Etude des interactions entre la plante Arabidopsis thaliana (L
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UNIVERSITE PARIS EST FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES THESE Pour obtenir le grade de docteur de l‘Université Paris Est Spécialité : Sciences de l‘Univers et de l‘Environnement Présentée par : tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Ulrike JANA Etude des interactions entre la plante Arabidopsis thaliana (L.) Heynh et le ver de terre Aporrectodea caliginosa (Savigny) : Application à la phytoremédiation de l’arsenic et de l’antimoine Soutenue le 14 décembre 2009 Direction de thèse : Mr D. LAFFRAY, Professeur à l‘Université Paris Est-Créteil et Mme A. REPELLIN, Maître de conférences à l‘Université Paris Est-Créteil Equipe d’Ecophysiologie moléculaire (LEPM), IBIOS-BIOEMCO, UMR 7618 Jury : M. P. Lavelle, Professeur, Université Paris VI Rapporteur Mme S. Nardi, Maître de conférences, Université de Palerme, Italie Rapporteur Mme H. Sallanon, Professeur, Université d’Avignon et Pays de Vaucluse Examinateur M. P.M. Badot, Professeur, Université de Franche Comté Examinateur M. D. Laffray, Professeur, Université Paris Est-Créteil Examinateur Mme A. Repellin, Maître de conférences, Université Paris Est-Créteil Examinateur tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 A la mémoire de mon père A ma mère A Romain tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 REMERCIEMENTS Ce travail achevé, je tiens à remercier tous ceux qui d’une façon ou d’une autre ont contribué à sa réalisation : Le Docteur Anne Repellin pour m’avoir proposé ce passionnant sujet de thèse. Elle a su encadrer ce travail en apportant son expérience scientifique sur une thématique nouvelle pour notre équipe. J’ai beaucoup apprécié ses qualités humaines et professionnelles, sa disponibilité et la confiance qu’elle m’a accordée. Le Professeur Daniel Laffray qui a partagé cet encadrement de thèse. Grâce à son tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 enthousiasme, ses précieux conseils et ses encouragements, il a su me transmettre le virus de la Physiologie végétale. Qu’il trouve ici toute ma gratitude. Un grand, grand merci au Professeur Yasmine Zuily-Fodil, ma directrice de laboratoire, qui a cru en moi et grâce à qui j’ai pu obtenir cette thèse. Mes remerciements vont également aux membres de mon jury, le Professeur Serenella Nardi, le Professeur Huguette Sallanon, le Professeur Pierre-Marie Badot et le Professeur Patrick Lavelle pour avoir pris le temps de lire et d’évaluer ce travail. Qu’ils soient assurés de ma profonde reconnaissance. L’aboutissement de ce travail ayant impliqué plusieurs collaboration, je souhaiterais également exprimer toute ma gratitude au Docteur Sébastien Barot pour toute l’aide qu’il m’a fournie pendant cette thèse mais également avant, pendant mon stage de master II et aux Docteurs Maryse Castrec-Rouelle et Emmanuel Aubry, chercheurs à Paris VI, pour m’avoir accueillie si chaleureusement dans leur laboratoire et m’avoir formée aux techniques de la chimie inorganique. Je n’oublie pas non plus l’équipe de l’ADEME : Frédérique Cadière, Cécile Grand et Philippe Bégassat pour le projet de réhabilitation qu’ils m’ont confié. Ce projet a pour moi été un révélateur et m’a donné envie de poursuivre dans cette thématique. Je souhaiterais également remercier toute l’équipe du LEPM qui m’a permis de travailler dans les meilleures conditions qu’il soit : - Le Docteur Chantal Passaquet avec qui j’ai partagé bien plus qu’un bureau durant ces trois années. Merci pour tes précieux conseils mais surtout merci pour ton optimisme et ta bonne humeur permanente, - Les Docteurs Dominique Contour-Ansel, Anh Pham-Thi et Maria Helena Cruz de Carvalho pour leurs conseils scientifiques et leur gentillesse, - Judicaëlle, pour ses relectures précieuses, - Biet, Georges, Kim et Rafiq pour leur bonne humeur permanente qui m’a permis de décompresser quand cela était nécessaire, - Fryni Grekis pour toute l’aide administrative qu’elle m’a fournie pendant ces trois tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 années. Je tiens également à remercier tout les membres du projet ADEME et notamment Vincent Chassany pour son sérieux inébranlable dans les situations d’urgence (…) et Simon Boudsocq toujours partant pour quitter son univers de la modélisation et donner un coup de main sur le terrain. Je dédie cette thèse à l’ensemble de mes amis et à l’ensemble de ma famille, et plus particulièrement à ma mère, qui a toujours cru en moi et qui m’a donné les moyens d’arriver jusqu’ici, mon beau père Christian qui m’a appris à ne pas me contenter du minimum mais à viser l’Excellence, et mon petit frère Cyprien pour la joie qu’il m’a apportée toute ces années. Enfin, je remercie Romain pour m’avoir soutenue au quotidien et m’avoir remotivée dans les moments difficiles. tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 ABREVIATIONS ABA acide abscissique ACC 1-aminocyclopropane-1-acide carboxylique AIA acide indole 3 acétique EDTA ethylene diamine tetraacetic acid FIT Fer-like Iron deficiency induced Transcription factor FRO ferric reductase GOGAT glutamate synthase cHATS constituve high affinity transporter system iHATS inductive high affinity transporter system IRT iron regulated transporter LATS low affinity transport system NR nitrate reductase NiR nitrite reductase NNP nitrate nitrite porter NRAMP natural resistance associated macrophage protein MS Matière sèche PC phytochelatine PGPR plant growth promoting rhizobacteria PLDα phospholipase D α ROS reactive oxygen species, espèce active de l‘oxygène RWC relative water content SOD super oxide dismutase ZIP ZRT, irt-like protein tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 LISTE DES ILLUSTRATIONS FIGURES Figure 1 : Modèle simplifié des effets physiques, chimiques et biologiques des vers de terre sur le sol avec leurs effets potentiels sur la croissance et la nutrition de la plante (d‘après Syers et Springett 1983) ............................................................................................................. 7 Figure 2 : Visualisation des trajets empruntés par les nutriments dans une racine. Les flèches fines symbolisent le trajet apoplastique, les flèches en gras le trajet symplastique et les flèches dans un cercle les transports actifs (Hopkins et Evrard 2003) ................................................. 15 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Figure 3: Modèle d‘un transporteur de phosphate contenant douze domaines transmembranaires et une large région hydrophile (d‘après Raghothama 1999) ..................... 25 Figure 4 : Réponses à une carence en fer (Guerinot 2007). En haut la réponse caractéristique d‘Arabidopsis thaliana. En bas, la réponse caractéristique d‘une Poacées : le maïs .............. 29 Figure 5 : Structure hypothétique de la protéine FRO2 associée à la membrane plasmique (MB, Robinson et al. 1999). Cette protéine est constituée de 725 acides aminés. Le site de liaison avec le FAD ainsi qu‘une région hautement conservée adjacente au site de fixation du NADPH ont été mis en évidence. Les ronds blancs symbolisent les quatre résidus histidine responsable de la coordination entre les deux groupes hèmes (barres blanches) ..................... 30 Figure 6 : Schéma des mécanismes possibles de l‘absorption de l‘arsenic par les cellules végétales (d‘après Zhao et al. 2009) ........................................................................................ 45 Figure 7 : Cartographie des quatre lagunes de l‘ancien site minier d‘Ouche. Les points d‘échantillonnage sont localisées au centre des îlots repères. Les quatres lagunes sont indiquées par les sigles L1, L2, L3 et L4. ................................................................................ 57 Figure 8 : Disposition des tranchées réalisées dans les îlots de végétation considérés comme repères sur les lagunes de résidus miniers du site d‘Ouche (Cantal, France). Les tranchées représentent les deux diamètres perpendiculaires des cercles concentriques de centre 0. Un échantillonnage fin a été réalisé au point 0. Un échantillonnage grossier a été réalisé aux distances 0 m, 0,5 m, 1 m et 1,5 m du point 0 dans chacune des quatre tranchées et les prélèvements effectués à même distance et même profondeur ont été rassemblés (selon protocole Pratas et al. 2005) ..................................................................................................... 59 Figure 9 : Schéma simplifié de la photochimie des végétaux supérieurs (Allen 2003). La phosphorylation non cyclique nécessite quatre électrons pour pouvoir transloquer douze protons et la phosphorylation cyclique du photosystème I nécessite 1 électron pour la translocation de deux protons. La combinaison des phosphorylations cyclique et non cyclique donne les rapports suivants : H+:ATP = 14 et ATP:NADPH = 3 :2. Pour la phosphorylation non cyclique seule, ATP:NADPH = 9 :7. Abréviations : cyt, cytochrome ; e-, électron ; Fd, ferrédoxine ; Pi, phosphate inorganique et PQ, plastoquinone ................................................ 64 Figure 10 : La photographie A présente la chambre Hansatech (chambre à électrode en phase gazeuse LD2/3, Hansatech) utilisée pour les mesures gazeuses et la photographie B présente une électrode de Clark (doc. Hansatech) .................................................................................. 66 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Figure 11 : Schéma du montage de la feuille dans la chambre à électrode Hansatech ........... 68 Figure 12 : Photographie du « Chlorophyll Mètre » ............................................................... 74 Figure 13 : Première plateforme (juin 2009). Le paysage a visiblement été modelé par les activités des moto-crosseurs. .................................................................................................. 171 Figure 14 : Wagonnet, témoin des anciennes activités minières du site. .............................. 171 Figure 15 : Ilot de végétation en majorité constitué de Pins sylvestres. ............................... 172 Figure 16 : Wagonet partiellement enfoui sous les sédiments contaminés par les motocrosseurs. ................................................................................................................................ 172 Figure 17 : Photographie des sédiments contaminés à l‘arsenic et à l‘antimoine. ................ 173 Figure 18 : Mesures des capacités photosynthétiques foliaires des traitements C (substrat sans polluant), CE (substrat sans polluant + vers de terre), P (substrat contaminé à l‘arsenic et à l‘antimoine) et PE (substrat contaminé + vers de terre). ........................................................ 200 Figure 19 : Mesure de la respiration foliaire des traitements C (substrat sans polluant), CE (substrat sans polluant + vers de terre), P (substrat contaminé à l‘arsenic et à l‘antimoine) et PE (substrat contaminé + vers de terre). ................................................................................ 200 Figure 20 : Schéma récapitulatif des effets des vers de terre sur l‘expression des gènes impliqués dans la nutrition en fer et en phosphate. Les flèches en pointillés rouges indiquent les gènes apparemment surexprimés en réponse aux vers de terre, les flèches en pointillés bleus indiquent les gènes apparemment sous-exprimés en présence des vers de terre. ......... 208 Figure 21 : Schéma récapitulatif des effets du ver de terre Aporrectodea caliginosa et de deux polluants métalloïdiques, l‘antimoine et l‘arsenic, sur les réponses physiologiques et la croissance de la plante modèle Arabidopsis thaliana. L‘arsenic et l‘antimoine sont respectivement représentés par des croix rouges et bleues. La fluorescence initiale (F0) et la fluorescence maximale (Fm) des photosystèmes II des feuilles de chacun des traitements correspondent aux valeurs obtenues sept jours après l‘apparition du bourgeon floral. Le dégagement de dioxygène, lié aux réactions de photosynthèse est représenté par une flèche rouge et le flux de vapeur d‘eau transpiratoire par des flèches bleues. L‘intensité de ces deux tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 phénomènes est proportionnelle à la taille de la police utilisée. ........................................... 212 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 TABLEAUX Tableau I : Eléments essentiels aux plantes supérieures et concentrations internes considérées comme optimales pour une croissance normale (Marschner 1988). MS : matière sèche ........ 14 Tableau II : Présentation des caractéristiques chimiques de l‘arsenic (Lide 2004)................ 33 Tableau III : Présentation des caractéristiques chimiques de l‘antimoine (Lide 2004) ......... 34 Tableau IV : Concentration en antimoine et en arsenic dans différents sites miniers contaminés ................................................................................................................................ 36 Tableau V : Quantité d‘arsenic accumulé dans différents organes d‘espèces végatales prélevées sur d‘anciens sites miniers. Les facteurs de bioaccumulation ont été calculés quand tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 cela a été possible en effectuant le rapport de la concentration du polluant dans les tissus de la plante et dans le sol .................................................................................................................. 39 Tableau VI : Quantité d‘antimoine accumulé dans différents organes d‘espèces prélevées sur d‘anciens sites miniers. Les facteurs de bioaccumulation ont été calculés quand cela a été possible en effectuant le rapport de la concentration du polluant dans les tissus de la plante et dans le sol ................................................................................................................................. 40 Tableau VII : Caractéristiques chimiques du cambisol sableux de Fol-Juif .......................... 53 Tableau VIII : Caractéristiques chimiques du leptosol calcaire de Brunoy ........................... 53 Tableau IX : Caractéristiques chimiques des résidus de minerai d‘Ouche............................. 53 Tableau X : Programmation du four graphite pour la détermination de l‘arsenic .................. 76 Tableau XI : Programmation du four graphite pour la détermination de l‘antimoine ............ 77 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 LISTE DES ANNEXES Annexe 1 Séquences des different couples d‘amorces utilisées dans les réactions de RTPCR Annexe 2 Protocole de la Turbo-DNase Ambion (Qiagen, France) Annexe 3 Principe de mesures de l‘analyseur Ciras-2 (PP System, Hansatech) . tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Annexe 4 Annexe 4 : Projet d‘article destiné à être publié dans les Comptes Rendus Biologies de l‘Académie des Sciences tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 SOMMAIRE INTRODUCTION GENERALE ............................................................................................ 1 Partie 1 : Synthèse bibliographique ........................................................................................ 3 1 Importance des vers de terre pour les écosystèmes ...................................................... 5 1.1 Les vers de terre dans l‘Histoire............................................................................ 5 1.2 Effets des vers de terre sur la croissance et le développement des végétaux ........ 6 1.3. Mécanismes responsables de l‘accroissement de la biomasse végétale ............... 7 1.3.1 Modifications de la structure du sol ............................................................... 7 1.3.2 Minéralisation accentuée et modification de la disponibilité en nutriments .. 8 1.3.3 Interactions avec les micro-organismes bénéfiques ....................................... 9 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 1.3.4. Production de facteurs de croissance et de vitamines ................................. 10 1.3.5. Régulation des parasites du sol ................................................................... 11 1.3.6. Interaction avec les semences ..................................................................... 12 1.3.7. Abrasion et ingestion des racines et des parties aériennes .......................... 12 1.3.7. Conclusion générale sur l‘effet des vers de terre ........................................ 13 2. La nutrition minérale ................................................................................................. 13 2.1. Mécanismes généraux ........................................................................................ 13 2.1.1. Généralités sur les nutriments minéraux ..................................................... 13 2.1.2. Absorption des nutriments .......................................................................... 14 2.2. L‘azote................................................................................................................ 16 2.2.1 Rôle de l‘azote chez le végétal ..................................................................... 16 2.2.2. Effet d‘une carence en azote dans la plante ................................................ 17 2.2.3. Mécanismes d‘absorption de l‘azote ........................................................... 17 2.3. Le phosphore ...................................................................................................... 21 2.3.1. Importance du phosphore ............................................................................ 21 2.3.3. Effet d‘une carence en phosphate ............................................................... 22 2.3.2. Mécanismes d‘absorption du phosphore ..................................................... 24 2.4. Le fer .................................................................................................................. 27 2.4.1. Importance du fer chez les végétaux ........................................................... 28 2.4.2. Mécanismes d‘absorption du fer par les végétaux ...................................... 28 2.4.3. Effet d‘une carence en fer ........................................................................... 31 2.5 Conclusion sur la nutrition minérale ................................................................... 32 3. Application de l‘association plantes-vers de terre à la décontamination de sites pollués .................................................................................................................................. 33 3.1. Pollution des sols par les métaux lourds : cas de l‘arsenic et de l‘antimoine .... 33 3.1.1. Propriétés physico-chimiques de ces deux polluants .................................. 33 3.1.2. Origines des contaminations à l‘arsenic et à l‘antimoine ............................ 34 3.1.2. Toxicité de l‘arsenic et de l‘antimoine pour l‘espèce humaine ................... 35 3.2. Effets de l‘arsenic et de l‘antimoine sur les plantes ........................................... 37 3.2.1. Identification d‘espèces tolérantes, accumulatrices et hyperaccumulatrices ...................................................................................................................................... 37 3.2.2. Mécanismes d‘absorption et d‘accumulation de l‘arsenic et de l‘antimoine chez les plantes ............................................................................................................. 41 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 3.2.3 Mécanismes de toxicité de l‘arsenic et de l‘antimoine et mécanismes de protection des plantes ................................................................................................... 43 3.3. Effets de l‘arsenic et de l‘antimoine sur les vers de terre................................... 47 3.3.1. Effets des différentes classes écologiques des vers de terre sur les polluants métalliques du sol ......................................................................................................... 48 3.3.2. Interaction entre arsenic et vers de terre...................................................... 49 3.3.3. Intérêts des vers de terre pour la phytoremédiation .................................... 49 Partie 2 : Matériels et méthodes ............................................................................................ 51 1 Expérimentation en conditions contrôlées ................................................................. 53 1.1 Les substrats de culture et détermination de la capacité au champ ..................... 53 1.2. Le matériel végétal : Arabidopsis thaliana et Arabidopsis halleri ..................... 54 1.3. Le matériel animal : le ver de terre Aporrectodea caliginosa (Savigny) ........... 54 1.4. Assemblage des microcosmes (substrat de culture, vers de terre et plantes) ..... 55 1.5. Conditions de culture des microcosmes ............................................................. 55 1.6. Précautions adoptées relatives à l‘antimoine et à l‘arsenic ................................ 55 2. Prélèvement des échantillons végétaux ..................................................................... 56 2.1. Plantes cultivées en conditions contrôlées ......................................................... 56 2.2. Espèces végétales présentes sur le site minier ................................................... 56 3. Substrats de culture et résidus miniers du site d‘Ouche ............................................ 57 3.1 Prélèvements in situ des résidus miniers du site d‘Ouche .................................. 57 3.2. Prélèvements des substrats de culture des microcosmes après expérimentation 59 4. Analyses moléculaires ............................................................................................... 59 4.1. Broyage des échantillons végétaux .................................................................... 59 4.2 Amorces oligonucléotidiques utilisées dans les réactions de PCR : détermination des séquences et des couples ............................................................................................ 60 4.3 Extraction des ARN totaux des échantillons végétaux ....................................... 60 4.4. Analyses quantitative et qualitative des acides nucléiques ................................ 60 4.5. Synthèse des ADNc par transcription inverse (reverse transcription) ............... 61 4.6. Les réactions de PCR semi-quantitative (Polymerase Chain Reaction) ............ 62 4.7. Dosage de l‘activité « ferric chelate reductase » (protéine Fro2) dans les racines de plantes d‘Arabidopsis thaliana .................................................................................... 62 5. Analyses physiologiques ........................................................................................... 63 5.1. Mesure des échanges gazeux ............................................................................. 64 5.1.1. Principe ....................................................................................................... 64 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 5.1.2. Protocole de mesure de la photosynthèse nette ........................................... 65 5.2. Mesure de la capacité photosynthétique foliaire et de la respiration ................. 66 5.2.1. Principe des mesures polarographiques ...................................................... 66 5.2.2. Protocole des mesures polarographiques .................................................... 68 5.3. Mesure de la fluorescence .................................................................................. 69 5.3.1 Principe de la fluorescence........................................................................... 70 5.3.2. Protocole des mesures ................................................................................. 72 2.5.4. Dosage des chlorophylles totales (Chla et Chlb) ............................................ 73 2.5.5. Détermination des teneurs relatives en chlorophylles ..................................... 73 5.6. Détermination de l‘humidité pondérale ............................................................. 74 6. Techniques d‘analyses élémentaires ......................................................................... 74 6.1. Analyses élémentaires et granulométriques des substrats de culture et des échantillons du site d‘Ouche ............................................................................................ 74 6.2. Analyses élémentaires des échantillons végétaux .............................................. 75 6.2.1. Détermination des concentrations en azote, fer et phosphore ..................... 75 6.2.2. Détermination des concentrations en As et Sb par spectroscopie d‘absorption atomique à four graphite ......................................................................... 75 2.7. Analyses statistiques .............................................................................................. 77 Partie 3 : Résultats ................................................................................................................. 79 Chapitre 1 : Etude des mécanismes moléculaires responsables de l’accroissement de biomasse végétale en réponse au ver de terre Aporrectodea caliginosa ............................. 81 ARTICLE N°1: Influence du ver de terre Aporrectodea caliginosa sur la biomasse aérienne et racinaire ainsi que sur l’expression de gènes impliqués dans la prolifération cellulaire et les réponses aux contraintes chez Arabidopsis thaliana ................................. 83 Expérimentation ............................................................................................................ 85 Résultats et discussion................................................................................................... 86 Conclusion..................................................................................................................... 87 Chapitre II: Effets du ver Aporrectodea caliginosa sur la nutrition minérale d’Arabidopsis thaliana .......................................................................................................... 113 ARTICLE N°2 : Influence du vers de terre Aporrectodea caliginosa sur l’absorption et l’accumulation du phosphate chez la plante Arabidopsis thaliana ................................... 115 Expérimentation .......................................................................................................... 117 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Résultats et discussion................................................................................................. 118 Conclusion................................................................................................................... 119 ARTICLE N°3 : Influence du ver de terre Aporrectodea caliginosa sur l’absorption et l’accumulation du fer chez la plante Arabidopsis thaliana ............................................... 131 Expérimentation .......................................................................................................... 133 Résultats et discussion................................................................................................. 134 Conclusion................................................................................................................... 135 Chapitre 3 : Application du système expérimental à la phytoremédiation d’un site contaminé à l’arsenic et à l’antimoine ................................................................................ 151 ARTICLE N°5: Présentation d’un ancien site minier à Ouche (Cantal, France) contaminé à l’antimoine et à l’arsenic ................................................................................ 153 Expérimentation .......................................................................................................... 155 Résultats et discussion................................................................................................. 155 Conclusion................................................................................................................... 156 PROJET D’ARTICLE N°6: Effets du ver de terre Aporrectodea caliginosa sur la phytoextraction de l’arsenic et de l’antimoine par la plante Arabidopsis thaliana ........ 175 Expérimentation .......................................................................................................... 177 Résultats et discussion................................................................................................. 178 Conclusion................................................................................................................... 180 Partie 4 : Conclusion générale et perspectives................................................................... 201 1. Un nouveau système expérimental bouleversant l‘étude des interactions vers / plantes............................................................................................................................. 204 2. Aporrectodea caliginosa : une nutrition « forcée » ? .......................................... 206 3. Aporrectodea caliginosa : un catalyseur de la phytoextraction ? ....................... 209 4. Conclusion........................................................................................................... 212 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Références ............................................................................................................................. 