Cours 4

Biologie du développement (2)
Aspects cellulaires et moléculaires
du développement précoce
chez l’amphibien
Frédéric TOURNIER
Maître de Conférences
Université Paris Diderot – Paris 7
INTRODUCTION
Etude du développement des organismes (nombreux modèles)
embryologie
Prolifération / différenciation / migration
/ mort cellulaire
spécialisations tissulaires
Données physiologiques
Chez l’adulte
altérations
Données physiopathologiques
Renouvellement des tissus
Réparation:
Prolifération / différenciation / migration
/ mort cellulaire
CHOIX DU MODELE !
En fonction de la question posée….
Invertébrés
Vertébrés
Mammifères
Caenorhabditis
elegans (nématode)
drosophile
xénope
souris
Poisson
zèbre
homme
poulet
Propriétés communes entre des modèles, même
très éloignés évolutivement
Mais…. aussi propriétés différentes dans des
modèles « proches » ! !
Voir plus loin: comparaison de la fécondation chez
la souris et chez l’homme
Le plan
d’organisation
de l’embryon est
commun à différentes
espèces de Vertébrés
fécondation
1
2
segmentation
3
gastrulation
4
métamorphose
neurulation
et
organogenèse
Les principales étapes
Fécondation:
- Rétablissement de la ploïdie
- Réaction d’équilibration et réaction corticale
- Divisions embryonnaires (opposées à somatiques)
Segmentation:
- Permet de passer du stade unicellulaire (ovocyte
fécondé = zygote) au stade pluricellulaire (blastula)
- Mise en place d’une cavité (le blastocèle).
La gastrulation:
- mise en place des 3 feuillets fondamentaux:
ectoderme, mésoderme, endoderme.
La neurulation:
- mise en place d’un tube creux (le tube neural) dans la
région dorsale.
- début du « modelage » de l’embryon, allongement selon
l’axe antéro-postérieur.
Et.... L’organogenèse:
- exemple de la formation des muscles
Ovogenèse
- Dans l’ovaire:
Ovogonies: entrée en méiose
¾ovocytes I (blocage en prophase de 1ère
division de méiose)
hormone: progestérone
¾reprise de la méiose
¾blocage en métaphase II
¾ponte
Rappel: fécondation interne chez les mammifères!
Externe chez l’amphibien
1) La fécondation
Un pôle animal (région pigmentée): PA
Tâche de maturation
Un pôle végétatif (région non
pigmentée): PV
PA
Donc un axe
animal / végétatif
Ovocytes II pondus
- Les ovocytes sont
orientés dans tous les sens
- Gonflement des gangues
au contact de l’eau
PV
Ovocyte non fécondé:
distribution hétérogène des constituants
rôle du spermatozoïde lors de la fécondation
acrosome
noyau haploïde
centriole
proximal
flagelle
Ovocyte
Métaphase II
centriole
distal
Fécondation:
apport d’un centrosome
par le spermatozoïde
Centriole: 9 triplets puis 9
doublets de microtubules…
… et nombreuses protéines
associées!
Centriole père
Matériel péri-centriolaire
Centriole fils
Cycle de duplication du centrosome
ATTENTION ! Cycle somatique = croissance + division
4 phases: G1, S, G2, M
La question des centrioles du spermatozoïde…!
Conversion fonction axonémale (établissement d’un cil ou d’un flagelle)
et fonction centrosomique (organisation du réseau microtubulaire)
Centriole distal (9+0)
Zone de transition > rupture après fécondation
axonème du flagelle (structure 9+2)
Centriole proximal
spermaster
4N
duplication
N
4N
N
- Migration des noyaux
- Duplication de l’ADN
- Duplication des centrioles
du spermatozoïde
xénope ………..
homme
1ère division
de segmentation
¾2 blastomères
(2N)
Mais pas chez la souris !
Probablement pas chez les rongeurs.
Divisions acentriolaires (sans centrioles)
jusqu’au stade 16/32 cellules
Deux questions - non résolues - se posent:
1) Comment apparaissent les centrioles au stade
16 ou 32 cellules chez la souris?
2) Comment les centrioles disparaissent dans
toutes les espèces au cours de l’ovogenèse?
Intérêt?
Duplication du centrosome => mitose « normale »
Réaction d’équilibration
Rotation corticale
Réaction d’équilibration: après fécondation, le décollement de la
membrane de fécondation de la membrane plasmique de l’ovocyte
fécondé lui permet d’être libre dans sa gangue
¾ orientation tel un « culbuto », due à la densité des plaquettes
vitellines dans l’hémisphère végétatif
¾ tous les ovocytes fécondés sont orientés PA vers le haut.
Réaction corticale, formation du croissant gris
ovocyte non fécondé
spermatozoïde
Pôle animal
ovocyte fécondé
Rotation
d’environ
30°
Pôle animal
Croissant
gris
V
D
Pôle végétatif
Pôle végétatif
Etablissement d’un nouvel axe: dorso-ventral
Réaction corticale: rôle du spermaster
Interprétation:
Le croissant gris (ou dépigmenté) apparaît à la suite de la rotation du
cytoplasme par rapport au cortex. Le spermaster (« lourd ») serait
responsable de ce mouvement relatif.
2) La segmentation
- passage du stade unicellulaire
(zygote = ovocyte fécondé) au stade
pluricellulaire,
- les premières divisions aboutissent
à la formation de la morula.
