Caractérisation des variants de séquence du

ALEXANDRAFERLAND
CARACTÉRISATION DES VARIANTS DE SÉQUENCE DU GÈNE ENCODANT
LA 17~-HYDROXYSTÉROÏDE DÉSHYDROGÉNASE DE TYPE 5 CHEZ LES
FEMMES CANADIENNES-FRANÇAISES ATTEINTES D'UN CANCER DU SEIN
ET PROVENANT DE FAMILLES À RISQUE ÉLEVÉ
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval
dans le cadre du programme de physiologie-endocrinologie
pour l'obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.)
DÉPARTEMENT DE PHYSIOLOGIE-ENDOCRINOLOGIE
(ENDOCRINOLOGIE MOLÉCULAIRE)
F ACUL TÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAV AL
QUÉBEC
2009
© Alexandra Ferland, 2009
RÉSUMÉ
L 'histoire familiale et l'exposition aux estrogènes sont deux facteurs de risque de cancer du
sein bien connus. À l'opposé, les androgènes agissent comme protecteurs dans le tissu
mammaire tout comme certains métabolites de la progestérone. Ce sont les membres de la
famille des 17f3-hydroxystéroïdes déshydrogénases qui sont responsables des étapes
importantes dans la formation et l' inactivation de tous les stéroïdes sexuels.
particulièrement, la
17f3-HSD de type 5
Plus
est une enzyme clé dans la formation des
androgènes et dans l' inactivation de la progestérone en métabolites protecteurs.
Nous
avons donc procédé à l' identification des variants de séquence du gène HSD 17B5 chez des
femmes canadiennes-françaises ayant eu un cancer du sein. Par la suite, nous avons fait
l'analyse fonctionnelle des variants qui entraînent un changement d'acide aminé.
Ces
différentes expérimentations nous ont permis de vérifier l'implication potentielle de ce gène
dans la modulation du risque de développer un cancer du sein.
REMERCIEMENTS
Je tiens tout d' abord à remercier sincèrement mon directeur de recherche le Dr. Jacques
Simard qui tout au long de mes études a su m ' encourager et me transmettre sa passion. Ces
deux années au sein de son équipe m ' ont permis d' acquérir une rigueur de travail et une
confiance dont il est le principal responsable.
Je voudrais aussi tout particulièrement remercier Dre. Penny Soucy pour sa disponibilité, sa
versatilité ainsi que son intelligence légendaire. La douceur et la gentillesse de Penny a
ajouté à ces années un réel bonheur qui embellissait mes journées.
J' aimerais remercier Marie Plourde et Martine Tranchant pour m'avoir aidée dans mes
projets, Dre. Martine Dumont pour sa grande compréhension et son leadership ainsi que
Josée Rhéaume pour son calme, son originalité et surtout sa facilité de communication.
Je tiens aussi à remercier la Dre. Francine Durocher pour sa grande disponibilité tout au
long de mon cheminement ainsi que son implication générale auprès des étudiants.
Je
remercie aussi son assistant Dr. Yvan Labrie pour ses compétences, sa curiosité et surtout
son grand sens de l' humour.
Finalement, je ne pourrais passer à côté de l'équipe du Dre. Durocher. Ces années
n'auraient jamais été aussi belles sans l'humour de Frédéric Guénard, le savoir-faire de
Sylvie Desjardins, l' opinion franche de Geneviève Ouellette, le perfectionnisme de Charles
Joly Beauparlant et surtout grâce à leur amitié qui me motivait à chaque jour.
Grâce à vous, ces deux années ont été pour moi un véritable cadeau. Encore une fois je
vous en remercie!
AVANT-PROPOS
Ce mémoire est présenté avec insertion d'article. Il débute par une introduction générale
permettant la compréhension de la problématique qui vient justifier le choix de mon sujet
de recherche.
L'introduction permet aussi de mieux comprendre les différentes
manipulations décrites dans l'article.
Il est suivi d'un article, rédigé en anglais, pour ainsi répondre aux critères de publication
des différentes revues scientifiques. Cet article qui n'est pas encore publié, résume mes
travaux de recherche effectués durant ma maîtrise. En effet, les expérimentations décrites
dans cet article proviennent entièrement de mes travaux.
Par contre, j'ai eu l'aide de
Martine Tranchant et Penny Soucy pour le travail de laboratoire. De plus, Penny m' a aussi
aidée dans l'écriture de l'article.
Finalement, l'article est suivi d'une conclusion générale énonçant les retombées de mes
résultats ainsi que les travaux qui restent à faire afin de vérifier l'implication réelle de ce
gène dans la susceptibilité génétique au cancer du sein.
TABLE DES MATIÈRES
PAGE DE TITRE ....................................................... ......................... . .... . .1
RÉSUMÉ ................................................ . ............................................... 11
REMERCIEMENTS ............................................ . ................................ . ... .111
AVANT-PROPOS ......... . ... . ............................ .. . ...................................... .IV
TABLE DES MATIÈRES ........... . ......................................... . ... . .. . ............ ... V
LISTE DES TABLEAUX ............................................................ ........... .... VII
LISTE DES FIGURES .............................................................................. VIII
LISTE DES ABRÉVIATIONS ... . ................................................................. .IX
INTRODUCTION .............................................. . ...... . . . ............ . ........ . .. . .. ... . 1
1.
LE CANCER DU SEIN .............................................. . .................... 1
1.1 ÉVOLUTION DE LA RECHERCHE SUR LE CANCER DU SEIN ..... 1
1.2 FACTEURS DE RISQUE .......... . .................................... . .. .. ... 2
1.2.1 L'ÂGE .................................................................. 4
1.2.2 LA RÉGION GÉOGRAPHIQUE .................................. 4
1.2.3 LA DURÉE D'EXPOSITION AUX ESTROGÈNES ........... 4
1.2.4 L'HISTOIRE FAMILIALE ................................... . ..... 4
1.2.5 MUTATION DANS LES GÈNES BRCA1 ET BRCA2 ........ 5
1.2.6 AUTRES GÈNES DE SUSCEPTIBILITÉ ........................ 7
2. POURQUOI UTILISER UNE POPULATION FONDATRICE EN
GÉNÉTIQUE? ........................................................................................................... 8
3.
EFFETS DES HORMONES SUR LE CANCER DU SEIN ........................ 9
3.1 EFFET DES ESTROGÈNES ................................................... 9
3.2 EFFET DE LA PROGESTÉRONE .......................................... 10
3.3 EFFET DES ANDROGÈNES ................................................ 11
4.
FORMATION DES HORMONES .................................................... 12
4.1 PARLES GONADES ......................................................... 12
4.2 DANS LES TISSUS PÉRIPHÉRIQUES .................................... 15
17~-HSDs
5.
FAMILLE DES
............................................................ 17
6.
CARACTÉRISATION DE LA 17~-HSD DE TYPE 5 ............................ 18
6.1 HISTORIQUE .................................................................. 18
6.2 CARACTÉRISTIQUES ....................................................... 18
VI
6.3 IMPLICATION POTENTIELLE DANS LES CANCERS RELIÉS
AUX HORMONES SEXUELLES? ............................................................ 19
7.
PROBLÉMATIQUE ET APPROCHES EXPÉRIMENTALES DE L'ÉTUDE
PRÉSENTÉE ................................................................................ ..20
CHAPITRE 1.................................................................................. 23
1.0
RÉSUMÉ ..................................................................... 25
2.0
ABSTRACT ................................................................. 26
CONCLUSION ............................................................................... 58
RÉFÉRENCES ................................................................................ 61
LISTE DES TABLEAUX
INTRODUCTION
TABLEAU 1 : RÉSUMÉ DES FACTEURS DE RISQUE DU CANCER DU SEIN ...... 3
TABLEAU 2 : CARACTÉRISTIQUES DES DIFFÉRENTES CLASSES DE GÈNES
DE SUSCEPTIBILITÉ ....... .......................................................................... 8
TABLEAU 3 : POURCENTAGES DE RÉDUCTION DU NOMBRE DE CAS REQUIS
SOUS UN MODÈLE MULTIPLICATIF, EN UTILISANT DES CAS AYANT UNE
HISTOIRE FAMILIALE DE CANCER DU SEIN, AFIN D ' OBTENIR UNE PUISSANCE
DE 900/0 À UN NIVEAU SIGNIFICATIF DE 10-4 .........•••......•............................. 21
CHAPITRE 1
TABLE 1 : OBSERVED SEQUENCE VARIANTS AND GENOTYPE FREQUENCIES
IN AKR1C3 GENE AMONG FAMILIAL BREAST CANCER CASES AND
CONTROLS .................................................................................. .,........ 45
SUPPLEMENTAL TABLE 1 A: OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS USED FOR
AMPLIFICATION AND SEQUENCE ANAL YSIS OF THE AKR1C3 GENE
.................................................................................................................................... 48
SUPPLEMENTAL TABLE 1 B : OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS USED FOR
SITE-DlRECTED MUTAGENESIS ....................................................................... 49
LISTE DES FIGURES
INTRODUCTION
FIGURE 1 : PYRAMIDE ILLUSTRANT LA PROBLÉMATIQUE DES MALADIES
COMPLEXES ....................... .......................................................... .......... 2
FIGURE 2: PROPORTION DE CAS DE CANCERS DU SEIN FAMILIAUX ET
GÈNES DE SUSCEPTIBILITÉ ........................................................... ..... .... ... 6
FIGURE
3:
PRÉCURSEURS
DANS
LA
FORMATION
DE
L' ESTRADIOL ................................................. . .................................. .... 12
FIGURE 4 : ORIGINE DE L' ESTRADIOL ET DE LA TESTOSTÉRONE DANS LA
GLANDE MAMMAIRE .................................................................. ........ ... 14
FIGURE 5: ENZYMES DE LA STÉROÏDOGÉNÈSE DANS LES TISSUS
PÉRIPHÉRIQUES INTRACRINES HUMAINS ......................................... ........ 16
CHAPITRE 1
FIGURE 1 : GENOMIC STRUCTURE OF THE HUMAN HSD17B5 GENE ............ 50
FIGURE 2: COMP ARISON OF EXPRESSION LEVELS AND ACTIVITY OF
MUTANT RECOMBINANT 17~-HSD TYPE 5 PROTEINS .................................. 51
FIGURE 3 : PAIRWISE LINKAGE (LD) MEASURES OF R2 FOR THE SEQUENCE
VARIANTS IDENTIFIED IN THE BREAST CANCER AND CONTROL SERIES ...... 52
FIGURE 4: AKR1C3 HAPLOTYPE BLOCKS, FREQUENCIES AND TSNPS
DETERMINED IN THE FRENCH-CANADIAN POPULATION ....................... ..... 53
LISTE DES A.BRÉVIATIONS
~4-Dione
Androst-4-ene-3, 17-dione
20a-HP
20a-hydroxyprogestérone
AC TH
Adreno cortico tropic hormone
ADN (DNA) Acide désoxyribonucléique
ADT
Androstérone
AKRI C3
Aldo-céto-réductase
AR
Androgen receptor
ARN (RNA) Acide ribonucléique
ATM
Ataxia telangiectasia mutated
BCAC
Breast cancer association consortium
bp
Paire de base
BRCA1 /2/X Breast cancer susceptibility 1/2/X
BRIP 1
BRCA 1 interacting prote in C-terminal helicase 1
cDNA
Complementary deoxyribonucleic acid
CEPH
Centre d'étude du polymorphisme humain
CGEMS
Cancer genetics markers of susceptibility study
CGL
Cancer genomics laboratory
CHEK2
CHK2 checkpoint homolog
CIMBA
Consortium ofinvestigators ofmodifiers ofBRCA1/2
CRH
Corticotropin-releasing hormone
CYP 17/19
Cytochrome P450 C 17IC 19
DHEA
Déhydroepiandrostérone
DHT
Dihydrotestosterone
DMEM
Dulbeccos' modified Eagles medium
El
Estrone
E2
Estradiol
EBV
Epstein··Barr virus
Epi-ADT
Epiandrostérone
ER
Estrogen receptor
ESE
Exon splicing enhancer
FBS
Fetal bovine serum
FGFR2
Fibroblast growtn factor receptor 2
HEK293
Human embryonnic kindey 293
HMG
High mobility group
HSD
Hydroxystéroïde déshydrogénase
INHERIT BRCAs Interdisciplinary health research international team on breast cancer
susceptibility
Kilo base
Kb
Kilodalton
kDa
Linkage:
disequilibrium
LD
Luteinizing hormone
LH
L uteinizing hormone-releasing hormone
LHRH
Minor allele frequency
MAF
Michigan cancer foundation- 7
MCF-7
Multiplex Ligation-dependant Probe Amplification
MLPA
x
mRNA
NADPH
NCBI
NT
PALB2
PCR
PTEN
SDRs
SDS
SE
S.E.M
SIFT
SNP
T
TNRC9
TP53
tSNPs
UGT
Messenger ribonucleic acid
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
National center for biotechnology information
N on-transfecté
Partner and localizer of BRCA2
Polymerase chain reaction
Phosphatase and tensin homolg
Short chain dehydrogenase/reductase
Sodium dodecyl sulfate
Standard error
Standard error of the mean
Sorting intolerant from tolerant
Single nucleotide polymorphism
Testostérone
Trinucleotide repeat containing 9
Tumor protein 53
Tagging SNPs
UD P -gl ucuronosy ltransférase
À Papa, Maman, Valérie, Alice
et Simon qui m 'accompagnent et
embellissent ma vie ...
INTRODUCTION
1.
LE CANCER DU SEIN
La population canadienne se montre très compatissante envers les femmes qui développent
un cancer du sein.
La sensibilité des gens se traduit par des gestes concrets tels que
l' amassement de fonds pour la recherche ainsi que le soutien moral des femmes atteintes.
Cette fidélité est concevable vu le grand nombre de femmes touchées par ce type de cancer.
En effet, environ 22 000 nouveaux cas de cancer du sein sont diagnostiqués chaque année
et ce, seulement au Canada. Il y a donc une femme sur neuf qui sera atteinte cl ' un cancer
du sein au cours de sa vie et une femme sur vingt-huit sera emportée par cette maladie (1).
En plus d' être le type de cancer le plus répandu chez la femme, il peut apparaître, dans
moins de 1% des cas, chez l'homme (1). À la vue de ces données, il est normal que nous
attachions autant d'importance à cette maladie qui touchera potentiellement une personne
près de nous. En plus d' être très fréquent, ce type de cancer s' attaque directement à la
féminité ce qui le rend encore plus cruel. Heureusement, la sensibilisation au dépistage, les
actions pour soutenir la cause ainsi que les recherches abondent et donnent de bons
résultats. En effet, selon les statistiques canadiennes sur le cancer, la survie s' améliore
graduellement depuis les années 70, et de manière significative depuis 1989, surtout dans
les groupes d'âge où le dépistage est recommandé (50 à 59 ans et 60 à 69 ans) (1).
1.1
ÉVOLUTION DE LA RECHERCHE SUR LE CANCER DU SEIN
Il est tout à fait normal que le nombre de cas de cancer du sein nous semble de plus en plus
élevé à chaque année.
Cette observation est reliée à l'amélioration des techniques de
dépistage ainsi qu'à la croissance et la longévité de la population (1). Aujourd'hui, les
connaissances sur les techniques de biologie moléculaire ont largement progressé.
La
recherche actuelle mise beaucoup sur l'amélioration des techniques de dépistage, de
traitement mais aussi sur la prévention. En effet, nous comprenons maintenant que chaque
personne est unique et donc qu'elle possède un risque personnel de développer un cancer.