215 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Introduction générale INTRODUCTION GENERALE Depuis le siècle dernier, les activités minières, industrielles, agricoles et urbaines ont conduit à un fort accroissement de la pollution des sols. En France, 4033 sites ont été recensés comme pollués ou potentiellement pollués à la fin de l‘année 2008. Parmi ces sites, 41% sont contaminés par des hydrocarbures, 18% par des hydrocarbures acycliques et 18% par le plomb. Les 23% restants sont essentiellement contaminés par d‘autres résidus métalliques. Ces pollutions locales peuvent gagner les nappes phréatiques par des processus de percolation ou encore être disséminées par l‘érosion éolienne. De ce fait, elles ont une sérieuse incidence tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 sur les cultures voisines ou encore sur la santé humaine. L‘arsenic et l‘antimoine bien que n‘étant pas recensés parmi les polluants majeurs de l‘environnement sont souvent retrouvés associés à d‘autres contaminants. En France, et plus particulièrement dans la région Auvergne, de nombreux sites miniers où s‘effectuait l‘extraction d‘antimoine sont désormais à l‘abandon. Pouvant présenter des risques sanitaires pour les populations avoisinantes, leur réhabilitation paraît donc essentielle. Actuellement, la dépollution des sites se fait principalement de manière physicochimique, in situ ou ex situ. Ces traitements sont extrêmement coûteux, perturbent irréversiblement la structure physique et chimique du sol traité et ne peuvent pas être appliqués à de grandes surfaces. Aussi, des approches alternatives, plus économiques et mieux intégrées à l‘échelle du paysage commencent à être développées. Elles impliquent notamment la revégétalisation d‘anciens sites miniers ou de friches industrielles soit par des plantes tolérantes à de fortes concentrations en polluants dans les sédiments (phytostabilisation), soit par des plantes phytoremédiatrices, c'est-à-dire ayant la possibilité d‘hyperaccumuler le(s) polluant(s) dans leurs organes aériens (phytoextraction) ou racinaires (rhizofiltration pour milieux liquides). Cependant, peu de plantes hyperaccumulatrices ont pour le moment été identifiées et la plupart présente une faible production de biomasse et une croissance lente. De plus, de telles espèces végétales sont le plus souvent spécifiques à certains éléments métalliques : le zinc par exemple est hyperaccumulé par plus de 18 espèces végétales telles que Thlaspi caerulescens (L.), Arabidopsis halleri (L.) Heynh ou encore Alyssum murale (L.). Dans le cas de l‘arsenic et de l‘antimoine, le faible nombre d‘espèces 1 Introduction générale tolérantes ou accumulatrices recensées provient d‘inventaires floristiques effectués sur d‘anciens sites contaminés. L‘idée principale de ce travail de doctorat est de tester un catalyseur : le vers de terre dans le but d‘augmenter l‘efficacité des processus de phytoremédiation. De nombreuses études ont montré l‘effet positif de cet invertébré sur la biomasse des végétaux. De plus, en tant que « ingénieur du sol », il est à la base des processus de pédogénèse et peut donc assurer la restructuration du sol et donc renforcer l‘aspect écologique de cette approche. Pour atteindre cet objectif, un système expérimental modèle, permettant une meilleure compréhension des interactions entre le vers de terre et la plante, a été mis en place. Des tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 études préliminaires mesurant les effets des vers de terre sur de grandes voies métaboliques et également sur la nutrition minérale d‘Arabidopsis thaliana ont été effectuées dans le but ultime étant de tester l‘incidence de cette interaction sur la phytoremédiation d‘un site contaminé à l‘arsenic et à l‘antimoine. 2 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Partie 1 : Synthèse bibliographique 3 4 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Synthèse bibliographique 1 Importance des vers de terre pour les écosystèmes 1.1 Les vers de terre dans l’Histoire Selon les civilisations et les époques, le degré d‘appréciation des vers de terre a beaucoup varié. Trois périodes peuvent être distinguées : l‘antiquité, « l‘avant Darwin » et « l‘après Darwin ». Chez les Egyptiens (-1558 à -30 avant J.C.), les vers de terre étaient vénérés, considérés comme des promoteurs de la fertilité des sols. La reine Cléopâtre alla même jusqu‘à rédiger un édit interdisant leur exportation hors du territoire (Minnich 1977). Dans la Grèce Antique, Aristote s‘intéressa vivement à ces animaux, les qualifiant « d‘entrailles de la terre » (Kevan 1985). tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Cependant, à partir du 17ème siècle, en Europe, les vers de terre sont considérés comme des espèces nuisibles qu‘il faut à tout prix éradiquer (Minnich 1977). Ce n‘est qu‘à la fin du 19ème siècle que leur statut est réhabilité grâce à l‘intervention de Darwin qui rédige un livre à leur sujet : The Formation of Vegetable Mold through the Action of Worms dans lequel le naturaliste met en évidence leur action capitale dans les processus de dégradation de la matière organique ainsi que leurs effets sur la structure et la fertilité du sol (Brown et al. 2003). Quelques années après la parution de cet ouvrage, un pédologue allemand, Wollny, mena de nombreuses expériences sur ces invertébrés (Wollny 1890) ; il est le premier à s‘être intéressé à l‘érosion des sols, en étudiant notamment les effets de différents facteurs tels que la végétation et l‘état du sol. Pendant cinq ans, il s‘est intéressé à la place des vers de terre dans l‘agriculture. Pour cela, il a tout d‘abord étudié leurs effets sur des céréales et des légumineuses. Ses résultats montrent une augmentation de 35% à 50% du rendement en grains et de 40% pour la paille. Il obtint des résultats similaires avec la pomme de terre, le lin et la betterave. Aussi, émit-il l‘hypothèse que les vers de terre amélioraient la perméabilité du sol et de ce fait permettaient une meilleure oxygénation et un meilleur drainage de ce dernier. Pour pousser plus avant ses recherches, il étudia la composition chimique des sols avec et sans vers de terre et observa une augmentation considérable de l‘azote soluble et des minéraux disponibles. Cependant, la validité de ces derniers résultats restait discutable du fait qu‘il fut incapable de déterminer si ses observations étaient dues à la présence de turricules ou simplement liées à la mort des vers. 5 Synthèse bibliographique L‘ensemble des observations faites par Darwin et les autres chercheurs s‘intéressant aux vers de terre n‘eut cependant que très peu d‘effets immédiats sur l‘agriculture. En effet, cette dernière était à cette époque très liée à la chimie depuis la parution d‘un ouvrage de Liebig en 1840 : «Chimie Appliquée à la Physiologie Végétale et à l‘Agriculture » (Blanchart et al. 2005). Il faut attendre la seconde moitié du 20ème siècle pour que les idées de Darwin commencent à se répandre. Dès lors, le nombre d‘études portant sur l‘impact des vers de terre, sur la structure du sol ou encore sur la croissance végétale n‘a cessé de croître. 1.2 Effets des vers de terre sur la croissance et le développement des végétaux tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 De nombreuses études ont recensé les effets des vers de terre sur différentes espèces végétales. Brown et al. (1999) ont compilé dans une revue 246 expériences réalisées en milieu tropical, en champ et en serre. Ces expériences ont impliqué 34 espèces de vers de terre, 19 espèces végétales et 23 types de sols différents. De l‘ensemble de ces données, il ressort que les vers de terre affectent de manière positive la biomasse des plantes dans 75% des cas (biomasses aérienne et racinaire confondues) avec une augmentation moyenne de 57% pour les parties aériennes et 36% pour le rendement en graines. En revanche, les vers de terre n‘affectent la croissance du système racinaire que dans 59% des cas. Une seconde revue concernant 84 cas portant cette fois-ci des espèces tempérées de vers de terre a été menée par Scheu (2003). Dans cette étude, il apparaît que les vers affectent de manière significativement positive la biomasse aérienne des plantes dans 79% des cas et la diminue dans 9% des cas. En ce qui concerne la biomasse racinaire, les effets des vers apparaissent plus contrastés : Scheu a remarqué une augmentation de la biomasse de l‘appareil souterrain dans 50% des cas, mais également une diminution significative dans 38% des expériences. Au vu de ces deux grandes études, l’effet positif des vers de terre sur la biomasse aérienne des végétaux semble bien établi. En revanche, leur action sur le système racinaire semble beaucoup plus contrastée. De plus, ces études montrent la spécificité de l’interaction entre le ver, la plante et également le type de sol utilisé pour l’expérience. Il apparaît donc essentiel de comprendre les différents mécanismes mis en jeu lors de telles interactions. 6 Synthèse bibliographique 1.3. Mécanismes responsables de l’accroissement de la biomasse végétale Brown et al. (2004) ont identifié sept grands mécanismes permettant d‘expliquer les effets des vers sur la croissance et le développement des plantes. Ces effets peuvent être tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 de natures physiques, chimiques ou encore biologiques (figure 1). Figure 1 : Modèle simplifié des simplifié effets physiques, biologiques des vers de Figure 2 : Modèle des effetschimiques physiques, et chimiques et biologiques desterre sur le sol de terresur sur lale croissance sol avec leurs effets potentiels la cro issanceSyers et la nutrition avec leurs effetsvers potentiels et la nutrition de lasur plante (d‘après et Springett 1983) de la plante (d‘après Syers et Springett, 1983) 1.3.1 Modifications de la structure du sol De part leurs activités, les vers de terre entraînent des modifications physicochimiques dans les sols où ils évoluent (Edwards 2004). Les turricules qu‘ils forment affectent l‘agrégation et les galeries qu‘ils creusent modifient les propriétés hydriques. Ils sont très importants dans les processus de pédogénèse, principalement en raison de leur consommation de matière organique qu‘ils vont fragmenter et mélanger intimement aux particules minérales pour former des agrégats aqueux stables (Brown 2000). D‘une manière générale, les vers de terre diminuent la taille des particules organiques et minérales (Joshi et Kelkar 1952). Plus de 50% des agrégats présents en surface du sol sont issus des vers de terre (Kubiena 1953). Les espèces anéciques telles que Lumbricus terrestris, qui vivent dans des galeries permanentes s‘enfonçant profondément dans la terre, ingèrent préférentiellement de la matière organique mais consomment également d‘importantes quantités de particules minérales. De ce fait, en 7 Synthèse bibliographique réinjectant ces composés aux couches les plus profondes du sol, elles font partie des espèces les plus actives pour les processus de pédogenèse (Edwards 2004). Darwin fut le premier à remarquer que les vers permettaient un brassage du sol des couches les plus profondes vers la surface (Blanchart et al. 2005). La quantité de sol déplacée est variable : de 2 à 250 tonnes par hectare et par an. Ces agrégats ainsi formés vont permettre un meilleur taux d‘infiltration de l‘eau (Carter et al. 1982), et surtout une meilleure rétention de cette dernière dans le sol. Les galeries des vers de terre affectent également la structure du sol. Certaines espèces anéciques (qui creusent des galeries verticales) telles que Lumbricus terrestris creusent profondément dans le sol et parviennent même à passer à travers les couches d‘argiles (Edwards et Lofty 1978). En effet, ces vides dans le sol influencent de manière tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 positive le drainage et l‘aération (Edwards and Lofty 1977) : des études ont montré qu‘en présence de vers de terre, l‘eau pénétrait deux à dix fois plus vite dans le sol (Stockdill 1966) limitant ainsi les phénomènes de ruissellement. Ces modifications physiques du sol ont donc plusieurs conséquences pour les plantes, en augmentant notamment la rétention en eau, en facilitant les échanges gazeux (notamment en permettant un apport de dioxygène aux micro-organismes du sol) et également en permettant un meilleur ancrage du végétal. 1.3.2 Minéralisation accentuée et modification de la disponibilité en nutriments Dans les agro-systèmes tempérés et tropicaux, il a été démontré que les vers de terre accéléraient la minéralisation des nutriments et augmentaient la fertilité du sol (Lee 1985). En effet, en l‘absence de vers de terre, la matière organique reste bloquée en surface, freinant ainsi le recyclage des nutriments. Les lombrics permettent donc l‘incorporation des excréments et des matières végétales dans le sol, modifiant ainsi la capacité d‘échange cationique en surface et dans les couches plus profondes du sol (Sears 1953, Araujo et al. 2004). Les propriétés physico-chimiques des structures biogéniques des vers de terre (galeries et turricules) sont différentes du reste du sol. En effet, ces structures sont enrichies en nitrate (NO3-), en ammonium (NH4+) et en carbone organique (Bhatnagar 1975, Syers et Springett 1983). Le potassium, le calcium, le magnésium et le phosphore voient également leur concentration augmenter dans les turricules (Lavelle et al. 1992). De plus, les sécrétions de mucus laissées par les vers sur les murs de leurs galeries contiennent des concentrations élevées en azote organique et en ammonium (Needham 1957). L‘ammonium, trouvé en concentration très élevée dans 8 Synthèse bibliographique les turricules frais, décline très rapidement sur deux semaines. Cette diminution est corrélée à l‘augmentation de la concentration en nitrate observée dans ce même intervalle de temps (Parkin et Berry 1994). Cet enrichissement en nutriments est dû à une série de processus. Tout d‘abord, les particules organiques et minérales absorbées par le ver de terre sont concassées lors de leur passage dans le gésier. Dans l‘intestin, le changement de pH et les enzymes produits par les bactéries mutualistes poursuivent la fragmentation des particules de manière chimique (Edwards et Bohlen 1996). Ces processus permettent donc la libération des nutriments au départ enchâssés dans les particules minérales. Le rapport C:N de la matière organique diminue progressivement grâce à l’activité des bactéries et la plante peut bénéficier tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 de l’ammonium et des nitrates ainsi libérés. 1.3.3 Interactions avec les micro-organismes bénéfiques Les micro-organismes ont des capacités de mouvement très limitées. Ils ne sont donc pas toujours en contact avec leurs substrats et peuvent également se retrouver dans des conditions défavorables à leur développement. C‘est pourquoi plus de 90% des bactéries du sol se trouvent en état de dormance (Lavelle 1997). Les vers de terre en brassant le sol et en construisant des galeries permettent aux micro-organismes d‘être dispersés dans le sol et d‘entrer en contact avec des ressources auparavant inaccessibles. De plus, l‘intestin des vers de terre fournit un environnement propice à l‘éveil et à la multiplication de certaines espèces de micro-organismes (et défavorable pour d‘autres). En effet, le mucus du tube digestif du ver est riche en acides aminés, en sucres et en glycoprotéines de haut poids moléculaire (40000-60000 Dalton, Martin et al. 1987). Les bactéries sortent de leur dormance : ce phénomène a été appelé « priming effect » par Jenkinson (1966) ou encore dans une version plus moderne « le paradoxe de la Belle au Bois Dormant » (Lavelle 1995) où la belle au bois dormant est interprétée par les bactéries et le prince charmant par le mucus intestinal du ver de terre. L‘analyse des acides gras des phospholipides issus de portions de sols travaillées par les vers a mis en évidence une quantité plus importante de bactéries Gram-négatives par rapport aux bactéries Gram-positives (Clapperton et al. 2001). Les Plant Growth Promoting Bacteria (PGPB, bactéries promotrices de la croissance des plantes), qui synthétisent des substances similaires aux hormones végétales, voient également leurs populations et leur activité augmenter dans les 9 Synthèse bibliographique turricules (Pederson et Hendrikson 1993). Cependant, il apparaît que ce pic d‘activité bactérienne décroît très rapidement dans le temps et qu‘au bout de deux semaines, il n‘y a plus de différence significative entre le turricule et le sol environnant. Il est également utile de préciser que l‘ensemble des effets cités précédemment dépend de la classe écologique du ver. En effet, les vers épigés agissent essentiellement sur la microfaune de la litière, les endogés géophages influencent les micro-organismes du sol. Enfin, les espèces anéciques, de part la construction de leurs galeries verticales permanentes, permettent le développement de points chauds riches en eau et oxygène où les populations bactériennes et fongiques vont pouvoir se développer. L’ensemble de ces micro-organismes, et plus particulièrement les bactéries promotrices de la croissance des plantes va donc être bénéfiques à la plante et va tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 favoriser sa croissance. 1.3.4. Production de facteurs de croissance et de vitamines Au début des années 60, des études sur la production des pâturages, démontrent que la présence du ver de terre endogé Aporrectodea caliginosa induit une augmentation de la production de gazon allant de 28% à 110% (Nielson 1965). L‘auteur émet alors l‘idée que des régulateurs de la croissance des plantes sont sécrétés par les vers. Poursuivant ses expériences (1965), il parvient à extraire des substances indoles à partir de tissus de trois espèces de vers de terre : Aporrectodea caliginosa, Lumbricus rubellus et Eisenia fetida. Avec ces substances extraites, il observe une augmentation de la croissance du pois. Plus récemment, une autre équipe de chercheurs a mis en évidence la production de cytokinines et d‘auxines par sept espèces de vers de terre (Krishnamoorthy et Vajranabhaiah 1986). Selon eux, ces deux types de molécules, similaires aux phytohormones, pourraient persister plus de dix semaines dans les sols mais seraient dégradées en quelques jours sous l‘action de la lumière. En dehors des vers de terre, ces molécules sont principalement retrouvées dans les turricules des vers de terre, dans le vermicompost et dans les substances humiques. L‘équipe de Nardi, (1994) est parvenue à isoler de l‘acide indole 3 acétique (AIA) des substances humiques extraites des fèces de deux vers de terre : Allobophora caliginosa et Allobophora rosea. La concentration en IAA dans ces substances humiques est estimée à 0,5% (v/v) d‘après des imuno-essais enzymatiques (Muscolo et al. 1998). 10 Synthèse bibliographique Les substances humiques présentent de nombreux effets bénéfiques pour la croissance et le développement des plantes. Tout d‘abord, de façon indirecte, elles contribuent à réduire la compaction des sols et améliorent la capacité d‘échange cationique. De façon directe, ces substances humiques influencent positivement la biomasse totale des végétaux et plus particulièrement la biomasse racinaire (Vaughan et Malcolm 1985). De plus, les substances humiques possèdent des propriétés complexantes qui augmentent la disponibilité des micronutriments (Stevensen 1991). Elles stimulent l‘absorption des ions Na 2+ et Ba2+ et également l‘expression de protéines impliquées dans le transport de l‘azote (Vaughan et MacDonald 1976). Ces substances pourraient également agir comme des hormones (Nardi et al. 1988) ou encore induire des modifications dans le génome (Attinà et al. 1992). Des substances de faible poids tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 moléculaire, pourvues d‘une activité similaire aux gibbérellines stimulent l‘absorption des nitrates alors qu‘elles inhibent fortement l‘extrusion des protons au niveau du système racinaire (Nardi et al. 2000). Enfin, il a été montré (Pinton et al. 1998, Pinton et al. 1999) que des plants de concombre déficients en fer pouvaient utiliser le fer complexé aux substances humiques pour réduire les ions Fe 3+ avant de les absorber. Ces dernières années ont vu se multiplier les études concernant les effets de ces facteurs de croissance d’origine bactérienne sur la croissance des végétaux et plus particulièrement sur la stimulation de la nutrition minérale. Les futurs enjeux concernent la caractérisation des espèces bactériennes produisant de tels composés et également le décryptage des mécanismes moléculaires induit par ces composés similaires aux phytohormones. 1.3.5. Régulation des parasites du sol Comme les micro-organismes bénéfiques pour les plantes, les vers de terre altèrent la distribution des pathogènes en participant notamment à leur dispersion. De plus, les vers sont connus pour consommer une large gamme de champignons et bactéries pathogènes ainsi que certaines populations de nématodes (Brown 1995). Concernant les nématodes, plusieurs études ont montré que la présence des vers réduisait l‘impact de ces parasites sur le développement du végétal. Boyer (1998) a observé, au cours d‘expériences en pot avec du riz, une diminution du nombre de nématodes Pratylenchus zeae en présence du ver P. corethrurus. Blouin et al. (2005) ont également étudié les effets des vers de terre sur une population de nématodes s‘attaquant au riz (Oriza 11 Synthèse bibliographique sativa). Ils n‘ont pas observé de diminution du nombre de parasites, mais plutôt que les plantes maintiennent une biomasse aérienne identique à celles des plantes témoins. Ces résultats tendent à montrer que les vers n’agissent pas directement sur les nématodes mais sur les plantes elles-mêmes en stimulant leurs défenses et en augmentant leur seuil de tolérance. 1.3.6. Interaction avec les semences En ingérant du sol, les vers de terre sont responsables de la dissémination des graines. Le passage dans le tube digestif du ver peut affecter favorablement ou défavorablement leur germination (Grant 1983). Decaëns et al. (2001) ont observé une diminution du taux de germination et un ralentissement du processus chez plusieurs tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 adventices mises en culture sur des turricules. 1.3.7. Abrasion et ingestion des racines et des parties aériennes Quelques études, peu nombreuses, font état d‘effets négatifs causés par les vers de terre sur les cultures. Les galeries des vers ainsi que leurs turricules sont souvent en contact étroit avec la rhizosphère. De ce fait, la présence des vers peut affecter négativement les racines, particulièrement les jeunes qui n‘ont pas encore développé de cortex protecteur. Barrion et Litsinger (1996) ont reporté un phénomène d‘abrasion racinaire lié à la présence de vers de terre dans une culture de riz aux Philippines. Cependant, d‘autres raisons pourraient expliquer ce phénomène comme la surpopulation de vers qui entraînerait un nombre trop important de turricules pouvant étouffer les jeunes plants de riz. Certains auteurs tels que Cortez et Bouché (1992) ont également supposé que les vers de terre se nourrissaient de racines vivantes. Cette hypothèse a été invalidée : des analyses du bol alimentaire prélevé dans le gésier et du tube digestif de 30 espèces différentes de vers de terre ont révélé que les racines ne formaient qu‘une fraction infime de l‘alimentation des lombrics (Brown et al. 1999). Enfin le dernier effet négatif rapporté concerne plus particulièrement les vers de terre anécique. Ceux-ci sont connus pour enfouir dans leurs galeries des feuilles de plantes vivantes (Darwin 1881) ou encore endommager les jeunes plantules (Shumway et Koide 1994). Comparés à l’ensemble des effets positifs cités précédemment, les effets négatifs des vers de terre sur la croissance et le développement de la plante apparaissent comme anecdotiques. Des études moléculaires portant par exemple 12 Synthèse bibliographique sur des gènes impliqués dans les réponses aux blessures ou aux contraintes oxydatives permettraient une véritable évaluation de ce phénomène. 1.3.7. Conclusion générale sur l‘effet des vers de terre Les mécanismes généraux des vers de terre pouvant expliquer les gains de biomasse fréquemment observés chez les végétaux apparaissent comme clairement identifiés. La minéralisation accentuée et la libération de composés hormonaux par les bactéries apparaissent comme les facteurs les plus déterminants dans l‘amélioration du rendement. Pour le moment, aucun système expérimental n‘est parvenu à déterminer l‘importance relative de ces mécanismes. Les outils de la biologie moléculaire pourraient permettre d‘obtenir de nouvelles tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 données, notamment par l‘étude des variations d‘expressions de gènes (répondant par exemple à l‘auxine) ou l‘utilisation de mutants déficients dans la production d‘auxine, d‘éthylène ou dans l‘assimilation de certains éléments nutritifs. L‘étude de la nutrition minérale en présence des vers de terre peut permettre d‘améliorer la connaissance des mécanismes responsables de l‘accroissement de biomasse. 2. La nutrition minérale 2.1. Mécanismes généraux 2.1.1. Généralités sur les nutriments minéraux Les éléments requis pour assurer la croissance et le développement de la plante (encore appelé nutriments) sont considérés comme essentiels. Le caractère essentiel est principalement fondé sur deux critères formulés par Epstein (1972): 1) en l‘absence de l‘élément, la plante est incapable de boucler son cycle de développement, 2) l‘élément fait parti d‘un constituant ou d‘un métabolite essentiel. En général, 17 éléments sont considérés comme essentiels pour la plante. Ils sont séparés en deux catégories : les macro-éléments (au nombre de neuf) et les microéléments (encore appelé oligoéléments, au nombre de 8, tableau I). Cette distinction a été établie en fonction des concentrations dans les tissus végétaux. En effet, les macroéléments sont présents à des concentrations supérieures à 10 mmoles par kilo de matière sèche (tableau I). Ils sont le plus souvent impliqués dans la composition des 13 Synthèse bibliographique macromolécules (ADN, ARN, protéines etc.…), ce qui explique les besoins élevés des plantes. Tableau I : Eléments essentiels aux plantes supérieures et concentrations internes considérées comme optimales pour une croissance normale (Marschner 1988). MS : matière sèche Macro-éléments Micro-éléments tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Elément Symbole Forme Concentration chimique disponible (mmol/kg MS) Hydrogène H H2O 60 000 Carbone C CO2 40 000 Oxygène O O2 CO2 30 000 Azote N NO3- NH4+ 1 000 Potassium K K+ 250 Calcium Ca Ca2+ 125 Magnésium Mg Mg2+ - 80 2- Phosphore P HPO4 ,HPO4 60 Soufre S SO42- 30 Chlore Cl Cl- 3,0 Bore B BO33- 2,0 Fer Fe Fe2+ Fe3+ 2,0 Manganèse Mn Mn2+ 1,0 Zinc Zn Zn2+ 0,3 Cuivre Cu Cu2+ 0,1 Nickel Ni Ni2+ 0,05 Molybdène Mo Mo42- 0,001 2.1.2. Absorption des nutriments Les nutriments du sol doivent être acheminés en solution, du sol jusqu‘au xylème pour ensuite être distribués à l‘ensemble des tissus végétaux. Pour parvenir jusqu‘aux vaisseaux conducteurs localisés dans la stèle, ils progressent transversalement et de façon centripète dans la racine. Ce trajet peut être schématisé en trois étapes (figure 2) : - L‘absorption des nutriments se déroule principalement au niveau de la zone pilifère. Les sels minéraux présents dans l‘eau peuvent circuler 14 Synthèse bibliographique dans les espaces existants entre les cellules épidermiques tout d‘abord puis entre les cellules du cortex racinaire. Cette diffusion se fait de manière passive : c‘est la voie apoplastique. - Pour pénétrer dans les cellules, que ce soit les cellules épidermiques, corticales ou encore de l‘endoderme (le cadre de Caspari, composé de cellules subérifiées et donc imperméables, forme une barrière à la diffusion apoplastique), les nutriments sont contraints d‘utiliser des transporteurs localisés sur les membranes. C‘est la voie symplastique. - Une fois dans les cellules, les plasmodesmes (c‘est-à-dire les tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 connections symplastiques entre les cellules) vont permettre aux nutriments de diffuser selon leur gradient de concentration jusqu‘au parenchyme xylèmien de la stèle. Là, les nutriments sont « chargés » dans le xylème. Ce processus met en jeu des transporteurs qui vont permettre d‘accumuler les nutriments dans les vaisseaux conducteurs à l‘encontre de leur gradient de concentration. Figure 2 : Visualisation des trajets empruntés par les nutriments dans une racine. Les flèches fines symbolisent le trajet apoplastique, les flèches en gras le trajet symplastique et les flèches dans un cercle les transports actifs (Hopkins et Evrard 2003) 15 Synthèse bibliographique En raison de l‘importance de l‘azote, du phosphore et du fer dans ce travail de thèse, les modes d‘acquisition de ces éléments par les plantes vont maintenant être décrits en détail. 2.2. L’azote L‘azote est le quatrième élément le plus abondant de la planète. Contrairement à ce qui se passe pour les autres minéraux, l‘érosion des roches mères ne relargue que de très faibles quantités de cet élément. En effet, l‘azote représente moins de 0,1% des éléments de la croûte terrestre. En revanche, il est le principal constituant de l‘atmosphère terrestre dont il représente 78% du volume (sous forme de diazote N2). Les océans et la tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 matière organique du sol sont respectivement les deuxième et troisième réservoirs en azote de la planète. Seules les cyanobactéries et les bactéries symbiotiques du genre Rhizobium (Trinchant et al. 1997) peuvent utiliser le diazote de l‘air. Les nitrates (NO3-) et les ions ammonium (NH4+) sont les principales sources d‘azote inorganique assimilé par les plantes. Dans les régions tempérées, les sols peuvent présenter des teneurs en azote de l‘ordre du gramme par kilo de terre au niveau des horizons superficiels (Heller 1981). Cependant, cet élément est essentiellement sous forme organique (principalement sous forme d‘humus). L‘azote minéral (ammonium, nitrate et nitrite) qui représente moins de 2% de l‘azote total présent dans le sol est issu et donc dépendant de la dégradation de la matière organique (humification et minéralisation de l‘humus). En conséquence, les concentrations en nitrate sont extrêmement variables (de 10 µM dans les terrains les plus pauvres à 100 mM dans les plus riches). 2.2.1 Rôle de l‘azote chez le végétal L‘azote est le quatrième élément le plus abondant dans un végétal (Tableau I) et le principal facteur limitant sa croissance, notamment en raison de sa présence dans de très nombreuses macromolécules essentielles à la vie cellulaire, telles que les acides nucléiques, les acides aminés, les protéines, la chlorophylle et certaines hormones (Harper 1994). Les besoins en azote des plantes varient en fonction de l‘espèce et du stade de développement. La concentration en azote nécessaire pour une croissance optimale varie entre 2% et 5% de la biomasse sèche (Marschner 1988). 