Du nouveau pour le cancer de la thyroïde ! dossier thématique Modèles animaux du cancer papillaire de la thyroïde Animal models of papillary thyroid cancers Camille Buffet* Mouse models of Papillary Thyroid Cancer (PTC) are valuable tools in elucidating the role in the initiation and/or tumor progression of activating-mutations of genes encoding effectors of the Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) pathway (RET/PTC rearrangement, activating-point mutations of Ras or B-Raf ). (CPT) ont permis de valider le rôle dans l’initiation et/ou la progression tumorale des altérations génétiques de la voie MAPK (réarrangement RET/PTC, mutation activatrice des oncogènes Ras et B-Raf ) identifiées dans environ 70 % des CPT. »»Les modèles animaux existants sont principalement les souris transgéniques et les souris immunodéficientes ayant reçu une xénogreffe de tissus ou de lignées cellulaires de CPT humains en position orthotopique. »»Aucun modèle ne reproduit pleinement tous les aspects du CPT. »»Ces modèles sont intéressants pour tester de nouveaux agents anticancéreux, avant leur utilisation chez l’être humain. Highlights p o i nt s f o rt s »»Les modèles murins de cancer papillaire de la thyroïde Mots-clés : Xénogreffe – Souris transgéniques – Voie MAPK – Cancer papillaire – Modèles animaux. P * Institut Cochin, département endocrino­ logie métabolisme et cancer, équipe tumeurs endocrines et signalisation, Paris. 190 armi les différents types histologiques de cancers de la thyroïde, les cancers différenciés de type papillaire, développés à partir des cellules épithéliales folliculaires, sont les plus fréquents (80 % de tous les cancers de la thyroïde) et leur incidence ne cesse d’augmenter depuis plusieurs décennies. Les autres cancers développés à partir des cellules folliculaires (vésiculaire, peu différencié et anaplasique) représentent moins de 15 % de tous les cancers thyroïdiens. Les anomalies de la voie Mitogen Activated Protein kinase (MAPK) jouent un rôle clé dans la pathogenèse des cancers papillaires de la thyroïde (CPT). Des anomalies moléculaires conduisant à une activation constitutive de cette voie sont identifiables dans environ 70 % des CPT. Les 3 principales altérations génétiques caractérisées dans les CPT sont (figure 1) : ✓✓ les réarrangements chromosomiques de type RET/ PTC (≃ 20 %) ; ✓✓ les mutations ponctuelles des isoformes de Ras : H-Ras, N-Ras ou K-Ras (≃ 10 %) ; Most animal models of PTC are genetically engineered mouse models of thyroid cancer and xenografts of human thyroid tumor tissue or immortalized thyroid carcinoma cell lines into Severe Combined ImmunoDeficient (SCID) mice. None of these models are fully satisfactory. These models are useful for testing novel anticancer agents prior to use in humans. Keywords: Xenograft – Transgenic mice – MAPK pathway Papillary thyroid cancer – Animal models. ✓✓ les mutations activatrices de l’oncogène B-Raf, événement génétique le plus fréquent dans les CPT, retrouvé dans 40 à 50 % des cas. Ces mutations sont spécifiques des carcinomes papillaires, peu différenciés et anaplasiques, à l’exclusion des carcinomes vésiculaires. La mutation retrouvée de façon quasi exclusive est de type B-RafV600E, rendant la kinase constitutivement active. Dans les CPT, ces événements moléculaires sont le plus souvent mutuellement exclusifs : une seule anomalie est présente au sein d’un carcinome et suffit à activer la voie de façon constitutive. Les modèles animaux des cancers papillaires ont conduit à mieux comprendre les conséquences de ces anomalies moléculaires sur le phénotype tumoral et son