Il est donc essentiel d' approfondir nos connaissances sur les facteurs de risque pour ainsi
offrir des suivis personnalisés.
2
1.2
FACTEURS DE RISQUE
Puisqu'il est très difficile de déterminer les causes exactes de cancer du sein vu son statut
de maladie complexe donc multifactorielle, nous ne pouvons pas encore affIrmer, hors de
tout doute, les raisons pour lesquelles une femme développe un cancer du sein plutôt
qu'une autre. Les maladies complexes sont plus difficiles à étudier étant donné qu' elles
résultent de l' intéraction des gènes avec l'environnement (2). De plus, plusieurs gènes de
pénétrance variable peuvent être responsables de la maladie. Le schéma suivant illustre
bien la complexité de ces maladies dont le cancer du sein fait partie.
E
1
"roRneDl e[ll
Figure 1: Pyramide illustrant la problématique des maladies complexes
Le haut de la pyramide présente les maladies mendeliennes simples pour lesquelles un gène
est responsable de la maladie. Plus nous descendons vers la base de la pyramide et plus les
causes deviennent multiples, ce qui représente bien les maladies complexes.
Par contre, grâce aux diverses recherches effectuées pour comprendre les causes de cancer
du sein, plusieurs facteurs de risque ont été mis en évidence. Certains de ces facteurs sont
maintenant bien prouvés tandis que d'autres doivent être confrrmés par différentes études
indépendantes.
Le tableau suivant présente un bref résumé de différents facteurs qui
diminuent ou augmentent le risque, ceux qui sont bien confirmés et ceux qui sont
probables:
3
Tableau 1: Résumé des facteurs de risque du cancer du sein
Fa
Magnitude du
risque *
Facteurs
Bien confirmés
Age avancé
Histoire familiale de cancer du sein
Région géographique (Amérique du Nord et Europe)
Mutation dans les gènes BRCAl et BRCA2
Mutation dans d'autres gènes de susceptibilité
(p53,ATM,PTEN)
Affections mammaires antérieures bénignes
++
++
++
++
++
Exposition aux radiations ionisantes durant l'enfance
++
++
Age tardif à la ménopause (>54)
Age précoce des ménarches «12)
Nulliparité et âge tardif à la première grossesse
Forte densité mammaire
Thérapie honnonale de remplacement
Obésité chez les femmes ménopausées
Grande taille à l'âge adulte
Consommation d' alcoo 1
++
++
++
++
+
+
+
+
Probables
Contraceptifs oraux
Taux élevé de prolactine
Consommation élevée en gras saturé
Variants génétiques dans les gènes de faible
pénétrance
Statut socioéconomique élevé
+
+
+
+
+
F
Bien confirmés
Région géographique (Asie et Afrique)
Jeune âge à la première grossesse menée à terme
Multiparité
Allaitement (longue période)
Obésité chez les femmes pré-ménauposées
Consommation de fruits et légumes
Activité physique
Agents de chimioprévention
Probables
*
++
+
Prise d'un anti-inflammatoire non-stéroïdien
Variants génétiques dans les gènes de faible
pénétrance
Tiré de: Dumitrescu et Cotarla. 2005 (3)
augmentation du risque (modéré à fort)
augmentation du risque (faible à modéré)
-
diminution du risque (modéré à fort)
diminution du risque (faible à modéré)
4
V oici maintenant une brève description des facteurs de risque les mieux connus :
1.2.1
L'ÂGE
Il est assez rare de diagnostiquer un cancer du sein chez une femme âgée de moins de 25
ans. À cet âge, l' incidence est de moins de 10 femmes sur 100 000 et elle double environ
tous les dix ans jusqu' à la ménopause où les taux augmentent moins drastiquement (3,4).
1.2.2
LA RÉGION GÉOGRAPHIQUE
Au Canada, les taux d' incidence du cancer du sein sont très élevés.
En effet, ils se
retrouvent parmi les plus élevés à travers le monde tout comme les Etats-Unis, l'Europe du
Nord et l' Australie qui possèdent des taux comparables à ceux du Canada. À l' opposé,
l' Asie, l' Amérique latine et l' Mrique possèdent des taux d' incidence de cancer du sein
beaucoup plus faible (1). Fait intéressant, une étude évaluant le risque de cancer du sein
chez des femmes asiatiques ayant émigré aux États-Unis démontre que ces femmes voient
leur risque de développer un cancer du sein augmenté lorsqu' elles s' établissent aux ÉtatsUnis. Ces recherches viennent donc confirmer que la différence dans l'incidence peut être
liée à des facteurs environnementaux et socioéconomiques qui sont propres à chaque pays
(5).
1.2.3
LA DURÉE D'EXPOSITION AUX ESTROGÈNES
La durée d'exposition aux estrogènes durant notre vie est un facteur important dans la
modulation du risque de développer un cancer du sein. L ' exposition aux estrogènes se fait
par le début et l' arrêt des règles que l'on nomme ménarche et ménopause. Une ménarche
précoce et une ménopause tardive augmentent la durée d'exposition aux estrogènes et donc
sont associées à une augmentation du risque de développer un cancer du sein (6). Le fait
d' avoir plusieurs enfants diminuent aussi le temps d'exposition aux estrogènes et donc
diminuent le risque (3).
1.2.4
L'HISTOIRE FAMILIALE
Les premières évidences incriminant l 'histoire familiale de cancer du sein, comme facteur
de risque important, furent bien documentées par le médecin français Paul Broca. Il réalisa
qu' il y avait un excès de cas de cancer du sein dans la famille de sa femme qui ne pouvait
être dû au hasard. Il initia donc la recherche sur les cancers du sein hérités et écrivit les
5
premières publications sur ce sujet (7).
Depuis ces découvertes, la recherche s'est
beaucoup raffinée et nous connaissons mieux la proportion de cas de cancer du sein qui est
clairement familiale. À ce sujet, une méta-analyse de 52 études a démontré que 120/0 des
femmes ayant un cancer du sein avaient au moins un apparenté du premier degré de leur
famille affecté (8). Notez que cette étude ne prenait pas en considération les cas de cancer
du sein chez les apparentés du côté paternel, sous-estimant d' au moins la moitié les cas de
cancer du sein familiaux. De plus, les familles sont maintenant moins nombreuses et la
susceptibilité qui se transmet entre les générations n' entraîne pas nécessairement le
développement du cancer. Il est donc possible que nous sous-estimions l' effet de l' hérédité
sur le cancer du sein.
Grâce à la méta-analyse citée précédemment, nous savons maintenant qu' une femme , dont
l'un des membres de sa famille du premier degré (mère-sœur-fille) a déjà eu un cancer du
sein, possède un risque plus élevé d'en développer un à son tour (8).
Ces études ont donc
mis en évidence le risque commun qui existait entre les membres d'une même famille. Ce
risque peut donc être lié à des facteurs environnementaux ou à une prédisposition héritée.
Par contre, des études faites sur des jumeaux ont démontré que l'excès du risque provenait
principalement de la prédisposition héritée de développer un cancer du sein qu' on appelle
aussi susceptibilité génétique (9). Cette susceptibilité est transmise de façon autosomique
dominante dans les familles porteuses de mutation (10).
1.2.5
MUTATION DANS LES GÈNES BRCAl ET BRCA2
La première évidence convaincante de l'existence d' un gène de susceptibilité au cancer du
sein a été publiée en 1990 (11). C'est à l'automne 1994 que la structure du gène BReAl a
enfin été élucidée (12). Presque simultanément, le Breast Cancer Linkage Consortium a
localisé le locus BReA2 sur le chromosome 13q12-13 (13). En décembre 1995, Wooster et
al (14) rapportaient la séquence partielle du gène BReA2, soit environ les deux-tiers de la
séquence codante. En parallèle, la séquence complète, ainsi que la structure exonique du
gène BReA2 ont été déterminées par un consortium Nord-Américain (15).
Les personnes porteuses d'une mutation dans le gène BReAl possèdent un risque de 65%
de développer un cancer du sein avant l' âge de 70 ans tandis que pour BReA2, le risque est
de 45% (16). Étant donné que les risques associés aux mutations sont très élevés, nous
6
qualifions BReAl et BReA2 de gènes de forte pénétrance. La pénétrance se définie donc
comme étant la ségrégation des mutations avec le phénotype, qui dans notre cas est le
cancer du sein. Ces deux gènes sont responsables d'environ 15 à 20% de tous les cas de
cancer du sein familiaux (16). Comme il a été mentionné précédemment, la susceptibilité
est héritée de façon dominante par la présence de mutation inactivatrice d'un des deux
allèles des gènes BReAl et BReA2 ainsi que des autres gènes de susceptibilité connus. Par
contre, pour développer un cancer du sein, c'est la perte du deuxième allèle, qu' on appelle
perte de l ' hétérozygosité, qui serait déterminante dans le développement de la
carcinogénèse. De plus, la plupart du temps, les mutations résultent en une protéine
tronquée prématurée ou en une dégradation de l' ARN. Seulement une petite partie des
mutations est causée par un simple changement de nucléotide situé dans une partie
importante du gène (10). Maintenant que l'implication des gènes de susceptibilité a été
démontrée dans une proportion des cas de cancer du sein hérités, il reste donc à déterminer
les autres gènes de susceptibilité couvrant le 75% restant des cas de cancer du sein
clairement familiaux (schéma 1).
Canee
u ein fa
l
•
ai
T0 s les cancers du sein
Figure 2 : Proportion de cas de cancer du sein familiaux et gènes de susceptibilité
connus: Seulement le quart des cas de cancer du sein familiaux sont expliqués par des
gènes connus. Il est aussi possible qu'il y ait une composante génétique dans les cas de
cancer du sein qui ne sont pas clairement familiaux.
7
1.2.6
AUTRES GÈNES DE SUSCEPTIBILITÉ
Suite à la découverte de BRCAl et BRCA2, les efforts se sont multipliés pour trouver un
nouveau gène BRCAX responsable du pourcentage restant des cas de cancer du sein
familiaux.
Malheureusement, ces recherches n' ont pas permis d' identifier un gène de
susceptibilité d' une pénétrance aussi forte que les deux précédents. Par contre, quelques
gènes de susceptibilité de pénétrance modérée ont été identifiés dont PTEN , ATM et
CHEK2 font partie, et qui sont responsables d' environ 5% des cas de cancer du sein
familiaux (17). Plus les recherches avancent et plus l' hypothèse du gène BRCAX est mise
de côté. En effet, si un tel gène existait, il serait probablement déjà connu, compte tenu des
nouvelles technologies permettant de faire le tour du génome et des nombreuses recherches
indépendantes effectuées pour l'identification d'un tel gène. Une nouvelle hypothèse a
donc vu le jour et propose que la susceptibilité héritée restante pourrait être causée par
l' effet combiné de plusieurs mutations de faible pénétrance (17).
Il existe trois classes de gènes de susceptibilité qui sont maintenant bien caractérisées soit:
les gènes de forte pénétrance, de pénétrance modérée et de faible pénétrance. Les stratégies
d'identification des gènes sont différentes pour chaque classe. Pour trouver des gènes de
susceptibilité de forte pénétrance qui ségrègent souvent avec la maladie, des études de
liaison seront utilisées.
Pour ce qui est des gènes de pénétrance modérée, c' est le
reséquençage de gène candidat qui est privilégié. Cette approche signifie que les gènes
sont choisis en fonction de leur implication potentielle dans le cancer du sein. De plus,
l' utilisation de cohorte enrichie de familles, ayant plusieurs cas de cancer du sein, est
souhaitable ainsi qu' une population contrôle pour vérifier si les mutations sont visibles plus
fréquemment, chez les cas que chez les contrôles. Finalement, les variants causals dans les
gènes de susceptibilité de faible pénétrance sont plus difficiles à trouver, étant donné que
l' allèle responsable de la susceptibilité peut être celui qui est le plus fréquent dans la
population. Il est donc important d'utiliser de très grandes cohortes d'individus pour avoir
le pouvoir statistique adéquat de déterminer si le variant se retrouve significativement plus
souvent chez les cas que chez les individus contrôles (10). Le tableau 2 présente un résumé
des trois différentes classes de gènes de susceptibilité et leurs caractéristiques respectives.
8
Tableau 2 : Caractéristiques des différentes classes de gènes de susceptibilité
GiDe de . ._ _tté.ëllê·:f'erte-.:i. ,.fIn. ..·
Exemples: BRCAI, BRCA2, TP53
• Type de mutation: Multiple, mutations entraînant une protéine tronquée
• Fréquence: Rare (fréquence des porteurs dans la populations ~ 0.1 %)
• Risque relatif: 10- à 20- fois
• Première stratégie d'identification: étude de liaision
~~~~~~~~~~~~~
Exemples: ATM, BRIP l, CHEK2, P ALB2
• Type de mutation: Multiple, mutations entraînant une protéine tronquée
• Fréquence: Rare (fréquence des porteurs dans la populations ~ 0.6%)
• Risque relatif: 2- à 4- fois
• Première stratégie d'identification: Reséquençage de gènes candidats
utilisant une grande cohorte enrichie génétiquement de cas et contrôle
. .~·_::••_ ;. . . . . . .~.~
de: .~~
Exemples: rs2981582 (FGFR2, 10q), rs3803662 (TNRC9)
• Type de mutation: Variant causal ou en déséquilibre de liaison avec le variant
causal. Peut survenir dans une région non codante
• Fréquence: Commun (fréquence des porteurs dans la populations 5-50%)
• Risque relatif: plus de 1.25 fois (hétérozygotes) ou 1.65 fois (homozygotes)
• Première stratégie d'identification: Étude d'association de centaines de
milliers de variants dans de grandes cohortes de cas et contrôles
Tiré de : Stratton et Rahman , 2008 (1 0)
2.
POURQUOI
UTILISER
FONDATRICE EN GÉNÉTIQUE?
UNE
POPULATION
L' analyse de ségrégation d'une mutation avec une maladie est facilitée par l'utilisation de
cohortes d' individus provenant d' une population fondatrice.
En effet, le fait d' utiliser des
familles nombreuses dont l'origine découle de peu d'immigrants rend la population plus
homogène et donc plus simple à étudier. La population québécoise est un bel exemple de
population fondatrice. En effet, le clergé encourageait fortement les naissances et tenait des
registres qui, maintenant, facilitent la reconstruction d'arbres généalogiques (18).
Les
familles sont donc très nombreuses et nous pouvons aisément remonter plusieurs
générations, ce qui aide évidemment la recherche en génétique.
9
3.
EFFET DES HORMONES SUR LE CANCER DU SEIN
3.1
EFFET DES ESTROGÈNES
Le tissu mammaire subit différentes transformations au cours de la vie de la femme. Ces
changements débutent avant la naissance et se poursuivent à la puberté, à la grossesse ainsi
qu' à la ménopause. Ces transformations sont régies par les hormones ovariennes comme la
progestérone et l'estrogène (19). Bien que ces hormones soient indispensables à plusieurs
étapes de la vie de la femme, elles peuvent s' avérer aussi néfastes. En effet, les estrogènes,
plus précisément l' estradiol (E 2 ) joue un rôle important dans le développement du cancer
du sein (20). La grande majorité des cancers, environ 95%, sont initialement hormonodépendants autant chez les femmes préménopausées que post-ménopausées.
Les
estrogènes sont donc essentiels dans le développement et la progression du cancer (20).