16 Synthèse bibliographique 2.2.2. Effet d‘une carence en azote dans la plante Une faible diminution de la biodisponibilité de l‘azote dans le milieu entraîne une modification de la répartition de la biomasse entre les parties aérienne et racinaire de la plante : le carbone est préférentiellement alloué aux racines (Hirose et al. 1984). Ceci entraîne une forte diminution du rapport entre la matière sèche totale et racinaire (Brouwer 1962). En effet, la plante favorise la croissance du compartiment impliqué dans l‘acquisition de l‘élément déficient (Gastal et Lemaire 2002). De ce fait, la déficience en azote s‘associe souvent à une diminution de la taille des feuilles et des ramifications (William et Pearce 1984). Afin d‘assurer sa croissance, une plante en carence azotée peut recycler une partie de l‘azote qu‘elle contient, dans ses feuilles sénescentes et dans certains tissus matures, tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 afin d‘assurer le développement des tissus jeunes. Cette remobilisation entraîne une diminution de la teneur en azote dans tout le végétal en raison d‘une dilution de cet élément. Si la carence persiste, les pools d‘azote des feuilles matures (acides aminés et protéines, tout particulièrement la Rubisco) vont être affectés et les synthèses protéiques diminuent (Lawlor 2002). Ces phénomènes ont pour conséquence de diminuer la capacité photosynthétique car cette dernière est corrélée à la concentration en azote dans les limbes (Evans 1983, Field et Monney 1986). La sensibilité à la contrainte photooxydante augmente également. Les feuilles prennent une teinte violacée, symptomatique de l‘accumulation d‘anthocyanes (Cobbina et Miller 1987; Nielsen et al. 1998). L‘équipe de Sakamoto (Sakamoto et al. 1994) a montré que l‘addition d‘azote dans un milieu contenant des cellules en suspension permettait de réduire cette accumulation. Du fait du rôle essentiel de l‘azote dans les processus anaboliques des végétaux, ceux-ci ont dû développer des stratégies pour limiter les carences en cet élément. La présence de transporteurs à basse et haute affinité ainsi qu‘une grande plasticité du système racinaire sont autant de moyens que la plante a à sa disposition pour optimiser son absorption de l‘azote minéral. 2.2.3. Mécanismes d‘absorption de l‘azote Les plantes prélèvent l‘azote du sol principalement sous la forme de nitrate (NO 3-) et plus rarement sous forme d‘ammonium (NH4+). Les espèces appartenant à la famille des légumineuses peuvent également utiliser l‘azote atmosphérique (N 2) par l‘intermédiaire des bactéries symbiotiques de type Rhizobium (Trinchant et al. 1997). 17 Synthèse bibliographique L‘ammonium absorbé par les racines est aussitôt incorporé dans des composés organiques du fait de sa toxicité pour les cellules lorsqu‘il est à l‘état libre. En revanche, le nitrate est stocké dans les vacuoles des cellules racinaires et des organes de stockage et dans les parties aériennes. L‘absorption du nitrate et de l‘ammonium est effectuée par des transporteurs localisés sur la membrane plasmique des cellules épidermales, corticales et endodermales des racines. Des études physiologiques ont montré qu‘il existait trois systèmes de transport actif pour les ions nitrates : - un système à haute affinité constitutif (cHATS pour « constitutive High Affinity Transport System ») qui permet d‘absorber le nitrate lorsque celui-ci est présent en faible concentration dans la rhizosphère tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 (entre 1µM et 1mM, Behl et al. 1988) - un système à haute affinité inductible (iHATS pour « inductible High Affinity Transport System ») qui est mis en place pour des concentrations en azote identiques à celles citées précédemment (Aslam et al. 1992) - un système à basse affinité (LATS pour « Low Affinity Transport System ») qui se met en place pour des concentrations supérieures à 1 mM (Glass et al. 1992) et dont l‘activité est proportionnelle à la concentration en nitrate dans la solution du sol. Ces systèmes de transport actif sont codés par deux familles de gènes : Nrt1 (Nitrate Root Transporter 1) et Nrt2 (Nitrate Root Transporter 2, Crawford et Glass 1998). L‘aboutissement du projet de séquençage de l‘ensemble du génome d‘Arabidopsis (Arabidopsis genome project, 2001) a permis d‘identifier 52 membres de la famille Nrt1 et 7 membres de la famille Nrt2. Les protéines de type NRT1 appartiennent à la famille des transporteurs de peptides (PTR pour Peptide Transporter) et celles de types NRT2 à la famille des NitratesNitrites Transporteurs (NNP pour Nitrate-Nitrite Porter, Forde 2000). Jusqu‘en 1999, les chercheurs (Forde et Clarkson 1999) pensaient que les transporteurs de type NRT1et de type NRT2 étaient respectivement impliqués dans les systèmes de transport à basse affinité (LATS) et les systèmes de transport à haute affinité (HATS). Des études plus récentes ont invalidé cette hypothèse en montrant que le transporteur AtNRT1.1 pouvait 18 Synthèse bibliographique également fonctionner comme un transporteur de haute affinité lorsqu‘il était phosphorylé (Liu et al. 1999 ; Liu et Tsay 2003). Les transporteurs de type NRT1 (famille des PTR) AtNrt1.1 fut le premier gène identifié, au début des années 70 (OostindiërBraaksma 1970 et 1973), lors de recherches de mutants résistants aux chlorates, qui est un analogue toxique du nitrate. Il s‘est avéré que l‘un d‘eux, le mutant chl1, déficient pour le gène Chl1, présentait également une défaillance dans l‘absorption des nitrates. Des analyses complémentaires sur un mutant d‘Arabidopsis thaliana n‘exprimant pas le gène Nrt1.1 ont montré que la plante ne répondait pas à l‘apport localisé de nitrate contrairement au sauvage (Remans et al. 2006). Les auteurs ont alors proposé que ce tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 gène, exprimé de façon constitutive dans les racines et plus particulièrement dans les poils absorbants et l‘épiderme (Huang et al. 1999), puisse agir comme un détecteur des nitrates ou alors faciliter l‘accès de cet élément au senseur qui serait localisé dans le cortex racinaire. Une seconde expérience avec ce même mutant a montré que l‘absence d‘expression de Nrt1.1 induisait une altération de la régulation du gène Nrt2.1 (Munos et al. 2004). Les gènes AtPtr2A et AtPtr2B appartiennent également à la famille des PTR. Ce sont des transporteurs d‘oligopeptides. En revanche, ils ne présentent qu‘une faible identité avec Nrt1.1 : 25 et 39% respectivement (Song et al. 1996). Les trois derniers membres bien caractérisés de cette famille sont AtNtp2 et AtNpt3 (Hatzfeld et Saito 1999) dont les rôles demeurent à ce jour inconnus et AtNrt1.2 qui, d‘après des études d‘expression dans des œufs de xénope, est un transporteur à basse affinité pour les nitrates (Liu et al. 1999). Les transporteurs de type NRT2 (famille des NNP) Ces gènes sont essentiellement exprimés dans les tissus racinaires. Le premier gène identifié comme codant un transporteur de nitrate appartenant à la famille des NNP est le gène CrNrt2.1. Il a été identifié chez l‘algue Chlamydomonas reinardtii par complémentation d‘un mutant (Quesada et al. 1994). Une souche mutante du champignon Aspergillus nidulans, la souche crna, a été identifiée pour sa résistance au chlorate. En parallèle, cette souche présente une défaillance dans l‘absorption des nitrates à certaines étapes de son développement. La comparaison des séquences en acides aminés déduites du gène CrNrt2.1 et du gène muté de la souche crna a mis en 19 Synthèse bibliographique évidence des régions hautement conservées. Celles-ci ont été utilisées pour la conception d‘oligonucléotides dégénérés qui ont permis d‘isoler la plupart des gènes Nrt2 chez l‘orge, le tabac, le soja et la tomate (Orsel et al. 2002). Chez la plante modèle Arabidopsis thaliana, le premier gène Nrt2 a été identifié par la technique d‘expression différentielle entre deux modes de nutrition : glutamine et nitrate (Filleur et DanielVedele 1999). Les nitrates absorbés par les transporteurs de type NRT2 peuvent être stockés dans les vacuoles des cellules des racines ou des organes aériens ou encore être réduits (Crawford et Glass 1998). La réduction des nitrates fait intervenir deux enzymes clés : la nitrate réductase (NR) et la nitrite réductase (NiR). Elles catalysent respectivement la tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 réduction du nitrate en nitrite et celle du nitrite en ammonium. Les ions NH 4+ sont incorporés en glutamine par la glutamine synthase (GS) puis en glutamate par la glutamate synthase (GOGAT). Le glutamate est le précurseur de tous les acides aminés exceptée la proline. De nombreuses études rapportent une importante plasticité du système racinaire en fonction des concentrations en azote dans le sol. Chez Arabidopsis thaliana, un apport d‘azote déclenche quatre effets principaux : - Zhang et Forde (1998) ont noté que la présence d‘une zone riche en nitrate stimulait l‘élongation des racines latérales à ce niveau. - L‘équipe de Remans (Remans et al 2006) a observé un effet inhibiteur systémique de la croissance racinaire lorsque la plante présente des concentrations en azote élevées dans l‘ensemble de ses tissus. - De même, un rapport C : N élevé dans les tissus aériens supprime l‘initiation des racines latérales (Malamy et Ryan 2001). - Enfin, un apport externe de L-Glutamate entraîne une inhibition de l‘élongation de la racine primaire et stimule la prolifération des racines latérales (Watch Liu et al. 2006). De très récentes études ont montré que l‘inhibition du développement des racines latérales pour une concentration élevée en nitrate était influencée par des bactéries du sol. En effet, l‘effet inhibiteur peut être levé en inoculant certaines rhizobactéries promotrices de la croissance des plantes (Plant Growth Promoting Rhizobacterium, PGPR) comme la souche STM196 de Phyllobacterium (Mantelin et al. 2006). En plus 20 Synthèse bibliographique de levée l‘inhibition de croissance racinaire, l‘ajout de cette rhizobactérie altère également l‘expression de plusieurs transporteurs d‘azote : l‘expression des transporteurs AtNrt1.1 et AtNrt2.1 décroit huit jours après l‘inoculation de la souche bactérienne et les transporteurs AtNrt2.5 et AtNrt2.6 dont la fonction demeure inconnue sont très fortement induits. Bien que l’azote soit un élément limitant dans la majorité des sols, les plantes présentent grâce à l’évolution des systèmes d’assimilation optimisés pour cet élément, notamment en exprimant les transporteurs à haute affinité de type NRT2. La plasticité du système racinaire est également un facteur clé pour l’absorption de l’azote mais également pour le phosphate et le fer dont les tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 mécanismes d’absorption sont détaillés dans les prochains paragraphes. 2.3. Le phosphore Le phosphore constitue entre 0,02 et 0,15% des éléments présents dans la croûte terrestre. Dans les sols, il se trouve presque exclusivement sous forme organique (20 à 80% du phosphore total) et est en revanche considéré comme l‘ion majeur le moins disponible en raison des interactions électrostatiques qu‘il forme avec les particules du sol (Raghothama 1999). De ce fait, sa disponibilité dans les sols ne dépasse guère 10µM (Abel et al. 2002), ce qui est bien inférieur aux concentrations trouvées dans les tissus végétaux (5 à 20 mM). Du fait de sa faible disponibilité dans les sols, les plantes entrent en concurrence directe avec les micro-organismes. Le phosphore est, après l‘azote, le deuxième macro-élément limitant la croissance des végétaux (Abel et al. 2001 ; Barrow 1963). 2.3.1. Importance du phosphore Le phosphore est un macro-élément essentiel pour la plante. Sa concentration moyenne pour une croissance optimale est de l‘ordre de 60µmol/g de matière sèche, ce qui correspond à moins de 0,2 % de la biomasse sèche totale. En tant qu‘élément structural, il est à la fois impliqué dans des macromolécules telles que les acides nucléiques et les phospholipides membranaires. Fonctionnellement, il est essentiel dans les transferts d‘énergie via les liaisons anhydres phosphoriques à haute énergie. Le phosphate inorganique (Pi) est également un substrat ou un produit final essentiel à de nombreuses réactions enzymatiques : il intervient dans la voie de la 21 Synthèse bibliographique glycolyse (Plaxton 1996), dans la régulation des ARNases (Green 1994) et au niveau des phosphatases (Duff et al. 1994). Enfin, au niveau des chloroplastes et des mitochondries, il est utilisé en tant que cofacteur dans le transport des sucres (Schott et al. 1995). 2.3.3. Effet d‘une carence en phosphate Tout comme pour l‘azote, l‘acquisition du phosphate est souvent associée avec des modifications du système racinaire. En réponse à une carence en phosphate, la croissance et l‘architecture des racines sont modifiées (Lynch 1995). La biomasse racinaire augmente, entraînant de ce fait un accroissement des surfaces d‘absorption. Chez Arabidopsis thaliana, la carence en tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 phosphate inhibe l‘élongation de la racine primaire, stimule celle des racines secondaires ainsi que la formation de poils absorbants (Raghothama et Karthikeyan 2005), qui sont également retrouvés dans des zones où ils ne sont habituellement pas présents (Lynch et Beebe 1995). En cela, la plupart des réponses à une carence en phosphate sont similaires à celles causées par l‘auxine et l‘éthylène. En effet, une application d‘auxine exogène sur une plante de lupin non carencée en phosphore entraîne des modifications du système racinaire identiques à celles observées en réponse à une carence en phosphate (Gilbert et al. 2000). L‘application d‘inhibiteurs du transport de l‘auxine annule ces réponses. L‘éthylène semble également être impliqué dans les réponses à une carence en phosphate, mais son rôle est beaucoup moins bien connu. Comme décrit plus haut, l‘une des conséquences de la carence en phosphate est un accroissement de la biomasse racinaire. Or cet effet est annulé par l‘aminoethoxyvinylglycine (AVG) qui est un inhibiteur de l‘éthylène endogène. L‘effet inhibiteur partiellement levé par l‘apport d‘éthylène exogène (Borch et al. 1999). De même, un mutant d‘Arabidopsis thaliana surproduisant de l‘éthylène, eto3, présente un phénotype de plante carencée en phosphate quelque soit la teneur en phosphate de son milieu de culture (Schmidt 2001). En revanche, des études sur des mutants des voies de signalisation de l‘ACC (1aminocyclopropane-1-acide carboxylique), le précurseur de l‘éthylène, ont montré que cette hormone n‘était pas directement impliquée dans la formation des racines latérales (Lopez-Bucio et al. 2002) 22 Synthèse bibliographique Jusqu‘à présent, les molécules responsables de la perception de la carence en phosphate n‘ont pas été identifiées. En revanche, un certain nombre de gènes induits par une telle carence ont été mis en évidence, notamment ceux appartenant à la famille des transporteurs à haute affinité dont les fonctions seront détaillées dans le chapitre suivant. Baldwin (2001) a mis en évidence que l‘expression de ribonucléases et de phosphatases acides est induite par une carence en Pi dans des cellules de tomates. La quantité d‘ARNm codant pour ces ribonucléases augmente très fortement seulement deux heures après le transfert des cellules dans un milieu exempt de Pi. Le transfert des cellules carencées d‘un milieu pauvre à un milieu riche en Pi a pour effet de faire décliner rapidement la quantité de ces mêmes ARNm (en deux à quatre heures) tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 suggérant que ces transcrits ont une durée de vie très courte. Ainsi, l‘induction des gènes répondant à la carence en phosphate apparaît être une réponse primaire dynamique qui nécessite la présence d‘un mécanisme senseur au niveau intracellulaire. Dans une plante entière, le délai de réponse à une carence est beaucoup plus long et celles-ci ne sont observées qu‘après plusieurs jours de carence. Ceci peut s‘expliquer par le fait que la plante a initialement un état en Pi suffisant, lui permettant de « tenir » plusieurs jours avant la perception du manque et donc l‘induction des gènes présentés précédemment (Abel et al. 2001). Une fois induits, ces mêmes gènes peuvent être réprimés par une application locale de Pi sur les racines (Burleigh et Harisson 1999). Cependant, selon ces auteurs, le Pi ne serait pas le signal systémique car les gènes sont réprimés avant que les concentrations internes en phosphate n‘augmentent. Plusieurs molécules, principalement des hormones, ont été proposées comme signal. Dès 1979, Salama et Wareing proposent les cytokinines dont la concentration au niveau de l‘ensemble des tissus diminue en réponse à une carence en phosphate. Martin et al. (2000) ont montré qu‘une application exogène de ce type de molécule réprimait les gènes inductibles par la carence en Pi mais n‘affectait pas la formation des poils absorbants. Cependant, le développement des poils absorbants (qui est l‘une des nombreuses réponses physiologiques à la carence en phosphate) ne dépendrait pas de la concentration interne de Pi de la plante mais de sa concentration dans le substrat de culture (Martin et al. 2000). 23 Synthèse bibliographique 2.3.2. Mécanismes d‘absorption du phosphore Le phosphore est absorbé par les racines essentiellement sous forme de phosphate ionique H2PO4- et HPO42-. Les concentrations en phosphore dans les cellules racinaires et le xylème peuvent être 100 à 1000 fois plus élevées que dans le milieu extérieur (Furihata et al. 1992). Ceci montre qu‘il est absorbé à l‘encontre de son gradient de concentration par des systèmes de transport actif (Bieleski et Ferguson 1983). Chez les plantes, les transporteurs de phosphate sont de deux catégories et présentent des cinétiques distinctes selon que cet élément est en faible (de l‘ordre du µM) ou en forte concentration (de l‘ordre du mM) dans le milieu extérieur, comme il l‘a précédemment été décrit dans le cas de l‘azote. tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Les transporteurs de phosphate à haute affinité Les transporteurs à haute affinité sont des protéines membranaires qui assurent le transfert du phosphate vers le cytoplasme des cellules racinaires lorsque celui-ci est en faible concentration dans le milieu extérieur. Tous appartiennent à la sous-famille 9 de la Super Famille des Facilitateurs Majeurs (MFS pour « Major Facilitator Super Family » (Pao et al. 1998). Ces transporteurs sont des symports, couplés à une pompe H+ ATP dépendante (Ullrich-Eberius et al. 1984). Chez Arabidopsis thaliana, neuf transporteurs à haute affinité, constituant une famille génique, ont été identifiés par bioinformatique (Okumara et al 1998). Pht1 (= Apt2 = AtPt1), Pht2 (= Apt1), Pht3 (= AtPt4), Pht4 (= AtPt2), Pht5 et Pht6. Les gènes Pht1, 2, 3 et 5 sont regroupés dans une région de 25kb du chromosome V (Okumara et al 1998) et les gènes Pht4 et 6 sont localisés sur le chromosome II. Tous ces transporteurs présentent douze régions transmembranaires séparées en deux groupes de six par une large région hydrophile (Figure 3) qui est une caractéristique commune à de nombreuses protéines impliquées dans le transport des ions, des sucres et des acides aminés (Raghothama 1999). 24 Synthèse bibliographique Figure 3 : Modèle d‘un transporteur de phosphate contenant douze domaines transmembranaires et une large région hydrophile (d‘après tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Raghothama 1999) Les transcrits des transporteurs de phosphate à haute affinité semblent préférentiellement exprimés dans les racines et pour la plupart en réponse à une carence en phosphate (Daram et al. 1998). Leur accumulation est stimulée dans les cellules de l‘épiderme racinaire et certaines cellules corticales. Des études effectuées sur des mutants d‘Arabidopsis thaliana ayant intégré des gènes rapporteurs couplés aux promoteurs de différents membres de la famille génique Pht1 ont permis d‘identifier précisément les organes dans lesquels ces gènes s‘expriment (Raghothama et Karthikeyan 2005). Les gènes Pht1.1, 1.2, 1.3 et 1.4 sont fortement exprimés dans les poils absorbants. Pht1.4 a également été détecté à la base des siliques et dans les bourgeons axillaires (Mudge et al. 2002). Enfin, Pht1.5 s‘exprime principalement dans les tissus conducteurs (xylème et phloème) et également dans les cotylédons des jeunes plantes et dans les feuilles sénescentes. Les transporteurs de phosphate à basse affinité Contrairement aux transporteurs à haute affinité qui sont inductibles, les transporteurs de phosphate à basse affinité sont constitutifs (Marschner 1995). Ce sont des transporteurs membranaires souvent impliqués dans le transport intracellulaire de Pi que ce soit vers les vacuoles, les mitochondries ou encore les chloroplastes (Raghothama et Karthikeyan 2005). Le premier de ces transporteurs à avoir été identifié, Pht2.1, a été cloné chez Arabidopsis thaliana. Ce gène code pour une protéine de 64 kDa dont la structure 25 Synthèse bibliographique quaternaire est très similaire à celle des transporteurs à haute affinité. En revanche, cette protéine est principalement exprimée dans les tissus chlorophylliens (Daram et al. 1999). De plus, elle comprend une séquence similaire aux peptides de transit chloroplastiques laissant supposer qu‘elle pourrait être localisée dans la membrane chloroplastique (Versaw et Harrison 2002). Des analyses ultérieures par couplage à la « green fluorescente protein » (GFP) ont confirmé cette hypothèse. De plus, il semblerait que cette protéine PHT2.1 fonctionne en association avec les transporteurs trioses: phosphate dans le but de mobiliser les Pi le long de la membrane chloroplastique (Raghothama et Karthikeyan 2005). Après pénétration dans les cellules racinaires grâce aux transporteurs de type PHT1 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 (Rausch et Bucher 2002), les ions phosphates intègrent quatre voies distinctes : - La majorité intègre le pool métabolique, c'est-à-dire qu‘elle reste dans le cytoplasme des cellules ou dans les organites qu‘elles contiennent. Dans ce cas, ils serviront à la formation de ponts anhydres pour générer l‘ATP (Bieleski et Ferguson 1983). - Une faible proportion des ions phosphate intègre la voie de biosynthèse des phospholipides et des acides nucléiques (Bieleski et Ferguson 1983). - Une autre est transférée vers les vacuoles afin de réguler l‘homéostasie du Pi dans la cellule (Mimura 1995). - Enfin, une partie des ions phosphate est transportée de façon symplasmique jusqu‘aux cellules du parenchyme xylemien qui assurent le chargement dans le xylème et donc l‘alimentation des organes aériens (Jeschke et al. 1997). Le chargement dans le xylème est un processus actif qui met en jeu un transporteur spécifique que l‘on pensait être la protéine PHO1 (Poirier et al. 1991). Son implication avait été déduite de l‘étude d‘un mutant d‘Arabidopsis thaliana, le mutant nucléaire récessif pho1, présentant une carence constitutive en phosphate dans les parties aériennes (Poirier et al. 1991). Cependant, des études plus récentes ont montré que PHO1 ne contrôle pas directement le chargement et le déchargement du phosphate dans le xylème mais qu‘il agirait plutôt de façon indirecte en régulant l‘activité d‘un transporteur PHT1 via une chaîne de transduction du signal (Hamburger et al. 2002). Une fois dans les cellules des parties aériennes, le phosphate intègre les mêmes voies que celles décrites dans le cas des cellules racinaires. Un transporteur de type 26 Synthèse bibliographique PHT1 permet l‘entrée du phosphate dans la cellule. Celui-ci peut être pris en charge par les transporteurs de type PHT2 et PHT3 pour le transfert du phosphate vers les chloroplastes et les mitochondries. Les dix dernières années ont permis d’obtenir de nombreuses informations sur la caractérisation moléculaire des transporteurs de phosphate. L’analyse des transporteurs à haute affinité (de type Pht1) a permis de mieux comprendre les voies d’entrée de cet élément dans les racines. De même, les études sur les transporteurs à basse affinité ont permis de mettre en lumière les mécanismes de transport longue distance du phosphate ainsi que sa compartimentation intracellulaire dans divers organites. Dans le futur, il reste à caractériser les modes tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 de régulation de ces transporteurs, en identifiant notamment les voies de signalisations locales et systémiques qui répondent aux concentrations en phosphate du végétal. 2.4. Le fer Le fer est le quatrième élément le plus important de la lithosphère (croûte terrestre et partie superficielle du manteau supérieur) Il représente 5% (en masse) des éléments composants la croûte terrestre et est le plus souvent combiné avec l‘oxygène pour former principalement de l‘hématite (Fe 2O3), de la magnétite (Fe3O4) et de la limonite (Fe2O3.nH2O). Malgré sa concentration souvent importante dans les sols, sa biodisponibilité (c'est-à-dire la portion de fer soluble et donc assimilable par les microorganismes du sol et les plantes) est très réduite dans les milieux aérobies ou à pH neutre. Dans ces conditions, le fer se retrouve le plus souvent sous la forme ferrique (Fe3+) ou complexé avec les ions OH- pour former des précipités d‘hydroxydes ferriques Fe(OH)3, très peu solubles. Aussi, les quantités de fer biodisponibles sont souvent insuffisantes pour satisfaire les besoins des végétaux. En effet, la concentration optimale pour une bonne croissance de la plante est de 10-9M (Guerinot et Yi 1994). Les processus évolutifs ont donc abouti au développement de mécanismes spécifiques permettant l‘acquisition et le transport de ce métal. 27 Synthèse bibliographique 2.4.1. Importance du fer chez les végétaux Tout comme l‘azote et le phosphore, le fer est un élément essentiel pour la croissance et le développement des plantes. Il se situe à la limite supérieure des micronutriments puisque sa concentration dans les végétaux est en moyenne de 2 µmol g-1. En plus d‘être un élément crustal majeur, le fer présente des propriétés chimiques tout à fait particulières. Comme tout métal de transition, il présente la possibilité d‘exister sous deux formes : l‘une oxydée (Fe3+), dénommée ferrique et l‘autre réduite (Fe2+), le fer ferreux. Cet élément a donc la possibilité de céder ou de capter un électron ce qui en fait un cofacteur de choix dans les réactions d‘oxydoréduction. De plus, grâce à ses six orbitales atomiques, il peut former jusqu‘à six liaisons de coordination et peut donc se combiner à d‘autres éléments électronégatifs tels que l‘azote, l‘oxygène ou tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 encore le soufre, ainsi qu‘à certaines molécules organiques telles que des protéines. Ces dernières sont différenciées en trois classes selon la façon dont l‘ion métallique leur est rattaché : les protéines à centre fer-soufre, les protéines à hème et une troisième grande classe qui regroupe toutes les protéines fixant le fer directement sur leur squelette. Ainsi, le fer, que ce soit en tant que cofacteur ou élément structurel des molécules organiques, intervient dans un grand nombre de voies métaboliques essentielles à la vie cellulaire et a fortiori à celle du végétal, telles que la photosynthèse, la respiration, le métabolisme de l‘azote ou encore les processus de détoxification. Une carence en cet élément affecte donc l‘ensemble des processus physiologiques d‘un végétal. 2.4.2. Mécanismes d‘absorption du fer par les végétaux Dans les sols, le fer existe principalement sous sa forme oxydée ferrique Fe3+. Cependant, une partie de cet élément est maintenue en solution (c'est-à-dire sous une forme disponible pour les végétaux) grâce à des chélateurs naturels du sol tels que la silice et les acides fulviques. Deux stratégies ont été mises en évidence pour l‘acquisition du fer, en fonction de l‘origine phyllogénétique de la plante : ces mécanismes ont été nommés stratégie 1, encore appelée stratégie réductrice et stratégie 2 ou stratégie chélatrice (figure 4). 28 Synthèse bibliographique Stratégie réductrice soil Fe2+ Fe3+ H+ + H+ H H+ H+ Membrane plasmique racinaire IRT1 AHA2 FRO2 Stratégie chélatrice soil Fe (III) - PS PS + Fe3+ tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 ? Fe (III) - PS Membrane plasmique racinaire PS Figure 4 : Réponses à une carence en fer (Guerinot 2007). En haut la réponse caractéristique d‘Arabidopsis thaliana. En bas, la réponse caractéristique d‘une Poacées : le maïs Les Poacées, famille botanique à laquelle appartiennent par exemple le riz, le maïs et l‘orge, chélatent le fer ferrique au moyen de phytosidérophores (PS) excrétés dans la rhizosphère (stratégie II, Figure 4, Römheld et Marschner 1986). Le Fe(III) chélaté est pris en charge par un transporteur spécifique des complexes phytosidérophore – Fe(III) : YS1 (Yellow Strip 1, Curie et al. 2001) isolé chez le maïs en 2001. La séparation du complexe et la réduction du fer se déroulent dans le cytoplasme de la cellule. Le reste des plantes supérieures, c'est-à-dire l‘ensemble des espèces Eudicotylédones (ou dicotylédones vraies) et monocotylédones n‘appartenant pas à la famille des Poacées, réduisent le fer avant de l‘absorber : c‘est la stratégie I (Figure 4). Cette stratégie comprend trois étapes. Une pompe à protons (AHA2), mise en évidence par Romheld en 1984 chez le tournesol, et en 2000 chez Arabidopsis, lors du séquençage de l‘intégralité du génome, acidifie la rhizosphère. Ce processus semble limité à la partie apicale de la racine (Marschner et al. 1986). Une réductase ferrique intervient ensuite pour catalyser la réduction de la forme ferrique Fe 3+ en forme ferreuse Fe2+. C‘est la protéine FRO2 (Figure 5). Le gène codant cette protéine a été isolé après identification des gènes Fre1 et Fre2 codant pour des réductases ferriques chez la levure 29 Synthèse bibliographique (Dancis et al. 1990). L‘expression du gène Fro2 est induite en réponse à une carence en fer dans les racines (Robinson et al. 1999). Sa fonction a été démontrée par complémentation du mutant frd1 d‘Arabidopsis thaliana, déficient pour l‘activité de réduction du fer (Robinson et al. 1999). La réduction du fer par FRO2 qui se produit au niveau des cellules épidermiques de la zone subapicale (Connolly et al. 2003) est la principale étape limitant l‘acquisition de cet élément. tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Extérieur MB Intérieur Figure 5 : Structure hypothétique de la protéine FRO2 associée à la membrane plasmique (MB, Robinson et al. 1999). Cette protéine est constituée de 725 acides aminés. Le site de liaison avec le FAD ainsi qu‘une région hautement conservée adjacente au site de fixation du NADPH ont été mis en évidence. Les ronds blancs symbolisent les quatre résidus histidine responsable de la coordination entre les deux groupes hèmes (barres blanches) Le fer réduit est transporté dans le cytosol des cellules par la protéine IRT1 qui appartient à la famille des transporteurs ZIP (ZRT IRT-like Protein, Mäser et al. 2001). Elle est composée de 339 acides aminés et possède huit segments transmembranaires putatifs (figure 1.6). Elle est localisée dans les cellules de l‘épiderme et dans le cortex de la racine. Des études sur une lignée de mutants d‘Arabidopsis thaliana n‘exprimant pas ce gène ont montré que seules de très fortes concentrations en fer dans le milieu de culture permettaient aux plantes de pousser, ce qui traduit le rôle essentiel de cette protéine pour l‘absorption de cet élément (Varotto et al. 2002, Vert et al. 2002). 