comportement clinicobiologique. De plus, ils permettent d’évaluer l’intérêt de thérapies ciblées (de type inhibiteur de tyrosine kinase, comme par exemple le sorafénib, qui inhibe l’oncogène B-Raf ), en présence d’un oncogène spécifique. Nous aborderons dans cette revue de la littérature les Correspondances en Métabolismes Hormones Diabètes et Nutrition - Vol. XVI - n° 7 - septembre 2012 Modèles animaux du cancer papillaire de la thyroïde différents modèles de CPT et leurs principaux apports. Les différentes stratégies utilisées sont : ✓✓ la xénogreffe de tissus ou de lignées cellulaires de cancer thyroïdien humain chez des souris ayant un déficit immunitaire combiné sévère (souris SCID) ou des souris Nude (athymique), essentiellement en position orthotopique ; ✓✓ les souris transgéniques. Voie MAPK RET/PTC 20 % Le modèle de choix est celui des xénogreffes orthotopiques. En raison de leurs nombreuses limites, les xénogreffes de tissus ou de lignées cellulaires de CPT humains sous-cutanées sont moins utilisées pour l’étude des CPT (tableau I). De façon générale, ces 2 modèles ont comme limite : ✓✓ de ne pas permettre d’étudier l’interaction entre la tumeur et le système immunitaire ; ✓✓ la survenue spontanée fréquente de multiples lésions néoplasiques. Les avantages et les inconvénients spécifiques de ces modèles sont résumés dans le tableau I. Ahn et al. (1) ont montré que l’injection orthotopique chez des souris Nude de lignées cellulaires de PTC humain porteuses d’une mutation B-RafV600E ou d’un réarrangement RET/PTC1 était techniquement faisable et bien tolérée par l’animal. Les xénogreffes réalisées ont permis d'obtenir, avec une bonne efficacité, des CPT reproduisant certaines caractéristiques des CPT humains (invasion locale, survenue de métastases ganglionnaires et pulmonaires, présence de composantes peu différenciées ou indifférenciées pour les tumeurs B-RafV600E). Cependant, la détection clinique des tumeurs à un stade précoce était difficile en raison de la profondeur de leur localisation cervicale. Pour remédier à ce problème, l’équipe de M. Bouvet (2) a créé un modèle murin de CPT et de cancer anaplasique par xénogreffe orthotopique de lignées cellulaires humaines fluorescentes (marquage des cellules avec la Green ou Red Fluorescent Protein). Cette technique a permis de détecter précocement les tumeurs et les micrométastases pulmonaires grâce à une imagerie non invasive détectant la fluorescence. H-RasV12 P 10 % B-RafV600E P MEK MEK P + – P 45 % ERK P ERK Xénogreffes de souris immunodéficientes Boucle de régulation P DUal Specificity Cytoplasme Phosphatase P ERK DUSP6 P ERK P P Dédifférenciation Prolifération Noyau (DUSP) – DUSP5 Figure 1. Schéma de la voie des MAPK et des principaux oncogènes impliqués dans le développement des CPT. Tableau I. Avantages et inconvénients des xénogreffes de souris immunodéficientes. Souris SCID ou Nude + Xénogreffe sous-cutanée Xénogreffe orthotopique – • Implantation tumorale dans un microenvironnement artificiel qui ne reproduit pas l’interaction entre les cellules tumorales et l’environnement natif • Survenue rare de métastases ganglionnaires et pulmonaires • Reproduit l’interaction entre les cellules tumorales et l’environnement natif • Permet d’étudier le potentiel métastatique de la tumeur initiale • Reproduit la morbidité liée à la croissance de la tumeur (compression trachéale, œsophagienne) Ne reproduit pas les stades prénéoplasiques Souris transgéniques Réarrangement chromosomique RET/PTC1 Les modèles murins ont montré de façon constante que le réarrangement RET/PTC était un événement précoce, capable