L' une des premières observations démontrant l'implication des estrogènes dans le cancer
du sein est que les femmes qui ont recours à une ovariectomie bilatérale ont une diminution
significative du risque de développer un cancer du sein. Plus la chirurgie est effectuée tôt
dans la vie de la femme, plus le risque diminue (21).
Une autre indication de leur
implication dans le cancer du sein est que la concentration d'estrogènes est beaucoup plus
grande dans les tumeurs du sein que dans les tissus normaux (22). Il est donc maintenant
courant de prescrire des antiestrogènes comme le tamoxifène dans le traitement ou la
prévention du cancer du sein.
Les mécanismes par lesquels les estrogènes peuvent être impliqués dans le développement
du cancer du sein ne sont pas encore parfaitement bien compris. Il existe tout de même
plusieurs hypothèses intéressantes.
L 'hypothèse la plus commune est que lorsque les
estrogènes se lient à leurs récepteurs, ils stimulent la transcription de gènes impliqués dans
la prolifération cellulaire. Les estrogènes agissent donc comme des stimulateurs de la
prolifération cellulaire. Par contre, chaque cycle de synthèse de l'ADN comporte un risque
d'erreurs encore plus important, dû à cette prolifération augmentée par les estrogènes. Si
les erreurs ne sont pas corrigées, elles peuvent engendrer des mutations qui pourraient
potentiellement provoquer un cancer du sein (23).
10
3.2
EFFET DE LA PROGESTÉRONE
La progestérone est essentielle au développement normal du sein, au cycle menstruel, à la
grossesse et à la lactation (24) . Nous avons longtemps pensé que la progestérone agissait
de façon opposée à l' estrogène dans le sein. Ces croyances provenaient de données in vitro
où l' on avait observé que l' addition de progestatifs réduisait la prolifération du cancer du
seIn. Par contre, les expériences in vitro comportent leurs limites et nous ne pouvons en
tirer des conclusions définitives (25).
Les recherches sur l ' hormonothérapie de
remplacement et le cancer du sein ont augmenté de façon significative ces dernières années
afin de pouvoir offrir ce qu 'il y a de mieux aux femmes.
Il y a maintenant beaucoup
d' évidences que la thérapie de remplacement combinée, c' est-à-dire estrogène et
progestérone, aurait plus d'effets négatifs que positifs (25).
Quoique l' effet de l' hormonothérapie de remplacement combinée soit beaucoup étudié dans
le cancer du sein, le rôle direct de la progestérone n'est pas clairement établi dû aux
nombreux résultats divergents. Une hypothèse probable du rôle de la progestérone est que
celle-ci agirait comme précurseur tandis que ses métabolites quant à eux joueraient le rôle
des hormones actives (24).
Effectivement, des études ont démontré que la progestérone
est convertie en deux classes de stéroïdes dans le tissu mammaire soit les 4-pregnenes et les
5a-pregnanes (26). Ces deux différentes classes possèdent des fonctions opposées dans le
cancer du sein.
En effet, une étude démontra que les cellules, traitées avec des 5a-
pregnanes telles que la 5a-pregnan-3a-ol-20-one, se voyaient stimulées à proliférer tandis
que celles qui étaient traitées avec des 4-pregnenes comme la 20a-hydroxyprogestérone
(20a-HP) avait une prolifération supprimée (27). De plus, dans le tissu mammaire normal,
la conversion en 4-pregnenes est plus grande que celle de 5a-pregnanes tandis que dans le
tissu tumoral, c'est la conversion en 5a-pregnanes qui est la plus grande. Finalement, la
conversion en 5a-pregnanes requiert l'enzyme 5a-reductase qui est significativement plus
élevée dans les tumeurs (27). Malgré ces avancées, beaucoup de travail reste à faire pour
bien connaître les différents métabolites de la progestérone et donc fournir une estimation
du risque que chacun entraîne.
Il
3.3
EFFET DES ANDROGÈNES
L'implication des androgènes tels que la dihydrotestostérone (DHT) et la testostérone dans
le cancer du sein est très controversée. Une des évidences marquantes de l' effet des
androgènes sur les estrogènes est que la suppression des androgènes chez un homme est
associée à une croissance du tissu mammaire (28). Étant donné leur rôle d' inhibition sur
les estrogènes, les androgènes deviennent donc d' excellents candidats dans le traitement du
cancer du sein. D' ailleurs, plusieurs études ont déjà été faites sur le sujet et ont confirmé
les effets bénéfiques des androgènes sur le cancer du sein. D' autres ont plutôt analysé
l' effet combiné des androgènes et des anti-estrogènes et ils ont découvert que l' effet
combiné était encore plus efficace que lorsque pris séparément. Cette dernière observation
nous donne des pistes de recherche dans l' analyse du mécanisme d' action des androgènes.
Beaucoup d'études sont en cours pour comprendre le mécanisme des androgènes sur
l' action des estrogènes. Par contre, une des hypothèses bien décrite est que les androgènes
réduisent la sensibilité des tumeurs aux estrogènes en diminuant leur nombre de récepteurs
(28).
Cette hypothèse nous fournit aussi l'explication de l'efficacité augmentée du
traitement du cancer du sein lors de l'utilisation combinée d'anti-estrogènes et
d'androgènes.
Bien que plusieurs évidences favorisent l'hypothèse que les androgènes exercent une action
antiproliférative sur le cancer du sein, certaines études quant à elles démontrent que les
androgènes, plus particulièrement la testostérone aurait plutôt un effet pro-estrogénique en
servant de précurseur à la formation de l'estradiol. L'une d'entre elles apporta la preuve
que la testostérone stimulait les cellules MCF -7, lignée du cancer du sein, par leur
aromatisation en estradiol (voie bleue sur le schéma) (29). L'explication possible de ces
divergences, dans les résultats, est qu'il y a en effet une transformation partielle de
testostérone en estrogènes dans les cellules de cancer ER-positive comme celles de la
lignée MCF-7. Donc, dans ce type de cellules, l'inhibition de la prolifération cellulaire se
fait principalement par la DHT (30).
De plus, les chercheurs ne s'entendent pas encore sur la voie favorisée dans la production
d'estradiol dans les tumeurs du sein.
Certaines études indiquent que le précurseur de
l'estradiol est préférentiellement l' androsténedione aromatisé en estrone qui ensuite est
12
transformée en estradiol plutôt que la testostérone via l' aromatase (voie rouge sur la figure
3) (29).
4 1
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1
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..
IIJI
Figure 3: Précurseurs dans la formation de l'estradiol: les deux différentes voies
pouvant mener à la formation d'estradiol sont illustrées en rouge et en bleue.
4.
FORMATION DES HORMONES
4.1
PAR LES GONADES
Les estrogènes sont responsables de la régulation des cycles du système reproducteur, la
grossesse, la lactation, le développement et le maintien des caractères sexuels secondaires
chez la femme. Avant la ménopause, ce sont les ovaires qui produisent la majorité des
estrogènes. Les hormones produites sont sécrétées dans le sang et se dirigent vers les tissus
13
périphériques cibles tels que le tissu mammaIre où l' apport estrogénique des ovaIres
représente environ 25% de la quantité totale d' estrogènes présente dans ce tissu. Les 75%
d' hormones résiduelles présentes dans les tissus périphériques sont produites à l' intérieur
même du tissu, à partir de précurseurs stéroïdiens provenant de la glande surrénale (Figure
4). À la ménopause, les ovaires cessent la production d' estrogènes et presque la totalité
d' entre eux sont produits localement à partir des précurseurs d' origine surrénalienne (31 ).
D' ailleurs, les humains et quelques autres primates sont les seuls mammifères à synthétiser
des hormones localement, dans les tissus périphériques, à partir du DHEA provenant des
glandes surrénales (32). Cette voie de biosynthèse, que l' on nomme intracrinologie, a été
récemment identifiée dans les laboratoires du Centre de recherche du CHUL.
14
GIa d
ou ,' utre '" ris ·, . s.
Figure 4: Origine de l'estradiol et de la testostérone dans la glande mammaire: une
partie est sécrétée par les ovaires tandis que l'autre est produite localement à partir de
précurseurs surrénaliens (28).
15
4.2
DANS LES TISSUS PÉRIPHÉRIQUES
Comme il a été décrit précédemment, les estrogènes et les androgènes sont en majorité
produites localement dans les tissus périphériques. Seulement une petite partie, 25% pour
les estrogènes et 50% pour la testostérone sont produites par les ovaires avant la
ménopause. Après la ménopause, la presque totalité des estrogènes est produite dans la
périphérie tandis que pour la testostérone, les proportions restent inchangées.
Pour
synthétiser les hormones actives telles que la testostérone, la DHT et l' estradiol les tissus
périphériques doivent posséder les enzymes requises pour transformer le précurseur
surrénalien, soit le DHEA, en hormones actives.
Les membres de la famille des
17~­
hydroxystéroïdes déshydrogénases contrôlent les étapes clés dans la formation et
l' inactivation de toutes les hormones sexuelles actives. Ces enzymes diffèrent entre elles
par le cofacteur utilisé, les substrats métabolisés et leur expression spécifique au niveau des
différents tissus (33). Les principales enzymes retrouvées chez l'humain dans les tissus
périphériques sont décrites à la figure 5.
<
SURRÉNALÈ\
<:::::
HSD-1
~
Sa réducœse-1
<:::::
'-.
RÉPONSE
ESTROGÉNIQUE
'-
RÉPONSE
ANDROGÉNIQUE
178 HSD-2
17 HSD-4
HSD-3
HSD-5
1tjrFïSD-2
17~
17~
A-DIONE
3a HSD-3
HSD-1
!
5a réductase-2
3a HSD-1
17~
17~
17~
A4-DIONE
3~ HSD-1
Sulfatase
!SUlmœSe
DHEA
3~
5-DIOL-S
DHEA-S
Jt
"
HSD-3
HSD-5
'Tfl RSU-2
'-
3a HSD-4
17~
Il
17~
ADT
epi-ACT
HSD-3
HSD-5
'-
3a-DIOL-G
ADT-G
ADT-S
3~-DIOL
"
E1 -G
E2 -G
17~ HSD-7
~
_
1 SU~
Sulfaœse
~ tra~~iéra~
1
1711 HSD-12
1711 HSD-2
17
11 HSD-4
.......
ÉLIMINATION
DES STÉROïDES
E1-S
Figure 5 : Enzymes de la stéroïdogénèse dans les tissus périphériques intracrines humains
~
0\
17
5.
FAMILLE DES
17~-HSDs
Jusqu'à récemment, il était généralement accepté que les hormones sexuelles étaient
produites exclusivement dans les gonades. Cependant, cette croyance fut démentie suite
aux études faites chez les hommes ayant subi la castration. Les chercheurs ont remarqué
que chez ces hommes, le niveau de testostérone sanguin était diminué de 90% à 95%, par
contre, leur DHT prostatique n' était diminué que de 50%. Ces études ont donc fourni
l' évidence d' une synthèse hormonale périphérique (34). De plus, comme il a été mentionné
précédemment, seulement 25% des estrogènes sont produits par les ovaires avant la
ménopause ce qui suppose une synthèse hormonale dans les tissus périphériques. Après la
ménopause, les ovaires cessent la production d' estrogènes qui seront produits localement
dans les tissus cibles.
Cette synthèse ne peut être possible qu' avec l' aide d' enzymes
permettant la conversion des précurseurs sanguins comme la DHEA.
Suite à ces découvertes et grâce à l'amélioration des techniques de clonage moléculaire,
une nouvelle famille d'enzymes a été identifiée, soit les
déshydrogénases
(17~-HSD) ,
17~-hydroxystéroïdes
dont 14 membres ont été répertoriés jusqu' à maintenant (35).
Comme il a été mentionné précédemment, ce sont des enzymes clés impliquées dans la
17~-HSDs
formation et l'inactivation des stéroïdes sexuels (36).
Précisément, les
responsables de l'interconversion des 17-cétostéroïdes en
17~-hydroxysteroïdes
plus efficacement à leur récepteur sous cette forme (32,37).
sont
qui se lient
Ces enzymes sont donc
impliquées dans le développement, la croissance et la fonction de tous les tissus
reproductifs autant chez les hommes que chez les femmes (32). Les membres de cette
famille partagent très peu d'homologie de séquence, ce qui reflète une évolution
convergente (36). Structurellement parlant, la plupart des membres de cette famille sont
des déshydrogénases/réductases à chaîne courte (SDRs) à l' exception de l'enzyme
17~­
HSD de type 5 qui est une aldo-céto réductase (AKR).
La
17~-HSD
de type 5 est donc l'unique
17~-HSD
superfamille des aldo-céto réductases (37).
dont la séquence d'ADN appartient à la
Les membres de cette superfamille ont la
propriété de métaboliser un grand nombre de substrats (38). Plus précisément, l'enzyme
17~-HSD
de type 5 possède un site de liaison aux substrats spacieux et flexible qui lui
18
confère une grande diversité d'activités (36). En effet, elle possède une activité 3a-, 17Bet 20a-HSD aussi bien que prostaglandine synthase (39).
Ces nombreuses activités,
combinées à la labilité de l'enzyme, ont rendu la tâche de caractérisation très ardue.
6.
CARACTÉRISATION DE LA 17~-HSD DE TYPE 5
6.1
HISTORIQUE
La caractérisation de l' enzyme 17 B-HSD de type 5 a été une tâche très complexe. En effet,
cette enzyme, en plus de posséder de nombreuses activités, est également très labile lors de
l'homogénisation des cellules (37). La méthode utilisée dans l' identification de l' activité
de l'enzyme était donc très importante pour éviter le biais des résultats. C'est d' ailleurs
pour cette raison que la 17B-HSD de type 5 a d'abord été qualifiée de 3a-hydroxystéroïde
déshydrogénase de type 2, car cette activité est la plus importante en homogénat (40). Par
la suite, une étude du Dr. Van Luu-The démontra qu'en cellule intacte, l'activité 17B-HSD
était beaucoup plus importante que l'activité 3a-HSD. De plus, ils ont aussi démontré que
la 17B-HSD de type 5 était présente dans la prostate ainsi que dans les cellules cancéreuses
prostatiques, ce qui rendait cette activité très intéressante. Cette même recherche a aussi
permis de découvrir que cette enzyme possédait également une activité 20a-HSD très forte ,
menant à l'inactivation de la progestérone en 20a-hydroxyprogestérone (37). Finalement,
elle occupe aussi une fonction de prostaglandine synthase et donc, stabilise les métabolites
des prostaglandines. Ceux-ci sont distribués dans pratiquement tous les tissus humains et
exercent plusieurs fonctions telles que la contraction musculaire et l'inflammation (41).
6.2
CARACTÉRISTIQUES
La 17B- HSD de type 5 aussi connue sous le nom de 3a-HSD2, convertit principalement
l' androst-4-ene-3, 17-dione (4-dione) en testostérone ainsi que la progestérone en 20ahydroxysprogestérone à l'aide du cofacteur NADPH (37,42). Le gène AKR1C3 encodant
cette enzyme est composé de neuf exons qui s'étendent sur 16 kb et est localisé sur le
chromosome 10p14,15 (43). De plus, ce gène encode une protéine de 323 acides aminés
(44).
Il possède 76% d'identité avec celui de la souris qui engendre sensiblement les
19
mêmes activités que chez l' humain mais à des pourcentages différents. De plus, la
17~­
HSD de type 5 de souris est stable en homogénat contrairement à celle de l' humain.
6.3 IMPLICATION POTENTIELLE DANS LES CANCERS RELIÉS
AUX HORMONES SEXUELLES?
