par action d’agents chimiques,
par introduction aléatoire de séquences étrangères (transposons, rétrovirus), par piégeage
de gène et par transgénèse.
C’est le caractère systématique et coordonné
de ces approches qui constitue la révolution
en question. Le biologiste se voit désormais
offrir une possibilité sans précédent d’étudier
au niveau moléculaire un maximum de mécanismes qui contrôlent les fonctions biologiques. L’étude des génomes au sens large
constitue donc, non pas le triomphe du réductionnisme comme certains le prétendent, mais
bien au contraire le début d’une tentative
d’étude des organismes vivants dans leur
entière complexité, en intégrant un maximum
d’informations.
Dans cette aventure, la transgenèse fait le lien
entre l’élément réduit qu’est le gène isolé et
ses effets biologiques dans le contexte complexe qu’est l’animal. Cela explique l’éclosion
d’ateliers publics et privés, dont la fonction
est d’obtenir en série des animaux transgéniques, et d’animaleries pour les abriter.
La transgenèse offre d’autres possibilités plus
directement appliquées, dont certaines sont
déjà devenues réalité. Dans le domaine médical,
les animaux transgéniques sont des modèles
sans précédent pour l’étude de certaines
maladies humaines et la mise au point de
médicaments. Il n’est pas impossible que des
cellules et certains organes de porc (cœur,
rein, foie, etc.) deviennent immunologiquement tolérés par des patients lorsque certains
gènes auront été transférés aux animaux. Il
est admis que le lait et le blanc d’œuf d’animaux transgéniques vont devenir une des
sources essentielles de protéines recombinantes pour des usages thérapeutiques. L’autre
grand domaine d’application de la biologie,
l’agroalimentaire, va également bénéficier
progressivement de la transgenèse, comme
cela est déjà le cas pour les plantes. Les éleveurs pourront ainsi résoudre des problèmes
en face desquels la sélection génétique est
impuissante.
Les techniques de transgenèse
Le nombre de laboratoires dans lesquels la
transgenèse animale est pratiquée de manière
courante reste limité à une bonne cinquantaine en France. Ce potentiel répond tout juste
aux besoins des chercheurs. La raison en est
clairement que la transgenèse comporte des
contraintes qui sont relativement dissuasives.
La méthode presque exclusivement utilisée
pour obtenir des souris transgéniques repose
sur la microinjection d’ADN dans le noyau
des embryons d’un jour. Le remplacement de
gène implique la manipulation de cellules ES
et de blastocystes, méhode bien plus lourde
encore. À cela, il faut ajouter le poids de la
mise à disposition d’animaleries conséquentes
et du personnel nécessaire pour prendre soin
des animaux.
L’utilisation des animaux transgéniques ne
pose par contre pas de difficultés particulières, même si des règles de biosécurité – qui
seront décrites plus loin – doivent être respectées. L’ensemble des techniques de transgènes sont décrites dans plusieurs livres
récents (1-3).
La construction des vecteurs
d’expression des transgènes
Dans la plupart des cas, l’expérimentateur ne
souhaite pas uniquement transférer un gène
natif mais bien une combinaison de promoteur de gène rapporteur, etc. Ces assemblages
ne posent pas de difficulté particulière puisqu’ils font appel aux techniques classiques du
génie génétique.
Une mention particulière doit toutefois être
faite pour les vecteurs comportant de longs
fragments d’ADN. Ces situations se rencontrent de plus en plus fréquemment. Il est en
effet parfois souhaitable d’introduire dans un
animal d’assez longs fragments d’ADN
génomique qui seuls contiennent l’ensemble
des éléments régulateurs d’un gène. Pour les
mêmes raisons, il est avantageux d’utiliser de
longs fragments d’ADN génomique, contenant l’ensemble des éléments régulateurs
d’un gène ou d’un locus, pour faire exprimer
un gène étranger. Cela suppose que le gène
en question ait été introduit précisément dans
un site du locus. Ces opérations ne peuvent
pas se faire dans un tube Eppendorf, comme
la construction classique de plasmides.
L’introduction d’un fragment d’ADN étranger dans un vecteur BAC (bacterial artifical
chromosome) de 50-300 kb ou un vecteur
YAK (yeast artifical chromosome) ne peut se
faire que par recombinaison homologue réalisée à l’intérieur d’une bactérie ou d’une
levure. Les meilleures techniques actuellement
utilisées dans ce but ont été résumées et commentées dans une publication récente (1).
La plus grande difficulté rencontrée pour
construire un vecteur d’expression pour un
transgène tient surtout dans le choix des éléments à assembler.