30 Synthèse bibliographique Dans la plante, d‘autres transporteurs de fer ont été identifiés : ce sont les protéines NRAMP (Natural resistance-associated Macrophage Protein). Ces transporteurs sont largement répandus chez les êtres vivants puisqu‘ils existent chez les bactéries et les animaux. Le gène Nramp1 a été identifié chez la souris : une mutation dans la séquence nucléotidique entraîne une sensibilité accrue aux bactéries pathogènes (Cellier et al. 1994). Chez Arabidopsis thaliana, six gènes ont été identifiés par analyse bioinformatique du génome. Ils sont regroupés en deux familles géniques. La première comprend AtNramp1 et AtNramp6 et la seconde, les gènes AtNramp2-5. Des études en systèmes hétérologues ont montré que l‘expression des ADNc des Nramp1, 3 et 4 d‘Arabidopsis thaliana permettaient une restauration de la croissance des mutants de tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 levures affectés dans le transport du fer et du manganèse (Curie et al. 2000, Thomine et al. 2000), ce qui confirme l‘implication des protéines correspondantes dans l‘acquisition du fer. In situ, les transcrits de Nramp1 et Nramp3 semblent majoritairement présents dans les racines alors que ceux de Nramp4 s‘accumulent majoritairement dans les parties aériennes. De plus, l‘expression de ces trois transporteurs est induite par une carence en fer. Des études récentes ont montré que la protéine NRAMP3 est localisée dans le tonoplaste (Thomine et al. 2003) et pourrait être impliquée dans la remobilisation du fer stocké dans la vacuole vers le cytoplasme lors d‘une carence en fer. Par ailleurs, un signal d‘adressage aux plastes a été identifié chez AtNramp1 et AtNramp6, ce qui en fait de bons candidats pour le transport du fer vers l‘enveloppe interne des chloroplastes. En revanche, le rôle de la protéine NRAMP2 reste pour le moment non élucidé. 2.4.3. Effet d‘une carence en fer Les premiers symptômes visuels d‘une carence en fer incluent l‘apparition de chloroses intercostales, principalement chez les feuilles jeunes. Ces lésions ont été corrélées à des modifications au niveau de l‘ultra-structure des chloroplastes (Spiller et Terry 1980) ainsi qu‘à une diminution de l‘expression des gènes codant la petite et la grande sous unité de la RUBISCO et des protéines liées aux chlorophylles a et b (Spiller et al. 1987, Winder et Nishio 1995). La carence entraîne la surexpression de gènes impliqués dans l‘absorption du fer principalement dans les racines (Hell et Stephan 2003) mais également dans d‘autres tissus afin de maintenir l‘homéostasie de cet élément (Vert et al. 2003). La morphologie 31 Synthèse bibliographique du système racinaire évolue afin d‘augmenter la surface d‘absorption : le nombre et la longueur des poils absorbants augmentent et des cellules de transfert se différencient sur le rhizoderme (Schmidt 1999). Plusieurs hormones telles que l‘éthylène et l‘auxine sont impliquées dans la réponse à la carence en fer : plusieurs équipes ont rapporté une augmentation de leur synthèse chez les plantes de stratégie I et celles de stratégie II (Morgan et Hall 1962, Römheld et Marschner 1986, Romera et al. 1999). L‘application d‘auxine, d‘éthylène et d‘ABA (acide abscissique) peut mimer l‘ensemble des réponses morphologiques correspondant à une carence en fer (Schmidt et Bartels 1996). De même, l‘application d‘un analogue de l‘acide indole-acétique (l‘auxine), l‘acide 2,4 dichlorophenoxyacétique (2,4-D) sur Plantago lanceolata non carencé stimule la formation des poils absorbants ainsi que celle des cellules de transfert mais n‘affecte tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 que très peu la réduction de fer (Schmidt et Bartels 1996). Ainsi, il apparaît que les mécanismes d‘absorption du fer sont désormais bien caractérisés, en particulier grâce à la caractérisation des gènes Fro2, Irt1 et Ys1. Les transporteurs NRAMPs apparaissent comme de bons candidats assurant la mobilité intracellulaire du fer et sa compartimentation dans les chloroplastes, les vacuoles et les mitochondries. En revanche, comme pour le phosphate, il apparaît désormais important de caractériser les régulations de l‘ensemble de ces transporteurs. Bien que certaines phytohormones semblent impliquées dans la régulation de la nutrition en fer, aucune corrélation claire entre leur accumulation et l‘expression des gènes codant ces transporteurs n‘a pour le moment été établie. L‘implication de phytohormones, plus particulièrement des auxines et de l‘éthylène, dans les changements de phénotype racinaire en réponse à une carence en fer semble être établie de manière plus claire. 2.5 Conclusion sur la nutrition minérale Que ce soit pour le fer, le phosphore ou encore l‘azote, les réponses morphologiques et moléculaires semblent en partie contrôlées par des hormones. Or, les vers de terre en agissant sur les bactéries de type PGPB peuvent influencer l‘accumulation d‘auxines et de cytokinines bactériennes à proximité des racines. De plus, en réponse à une carence minérale, les transporteurs à haute affinité peuvent accumuler des analogues toxiques des ions dont ils assurent le transport. Ces éléments sont par exemple le cadmium pour les transporteurs IRT1 et NRAMPs ou 32 Synthèse bibliographique l‘arsenic pour le transporteur de phosphate Pht1. De ce fait, les vers de terre, en influençant à la fois la production de molécules similaires aux phytohormones et également la disponibilité des métaux, vont pouvoir favoriser l‘absorption de métaux lourds et présentent donc un potentiel pour l‘amélioration des processus de phytoremédiation. 3. Application de l’association plantes-vers de terre à la décontamination de sites pollués 3.1. Pollution des sols par les métaux lourds : cas de l’arsenic et de l’antimoine tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 3.1.1. Propriétés physico-chimiques de ces deux polluants L‘arsenic, de symbole As, est un métalloïde appartenant au groupe 15 (ou VA) de la classification périodique des éléments de Mendeleïev (tableau II). C‘est un élément de transition dont les propriétés physico-chimiques sont intermédiaires entre celles des métaux et celles des non-métaux : en solution, l‘arsenic se rapproche des non-métaux puisque comme eux, il forme des anions. En revanche, sa conductivité électronique et thermique le rapproche des métaux. Tableau II : Présentation des caractéristiques chimiques de l‘arsenic (Lide 2004) Numéro atomique : 33 Symbole atomique : As Masse atomique : 74,9216 Configuration électronique : [Ar]4s23d104p3 Rayon atomique : 125 pm Point de fusion : 603°C Point d‘ébullition : 817°C Etats d‘oxydation : 5, 3, -3 En fonction des conditions environnantes, l‘arsenic peut naturellement adopter quatre états d‘oxydation différents : -III (arsine), 0 (arsenic natif), +III (arsénites) et +V (arséniates). Ainsi, dans les environnements fortement réducteurs, l‘arsenic natif (0) et l‘arsine [-III] sont majoritaires ; dans les milieux modérément réducteurs, la forme prédominante est l‘arsénite, As[III], tandis que dans les milieux oxygénés la forme majeure est l‘arséniate, As[V] (Schiferl et Barrett, 1969). Dans les sols, l‘arsenic se retrouve naturellement sous plus de 200 formes minérales (c'est-à-dire un assemblage élémentaire d‘espèces ioniques ou d‘atomes à la genèse des roches). Celles-ci sont dans 60% des cas des arséniates (forme pentavalente de l‘arsenic), dans 20% des cas des sulfites ou des sels sulfuriques et dans les 20% restants, 33 Synthèse bibliographique l‘arsenic est retrouvé sous forme d‘arsénite (forme trivalente), de silicate ou encore sous sa forme élémentaire (Onishi 1969). L‘antimoine, de symbole Sb (issu de l‘abréviation de son nom latin stibium), est également un métalloïde. De ce fait, il appartient également au groupe 15 de la classification périodique des éléments de Mendeleïev et fait partie de la famille des pnictogènes (c'est-à-dire la famille qui regroupe les éléments de la 15 ème colonne de la table périodique des éléments) tout comme l‘arsenic (tableau III). tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Tableau III : Présentation des caractéristiques chimiques de l‘antimoine (Lide 2004) Numéro atomique : 51 Symbole atomique : Sb Masse atomique : 121,760 Configuration électronique : [Kr]4d105s25p3 Rayon atomique : 145 pm Point de fusion : 630,63°C Point d‘ébullition : 1750°C Etats d‘oxydation : 5, 4, 3, -3 L‘antimoine est peu abondant dans l‘écorce terrestre (0,7%). Il est principalement exploité à l‘état de sulfure, sous forme de stibine et de stilbine. Tout comme l‘arsenic, l‘antimoine peut former des composés dont le degré d‘oxydation varie de -3 à +5. Quatre espèces chimiques sont connues : la forme Sb-3 (anion antimoniure), à laquelle est souvent associée la stibine (SbH3), qui est un gaz très toxique, la forme élémentaire Sb (0), qui est extrêmement toxique, la forme Sb+3 et enfin la forme ionisée la plus oxydée Sb+5 (http://atctoxicologie.free.fr/archi/bibli/antimoine.pdf). 3.1.2. Origines des contaminations à l‘arsenic et à l‘antimoine Dans la croûte terrestre, les concentrations en arsenic et en antimoine ont été estimées à 1.8 mg As kg-1 (Greenwood et Earnshaw 1984) et 0,2 mg Sb kg-1 (Crommentuijn et al 1997). Pour l‘arsenic, des valeurs plus élevées (environ 13 mg As kg-1) ont été trouvées dans certaines roches sédimentaires et dans certains schistes (Wedepohl 1970). Avec l‘effritement des roches mères, l‘arsenic s‘accumule dans les fractions colloïdales, ce qui explique que les concentrations dans les sols soient souvent supérieures à celles observées dans la roche mère (Yan-Chu 1994). Par un mécanisme identique, les concentrations en antimoine peuvent atteindre des valeurs de 0,3 à 8,4 mg Sb kg-1. Dans les sols lourdement fertilisés ou glaiseux, cet élément peut être retrouvé dans des concentrations encore plus élevées. 34 Synthèse bibliographique Les principales sources d‘émission de ces deux métalloïdes dans l‘environnement sont anthropiques et sont majoritairement dues au trafic routier (Dietl et al. 1996) et aux fonderies (Manz et Castro 1997). Dans le cas de l‘antimoine, certains chercheurs ont rapporté que cet élément pouvait être transporté dans l‘atmosphère sur de très grandes distances, par exemple d‘Europe centrale jusqu‘en Norvège (Steinnes 1980, 1997). Des contaminations localisées et beaucoup plus élevées résultent de certaines activités minières (Savage et al. 2000). En effet, a proximité de certains sites miniers des concentrations en arsenic et en antimoine plus de 1 000 fois supérieures aux concentrations habituellement retrouvées dans des sols non contaminés sont observées (Tableau IV). Une synthèse non exhaustive de données recueillies sur différents sites miniers dans le monde montre que les concentrations en arsenic peuvent dépasser les tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 12 000 mg As kg-1 alors que pour l‘antimoine, elles n‘atteignent que 2500 mg Sb kg-1 dans les sites les plus pollués. Bien que l‘arsenic et l‘antimoine soient peu mobiles, dans ces sites faiblement végétalisés et de structure instable, l‘eau soit en ruisselant, soit en s‘infiltrant, entraîne une contamination des nappes phréatiques ou des rivières voisines, étendant de ce fait la zone de contamination, bien qu‘à des concentrations moindres, et entraînant un risque pour la santé des populations voisines. 3.1.2. Toxicité de l‘arsenic et de l‘antimoine pour l‘espèce humaine L‘arsenic et l‘antimoine sont considérés comme fortement toxiques et carcinogènes pour l‘homme (Gebel 1997). Une exposition à l‘antimoine et particulièrement à l‘espèce trivalente Sb(III) peut provoquer de graves troubles cardiaques, rénaux et respiratoires (Fowler et Goering 1991).Les formes inorganiques de l‘arsenic As[III] et As[V] sont les plus toxiques et aussi les plus abondantes dans les milieux aquatiques. Dans l‘eau potable, particulièrement en Asie, ce sont les principaux polluants inorganiques (Smedley et Kinniburgh 2002). Leur concentration maximale a été fixée par l‘Organisation Mondiale de la Santé à 10 µg L-1 pour l‘arsenic et 5µg L-1 pour l‘antimoine. La consommation d‘eau contaminée est ainsi devenue un problème majeur pour de nombreux pays, notamment l‘Inde et le Bengladesh. 35 Synthèse bibliographique Tableau IV : Concentration en antimoine et en arsenic dans différents sites miniers contaminés tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Localisation Nom du site Caractéristiques du site Mari Rosa Valencia del Alcantara, Espagne San Antonio La Codosera, Espagne Filons de quartz, stibine et or. Pilar Herrera del duque, Espagne Dong Mai Hom Ron Phibun district, province de Nakorn Si Thammarat, Thaïlande Bannang Sata district, province de Yala, Thaïlande Bannang Sata district, province de Yala, Thaïlande Bannang Sata district, province de Yala, Thaïlande Filons de quartz, carbonates, stibines, sphalérites et or. Filons d‘arsenic et d‘arsénopyrite Tham thalu Na Sua Phin Yo Dalsung Dalsung, Corée du Sud Sarzedas Province de Castelo Branco, Portugal District de Liverpool, Grande Bretagne Site de Merton Bank Principale mine d‘antimoine en Espagne Teneur moyenne d‘As et/ou de Sb dans les sédiments miniers 225,0 mg Sb kg-1 2443,8 mg Sb kg-1 (sédiments) 1752,0 mg Sb kg-1 (boues) 874,6 mg Sb kg-1 Références directes MurciegoMurciego et al. 2006 12300 mg As kg-1 Filons d‘arsenic et d‘arsénopyrite 4040 mg As kg-1 Filons d‘arsenic et d‘arsénopyrite 6620 mg As kg-1 Filons d‘arsenic et d‘arsénopyrite 8010 mg As kg-1 Filons de cuivre et de tungstène. Le site est également fortement contaminé par l‘antimoine et l‘arsenic Forte contamination à l‘arsenic, l‘antimoine et au tungstène Ancienne raffinerie de cuivre et de produits chimiques 2500 mg As kg-1 54 mg Sb kg-1 76,3 mg As kg-1 663,1 mg Sb kg-1 1386 mg As kg-1 Visoottiviseth et al. 2002 Jung et al. 2002 Pratas et al. 2005 Hartley et al. 2009 36 Synthèse bibliographique 3.2. Effets de l’arsenic et de l’antimoine sur les plantes 3.2.1. Identification d‘espèces tolérantes, accumulatrices et hyperaccumulatrices En général, les plantes poussant sur des sols non pollués présentent des concentrations de 0,009 à 1,5 mg As kg-1 MS pour l‘arsenic et d‘environ 0,1 mg Sb kg-1 MS pour l‘antimoine (Markert 1996). En ce qui concerne les plantes comestibles, les teneurs demeurent également relativement faibles, même lorsque la culture est réalisée sur des sites contaminés (O‘Neill, 1990 ; Hammel et al. 2000). Les anciens sites miniers présentent localement des concentrations extrêmement élevées en arsenic ou en antimoine (tableau IV). Les plantes ayant recolonisé de tels sites sont tolérantes à ces polluants et sont capables de les accumuler ou de les exclure (Pratas et al. tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 2005). Dans les deux cas, ces espèces présentent un intérêt pour la phytostabilisation et la revégétalisation de ces sites (Hooper et Vitousek 1997). En effet, elles peuvent être utilisées dans une optique de stabilisation d‘un site (par limitation des effluents contaminés vers les cours d‘eau et/ou la nappe phréatique) ou dans une optique de décontamination par phytoextraction. Plusieurs équipes de recherche ont publié des inventaires floristiques et les teneurs an arsenic et en antimoine pour les espèces végétales identifiées sur d‘anciens sites miniers (tableaux V et VI). Deux notions sont essentielles pour caractériser une plante hyperaccumulatrice : - Le facteur de bioaccumulation (rapport entre les concentrations du polluant en mg kg-1 dans les parties aériennes et dans le sol), qui représente la capacité d‘une plante à concentrer un polluant dans ses tissus. - Le facteur de translocation (rapport entre les concentrations du polluant dans les parties aériennes et dans le système racinaire), qui représente la capacité d‘une plante à transporter un polluant des racines vers ses parties aériennes. Pour des polluants étudiés fréquemment tels que le plomb, le cuivre et le cadmium, des valeurs seuil de bioaccumulation et de translocation ont été établies afin de distinguer les espèces accumulatrices des espèces hyperaccumulatrices. En revanche, aucune valeur seuil n‘a été déterminée à ce jour pour l‘arsenic et l‘antimoine. Pour l‘arsenic, il faut noter la forte capacité d‘accumulation de la fougère à feuille longue Pteris vittata. Il s‘agit de la première plante identifiée comme hyperaccumulatrice pour cet élément. Elle provient d‘un ancien site contaminé dans le centre de la Floride (Etats Unis) et peut accumuler jusqu‘à 22,6 g As kg-1 dans ses frondes après six semaines de croissance. En moyenne, elle accumule environ 7230 mg As kg-1 MS (Ma et al. 2001), et son 37 Synthèse bibliographique facteur de bioaccumulation a été estimé à 160 lorsque elle est cultivée sur un site faiblement pollué (6 mg As kg-1, Ma et al. 2001). Certaines espèces du genre Agrostis (famille des Poacées) peuvent également accumuler plus de 6000 mg As kg-1 dans leurs feuilles (Porter et Peterson 1975). En ce qui concerne l‘antimoine, des valeurs exceptionnellement élevées ont été mesurées chez trois espèces tempérées (Baroni et al. 2000) : Achillea ageratum qui peut accumuler des quantités d‘antimoine comprises entre 1000 et 1500 mg kg-1 dans ses feuilles et ses inflorescences ; Plantago lanceolata qui accumule essentiellement au niveau de son système racinaire (environ 1500 mg kg-1) et Silene vulgaris qui accumule principalement dans ses tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 parties aériennes (1150 mg kg-1, tableau VI). 38 Synthèse bibliographique Tableau V : Quantité d‘arsenic accumulé dans différents organes d‘espèces végatales prélevées sur d‘anciens sites miniers. Les facteurs de bioaccumulation ont été calculés quand cela a été possible en effectuant le rapport de la concentration du polluant dans les tissus de la plante et dans le sol tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Localisation du site Quantité d‘As dans le substrat de culture (mg kg-1) Famille Espèce Pityrogramma Parkeriaceae calomelanos (L.) Link Comté de Bannang Sata, province de Yala, Thaïlande Mines de Sarzedas, Comté de Castello Branco, centre du Portugal Centre de la Floride racines jeunes feuilles Quantité d‘As accumulée (µg As g-1 MS) Facteur de bioaccumulation 5130-5610 3710-8800 Pteridacea Pteris vittata L. Pinaceae Fagaceae Pinus pinaster Aiton Quercus suber L. Poaceae Agrostis cutisii Kerguelen Phragmites australis 11,1-651.1 144-160 Salicaceae 18,8-1603 Pteridacea Salix phylicifolia et borealis Pteris vittata L. racines frondes frondes sénescentes jeunes aiguilles vieilles aiguilles branches feuilles tiges plante entière feuilles rhizomes racines feuilles tiges racines frondes racines Référence 88-370 4,35 Visoottiviseth et al. 2002 vieilles feuilles Poaceae Mine de Boliben, Suède Organe 600 103-330 4240-6030 300-650 0,12-9,99 0,11-30,07 0,08-0,034 0,15-1,44 0,27-2 0,28-0,50 0,7-1,3 1,9-3,1 25-40 0,6-0,8 0,6-1,2 99-155 7 234 303 6,05 ND ND ND ND ND ND Pratas et al. 2005 ND Stoltz et Greger 2002 ND Ma et al. 2001 10 39 Synthèse bibliographique Tableau VI : Quantité d‘antimoine accumulé dans différents organes d‘espèces prélevées sur d‘anciens sites miniers. Les facteurs de bioaccumulation ont été calculés quand cela a été possible en effectuant le rapport de la concentration du polluant dans les tissus de la plante et dans le sol Localisation du site tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Site de San Antonio, Espagne Comté de Castello Branco, centre du Portugal Quantité de Sb dans le substrat (mg Sb kg-1) 522-3980 11,1-651,1 Forêt de Palatinate, Allemagne Référence 18,79 13,43 ND ND ND ND ND ND Murciego et al. 2007 feuilles basales feuilles caulinaires inflorescences racines feuilles basales 1333-1401 346-372 1,85 0,48 1079-1131 195-217 548-590 1,29 0,29 3,91 Baroni et al. 2000 racines feuilles basales racines racines racines bulbe tubercule 1128-1172 822-886 237-263 0,02-0,03 0,02-0,09 0,02-0,03 <0,002 8,53 6,97 2,09 ND ND ND ND Hammel et al. 2000 Espèce Organe Asteraceae Cistaceae Dittrichia viscosa Cistus ladanifer Pinaceae Pinus pinaster Aiton Quercus suber L. feuilles feuilles jeunes aiguilles vieilles aiguilles branches feuilles tiges plante entière Fagaceae Asteracea Sud de la Toscane, Italie 5439-7621 Facteur de bioaccumulation Famille Poaceae 7992-10402 Quantité de Sb accumulée (µg Sb g-1 MS) 790-1600 58-96 0,01-1,41 0,01-1,85 0,01-1,89 0,03-2,24 0,03-0,72 0,01-0,04 Plantaginaceae Agrostis cutisii Kerguelen Achillea ageratum Plantago lanceolata 5639-7421 Caryophyllaceae Silene vulgaris 37-159 56-159 19-94 19-83 Apiaceae Amaranthaceae Liliaceae Solanaceae Daucus carotta Beta vulgaris Allium cepa Solanum tuberosum Pratas et al. 2005 40 Synthèse bibliographique 3.2.2. Mécanismes d‘absorption et d‘accumulation de l‘arsenic et de l‘antimoine chez les plantes Dans la littérature, les mécanismes d‘absorption de l‘arsenic ont été bien caractérisés chez les plantes supérieures. En revanche, les transporteurs responsables de l‘assimilation de l‘antimoine demeurent encore inconnus et seule la microbiologie permet d‘émettre des hypothèses sur leur nature. C‘est pourquoi, une large partie de ce paragraphe est principalement consacrée au transport des différentes espèces chimiques de l‘arsenic. Absorption des ions arséniates (As(V)) et antimoniates (Sb(V)) La forme arséniate, pentavalente, présente une structure analogue à celle du phosphate. tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Bennet et Malamy (1970) sont les premiers à avoir émis l‘hypothèse que les transporteurs de phosphate permettaient l‘assimilation d‘arsenic : ils ont observé que certaines souches bactériennes, de l‘espèce Escherichia coli, présentant des transporteurs de phosphate défectueux, accumulent moins d‘arsenic et tolèrent cet élément. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, l‘arséniate est pris en charge par la protéine PHO84P (un transporteur de phosphate), apparemment en association avec les protéines PHO87P et PHO88P (Bun-ya et al. 1996). Comme chez les bactéries, une mutation sur l‘un de ces trois gènes entraîne une augmentation de la tolérance à l‘As(V). Chez les plantes supérieures, des études physiologiques et électrophysiologiques sur des cellules racinaires de Holcus lanatus provenant de génotypes tolérants ou intolérants à l‘arséniate ont confirmé que le phosphate et l‘arséniate empruntaient les mêmes transporteurs : les transporteurs à haute affinité pour le phosphate (Meharg et al. 1994). Ce mécanisme d‘absorption est un co-transport mettant en jeu un ion d‘arséniate et deux protons : (Ullrich-Eberius et al. 1989). Comme nous l‘avons vu précédemment chez Arabidopsis thaliana, PHT1.1 et PHT1.4 sont deux transporteurs qui jouent un rôle majeur dans l‘acquisition du phosphate. Le double mutant pht1.1∆4∆ est plus résistant à l‘arséniate que le sauvage, ce qui confirme le rôle essentiel de ces deux transporteurs dans l‘absorption du polluant (Shin et al. 2004). Plus récemment, l‘équipe de Catarecha et al. (2007) a identifié chez Arabidopsis thaliana un double mutant pht1.1∆3 tolérant à l‘arséniate et qui présente un double phénotype : l‘absorption de l‘arséniate diminue au début du cycle de croissance en raison de l‘altération des deux transporteurs de phosphate, et augmente plus tard dans le cycle de croissance par rapport à celle des plantes sauvages. Ceci s‘explique par le fait que les plantes sauvages affectées par la toxicité de l‘arsenic limitent sur le long terme leur capacité 41 Synthèse bibliographique d‘absorption alors que les mutants, moins affectés en début de croissance, continue d‘absorber l‘arsenic en faible quantité grâce aux transporteurs racinaires intacts tels que PHT1.4. Enfin, tout récemment, trois équipes américaines ont étudié les variations du transcriptôme d‘Arabidopsis thaliana en réponse à l‘arséniate (Abercrombie et al. 2008). Ces chercheurs ont mis en évidence une répression des gènes impliqués dans l‘acquisition du phosphate dans le but de protéger le végétal. A la suite de cette synthèse bibliographique, il est possible d‘émettre les conclusions suivantes : - les ions arséniates sont pris en charge par les transporteurs de phosphate, - certaines espèces végétales sont capables de limiter l‘absorption d‘As en tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 régulant l‘expression des transporteurs de phosphate. En revanche, dans le cas de l‘antimoniate, aucun transporteur n‘a pour le moment été identifié, pas même chez les levures ou les bactéries, bien qu‘il ait été montré que les plantes peuvent absorber cet élément. Absorption des ions arsénites (As(III)) et antimonites (Sb(III)) Jusqu‘en 1996, les scientifiques pensaient que l‘arsénite (As(III)) et l‘antimonite (Sb(III)) entraient dans les cellules par diffusion passive en suivant les composés organiques non ionisés tels que les acides aminées. En 1997, l‘équipe de Sanders (Sanders et al. 1997) remarqua que la souche bactérienne mutante glpF présentait une tolérance à l‘antimonite supérieure par rapport à la souche sauvage. C‘est ainsi que fut mis en évidence le rôle de l‘aquaglycéroporine GlpF (Glycerol facilitator) dans le transport de l‘antimonite et de l‘arsénite. Les aquaglycéroprotéines sont une sous-famille de la superfamille des aquaporines (Fu et Min 2007). D‘autres études portant sur les bactéries et les levures ont suivi et ont montré que ce type de protéines était également impliqué dans le transport de l‘arsénite (Bhattacharjee et Rosen 2007). L‘équipe de Bienert (Bienert et al. 2007) a transformé des levures avec des gènes de différentes espèces végétales codant pour des nodulin26-like intrinsic proteins (NIPs), qui sont des aquaporines. Il en résulte que les levures transformées par les gènes d‘Arabidopsis thaliana AtNIP5.1 et AtNIP6.1 ont une sensibilité accrue à l‘arsénite et à l‘antimonite ainsi que des taux d‘accumulation supérieurs à ceux des souches sauvages. En revanche, l‘insertion des ADN-T de ces mêmes gènes chez Arabidopsis n‘entraîne pas de différence significative 42 Synthèse bibliographique par rapport au phénotype sauvage lorsque les plantes poussent sur un milieu riche en arsénite et en antimonite. Ceci signifie que ces protéines ne contribuent pas de manière significative au transport de ces deux éléments (Isayenkov et Maathuis 2008). Le gène AtNIP7.1 apparaît comme un bon candidat pour le transport de l‘arsénite : des mutants d‘Arabidopsis, n‘exprimant pas le gène NIP7.1, présentent une meilleure résistance à l‘arsénite et en accumulent 25% de moins que les Arabidopsis sauvages. De même, l‘expression de ce gène chez la levure augmente la sensibilité de cette dernière à l‘arsénite (Isayenkov et Maathuis 2008). D‘autres études ont montré que l‘arsénite utilise les voies de transport du silicone pour pénétrer dans les cellules de l‘épiderme et de l‘endoderme racinaire, notamment en raison de leurs pKa proches et de leur structure tétraédrique d‘encombrement similaire. Chez le riz tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 (Oriza sativa), la protéine OsNIP2.1, également appelée LSI1 pour son rôle dans le transport du silicone (Ma et al. 2006), a été identifiée très récemment comme transporteur principal de l‘arsénite dans les racines du riz (Ma et al. 2008). Un second transporteur, LSI2, est impliqué dans l‘efflux d‘arsénite vers le xylème (Ma et al. 2008). Des mutations sur ce gène diminuent de 66 à 75% la translocation vers les parties aériennes chez le riz. 3.2.3 Mécanismes de toxicité de l‘arsenic et de l‘antimoine et mécanismes de protection des plantes Transport de l‘arsenic à longue distance dans les plantes Contrairement au phosphate, l‘arsenic est très peu mobile dans la plante, excepté chez les espèces hyperaccumulatrices. Chez Arabidopsis thaliana, moins de 3% de l‘arsenic absorbé par les racines est transféré vers les parties aériennes (Quaghebeur et Rengel 2004). Une étude intégrant 46 espèces végétales a montré que le rapport entre la quantité d‘arsenic présente dans les feuilles et celle présente dans les racines était compris entre 0,01 et 0,9 avec une médiane à 0,09 (Raab et al. 2007). L‘une des hypothèses pouvant expliquer ce faible taux de translocation vers les parties aériennes est que les ions arséniates sont rapidement réduits en arsénites dans les racines, puis complexés à des phytochélatines, ce qui entraînerait leur séquestration dans les vacuoles (Zhao et al. 2008). Des expériences sur Arabidopsis thaliana ont montré que lorsque le gène AtACR2 ((Arsenic Compound Resistance, qui permet la réduction des ions arséniate en arsénite) était « éteint », le rapport entre l‘arsenic présent dans les parties aériennes et dans les racines passait de 0,01 chez le phénotype sauvage à 0,025 chez les plantes transformées (Dankher et al. 2006). Les auteurs de cette expérience ont donc supposé qu‘en bloquant l‘activité de la 43 Synthèse bibliographique protéine AtACR2, la disponibilité de l‘arséniate dans les racines serait accrue ce qui le rendrait exportable vers xylème, probablement par l‘intermédiaire des transporteurs de phosphate. La même année, une autre équipe de chercheurs (Bleeker et al. 2006) a identifié des protéines de type CDC25, similaires à ACR2 par des analyses in silico : AtASR, chez Arabidopsis thaliana et HLASR chez Holcus lanatus. La surexpression du gène AtASR par insertion d‘un ADN-T dans des Arabidopsis thaliana entraîne une rétention de l‘arsenic dans le système racinaire. De cette étude, il ressort que la forme As(III) est moins mobile vers les parties aériennes que la forme As(V). De plus, des études sur un mutant pho1 d‘Arabidopsis thaliana qui présente un système de transfert du phosphate défectueux vers le xylème, n‘ont révélé aucune modification de la tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 répartition de l‘arsenic entre les feuilles et les racines par rapport aux témoins (Quaghebeur et Rengel 2004). Ainsi, l‘arsenic apparaît donc comme très peu mobile dans la plupart des plantes. La forme arséniate (As5+) est réduite par une arséniate reductase (AR) grâce au pouvoir réducteur du glutathion pour donner la forme arsénite. Celle-ci étant plus toxique pour la cellule, elle est complexée par des phytochélatines puis transportée dans la vacuole où elle est séquestrée. Certaines espèces végétales font exception : ce sont les espèces hyperaccumulatrices comme Pterris vittata qui mobilise facilement l‘arsenic vers le xylème (Su et al. 2008) et également certaines plantes comestibles telles que le riz (Oriza sativa) probablement en raison de la forte expression du transporteur de silicone LSI2 dont il a été montré précédemment qu‘il a également la faculté de transporter l‘arsenic (Ma et al. 2008). La figure 6, extraite d‘un article publié par Zhao et al. (2009) est une bonne synthèse de l‘ensemble des mécanismes d‘absorption et de stockage de l‘arsenic. 