d’initier la carcinogenèse thyroïdienne. Tous les modèles conçus, exprimant RET/PTC1 sous contrôle du promoteur de la thyroglobuline (Tg) bovine (3, 4) ou de rat (5), conduisent à l’apparition de CPT. Néanmoins, leur potentiel invasif est faible, ce qui suggère que la survenue d’autres événements est nécessaire pour permettre la progression tumorale, comme la perte du gène suppresseur de tumeurs p53 (6). Les principales caractéristiques des modèles murins transgéniques et la comparaison avec les tumeurs humaines sont résumées dans le tableau II, p. 192. Réarrangement chromosomique RET/PTC3 Les souris transgéniques RET/PCT3 développent tout comme l’homme, des CPT de forme solide, avec des Correspondances en Métabolismes Hormones Diabètes et Nutrition - Vol. XVI - n° 7 - septembre 2012 191 Du nouveau pour le cancer de la thyroïde ! dossier thématique Tableau II. Modèles de souris transgéniques : résumé des caractéristiques et comparaison avec les cancers humains. Modèle Morphologie tumorale Principe Homme Souris RET/PTC1 Expression du transgène sous contrôle du promoteur de la thyroglobuline (Tg) bovine ou de rat CPT classique CPT classique ± anaplasique RET/PTC1 + p53-/- Idem + croisement avec des souris p53-/- CPT et cancer anaplasique CPT et cancer anaplasique RET/PTC3 Expression du transgène sous contrôle du promoteur de la Tg bovine - CPT classique ou variant solide - Rarement peu différencié ou anaplasique CPT ± variant solide - Inv - M1 RET/PTC3 + p53-/- Idem + croisement avec des souris p53-/- CPT et cancer anaplasique - CPT classique ou variant solide - Secteur peu différencié ou anaplasique fréquent Pote (loc B-RafV600E Expression du transgène sous contrôle du promoteur de la Tg bovine ± inductible par la doxycycline - CPT classique, à cellules hautes - Cancer peu différencié ou anaplasique CPT classique, à cellules hautes ± secteur anaplasique - Inv - Év siqu de d Knock-in de B-RafV600E - CPT classique, à cellules hautes - 0 anaplasie c-Ha-Ras Expression du transgène sous contrôle du promoteur de la Tg CPT de variant vésiculaire ± cancer peu différencié ou anaplasique H-RasG12V Knock-in de H-RasG12V exprimé sous le contrôle de son propre promoteur Pas de CPT K-RasG12D Knock-in de K-RasG12D (expression dans la thyroïde induite par le tamoxifène) Pas de CPT TRK-T1 Expression du transgène sous contrôle du promoteur de la Tg bovine CPT ± cancer peu différencié ou anaplasique CPT classique ou pas de cancer (pour une des lignées) Carcinomes avec papilles (pas d’anomalies nucléaires typiques) ± variant solide hypoT : hypothyroïdie ; peu diff. : peu différencié ; NR : non rapporté ; c-Ha-Ras : human activated Ras. métastases ganglionnaires dans environ 2/3 des cas, sans métastases à distance. L’analyse de la tumorigenèse chez des souris RET/PTC3p53-/- révèle un rôle important de la perte d’expression de p53 pour la progression du CPT vers des stades peu différenciés et/ou anaplasiques. Oncogène B-RafV600E Il existe 4 modèles différents de souris transgéniques porteuses de l’oncogène B-RafV600E : ✓✓ expression de l’oncogène B-RafV600E sous le contrôle du promoteur de la Tg bovine, de façon inductible (7) ou non (8) par la doxycycline, pour induire une surexpression du transgène ; ✓✓ knock-in de B-RafV600E dans les thyrocytes, en croisant des souris ayant un allèle B-RafV600E latent avec des souris exprimant une recombinase Cre sous le contrôle du promoteur de la thyroperoxydase (TPO) [9]. L’expression de la 192 recombinase Cre, liée à l’activité du promoteur de la TPO, n’apparaît qu’à partir du 14e jour de vie embryonnaire. Ce modèle de souris transgénique