Les toutes premières expériences de transgénèse, puis de nombreuses autres qui ont suivi,
241
Act. Méd. Int. - Métabolismes - Hormones - Nutrition, Volume V, n° 6, novembre-décembre 2002
Dossier :
Génomique, recherche et thérapie en endocrinologie
ont révélé que les transgènes fonctionnent in
vivo de manière quelque peu imprévisible. Le
transgène est très peu actif, voire totalement
inactif, dans nombre de lignées. Le transgène
s’exprime, par ailleurs, plus ou moins dans
des tissus autres que celui dans lequel le promoteur utilisé est normalement actif.
Il est admis que ces événements sont dus à
des effets de position. La microinjection
introduit l’ADN étranger dans des sites très
variables du génome. La chromatine exerce
des effets stimulateurs ou inhibiteurs sur les
transgènes par l’intermédiaire d’amplificateurs ou de silenceurs qui se trouvent au voisinage de l’ADN intégré.
La réalité est en fait plus subtile. Le nombre
de cas où un transgène reste silencieux est
relativement élevé, ce qui laisse supposer que
la chromatine contient de nombreux silenceurs.
De nombreuses expériences démontrent qu’un
transgène a d’autant plus de chance de
s’éteindre qu’il contient un ADNc plutôt
qu’un fragment génomique comportant des
introns ou des séquences riches en CpG
(notamment de l’ADN d’origine bactérienne) et qu’il est intégré sous forme de
copies multiples (5, 6). Il semble donc que
les transgènes dont l’organisme ne peut pas
se débarrasser soient facilement éteints, vraisemblablement par des mécanismes qui inactivent les transposons et les rétrovirus. Il est
vraisemblable que l’inactivation des transgènes a lieu dès la vie embryonnaire précoce,
au moment où le génome se méthyle sélectivement et où sont définis les gènes qui resteront silencieux (7).
Pour éviter ces inconvénients, il est nécessaire de modifier les gènes pour réduire leur
contenu en CpG, d’ajouter des introns (au
moins un, plutôt devant l’ADNc) et surtout
d’ajouter des isolateurs de gènes devant le
promoteur (et éventuellement après le terminateur) (8), ou de longs fragments d’ADN
génomique contenant des isolateurs. Ces isolateurs sont constitués d’un ensemble d’éléments qui empêchent l’hétérochromatine
inactive de propager sa structure compacte
jusqu’au transgène et qui maintiennent la
chromatine dans une conformation ouverte.
Les ouvreurs de chromatine favorisent l’acétylation locale des histones H3 et H4 et s’opposent à leur méthylation ainsi qu’à la méthylation de l’ADN (9).
D’autres règles doivent être respectées pour
optimiser l’expression des transgènes. Les
codons peuvent être mutés pour être adaptés
au mieux à la cellule dans laquelle ils doivent
fonctionner. Un intron ajouté après un ADNc
ne doit pas être éloigné de plus de 50 bp du
codon de terminaison, sous peine de déclencher un mécanisme de destruction de l’ARNm,
mécanisme appelé NMD (non sense mediated
decay). Les ADNc ne doivent pas contenir des
régions 5’UTR (untranslated region) riches
en GC et hautement structurées. Les régions
3’UTR ne doivent pas contenir des séquences
riches en AU qui déstabilisent les ARNm.
Ces recommandations sont résumées dans un
chapitre du livre édité par C.A. Pinckert (10).
L’expression simultanée
de plusieurs transgènes
Pour exprimer simultanément deux gènes ou
ADNc, deux constructions indépendantes
peuvent être coinjectées. Elles seront cointé-
KRAB
promoteur
isolateur
– doxycycline
–
R
promoteur
L’expression conditionnelle
des transgènes
Un modèle biologique est d’autant plus intéressant que le transgène ne s’exprime que là
et lorsque l’expérimentateur le souhaite.
Plusieurs familles de vecteurs ont été définies
pour n’exprimer leur transgène que sous l’influence d’inducteurs exogènes n’agissant pas
sur les gènes de l’hôte. Le système tétracycline
est le plus utilisé. Une des versions les plus
sophistiquées est décrite dans la figure 1. La
souris doit exprimer simultanément trois
gènes : deux gènes régulateurs (KRAB et tet
on) et le gène d’intérêt. L’addition de doxycycline à l’eau de boisson des souris induit
réversiblement l’expression du gène d’intérêt.
Les deux régulateurs assurent un bruit de
fond très réduit et une bonne induction par la
doxycycline.
IRES
tet on
intron
KRAB
I
grées avec une fréquence de 70 % environ.