44 Synthèse bibliographique Xylème Cellule racinaire Cytoplasme As(V) H+ As(V) As(V) Vacuole ATP H+ ADP H+ As(III)-PCs GSH GSH AR? ? GSSG tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 As(III) As(V) As(III)-PCs As(III) ? As(III) As(III) Transporteur d’efflux Si/arsénate, Lsi2 chez le riz, inconnu chez les autres plantes Aquaporine, Lsi 1 chez le riz Transporteur du complexe As(III)-PC, probablement de type ABC transporteur Transporteur Phosphate/ arséniate Transporteur non identifié pour l’efflux de l’arsénite AR arséniate reductase de type Cdc25 Principaux flux de l’arsenic chez les plantes hyperaccumulatrices Figure 6 : Schéma des mécanismes possibles de l‘absorption de l‘arsenic par les cellules végétales (d‘après Zhao et al. 2009) Toxicité de l‘arsenic et de l‘antimoine L‘arsenic et l‘antimoine ne sont pas des éléments essentiels pour les plantes. Une fois absorbés, ils entrent en compétition avec des métabolites essentiels, ce qui les rend phytotoxiques (Bowen 1979). Comme c‘est le cas pour l‘homme, la toxicité de ces deux éléments pour les plantes dépend de leur nature chimique : les formes inorganiques sont plus toxiques que les formes organiques. Cette toxicité est aussi dépendante du degré d‘oxydation : l‘arsenic natif (As(0)) est plus toxique que l‘arsénite (As (III)) et l‘arséniate (As(V)) est la moins toxique des formes. 45 Synthèse bibliographique Biochimiquement, l‘arsenic a deux effets majeurs : - il interrompt les chaînes de transport d‘électrons mitochondriales en se substituant au phosphore dans la réaction de formation de l‘ATP - à forte concentration, les formes inorganiques entraînent la précipitation des protéines en interagissant avec les liens sulfures et les sites actifs Selon Sun et al. (2000), l‘antimoine agirait sur les groupements thiols du glutathion et des protéines de la même manière que l‘arsenic et que d‘autres métaux lourds tels que le plomb. De plus, Abercrombie et al. (2008) ont mis en évidence que les protéines de la famille des Super Oxyde Dismutase (SOD) sont très affectées par l‘arséniate chez la plante Arabidopsis thaliana. Le niveau de transcription des gènes de SOD Cu/Zn chloroplastiques et non chloroplastiques est multiplié par 4,6 et 2,4 respectivement par rapport aux témoins. A tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 l‘inverse, les quantités de transcrits de la SOD Fe diminuent de plus de 5 fois en réponse à l‘arséniate. Ces réponses s‘expliquent par le fait que l‘arsenic génère une forte production d‘espèces actives de l‘oxygène (ROS). Cette production pourrait être une conséquence de la réduction de l‘arséniate en arsénite (Mylona et al. 1998). Une équipe de chercheurs a estimé que l‘antimoine pouvait être considéré comme phytotoxique lorsque la concentration en cet élément était supérieure ou égale à 150 mg kg-1 au niveau des feuilles matures. Aussi, pour éviter l‘ensemble de ces effets délétères, les plantes ont mis en place des stratégies de détoxification. Processus de détoxification Chez les mammifères (Aposhian 1997), les champignons et les algues (Edmond et Francesconi 1981 ; Cullen et Reimer 1989), la détoxification de l‘arsenic implique principalement des processus de méthylation ou de biotransformation tels que l‘incorporation dans des molécules organiques pour former par exemple de l‘arsénobétaine, de l‘arsénocholine ou encore des arsénosucres (Schmöger et al. 2000). Chez les bactéries, une large gamme de mécanismes de tolérance a été mise en évidence, comme le système d‘efflux de la forme As(V)O43-, ATP dépendant (Sylver 1996). Par contre, les plantes supérieures semblent plus souvent mettre en jeu un système de détoxification basé sur la conjugaison de l‘arsenic avec des phytochélatines (PC). Ces peptides non transcriptionnels, riches en résidus cystéine, sont issus de la coupure du tripeptide du glutathion (GSH) par la phytochélatine synthase (Cobett 2000). Elles sont capables de fixer les métaux lourds. Leur synthèse est souvent initiée par la présence dans le cytoplasme d‘ions métalliques tels que le cadmium et le cuivre (Nieboer et Richardson 1987). 46 Synthèse bibliographique En 1996, la synthèse de phytochélatines chez une plante supérieure en réponse aux anions arséniates et arsénites a été montrée pour la première fois (Maitani et al. 1996) mais la formation du complexe As-PC ne fut pas démontrée par ces chercheurs. Ceci fut réalisé l‘étude de Ha (Ha et al. 1999) sur des mutants d‘Arabidopsis ayant perdu l‘activité phytochélatine synthase et présentant une sensibilité accrue aux ions arséniates. En 2000, Schmöger et son équipe (Schmöger et al. 2000) se sont penchés sur le rôle cellulaire des différentes phytochélatines en réponse à l‘arsenic dans le but de compléter les études antérieures. Ils ont entamé des études comparatives avec le cadmium sur des cellules en suspension de Rauvolfia serpentina. Par analyse en chromatographie en phase liquide à haute performance, ils ont mis en évidence une stimulation de la synthèse de deux phytochélatines (PC2 et PC3) : leur vitesse de formation est plus faible en présence des deux tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 métalloïdes qu‘en présence de cadmium mais l‘induction persiste plus longtemps et la concentration finale en PC est plus importante avec l‘arsenic. Parallèlement à cette expérience, les chercheurs ont également mesuré des teneurs élevées en phytochélatines dans des cellules en suspension de Silene cucubalus traitées avec différentes concentrations d‘arsénites. Ces résultats ont été confirmés sur une troisième espèce végétale : Arabidopsis thaliana. Par ces trois expériences, l‘équipe de Schmöger est donc parvenue à démontrer la formation in vivo des phytochélatines. Enfin, l‘existence de complexes arsenic-PC dans lesquels deux molécules de phytochélatine fixent un ion As(III) par trois groupements thiols a également été démontrée par cette même équipe en utilisant des cellules de R. serpentina (Schmöger et al. 2000). Au final, ces données montrent que les plantes favorisent une stratégie de complexation pour résister à la présence d’arsenic. Etant donné l’absence de données sur les mécanismes de détoxification des différentes espèces ioniques de l’antimoine chez les plantes supérieures, ni même chez les bactéries, il nous est impossible de décrire ces mécanismes. 3.3. Effets de l’arsenic et de l’antimoine sur les vers de terre En raison de leur rôle essentiel dans la formation des sols et dans le maintien de leur fertilité, les vers de terre sont souvent inoculés dans les sites dégradés (Butt 1999). Aussi, leur introduction dans des sites contaminés par des métaux a été suggérée (Dickinson 2000). 47 Synthèse bibliographique 3.3.1. Effets des différentes classes écologiques des vers de terre sur les polluants métalliques du sol Les vers de terre ont un contact intime avec le sol que ce soit au niveau de leur derme (contact externe) ou lors de l‘ingestion (contact). Ils sont donc susceptibles d‘accumuler les polluants présents dans le sol. Selon leur classe écologique (endogée, épigée ou anécique), les vers de terre sont plus ou moins sensibles aux éléments traces métalliques (Tomlin 1992). Les individus épigées tels que Lumbricus rubellus et Eisenia fetida sont très mobiles et se localisent préférentiellement dans les horizons superficiels du sol où ils consomment de grandes quantités de matières organiques (Edwards et Bohlen 1996). Ce mode de vie les expose peu à une contamination par voie cutanée, c'est-à-dire par absorption directe par le derme (Langdon et al. 2003). De ce fait, ces espèces ont été largement employées dans tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 diverses expériences étudiant leur influence sur la biodisponibilité des métaux dans le sol (Wen et al. 2004 ; Udovic et al. 2007), pour les plantes (Wen et al. 2005 ; Liu et al. 2005) ou pour les vers eux même (Curie et al. 2005). Eisenia fetida a même été choisi par l‘OCDE comme ver de terre de référence internationale pour les tests standards de toxicité (Nahmani et al. 2007). Généralement, les études portant sur ces vers endogés rapportent une augmentation de la disponibilité des métaux présents dans le sol en leur présence (Sizmur et Hodson 2009). Les espèces anéciques telles que Lumbricus terrestris sont d‘avantage en contact avec les polluants puisqu‘elles creusent profondément dans le sol. Les galeries verticales permanentes qu‘ils créent facilitent l‘infiltration de l‘eau (Farenhorst et al. 2000). Cette dernière passe donc moins de temps à la surface du sol et les métaux présents à la surface ne suivent pas forcément ce flux, ce qui peut entraîner une diminution de la disponibilité des éléments traces métalliques dans les couches plus profondes du sol. Tout comme les espèces épigées, les vers anéciques semblent augmenter la disponibilité des polluants du sol (Ma et al. 2000 ; Cheng et Wong 2002). Les espèces endogées sont probablement les plus adaptées pour toutes les études concernant les changements de disponibilité des polluants du sol étant donné qu‘elles évoluent en permanence en profondeur (cette classe écologique demeure dans les couches profondes du sol où elle creuse des galeries horizontales). Cependant, en raison des contraintes qu‘engendre leur élevage (impossibilité d‘approvisionnement dans le commerce et difficulté à élever en laboratoire), cette catégorie de vers de terre reste la moins étudiée (Sizmur et Hodson 2009). De rares études ont cependant montré que les espèces du genre Aporrectodea augmentaient la disponibilité des métaux pour d‘autres espèces invertébrés 48 Synthèse bibliographique (Coeurdassier et al. 2007) et pouvaient à la fois augmenter (Stephens et al. 1994) ou diminuer les concentrations directement assimilables par les plantes selon la nature du polluant (Zorn et al. 2005). Ces résultats montrent que les vers de terre endogés comme l’espèce Aporrectodea caliginosa représentent l’espèce écologique influençant le plus la disponibilité des métaux lourds. Cependant, cette influence peut se traduire par une augmentation ou une diminution de la disponibilité selon l’élément étudié. Le paragraphe suivant synthétise l’ensemble des effets des vers de terre sur l’arsenic. 3.3.2. Interaction entre arsenic et vers de terre tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 De nombreuses études ont montré que les vers de terre évoluant dans des sites contaminés pouvaient stocker de l‘arsenic dans leurs tissus (Yeates et al ; 1994 ; Fischer et Koszorus 1992 ; Meharg et al. 1998). Certaines espèces présentent un facteur de bioconcentration (concentration dans les tissus du ver de terre/concentration dans le sol) très élevé, notamment Eisenia fetida qui peut présenter un facteur de bioconcentration de 18 pour une concentration en arsenic dans le sol voisine de 20 mg kg-1 (Fischer et Koszorus 1992). Les auteurs de cette expérience ont également montré qu‘il n‘y avait aucune diminution de la teneur en arsenic dans les tissus des vers de terre avant huit semaines. La durée de vie de l‘arsenic dans les tissus semble variable selon les espèces étudiées. En effet, contrairement aux études menées sur E. fetida, la demi-vie de cet élément a été estimée à 10,4 jours chez Lumbricus rubellus (appartenant également à la classe des épigés), après transfert sur un sol exempt de polluant (Langdon et al. 2001). L‘équipe de Geiszinger (1998) a montré qu‘il n‘y avait pas de relation stricte entre la concentration en arsenic dans les sols et celle retrouvée dans les tissus des vers de terre : le facteur de bioconcentration dans les sols non pollués était plus élevé (0,64) que dans les sols contaminés à l‘arsenic (0,1-0,22). Il est donc probable que les vers de terre parviennent à réguler partiellement la concentration en éléments toxiques dans leurs tissus. 3.3.3. Intérêts des vers de terre pour la phytoremédiation Comme il a été décrit précédemment dans cette synthèse, les vers de terre peuvent augmenter la biomasse des plantes. Etant donné qu‘ils peuvent dans certains cas survivre à des concentrations très élevées en métaux lourds et augmenter la disponibilité de nombreux polluants, leurs activités d‘ingénieurs du sol doivent nécessairement être prises en compte dans les stratégies de phytoremédiation. En Asie, et plus particulièrement en Chine, les vers 49 Synthèse bibliographique de terre du genre Pheretima, également appelé Metaphire (appartenant à la classe écologique des épigés) font partis des espèces les plus employées pour étudier les effets des lombrics sur l‘absorption des métaux par les plantes, notamment dans le cadre de processus de revégétalisation ou de phytoextraction d‘anciens sites miniers (Sizmur et Hodson 2009). Ces vers de terre ont notamment été employé pour la dépollution d‘un sol artificiellement contaminé au zinc par du ray-grass (Lollium multiflorum) et de la moutarde indienne (Brassica sp. Wang et al. 2006). De cette étude, il ressort que les vers de terre ont augmenté la biomasse aérienne et racinaire des deux espèces végétales ainsi que les concentrations en zinc à la fois dans les parties aériennes et racinaires, en raison d‘une augmentation de la biodisponibilité de cet élément dans le sol. Cette même équipe a également conduit une seconde expérience en cultivant du ray-grass sur des sols contaminés artificiellement par du tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 cuivre. Dans ce dernier cas, en plus de vers de terre de l‘espèce Metaphire Gillelmi, les expérimentateurs ont ajouté de la paille afin d‘enrichir le substrat de culture en matière organique, potentiellement assimilable par les vers de terre et par les plantes après minéralisation. Comme précédemment, les vers de terre ont permis aux plantes d‘accumuler plus de cuivre dans leurs organes souterrains et aériens. Le ver Eisenia fetida (groupe des épigés) a également fait l‘objet d‘études similaires en Europe. Des études en microcosmes mettant en jeu un substrat issu d‘un ancien site minier contaminé au plomb, zinc, cadmium et cuivre ont montré une fois encore que ce ver de terre augmentait les taux d‘accumulation des éléments chez deux espèces végétales, le maïs (Zea mays) et l‘orge (Hordeum vulgare), dans l‘ensemble des organes des plantes. D’après ces trois études, certaines espèces de vers de terre semblent présenter un très fort potentiel pour la phytoremédiation. Actuellement, aucune publication ne rapporte d’interaction entre les vers de terre, les métalloïdes tels que l’arsenic et l’antimoine et les plantes. Cependant, les vers de terre influencent de façon majeure la biodisponibilité de l’arsenic et peut-être également de l’antimoine dans les sols. Dans des conditions standards, ils influent également sur la concentration foliaire d’un grand nombre d’éléments essentiels tes que l’azote, le calcium, le potassium, le fer ou encore le phosphate (Stephens 1994). Il est donc probable qu’ils aient un impact sur la phytoaccumulation de l’arsenic et de l’antimoine. 50 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Partie 2 : Matériels et méthodes 51 52 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Matériels et méthodes 1 Expérimentation en conditions contrôlées 1.1 Les substrats de culture et détermination de la capacité au champ Trois substrats ont été utilisés pour la culture des plantes. Le premier est un cambisol sableux (tableau VII) prélevé sur le site expérimental de l‘Ecole Normale Supérieure (ENS, Fol-Juif, Seine et Marne, France). Il se caractérise au plan granulométrique par une teneur élevée en sable (74%), les argiles ne représentant que 7% et les limons 19%. tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Tableau VII : Caractéristiques chimiques du cambisol sableux de Fol-Juif N Total (g/kg) 1,2 C Total (g/kg) C:N Nitrate Ammonium (mg/kg) (mg/kg) Matière organique Ca total (g/kg) (g/kg) PH CEC (meq/100g) 14,7 12,4 14 25 5,2 4,1 20 <1 Le second est un leptosol calcaire (tableau VIII) qui a été prélevé sur le site du Muséum d‘Histoires Naturelles, à Brunoy (Essonne, France). Il présente une texture équilibrée avec 34% d‘argile, 39% de limon et 27% de sable. Tableau VIII : Caractéristiques chimiques du leptosol calcaire de Brunoy N Total (g/kg) 4,7 C C:N Total (g/kg) 56,7 12,2 Nitrate (N03) Ammonium (NH4) Matière organique Ca total (g/kg) (g/kg) PH CEC (meq/100g) 78,2 15,2 98,1 7,5 23,4 211 Le troisième substrat (tableau VIII) provient de l‘ancien site minier d‘Ouche (Cantal, France ; paragraphe 2.3.1). Il est contaminé à l‘arsenic et à l‘antimoine. Ce substrat n‘est pas un sol au sens pédologique mais résulte de la sédimentation des éléments très fins de résidus miniers (essentiellement des argiles), sa composition chimique est présentée dans le tableau 2.3. Tableau IX : Caractéristiques chimiques des résidus de minerai d‘Ouche N total (g/kg) 0,8 As total (mg/kg) 324 C total (g/kg) 9,9 Sb total (mg/kg) 1180 Matière organique (g/kg) 17,2 Fe total (g/kg) 8,8 pH 7,3 Fe disponible (mg/kg) 83,7 CEC (meq/100g) 4 53 Matériels et méthodes Les substrats ont été systématiquement prélevés dans les 20 premiers centimètres. Les analyses chimiques ont été réalisées au Laboratoire d‘Analyse des Sols de l‘Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) à Arras (Pas de Calais, France). Les trois substrats ont été préparés de manière identique. Le substrat a été séché à l‘étuve à 40°C pendant une semaine, après un tamisage à 2 mm avant retrait manuel de la macrofaune. La capacité au champ est déterminée selon le protocole suivant : un échantillon de 25 g est placé dans un flacon dont la base a été remplacée par un grillage à mailles fines (dix microns). La base du flacon est immergée dans l‘eau jusqu‘à ce qu‘une pellicule d‘eau affleure à la surface de l‘échantillon (phase de saturation). Le flacon est alors transféré sur une surface sèche pendant 24 heures pour drainer l‘excès d‘eau (phase de ressuyage). tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 L‘échantillon retient par les forces de tension superficielle une quantité d‘eau maximale correspondant à la capacité au champ (CAC, équilibre entre la gravité et la tension superficielle). Elle est exprimée en pourcentage (grammes d‘eau retenus pour 100 g de sol sec). 1.2. Le matériel végétal : Arabidopsis thaliana et Arabidopsis halleri Le groupe d‘Ecophysiologie moléculaire possède sa propre collection de graines d‘Arabidopsis thaliana (L.) Heynh, écotype Columbia. Les semences d‘Arabidopsis halleri (L.) ont été gracieusement fournies par le Professeur B. Saumittou Lapprade (Laboratoire de Génétique et Evolution des Populations végétales, Université de Lille, France). Les semences des deux écotypes ont été déposées dans des boîtes de Pétri contenant un des substrats humidifiés à la capacité au champ. Les boîtes sont placées à l‘obscurité pendant deux jours puis transférées à la lumière une fois les semences germées. Lorsque les jeunes plantules atteignent le stade de développement de « quatre feuilles », elles sont transférées dans les microcosmes. 1.3. Le matériel animal : le ver de terre Aporrectodea caliginosa (Savigny) L‘ensemble des vers de terre a été prélevé à Bondy (site de l‘Institut de Recherche et de Développement, IRD, rue H. Varagnat, Seine Saint Denis, France). Une masse moyenne de 1,5 g de vers, soit quatre à cinq individus adultes, est introduite dans les microcosmes. 54 Matériels et méthodes 1.4. Assemblage des microcosmes (substrat de culture, vers de terre et plantes) Des tubes en « polyvinyle chloride » (PVC) de 10 cm de diamètre ont été débités en tronçons de 16 cm de longueur. Un film plastique épais (0,5 mm d‘épaisseur) a été soudé sur une plaque chauffante à la base de chacun de ces tronçons. Afin de le consolider, une couche de plastique adhésif a été ajoutée et percées de 20 trous pour permettre un bon drainage du sol. Les pots sont remplis avec 1 kg de substrat sec puis réhydratés à 80% de la capacité au champ (humidité pour laquelle les vers présentent une activité maximale, (Pr. P. Lavelle, communication personnelle). Les vers de terre sont introduits dans les microcosmes quatre semaines avant le repiquage des plantules ; ce délai correspond au temps moyen pour qu‘un dixième du volume de substrat soit turriculé (la consommation moyenne journalière de sol tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 pour un ver de type Aporrectodea caliginosa a été estimée à 1 gramme de sol par gramme de ver (Pr. P. Lavelle, communication personnelle)). 1.5. Conditions de culture des microcosmes Après introduction des vers de terre dans les microcosmes, ces derniers sont placés dans une chambre phytotronique (Conviron SH10, Canada). Les conditions sont les suivantes : - lumière/obscurité : 10 heures / 14 heures, - température : 20°C jour, 18°C nuit, - intensité lumineuse : 200 µmoles de photons/m2/s à la hauteur des rosettes, - humidité relative : 70% jour, 60% nuit, - humidité du substrat des microcosmes maintenue à 80% de la capacité au champ. 1.6. Précautions adoptées relatives à l’antimoine et à l’arsenic Les résidus de minerai du site minier d‘Ouche fortement chargés en antimoine et en arsenic, ont entraîné la mise en place de mesure de précaution. Pour toute manipulation, le port de gants est systématique et un masque de type P3 est porté lors du tamisage. De plus, tous les déchets générés par l‘utilisation de ces substrats (solides et liquides) sont stockés dans des containers prévus à cet effet, identifiés et traités comme des produits dangereux. 55 Matériels et méthodes 2. Prélèvement des échantillons végétaux 2.1. Plantes cultivées en conditions contrôlées Trois plantes sont échantillonnées séparément pour chaque traitement (elles représentent trois réplicas biologiques). Le système racinaire est dégagé du substrat par lavage à l‘eau déionisée dans un tamis. Les plantes destinées aux analyses moléculaires sont récoltées dès l‘ébauche du bourgeon floral en séparant les feuilles et les systèmes racinaires. Les échantillons prélevés sont immédiatement congelés dans l‘azote liquide (-176°C) et conservé à -80°C Les plantes destinées aux analyses biochimiques sont également récoltées à l‘ébauche du bourgeon floral et utilisées directement. Enfin, les plantes destinées aux analyses élémentaires sont récoltées tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 en fin de cycle et réparties en cinq lots (graines, siliques évidées, tiges, feuilles et racines). Ces échantillons sont placés dans des tubes plastiques, séchés à 35°C dans une étuve pendant une semaine à poids constant et conservés au sec. Ils sont pesés avant d‘être utilisés pour les analyses élémentaires. 2.2. Espèces végétales présentes sur le site minier L‘échantillonnage a pris en compte tous les végétaux présents sur le site (espèces arborées, arbustives, herbacées et bryophytes). L‘emplacement de chacun des individus identifiés a été caractérisé par le numéro de lagune et l‘environnement (voir paragraphe 2.3.). L‘ensemble des échantillons récoltés est lavé énergiquement dans de l‘eau déminéralisée (les racines sont en plus frottées afin d‘ôter les résidus de sédiments pollués), puis placés dans des tubes plastiques et mis à l‘étuve à 35°C pendant une semaine. Espèces ligneuses arborée Pour les espèces arborées, Pinus sylvestris (L.) et Betula pendula (L.), un total de douze arbres pour chacune des deux espèces a été échantillonné. Pour chacun, quatre lots sont constitués, correspondant aux racines, tronc, branches et aiguilles ou feuilles. Les carottes de tronc sont obtenues à l‘aide d‘une tarière de Pressler (150 mm, Haglöf, Suède). Pour l‘espèce Quercus pubescens (Willd), un seul individu juvénile (moins de 10 cm de haut) a été prélevé en raison de la faible représentation de l‘espèce sur le site : moins de cinq individus ont été recensés sur l‘ensemble du site et tous étaient juvéniles. Trois lots sont prélevés correspondant aux racines, tige et feuilles. Espèces ligneuse arbustives et herbacées 56 Matériels et méthodes Ces espèces étant faiblement représentées et afin de ne pas perturber l‘équilibre de cet écosystème fragile, un à deux individus seulement ont été prélevés pour chacune des espèces. 3. Substrats de culture et résidus miniers du site d’Ouche 3.1 Prélèvements in situ des résidus miniers du site d’Ouche La carte ci-après (figure 8) présente le site minier d‘Ouche (Longitude : 03°10‘44‘‘E, Latitude : 45°16‘19‘‘N). Celui-ci est constitué de quatre lagunes successives dont la largeur moyenne est de 50 mètres et la longueur de 50 à 100 mètres. Ces lagunes sont nues avec quelques îlots de végétation. Sur chaque lagune, l‘îlot de végétation le plus central (dénommé tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 îlot repère) a été choisi pour effectuer les différents prélèvements de sédiments. LEGENDE Mare temporaire NO Ilots de végétation Points d‘échantillonnage L4 L2 Entrée de la mine L3 L1 SE Section NO -SE Figure 7 : Cartographie des quatre lagunes de l‘ancien site minier d‘Ouche. Les points d‘échantillonnage sont localisées au centre des îlots repères. Les quatres lagunes sont indiquées par les sigles L1, L2, L3 et L4. A proximité de l‘îlot-repère de chaque lagune, deux tranchées perpendiculaires ont été creusées (longueur : 3 m ; profondeur : 0,5 m). Ces tranchées représentent les rayons de quatre cercles concentriques de centre 0 (Figure 8, selon le protocole de Pratas et al., 2005). 57 Matériels et méthodes Dans ces tranchées, deux échantillonnages ont été réalisés, un échantillonnage grossier et un échantillonnage fin. Les prélèvements grossiers sont effectués à trois profondeurs (0¸ 0‚2 et 0,5 mètre) au point 0 (centre des cercles), à 0,5¸ 1 et 1,5 mètre de distance du point 0, dans les quatre directions déterminées par les tranchées. Les échantillons grossiers sont composites. Ils correspondent au mélange des quatre prélèvements effectués à une même distance du point central pour une profondeur donnée. L‘analyse de ces échantillons fournira des informations globales sur les concentrations en arsenic et antimoine et permettra également de mettre en évidence et de quantifier la présence d‘autres Eléments Traces Métalliques (ETM). Les trois profondeurs choisies : surface, 0,2 m (qui correspond à la limite maximale d‘enracinement des végétaux sur le site) et 0,5 m permettront de déterminer le profil vertical des concentrations de tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 ces éléments. L‘échantillonnage fin a été effectué uniquement au point 0 et sur une profondeur comprise entre 0 et 0,2 m. Il a été réalisé strate par strate. L‘épaisseur de chacune des strates variant d‘une lagune à l‘autre, le nombre d‘échantillons fins est donc différent pour chacune d‘elles. Les échantillons fins et grossiers une fois collectés sont traités de la même façon que les substrats de culture (paragraphe 2.3.2.). 58 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Matériels et méthodes Figure 8 : Disposition des tranchées réalisées dans les îlots de végétation considérés comme repères sur les lagunes de résidus miniers du site d‘Ouche (Cantal, France). Les tranchées représentent les deux diamètres perpendiculaires des cercles concentriques de centre 0. Un échantillonnage fin a été réalisé au point 0. Un échantillonnage grossier a été réalisé aux distances 0 m, 0,5 m, 1 m et 1,5 m du point 0 dans chacune des quatre tranchées et les prélèvements effectués à même distance et même profondeur ont été rassemblés (selon protocole Pratas et al. 2005) 3.2. Prélèvements des substrats de culture des microcosmes après expérimentation A la fin de chacune des expérimentations en conditions contrôlées, les microcosmes sont démontés et trois microcosmes sont récupérés pour chaque traitement et échantillonnés séparément afin d‘obtenir trois répétitions des substrats de culture. Après homogénéisation de chaque substrat, un prélèvement de 50 g est placé dans un tube plastique et séché à l‘étuve pendant sept jours à 40°C. 4. Analyses moléculaires 4.1. Broyage des échantillons végétaux Les échantillons de racines et de feuilles conservés à -80°C sont transférés dans un mortier contenant de l‘azote liquide, broyés et réduits en une poudre fine à l‘aide d‘un pilon. 59 Matériels et méthodes Les mortiers et pilons ont été préalablement lavés à l‘hypochlorite de sodium (5%, v/v), rincés, séchés et chauffés à 180°C pendant trois heures. 4.2 Amorces oligonucléotidiques utilisées dans les réactions de PCR : détermination des séquences et des couples Les séquences nucléotidiques des gènes d‘Arabidopsis thaliana sont disponibles sur le site http://www.tair.org. La qualité des amorces dessinées (absence de structure en épingle, absence d‘hybridation entre les amorces) ainsi que la température d‘hybridation ont été vérifiées avec le logiciel Netprimer (http://www.premierbiosoft.com/netprimer/). Les oligonucléotides sont fournis par la société MWGBiotech AG (Ebersberg, tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Allemagne). Les séquences des différents couples d‘amorces ainsi que la taille des amplicons sont disponibles en annexe 1. 4.3 Extraction des ARN totaux des échantillons végétaux L‘extraction des ARN totaux se fait avec du matériel stérile, exempt de RNase. Les ARN totaux sont extraits des échantillons végétaux (dont le poids frais varie de 30 à 300 mg) à l‘aide du kit « Rneasy Plant Mini Kit » (Qiagen, France). Le protocole permet d‘obtenir une solution d‘ARN totaux tout en éliminant les contaminants. Après lyse des cellules et élimination des débris cellulaires, les ARN se fixent sur la membrane de silice d‘une microcolonne en présence d‘une forte concentration saline, tandis que les contaminants sont éliminés par plusieurs lavages successifs à l‘éthanol. Les ARN sont ensuite élués par addition d‘eau stérile et exempte de nucléases. Afin d‘éliminer tout résidu d‘ADN génomique, les échantillons sont traités par la DNase I à raison de 2U/µg d‘ARN (kit turbo DNAse free, Ambion, France). Le protocole détaillé est fourni dans l‘annexe 2. 