va permettre l’expression de l’oncogène sous le contrôle de son propre promoteur, et cela de façon spécifique dans les thyrocytes ; ✓✓ knock-in de B-RafV600E, selon le même principe que précédemment, hormis le fait que la recombinase Cre est sous le contrôle d’un promoteur (toujours celui de la TPO), inductible par le tamoxifène (10). L’avantage de ce système est de permettre un contrôle de l’expression de B-RafV600E dans l’espace (la thyroïde) et le temps (expression uniquement après administration de tamoxifène). Tous ces modèles murins permettent le développement de CPT récapitulant les caractéristiques clés de la pathologie humaine : CPT de forme classique, variant à cellules hautes, composante anaplasique, invasion locale. Néanmoins, aucun ne reproduit la survenue de Correspondances en Métabolismes Hormones Diabètes et Nutrition - Vol. XVI - n° 7 - septembre 2012 ± In ±N ±M Cap Pote (loc ± In ±N ±M ± Év peu e s Modèles animaux du cancer papillaire de la thyroïde Signes d’agressivité Homme Trouble hormonal Souris Homme Souris Références ± Invasion locale ± N1 ± M1 Capacité à concentrer l’iode Potentiel invasif +++ (local, N1, M1) Invasion locale limitée 0 hypoT (3-5) - Invasion locale - 0 N1 - 1 M1 hépatique d’un cancer anaplasique 0 hypoT (6) - Invasion locale et N1 fréquents - M1 + rare - Invasion locale - rare N1 (< 10 %) - 0 M1 (sauf si croisement avec des souris p53-/-) 0 NR (11) Potentiel invasif +++ (local, N1, M1) Invasion locale et à distance rare 0 NR (12) - Invasion locale et N1 fréquents - Évolution vers cancer anaplasique avec perte des marqueurs de différenciation - Invasion locale ± N1 - 0 M1 - expression des marqueurs de différenciation 0 TSH T4L N (7, 8) 0 TSH T4L (9, 10) ± Invasion locale ± N1 ± Métastase à distance ± Invasion locale - Rares métastases pulmonaires (diagnostic histologique incertain) 0 0 (9) - 0 0 (13) - 0 0 (10) - Pas d’évolution vers cancer peu différencié - 0 N1 - 0 M1 0 NR (14) ± Évolution vers cancer peu différencié métastases à distance, notamment au niveau pulmonaire. Le fait que la tumorigenèse du CPT puisse être induite par une expression endogène de l’oncogène B-RafV600E (9, 10) aussi bien que par une surexpression de ce transgène (8) est un argument important pour impliquer les mutations activatrices de l’oncogène BRAF comme événement inaugurant le développement tumoral. Ces modèles suggèrent aussi que cet oncogène joue un rôle dans la progression vers les cancers moins différenciés. Le modèle murin de Chakravarty (7) permet “d’allumer” et “d’éteindre” l’expression de l’oncogène B-RafV600E spécifiquement dans la thyroïde, respectivement, en traitant ou en sevrant les souris par la doxycycline. Cela s’accompagne de l’apparition de CPT qui régressent lors de l’arrêt de l’expression de B-RafV600E. Ce modèle démontre la dépendance des CPT vis-à-vis de l’oncogène et leur réversibilité après la disparition de ce dernier (sevrage en doxycycline responsable de l’arrêt de l’expression de B-RafV600E ou l’inhibition pharmacologique (inhibiteurs de MEK ou de B-RafV600E). Ces données plaident en faveur d’une dépendance de la tumeur à l’oncogène initial (“oncogene addiction” pour les anglophones). Ces modèles animaux permettent ensuite de tester les thérapies ciblées à différents stades de la cancérogenèse. Une élévation de la Thyroid Stimulating Hormone (TSH) est constatée dans tous ces modèles de souris transgéniques, en rapport avec une baisse de l’expression de gènes importants pour la synthèse des hormones thyroïdiennes (processus de dédifférenciation avec la prolifération tumorale). Ces résultats rappellent les