Une séquence IRES (internal ribosome entry
site) peut être introduite entre les deux ADNc
d’un gène bicistronique. L’utilisation des
IRES doit suivre des règles et il faut considérer que, dans la majorité des cas, les ADNc
sont moins bien exprimés que chacun d’entre
eux introduit dans un vecteur propre (11).
terminateur
I
A
R
R tet on
+ doxycycline
A
+
R
gène d'intérêt
pas d'expression
promoteur
gène d'intérêt
haute expression
Figure 1. Le contrôle des transgènes par la doxycycline. Des souris exprimant deux facteurs de transcription
KRAB et tet on sont croisées avec des souris portant le gène d’intérêt placé sous la dépendance des deux facteurs de transcription. En absence de doxycycline, le silenceur KRAB inhibe l’expression du gène d’intérêt.
En présence de doxycycline, le facteur tet on prend la place du facteur KRAB et stimule l’expression du gène
d’intérêt.
242
Act. Méd. Int. - Métabolismes - Hormones - Nutrition, Volume V, n° 6, novembre-décembre 2002
Dossier :
Génomique, recherche et thérapie en endocrinologie
Le remplacement de gènes
et l’intégration ciblée
Le remplacement de gènes et leur intégration
ciblée reposent sur un processus de recombinaison homologue. Ceux-ci sont peu fréquents.
Les cellules où le remplacement de gène a eu
lieu doivent être sélectionnées à l’aide de
vecteurs similaires à celui décrit dans la
figure 2.
Une construction de gène peut être ciblée
dans un site préalablement choisi du génome
dans lequel a été introduite une séquence
LoxP. La recombinase Cre permet au vecteur
possédant lui-même une séquence LoxP de
s’introduire dans le site LoxP du génome
(figure 3). Le remplacement de gène permet
de substituer un gène donné par des allèles
A
naturels ou définis par l’expérimentateur ou
par tout autre gène. Dans le premier cas, on a
le plus souvent réalisé l’invalidation du gène
(knock out) et, dans le second, une opération
désignée par knock in. Le ciblage par le système Cre LoxP permet d’introduire de multiples versions d’un gène dans le même site.
Cela limite les effets de position sur le transgène à ceux intrinsèques au site choisi.
L’inhibition d’un gène de l’hôte
Il est aussi important d’inhiber un gène endogène que d’apporter un gène supplémentaire
dans un génome. Cette démarche a plus de
chance de révéler le rôle d’un gène qui est
devenu manquant. L’invalidation de gène par
recombinaison homologue même optimisée
en la restreignant à un type cellulaire donné
et à une période précise de la vie de l’animal
est contraignante et elle présente l’inconvénient d’être irréversible. L’expression peut
être obtenue par des outils très différents qui
agissent aux diverses étapes de l’expression
génétique.
Les régions composées de polypurines (au
moins 20) peuvent former une triple hélice
stable avec un ADN ou un ARN simple brin
anticomplémentaire. Une telle triple hélice
s’oppose à la transcription du gène ciblé. Ce
système a fait ses preuves in vitro dans des
cellules en culture (12). Plusieurs tentatives
pour transposer cette technique chez les animaux transgéniques se sont soldées par des
échecs. Les animaux qui naissent ne sont pas
transgéniques ou n’expriment pas leur transgène. Cela suggère qu’un simple brin anticomplémentaire composé seulement de
purines reconnaît de multiples séquences du
génome et rend les embryons non viables.
Recombinaison homologue
Neo
ADN
génomique
TK
Vecteur de
recombinaison
isolateur
Lox P
isolateur
ADN
intégration génomique
au hasard
(G 418 r, ganc r)
isolateur Lox P isolateur
Neo
Lox P
B
Recombinaison hétérologue
Neo
TK
Vecteur de
recombinaison
ADN
génomique
Neo
TK
(G 418 r, ganc s)
Figure 2. Les vecteurs avec double sélection sont utilisés pour éliminer les cellules dans lesquelles une recombinaison illégitime (ou hétérologue) a eu lieu. Les régions homologues qui se recombinent sont indiquées par
des croix. Le gène neo confère la résistance des cellules au G 418 tandis que le gène TK est létal pour les cellules
mises en présence de ganciclovir. Les cellules ES ainsi sélectionnées sont introduites dans des blastocystes.
gène
d'intérêt
recombinase
Cre
Lox P
Lox P
isolateur gène d'intérêt isolateur
Figure 3. Principe de l’intégration ciblée d’un gène
en un site donné du génome. Un site LoxP contenant 35 paires de bases est introduit dans le génome
par recombinaison homologue, ou au hasard par
microinjection. Le site retenu peut recevoir une
construction de gène portant elle aussi un site
LoxP. La recombinase Cre est apportée dans l’embryon en coinjectant un plasmide circulaire exprimant le gène Cre et la construction à intégrer. Le
site LoxP peut avoir été bordé par un isolateur pour
réduire les effets de position des gènes intégrés dans
ce site.