Vu les multiples fonctions exercées par la
17~-HSD
de type 5, plusieurs recherches ont été
faites dans le but de déterminer sa distribution tissulaire.
Cette enzyme a donc été
retrouvée dans plusieurs tissus, dont la prostate et la glande mammaire où elle est fortement
exprimée (45).
Dans la prostate, elle catalyse principalement la conversion de ~ 4_
androstene-3, 17 -dione en testostérone (46).
Elle est donc responsable de réguler la
disponibilité des ligands aux récepteurs des androgènes, ce qui la rend très intéressante
dans l'étude du cancer de la prostate. De plus, des études ont déterminé qu' il y avait une
augmentation de l'expression du gène encodant cette enzyme dans différents types de
cancers de la prostate (47,48). Compte tenu des évidences démontrant un rôle de l'enzyme
17~-HSD
de type 5 dans la régulation des niveaux intratissulaires d'androgènes, quelques
études d' associations ont été effectuées jusqu'à maintenant pour déteminer l'implication de
certains variants de séquence dans le risque de développer un cancer de la prostate. Une
étude a vérifié l'effet de deux polymorphismes de ce gène dans le risque de cancer de la
prostate soit: c.15C/G et c.90G/A.
L'allèle rare du variant c.90G/A s' est montré
significativement plus fréquent chez les cas ayant eu un cancer de la prostate que chez les
contrôles (49). Par contre, aucune étude n'a confirmé ces données. Finalement, une étude
a analysé le taux de testostérone dans le sérum d'individus possédants certains
polymorphismes dans le gène AKR1C3. Elle a démontré que les personnes hétérozygotes
pour le variant p.Glu77Gly avaient un taux plus faible de testostérone que les personnes
ayant un génotype homozygote commun (50).
Cette enzyme est également intéressante dans l'étude du syndrome ovarien polykystique
qui est causé par un excès de testostérone. Une étude s'est donc intéressée à l'impact d'un
variant situé dans le promoteur sur l'activité transcriptionnelle. Ce variant, -71 G, situé près
du site de liaison au facteur de transcription Sp1/Sp3 démontre une augmentation
significative de l'activité du promoteur (51).
20
Finalement, très peu de recherches ont investigué l' impact potentiel de ce gène dans le
risque de cancer du sein. Pourtant, il a été démontré qu' il était très exprimé dans la glande
mammaire (48) et qu' il y avait des niveaux plus faibles dans les tumeurs du sein que dans
les tissus sains (52). Ces dernières constatations combinées aux fonctions occupées par la
17~-HSD
de type 5 dans la protection du sein font de cette enzyme une excellente
candidate dans l' étude de la modulation du risque de cancer du sein.
7.0 PROBLÉMATIQUE
ET
APPROCHES
EXPÉRIMENTALES DE L'ÉTUDE PRÉSENTÉE
Depuis la découverte des gènes de susceptibilité au cancer du sein, BRCA l et BRCA2 ,
plusieurs recherches ont été faites dans le but d'identifier un nouveau gène BRCAX d' aussi
forte pénétrance que les deux précédents. Par contre, jusqu' à maintenant, aucun gène de
cette envergure n' a encore été identifié. Étant donné que beaucoup de recherches ont déj à
été effectuées, une nouvelle hypothèse a émergé et nous croyons maintenant que ce serait
plutôt l' addition de plusieurs gènes de pénétrance faible ou modéré qui sont responsables
de la susceptibilité génétique restante.
La stratégie d'identification des gènes de pénétrance modérée privilégiée est le
reséquençage de gènes candidats dans une grande cohorte, emichie génétiquement, de cas
et de contrôle. Pour ce qui est des gènes de faible pénétrance, c'est l' étude d' association
dans de grandes cohortes de cas et contrôles qui doit être utilisée. Étant donné que nous
disposons, dans notre laboratoire, d'une cohorte de 50 femmes canadiennes-françaises nonporteuses de mutations dans les gènes BRCAl/2, ayant eu un cancer du sein et provenant de
famille à risque élevé et de 70 individus contrôles, nous pouvions procéder au reséquençage
de gènes candidats afin d' étudier ces gènes. Malgré le nombre restreint de cas à l' intérieur
de notre cohorte, elle demeure efficace pour déterminer la maj orité des variants de
séquence.
En effet, étant donné que nous sélectionnons les cas de cancer du sein en
fonction de leur forte histoire familiale de cancer du sein, cela diminue de beaucoup la
quantité d'individus requis pour identifier les variants de séquence.
D' ailleurs une
recherche a été faite à ce sujet et démontre que la quantité d'individus requis diminue de
beaucoup lorsqu'on sélectionne les cas selon l' histoire familiale (53).
21
Tableau 3: Pourcentages de réduction du nombre de cas requis sous un modèle
multiplicatif, en utilisant des cas ayant une histoire familiale de cancer du sein, afin
d'obtenir une puissance de 90% à un niveau significatif de 10-4.
Risque relatif = 2.0
Fréguence d'allèle
Risque relatif = 1.5
Fréguence d'allèle
Histoire familiale
0.01
0.05
0.10
0.20
0.30
0.01
0.05
0.10
0.20
0.30
Mère affectée
58.7
56.8
56.2
54.5
53.0
60.3
59.3
57.7
54.5
51.4
Mère et sœur
affectées
77.6
76.4
75.7
73.9
72.3
79.8
78.4
76.6
73.2
70.0
Cas bilatéraux
78.4
77.4
76.9
75.6
74.4
79.8
78.8
77.5
74.6
72.1
77.7
75.1
87.5
85.2
82.1
76.3
7l.0
Forte HF, incluant la
82.l
80.7
83.7
mère
Âge au diagnostic du cas index est de 45 ans.
Tiré de : Antoniou et Easton , 2003 (53)
Nous choisissons donc nos gènes selon leurs implications dans la formation des hormones
sexuelles. En effet, nous savons maintenant que l'exposition aux estrogènes est un facteur
de risque de développer un cancer du sein. À l'opposé des estrogènes, les androgènes
agissent comme protecteurs dans le tissu mammaire tout comme certains métabolites de la
progestérone.
Les membres des enzymes de la famille des 17f:3-hydroxystéroïdes
déshydrogénases sont responsables des étapes importantes dans la formation et
l'inactivation de tous ces stéroïdes sexuels. Plus particulièrement, la 17f:3-HSD de type 5
est une enzyme clé dans la formation des androgènes et dans l'inactivation de la
progestérone en métabolites protecteurs pour le sein. Notre objectif principal était donc
d'estimer le rôle potentiel du gène HSD17B5 (AKR1C3) dans la susceptibilité génétique au
cancer du sein.
Plus spécifiquement, nous avions trois objectifs principaux à réaliser:
déterminer s'il y a présence de mutations délétères, à l'intérieur du gène HSD 17B5,
pouvant être impliquées dans la susceptibilité génétique au cancer du sein, caractériser les
variants de séquence de ce gène et finalement, déterminer les tagging SNPs pouvant servir
d'outils dans de futures études d'association utilisant de plus grandes cohortes.
Pour réaliser cette étude, il est essentiel de débuter par un reséquençage de ce gène chez les
individus de notre cohorte. De cette façon, nous pouvons alors obtenir un grand nombre de
variants à caractériser soit in silico ou en laboratoire par des tests fonctionels, par exemple.
Étant donné que notre cohorte n'est pas assez grande pour déterminer la présence de
-
-
-
----
-
-
-
-- -
---
-
-
-
-
-
-
-
-
- --
-
-
-
-
22
différence significative entre la fréquence d' un variant chez les cas et les contrôles, il est
donc important de valider nos résultats dans de plus grandes cohortes. Cette dernière étape
est essentielle pour permettre l' association d'un variant avec le cancer du sein. Nous avons
donc déterminé les variants les plus informatifs pouvant être séquencés dans de plus larges
cohortes. Ces dernières informations permettront de diminuer les coûts et le temps reliés à
ces manipulations. Les recherches sur les gènes de susceptibilité au cancer du sein sont très
importantes. En effet, elles permettront, un jour, de bien cibler les femmes à risque élevé
de développer un cancer du sein et leur offrir un suivi personnalisé et donc, prévenir
l' apparition du cancer.
Au cours de ce présent ouvrage, nous essaIerons de répondre à différentes questions
concernant l' implication potentielle des variants de séquence du gène HSD 17B5 dans la
susceptibilité génétique au cancer du sein. Plus concrètement, voici quelques questions
auxquelles nous tâcherons de répondre: Existe-t-il une mutation délétère dans le gène
HSD1 7B5 ayant un effet important sur la formation des androgènes ou sur l' inactivation de
la progestérone? Existe-t-il d' autres variants de séquence ayant un léger effet sur ces
mêmes événements? Quels sont les variants les plus informatifs qui pourront être étudiés
dans de plus grandes cohortes?
CHAPITRE 1
24
Analysis of 17f3-Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 5 (AKR1C3) Genetic Sequence
Variants in Breast Cancer Cases from French Canadian Families with High Risk of
Breast and Ovarian Cancer
Alexandra Ferland l , Martine Tranchant 1, Penny Soucyl , Francine Durocher
l
,
INHERIT
1
BRCAst and Jacques Simard ,2*
1
Cancer Genomics Laboratory, Oncology and Molecular Endocrinology Research Center,
Centre Hospitalier Universitaire de Québec and Laval University, Quebec, G 1V 4G2,
Canada;
2 Canada Research Chair in Oncogenetics
t
Other members of INHERIT BRCAs involved in clinical aspects of the program are listed
in the Appendix.
*Corresponding author:
Dr Jacques Simard
Cancer Genomics Laboratory
CHUL Research Center, CHUQ
2705 Laurier Boulevard, T3-57
Quebec city (Quebec)
Canada, G 1V 4G2
Tel: (418) 654-2264
Fax: (418) 654-2278
E-mail: Jacgues.sÏlnard(cl)crchul.ulaval.ca
25
RÉSUMÉ
Les membres de la famille des
17~-hydroxystéroïdes
déshydrogénases
(17~-HSD )
sont
responsables d' étapes importantes dans la formation et l' inactivation des androgènes et des
estrogènes. La
17~- HSD
de type 5 est une enzyme clé dans la formation des androgènes et
l' inactivation de la progestérone en 20a-hydroxyprogestérone. En sachant que les
androgènes exercent une action antiproliférative sur le développement du cancer du sein et
que l' inactivation de la progestérone est aussi protectrice, il devient donc important
d' identifier des mutations germinales dans le gène encodant la
17~-HSD
de type 5 afin de
vérifier si elles peuvent être associées à une susceptibilité accrue au cancer du sein. Ainsi,
la séquence nucléotidique des 9 exons, des jonctions intron-exon, des régions 5' et 3' noncodantes et d'environ 1Kb du promoteur du gène HSD17B5 a été analysée chez 50 femmes
canadiennes-françaises ayant développé un cancer du sein et/ou de l' ovaire et possédant
une forte histoire familiale de cancer du sein et/ou de l'ovaire ainsi que chez 70 individus
contrôles non-apparentés.
Notre analyse extensive par re-séquençage ne supporte pas
l' existence de mutations délétères germinales dans les régions codantes de ce gène, ainsi il
apparaît peu probable que des mutations très pénétrantes dans ce gène comptent pour une
fraction significative de la susceptibilité au cancer du sein. Par contre, plusieurs variants de
séquence ont été détectés comprenant quatre variants entraînant un changement d' acide
aminé, ainsi que trois variants silencieux se retrouvant eux aussi dans les exons. Au total,
53 variants de séquence ont été retrouvés. L'impact potentiel des variants de séquence
faux-sens sur les propriétés catalytiques de l'enzyme a été investigué dans des cellules
HEK293.
Ces expériences ne nous ont pas permis de démontrer que les changements
d'acides aminés avaient un effet significatif sur l'activité de l'enzyme.
Finalement, grâce
aux logiciels Phase et ' Haploview, nous avons estimé les différents haplotypes que l' on
retrouve dans notre population et identifié Il SNPs marqueurs. Ces données fourniront un
outil maj eur pour de futures études d'association cas-contrôle ayant pour but de déterminer
le rôle potentiel de ce gène dans le risque de cancer du sein.
26
ABSTRACT
A family history and estrogen exposure are well-known risk factors for breast cancer.
Members of the 17f3-hydroxysteroid dehydrogenase family are responsible of important
steps in the formation and inactivation of androgens and estrogens in peripheral tissues,
including the mammary gland. The crucial biological function of 17f3-HSDs renders these
genes good candidates for being involved in breast cancer etiology. This study was thus
designed to screen for mutations in 17f3-HSD type 5, an enzyme involved in androgen and
progesterone metabolism, in order to assess whether high penetrance allelic variants could
be involved in breast cancer susceptibility. The complete sequence of the coding exons,
flanking intronic sequences, 5' - and 3' -untranslated regions and 1 Kb of the promoter
region was analyzed in genomic DNA from 50 breast cancer cases from BRCA l- and
BRCA2-negative French Canadian families with high risk of breast and ovarian cancer.
The presence and frequency of variants was also ascertained in healthy unrelated French
Canadians.
The impact of missense variants on the enzyme' s catalytic properties was
assessed in non-steroidogenic HEK293 cells. Mutation screening of 50 breast cancer cases
failed to identify deleterious germline mutations, and therefore mutations in this gene do
not explain the clustering of breast cancer cases in non-BRCAl/2 high-risk French
Canadian families. Numerous sequence variants were identified, including four missense
variants. In aIl, 53 variants were found. Catalytics properties of mutated enzymes were
similar to those of the wild-type enzyme. FinaIly, a haplotype-based approach was used to
determine Il tagging SNPs providing valuable information for future studies investigating
common disease-associated variants in this gene with breast cancer risk.
27
INTRODUCTION
Breast cancer is the most common malignant form of cancer among occidental women.
Although the major susceptibility genes BReAl and BReA2 have been identified as highpenetrance alleles, these alleles only account for approximately 15-20 % of the familial
component of breast cancer (1-3). A recent study by our group has demonstrated that
among French Canadians, about two-thirds of the high-risk families tested for the presence
of mutations in the BReAl and BReA2 genes will yield an inconclusive result (4),
suggesting the existence of either other high-penetrance genes or multiple alleles of low to
moderate penetrance (5).
Sex steroid hormone signaling regulates the development and functioning of the normal
mammary gland and plays a role in the etiology of breast cancer. The contribution of
estrogens in the regulation of cellular growth, differentiation and proliferation of the
mammary gland as weIl as in hormone-sensitive breast carcinomas is now welldocumented (6, 7). Recent evidence also suggest that progesterone metabolites may play
important roles in regulating the development of breast cancer. Epidemiological studies of
hormone replacement therapy in post-menopausal women demonstrate an increased risk of
breast cancer under combined estrogen/progestin therapy. However, evidence tends to show
that the nature of the progestin component in combined hormone therapy is of importance
regarding breast cancer risk (8, 9). Increasing evidence also indicates that androgens rather
exert inhibitory effects on the proliferation of the breast epithelial cells and play a
protective role in the pathogenesis of breast cancer (for review see (10)). The intracellular
concentration of active sex steroid hormones in the breast is regulated by several enzymes,
and changes in the expression pattern of these enzymes may play a pathophysiological role
in malignant transformation, by significantly altering the intracellular steroid content.
Indeed, several recent studies have reported altered expression levels of several steroid
hormone metabolizing enzymes in human breast carcinoma (11, 12) and therefore the
analysis of genetic variations potentially responsible of the modulation of either expression
levels or activity of these enzymes in the mammary gland, is an interesting venue to
possibly explain an increased susceptibility to breast cancer.
