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Activité
Comment identifier des allèles mutés
à l'aide d'enzymes de restriction
+
Problème à résoudre
Etablir un diagnostic prénatal pour l'enfant de l'individu III1 dont le frère (III3) et la soeur (III2)
sont atteints d’albinisme oculo-cutané (pas d'albinisme connu dans l'arbre généalogique de son conjoint).
I
1
2
3
4
Homme sain
II
1
2
3
4
Femme saine
Homme albinos
Femme albinos
III
1
2
3
?
1. La transmission de l'albinisme oculo-cutané
Indices phénotypiques (phénotype clinique ou macroscopique) L'albinisme oculo-cutané est une anomalie génétique se manifestant par un déficit de pigmentation de la peau, des poils, de l'iris, de la rétine et
un certain nombre de troubles de la vision.
Cause C'est une déficience de la production d'un pigment sombre, la mélanine, due à l'absence d'une enzyme, la tyrosinase (phénotype cellulaire). Celle-ci est responsable de 4 réactions de la transformation de
précurseurs en mélanine. Le gène de cette enzyme, situé sur le chromosome 11, présente une certaine variabilité. On connaît:
ê
2 allèles conduisant à des enzymes fonctionnelles (brins non transcrits
nommés “tyrcod1” et “tyrcod2” dans la banque de données du logiciel)
ê de nombreuses mutations conduisant à des polypeptides non fonctionnels
(”tyralb-a1, a2, ..., a5, b1, ts” dans la banque de données)
phénotypes
moléculaires
alternatifs
On supposera (hypothèse initiale) que les phénotypes alternatifs ne sont liés qu’à un seul gène,
dont on connaît un certain nombre de variants.
montrer, rapidement et par simple observation de l'arbre, que le gène est pro1 bablementDansportéce cas,
par un autosome et que les allèles mutés déficients ne s'expriment que présents en
double exemplaire (”récessivité” de ces allèles).
Evaluer le risque d'albinisme de l'enfant à naître sachant que la fréquence des hétérozygotes dans la population est voisine de 1%.
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2. Comparaison des différentes formes alléliques du gène
Charger les fichiers d’allèles: “Fichier”, “Ouvrir”, edit7034.edi situé dans Anagene/Sauve, “OK”).
Puis, sélectionner toutes les séquences complètes du gène portant les préfixes Tyr (elles doivent apparaître sur
fond blanc). Garder le fichier “tyrcod1” en tête (il devient la référence de la comparaison).
Effectuer la comparaison (dans la barre d’outils: “Comparer les séquences” … “Comparaison
simple”.
En cas de doute pour un allèle, le sélectionner avec “tyrcod1” et recommencer la comparaison avec
l’option “Alignement avec discontinuité”.
Remplir le tableau suivant (selon le modèle proposé) afin de distinguer les différentes
1
formes alléliques (”tyrcod1” est choisi comme référence).
Séquence nucléique
Polypeptide
Nucléotides changés
Nature - Position
Triplets changés
Nature - Position
Acides aminés changés
Nature - Position
Type de mutation
tyrcod 1
référence
référence
référence
référence
tyrcod2
A 575 Ù C
TAT 192 Ù TCT
Tyr 192 Ù Ser
substitution faux-sens
tyralba1
G 1147 Ù A
GAT 383 Ù AAT
Asp 383 Ù Asn
substitution faux-sens
Tyr 192 Ù Ser
Cys 244 Ù non-sens
Trp 178 Ù non-sens
Tyr 192 Ù Ser
substitution faux-sens
délétion, non-sens en 244
substitution non-sens en 178
substitution faux-sens
Nom des
allèles
tyralba2
tyralba3
A 575 Ù
GT 731-732
G 533 Ù
A 575 Ù
TAT 192 Ù TCT
C
Ù __ TGT 244 Ù TGA (stop)
TGG 178 Ù TAG (stop)
A
C
TAT 192 Ù TCT
tyralba4
tyralba5
tyralbb1
tyralbts
3. Mise en forme des séquences pour la suite du travail
En utilisant l’outil “Comparaison” “Alignement avec discontinuité”, vérifier que toutes les
séquences ne portant pas le préfixe Tyr- sont celles du gène soigneusement débarrassé de ses extrémités
grâce aux enzymes Bsm I (reconnaissant GAATGC ou GCATTC) et Bgl II (reconnaissant AGATCT).
1
Présenter rapidement la méthode de vérification.
Une fois la vérification effectuée, construire le dernier allèle raccourci “albts” correspondant à
l’allèle entier “tyralbts”: “Fichier”, “Créer”, type ADN, nom albts, “OK”.
Copier sur la séquence Tyralbts la partie à conserver, puis la coller dans la ligne albts qui vient d’être
crée.
Eliminer toutes les séquences portant le préfixe Tyr- devenues inutiles: les sélectionner puis cliquer
sur l’icône “Supprimer” (croix).
A partir de cet instant, tout le travail portera sur les allèles raccourcis.