243
Act. Méd. Int. - Métabolismes - Hormones - Nutrition, Volume V, n° 6, novembre-décembre 2002
Dossier :
Génomique, recherche et thérapie en endocrinologie
Des ARN antisens monocatenaires peuvent
en principe s’associer spécifiquement à un
ARNm et inhiber sa traduction. Un ARN
antisens est encore plus puissant lorsqu’il
contient un ribozyme qui clive l’ARNm ciblé.
Ces outils sont en pratique peu performants
car les deux partenaires ARNs complémentaires ne se rencontrent pas aisément dans
une cellule. Les ARNs sont souvent conformés en structure secondaire et associés à des
protéines qui s’opposent à une association
avec un autre ARN complémentaire. L’association d’une hélicase au ribozyme augmente
nettement son efficacité, qui peut être plus
élevée lorsqu’on choisit des régions de
l’ARNm cible qui sont sous forme monocatenaire (13).
La découverte récente de l’interférence de
l’ARN offre des perspectives particulièrement intéressantes chez les organismes pluricellulaires. De longs ARNs en double brin
( 300 bp) induisent une destruction sélective
et intense d’un ARN ayant une séquence
complémentaire. On sait maintenant que
l’ARN double brin est clivé en fragment de
21-23 paires de bases ayant 2-3 nucléotides
saillants en 3’OH. Ces structures ciblent
l’ARN correspondant et induisent une RNAse
qui détruit l’ARN (figure 4). Ce phénomène
permet en routine de cibler les ARNms chez
la drosophile ainsi que chez le Caenorhabditis
elegans via la transgenèse. Chez les vertébrés,
et notamment les mammifères, le phénomène
n’est pas observé aussi aisément. Les ARN
double brin de 30 bp ou plus induisent
l’interféron et un arrêt de la synthèse protéique. Des ARNs double brin synthétiques
de 21-23 bp transfectés dans les cellules inhibent parfaitement l’ARN ayant la même
séquence. Des expériences récentes ont montré que de tels ARNs pouvaient être synthétisés dans les cellules par des vecteurs transcrits par l’ARN polymérase III. C’est le cas
pour le promoteur du gène U6. Le transfert
de ces constructions de gène inhibe spécifiquement les ARNs cellulaires ou viraux. Ces
résultats établis avec des cellules devraient
pouvoir l’être également in vivo via la transgénèse.
géne codant pour
un ARN double brin
plasmide
transfection
ou injection
d’une protéine mutante exerçant un effet
leurre sur ses partenaires cellulaires peut
inhiber les effets de la protéine normale. De
telles protéines leurres sont pour cette raison
appelées “transdominants négatifs”. Les vecteurs conventionnels permettent une surexpression de tels gènes.
Les applications biologiques
et médicales de la transgenèse
RNAse
ARNm
RNAse
transfection
ou injection
transfection
ou injection
ARN double brin
Figure 4. Inhibition de l’expression d’un gène par
l’interférence de l’ARN. Un ARN double brin d’au
moins 300 bp est clivé en fragments qui ciblent
l’ARN cellulaire correspondant, ou le dégradent.
Les ARN interférents de 21-23 bp peuvent être
introduits dans les cellules par transfection ou
microinjection ou être synthétisés par des vecteurs
appropriés, notamment celui du gène de l’ARN U6
qui est transcrit par l’ARN polymérase III.
Le mécanisme d’interférence de l’ARN peut
être un des moyens de contrôler l’expression
des gènes cellulaires. Il semble que ce soit
aussi un moyen de défense contre des
génomes viraux. Pour l’expérimentateur, les
ARNi (double brin ayant un effet interférent)
représentent un équivalent plus simple et plus
souple que l’inactivation de gène par recombinaison homologue pour arrêter l’expression
d’un gène.
La dernière étape de l’expression génétique
sur laquelle l’expérimentateur peut agir est la
protéine elle-même. L’expression intense
Comme il vient d’être mentionné, la transgenèse permet de créer toutes sortes de
mutants conditionnels qui apportent aux
expérimentateurs des outils incomparables
pour décrypter les mécanismes cellulaires les
plus variés. La transgenèse permet également
l’obtention de modèles pour l’étude de maladies humaines que n’autorise pas le simple
élevage de souris.