28
Human
17~-hydroxysteroid
dehydrogenase
(17~-HSD)
type 5 belongs to the aldo-keto
reductase (AKR) superfamily (13) and is widely expressed in human tissues including the
prostate, endometrium and mammary gland (14). It is an enzyme that participates in the
biosynthesis and metabolism of a variety of substrates including androgens (15), estrogens
(14), progestins, prostaglandins (16) and polycyclic aromatic hydrocarbons (17). The
enzyme possesses a weak 17-keto reductase activity towards estrogens, converting estrone
to the more potent estradiol, and also shows a stronger 17-keto reductase activity towards
androgens, reducing the weak androgen i14-androstenedione to testosterone (18). With
regard to this activity, a recent study has suggested that the AKRl C3 gene was associated
with enlarged prostate in oider men (19). Other reports have provided suggestive findings
for an association of AKRl C3 polymorphisms with testosterone levels in serum (20) and
with familial prostate cancer, although these latter results were not significant after
correction for multiple comparisons (21).
The enzyme also possesses a strong 20a-hydroxysteroid dehydrogenase activity through
which it catalyzes the reduction of progesterone to 20a-OH-progesterone. Studies by
Wiebe et al. have demonstrated that 4-pregnene and 5a-pregnane progesterone metabolites,
such as 20a-OH-progesterone, formed in non-tumorous and tumorous breast tissues have
opposite effects on breast cell proliferation and adhesion. More precisely, the resulting
higher levels of 5a-reduced progesterone metabolites in tumorous tissue promote cell
proliferation and detachment, whereas the 4-pregnene metabolites, more prominent in
normal tissue, have the opposite effects (22). These results coupled with altered AKRl C3
expression levels in breast tumors as compared to normal tissue (11, 12), renders this gene
an attractive candidate that might explain a fraction of the remaining inherited
susceptibility to breast cancer.
The CUITent study was thus designed to determine whether AKRl C3 might contain
mutations possibly involved in breast cancer susceptibility, by directly sequencing 1.5 Kb
of the promoter/5 ' -UTR region, the nine coding exons and flanking intronic sequences of
the AKRlC3 gene in DNA samples from individuals affected with breast cancer from nonrelated BRCAl and BRCA2-negative high-risk French Canadian breast/ovarian families.
29
MATERIALS AND METHODS
Ascertainment of high-risk families and DNA extraction
The recruitment of French Canadian families with high-risk of breast and ovarian cancer
started in 1996 trough a research project, which thereafter evolved in a large ongoing
interdisciplinary research program designated INHERlT BRCAs. More details regarding
ascertainment criteria, experimental and critical procedures as weB as the INHERIT
BRCAs research program have been described elsewhere (4). A major component was to
identify and characterize the prevalence and penetrance of BRCAl and BRCA2 mutations in
French Canadian high-risk families (4, 23). Subsequently, another component was designed
for the « Localization and identification of new breast cancer susceptibility loci/genes ».
Ethics approval was obtained from the different institutions participating in this research
component and each participant had to sign an informed consent for their participation in
this latter project (24). A subset of 50 high-risk French Canadian breast/ovarian cancer
families were recruited in the present study according to the presence of multiple cases of
breast cancer, among which 45 included at least 3 individuals with breast cancers within 2 nd
degree relatives, while five families included three or more individuals within 3rd degree
relatives. AB participants had to be at least 18 years of age and mentaBy capable. The
diagnoses of breast and/or ovarian cancer were confirmed by a pathology report. When two
or more subjects were available within a family, the youngest subject was systematicaBy
chosen for this study. The mean age at diagnosis of these 50 subjects affected with breast
cancer was 47.7 years old (34-69 years), while 35 of them have been diagnosed before 50
years of age and 8 had bilateral breast cancer. The BRCA1/2 status of each participant was
previously assessed (4). Evidence of the absence of genomic rearrangements in BRCAl/2
genes was investigated by Multiplex Ligation-dependant Probe Amplification (MLP A) for
42 of the 50 subjects (BRCA1/2 Southern analyses were done for 32 of these 50 subjects).
For four of the remaining subjects, MLPA was performed on another individual of the
family (25), while for two subjects this analysis was not performed in their family.
Genomic DNA from 70 healthy unrelated French Canadian individuals was obtained from
Dr Damian Labuda at the Centre de Cancérologie Charles Bruneau, Hôpital Ste-Justine,
30
Montreal, Canada. The individuals who provided these samples were recruited on a nonnominative basis, in the framework of long-term studies aiming the characterization of the
genetic variability in human populations, approved by the Institutional Ethic Review Board.
The mean age ofthese individuals was 47.1 years old.
PCR amplification, mutation analysis and sequence variant identification
Sequencing in both directions of the nine coding exons, flanking intronic sequences, 5' and
3' non-coding regions and 1500 bp of the promo ter region of the AKRl C3 gene was
analyzed in DNA samples obtained from Epstein-Barr virus (EBV)-transformed Blymphoblastoid cell lines of 50 affected individuals. Eleven primer pairs were used to
amplify the fragments and their sequence is indicated in Supplemental table 1 A. The
frequency of variants was also ascertained in 70 healthy umelated French Canadians.
AKR1C3 direct sequencing was performed on an ABI Prism 3730xl DNA Analyser
automated sequencer using version 3.1 of the Big Dye fluorescent method according to the
manufacturer's instructions (Applied Biosystems, Foster City, USA). Sequence data were
analyzed using the Staden preGap4 and Gap4 programs. GenBank accession numbers for
the AKR1C3 reference sequences used in these experiments were NT 077567.3 and
NM 003739.4.
Linkage disequilibrium analysis, haplotype estimation and in silico analysis
tools
The D' and r2 statistics of the Haploview program (26) were used to calculate the pairwise
LD for each sequence variant pair in the whole case-control set. Haplotype reconstructions
and frequency estimations were performed using Phase 2.1.1 software (27). This program
estimates haplotype frequencies with a Bayesian-based algorithm and then uses a
permutation test to determine the significance of differences in inferred haplotypes between
cases and controls. Haplotypes were estimated using SNPs with minor allele frequencies
(MAF) 2: 5% in controls individuals. Genotype and marker data from controls individuals
as weIl as data from the International HapMap project data (http://wwww.haplnap.org) for
the CEPH trios (public data release of April 2007) were loaded into the Haploview
31
software
(http ://www.broad.mit.eduhnpg/haploview)
(28)
for
haplotype
block
identification. The default algorithm of block definition based on work of Gabriel et al. (29)
was selected. Tagging SNPs (tSNPs) from each LD block, efficiently tagging all the known
common variants (MAF 2: 5%), were then identified using the same software.
Analysis of transcription factor binding sites in the promoter region was performed using
MatInspector from Genomatix (30). Splice site prediction scores were evaluated using
splice
site
prediction
fruitfly .0rg/seCLtools/splice.html)
by
neural
and
network
Alex
Dong
(SSPNN;
Li' s
splice
http://www.
site
finder
(http://www.genet.sickkids.on.ca/ali/splicesitefinder.html; (31 )), while exonlC splicing
enhancers
were
analyzed
uSlng
the
ESEfinder
pro gram
(available
at
http://rulai.cshl.edu//cgi-bin/tools/ESE3/esefinder.cgi) (32). The effect of amino acid
substitutions
was
evaluated
using
sorting
http://blocks.fucrc.org/sift/SIFT.html;
intolerant
(33))
from
and
tolerant
(SIFT;
PolyPhen
(http ://genetics. bwh.harvard.edu/pph/; (34)).
Site-directed mutagenesis
Site-directed mutagenesis was performed on an expression vector containing the full-Iength
cDNA fragment encoding the complete amino acid sequence for human type 5 17~-HSD
(kindly provided by Dr Van Luu-The, CHUL Research Center, Quebec, Canada) inserted in
the pcDNA3.1 vector (Invitrogen), using the QuickChange Site-directed mutagenesis kit
from Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA) according to the
supplier' s protocol. Insertion of the desired mutation was confirmed by direct sequencing
of both strands using Big Dye Terminator chemistry on an ABI Prism 3730xl automated
sequencer from Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA). The primer
sequences used for insertion of the c.15C>G, c.230A>G, c.638C>T and c.648A>G
mutations are indicated in Supplemental table 1 B.
32
Transcription/Translation
Transcription/translation
was
performed
uSlng
the
TNT®
T7
Quick
Coupled
Transcription/Translation System from Promega (Promega Corporation, Madison, WI)
according to the manufacturer' s instructions, as previously described (35).
Cell culture and Transfection
Human embryonic kidney 293 cells (HEK293) were cultured in Dulbeccos' modified
Eagles medium (DMEM)/low glucose from Invitrogen Life Technologies, Inc. (Grand
Island, NY) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 1% glutamine, 100 l U/ml
penicillin and 50 mg/ml streptomycin from Wisent, Inc. (St-Bruno, Québec, Canada). Cells
were then seeded in 6-well culture dishes and transient transfection was performed using
ExGen 500 cationic polymer transfection reagent (MBI Fermentas Inc, Ontario, Canada)
according to the supplier's protocol. Briefly, cells were transfected with 3
~g
of constructs
containing the wild-type and mutants and 1 ~g of pSV -(3-galactosidase DNA (Promega) as
a control for transfection efficiency.
Western analysis
Western analysis of proteins was performed by sodium dodecyl sulfate (SDS)-PAGE on
discontinuous acrylamide gels. HEK293 cells were washed in phosphate buffered saline
and cell lysis was performed using standard procedures. Total proteins (15
~g)
were
separated on a 40/0 stacking and 12% resolving gel and transferred onto a nitrocellulose
membrane (Hybond-ECL, Amersham Pharmacia Biotech Inc. Picastaway, NJ, USA).
Thereafter, the membrane was hybridized to a polyclonal antibody directed against human
17(3-HSD type 5 (kindly provided by Dr Van Luu-The) at dilution of 1:2000 and
subsequently incubated with a donkey anti-rabbit IgG peroxidase conjugated secondary
antibody (Amersham Pharmacia Biotech Inc. Picastaway, NJ) at dilution of 1:10 000.
Membranes were washed and proteins were visualized using the Western lightning™
chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer), followed by exposure of the membranes
33
to X-ray films for 1-10 min. The audiographic film was scanned and the ImageJ program
(NIH, USA) was used to quantify the density of the autoradiographic bands.
Assay of 17p-HSD type 5 enzymatic activity
14
Transfected cells were incubated 0, 4, 8, 12, 18 and 24 hours with either 10nM [4_ C]_
androst-4-ene-3 ,17-dione (56mCi/mmol) (American Radiolabeled Chemicals inc. , StLouis, MO) (17f3-HSD activity) or [4_ 14 C]-progesterone (55 ,40mCi/mmol) (NEN/
PerkinElmer Life Sciences, Inc., Boston, MA) (20a-HSD activity). After the indicated time
intervals, steroids were extracted by addition of 2 volumes of diethy 1 ether and the
incubation mixture was chilled in a dry-ice/ethanol bath. Steroids were separated by thin
layer using a mobile phase of toluene:acetone (4: 1) and analyzed using phosphorimaging,
Storm 860 (Molecular Dynamics, Inc., Sunnyvale, CA). AlI results are expressed as the
mean ±SE of at least two separate transfection experiments performed in triplicate.
34
RESUL TS AND DISCUSSION
AKR1C3 mutation analysis and variant characterization
Exposure to elevated concentrations of sex steroids is associated with the etiology of breast
cancer. Based on the pivotaI role of AKRl C3 in estrogen, progesterone and androgen
metabolism and given the demonstration of its altered expression in mammary tumors, this
gene represents a potential candidate gene to possibly explain a fraction of the remaining
inherited susceptibility to breast cancer. The present study was thus designed to screen for
high penetrance variants involved in breast cancer susceptibility. In order to increase the
likelihood of potentially identifying genetic variants associated with breast cancer risk,
individuals from French Canadian high-risk breast cancer families without BRCA 1/2
mutations were selected (36). Mutation analysis failed to reveal the presence of truncating
mutations in the AKRl C3 co ding region of our French Canadian breast cancer cases.
However, 53 sequence variants were identified in the exonic, flanking intronic and
promoter sequences (Figure 1, panel A) (Table 1), which included eight promoter variants
(arbitrarily defined as a 1500 bp genomic segment upstream exon 1), seven coding variants,
four of which resulted in amino acid changes, two variations located in the 3' -UTR region,
while the remaining 36 were intronic sequence variations. Among the 53 variants, 49 are
single nucleotide substitutions, while the four remaining variations consist of three short
deletions and one 1bp insertion. Ten of these variants were novel while forty-three were
reported
in the
single
nucleotide polymorphism database
(www.ncbi.nlnl.njh.gov/SNP).Thirty-five
of the
(dbSNP
observed variants
Build
are
129)
common
polymorphisms with minor allele frequencies (MAF) 2:5%, 12 of which are very frequent
(MAF '"" 30-40%), while 18 of the identified variants are considered rare variants since they
display frequencies :S 5% (Table 1).
In silico analysis ofpromoter variants
Promoter analysis using the MatInspector pro gram of Genomatix (30) revealed that, of
these variants, variant #3 (g.5076041C>A) created a novel GATA binding site in the
promoter region of the AKRl C3 gene. Interestingly, four consensus GAT A elements are
35
found within the frrst 1.5 kilobases of the AKR1 C3 promoter, rendering this gene a
potential target for GA T A factor regulation. The creation of an additional consensus
element by SNP #3 could represent a potential mechanism that may be involved in altered
AKR1 C3 expression levels in individuals harboring this variation. Indeed, the GAT A
transcription factors are emerging as important regulators of steroidogenesis (37) and
several key enzymes involved in steroid hormone metabolism are target genes for GAT A
factors, including HSD1 7B1 (38), HSD3B1 (39), HSD3B2 (40), CYP 17 (41 , 42) and CYP 19
(43). It is interesting to note that, within the GATA protein family , GATA-3 was identified
as an essential regulator of mammary gland morphogenesis and is also involved in the
regulation of tumor differentiation and suppression of tumor dissemination in breast cancer
(44-46). Further analyses, which are beyond the scope of the current study, will be
necessary to determine the contribution of GAT A factors to AKR1 C3 transcriptional
activity as weIl as the potential variation of promo ter activity induced by the presence of an
additional GAT A consensus element. However, taking into account that SNP #3 is a rare
variant (MAF ::; 1%) observed at a heterozygous state in one breast cancer case and one
control individual, its relevance in the development of breast cancer appears rather unlikely.
A previously reported promoter SNP (SNP #8, g.5076499A>G), shown to significantly
increase the transcriptional activity of the AKR1 C3 promoter by increasing the binding
affinity for Sp 1/Sp3 transcription factors (47), was also observed in our cases as weIl as in
our controls albeit at similar frequencies in both samples sets (MAF 0.41 vs 0.33).
In addition to the sites mentioned above, three potentially interesting additional
transcription factor binding sites are created by polymorphisms #2 and #4 in the promoter
region of the AKR1C3 gene, as estimated by the Genomatix software. Variant #2
(g.5075582G>T) creates a new binding site for Fork head domain factors, which are
essential in a wide range of cellular and developmental processes. Of most importance in
the context of the CUITent study is the implication of the forkhead gene in tumorigenesis and
particulary in cell-cycle control (48). This same variant also creates a binding site for
SOX/SOY-sex/testis determining and related HMG box factors. Members of the Sox
prote in family are transcription factors, with sorne being transcriptional activators while
others are repressors, depending on the requisite partners for target specificity (49). A
member of this family, SOX4, is expressed in normal breast tissue and in breast cancer
36
cells and is transcriptionally regulated by progesterone (50). This variant was observed only
once at a heterozygote state in our breast cancer cases. Lastly, variant #4 (g.5076148A>G)
creates a new binding site for cellular and viral myb-like transcriptional regulators. C-myb
is known to be a proto-oncogene and Myb-related protein B was shown to be deregulated in
breast cancer (51). The associated variant is very frequent with MAF
:s 30% for cases and
40% for controls.