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4. Choix d'une enzyme de restriction susceptible de permettre l’identification des 2 allèles fonctionnels du gène
Sélectionner les 2 allèles concernés (voir titre) et les comparer (voir précédemment).
Observer ce qui les distingue ainsi que les nucléotides les plus proches dans la chaîne.
Consulter la liste des enzymes de restriction disponibles (ci-contre). En choisir une qui
pourrait permettre de distinguer les 2 allèles. Faire agir cette enzyme sur les 2 allèles (barre
d’outils: icone “Action enzymatique” ..... “Représentation graphique” ..... “Fichier”, dans le
répertoire “Anagene/Sauve” ..... sélectionner “Tyrrest2.zym” .....ok ..... Dans la nouvelle fenêtre
“Carte de restriction”, sélectionner l’enzyme choisie précédemment et les 2 allèles étudiés grâce
aux menus déroulants.
Enzymes
disponibles
Mnl I
par électrophorèse. Pour les longueurs, prendre le brin du haut comme référence.
Enzyme choisie:
0
“cod1”
“cod2”
CCTC
ou
Hae III
GGCC
Hpa II
CCGG
Alw I
sur la représentation schématique ci-dessous, les sites de coupure ain1 si que lesReporter,
longueurs des différents fragments que l'on pourra ensuite tenter de séparer
Sites de reconnaissance
GGATC
GAGG
ou
Xba I
TCTAGA
Einv IV
AGTGTG
GATCC
Sites de reconnaissance de l’enzyme:
200
400
600
800
1000
1200
Avec l’enzyme
...............................
4. suite …
tyrcod1
1000 et plus
Ouvrir le fichier “simul_electroph.xls” (tableur-grapheur) puis simuler les 2 électrophorèses des
fragments de restriction obtenus précédemment.
Dans la réalité, on devrait utiliser différents types
de gel d’électrophorèse: par exemple, un “gel 1” qui permet la séparation des fragments de taille moyenne (100 à
1000 kb) et un “gel 2” celle des petits fragments (10 à 100
kb).
Pour la suite du travail, on supposera que l’on est
capable de réaliser:
I
ce type d’électrophorèse
I
un “marquage” correct de l’ensemble des fragments.
800
600
tyrcod2
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Témoins
de tailles (kb)
1500
750
500
400
Gel 1
250
200
120
100 et moins
1
En s’aidant de la simulation précédente, placer
les différents fragments de restriction, obtenus pour les
2 allèles , sur les 4 bandelettes d’électrophorèse . Les représenter par des barres noires transversales.
100 et plus
150
80
Indiquer le sens de migration des fragments.
Quel est, dans le cas présenté, le gel le plus intéressant à utiliser et quel est le fragment le plus intéressant à repérer afin d’identifier clairement les 2 allèles
fonctionnels.
60
60
40
30
Gel 2
20
15
10 et moins
Echelle
approximative
du nombre
de bases des
fragments de
restriction
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5. Détection des différentes formes du gène à l'aide
d'une batterie d'enzymes de restriction
Sélectionner les 9 fichiers d’allèles et faire agir les 6 enzymes du fichier “Tyrrest2.zym”.
Demander l’affichage sous forme de tableau et cliquer sur les différentes enzymes pour les activer .....ok
1
Compléter le tableau du nombre de fragments de restriction obtenus.
(Attention: le logiciel ne donne que le nombre de sites de coupure).
Tableau du nombre de fragments d'ADN obtenus par restriction
Enzymes disponibles
Allèles fonctionnels et autres versions mutées
Mnl I
HaeIII
Hpa II
Alw I
Xba I
Einv IV
cod 1
cod2
alba1
alba2
alba3
alba4
alba5
albb1
albts
S’il dispose de ces enzymes, comment le biologiste peut-il s'y prendre pour mettre en
1évidence la présence
de la mutation “tyralbb1” ? de la mutation” tyralba4” ?
Les 6 enzymes sont-elles toutes indispensables pour la détection d’une éventuelle
anomalie du gène considéré? (c’est-à-dire peut-on se permettre d’en enlever une ?)
Expliquer.
6. Utilisation des enzymes lors du diagnostic prénatal
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On supposera que l’on est capable:
de réaliser les électrophorèses appropriées
de révéler tous les fragments de restriction concernés.
I
I
Observer les résultats de restrictions effectuées sur l'ADN total (2 chromosomes 11) du père III1 à
partir de la batterie d'enzymes (voir ci-dessous).
1
Expliquer comment on peut en déduire le génotype probable de cet individu.
Conclure quant au risque d'albinisme calculé en (1.)
A quels résultats de restrictions doit-on s’attendre si l’individu III 1 est hétérozygote cod2//alba2 ?
Résultats des différentes restrictions de l'ADN de l'individu III 1.
Témoins
de tailles
1500
Mnl I
1000 et plus
750
500
250
Gel 1
120
100 et moins
150
100 et plus
60
30
Gel 2
15
10 et moins
Hae III
Hpa II
Alw I
Xba I
Einv IV