Les modèles animaux pour l’étude
des maladies humaines
Obtenir un modèle animal pertinent pour
l’étude d’une maladie humaine n’est pas une
chose aussi simple qu’il y paraît. Des lignées
de souris transgéniques peuvent souvent ne
mimer que très partiellement la maladie. C’est
notamment le cas des cancers. Il est admis
qu’une tumeur dérive d’une seule cellule qui
a subi toutes les mutations des oncogènes et
des antioncogènes qui caractérisent la cellule
cancéreuse. Ces mutations et leurs combinaisons sont multiples. La souris transgénique
n’est que rarement aussi subtile. Un système
permettant une activation aléatoire et donc
monoclonale du gène K-ras a permis d’obtenir
des souris transgéniques reflétant mieux que
les précédentes le cancer de la vessie.
Les maladies résultant d’une dégénérescence
cellulaire sont multifactorielles et se développent lentement. Divers modèles de souris
pour l’étude de la maladie d’Alzheimer ont
ainsi pu être obtenus. Ces animaux permettent
une description satisfaisante de la maladie
mais aussi la mise au point de nouvelles substances chimiques qui sont autant de médicaments candidats.
244
Act. Méd. Int. - Métabolismes - Hormones - Nutrition, Volume V, n° 6, novembre-décembre 2002
Dossier :
Génomique, recherche et thérapie en endocrinologie
Bien peu de choses auraient été comprises sur
les maladies à prions si les expérimentateurs
n’avaient disposé de souris transgéniques. La
spécificité d’espèce et ses limites ont ainsi pu
être évaluées. Des modèles pertinents existent
désormais pour mesurer in vivo le pouvoir
infectieux d’extraits cellulaires provenant de
vaches atteintes de l’encéphalopathie spongiforme.
Les modèles cellulaires pour l’étude de la
mucoviscidose existent, à l’inverse des modèles
animaux. Les souris dont le gène CFTR a été
muté ne souffrent que très partiellement de la
maladie. Un canal ionique actif dans le poumon vient compenser l’effet de la mutation.
Des moutons et des lapins ayant le gène
CFTR muté sont en cours de préparation,
avec l’espoir d’obtenir un modèle satisfaisant.
L’avancée des connaissances sur les mécanismes de l’athérosclérose nécessite l’étude
de multiples gènes, notamment ceux des apolipoprotéines. La majeure partie des souris
transgéniques qui pouvaient être obtenues
dans ce domaine l’ont été. Elles ont apporté
des informations précieuses mais dont l’intérêt est limité par le fait que la souris est très
peu sensible au cholestérol. Le lapin est,
de ce point de vue, un bien meilleur modèle.
L’addition des principaux gènes humains
concernés a pu être réalisée chez le lapin, à
l’inverse de l’inactivation de ses propres gènes.
L’étude de plusieurs maladies infectieuses a
été rendue possible en transférant aux souris
des gènes permettant aux pathogènes humains
d’infecter les cellules de souris normalement
résistantes.
Le nombre d’exemples dans ce domaine pourrait être multiplié (tableau). Ils montreraient
encore plus la diversité et l’efficacité de cette
approche mais aussi ses limites. Parmi cellesci il faut ajouter, à l’inadéquation de l’animal
expérimental en tant que tel dans certains cas,
d’autres problèmes plus sournois. Le fond
génétique peut avoir un effet très notable et
faire perdre de son intérêt au modèle. De
nombreuses lignées sont disponibles chez la
souris mais toutes ne se prêtent pas aussi bien
à l’addition de gène. Deux seulement se prê-
tent au replacement de gène via les cellules ES.
Les expérimentateurs peuvent être contraints
de transférer la mutation intéressante par
croisement, ce qui est long, coûteux et frustrant. La diversité des lignées est beaucoup
plus faible chez le lapin. Cela conduit parfois
à une très grande hétérogénéité des animaux
de chaque lignée, rendant difficile l’exploitation du modèle. C’est notamment le cas pour
l’athérosclérose. La multiplication par clonage
des animaux transgéniques a été envisagée et
réalisée. Elle a fait preuve de sa pertinence
mais reste d’une utilisation de routine difficile
tant que le clonage restera une technique aussi
complexe.
L’état sanitaire des animaux joue un rôle
essentiel sur certains modèles. L’utilisation
d’emblée d’animaux dont le statut sanitaire
est bien contrôlé est souhaitable. À défaut,
une purification des lignées par césarienne
est possible, mais longue, coûteuse et non
maîtrisée par tous les groupes.
mental. Plusieurs dizaines d’entre elles ont
été secrétées à des concentrations dépassant
1 mg/ml de lait. De petites productions de
protéines (10-100 mg) peuvent être obtenues
à partir du lait de lapin pour des études structurales et biologiques, notamment précliniques, des protéines et de certains de leurs
mutants. Ces études préliminaires peuvent
justifier une production à l’échelle industrielle. Le lapin peut fournir plusieurs dizaines
de kilos par an d’une protéine recombinante.