observations faites chez l’homme, pour les CPT mutés B-RafV600E, de baisse, voire de perte d’expression de la Correspondances en Métabolismes Hormones Diabètes et Nutrition - Vol. XVI - n° 7 - septembre 2012 193 Du nouveau pour le cancer de la thyroïde ! thématique Tg, de la TPO et du NIS (Sodium Iodide Symporter), cela conduisant au développement des cancers réfractaires, résistant au traitement par l’iode radioactif. Oncogène H-Ras Un modèle de 4 lignées de souris transgéniques, exprimant H-Ras muté sous le contrôle du promoteur de la Tg bovine, a permis le développement de CPT pour 3 lignées, sans que ce phénotype puisse être maintenu chez la descendance. Deux modèles murins récents de knock-in du gène Ras (9, 10) n’entraînent pas la survenue de CPT, même après exposition à des taux supraphysiologiques de TSH, secondaires à l’administration de propylthiouracile. Réarrangement TRK-T1 Le réarrangement entre le récepteur NTRK1 et un partenaire de fusion (le gène TPR) a été rapporté dans les CPT avec une fréquence comprise entre 0 et 12 % des patients, selon les séries. La protéine de fusion TRK-T1 qui résulte de ce réarrangement semble responsable de l’activation constitutive de voies de signalisation mitogéniques. In vitro, TRK-T1 peut transformer la lignée cellulaire NIH3T3 (fibroblastes), mais est incapable de promouvoir la croissance ou d’entraîner une dédifférenciation de la lignée PCCL3 (thyroïde de rat). Le modèle de souris transgénique TRK-T1 a permis de mieux comprendre le rôle de TRK-T1 dans la genèse des CPT. La perte de l’architecture thyroïdienne normale, l’apparition d’une hyperplasie et de carcinomes thyroïdiens chez certaines souris avant 7 mois montrent que TRK-T1 est capable de causer la tumorigenèse thyroïdienne. Néanmoins, TRK-T1 semble être un oncogène moins puissant que RET/PTC1, puisqu’un peu moins de 50 % des souris transgéniques TRK-T1 développent un CPT contre 100 % pour les autres. De plus, la survenue tardive de la plupart des CPT chez les souris suggère que l’oncogène TRK-T1 donne un avantage sélectif aux cellules épithéliales pour survivre mais que la formation de CPT nécessite l’accumulation d’autres anomalies génétiques. Conclusion Le développement de ces modèles murins de cancers de la thyroïde a permis de confirmer le potentiel oncogénique d’altérations moléculaires isolées de la voie des MAPK ainsi que l’importance d’effets génétiques additifs et synergistiques comme les délétions de p53 et les réarrangements RET/PTC. De plus, ces modèles ont permis de mieux comprendre le rôle de différentes voies de signalisation (MAPK, PI3K) dans la tumori­ genèse thyroïdienne. Enfin, ces modèles sont importants pour le développement de thérapies ciblées avant leur utilisation chez l’homme. ■ Références 1. Ahn SH, Henderson Y, Kang Y et al. An orthotopic model of papillary thyroid carcinoma in athymic nude mice. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2008;134(2):190-7. 2. Tran Cao HS, Kaushal S, Snyder CS, Ongkeko WM, Hoffman RM, Bouvet M. Real-time imaging of tumor progression in a fluorescent orthotopic mouse model of thyroid cancer. Anticancer Res 2010;30(11):4415-22. 3. Jhiang SM, Sagartz JE, Tong Q et al. Targeted expression of the RET/PTC1 oncogene induces papillary thyroid carcinomas. Endocrinology 1996;137(1):375-8. 4. Sagartz JE, Jhiang SM, Tong Q, Capen CC. Thyroid- stimulating hormone promotes growth of thyroid carcinomas in transgenic mice with targeted expression of the RET/PTC1 oncogene. Lab Invest 1997;76(3):307-18. 5. Santoro M, Chiappetta G, Cerrato A et al. 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