4.4. Analyses quantitative et qualitative des acides nucléiques Analyse quantitative des acides nucléiques La concentration (c) en ARN totaux des extraits a été déterminée (A 260nm) à partir de 1.5 µL d‘extrait non dilué (spectrophotomètre Nanodrop ND100, Noryx, USA). Pour cette quantification on utilise l‘équation de Beer-Lambert modifiée pour mesurer directement la concentration dans l‘extrait (ng/µl). Le coefficient d‘extinction utilisé est exprimé en 60 Matériels et méthodes ng.cm/μl. La concentration (c) en acides nucléiques (ng/µl) est égale à (A×e)/b, où A est l‘absorbance, e le coefficient d‘extinction dépendant de la longueur d‘onde (ng.cm/μl) et b est le trajet optique en cm. Dans le cas des ARN la valeur de e est 40 ng.cm/μl et celle de b 0,01 cm. De plus, pour chaque extrait le spectre d‘absorption entre 210 et 320 nm permet de déceler la présence d‘éventuels contaminants (protéiques) qui absorbent à 280 nm. Le rapport A260/A280 permet d‘estimer le degré de pureté de l‘échantillon d‘acides nucléiques : ce rapport doit être voisin de 2 pour les ARN élués dans de l‘eau pure « Dnase-Rnase free » (Qiagen, France). Pour chaque extrait, la concentration est normalisée à 100 ng/µL dans de l‘eau pure « DNase-Rnase free » (Nuclease-Free Water, Qiagen, France). tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Analyse qualitative des acides nucléiques L‘analyse est effectuée par électrophorèse sur gel d‘agarose en conditions non dénaturantes, ce qui permet de séparer les molécules d‘acides nucléiques (ARN ou ADN) sans altérer leurs différentes structures secondaires. Le gel d‘agarose (Agarose LE Analytical Grade, Promega, France) est utilisé à la concentration de 1% (P/v) pour les ARN et à 2% (P/v) pour les amplicons d‘ADNc (les fragments sont de taille inférieure à 200 pb). L‘agarose est d‘abord dissout dans du tampon TAE 0.5X (Tris 0,04 M, EDTA 0,001M, pH 8,0, Buffer 50X, Qiagen, France) par chauffage puis 2 µL d‘une solution aqueuse de bromure d‘éthidium (BET, 0,60 µg.mL-1) afin d‘obtenir une concentration finale de 2 10-5 µg mL-1 sont ajoutés avant de couler le gel. Les ARN (environ 300 ng) et les fragments d‘ADN amplifiés par PCR sont déposés sur le gel puis séparés par électrophorèse (Mupid®-one). Le marqueur de taille Smart Ladder® (Eurogentec, France) de 100 à 1000 pb a été utilisé pour l‘analyse des amplicons d‘ADN. Les acides nucléiques sont révélés en présence de BET sous éclairage U.V. à l‘aide de l‘imageur Bio-Rad (Gel Doc XR, BioRad, France) et la quantification des bandes est réalisée par l‘analyseur d‘image « Quantity One », fourni avec l‘imageur Bio Rad. 4.5. Synthèse des ADNc par transcription inverse (reverse transcription) La transcription inverse permet de synthétiser une molécule d‘ADN complémentaire (ADNc) à partir d‘une molécule d‘ARNm en présence d‘une enzyme transcriptase inverse d‘origine virale (kit Omniscript, Qiagen, France) qui catalyse cette réaction. Une amorce 61 Matériels et méthodes poly-dT s‘hybride sur la queue poly-A des ARN messagers et la reverse transcriptase synthétise le brin d‘ADNc complémentaire du brin d‘ARN. Le milieu réactionnel (V=20 µL) contient : - 300 ng d‘ARN totaux - 1 µL d‘inhibiteur de Rnase (10U/µL) - 2 µL de tampon de transcription inverse 10 X - 2 µL de mélange des quatre types de dNTP (10µmol/µL) - 2 µL d‘amorce poly-T (10 µM/µL) - 1 µL d‘enzyme Omniscript Reverse Transcriptase (4U/µL) - de l‘eau ultra pure exempte de Rnase (Qiagen, France) qsp 20µL. tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 La réaction se déroule au bain marie à 37°C pendant une heure. 4.6. Les réactions de PCR semi-quantitative (Polymerase Chain Reaction) Cette technique mise au point par Saiki et al. (1985) permet la synthèse et l‘amplification d‘un fragment d‘ADN de manière exponentielle grâce à l‘utilisation d‘une ADN polymérase, thermostable. La PCR nécessite l‘utilisation de deux amorces spécifiques de la séquence à amplifier (annexe 1) Le volume réactionnel utilisé est de 20 µl et contient : - 1µL d‘ADNc - 1 µL de dNTP (concentration finale : 200 mM chacun) - 10 µL de Master Mix 2X (Promega, France) contenant la Taq DNA polymerase (Thermus aquaticus polymerase à 50U/mL) - 1 µl de chaque amorce (à 0,5 µmol/µL) - de l‘eau ultra pure qsp 20 µl. Cette réaction se déroule dans un « Thermocycler » (Master Cycler Gradient, Eppendorf AG, Allemagne) qui présente l‘avantage d‘avoir des blocs chauffants indépendants permettant d‘effectuer simultanément plusieurs réactions. 4.7. Dosage de l’activité « ferric chelate reductase » (protéine Fro2) dans les racines de plantes d’Arabidopsis thaliana La « ferric chelate reductase » est une enzyme qui réduit les ions ferriques (Fe 3+) en ions ferreux (Fe2+). La technique de dosage colorimétrique décrite ici a été employée par Schmidt 62 Matériels et méthodes sur différentes espèces végétales dont Arabidopsis thaliana (Schikora and Schmidt 2001). Les racines des plantes intactes sont immergées dans une solution aqueuse de ferrozine (FZ, disodium salt of 3-(2-pyridyl)-5,6-bis (4-phenylsulfonic acid)-1,2,4-triazine, Sigma, France). La ferrozine réagit en présence de fer ferreux (Fe 2+) qu‘elle capture pour former un complexe Fe(II)(FZ)3 de couleur magenta. Le Fe-EDTA présent dans le milieu est la source d‘ions ferriques. La composition du mélange réactionnel est la suivante : - 500 µM de Ferrozine, - 500 µM de Fe(III) EDTA, - 25 mM de tampon MES ajusté à pH 5,5, - 500 µM de CaSO4. tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 La réaction est effectuée dans des tubes à essai de 25 mL à température ambiante. L‘ensemble de la verrerie a été préalablement lavé dans une solution à 5% d‘acide nitrique (v/v) afin d‘éliminer les résidus métalliques potentiellement présents et rincé à l‘eau ultrapure. Les racines sont immergées dans le mélange réactionnel pendant 20 minutes puis l‘absorbance de la solution est mesurée au spectrophotomètre à 562 nm. Le témoin est la solution de ferrozine initiale. Le taux de réduction de la protéine Fro2 est ensuite déterminé en utilisant la loi de Beer Lambert : A = C.l. en utilisant un coefficient d‘extinction () de 25.200 M-1.cm-1. L‘activité de réduction de Fe(III) est exprimée en µmol de Fe(III) réduit par g de matière sèche. 5. Analyses physiologiques Différentes méthodes d‘étude ont été utilisées pour une approche globale des paramètres photosynthétiques (figure 10) : la mesure des échanges gazeux renseigne sur l‘efficacité de la biochimie de la photosynthèse (activité de fixation du dioxyde de carbone), et les échanges de vapeur d‘eau (conductance stomatique (Gs) et transpiration (E) ; la méthode polarographique (chambre Hansatech en phase gazeuse) permet de mesurer l‘émission en conditions de CO 2 saturantes (50 000 vpm) ou la consommation de dioxygène et donc mesurer la capacité photosynthétique de la plante et la respiration ; la mesure de fluorescence foliaire permet de caractériser les réactions photochimiques primaires qui correspondent aux réactions lumineuses c‘est-à-dire à la première phase de la photosynthèse ; et enfin, l‘utilisation du 63 Matériels et méthodes « Chlorophyll Meter » permet une estimation relative des teneurs en chlorophylles totales (Chla et b) dans les tissus foliaires. tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Photophosphorylation cyclique et non cyclique Phosphorylation non cyclique Phosphorylation cyclique Figure 9 : Schéma simplifié de la photochimie des végétaux supérieurs (Allen 2003). La phosphorylation non cyclique nécessite quatre électrons pour pouvoir transloquer douze protons et la phosphorylation cyclique du photosystème I nécessite 1 électron pour la translocation de deux protons. La combinaison des phosphorylations cyclique et non cyclique donne les rapports suivants : H+:ATP = 14 et ATP:NADPH = 3 :2. Pour la phosphorylation non cyclique seule, ATP:NADPH = 9 :7. Abréviations : cyt, cytochrome ; e-, électron ; Fd, ferrédoxine ; Pi, phosphate inorganique et PQ, plastoquinone 5.1. Mesure des échanges gazeux La mesure des échanges gazeux a permis de calculer différents paramètres (dont le paramètre Vcmax qui caractérise la capacité de carboxylation de la Rubisco) selon le modèle biochimique de l‘assimilation du CO2 de Farquhar et al. (1980) et de Sharkey (1985). 5.1.1. Principe L‘analyseur de gaz (CIRAS-2 PP Systems, Hitchin, UK, annexe 3) est utilisé pour déterminer l‘assimilation nette de CO2 (A) ainsi que les concentrations internes en CO2 (Ci), la conductance stomatique (Gs) et la transpiration (E). 64 Matériels et méthodes Cet appareil intègre un double système de dilution de gaz pour ajuster la composition de l‘air utilisé (pression de CO2 et de vapeur d‘eau) et un contrôle du débit à l‘entrée de la chambre de mesure. La température de la chambre et de la feuille sont également contrôlées au 1/10ème de degré grâce à un élément Peletier alimenté par un accu 12V externe. Les variations de concentration en CO2 et en vapeur d‘eau entre l‘entrée et la sortie de la chambre sont mesurées par un double analyseur infrarouge (IRGA, annexe 3) opérant en mode différentiel. L‘appareil se compose d‘une unité centrale (régulation, mesure), d‘une interface de commande et d‘une pince contenant la chambre de mesure (appelée PLC ou « Parkinson Leaf Chamber») dont la surface est modifiable selon le type de feuille. La source de CO 2 est une tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 cartouche de gaz carbonique sous pression qui permet d‘ajuster les concentrations en CO 2 en entrée de chambre entre 0 et 2000 vpm. L‘interface d‘acquisition de données fonctionnant sous Windows permet de visualiser sous forme graphique et numérique en temps réel différents paramètres : - les paramètres fixés par l’opérateur : surface de feuille (cm²), PAR (µmol photons m-2 s-1), CO2 (ppm) et humidité de l‘air de référence (%) et débit du flux d‘air de la chambre, - les paramètres mesurés : ΔCO2 (qui correspond à la différence de concentration entre l‘entrée et la sortie de la chambre), ΔH2O (qui correspond à la différence de pression de vapeur entre l‘entrée et la sortie de la chambre), température de la chambre, température de la feuille (en °C, mesurée par capteur IR ou calculée par la méthode du bilan d‘énergie si la surface est inférieure à la surface de la chambre), PAR (Radiations photosynthétiquement actives) et pression atmosphérique, - les paramètres calculés selon les équations de Caemmerer et Farqhar : Pn (photosynthèse nette), Ci (concentration interne en CO2), E (évapotranspiration), Gs (conductance stomatique). Les modes de calcul de ces paramètres sont détaillés dans l‘annexe 3. 5.1.2. Protocole de mesure de la photosynthèse nette Les mesures de la photosynthèse nette sont effectuées sur des feuilles d‘Arabidopsis in situ avec la chambre et l‘adaptateur dont la surface est de 1,7 cm2. Dans le but de connaître la relation entre la photosynthèse nette et de la concentration en carbone interne (courbes A/Ci), 65 Matériels et méthodes l‘appareil est programmé pour incrémenter la concentration en CO 2 de la chambre de 100 vpm toutes les 300 secondes. Les autres paramètres sont stables et fixés comme suit : - Température de la chambre : 20°C - Humidité relative de la chambre : 100% - VPD (Différence de Pression de Vapeur) < 1 kPa - PAR : 1000 µmol.m2.s-1 Cinq enregistrements de l‘ensemble des paramètres (fixés, mesurés et calculés) sont effectués pour chaque concentration de CO2. Ces enregistrements ont été répétés sur trois réplicas biologiques pour chaque traitement. Sur chacune des plantes, une feuille jeune mais suffisamment développée pour être insérée dans la chambre a été utilisé. tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 5.2. Mesure de la capacité photosynthétique foliaire et de la respiration 5.2.1. Principe des mesures polarographiques La chambre Hansatech (Chambre à électrode en phase gazeuse LD2/3 et électrode S1, Hansatech, Angleterre, figure 12) utilise une électrode de Clark pour mesurer les variations d‘O2 entre l‘atmosphère de la chambre et l‘échantillon de feuille. A B Figure 10 : La photographie A présente la chambre Hansatech (chambre à électrode en phase gazeuse LD2/3, Hansatech) utilisée pour les mesures gazeuses et la photographie B présente une électrode de Clark (doc. Hansatech) Le principe de fonctionnement de la chambre consiste à mesurer les variations d‘O2 (positive lors de l‘étude de la photosynthèse et négative lors de la respiration) dans la chambre de faible volume (6 à 7 cm3) par polarographie. On mesure le courant électrique (i) entre une cathode de platine et une anode d‘argent provenant de la réaction électrochimique liée à l‘oxygène de la chambre diffusant à travers une membrane en téflon. Le pont électrolytique entre la cathode et l‘anode est assuré par un papier cigarette imprégné d‘un tampon spécial (KCl + Na2CO3 + NaHCO3, selon le manuel Hansatech). 66 Matériels et méthodes La somme des réactions au niveau des électrodes s‘écrit de la manière suivante : - Au niveau de l‘anode d‘argent (oxydation de l‘argent) 4 Ag + 4 Cl- 4 AgCl + 4 e- Au niveau de la cathode de platine (réduction de l‘oxygène) 2 H+ + 2 e- + 2 O2 H2O2 + O2 avec : tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 H2O2 + 2H+ + 2e- 2 H2O soit globalement : 4 Ag + 4 Cl- + 4H+ + O2 4AgCl + 2 H2O L‘oxygène présent dans la chambre diffuse à travers une membrane de téflon jusqu‘à la cathode de platine. Le courant (i) observé est, pour une concentration donnée en oxygène dépendant de la tension (V) appliquée entre l‘anode et la cathode. La tension de polarisation de l‘électrode pour laquelle i reste stable pour de faibles variations toujours possibles de V est de 0,7 V (valeur fixée par le constructeur). Dans ces conditions, la réponse ampérométrique est alors proportionnelle à la seule concentration en oxygène de l‘atmosphère à analyser. Toutes les mesures sont effectuées à température constante (20 +/- 0,1°C) car la réponse de l‘électrode, de même que l‘intensité de la photosynthèse et de la respiration, sont fonction de la température. Un bain thermostaté permet la régulation thermique. Pour les mesures de capacité photosynthétique, une tête d‘éclairage comprenant 36 diodes électroluminescentes (LED) rouges (λ=660 nm) fournit la source lumineuse et permettent de travailler entre 0 et 2000 µmol/m²/s de photons. La source de carbone est constituée par une rondelle imprégnée d‘une solution de NaHCO3 1M qui permet d‘obtenir une concentration de 5% de CO2 dans la chambre au lieu de 0,038% dans l‘air. Dans ces conditions, la Rubisco est saturée en CO 2 (même si les stomates sont partiellement fermés), ce qui favorise la fonction carboxylase et limite la fonction oxygénase. Cette technique permet donc de mesurer à la lumière la photosynthèse en 67 Matériels et méthodes conditions de CO2 saturantes c‘est à dire la capacité photosynthétique et la respiration à l‘obscurité. A noter, cet appareil peut aussi être complété par une mesure de fluorescence Hansatech. 5.2.2. Protocole des mesures polarographiques La solution tampon spéciale « leaf disc electrode » (annexe 4) qui assure le pont électrolytique est refaite toutes les deux semaines. La solution de NahCO 3 à 1M est refaite quotidiennement. Etalonnage de l‘appareil Une fois l‘électrode montée et thermostatée, il faut attendre la stabilisation du signal tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 (c'est-à-dire que le courant, quelque soit sa valeur, reste stable) sur le boîtier de polarisation (30 minutes minimum). Les fonctions du boîtier sont réglées sur les positions suivantes : - amplification du signal ×1 - Backoff sur OFF - Gain au minimum. Une fois le signal stabilisé, la chambre est balayée par un flux d‘azote pur pour régler le zéro (sans dioxygène). Une fois cette vérification réalisée, sont successivement placés dans la chambre (Figure 13), un disque de fibres non tissées imprégné de NaHCO3 1M, une première grille, une rondelle de mousse, une seconde grille et enfin la feuille sectionnée au niveau du pétiole. Feuille d‘Arabidopsis thaliana Grille Mousse Grille Éponge imprégnée de la solution de bicarbonate de soude 1M Figure 11 : Schéma du montage de la feuille dans la chambre à électrode Hansatech . 68 Matériels et méthodes On mesure alors une tension V1 dans la chambre fermée une fois le montage terminé. Après injection d‘1 mL d‘air (= 210 µL d‘O2) dans la chambre, on mesure une tension plus élevée V2. Dans ces conditions, le volume d‘air dans la chambre est égal à V1/(V2-V1) mL (selon manuel Hansatech). Le volume de dioxygène présent dans la chambre va pouvoir être calculé pour une température de 20° (8,57 micromoles d‘O2/mL d‘air) et le signal de sortie (visualisé sur l‘écran), ajusté à un multiple de cette valeur (avec le bouton gain) qui dépend du système d‘enregistrement. O2 en µmoles = V × 8.57 × 20 V2 − V1 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Le facteur 20 correspond à l‘ajustement du signal (nombre de mV par µmole d‘O 2 dégagée pour l‘enregistreur Kipp et Zonen utilisé). Etant donné que la largeur papier est de 20 cm et le signal compris entre 0 et 2000 mV, une variation de 10 millimètres sur le papier correspond à une variation de 5 µmoles d‘O2 pour la surface de feuille dans la chambre). Réalisation des mesures Le signal de sortie est amplifié afin d‘avoir une précision optimale (×20 à ×100) et le Backoff (qui permet l‘élimination de la base du signal amplifié) est activé pour que le signal soit lisible sur le boîtier de polarisation et sur l‘enregistreur. Dans ces conditions, toute augmentation ou diminution du dioxygène dans la chambre se traduit par une augmentation ou une diminution du signal enregistré. La pente positive ou négative tracée par l‘enregistreur traduira ces variations de dioxygène par unité de temps pour la surface de feuille introduite. Pour les mesures de capacité photosynthétique, il est nécessaire de travailler en lumière saturante soit à une intensité lumineuse de 700 µmoles.m-2.s-1 de lumière rouge (qui correspond à la longueur d‘onde préférentiellement absorbée par les chlorophylles). La surface de la feuille est déterminée par passage au scanner à une résolution de 400 dpi (Scanner professionnel A3 Epson expression 10000 XL) et utilisation d‘un logiciel d‘analyse d‘image (Winrhizo Pro, Instruments Regent, Canada). 5.3. Mesure de la fluorescence La fluorescence foliaire correspond à de l‘énergie dissipée sous forme de radiations dans le proche infra-rouge (705 nm) par la feuille. La mesure de la fluorescence chlorophyllienne, 69 Matériels et méthodes permet d‘évaluer un à niveau de stress donné les dommages causés aux photosystèmes et la capacité d‘une plante à le tolérer. Cette méthode non destructive est mesurée directement sur la feuille à l‘aide d‘un fluorimètre FMS1 (Hansatech, UK). 5.3.1 Principe de la fluorescence La photochimie de la photosynthèse se produit au niveau des thylakoides et fait intervenir soit deux photosystèmes en série (PSII et PSI) pour le transport non cyclique des électrons soit le seul PSI pour la voie cyclique. Ils sont composés de protéines associées à aux pigments chlorophylliens et aux caroténoïdes. Lors de la première phase de la photosynthèse, l‘énergie des photons issus de la lumière est piégée dans l‘antenne LHCII puis transmise au tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 photosystème II. La réaction de photolyse de l‘eau permet de réduire la chlorophylle oxydée après son excitation. Les protons issus de l‘eau et du transfert acyclique des électrons vont permettre de créer le gradient de pH nécessaire à la formation d‘ATP. Les électrons issus de l‘eau vont parcourir la chaîne redox entre les des deux photosystèmes pour réduire via la ferrédoxine le NADP oxydé. La fluorescence résulte d‘une impossibilité du photosystème II à transmettre l‘énergie perçue vers la chaine redox (état fermé). La réduction des plastoquinones (principalement QA) a lieu lorsque la feuille passe de l‘obscurité à la lumière. A ce moment, le pool de plastoquinones à l‘état oxydé va être réduit par la capture d‘un électron (provenant des chlorophylles a du centre réactionnel) jusqu‘à ce que ceux ci soient transférés vers un second transporteur d‘électrons (QB). La fluorescence résulte d‘une différence de vitesse de transmission des électrons entre les chlorophylles vers QA et QA vers QB. Tant que les plastoquinones sont réduites (état fermé), elles ne peuvent plus capturer d‘électrons ce qui entraîne une dissipation de l‘énergie collectée sous forma radiative (fluorescence), seul moyen pour la plante de dissiper l‘énergie excédentaire qu‘elle a reçu si la durée d‘éclairement est brève (flash). Pour des éclairements continus (au cours de la journée), l‘émission de chaleur (IR) est la seconde voie de désexcitation utilisée. Dans ces dernières conditions la fluorescence qui est maximale au départ de la phase d‘éclairement continu va diminuer en quelques minutes, sous l‘effet de deux processus. Tout d‘abord, l‘activation des enzymes du cycle de Calvin induites par la lumière va permettre d‘augmenter la consommation d‘électrons transportés par le PSII : c‘est l‘extinction photochimique de la fluorescence (PQ, quenching photochimique). Puis, plus tardivement, une fraction de l‘énergie lumineuse reçue 70 Matériels et méthodes sera dissipée sous forme d‘infra-rouge (chaleur). Cette deuxième voie de désexcitation va augmenter progressivement : c‘est l‘extinction non photochimique de la fluorescence (NPQ, quenching non photochimique). Lors de la photochimie de la photosynthèse, une fraction de l‘énergie lumineuse incidente parvient jusqu‘aux chloroplastes et sera captée par différents pigments : les chlorophylles a et b et les carotènes. En situation de stress, la plante ne pourra utiliser tout le pouvoir réducteur produit par la photochimie. Les photosystèmes vont donc réémettre l‘énergie reçue sous forme de proche infra-rouge (fluorescence) ou d‘infra-rouge de grande longueur d‘ondes (chaleur). On peut résumer le bilan de l‘énergie absorbée (E abs) : E abs = P + F + C tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 P = photochimie, F = fluorescence, C = chaleur De ce fait, si P diminue, alors F et C augmentent pour un E abs donné. Par ailleurs, le rendement du transfert d‘énergie entre pigments n‘est pas de 100% : une grande partie de cette énergie captée alimente les photosystèmes, mais une portion va être aussi dissipée sous forme de chaleur. Cette portion augmente en situation de non utilisation de l‘énergie. L‘autre voie est liée à l‘échauffement des structures non absorbantes de la feuille (énergie émise = GT4). Dans la pratique, on doit considérer deux modalités d‘approche dans la mesure de la fluorescence : feuille à l‘obscurité et feuille éclairée (photosynthèse active). Dans le premier cas, suite à un flash saturant de courte durée (1/10ème de seconde), P et H sont nuls et E sera dissipée uniquement sous forme de fluorescence. Dans le deuxième cas, sous éclairement continu et flash de courte durée, la fluorescence sera la résultante des trois termes précités. Durant tout le protocole de mesure, la feuille est éclairée par la lumière modulée (0,1 µmol.m 2 -1 .s ) qui permet de mesurer la fluorescence de base Fo (associée aux antennes collectrices). 1 Première étape : En illuminant un fragment de feuille préalablement mis à l‘obscurité (chaîne de transfert des électrons à l‘état oxydé donc réceptive = état ouvert) avec un flash (1/10ème de seconde) de très forte intensité lumineuse (7500 µmol.m-2.s-1) l‘émission de fluorescence va être observée pendant un laps de temps très court (1 seconde environ). Cette émission montre une augmentation rapide lors de l‘émission du flash, puis décline pour atteindre une valeur stable (courbe de Kautsky). Cette émission est due à la réduction du pool de plastoquinones (principalement QA) du photosystème II. En effet, lorsque la feuille passe 71 Matériels et méthodes de l‘obscurité à la lumière, le pool de plastoquinones initialement oxydé va être réduit par la capture des électrons jusqu‘à leur transfert vers un second transporteur d‘électrons (QB). Tant que le pool de plastoquinones A est réduit, il ne peut plus accepter d‘électrons et la chlorophylle a des centres réactionnels se désexcite en réémettant de l‘énergie sous forme de fluorescence (λ>700nm). En quelques minutes, la fluorescence va diminuer. On mesure alors la fluorescence maximale et le rapport Fv/Fm qui correspond au rendement quantique du photosystème II (ϕPS2). 2 Seconde étape : La feuille est ensuite éclairée avec une lumière actinique et soumise à des flashs identiques à celui émis précédemment en fin de période obscure (7500 µmol.m -2.s1 ). L‘équation Eabs = P + F + C s‘applique avec les termes P et C non nuls. On détermine les tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 quenching photochimiques, non photochimiques et le rendement quantique du photosystème II à la lumière, ce qui permet de calculer le flux d‘électrons circulant entre le PSII et le PSI (ETR= Electron Transport Rate, µmoles d‘électrons.m -2.s-1) à partir de l‘éclairement incident. Le quenching non photochimique traduit la dissipation thermique et la non dissipation des gradients de protons dans les thylakoides. 5.3.2. Protocole des mesures L‘émission de fluorescence est mesurée au niveau de la face adaxiale des feuilles. Des clips (figure 14) sont positionnés sur les feuilles à analyser. Il s‘agit de pinces dotées d‘une plaque métallique coulissante au niveau de la fenêtre de lecture pour mettre la feuille à l‘obscurité. Vingt minutes d‘adaptation sont nécessaires avant de commencer les mesures afin de dissiper les gradients d‘électrons et de pH. La fibre optique du fluorimètre est positionnée sur le clip. Au moment des mesures, la plaque métallique est tirée afin de dégager la fenêtre. Après application de la lumière modulée (0.1µmoles.m -2.s-1) permettant de mesurer Fo (qui correspond à la fluorescence des antennes), un flash lumineux d‘excitation (λ=650 nm, 7500 µmoles.m-2.s-1) est alors émis pendant un dixième de seconde. La fluorescence est mesurée grâce à une photodiode et à un circuit d‘amplification. Le fluorimètre fournit les valeurs de Fo, état initial de la fluorescence émise au début de l‘illumination par la lumière modulée et de Fm, valeur maximale de fluorescence. 72 Matériels et méthodes Ces données vont permettre de calculer Fv qui correspond à la fluorescence variable maximale (Fv = Fm – Fo). Le rapport Fv/Fm, sans dimension, est proportionnel au rendement quantique maximal (ϕ PS2). 2.5.4. Dosage des chlorophylles totales (Chla et Chlb) . Les feuilles d‘Arabidopsis sont rincées à l‘eau distillée puis séchées dans du papier absorbant et la nervure centrale de chaque feuille est éliminée. Des rondelles d‘un diamètre de 1.8 cm sont effectuées à l‘aide d‘un emporte pièce. Chaque rondelle est ensuite broyée dans un mortier avec de l‘acétone à 80% à l‘aide d‘un pilon, selon la méthode de Holden (1965). Cette étape s‘effectue dans la glace et à l‘obscurité afin de ne pas photo-détruire les pigments tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 chlorophylliens. Les concentrations en chlorophylles a et b sont ensuite déterminées au spectrophotomètre par détermination de l‘absorbance à deux longueurs d‘ondes (645 et 663 nm). Les quantités totales de chlorophylles a et b, exprimées en µn.m, sont calculées par la formule de Anon (1949): Chla = 12.7 (DO663) - 2.69 (DO645) Chlb = 22.9 (DO645) - 4.86 (DO663) Chla + Chlb = 8.02 (DO663) + 20.20 (DO645) Ces donnes sont ensuite exprimées en µg cm-² de feuille. 2.5.5. Détermination des teneurs relatives en chlorophylles Les teneurs relatives en chlorophylles sont déterminées de manière non destructive avec un « Chlorophyll Mètre » (« portable Chlorophyll mètre », Opticiennes, Japon, figure 14). Trois mesures consécutives sont effectuées au même endroit sur chaque feuille, et trois feuilles de même rang par plante sont analysées. 73 Matériels et méthodes Figure 12 : Photographie du « Chlorophyll Mètre » L‘appareil utilise deux longueurs pour mesurer les chlorophylles en éliminant les variations des propriétés optiques des feuilles (réflectance). Le « Chlorophyll Mètre » fournit un indice de teneur en chlorophylle sans unité : le « Chlorophyll content index » (CCI). Cette tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 valeur est obtenue par le rapport entre l‘absorption à 655 et 940 nm. Avant le dosage des chlorophylles totales, des rondelles de feuilles d‘âge et de coloration variable sont mesurées au « Chlorophyll mètre » ce qui permettra après le dosage de corréler le CCI à la concentration en chlorophylle dans les feuilles et donc d‘obtenir une courbe standard. 5.6. Détermination de l’humidité pondérale L‘humidité pondérale représente la quantité d‘eau rapportée à la masse sèche. Elle se calcule à partir de la masse fraîche (Pf) et de la masse sèche (Ps) selon la formule suivante : Humidité pondérale = (PF – PS) × 100 / PS La masse fraîche est déterminée immédiatement après section de la feuille. La masse sèche est déterminée après séchage à 40°C : les échantillons sont pesés tous les deux jours jusqu‘à stabilisation de leur masse. 6. Techniques d’analyses élémentaires 6.1. Analyses élémentaires et granulométriques des substrats de culture et des échantillons du site d’Ouche Le Laboratoire d‘Analyse des Sols de l‘INRA d‘Arras (France) a été chargé de doser les teneurs totales en fer, phosphate, nitrate, ammonium, antimoine et arsenic dans chacun des substrats de culture (échantillons de 50 grammes de substrat). Des analyses élémentaires 74 Matériels et méthodes complètes (voir tableaux 2.1, 2.2 et 2.3) et granulométriques ont été effectuées afin de caractériser les substrats. 