Des petits ruminants (chèvre, mouton) ou la
vache sont nécessaires pour des productions
devant atteindre plusieurs centaines de kilos
par an. L’α-glucosidase humaine, obtenue à
partir du lait de lapin, a ainsi permis à des
enfants atteints de la maladie de Pompe de
survivre lors d’essais cliniques de phase II.
Plusieurs protéines, notamment des anticorps
monoclonaux, sont actuellement en cours
d’essai de phase II ou III (15).
La préparation de protéines
recombinantes
La transgenèse est un des moyens permettant
de préparer des protéines recombinantes
ayant subi l’essentiel des modifications posttraductionnelles, notamment les glycosylations. Le lait est une source de telles protéines.
Environ deux cents protéines recombinantes
ont été produites dans du lait à titre expéri-
L’utilisation du porc comme source de cellules et d’organes utilisables dans l’espèce
humaine reste un espoir en dépit des nombreuses difficultés à vaincre (16). La transgenèse joue là un rôle double. Elle permet, sur
divers modèles animaux, d’inhiber les mécanismes de rejet. Elle est indispensable pour
créer les lignées de porcs qui portent des
gènes. Des porcs transgéniques exprimant les
La xénogreffe
Tableau. Modèles d’animaux transgéniques pour l’étude de maladies humaines.
Maladies
gènes
listériose
E-cadherine
références
Lecuit et al. Science 2001 ; 292 : 1722-5.
sida
génome de HIV
Reid et al. Proc Natl Sci USA 2001 ; 98 : 9271-6.
rougeole
CD46
Fausto et al. Nature Med 2001 ; 7 : 890-1.
Creutzfeld-Jakob
PrP
Prusiner et al. Cell 1998 ; 93 : 337-48.
Alzheimer
ADP
Lewis et al. Science 2001 ; 293 : 1487-91.
Parkinson
α-synuclein
Betarbet et al. Bioessays 2002 ; 24 : 308-18.
Huntington
huntingtin
Rubinsztein. Trends Genet 2002 ; 18 : 202-9.
vieillissement
XPA
De Boer et al. Science 2002 ; 296 : 1276-9.
athérosclérose
apoliprotéines
Brousseau et Hoeg. J Lipid Res 1999 ; 40 : 365-75.
obésité
plusieurs gènes
Brockman et Bevova. Trends Genet 2002 ; 18 : 367-76.
cancer
K-ras
Johnson et al. Nature 2001 ; 410 : 1111-6.
diabète
plusieurs gènes
Hribal et al. J Physiol Endocrinol Metab 2002 ; 282 : 977-981.
245
Act. Méd. Int. - Métabolismes - Hormones - Nutrition, Volume V, n° 6, novembre-décembre 2002
Dossier :
Génomique, recherche et thérapie en endocrinologie
gènes DAF et CD59 humains ont été obtenus
dans divers endroits du monde, y compris en
France. Les cœurs et les reins de ces animaux
sont maintenus fonctionnels plusieurs jours
chez des singes, sans être rejetés par le complément qui se trouve localement inhibé par
la présence des protéines DAF et CD59
humains à la surface des cellules des greffons. Plus récemment, deux équipes ont
simultanément obtenus des porcs transgéniques chez lesquels le gène de l’α-1,3 galactosyl transférase a été inactivé par recombinaison homologue. Des cellules ES capables
de participer au développement des gonades
après avoir été transférées dans des blastocystes n’ont été obtenues à ce jour que chez
la souris. Pendant des années, l’utilisation de
la recombinaison homologue chez les animaux a, pour cette raison, été cantonnée à la
souris. La possibilité de reconstituer des
embryons viables clonés par transfert de
noyau de cellules somatiques génétiquement
modifiées a changé cette perspective. Des
remplacements de gènes ont ainsi été obtenus
chez le mouton, la souris et le porc en mettant
en œuvre ces techniques.
Les porcs dépourvus du gène de l’α-1,3 galactosyl transférase ne devraient pas avoir le
motif Gal-1,3 Gal associé aux protéines de la
surface de leurs cellules. Ce motif est le plus
puissant antigène induisant le rejet par le
complément. Son absence attendue pour la
mutation chez les porcs homozygotes (qui
devraient être disponibles prochainement)
devrait nettement atténuer le rejet des organes
porcins par les primates.
D’autres gènes seront nécessaires pour
contrôler l’ensemble des mécanismes de rejet
des organes porcins par les patients.