Assessment of the impact of missense substitutions on 17BHSD5 enzymatic
activity
Among the exonic variants, four resulted in amino acid changes (p.His5Gln, p.Glu77Gly,
p.ProI80Ser, p.LysI83Arg). The first non-synonymous co ding SNP, p.His5Gln, is a
frequent variant (MAF 0.3 in cases and 0.4 in controls) located in exon 1. It codes for a
histidine to glutamine change, which are basic and acidic residues respectively, but whose
structures are quite similar. Comparison of ortholog and several paralog sequences revealed
that this residue is poorly conserved across species as weIl as in other members of the aldoketo reductase family (data not shown). ln silico analyses revealed that the change from a
histidine to a glutamine is predicted to be a tolerated change and therefore probably have
little impact on prote in structure (34, 52). In support of these predictions, functional
analyses in non-steroidogenic human embryonic kidney cells revealed that the mutant GInS
enzyme possesses similar activity to the wild-type enzyme, and this for its 17-keto-activity
as weIl as its 20-keto-activity (Figure 2, panel A and B). A previous study found that the
His5Gln polymorphism was associated with lung cancer, suggesting functional impact on
the oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons to catechol through its 3-keto-activity,
however due to the small sample size, additional studies are warranted to confirm this
association (53), as weIl as the real effect ofthis polymorphism on the enzyme's activity.
The second missense substitution (p.Glu77Gly) has a MAF of 10% in cases and controls
and involves a more drastic change from an acidic, polar, hydrophilic amino acid to a very
small, aliphatic, non-polar, hydrophobic residue. Alignment of AKR1C3 ortholog and
several paralog sequences revealed that this amino acid is conserved in aIl species,
including more distant species like Xenopus tropicalis and Takifugu rubripes, as weIl as in
other members of the AKR family. Given that this residue is invariant from hum an to frog ,
37
this could suggest that this position is under strong functional constraint. In support of this,
analyses using Polyphen and SIFT softwares predicted this change to be damaging to
protein structure. Functional analyses show that for both the 20-keto and 17-keto-activities,
the Gly77 substitution appears to slightly decrease the activity compared ta the wild-type
enzyme. These observations are in accordance with a recent study by Jakobsson et al.
which reported an association between the p.Glu77Gly polymorphism and lowered
testosterone levels in serum (20). Functional analysis revealed a tendency for decreased
activity of the polymorphic Gly77 enzyme, although this difference was not significant.
However, as stated by the authors, the crude bacterial celllysates used in the study may not
be sensitive enough to detect a mode st decrease in activity. Furthermore, bacteria may not
be an ideal system for investigating potential differences in activity resulting from posttranslational events. Although a tendency toward reduced activity is observed in bath
studies, more refined enzymology experiments will be required to determine the precise
impact of the variant on catalytic efficiency of this enzyme.
The two remaining missense variants are rare polymorphisms only observed in control
individuals. The first involves a change from a proline to a serine residue at position 180
located in exon 5. This variant involves a change from a cyclic, non-polar amino acid ta a
polar, hydrophilic residue. The second substitution involves two basic, polar, hydrophilic
residues which are structurally fairly similar. Alignment of AKRl C3 orthologue sequences
revealed that both positions are highly conserved across species as weIl as in several
members of the AKR superfamily (data not shown). Despite this high level of conservation,
the impact of these variants on protein structure or enzymatic activity is likely negligible
since these variants were only observed in our control series. In accordance with this, in
silico analyses predicted these variants to be benign or tolerated for protein folding.
Furthermore, in vitro assessment of enzymatic activity does not reveal a significant change
of activity of these two recombinant enzymes as compared to wild-type (Figure 2).
Regarding the possible effect of p.His5Gln, p. Glu77Gly, p.Pro 180Ser, p.Lys 183Arg
missense variants as weIl as that of the remaining exonic variants on ESE, analysis of the
scores revealed that none of these variants significantly altered the binding capacity of
putative ESE elements.
38
In silico analysis of the effect ofintronic variants on splicing
The possible effect of aU intronic variants on splicing consensus sequences was also
assessed using in silica analysis with SSPNN program. Four of the genetic variations,
namely g.5080980T>C (c.370-14T>C), g.5081137A>G (c.447+66A>G), g.5081307C>G
(c.448-212C>G) and g.5081530G>A (c.459G>A), significantly altered the splicing score of
either an acceptor or donor site thereby potentiaUy affecting pre-mRNA splicing. Variant
c.370-14T>C abolishes exon 4 donor site, which could mean skipping of this exon.
Variants c.447+66A>G and c.448-212C>G create new donor and acceptor sites resulting in
the addition of 61 nucleotides to exon 4 and 208 nucleotides to exon 5, respectively, while
variant c.459G>A increases the score of a pseudo-donor site in exon 5, potentiaUy resulting
in the exclusion of the last 109 nucleotides of exon 5 from mRNA. To further assess the
possible effect of these intronic variants on splicing at the mRNA level, PCR analyses were
performed on cDNA from carriers of these SNPs. Unfortunately, these analyses failed to
reveal evidence of aberrant splicing in carriers of aU these variants (data not shown).
LD, haplotype analysis and tSNP identification
Although no high penetrance variations were identified in the AKRl C3 gene which could
be associated with breast cancer risk, the current study provides relevant information on
AKRl C3 intragenic linkage disequilibrium (LD) and haplotype diversity and leads to the
identification of tSNPs, which wiU reduce genotyping costs and efforts in future large-scale
association studies without loss of power. tSNP identification is aU the more important
considering the limited variant data information currently available in the HapMap
database.
Pairwise LD between aU 53 variants identified in the control series was first calculated
using the LDA program, and r2 measures between aU variants are iUustrated in Figure 3. As
demonstrated, three LD blocks were identified in the AKRl C3 gene. The first block
encompasses a region from exon 1 to intron 5, the second block represents a region from
intron 5 to intron 8, which includes exons 6-8, while the third block includes part of intron
8 and the last exon. OveraU, there is no evidence of strong LD between the identified
variants in the AKRl C3 gene. The r2 coefficient is astringent measure that is sensitive to
39
aIlelic frequency variation, which is weIl represented by a large variability in the AKRI C3
gene. This variability may reflect the presence of a recombination hotspot in this genomic
region. Interestingly, two of the missense substitutions observed in this study, p.His5Gln
and p.Glu77Gly, are in perfect LD with respectively three and two variants. One of the
SNPs having a r 2 =1 with p.His5Gln was genotyped in the Cancer Genetics Markers of
Susceptibility study (CGEMS) involving a large cohort of breast cancer cases and controls
from the Nurses Health Study. This study failed to discover any association between this
variant and breast cancer. The lack of effect of this variation on enzymatic activity, as
iIlustrated in Figure 2, supports this non-association. p.Glu77Gly was previously reported
to be associated with circulating testosterone levels (20). As discussed previously, the
assessment of the effect of this variant on the enzymatic activity of the 17BHSD5 enzyme
did not reveal a significant difference in the conversion levels of progesterone and
androstenedione as compared to the wild-type enzyme (Figure 2). However, since
p.Glu77Gly is in perfect LD with SNPs #17 (g.5080980T>C) and #19 (g.5081262G>T),
these cannot be excluded as being the causal variants. These SNPs are located in intronic
regions proximal to exons 4 and 5 respectively. However, as discussed previously, although
in silico analyses predicted a loss of exon 4 acceptor site for variant # 17, PCR amplification
performed on the cDNA of carriers of this SNP did not show the presence of any
alternative splicing forms (data not shown).
Given that the association of a gene with disease may be aIlele-specific, the haplotype
diversity of AKRI C3 was estirnated with the use of the software PHASE. When using the
35 cornmon variants genotyped in this study (MAF2:5% ), the software estimated 19
haplotypes, 6 of which represent 85% of aIl estimated haplotypes in our French-Canadian
control sample set. Thereafter, considering haplotypes having a frequency 2:50/0, Il tSNPs
were identified using Haploview in our population and determined to be necessary for the
discrimination of aIl observed haplotypes. However, in order to efficiently tag only the 6
most common haplotypes only 4 tSNPs are necessary (Figure 4). Considering the large
number of variants found in this gene, narrowing down the genotyping to only four SNPs
provides a valuable, cost-efficient tool for future association studies.
40
CONCLUSION
Despite its role in sex steroid synthesis and metabolism in the mammary gland, our analysis
does not suggest a strong involvement of the AKRl C3 gene in breast cancer susceptibility.
N onetheless, additional studies are needed to determine the functional contribution of the
promoter sequence variants on AKRl C3 gene expression. Further association studies
involving larger cohorts of breast cancer cases are also warranted to establish whether
AKRl C3 could represent a low or moderate penetrance gene involved in breast cancer risk.
41
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors are indebted to the participants and their families for their generosity and
providing DNA samples. We thank Dr Damian Labuda from Centre de cancérologie
Charles Bruneau, Ste-Justine Hospital, for controls DNA samples. We would like to thank
Dr Martine Dumont and Carolle Samson for sample management, mutation screening, and
skillful technical assistance as well as Tina Babineau, Nathalie Bolduc, Claire Brousseau,
Marie-Andrée Lajoie, Pascale Léger, Hélène Malouin, Andrée McMillan and Josée
Rhéaume, for genetic counselling and clinical data management at the Cancer Genomics
Laboratory. We also thank Geneviève Ouellette for establishment of EBV -transformed Blymphoblastoid cell lines and RNA and genomic DNA extractions. We thank Claudia
Moreau at the Centre de Recherche de l'Hôpital Ste-Justine for help with control DNA
samples. We also appreciate advice received from ethics committees. This work was
supported by the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) through the INHERIT
BRCAs research program, the Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ)/Réseau
de Médecine Génétique Appliquée (RMGA), the CURE Foundation and the Canadian
Breast Cancer Research Alliance (CBCRA). J.S. is Chairholder of the Canada Research
Chair in Oncogenetics and F.O. is a recipient of a chercheur-boursier from the Fonds de la
Recherche en Santé du Québec (FRSQ) and a Research Career Award in the Health
Sciences from CIHRlRx&D Health Research Foundation.
42
APPENDIX
Other members ofINHERIT BRCAs involved in clinical aspects of the program.
Paul Bessette: Department of Obstetrics and Gynecology, Centre Hospitalier Universitaire
de Sherbrooke, Fleurimont, Canada
Jocelyne Chiquette: Clinique des maladies du sein Deschênes-Fabia, Hôpital du SaintSacrement, Québec, Canada
Rachel Laframboise: Medical Genetics Division, Centre Hospitalier Universitaire de
Québec, CHUL, Laval University, Québec, Canada
Jean Lépine: Haemato-Oncology Service, Centre Hospitalier Régional de Rimouski,
Rimouski, Canada
Bernard Lespérance, Roxane Pichette: Department of Haemato-Oncology, Hôpital du
Sacré-Coeur de Montréal, Montréal, Canada
Marie Plante: Gynecology Oncology Division, Hôtel-Dieu de Québec, Centre Hospitalier
Universitaire de Québec, Laval University, Québec, Canada
43
FIGURE LEGENDS
Figure 1. Genomic structure of the human HSD17B5 gene. On the gene, the promo ter
region is indicated by a white box and introns by solid broken lines. Exons are represented
by proportionally sized dark boxes, while the 5' and 3' untranslated regions are in light
gray on the gene and mRNA structure. The GenBank accession numbers corresponding to
the AKRl C3 contig, mRNA and prote in are indicated below the respective nucleotide and
protein sequence. The conserved active site residues are illustrated on the protein structure.
AlI sequence variants are indicated in open boxes while amino acid nomenclature is also
represented.
Figure 2. Comparison of expression levels and activity of mutant recombinant
17~-HSD
type 5 proteins. (A) Representation of an in vitro transcription/translation (TNT) rabbit
reticulocyte lysate assay showing that each pcDN A3 construct is adequately translated into
a
eS]-labeled-37
S
recombinant
kDa protein, indicative of normal expression levels of mutant
17~-HSD
type 5 proteins. Translation was assessed by separation on a 12%
SDS-PAGE gel. (B) Western blot analysis of homogenates purified from the corresponding
HEK293 cells transiently transfected with the indicated expression vectors. A 37 kDa band
corresponding to
17~-HSD
type 5 protein is detected in homogenate preparations from
HEK293 transfected cells expressing wild-type and mutant recombinant proteins. The
nonspecific band observed may be used as an internaI control for loading. Enzymatic
conversion of (C) 4C]-androstenedione to [14C]-testosterone and (D) progesterone to 20a-
C
OH-progesterone in HEK293 cells transfected with the expression vectors after the
indicated time periods. The results are presented as the mean ±S.E.M. (n=3) and when the
S.E.M. overlaps with the symbol used, only the symbol is illustrated. The cells were
transfected with the pcDNA3 vector alone to show the absence of endogenous
17~-HSD
type 5 mRNA expression.
Figure 3. Pairwise linkage (LD) measures of r2 for the sequence variants identified in
control series. Sequence variant are represented by thin lines and are denoted numerically
with reference to Table 1.
44
Figure 4. A, The table denotes haplotype frequencies estimated from HSD1 7B5 sequence
variants having a MAF ~ 5% among the 70 controls. B, Haplotype blocks predicted from
variants identified in French Canadian controls showing a frequency ~ 50/0.
tSNPs
identified on a block-by-block basis are denoted with an asterisk (*) above the SNP
number. Population haplotype frequencies are displayed on the right of each haplotype
combination, while the level of recombination is displayed above the connections between
the three blocks. Thick connections represent haplotypes with frequencies ~ 5%, while
frequencies below 5% are represented by thin lines. CGL: Cancer Genomics Laboratory.