6.2. Analyses élémentaires des échantillons végétaux 6.2.1. Détermination des concentrations en azote, fer et phosphore L‘ensemble des échantillons (graines, feuilles, tiges et racines) a été traité par l‘Unité de Service et de Recherche en Analyses Végétales et Environnementales de l‘INRA (USRAVE, INRA, Bordeaux). Les concentrations en azote dans les tissus végétaux ont été déterminées à l‘aide d‘un analyseur CHN et les concentrations en fer et en phosphore par ICP-AES radial. tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 6.2.2. Détermination des concentrations en As et Sb par spectroscopie d‘absorption atomique à four graphite Le dosage de l‘arsenic et de l‘antimoine dans les échantillons végétaux prélevés sur l‘ancien site minier d‘Ouche et les Arabidopsis thaliana cultivées en conditions contrôlées a été effectué dans le laboratoire de Géochimie Organique et Minérale de l‘Environnement (GOME) de l‘UMR 7618 Bioemco et supervisées par le Dr Maryse Castrec-Rouelle, Maître de Conférences à l‘Université Paris VI. Principe de la spectroscopie d‘absorption atomique à four graphite Couplée à un four graphite, la spectroscopie d‘absorption atomique rend possible l‘analyse quantitative d‘éléments traces tels que l‘antimoine et l‘arsenic. Cette technique mesure l‘émission ou l‘absorption de lumière par l'atome libre, c'est-à-dire lorsque celui-ci voit son énergie varier au cours d'un passage d'un de ses électrons d'une orbite électronique à une autre. Généralement seuls les électrons des couches externes de l'atome sont concernés. Cette technique consiste à vaporiser un échantillon, préalablement mis en solution par minéralisation, dans un four en graphite chauffé électriquement. L‘intensité de l‘absorption dépend du nombre d‘atomes absorbant la lumière et la concentration est déterminée d‘après la loi de Beer-Lambert. Minéralisation des échantillons 100 mg de chaque échantillon sont pesés directement dans des bombes en téflon et traités par 2 mL d‘acide nitrique ultra pur à 67% (Normatom for trace metal analysis, VWR, France). Les bombes sont rebouchées et déposées dans un bain de sable chauffant à une température 75 Matériels et méthodes constante de 220°C pendant 72 heures. Après refroidissement (une heure), les échantillons sont déposés dans un bain à ultra-sons (Bioblock, France) afin de dissocier les particules de matières organiques restantes. Enfin, 1 mL de peroxyde d‘hydrogène (VWR, France) est ajouté à chaque échantillon et les bombes sont chauffées à nouveau à 220°C pendant 24 heures. Le minéralisat est alors récupéré dans des tubes « bijoux » et les bombes sont rincées avec 5 mL d‘eau ultra pure qui sont ajoutés aux tubes « bijoux ». Dosage par spectroscopie d‘absorption atomique à four graphite Les concentrations en arsenic et antimoine présentes dans les différents échantillons végétaux sont déterminés par spectroscopie d‘absorption atomique dans un four graphite (UNICAM 989 QZ AA spectrometer). Les tableaux X et XI présentent les programmes tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 utilisés pour doser ces deux éléments. Pour ces deux éléments, un modificateur nickel-nitrate a été ajouté afin d‘augmenter la température d‘atomisation de l‘échantillon. Pour chaque échantillon, le spectromètre effectue trois analyses (réplicas techniques). Le dosage élémentaire se fait par la loi d‘ajustement linéaire des moindres carrés et le bruit de fond est corrigé par l‘équation de Zeeman. Une gamme étalon est réalisée pour chaque élément. Elle comporte cinq points : 0, 25, 50, 75 et 100 ppm. Un échantillon certifié (feuille de tabac de Virginie (CTA-VTL-2) ayant suivi le même protocole de minéralisation que les autres échantillons végétaux ainsi qu‘un blanc de minéralisation (afin de vérifier qu‘il n‘y ait pas eu de contamination) sont également utilisés. Tableau X : Programmation du four graphite pour la détermination de l‘arsenic Etapes Température (°C) Palier (s) Montée (°C/s) Débit d‘argon (L/s) Séchage 100 25 4 0,2 Vaporisation 1000 10 150 0,2 Atomisation 2700 3 0 0 nettoyage 2900 3 0 0.2 76 Matériels et méthodes Tableau XI : Programmation du four graphite pour la détermination de l‘antimoine Etapes Température (°C) Palier (s) Montée (°C/s) Débit de gaz (L/s) Séchage 100 25 5 0,2 Vaporisation 1200 10 150 0,2 Atomisation 2500 3 0 0 nettoyage 2700 3 0 0,2 2.7. Analyses statistiques L‘ensemble des données excepté les données d‘expression de gènes a été traitées de manière statistique par analyse de variance (ANOVA), en utilisant le t-test de Student (Graph tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Pad) afin de vérifier si les valeurs des paramètres diffèrent de manière significative en réponse aux différents traitements (type de substrat, présence ou non de vers de terre). Une probabilité inférieure à 5% est considérée comme significative. A titre indicatif, les valeurs avec une probabilité inférieure à 10% sont également indiquées dans les figures et tableaux de résultats. 77 78 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Partie 3 : Résultats 79 80 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Chapitre 1 : Etude des mécanismes m o l é c u l a i re s re s p o n s a b l e s d e l’accroissement de biomasse végétale en réponse au ver de terre Aporrectodea caliginosa 81 82 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 ARTICLE N°1 I nf l ue nc e d u v e r de t e r re A p o r r e c t o d e a c a l i g i no s a s ur l a bi o ma s s e a é r i e n ne e t r a c i na i re a i ns i q ue s ur l ’ e x pre s s i o n d e g è n e s i mp l i q u é s d a n s l a p r o l i f é r a t i o n c e l l u l a i r e e t l e s r é po n s e s a ux c o nt r a i nt e s c he z Ar a b i d o p s i s t h a l i a na 83 84 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Chapitre I -Avant proposCette première étude s‘intègre dans un projet ANR Jeunes Chercheurs intitulé « Vers une écologie évolutives des sols : évolution de la relation faune du sol-plante » (JC05_52229) et a fait l‘objet d‘un article accepté dans la revue Soil Biology and Biochemistry : Jana U., Barot S., Blouin M., Lavelle P., Laffray D., Repellin A., Earthworms influence the production of above- and belowground biomass and the expression of genes involved in cell proliferation and stress responses in Arabidopsis thaliana. Les objectifs de cette première étude ont été de caractériser les effets du ver de terre tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Aporrectodea caliginosa sur la croissance et le développement ainsi que sur l‘expression de gènes impliqués dans de grandes voies métaboliques chez la plante modèle Arabidopsis thaliana (L.) Heynh écotype Colombia O. et également de déterminer quels étaient les effets constants et ceux variant avec la nature du sol dans lequel les vers évoluent. Pour ce faire, les paramètres suivants ont été étudiés : - Mesures macroscopiques des paramètres reproductifs et végétatifs. - Dosage de l‘azote et du carbone dans les différents organes des Arabidopsis. - Analyse des variations d‘expression de gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire (ICK1 et HBT), la gestion des contraintes cellulaires (SOD et PLDα) et l‘activité photosynthétique (RbcS). - Analyses des teneurs en nitrates et ammonium dans les substrats de culture. Expérimentation Deux types de substrats de culture aux propriétés contrastées ont été introduits dans des unités de culture (appelées microcosmes) : un cambisol sableux pauvre en matière organique et en nutriments minéraux et un leptosol calcaire argileux riche en nutriments et en matière organique. Quatre traitements sont mis en place avec des substrats : - substrat seul - substrat + vers de terre - substrat + plante - substrat + vers de terre + plante 85 Chapitre I Chaque traitement inclut 10 réplicats biologiques. Les plantules d‘Arabidopsis sont repiquées dans les microcosmes six jours après leur germination. Le remplissage des microcosmes avec les deux substrats, leur réhydratation et l‘introduction des vers de terre s‘effectue un mois avant le repiquage des plantules. Les unités de culture sont ensuite déposées dans une chambre phytotronique et l‘humidité des substrats est maintenue à 80% de la capacité au champ. A l‘apparition du bourgeon floral, trois plantules d‘Arabidopsis par traitement sont récoltées pour les analyses moléculaires. Les autres plantules sont cultivées jusqu‘à la fin de leur cycle puis récoltées pour déterminer les biomasses de chaque organe et effectuer les dosages d‘azote et de carbone. Trois substrats de chacun des traitements sont utilisés pour tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 déterminer les concentrations de nitrate et d‘ammonium présents dans le milieu. Résultats et discussion Dans le substrat sableux pauvre en minéraux et en matière organique, les vers de terre augmentent de manière très significative la concentration en nitrate et ont un effet positif extrêmement marqué sur la biomasse aérienne des Arabidopsis. Parallèlement à ces modifications phénotypiques, une augmentation des transcrits HBT, dont la protéine est impliquée dans les mécanismes de division cellulaire et une diminution des transcrits SOD, dont la protéine est impliquée dans la détoxification des ions superoxydes, sont observés. Ces résultats suggèrent que les vers de terre ont un effet positif sur la division cellulaire et diminuent l‘incidence des espèces réactives de l‘oxygène. Dans le substrat calcaire, plus riche en minéraux et en matière organique, les vers de terre n‘ont pas d‘effet significatif sur la biomasse aérienne. Cependant, plusieurs réponses identiques ont été observées à l‘identique sur les deux substrats, suggérant l‘existence de mécanismes indépendants de la nature du sol : les vers de terre augmentent l‘accumulation d‘un transcrit impliqué dans la réponse à l‘auxine au niveau des parties aériennes, diminuent de façon drastique la biomasse et la longueur du système racinaire et diminue également le rapport C/N dans tous les organes aériens et plus particulièrement dans les tiges. 86 Chapitre I Conclusion Ce nouveau système expérimental confirme que l‘un des effets général des vers de terre est la stimulation de l‘absorption de l‘azote, probablement par l‘intermédiaire de composés phytohormonaux relargués dans le sol et dans la rhizosphère par des bactéries stimulées par la présence des lombrics. De plus, en accélérant les processus de minéralisation de la matière organique dans les sols pauvres, les vers de terre permettent aux plantes de mieux s‘adapter aux conditions défavorables. Le fait que les plantes soient capables d‘intégrer ces deux processus à l‘échelle moléculaire met en lumière le formidable pouvoir des vers de terre dans l‘ajustement phénotypique en réponses aux contraintes environnementales. De plus, ce système a pour la première fois mis en évidence la sensibilité de la plante tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 modèle Arabidopsis thaliana aux vers de terre. De ce fait, ce modèle original ouvre la voie à de nouvelles perspectives de recherches dans le domaine de l‘Ecologie des sols. En effet, la très grande variété de mutants disponibles pour cette espèce végétale (par exemple pour l‘absorption des nitrates ou pour les voies de signalisation hormonales) est peut être l‘une des clés qui permettra enfin d‘identifier et de quantifier les mécanismes responsables de ces ajustements phénotypiques et moléculaires. 87 Chapitre I Earthworms influence the production of above- and belowground biomass and the expression of genes involved in cell proliferation and stress responses in Arabidopsis thaliana Abridged title: impact of earthworms on Arabidopsis growth Ulrike JanaA, Sébastien BarotB, Manuel BlouinA, Patrick LavelleC, Daniel LaffrayA, Anne RepellinA,D tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 A Ecophysiologie Moléculaire, équipe Interactions biologiques dans les Sols, UMR 7618 Bioemco Faculté des Sciences et Technologie, Université Paris Est - Créteil, 61 Av. du Général de Gaulle, F-94010 Créteil cedex. B IRD-Laboratoire Bioemco (UMR 7618), Ecole Normale Supérieure, 46 rue d‘Ulm, F- 75230 Paris cedex 05 C IRD-Laboratoire Bioemco (UMR 7618), Centre IRD Bondy, 32 rue Henri Varagnat, F- 93143 Bondy Cedex D Corresponding author; E-mail: [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] Keywords: Arabidopsis thaliana, Aporrectodea caliginosa, plant plasticity, shoot-root ratio, soil quality, transcript accumulation, earthworm. 88 Chapitre I Abstract To better understand the complex mechanisms of action of earthworms on plants, we set up an experimental system using the model plant Arabidopsis thaliana (L.) Heynh, Aporrectodea caliginosa a common temperate earthworm and two types of soil with contrasted contents in organic matter and nutrients. Changes in plant biomass, biomass allocation to roots, leaves and stems and C/N ratios were related to variations in the expression of several plant genes involved in cellular division and stress responses and with earthworm-induced alterations in soil mineral status. In the poorest soil, i.e. with low content in mineral nutrient and organic matter, earthworms increased soil nitrate content very significantly and boosted plant aboveground biomass production. This correlated with changes in leaf transcript accumulation suggesting tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 enhanced cell division and lesser incidence of reactive oxygen species. In the richer soil, earthworms had no significant effect on the production of aerial biomass. However, several plant responses were observed regardless of soil quality: enhanced accumulation of an auxinresponsive transcript in the leaves, a strong decrease in root length and biomass and a reduction in C/N values, particularly in the bolt stems. Although these results pointed out at earthworm-induced enhancement of mineralization as a determining factor in the formidable plant growth responses, the release in the drilosphere of phytohormone-like compounds by earthworm-activated bacteria was most likely implicated as well in this process and resulted in ―forced‖ nitrogen uptake by the plants. The herein demonstrated sensitivity of the model plant Arabidopsis thaliana to earthworms shows that such new experimental set up could become a central key to the development of multidisciplinary investigation on plant – soil interactions. 89 Chapitre I 1. Introduction Earthworms are generally regarded as beneficial to plant growth (Brown et al., 1999; Scheu, 2003). Their mechanisms of action include changes in soil structure that affect root growth and water balance (Blanchart et al., 1999). Earthworms allow plants to better resist parasitic nematode attacks, either by decreasing nematode population density (Yeates, 1981; Senapati, 1992), by enhancing the capacity of plants to tolerate these parasites (Blouin et al., 2005; Lafont et al., 2007) or by stimulating microbes that are antagonistic to root pathogens (Clapperton et al., 2001). Mostly, earthworms are known to induce changes in nutrient spatiotemporal availability (Barois et al., 1999) through fragmentation and burying of soil litter (Brown et al., 2000) and microbe-based mineralization of soil organic matter (Postmatel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Blaauw et al., 2006). According to some authors, the latter leads to the release of mineral nitrogen essentially and represents the major mechanism of action of earthworms responsible for increases in plant biomass production (Brown et al., 1999). It could explain how greater benefits on productivity have mostly been observed in poor soils (Brown et al., 2004). However, in an experimental system combining rice plants and the earthworm Millsonia anomala, increasing the availability of mineral nutrients did not suppressed the positive effect of the earthworm on plant growth (Blouin et al., 2006). This meant that other mechanisms than mineralization were involved. The stimulation by earthworms of bacteria producing phytohormone-like compounds (Krishnamoorthy and Vajranabhaiah, 1986) has been suggested. Auxin-like compounds have indeed been identified in earthworm casts (Muscolo et al., 1998; Muscolo et al., 1999). Furthermore, these molecules appeared to be potent mediators of plant nitrogen metabolism since they systemically stimulated nitrate transport into plants and its assimilation by plant cells (Muscolo et al., 1999; Canellas et al., 2002; Quaggiotti et al., 2004). What emerges from this rapid overview of the literature is that plant-earthworms relations are extremely complex, due to the number of mechanisms involved, and the fact that soil characteristics, plant physiology and earthworm behaviour are likely to influence these mechanisms. As a result, efficient contributions to their understanding should address the physiological and molecular processes underlying the macroscopic changes in plant growth and morphology observed in the presence of earthworms. In this context, we designed an experimental set up combining the peregrine endogeic earthworm Aporrectodea caliginosa (Lee, 1985; Scheu, 2003) and the plant Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. This plant species 90 Chapitre I was chosen for its value as a model organism extensively studied at both physiological and genetic levels. Its responsiveness to earthworms was tested here for the first time through analysis of variations in C/N ratios and in root, leaf and seed biomass production . At the same time, the possible effects of earthworms on various plant cell processes was examined at the molecular physiology level by studying the steady-state levels of ICK1, PLD, Cu/Zn SOD, HBT and RubcS gene transcripts. When over-expressed in Arabidopsis plants, ICK1, which encodes a potent inhibitor of cell cycle cyclin-dependent protein kinases (CDKs) (Wang et al., 1998; Francis, 2007) induced a significant reduction in leaf size and rosette diameter (Bemis and Torii, 2007). A high ICK1 transcript level was therefore considered an indicator of poor cell division. HBT protein functions have been related to IAA-regulated cell division and differentiation (Blilou et al., 2002). PLD and Cu/Zn SOD transcripts both tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 encode proteins that are transcriptionally responsive to stresses, such as wounding (Wang, 2002) and excess of reactive oxygen species (Sakamoto et al., 1995; Kaminaka et al., 1999), respectively. They were used here as cell stress indicators. It is noteworthy that high levels of PLD gene expression have been observed in dividing and growing plant cells suggesting that it may play an essential role in cell proliferation (Xu et al., 1997). The RubcS transcripts that encode the small sub-unit of the ribulose 1,5-diphosphate carboxylase were studied here to assess the possible transcriptional impact of earthworms on the carbon fixing enzyme (Nielsen et al., 1998). Another original feature of our experimental system, in addition to the molecular analyses, consisted in the use of two soils with contrasting properties: a sandy cambisol and a clayey leptosol, the cambisol being much poorer in mineral nutrients and organic matter than the leptosol. The objective was to differentiate between two types of plant responses to earthworms: those mediated through nutrient release and those related to other mechanisms of action. It was assumed that the uncoupling between these response mechanisms would lead to the identification of general earthworm effects independent of soil quality. 91 Chapitre I 2. Materials and methods 2.1. Soil characteristics and microcosms preparation Soils were collected from the top layer (0-20 cm), at the Museum National d‘Histoire Naturelle in Brunoy (Essonne, France) and at the Centre de Recherche en Ecologie Expérimentale et Prédictive - CEREEP (Saint-Pierre-Lès-Nemours, France). One is a calcareous leptosol supporting a deciduous forest (total organic carbon content, 56.7 g kg-1; total nitrogen content, 4.65 g kg-1; pH, 7.45; CEC, 23.4 cmol kg-1) with a loamy texture (34.4% clay, 39.2% silt, 27.4% sand). The second soil, much poorer than the other one, is a cambisol supporting a natural meadow (total organic carbon content, 14.7 g kg-1; total tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 nitrogen content, 1.19 g kg-1; pH, 5.22; CEC, 4.08 cmol kg-1) with a sandy texture (6.9% clay, 19.0% silt, 74.1% sand). The leptosol and cambisol collected will hereafter be referred to as ―rich‖(R) and ―poor‖ (P) soils, respectively. Both soil samples were dried at 25°C for a week, passed through a 2 mm mesh sieve and used to prepare microcosms. These growth units consisted in 10 cm diameter, 16 cm-high pots filled with 0.9 kg or 1.3 kg of the rich or poor soil, respectively, to occupy similar volumes in the pots. Soils were maintained at 80% of the field capacity with deionised H2O. 2.2. Earthworms Aporrectodea caliginosa earthworms were collected at the IRD site in Bondy (Seine Saint Denis, France). Individuals of similar size and with a well developed clitellum were chosen. In all earthworm treatments, approximately 1.7 g of worms (around four animals), which correspond to a biomass of 200 g m-² as was observed in some pastures (Zou and Gonzalez, 1996), were added to microcosms four weeks prior to the introduction of the plants (d0) in order to maximize earthworm effects. Control microcosms (without earthworm) also were prepared and incubated for four weeks before d0. 2.3. Plant growth Arabidopsis thaliana (L.) Heynh ecotype Columbia seeds were germinated in the dark on wet Whatman paper. When cotyledons were fully open (six days after germination), plantlets were transferred to microcosms on the basis of one plant per microcosm. Plant growth was 92 Chapitre I carried out under controlled conditions (Conviron growth chamber, Canada): 20±1°C and 18±1°C day and night temperatures, 70% ± 5% relative humidity, 400 mol m-2 s-1 PPFD for 10 h per day. 2.4. Plant treatments Arabidopsis plantlets were transferred to different types of microcosms containing the rich soil (with or without earthworms) or the poor soil (with or without earthworms). Six replicates were set up for each treatment combination. For both soils, additional ―no-plant‖ control microcosms were set up (with or without earthworms). Three replicates were set up for the each control. The distribution of the microcosms in the growth chamber was tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 randomized and changed after each biweekly watering. 2.5. Plant sampling and total RNA extraction To sample plant tissue at a similar developmental stage, all plant samples were collected upon formation of the floral buds. Total leaf and root materials were collected from three of the six replicates, snap-frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C. Leaf ribs were systematically removed from the leaf samples. Total RNA extraction was carried out using RNeasy Plant Minikit (Qiagen, France) on 100 mg and 50 mg of fresh leaf and root material, respectively, following the manufacturer‘s instructions. DNAse I (Promega, France) treatment was applied to all RNA extracts. RNA quantification was done at 260 nm, using a Nanodrop ND-1000 UV-Vis spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, USA). 2.6. RT-PCR analysis First strand cDNA synthesis was performed in 20 L reactions on 150 ng of total RNA using four units of Omniscript reverse transcriptase (Qiagen, France) and 10 µM of oligo-dT primers according to the manufacturer‘s instructions. Transcript abundance of the Arabidopsis genes listed in Table I was analyzed by semi-quantitative RT-PCR using 1 L of cDNA obtained from the leaves and roots of plants exposed or not to earthworms and the primers shown in Table I. 20 L PCR reactions were performed in the Master Cycler Gradient thermocycler (Eppendorf AG, Germany), using the Taq PCR Master mix (Promega, France). 93 Chapitre I For each primer pair, the optimal number of cycles was determined during preliminary reactions (Table I). PCR reactions were as follows: 5 min at 94°C followed by 30-40 cycles (30 s at 94°C, 30 s at annealing temperature, 30 s at 72°C) and 10 min at 72°C. PCR products were analyzed after separation on ethidium bromide stained 1% agarose gels. Fluorescence images of PCR products were digitized and quantified with the Gel-Doc Quantity One software (BioRad, France). tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Table I Nucleotidic sequences and temperature melting of the five primers used for the RT-PCR reaction Genes name Sequences of primers Tm HBT (AtHBT-f) 5’GATAGAAGGAAGAATGCTGC3’ 52°C HBT (AtHBT-r) 5’TACTGCTTTTGAATGGAGAGAG3’ ICK1 (AtICK1-f) 5’GGTTATTTATTTGACTCTCTCT3’ ICK1 (AtICK1-r) 5’ATTCTTCTTTCTCCTCCTCT3’ PLD alpha (AtPLDα-f) 5’CCAAAACAAGGAGGAGATG3’ PLD alpha (AtPLDα-r) 5’CAGGGTTACGAGGACACAAAA 3’ RUBISCO (AtpRUB-f) 5’GTTGAAGGAAGTGGAAGAGT 3’ 47.5°C 52°C 50°C RUBISCO (AtpRUB-r) 5’TACACAAAAGCAAAGGGAAA 3’ SOD (AtSOD-f) 5’TGTCTACTGGTCCACATTTCAAC3’ SOD (AtSOD-r) 5’TTTCCGAGGTCATCAGGGTCT3’ S19 (AtS19-f) 5’TCCAGGAAGCAGTTCGTTATTGAT3’ S19 (AtS19-r) 5’CTGGTGATGCCAAGAAGAAGTGA3’ 57°C 60°C 2.7. DNA cloning and sequencing PCR products were cloned in the pGEM-Teasy vector plasmid system (Promega, France), following the manufacturer‘s instructions. Plasmidic DNA preparation was carried out using the Wizard Plus SV minipreps DNA purification kit (Promega, France). Sequencing was performed on both strands using the AbiPrism system (Genoscreen, France). 2.8. Macroscopic measurements For each treatment, plant biomass analysis was carried out on three of the six replicates. Rosette diameter was measured upon the formation of the floral bud. At the end of the plant cycle (two months after transfer of the seedlings to the microcosms), fresh weight and maximal length of floral stems and roots were determined. Roots were washed to remove soil 94 Chapitre I particles. For each plant, the number of bolts and mature siliques, the mass of total seed production and the weight of 1,000 seeds were determined. Clean vegetative organs were dried for two days at 70°C and weighed. Carbon and nitrogen contents (C/N ratios) were determined using a CHN elemental analyzer (Thermo Finnigan Flash EA1112) in roots, leaves, bolts and seeds separately. Root biomass distribution between diameter classes was established according to the method of Blouin et al. (2007) on dried root systems. Briefly, shredded dry roots were sieved on a column of sieves with decreasing mesh sizes; biomass distribution according to root diameter was assessed by weighing the biomass recovered in each sieve (Blouin et al., 2007). tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 2.9. Soil analyses Soil nitrate and ammonium contents were determined by KCL extraction and spectrocolorimetry at the INRA ―Laboratoire d‘Analyse des Sols‖ in Arras (France). For each treatment, approximatively 50 g of soil were taken from three separate microcosms and used for analysis. 2.10. Statistical analysis Analyses were performed using the SAS software (SAS, 1989). Output variables (plant growth parameters and soil nitrogen contents) were analyzed using a two-way ANOVA testing for soil and earthworm effects and the interaction between these two factors. To determine the direction of significant effects and the combinations of treatment and soil responsible for these effects, multiple comparisons of Least Square Means (SAS, 1990) were made. LSM differences are summed-up in the Figures, with letters indicating significant differences between treatments. 3. Results ANOVA for all vegetative and reproductive parameters (except for the parameter 1,000 seed weight) showed that over 80% of result variability was explained by the statistical model (soil type, earthworm presence, interactions between these factors). This suggested that the experimental conditions were efficiently controlled. 95 Chapitre I 3.1 Earthworm vitality in the microcosms The earthworms spend three months in the microcosms. At the end of the experiment, earthworms from the different microcosms were carefully collected and weighed together. In the rich soil, earthworm biomass had increased by 20% (n=6, SD=3.13) whereas it showed a 10% (n=6, SD=4.02) decrease in the poor soil. No death was recorded. Moreover, earthworm activity appeared to be superior in the poor soil than in the rich one: in the former, the surfaces of the microcosms were completely covered with casts, whereas fewer casts were observed on top of the rich soil. 3.2. Effects of earthworms and soil quality on plant vegetative growth tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Earthworms and soil type had significant impact on all plant vegetative growth parameters and several significant soil earthworms interactions were observed (Table II). For example, earthworms induced a three-fold increase in rosette diameter in the poor soil whereas they had no significant effect on this parameter, in the rich soil (Fig 1a; Table II). As a result, rosette diameters were equivalent in the rich soil and in the poor soil with the earthworms. Furthermore, the leaves of the plants grown in the poor soil without earthworms were purple and scrawny, whereas in the presence of the earthworms, they were bright green and well developed (Fig 2), as were the leaves of the rich soil plants. Significant soil earthworm interaction was also observed for root dry biomass. This parameter was reduced in both soils in the presence of the earthworms. However, this was statistically significant in the poor soil only (Fig 1b; Table II). Generally, very low root biomasses were recorded in the rich soil (Fig 1b). Regardless of soil type, earthworms induced a significant reduction (>50%) in the maximal length of root systems (Fig 1c, Table II). Table II Earthworm and soil effects on reproductive and vegetative parameters (P-values from a two-way ANOVA) df R2 Rosette diameter Root system maximal length Root dry biomass 0.97 0.98 0.97 Soil 1 <0.0001 0.0017 <0.0001 Earthworm 1 <0.0001 <0.0001 0.0014 SoilEarthworm 1 <0.0001 0.7430 0.0030 96 Chapitre I df Maximum Above Total seed Number of Weight of Number bolt length ground production silliques 1 000 of bolts seeds par plant biomass R2 0.98 0.92 0.85 0.94 0.15 0.93 Soil 1 <0.0001 <0.0001 0.0075 0.0002 0.5268 0.0011 Earthworm 1 0.0053 0.0002 0.0021 0.0003 0.8661 0.0011 Soil 1 0.0006 0.0022 0.0070 0.0001 0.3581 0.0011 Earthworm df Shoot/Root Allocation to seeds 1 0.0109 0.0037 Earthworm 1 0.1631 0.0050 SoilEarthworm 1 0.1797 0.0566 a a 10 (a) a 8 6 b 4 2 Root biomass (g DW) Rosette diameter (cm) 12 0 (c) 20 Poor soil c a 15 b 10 b 5 0 Poor soil 40 b c a a Poor soil (d) a b 30 20 10 ab a b 0 0- Rich soil (b) Rich soil Purcentage of total root biomass Rich soil 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 10 02 20 00 02 25 50 03 31 15 54 40 00 05 50 00 06 63 30 080 800 010 00 0.82 10 0 0.66 Soil Root system maximal length (cm) tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 R 2 Diameter classes (µm) Fig. 1. Changes in (a) rosette diameter, (b) root system biomass, (c) root system maximal length and (d) root biomass distribution between diameter classes in Arabidopsis thaliana plants grown in rich or poor soil with (black bars) or without (control; white bars) earthworms Aporrectodea caliginosa. Vertical bars indicate s.e.m. (n=3). Significant differences between earthworms vs control as evaluated by LSMEANS (P<0.05) and indicated by different letters. 