Conclusion
L’utilisation des animaux transgéniques
devrait logiquement s’amplifier au cours des
dix prochaines années, au moins grâce à la
disponibilité de l’ensemble des gènes humains
et murins que nous procure le séquençage
complet des génomes. Le nombre d’ateliers
propres à certains laboratoires va augmenter,
mais un relais est déjà pris par ceux des instituts publics qui mettent leur savoir-faire à la
disposition des chercheurs dans des conditions avantageuses. Les entreprises qui réalisent à façon la transgenèse, y compris le remplacement de gènes, se multiplient elles aussi.
Le rat, le lapin et le porc, qui seront toujours
beaucoup moins utilisés que la souris, suivent
la même tendance. Une entreprise des ÉtatsUnis propose de préparer des drosophiles
transgéniques. L’utilisation d’autres techniques que la microinjection va probablement
simplifier et banaliser encore plus la transgenèse. C’est le cas notamment de l’utilisation
de transposons (17), de vecteurs rétroviraux
(18) qui apportent leurs gènes aux embryons,
mais aussi du transfert d’ADN dans les spermatozoïdes (19, 20, 21).
L’exploitation des animaux transgéniques ne
pose pas de problème particulier. Ces animaux
doivent être maintenus dans des conditions
de confinement strictement définies par la
Commission de génie génétique.
La communauté scientifique doit également
faire face à un problème récurent qui est celui
du bien-être animal. L’opinion publique, souvent mal informée, voire désinformée, s’imagine parfois qu’un animal transgénique est un
monstre soumis à des souffrances intolérables.
La réalité est bien différente. Il suffit de visiter
une animalerie pour s’en convaincre. Diverses
instances ont tenté et cherchent encore à définir
une conduite acceptable par tous dans ce
domaine (22). La France, après bien d’autres
pays en Europe, a créé des comités d’éthique
pour examiner, entre autres, les protocoles
impliquant l’utilisation des animaux transgéniques. Les expérimentateurs se doivent de
coopérer pour que cette nouvelle manière
d’envisager l’expérimentation animale fasse
rapidement partie de la culture des laboratoires.
Références
1. Clarke AR. Transgenesis techniques.
Principles and protocols (second ed.). Methods
in molecular biology. Human Press, 2002 : 180.
2. Pinkert CA. Transgenic animal technology
(second ed.). Academic Press, 2002.
3. Houdebine LM. Transgénèse animale et
clonage. Paris : éditions Dunod, collection
Biotech. Info, 2001.
4. Giraldo P, Montoliu L. Size matters : use of
YACs, BACs and PACs in transgenic animals.
Transgenic Res 2001 ; 10 : 83-103.
5. Cohen-Tannoudji M, Vandormael-Pournin S,
Drezen J et al. LacZ sequences prevent regulated expression of housekeeping genes. Mech
Dev 2000 ; 90 : 29-39.
6. Montoliu L, Chavez S, Vidal M. Variegation
associated with lacZ in transgenic animals : a
warning note [letter] [in process citation].
Transgenic Res 2000 ; 9 : 237-9.
7. Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes & Dev 2002 ; 16 : 6-21.
8. Taboit-Dameron F, Malassagne B, Viglietta C
et al. Association of the 5’HS4 sequence of the
chicken beta-globin locus control region with
human EF1 alpha gene promoter induces
ubiquitous and high expression of human
CD55 and CD59 cDNAs in transgenic rabbits.
Transgenic Res 1999 ; 8 : 223-35.
9. Mutskov VJ, Farrell CM, Wade PA et al. The
barrier function of an insulator couples high
histone acetylation levels with specific protection of promoter DNA from methylation.
Genes & Dev 2002 ; 16 : 1540-54.
10. Houdebine LM, Attal J, Vilotte JL. Vector
design for transgene expression. In : Transgenic
animal technology (second ed.). Carl A. Pinkert
Ed. San Diego : Academic Press 2002 ; 419-58.
11. Houdebine LM, Attal J. Internal ribosome
entry sites (IRESs) : reality and use. Transgenic
Res 1999 ; 8 : 157-77.
12. Upegui-Gonzalez LC, Francois JC, Ly A,
Trojan J. The approach of triple helix formation in control of gene expression and the
treatment of tumors expressing IGF-I. Adv Exp
Med Biol 2000 ; 465 : 319-32.
13. Kawasaki H, Taira K. Identification of
genes by hybrid ribozymes that couple cleavage activity with the unwinding activity of an
endogenous RNA helicase. EMBO Rep 2002 ;
3 : 443-50.
14. Tuschl T. Expanding small RNA interference.
Nat Biotechnol 2002 ; 20 : 446-8.