Table 1
Observed sequence variants and genotype frequencies in AKR1 C3 gene among familial breast cancer cases and controls
Genotype Frequ encies
SNP
SNP ID
dbSNPID Location
Series
Rare
Common
H omozygo tes Heterozygotes Homozygotes
(Ex p)
2
4
6
9
MAF
(Exp)
(Exp)
0.000
0.007
X 2 p-value Reported MAF
g.50754 10_50754 13deIATAA
NIA
Pram oter
Cases
Controls
1.00 (1 .00)
0.99 (0.99)
0.00 (0 .00)
0.01 (0.01)
0.00 (0 .00)
0.00 (0 .00)
g. 5075582G>T
rs34747896
Promoter
Cases
ContraIs
0 .98 (0 .98)
1.00 (1,00)
0.02 (0 .02)
0.00 (0 .00)
0.00 (0 .00)
0.00 (0 .00)
0.0 10
0.000
0,943 1
g.5076041 C>A
rs l1 8 188 10
Promoter
Cases
ContraIs
0.98 (0 .98)
0 .99 (0 .99)
0.02 (0,02)
0.0 1 (0 .01)
0 .00 (0 .00)
0.00 (0 .00)
0.010
0.007
0.943 1
0,9 520
O(hapmap Ceu)
g.5076148A>G
rs l 937845
Pramoter
Cases
Control s
0.52 (0.49)
0.39 (0.36)
0.36 (0.42)
0.43 (0.48)
0.12 (0.09)
0.19 (0,16)
0.300
0.400
0.3 124
0.3 700
0,3 83(Hapmap Ceu), 0,3 68(Epie)
g.5076203C>T
rs 10904415
Promoter
Cases
Controls
0.32 (0 .35)
0.44 (0.45)
0.54 (0.48)
0.46 (0.44)
0 .14 (0 .17)
0 .10(0 .11 )
0.410
0.329
0.4 114
0.7628
0,383(Hapmap Cell), 0,392(Epie), 0,3 65(Ceph-Tri os)
0.9520
NIA
NIA
g.5076293T>G
rs36201177
Promoter
Cases
ContraIs
0 .94 (0.94)
0.97 (0.97)
0.06 (0.06)
0.03 (0 ,03)
0 ,00 (0 .00)
0,00 (0.00)
0.030
0.0 14
0.8269
0.9035
o (Epie)
g.5076360C>A
rs25 18047
Pram oter
Cases
Controls
0.68 (0.67)
0.69(0 .7 1)
0.28 (0 .30)
0.31 (0 .26)
0.04 (0 .03)
0 .00 (0 .02)
0.180
0.1 57
0,7 158
0.1188
0, 143(Hapmap Cell), 0, 145(Epie), 0, 173 (Ceph-Trios)
g.5076499A>G
rs3763676
Promoter
0.32 (0.35)
0.44 (0.45)
0.54 (0.48)
0.46 (0.44)
0.14 (0.17)
0 .10 (0 .11)
0.410
0.329
0.4 114
0.762 8
0,3 86(Hapmap Cell), 0,395(E pie), 0,369(Ceph-Trios)
g.50769 15 A>G
e.15C>G
p,His5 Gln
Cases
Controls
rs l 2529
Exon 1
Cases
ContraIs
0.52 (0.49)
0.39 (0.36)
0.36 (0.42)
0.43 (0.48)
0.12 (0,09)
0. 19 (0 .16)
0.300
0.400
0.3 124
0.3 700
0,400(Hapmap Cell), 0,3 68(Epie) , 0,400 (Ceph-Trios)
10
g,507665 1C>G
e.84+ 195A>G
rs 1937843
Intran 1
Cases
Control s
0.32 (0.35)
0.43 (0.44)
0.54 (0.48)
0.47 (0.45)
0 .14 (0 ,17)
0 ,1 0 (0.11 )
0.4 10
0.336
0.4 11 4
0.6336
0,383 (Hapmap Ceu), 0,3 95(Epie)
11
g.5078607G>A
e.90G>A
rs774 1
Exon 2
Cases
Controls
0.32 (0.3 5)
0.44 (0.45)
0.54 (0.48)
0.46 (0 .44)
0.14 (0 .17)
0 .10 (0.11)
0.4 10
0.329
0,4 11 4
0.762 8
0,3 90(Hapmap Ceu), 0,395 (Epie), 0,363(Ceph-Trios)
12
g.507 8747A>G
c.230A>G
p,Glu77Gly
rs4 1306308
Exon 2
Cases
ContraIs
0.82 (0.81)
0.8 1 (0.80)
0. 16 (0.18)
0.16 (0 .19)
0.02 (0.01)
0.03 (0.01 )
0. 100
0.107
0.432 1
0.1350
0,048(artic1 e jakobsson)
13
g.5079003T>C
c.252+ 234 T>C
rs2801 883
Intron 2
Cases
Control s
0.52 (0 .49)
0.39 (0.36)
0.36 (0.42)
0.43 (0.48)
0.12 (0.09)
0 ,19 (0 .16)
0.3 00
0.400
0.3 124
0.3700
0,3 93(CGEMS)
0,423 (HapmapCell), 0,592(Epie), 0,395(CGEMS )
14
g.50 79685A>G
c.3 12A>G
rs l 2387
Exon 3
Cases
Controls
0.66 (0.67)
0.69 (0.70)
0.32 (0.30)
0.30 (0.27)
0.02 (0.03)
0.01 (0.03)
0.180
0.164
0.5525
0.43 88
0, 167(Hapm apCeu), 0, 132(Epie)
Cases
ContraI s
0.60 (0.59)
0.59 (0.58)
0.34 (0.3 5)
0.36 (0.36)
0 .06 (0,05 )
0 .06 (0,06)
0.23 0
0.236
0.7768
0,94 14
0,242(Ha pm apCeu), 0,264(Epi e)
Intran 3
g. 5079815C>A
c.3 69+73C>A
rs224519 1
16
g. 5079886C>A
c.369+ 144C>A
rs2298 305
Intron 3
Cases
Controls
0.74 (0.74)
0.81 (0.82)
0.24 (0.24)
0.19 (0.17)
0.02 (0.02)
0.00 (0.0 1)
0,140
0.093
0.98 13
0.39 18
0, 1OO(Hapm apCell), 0,059(Epie)
17
g, 5080980T>C
c.370- 14T>C
rs34140485
Intron 3
Cases
Controls
0.82 (0.81 )
0.8 1 (0.80)
0.16 (0.18)
0.16 (0. 19)
0.02 (0.0 1)
0.03 (0.01 )
0. 100
0,107
0.432 1
0. 135 0
0, 106(Epic)
15
.,J::::.
Vl
18
g.5081137A>G
c.447+66A>G
rsl0508293
1ntron 4
0.86 (0.86)
0.71 (0 .70)
0.14 (0.13)
0.24 (0 .27)
0.00 (0.00)
0.04 (0.03)
0.070
0.164
0.5946
0.3336
0, 142(HapmapCeu), 0,1OO(Epic)
Cases
Controls
0 .82 (0.81)
0.81 (0 .80)
0.16 (0 .18)
0.16 (0.19)
0.02 (0 .01)
0.03 (0.01)
0. 100
0.107
0.432 1
0.1350
NIA
Cases
Controls
g.508 1262G>T
c.447+ 191G>T
NIA
20
g.5081289G>A
c.448-230G>A
rs1937841
Intron 4
Cases
Controls
0.74 (0 .76)
0.81 (0.82)
0.26 (0.23)
0.19 (0.17)
0.00 (0.02)
0.00 (0.01)
0.130
0.093
0.2907
0.3918
0, 107(CGEMS)
0, 1OO(Hapmap Ceu), 0,109(CGEMS)
21
g.5081307C>G
c.448-212C>G
I"s1937840
Intron 4
Cases
Controls
0.52 (0.49)
0.39 (0.36)
0.36 (0.42)
0.43 (0.48)
0.12 (0.09)
0.19 (0. 16)
0.300
0.400
0.3124
0.3700
0,3 83 (Hapmap Ceu),0,36 1(Epic)
22
g.5081530G>A
c.459G>A
rsl937839
Exon 5
Cases
Controls
0.98 (0 .98)
0.99 (0.99)
0 .02 (0.02)
0.01 (0.01)
0 .00 (0.00)
0.00 (0.00)
0.010
0.007
0.9431
0.9520
O(hapmap Ceu), O(Ceph-Trios)
Cases
Controls
1.00 (1.00)
0.96 (0 .96)
0.00 (0.00)
0 .04 (0 .04)
0.00 (0 .00)
0 .00 (0 .00)
0.000
0.02 1
0.8546
0,08 1(Epic)
Cases
Controls
1.00 (1 .00)
0.99 (0.99)
0 .00 (0.00)
0.01 (0 .01)
0.00 (0.00)
0.00 (0.00)
0.000
0.007
0.9520
NIA
19
23
24
g.5081609C>T
c.638C>T
p.Pro 180Ser
rs34186955
g.5081619A>G
c.648A>G
p.Lysl83Arg
NIA
1ntron 4
Exon 5
Exon 5
g.5083935A>C
c.571-358A>C
rs2 154307
Intron 5
Cases
Controls
0.60 (0 .59)
0.57 (0.54)
0 .34 (0.35)
0 .3 3 (0 .39)
0.06 (0.05)
0 .10 (0.07)
0.23 0
0.264
0.7768
0. 1945
0,2 50(Hapmap Ceu)
26
g.5084037T>G
c.571-256T>G
rs488 1400
1ntron 5
Cases
Contro1s
0.68 (0 .69)
0.61 (0 .58)
0.30 (0.28)
0 .30 (0 .36)
0.02 (0.03)
0 .09 (0.06)
0.170
0.236
0.6556
0. 1614
0,223(CGEMS)
0,2 50(Hapmap Ceu), 0,227(CGEMS)
27
g.5084063C>G
c.5 7 1-230C>G
rs 12242350
Intron 5
Cases
Controls
0.60 (0 .59)
0 .57 (0 .54)
0 .34 (0.35)
0.33 (0.39)
0 .06 (0 .05)
0.10 (0.07)
0.23 0
0.264
0.7768
0. 1945
0,263(Hapmap Ceu)
28
g.5084073A> T
c.571 -220A>T
rsl1252940
1ntron 5
Cases
Controls
0.60 (0 .59)
0 .57 (0.54)
0.34 (0.35)
0.33 (0.39)
0 .06 (0 .05)
0. 10 (0 .07)
0.23 0
0.264
0.7768
0.1945
0,250(Hapmap Ceu)
g.5084238T>A
c.571-55T>A
NIA
Cases
Controls
0.98 (0.98)
1.00 (1.00)
0 .02 (0.02)
0.00 (0.00)
0 .00 (0.00)
0.00 (0.00)
0 .0 10
0.000
0.943 1
Cases
Controls
0.32 (0 .35)
0.44 (0.45)
0.54 (0.48)
0.46 (0.44)
0.14 (0 .17)
0.10(0 .11)
0.4 10
0.329
0.4114
0.7628
NIA
Cases
Controls
0 .68 (0 .67)
0.69 (0.7 1)
0.28 (0 .30)
0.31 (0.26)
0.04 (0 .03)
0.00 (0.02)
0.180
0 .157
0.7 158
0.1188
0,143(Epic)
Cases
Controls
0.68 (0.69)
0 .60 (0.57)
0.30 (0.28)
0.3 1 (0.37)
0.02 (0 .03)
0.09 (0.06)
0.170
0.243
0.6556
0.223 8
0, 181 (Epic)
Cases
Controls
0.60 (0.59)
0.57 (0 .54)
0.34 (0.35)
0.33 (0.39)
0 .06 (0 .05)
0.10 (0.07)
0.230
0.264
0.7768
0.1945
0,292(Epic)
Cases
Controls
0.68 (0 .69)
0.59 (0.56)
0.30 (0.28)
0.33 (0.38)
0 .02 (0.03)
0.09 (0.06)
0.170
0.250
0.6556
0.3003
0, 181 (Epic)
25
29
30
31
32
33
g.5084562insG
c.681 - 115insG
NIA
g.5084599C>T
c.681 -78C>T
rsl09044 19
g.5084621 C>T
c.681-56C> T
rs33921818
g. 508463 5T>C
c.681 -42T>C
rs4347280
Intron 5
Intron 6
1ntron 6
Intron 6
1ntron 6
1ntron 6
NIA
g.5084638C>G
c.681-39C>G
rs33979906
35
g.5084657C>G
c.681 -20C>G
rsl1252941
Intron 6
Cases
Controls
0.34 (0.36)
0.46 (0.46)
0 .52 (0.48)
0.44 (0.44)
0.14 (0 . 16)
0.10 (0.10)
0.400
0.32 1
0.5557
0 .8988
0,400(Epic)
36
g.5084969C>T
c.846+ 127C>T
rsl2769666
Intron 7
Cases
Controls
0.60 (0.59)
0.57 (0.54)
0.34 (0. 35)
0 .33 (0 .39)
0 .06 (0 .05)
0.10 (0 .07)
0.230
0.264
0.7768
0.1945
0,276(Epic) , 0,234(CEPH-Trios)
g.5087579A>G
rsl71557 32
Cases
0.58 (0.57)
0.34 (0 .35)
0.06 (0.05)
0.235
0 .8 108
34
37
1ntron 7
-+;::.