A la fin de la segmentation,
l’embryon est au stade blastula
micromères
macromères
Cycles embryonnaires de segmentation
Division mais pas croissance
Pas de phases G1 et G2: alternance de
phases de synthèse (S) et de divisions mitotiques (M)
MPF (Maturation Promoting Factor) faible en S
(synthèse de cycline B) et élevé en M (dégradation
de la cycline B): phosphorylation de substrats. ex:
-Histone H1
-Lamines
Pas de transcription jusqu’à la transition blastuléenne
(environ 6000 cellules ou blastomères): reprise des
phases G1 et G2
Application:
Utilisation d’extraits
cytoplasmiques
d’ovocytes de
xénope
MPF ______ (activité)
Cycline B - - - - (ARN ou protéine)
0
10
fécondation
60
1er clivage
2ème clivage
Stade 2
blastomères
Stade 4
blastomères
90
120
temps
(min)
1) Extraits « mitotiques »
- Au temps 0: à partir d’ovocytes matures,
pondus, bloqués en métaphase de 2ème
division de méiose.
- Activité MPF élevée constante
MPF
t
MPF
2) Extraits interphasiques
- 10 min environ après « l’activation »
des ovocytes
- Activité MPF faible constante
t
3) Extraits « cyclants »
- 60 min environ après « l’activation »
des ovocytes
- Activité MPF faible. Mais le niveau
de cycline mitotique endogène permet
l’activation du MPF (cycle(s) « in vitro »)
MPF
Exemples d’expériences ?
t
En fin de segmentation se forme la blastula,
creusée d’une cavité, le blastocèle
Pôle animal
micromères
blastocèle
Cohésion des cellules ?
macromères
Pôle végétatif
Rôle du cytosquelette
et de la matrice extracellulaire
Macromères et micromères
Cadhérines: permettent les jonctions inter-cellulaires,
liens avec le cytosquelette.
Protéines de jonctions:
Fusion entre membranes
Passage des ions
et petites molécules
Hétérodimères
¾récepteurs à
la fibronectine
MEC:
Laminine
fibronectine
Revenons à la mise en place de
l’axe dorso-ventral
Expérience: coupure viable du zygote avant la première segmentation
Les cellules sont
séparées au stade 2
PA
PA
Hans Spemann
(1938)
V
D
Cellules épidermiques,
mésenchyme et cellules
endodermiques. Mais…
… en absence de croissant gris, pas d’axe dorso-ventral,
ni de système nerveux.
Expériences de
Peter Nieuwkoop (1980)
Au
stade blastula,
les cellules
la zone marginale
ont déjà
reçu
unedes
Conclusion:
des cellules
quide
« paraissent
identiques
» ont
déjà
information
pour les orienter
versblastula
une différenciation en:
destinées différentes
au stade
- chorde (mésoderme dorsal)
- cellules musculaires (mésoderme intermédiaire)
- cellules sanguines (mésoderme ventral)
Régulations moléculaires complexes
Inductions
Cellules inductrices > cellules compétentes
Mise en évidence par l’expérimentation
Expérience: marquage des cellules
avec un composé fluorescent
Stade 32 blastomères
PV
1- Si on marque les blastomères animaux: les cellules mésodermiques
sont marquées
2- Si on marque les blastomères végétatifs: les cellules mésodermiques
ne sont pas marquées
Expériences de
Dale et Slack (1987)
Régionalisation de l’induction (1)
Régionalisation de l’induction (2)
Conclusion:
1) les blastomères végétatifs induisent les cellules adjacentes à
fonder les lignées mésodermiques.
2) La régionalisation de cette induction est déjà déterminée.
Carte des territoires présomptifs au stade blastula:
Régionalisation des blastomères en fonction de leur
devenir en fin de gastrulation.
En résumé:
Des cellules inductrices envoient une information. Elle
synthétisent et sécrètent une ou plusieurs molécules.
Les blastomères végétatifs envoient une information
vers des micromères de la zone marginale > Induction
du mésoderme
Des cellules compétentes sont capables de recevoir
l’information. Elles possèdent des récepteurs et des
messagers intracellulaires capables d’agir au niveau
génomique.
3) La gastrulation
mouvements de cellules à partir de la blastula qui aboutissent à
la mise en place des 3 feuillets fondamentaux qui donneront
tous les organes:
- Ectoderme (et Neurectoderme)
- Mésoderme
- Endoderme
Les cellules migrent en surface et rentrent à l’intérieur de
l’embryon en constituant une nouvelle cavité: l’archentéron
(futur intestin)
Future
région
dorsale
Future
région
ventrale
Lèvre dorsale du blastopore
Stade du bouchon vitellin
Blastopore
Utilisation de la technique des marques colorées: pour mettre
en évidence la mise en place des 3 feuillets et les mouvements de
la gastrulation
Coloration de quelques cellules dans des régions d’intérêt.
On repère à différents stades les cellules qui portent la coloration
(coupes histologiques, observation au microscope)
Les cellules commencent à
entrer par la lèvre dorsale du
blastopore (localisée dans la
région du croissant gris)
Stades du bouchon vitellin
4) La neurulation
- Allongement selon l’axe D-V
- Dans la région dorsale, formation
du tube neural
Mouvements complexes
des cellules:
Interactions entre cellules
et matrice extra-cellulaire
(MEC)
Rôle du cytosquelette
Allongement et
stabilisation des
microtubules
Contraction des
faisceaux d’actine
Contractions à l’apex
des cellules > mouvement
« d’enroulement » du tube
neural
Après la neurulation, le plan d’organisation primaire
commun à tous les vertébrés est réalisé.
Les 3 feuillets sont en place:
Externe (ectoderme)
Moyen (mésoderme)
Interne (endoderme)
Les 3 axes sont en place:
- Antéro-postérieur
- Dorso-ventral
- Médiolatéral
Ectoderme: peau, système nerveux
Mésoderme: squelette, muscle, rein, cœur, vaisseaux
Endoderme: intestin, foie, poumons