15. Houdebine LM. Transgenic animal bioreactors. Transgenic Res 2000 ; 9 : 305-20.
246
Act. Méd. Int. - Métabolismes - Hormones - Nutrition, Volume V, n° 6, novembre-décembre 2002
Dossier :
Génomique, recherche et thérapie en endocrinologie
knock-out and transgenesis techniques for animal research. Handbook of molecular genetic
techniques for brain and behavior research
ED. W.E. Crusio, RT. Gerlai Eds. Elsevier,
1999 ; 13 : 936-948.
21. Nagano M, Brinster CJ, Orwig KE et al.
Transgenic mice produced by retroviral transduction of male germ-line stem cells. Proc
Natl Acad Sci USA 2001 ; 98 : 13090-5.
22. Houdebine LM. Ethical implications of
a
u
t
o
-
1. Vrai ou faux :
Il est aisé d’obtenir des modèles pertinents mimant les maladies humaines.
t
e
s
t
3. Vrai ou faux :
Est-il nécessaire de préparer soi-même
ses animaux transgéniques ou ne vautil pas mieux coopérer avec des
groupes qui maîtrisent les techniques
ou faire le travail à façon par des
entreprises spécialisées ?
4. Vrai ou faux :
La transgenèse est toujours responsable d’un mal-être pour l’animal ?
2. Vrai ou faux :
Suffit-il d’associer un promoteur, un
ADNc et un terminateur de transcription
pour obtenir une bonne expression
d’un transgène comme cela est le cas
pour les cellules en culture ?
Résultats : 1. faux 2. faux. 3. vrai. 4. faux
16. Houdebine LM, Weill B. The impact of
transgenesis and cloning on cell and organ
xeotrasplantation to humans. ECS 9 Brussels
1999. Focus on Biotechnology.
17. Dupuy AJ, Clark K, Carlson CM et al.
Mammalian germ-line transgenesis by transposition. Proc Natl Acad Sci USA 2002 ; 99 :
4495-9.
18. Lois C, Hong EJ, Pease S et al. Germline
transmission and tissue-specific expression of
transgenes delivered by lentiviral vectors.
Science 2002 ; 295 : 868-72.
19. Qian J, Chang K, Jiang M et al. Generation
of transgenic pigs by sperm-mediated gene
transfer using a linker protein (mAbC).
Transgenic animal research conference III,
Tahoe City, California. Abstract DD. Transgenic
Res 2002 ; 11 : 92.
20. Qian J, Liu Y, Jiang M et al. A novel and
highly effective method transgenic mice and
chickens : linker based sperm-mediated gene
transfer. Transgenic animal research conference III, Tahoe City, California. Abstract CC.
Transgenic Res 2002 ; 11 : 92-3.
✂
À découper ou à photocopier
O UI,
JE M’ABONNE AU BIMESTRIEL M é t a b o l i s m e s - H o r m o n e s - N u t r i t i o n
Merci d’écrire nom et adresse en lettres majuscules
❏ Collectivité .................................................................................
ABONNEMENT : 1 an
ÉTRANGER (AUTRE
FRANCE/DOM-TOM/EUROPE
❐
❐
❐
à l’attention de ..............................................................................
74 € collectivités
59 € particuliers
37 € étudiants*
❐
❐
❐
*joindre la photocopie de la carte
❏ Particulier ou étudiant
*joindre la photocopie de la carte
+
M., Mme, Mlle ................................................................................
Prénom ..........................................................................................
QU’EUROPE)
94 € collectivités
79 € particuliers
57 € étudiants*
ET
POUR
10 €
DE PLUS !
❐ 10 €, accès illimité aux 26 revues de notre groupe de presse disponibles sur notre
site vivactis-media.com (adresse e-mail gratuite)
Pratique : ❏ hospitalière
❏ libérale
❏ autre ..........................
Adresse e-mail ...............................................................................
+
RELIURE
❐ 10 € avec un abonnement ou un réabonnement
Adresse postale .............................................................................
Total à régler
......................................................................................................
MODE
Code postal ........................Ville ……………………………………
❐ carte Visa, Eurocard Mastercard
Pays................................................................................................
Signature :
Tél..................................................................................................
❐ chèque (à établir à l'ordre de Métabolismes-Hormones-Nutrition)
❐ virement bancaire à réception de facture (réservé aux collectivités)
Merci de joindre votre dernière étiquette-adresse en cas de réabonnement,
changement d’adresse ou demande de renseignements.
DE PAIEMENT
..........
À remplir par le souscripteur
€
Date d’expiration
DaTeBe - 62-64, rue Jean-Jaurès - 92800 Puteaux
Tél. : 01 41 45 80 00 - Fax : 01 41 45 80 25 - E-mail : [email protected]
MHN vol. VI - No 6
N°