0\
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
g.50876 10de1T
c.847- 177deIT
NIA
g.5087670A>G
c.847-11 7A>G
rs35768949
g.5087909A>G
c.929+40A>G
rs2275928
g.5087944T>C
c.929+75T>C
NIA
g.50880 12C>T
c.929+ 143C>T
rs35983920
g.5089303T>C
c.930-350T>C
rs9329316
g.5089330A>G
c.930-323A>G
rs791 7546
g.5089385C>T
c.930-268C>T
NIA
g.5089404G>A
c.930-249G>A
NIA
g.5089413T>C
c.930-240T>C
rs11252951
g.5089427T>C
c.930-226T>C
rsl0160019
g.5089439 5089444delCGTGTT
c.930-2 15delcgtgtt
NIA
g.5089539A>G
c.930- 114A>G
rsl7134355
g.5089649T>G
c.930-4T>G
rs34320249
g.5089703 A>G
c.980A>G
rs3209896
g.5089732G>A
c.1009G>A
rs28943581
Intran 7
Intron 7
Intron 8
Intran 8
Intran 8
1ntron 8
Intron 8
Intron 8
Intron 8
Intron 8
Intron 8
Intran 8
Intron 8
Intran 8
Exon 9
Exon 9
Cases
Controls
0.98 (0.98)
1.00 (1.00)
0.02 (0 .02)
0.00 (0.00)
0.00 (0.00)
0.00 (0 .00)
0.0 10
0.000
0.943 1
Cases
Contrais
0.98 (0.98)
1.00 ( 1.00)
0.02 (0.02)
0.00 (0.00)
0.00 (0.00)
0.00 (0 .00)
0.0 10
0.000
0.943 1
Cases
Contrais
0.38(0.41)
0.36 (0.35)
0.52 (0.46)
0.47 (0.48)
0.10 (0.13)
0.17 (0. 17)
0.360
0.407
0.3636
0.8444
0,375(Hapmap Ceu), 0,329(Epic)
Cases
Controls
1.00 (1.00)
0.99 (0.99)
0.00 (0.00)
0.0 1 (0.0 1)
0.00 (0 .00)
0.00 (0.00)
0.000
0.007
0.9520
NIA
Cases
Contrais
0.90 (0 .88)
0.94 (0.94)
0.08 (0 .11)
0.06 (0.06)
0.02 (0 .00)
0.00 (0.00)
0.060
0.029
0.0398
0.8056
O(Epic)
Cases
Controls
0.60 (0 .56)
0.57 (0.50)
0.30 (0.38)
0.27 (0.4 1)
0. 10 (0.06)
0.16 (0 .09)
0.250
0.293
0.1573
0.0039
0,25 0(Hapmap Ceu)
Cases
Controls
0.84 (0.85)
0.77 (0. 73)
0.16 (0 .15)
0.17 (0 .24)
0.00 (0.0 1)
0.06 (0 .02)
0.080
0. 143
0.5386
0.012 1
0, 138(Hapmap Ceu)
Cases
Contrais
0.90 (0.90)
0.97 (0 .97)
0.10 (0. 10)
0.03 (0 .03)
0.00 (0 .00)
0.00 (0.00)
0.050
0.014
0.7098
0.9035
NIA
Cases
Contrais
0.98 (0.96)
0.99 (0 .97)
0.00 (0.04)
0.00 (0 .03)
0.02 (0 .00)
0.0 1 (0 .00)
0.020
0.014
0.0000
0.0000
NIA
Cases
Controls
0.60 (0 .56)
0.57 (0.50)
0.3 0 (0 .38)
0.27(0.4 1)
0.10 (0.06)
0.16 (0.09)
0.250
0.293
0.1573
0.0039
0,263(Hapmap Ceu)
Cases
Controls
0.60 (0 .56)
0.57 (0.50)
0.30 (0.38)
0.27 (0.41)
0.10 (0.06)
0.16 (0.09)
0.250
0.293
0.1573
0.0039
0,250(Hapmap Ceu)
Cases
Controls
1.00 (1.00)
0.99 (0.99)
0.00 (0.00)
0.0 1 (0 .01)
0.00 (0.00)
0.00 (0.00)
0.000
0.007
0.9520
NIA
Cases
Controls
0.98 (0.98)
0.99 (0.99)
0.02 (0.02)
0.01 (0.01)
0.00 (0.00)
0.00 (0.00)
0.010
0.007
0.9431
0.9250
O(Hapmap Ceu)
Cases
Contrais
0.98 (0.96)
0.99 (0.97)
0.00 (0 .04)
0.00 (0.03)
0.02 (0.00)
0.0] (0.00)
0.020
0.014
0.0000
0.0000
0,111 (Epic)
Cases
Contrais
0.52 (0.50)
0.50 (0.46)
0.38(0 .4 1)
0.36 (0.44)
0.10 (0.08)
0.14 (0.10)
0.290
0.32 1
0.5850
0.1293
0,38 1(Hapmap Ceu), 0,338(Epic), 0,395(Ceph-Trios)
Cases
Contrais
0.98 (0.98)
0.99 (0.97)
0.02 (0 .02)
0.00 (0.03)
0.00 (0.00)
0.01 (0.00)
0.010
0.014
0.943 1
0.0000
O(Ceph-Trios)
NIA
0,026(Epic)
~
--...l
Supplemental table 1 A
Oligonucleotide primers used for amplification and sequence analysis of the AKRl C3 gene
Amplified region
Forward primer (5'-3')
Reverse primer (5'-3')
Annealing
Temp (C)
Product
length
(b~)
PrOlTIoter
& Exon 1
TCTCTTGCCCTTGGCATCAT
ACAAGATGACAGATTATATA
TATAAAGAAGGGGCATTATCAC
GAGTTTGGACATCATTTAATAT
CTGCTGCTTCTCCTCAGAGAT
CCAAGCTGGGAACTAGACATG
CGTGACCATAGGAATGGACC*
56
55
60
560
813
740
Exon2
TACCTCCATAACAGTGATCAAC
TGTGATTCTATAGCACATGTC
60
665
Exon3
CATCATAGTTATTACTTAATACT
CTCTTGTAGGTGTGCATTAGA
56
576
Exon4
CTGTGAAACTTGATTAAGACCT
GAAAATAGCTAGCAGTGATTG
60
674
Exon 5
TTAGAGAGTGGGGCACAAGAC
GATTCAGCATTAAACTCATTCCAA
60
620
Exon6
AGTGCTCATTCTTACCCAATG
TCCATGAGCCACTTGAAACTT
60
680
Exon 7
AAGTTTCAAGTGGCTCATGGA
AGATTGTCAACTTAATGCTG
60
597
Exon 8
CACAATGTCAGCGCTGTTTCT
ATGTCCAGTGGTAGAAACACC
60
653
Exon 9
AGCATGAGTAATTCTTATCATCC
CTTACAGGCAAATCACACAGTT
CACACACTACAGAACAGAGTA*
60
877
* U sed as sequencing primer only
+::0-
00
49
Supplemental table 1 B
Oligonucleotide primers used for site-directed mutagenesis
Mutation
Primers ( 5' -+ 3 ')
Annealing Temp (C)
p. His5Gln
GGATTCCAAACAGCAGTGTGTAAAG*
GCTTTACACACTGCTGTTTGGAATCCt
66,7
68
p.Glu77 Gly
GTGTGAAGAGAGGAGACATATTCTAC*
GTAGAATATGTCTCCTCTCTTCACACTGt
66,7
68
p.Pro 180Ser
GGAGATGATCCTCAACAAGTCAGGACTCAAGTACAAGCC*
GGCTTGTACTTGAGTCCTGACTTGTTGAGGATCATCTCCt
73,9
73,9
p.Lys1 83Arg
CCTCAACAAGCCAGGACTCAGGTACAAGCCTGTCTGCAACC*
GGTTGCAGACAGGCTTGTACCTGAGTCCTGGCTTGTTGAGGt
76,9
76,9
50
g.5087670A>G
Ig·5087909A>G ]
g.5087610de1T
g.5087944T>C
1
1
[ g.5087579A>G
g.508801 2C> T
1
g.5089303T>C
g.5084073A> T
g.5076203C> T
rg.507614BA>G
1
1
1
g.5076293T>G
1
g.5076360C>A
1
1
g.5076360C>A
g.5076041C>A
g.5075582G>T
1
g.507541 0de1ATIA
1
g.5080980T>C
1
g.5079886C>A
1
g.5079815C>A
10p 15 . p14
Promoter region
III ~I
III
Il
g.508456insG
g.5084037T>G
g.5084599C> T
g.5083935A>C 1
g.5084621 C> T
g.508 11 37A>G
g.50B4635T>C
l
1/
fT
Il
Il
Il
11/
Il
uI
1
~
~
c.230A>G
If
c.648A>G l
c.638C>T
1
~G>A I
c.459G>A 1
NT_077567.3
rnRNA 1.22 kb
(9 exons)
1
1
NM 003739.4:
1
Protein
-
NH 2
(323a.a)
5055 84 117
Conserved active
s ~e residues
NP_003730.4
g.5089404G>A
1
I"
1
1
g.5089427T>C 1
1
g.5089427T>c l
g.5089439de1CGTGTII
g.5089539A>G
g.5084969C> T
III
1
g.5089385C>T
1
g.5084657C>G
g.5081307C>G
l
g.5089330A>G
g.5084638C>G
g.5081289G>A
g.5076915A>G 1
l
g.5084063C>G
g.5081 262G>T
1 g.5079003T>C
Gen e 16 kb
g.5084238T>A
JYÂJW~:
r
g.5089649T>G
1
l}
T
c.980A>G
1
1
c.1009G>A
1
1
51
B.
A.
"<1>
Cf)
c
o
Ô
l.()
CO
r-
o
CIl
0:
i
Lucifera se
-1-
--'1
17r.,-HSD ~
type 5
-
61 kDa
37 kDa
~--------------------~
C.
C
___ pCDNA3
20
-+-WT
-.- His5Gln
-+- Glu77Gly
-v- Pro 180Ser
-I:s- Lys 183Arg
Q)
c .....
CIl
._ 0
CIl ....
L- CIl
<1> <1>
(j
<1>
~
o
c
.9
80
c""'
o <1>
"- c
<1>
....
0L-
CIl <1>
<1> .....
0) CIl
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o
15
L-
0)
0.0
70
60
50
'-'" L-
c a.
OI
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10
b
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ON
20
Q)
(j
5
40
0
>
co
"'0
~
~
AKRl C3-progesterone as ays
<1>
> ......
ÔÎ
----JI- 37 kOa
90
25
0
o
D.
AKR1C3-androstenedione assays
Q)
1 7~ ~; =11-________
'2f?- Î
.----1
10
0
0
0
4
8
12
Time (hrs)
18
24
0
4
8
12
Time (hrs)
18
•
24
52
53
A.
ATCGCGAATACCTAGGCATCAGCCTCGCAATATTA
GCCAGAGACAACTAGGGCTGTCCCCCCTGACACCA
GCCAGAGACACCTGGGGAGCACCTTGCCAGTGTTG
ACAACAGATGCATAGACATCACTCTCCCAGTATTG
ACAACAGATGCCTAGGCATCACTCTCCCAGTATTG
ACCACAGGTACCCATGCAGCACCTTGCCAGTATTA
.;.
Freq uency
Cumulative
Freq uency
0.307
0.221
0.129
0.079
0.071
0.043
0.30 7
0.528
0.65 7
0.736
0.80 7
0.850
P lO according to Table _
B.
or',
tr l - r-. ...:;:;
«:t '<t-:r r--
O r ")
---, oc
1/')
r.
-1/') 0::; 0-
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~ N r 'O - - r-- -.::r N - ri <"'1 r'O oc-tc'-C~x..
dbSN P ID
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tSNP
CG L SN P ID
4 - 78
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~~~
~ ~~
910 1 1 1 2 nI4 1 5 16 1 7 1 8 1 9202 1 2~
1 11 1 1 1 11 1111 1 11111
CG L controls
ATCGCGAATACCTAGGCA
GCCAGAGACAACTAGGGC
GCCAGAGACACCTGGGGA
ACCACAGGTACCCATGCA
ACAACAGATGCATAGACA
ACAACAGATGCCTAGGCA
-='
«:t
«:t
0
0e
'-0('1
'-Or.x
-.:;r--N
~..c
;::; ~
~Ir.o..
\0 lI) l.r)
o- r-r i r') 0'
r----. - (-
r l r-- N
~~ t
~~
:;-
~
43 4447 ~ 52
11111 11 1 1 111
1 1 1 1 1
• 107 ~ TCACTCTCCCAG
.321
.257
.229
.157
~ TATTA
CACCA
TGTTG
TATTG
.90
1.0
~
26 2728 JO 3132 3J 34 35 J6 :'740
.329 - - TCAGCCTCGCAA
· 236 - - TGTCCCCCCTGA
· 13 6 ~ GCACCTTGCCAG
.086
.064
~
e
.3 78
.29 3
.135
.18 7
54
REFERENCES
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CONCLUSION
Il existe dans la population générale un certain pourcentage de femme plus susceptible de
développer un cancer du sein. Il est donc primordial de cibler ces femmes à risque élevé et
leur offrir un suivi personnalisé. Pour ce faire, il est important d ' identifier les mutations
héritées qui confèrent une susceptibilité accrue de développer un cancer du sein. Dans cette
étude, nous avons donc analysé l' implication potentielle du gène HSD 1 7B5 dans la
susceptibilité génétique au cancer du sein. Étant donné que ce gène est impliqué dans la
formation des androgènes et dans l' inactivation de la progestérone, deux évènements
protecteurs du cancer du sein, il devient donc un excellent candidat dans l' étude de la
susceptibilité génétique au cancer du sein.
Cette étude sur la caractérisation des variants de séquence du gène encodant la
17~-HSD
de type 5 dans la population canadienne-française est une étape préliminaire essentielle
dans l' analyse de l' implication de ces variants dans la susceptibilité génétique au cancer du
sein.
En effet, l' identification des variants de séquence chez 50 femmes canadiennes-
françaises ayant eu un cancer du sein et provenant de famille à risque élevé ainsi que chez
70 individus contrôles nous a non seulement permis d'identifier les variants pouvant être
testés dans des études d'association utilisant de grandes cohortes mais aussi de déterminer
s' il y avait la présence de mutations délétères inactivatrices de pénétrance élevée. De plus,
cette recherche nous a aussi permis d'analyser l'effet des variants qui entraînaient un
changement d ' acide aminé sur l'activité de l'enzyme, ainsi que de restreindre le nombre de
variants informatifs à génotyper dans des études d'association futures à la recherche de
variants de pénétrance faible et modérée.
Notre analyse extensive par re-séquençage ne supporte donc pas l'existence de mutations
délétères germinales dans les régions codantes de ce gène, ainsi il apparaît peu probable
que des mutations très pénétrantes dans ce gène compteraient pour une fraction
significative de la susceptibilité au cancer du sein.
Par contre, plusieurs variants de
séquence ont été détectés, dont quatre d'entre eux entraînent un changement d' acide aminé
et trois variants silencieux se retrouvent également dans les exons. Au total, 53 variants de
séquence ont été identifiés. L'impact potentiel des variants faux -sens sur les propriétés
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catalytiques de l'enzyme a été étudié dans des cellules HEK293.
Malgré une légère
tendance à diminuer le pourcentage de conversion des substrats avec le variant p.Glu77Gly,
ces expériences ne nous ont pas permis de démontrer que les changements d' acides aminés
avaient un effet significatif sur l'activité de l'enzyme. Finalement, le logiciel PHASE a
estimé 6 haplotypes majeurs représentant 85% de notre population et Il SNPs marqueurs
ont été identifiés à partir du logiciel Haploview.
L 'hypothèse d'un nouveau gène de susceptibilité BRCAX contenant des mutations de forte
pénétrance devient de moins en moins probable vu les nombreuses recherches ayant déjà
été faites. C'est la thèse de l' effet combiné de plusieurs variants de faible pénétrance et
communs dans la population qui est de plus en plus convaincante. Pour déterminer de tels
variants, nous devons les analyser dans de très larges cohortes d' individus pour ainsi
comparer leurs fréquences d'apparition dans les cas de cancers et dans la population en
général.
De cette façon, ils pourront être considérés comme variants causals de la
susceptibilité, si c' est le cas et ce, de manière significative.
Étant donné que nous ne
possédons pas une large cohorte d'individus, nous n' avons pas le pouvoir statistique de
porter de conclusions sur la différence de fréquence d'un variant entre les cas et les
contrôles.
Par contre, cette analyse nous a permis d'identifier 35 variants de séquence
communs dans la population (MAF>5%) qui pourront être analysés dans des études
d' association utilisant de très larges cohortes.
Cette dernière étude est essentielle pour
déteminer, avec le pouvoir statistique adéquat, l' association réelle d' un variant dans le
cancer du sein. Certains consortiums tels que CIMBA et BCAC sont présentement
disponibles pour fournir le pouvoir statistique que n'ont pas les petites études.
Ces
consortiums peuvent soit fournir de larges cohortes d' individus ou combiner les données de
plusieurs études et ainsi vérifier s' il existe une association entre un gène et la susceptibilité.
D' ailleurs, le consortium BCAC a permis de démontrer qu'un variant commun du gène
FGFR2 était impliqué dans la susceptibilité au cancer du sein. Il est aussi possible que le
variant associé ne soit pas le variant causal mais soit simplement en déséquilibre de liaison
avec celui-ci.
Il est donc très utile de consulter les bases de données publiques telles que
HapMap, NCBI et UCSC où il est possible d'obtenir de l'information sur les variants
répertoriés à travers le génome.
60
Il existe encore beaucoup de travail à faire pour véritablement conclure que le gène
HSD1 7B5 n' est pas impliqué dans la susceptibilité au cancer du sein.
L' analyse du
promoteur avec le site GÉNOMA TIX a démontré plusieurs sites de liaison aux facteurs de
transcription créés ou supprimés par les variants. Il serait donc très intéressant de faire les
essais de régulation transcriptionnelle pour vérifier si les variants ont réellement un impact
sur ces sites.
De plus, étant donné qu' il n' y a pas de délimitation du promoteur, le
séquençage de 1000pb supplémentaire en amont pourrait apporter de nouveaux variants
intéressants à cette étude. En effet, un variant dans le promoteur peut très bien augmenter
ou diminuer la transcription du gène et donc influencer la quantité de produits formés qui,
dans notre cas, sont protecteurs dans le cancer du sein. Finalement, étant donné que cette
enzyme est impliquée dans la formation de testostérone, il serait très intéressant de
déterminer s'il existe d'autres variants intéressants chez des personnes souffrant du
syndrome ovarien polykystique ainsi que chez des hommes ayant le cancer de la prostate.
En effet, le reséquençage chez des individus atteints de ces maladies pourrait apporter de
nouvelles informations pertinentes ainsi que le reséquençage dans des populations autres
que canadienne-française.
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