97 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Chapitre I Bars: 1 cm Fig. 2. Phenological plate of Arabidopsis thaliana cultivated with or without earthworms in the rich or poor soil. Transfer: day 1 (D1) after transfer of seedlings to the microcosms; Floral bud: development of floral buds, Flowering: flower development, Fructification: silique development. Red arrows indicate stress-related anthocyanin build up in control plants grown on poor soil (D12, D19) 3.3 Effect of earthworms and soil quality on plant reproductive parameters In the poor soil, earthworms delayed the formation of floral buds since inflorescences emerged after 21 days of growth in their presence whereas plants growing without earthworms formed floral buds after 15 days. In the rich soil, plants growing with and without earthworms formed their floral buds after 21 days of growth in the microcosms (Fig 2). As was the case for most vegetative growth parameters, significant effects of the soil earthworm interaction on reproductive parameters (number of siliques, total seed weight, number of bolts per plant, maximum bolt length, Fig 3) were found, suggesting that earthworm impact was dependent on soil type (Table II). In the rich soil, no significant impact was recorded (Table II). In the poor soil, however, earthworms increased bolt length by 74% 98 Chapitre I (Fig 3a), above-ground biomass by 68% (Fig 3b), total seed weight by 136% (Fig 3c), the number of siliques per plant by 201% (Fig 3d), and the number of bolts per plant by 100% (Fig 3e, Table II). The values found with earthworms in the poor soil were equivalent to those measured in the rich soil, with or without earthworms, except for the average bolt length that remained 33% lower than that of the rich soil plants (Fig 3a). Neither soil type nor earthworm presence influenced the 1,000 seed weight (Fig 3f, Table II). As described previously, 60 c 40 b 20 0 Total seed weight (mg) 900 Poor soil (c) a a a 600 b 300 Above-ground biomass (g DW) a Number of siliques Maximum bolt length (cm) 80 (a) a Rich soil 2.0 a a b 1.0 0.5 0.0 Rich soil 1200 (d) a Poor soil a a 900 600 b 300 0 (e) a Poor soil a a 6 b 4 2 0 Rich soil Poor soil Rich soil Weight of 1,000 seeds (mg) Rich soil 8 (b) a 1.5 0 Number of bolts per plant tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 earthworm-derived benefits on plant productivity were limited to the poor soil. (f) a a Poor soil a a 20 10 0 Rich soil Poor soil Fig. 3. Changes in (a) maximum bolt length, (b) above ground biomass, (c) number of siliques per plant, (d) total seed production, (e) number of bolts per plants and (f) 1000 seed-weight in Arabidopsis thaliana plants grown in rich or poor soil with (black bars) or without (control; white bars) earthworms Aporrectodea caliginosa. Vertical bars indicate s.e.m. (n=3). Significant differences between earthworms vs control as evaluated by LSMEANS (P<0.05) and indicated by different letters 99 Chapitre I 3.4. Changes in plant resource allocation induced by earthworms A consequence of the presence of earthworms was a dramatic change in the distribution of biomass within the plants. In the poor soil, earthworms doubled global plant biomass allocation to seeds (Table II). As a result, this parameter was equivalent in the poor soil with the earthworms and in the rich soil with or without earthworms (Fig 4a; Table II). There was no general effect of earthworms or earthworm soil interaction on shoot/root ratio (Table II, Fig4b). However, when earthworm effects were tested separately in the two soils, it appeared that they significantly modified plant morphology in the poor soil, as shown by the significant increase in shoot/root ratios (ANOVA, P<0.05). In this soil, earthworms also influenced the architecture of the root systems. The biomass corresponding to fine roots 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 a (a) a a c Rich Soil Poor Soil Shoot / root ratio in the rich soil Biomass allocation to seeds (in %) allocated to larger roots (400-500 µm and 500-630 µm in diameter) was increased (Fig 1d). 300 (b) a d 4 200 100 a 0 Rich soil c 2 0 Poor soil Shoot / root ratio in the poor soil tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 (100-200 µm in diameter) was significantly reduced in their presence whereas the biomass Fig. 4. Changes in (a) allocation to seeds and (b) shoot : root ratio in Arabidopsis thaliana plants grown in rich or poor soil with (black bars) or without (control; white bars) earthworms Aporrectodea caliginosa. Vertical bars indicate s.e.m. (n=3). Significant differences between earthworms vs control as evaluated by LSMEANS (P<0.05) and indicated by different letters 3.5 Effect of earthworms and soil quality on plant C/N ratios Plant C/N ratios were significantly affected by the earthworms (Table III). Overall, they were lower in aerial organs but the difference was significant only in the bolt stems as shown by significant organ treatment interaction (Fig 5, Table III). 100 Chapitre I Table III ANOVA for C/N values. Interactions between soil, earthworms and organ Source DF F P>F Earthworm 1 9.15 0.0045 Organ 3 40.02 <.0001 Soil 1 0.40 0.5333 SoilEarthworm 1 0.02 0.8859 OrganEarthworm 3 4.88 0.0058 OrganSoil 3 3.23 0.0330 OrganEarthwormSoil 3 0.16 0.9226 a 50 a C/N content tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 40 a a 30 a b 20 a b a a a a a a a a 10 0 Roots Bolts Leaves Seeds Rich soil Roots Bolts Leaves Seeds Poor soil Fig. 5. Changes in C/N ratios in the roots, bolt stems, leaves and seeds of in Arabidopsis thaliana plants grown in rich or poor soil with (black bars) or without (control; white bars) earthworms Aporrectodea caliginosa. Vertical bars indicate s.e.m. (n=3). Significant differences due to earthworm effects on each organ and each soil as evaluated by LSMEANS (P<0.05) and indicated by different letters 3.6. Effects of plants and earthworms on soil nitrogen status Our experimental design did not allow analysis of a full-model testing simultaneously for the effects of earthworms, the presence of a plant and the soil type on soil nitrogen status (ammonium and nitrogen contents). As a result, soil-specific models testing for the effects of earthworms and plants (but not for their interaction) were analysed separately (Table IV). In the rich soil, neither the earthworms nor the plants significantly impacted ammonium or nitrate contents (Table IV). In the poor soil on the other hand, a 4.5-fold increase in nitrate content and a 0.8-fold decrease in ammonium content were observed with the earthworms (Fig 6, Table IV). Compared with earthworms, plants had opposite impact on nitrogen contents: ammonium concentrations increased (+100%) and nitrate concentrations were almost depleted (-90%) (Fig 6). 101 Chapitre I Table IV. ANOVA for nitrate and ammonium contents in the rich and the poor soil (RS and PS respectively). The total degree of freedom is 11 for the rich soil and 8 for the poor soil df Nitrate Ammonium Soil RS PS RS PS R2 0.28 0.82 0.08 0.95 Earthworm 1 0.0335 <0.001 0.7812 <0.001 Plant 1 0.1040 0.0473 0.4872 0.0294 50 4 40 mg.kg-1 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 3 30 2 20 1 10 0 0 IS FS SW SP SWP NO3- IS FS SW SP SWP NH4+ Fig. 6. Changes in (a) nitrate (mg.kg -1) and (b) ammonium (mg.kg -1) contents in the poor soil (IS) at the end of the experiment (FS) induced by the presence of earthworms (Aporrectodea caliginosa) (SW), the presence of Arabidopsis thaliana plants (SP), and the combination of both (SPW). Vertical bars indicate s.e.m. (n=3) 3.7. Earthworms affect transcript accumulation for target gene in Arabidopsis leaf tissues Regardless of soil type, earthworms triggered an over-accumulation of HBT (NM_104135) transcripts in the leaves (Fig 7a and e). Cu/Zn SOD transcripts were more abundant in the leaves of poor soil plants than in those growing in the rich soil (Fig 7a and c). Leaf Cu/Zn SOD transcript accumulation decreased slightly in response to earthworms (Fig 7a and c). Contrasting earthworm effects were observed on leaf PLDα steady-state transcript levels: a strong increase and a reduction in the poor and rich soil, respectively (Fig. 7a and b). 102 Chapitre I The reverse situation was observed for ICK1 leaf transcripts: they were much more abundant in the plants growing in the poor soil and the earthworm treatment reduced their abundance whereas earthworms had a slight boosting effect on ICK1 transcript accumulation in the rich soil (Fig 7a and d). Generally, transcript accumulation for the small nuclear-encoded subunit LEAVES Relative expression of HBT gene(a.u.) of Rubisco (RbcS) remained unaffected by the various treatments (Fig 7a). ROOTS (a) RC RE PC PE RC RE PC PE PLDa SOD ICK 1 RbcS S 19 2000 1000 R R P P 0 2000 (c) (c) 1500 1000 500 R R P P R R P P Leaves Roots 0 2000 Relative expression of PLD gene(a.u.) Relative expression of SOD gene (a.u.) Leaves Relative expression of ICK1 gene (a.u.) tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 HBT (a) (b) 2500 (d) (d) 2000 1500 1000 500 R R P P R R P P 0 Leaves Roots (e) (e) 1500 1000 500 R R P P R R P P 0 Leaves Roots Fig. 7. RT-PCR analysis of (a and b) HBT, (a and c) Cu/Zn SOD, (a and d) PLD and (a and e) ICK1 gene expression in the leaves and roots of Arabidopsis thaliana plants grown in rich (R) or poor (S) soil with (black bars) or without (control; white bars) earthworms Aporrectodea caliginosa. The S19 gene was used as an amplification control. Relative gene expression (arbitrary units, a.u.) was determined using the Quantity One programme (Bio-Rad) 103 Chapitre I 3.8. Earthworms affect transcript accumulation for target gene in Arabidopsis root tissues As was observed in the leaves, transcriptional influence of earthworms was gene specific in root tissues. They induced an over-accumulation of PLD transcripts (Fig 7a and 5b). This was more pronounced in the poor soil. Earthworms induced a strong decrease in the accumulation of ICK1 transcripts in the rich soil (Fig 7a and d). Cu/Zn SOD transcript levels were not influenced by their presence (Fig 7a and c). However, SOD transcript accumulation was higher in the roots of poor soil plants than in those growing in the rich soil, as it was observed in the leaves. tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 4. Discussion 4.1. In the poor soil without earthworms, Arabidopsis plants exhibit mineral deficiency characteristics Compared to those growing in the rich soil, the plants cultivated in the poor soil without earthworm showed phenotypic and developmental responses typical of mineral -particularly nitrogen (N)-deficiency: early reproductive switch, smaller shoot to root ratio, as a result of a higher allocation of assimilates to the roots and severely reduced seed yield (Eaton, 1935; Scheible et al., 1997; Hirai et al., 2004; Hermans et al., 2006; Mantelin et al. 2006; Remans et al., 2006). The almost complete depletion of the initial NO3- content in the poor soil by the end of the experiment support the hypothesis of N-starvation. In comparison, the growth conditions in the rich soil could be considered as near optimum. This new experimental system, using both a rich and a poor soil, led to the development of contrasted plant phenotypes that should facilitate the identification of earthworm effects in relation with soil quality. 4.2. Earthworms can reverse most effects of poor soil quality on Arabidopsis growth and development All mineral/nitrogen deficiency symptoms observed in the plants growing in the poor soil without earthworm were absent in their counterparts cultivated in the presence of earthworms. As a result, vegetative biomass and seed production with the earthworms were equivalent in the poor and rich soil plants. Rosette diameter was significantly increased and comparable to 104 Chapitre I that of the rich soil plants. ICK1 and PLD gene expression analyses suggested that this was mediated through enhanced cell proliferation in the leaf tissues. The dramatic increase in the nitrate content of the poor soil with earthworms was most likely a determining factor in the comparatively dramatic increase in Arabidopsis biomass production. In addition, earthworm-induced high nitrate concentrations were probably responsible for the significant reduction in the number of fine roots observed in the poor soil plants, as was previously reported (Zhang and Forde, 2000; Remans et al., 2006). Since decaying earthworms were not a possible source of additional N (worms survival rates were 100 %), the majority of the extra N was probably formed through mineralization of soil organic matter by gut-associated and cast-associated micro-organisms, in accordance with Brown‘s hypothesis that earthworms mostly increase plant growth through N mineralization tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 (Brown et al., 1999). However, recent evidence have started an ongoing and fascinating debate of whether enhanced mineralization alone provides a full explanation for the growth stimulation (Brown et al., 2004; Scheu 2003; Blouin et al. 2006). 4.3. Some effects of earthworms on Arabidopsis are independent of soil quality An effect of earthworms similarly observed in both soils was the decrease in C/N ratios of the aboveground tissues (particularly in bolt stems). Elevated nitrate contents have a negative effect on the transport of shoot-derived auxin to roots and, as a consequence, alter auxin metabolism in shoot tissues (Caba et al. 2000; Walch-Liu et al., 2006). In the present experiment, leaf auxin metabolism seemed affected, as shown by the over-accumulation of HBT transcripts in the leaves of Arabidopsis plants exposed to earthworms. At the same time, the change in plant nitrogen status alleviated the oxidative stress in the leaves, as indicated by the general reduction in leaf transcript accumulation for a Cu/Zn SOD. In the poor soil, the decrease in C/N ratio could easily be ascribed to the stimulation by earthworms- of organic matter mineralization - as mentioned before- and enhanced nitrification processes (Rizhiya et al., 2007). In the rich soil, on the other hand, the nitrate content was not significantly affected. To understand how apparently N-replete plants, such as the rich soil plants, absorbed additional N in the presence of earthworms, one should refer to the work by Quaggiotti et al. (2004). These authors observed a decrease in leaf C/N resulting from enhanced nitrate influx in N-fed maize plantlets exposed to purified extracts of earthworm casts. They concluded that this phenomenon was triggered by the auxin-like 105 Chapitre I compounds (with auxin-like activity) found in the earthworm casts (Tomati et al., 1988). These results and ours show that, in the presence of earthworms, control over mineral/nitrogen nutrition is not necessarily dependant on the plant mineral status, as is the case with inducible uptake systems that respond to mineral deficiency (Chrispeels et al., 1999). Other general effects of earthworms were a reduction in root maximum length as well as in global root biomass leading to higher shoot/root ratios. In the confined space of the microcosms, repeated root abrasion by earthworms leading to wounding stress could contribute to the limiting of root development. The high levels of PLDα transcripts as compared to no-worm controls suggested that such stress occurred since this gene is responsive to wounding in Arabidopsis (Wang, 2002). However, the lack of root expansion tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 could be a result of the earthworm-induced enhanced auxin supply at the root level, since it is acknowledged that root tissues are sink organs for auxin and rapidly stop elongating when exposed to increasing concentrations of the hormone (Chadwick and Burg, 1966). 4.4. Conclusion This new experimental set up confirms that organic matter mineralization and release of phytohormone-like compounds are complementary mechanisms stimulated by earthworms. The fact that plants are able to integrate both processes at the molecular level points at the enormous potential of earthworms in adjusting plant phenotypes in response to environment stresses. In addition, this original model plant system opens fascinating new possibilities for follow-up investigation in the area of plant/earthworm interaction. Its small size constitutes a great asset for the quick and easy screening of candidate microbes with plant growth enhancing capabilities. The unique diversity in Arabidopsis mutants (in nitrate uptake and hormonal signalling, for example) offers key-tools for the identification of active ingredient(s) responsible for molecular and phenotypic adjustments. To conclude, this experimental set up could be viewed as an essential model system to investigate plant/macrofauna and plant/microfauna interactions in particular and soil ecology in general. 106 Chapitre I Acknowledgements The authors wish to acknowledge the Agence Nationale de la Recherche for research funding (JC05_52229). References Barois, I., Lavelle, P., Brossard, M., Tondoh, J., Martinez, M.A., Rossi, J.P., Senapati, B.K., Angeles, A., Fragoso, C., Jimenez, J.J., Decaëns, T., Lattaud, C., Kanyonyo, J., Blanchart, E., Chapuis, L., Brown, G., Moreno, A. 1999. 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Après avoir mis en évidence l‘effet positif des vers de terre sur la nutrition azotée des plantes d‘Arabidopsis thaliana, il nous est apparu nécessaire de tester cette combinaison sur tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 l‘assimilation du phosphore. En plus d‘être le deuxième élément le plus limitant de la croissance des végétaux, le phosphore possède également une structure analogue à celle de l‘arsenic. Dans la littérature, il a été montré que ce polluant empruntait les transporteurs du phosphore pour pénétrer dans les cellules racinaires. L‘objectif de cette expérience est d‘évaluer les variations d‘expression de trois gènes impliqués dans le transport du phosphore en réponse aux vers de terre afin de tester le potentiel de ce système modèle avant de l‘employer à la phytoremédiation de l‘arsenic. Pour cela, les variations d‘expression de gènes codant un transporteur racinaire de haute affinité, surexprimé en condition de carence, PHT1.3, un transporteur impliqué dans le chargement du phosphore dans le xylème, PHO1, et un transporteur chloroplastique PHT 2.1 ont été étudiées par RT-PCR. Expérimentation Le substrat issu du cambisol sableux (tableau VII) est utilisé pour cette expérience. Quatre traitements sont appliqués : - substrat seul - substrat + vers de terre - substrat + plante - substrat + vers de terre + plante 117 Chapitre II Chacun des traitements inclut 9 réplicats biologiques. Les plantules d‘Arabidopsis sont repiquées dans les microcosmes six jours après leur germination, au stade quatre feuilles. Le remplissage des microcosmes avec le substrat, leur réhydratation et l‘introduction des vers de terre ont été effectués un mois avant le repiquage des plantules afin de maximiser les effets des vers de terre. Les unités de culture sont déposées dans une chambre phytotronique et l‘humidité des substrats est maintenue à 80% de la capacité au champ. Lors de l‘ébauche du bourgeon floral (soit 21 jours après le repiquage), trois plantes d‘Arabidopsis de chaque traitement sont récoltées afin d‘effectuer les analyses moléculaires par RT-PCR (cF paragraphe 4 de la section matériels et méthodes). Les plantes restantes sont récoltées pour les dosages du phosphore (par ICP radiale) dans les parties aériennes et racinaires. Au début et à la fin de l‘expérimentation, trois substrats de chacun des traitements tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 sont également analysés pour déterminer leur concentration en phosphate. Résultats et discussion En présence des vers de terre, des augmentations de 70% et de 25% des concentrations en phosphore ont été observées respectivement dans les racines et l‘appareil aérien des plantes d‘Arabidopsis. Cette forte accumulation est corrélée à la surexpression des trois transporteurs étudiés : les transcrits du gène PHT1.3 présentent une accumulation de plus de 55% par rapport aux plantes d‘Arabidopsis cultivées sans ver. De même, l‘expression des transcrits du gène PHO1 augmentent de 77% dans les racines et de 64% dans les parties aériennes par rapport aux témoins. Enfin, l‘accumulation des transcrits du transporteur chloroplastique PHT2.1 augmentent également de 35% dans les feuilles des plantes d‘Arabidopsis en présence des vers. Dans le substrat de culture, les vers de terre ont augmenté de façon significative la disponibilité du phosphore. Ainsi, cet élément était moins limitant pour les plantes d‘Arabidopsis cultivées en présence des vers de terre comparées aux plantes témoins. Malgré cela, le gène PHT1.3 est surexprimé comparé aux plantes témoins Or ce gène est généralement induit en réponse à une carence en phosphore (Rausch and Bucher 2002). Dans notre cas, les concentrations moyennes en phosphore dans nos plantes sont d‘environ 4g kg -1 et donc supérieures au seuil de croissance optimale déterminé par Marschner (1988) qui est de 2g kg-1. De même, l‘augmentation des transcripts PHO1 et PHT2.1 indique un meilleur 118 Chapitre II transfert du phosphore vers les parties aériennes (confirmé par les analyses élémentaires dans les feuilles). Conclusion Ces résultats montrent l‘effet considérable des vers de terre sur l‘absorption et l‘accumulation du phosphore par la plante Arabidopsis. Cette accumulation élevée est due à deux phénomènes concomitants : une meilleure disponibilité du phosphore dans le substrat de culture et une surexpression de l‘ensemble des transporteur impliqués dans l‘absorption racinaire et dans le transfert vers les parties aériennes. Ces résultats concordent avec nos précédentes observations sur la stimulation de la nutrition azotée et avec les observations de tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 l‘équipe de Quaggiotti (2004) qui a mis en évidence une augmentation de l‘influx d‘azote vers les parties aériennes. Pour le phosphore, les plantes d‘Arabidopsis n‘étant pas en situation de carence, il est possible que des substances exogènes similaires aux phytohormones, produites par des bactéries stimulées par la présence des vers de terre aient modifié les systèmes de régulation de ces trois transporteurs. Pour finir, cette stimulation de l‘absorption du phosphore notamment grâce à la surexpression du transporteur racinaire à haute affinité (PHT1.3) semble de bonne augure pour la phytoextraction de l‘arsenic. 119 Chapitre II Earthworms enhance phosphate uptake and accumulation in the model plant Arabidopsis thaliana Abridged title: impact of earthworms on phosphate uptake Ulrike JanaA, Daniel LaffrayA, Anne RepellinA,B A Ecophysiologie Moléculaire, équipe Interactions biologiques dans les Sols, UMR 7618 Bioemco Faculté des Sciences et Technologie, Université Paris Est - Créteil, 61 Av. du Général de Gaulle, F-94010 Créteil cedex. B Corresponding author; E-mail: [email protected] tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 [email protected] [email protected] [email protected] Keywords: phosphate uptake, Pht1.3, Pht2.1, Pho1, Arabidopsis thaliana, Aporrectodea caliginosa Introduction After nitrogen, phosphorus is the second most limiting nutrient for plant growth (Barrow 1963). This element is widely present in the earth crust where it represents 0.02-0.15% of the present elements. Nevertheless, in most of soils, the concentration in biodisponible phosphorus rarely oversteps 10µM (Abel et al., 2002) which is well inferior to the concentration found in plant tissues. In soils, this element is principally found under organic forms, but to be uptaken by the plants he has to be under the inorganic forms such as H2PO4and HPO42-. Phosphate is a macronutrient essential for all living organisms. Its biological functions are various and numerous. It‘s a structural element for nucleic acids, phospholipids and for the energetic metabolism (ATP). It‘s used also for the activation of secondary metabolisms involved in many signalling pathway. Thereby plants have created some metabolism and development adaptations in order to enhance this acquisition. Despite these mechanisms, phosphate starvations are the second cause of yield loss after nitrogen. 120 Chapitre II Phosphate is uptake by the roots mainly under its forms H2PO4- and HPO42-. Its cellular concentration is 100 to 1000 times more elevated than in the external medium (Furihata et al. 1992). This shows that phosphate is uptaken by active transporters (Bieleski and Ferguson 1983). In plants, phosphate transporters present two distinct cinetiks depending on whether this element is in low (µM) or in high (mM) concentration in the medium. Several studies have shown that earthworms stimulate nitrogen influx (Quaggiotti et al., 2002) and nitrate content in the different organs (Jana et al., 2009). In our case we want to study the impact of the earthworms Apporectodea caliginosa on three P transporters: a root transporter, PHT1.2, a xylem transporter PHO1 and a chloroplastic transporter PHT2.1. PHT1.3 appears to be a high affinity transporter (Okumara et al. 1998). It possesses twelve tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 transmembranaire regions divided by a large hydrophyllic region in two groups of six (). Transcripts of high affinity transporters are preferentially expressed in the roots and most of them in answer to phosphate starvation (Daram et al. 1998). PHT1.3 is highly expressed in root hairs (Mudge et al. 2002). PHT2.1 is the first low-affinity transporter identified in Arabidopsis thaliana (Daram et al. 1999). This gene is mainly expressed in green tissus (Daram et al. 1999). Moreover it has a peptide sequence similar to a chloroplastic transit peptide and appears to be potentially localised chloroplastic membrane Material and methods Soil collection The sandy cambisol soil used in this experiment was collected at the Centre de Recherche en Ecologie Expérimentale et Prédictive - CEREEP (Saint-Pierre-Lès-Nemours, France). Before to be used, it has been sieved at 2mm and dried at 25°C during one week. Soil phosphorus content was determined at the beginning and the end of the experiment (in three microcosms of each treatment) by a KCl extraction. Earthworms Aporrectodea caliginosa earthworms were collected at the IRD site in Bondy (Seine Saint Denis, France). Adults with a well developed clitellum and similar size were added to the microcosms at a density of 1.4g of earthworms per microcosm which corresponded to an 121 Chapitre II average of four earthworms. This introduction occurred four weeks before the plantlets introduction in order to allow earthworms to digest a part of the soil. Plant growth and microcosm preparation Arabidopsis thaliana (L.) Heynh ecotype Columbia has been used during this experiment. Seeds were germinated on Petri dishes which contained the sandy cambisol soil. When cotyledons were fully open (6 days after germination), plantlets were transferred individually to microcosms. These growth units consisted in 10 cm diameter, 16 cm-high pots filled with 1.3 kg of the sandy cambisol soil. Soils were maintained at 80% field capacity with deionised H2O. Plant growth was carried out under controlled conditions (Conviron growth chamber, Canada): 20±1°C and 18±1°C day and night temperatures, 60% ± 5% relative humidity, 100 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 mol m-2 s-1 PPFD for 10 h per day. Treatments Two treatments were applied to the Arabidopsis: plant alone (control treatment) or plant with earthworms (earthworm treatment). For these two treatments nine replicates were implemented. Plant sampling and total RNA extraction At the apparition of the floral buds, total leaf and root materials were collected from three of the six replicates, weighted, washed rapidly into three different bath (triton, ethanol and sterilized water), snap-frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C. Total RNA extraction was carried out using RNeasy Plant Minikit (Qiagen, France) on 100 mg and 50 mg of fresh leaf and root material, respectively, following the manufacturer‘s instructions. DNAse (Promega, France) treatment was applied to all RNA extracts. RNA quantification was done at 260 nm, using a ND-1000 Nanodrop spectrophotometer (Starlab, USA) and RNA were homogeneised at 100 ng µL-1. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and PCR. First strand cDNA synthesis was performed in 20 L reactions on 150 ng of total RNA using 4 units of Omniscript reverse transcriptase (Qiagen, France) and 10 µM of oligo-dT primers according to the manufacturer‘s instructions. Transcript abundance of the genes listed in Table I was analyzed by semi-quantitative RT-PCR using 1 L of cDNA obtained from the 122 Chapitre II leaves and roots of control and treated plants and the primers shown in Table I. The S19 gene was used as reference gene. Gene expression (arbitrary unit, a.u.) was correlated with intensity of transcript accumulation and was measured using the Quantity-One software (BioRad, France). ) tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Table I Nucleotidic sequences and temperature melting of the primers used for the RT-PCR reaction Genes name Sequences of primers Tm PHT1.3 (AtPht1-f) 5’ CGGGAGGTTTTGTGGCA 3’ 58°C PHT1.3 (AtPht1-r) 5’A ATTCGCCAAATGTAATCAGC 3’ PHO1 (AtPho-f) 5’ TGGAAGAACACGAGGATAAA 3’ PHO1 (AtPho-r) 5’ GCTGCCACAACTGAGGTC 3’ PHT2.1 (AtPht2.1-f) 5’ ACAATGTGGGGATACAGAGTC 3’ 53°C 53°C PHT2.1 (AtPht2.1-r) 5’ CGAAGCAAACAAAACAACC 3’ S19 (AtS19-f) 5’TCCAGGAAGCAGTTCGTTATTGAT3’ 60°C S19 (AtS19-r) 5’CTGGTGATGCCAAGAAGAAGTGA3’ Phosphorus content in Arabidopsis tissue At the apparition of the floral bud, three plants per treatment were harvested. The rosette and the roots were collected separately, carefully washed, dried for one week at 50°C in a oven and pulverised with a mortar and a pestle. Phosphorus content in the aerial and subterranean parts of Arabidopsis was then determined by radial-ICP at the INRA ―Unité de Service et de Recherche en Analyses Végétales et Environnementales‖ in Villenave d‘Ornon (France). Results Earthworm effect on phosphate transporter transcription The observation of the PHT1.3 transcript accumulation showed that in presence of earthworms, this gene was overaccumulated in the roots of Arabidopsis thaliana compared to the control (figure 1). Moreover, the gene PHO1 which is indirectly involves in phosphate loading into the xylem was also overexpressed, in a relative similar ratio, in the roots and in the leaves of Arabidopsis. To finish, the expression of the chloroplastic transporter PHT2.1 was enhanced too (figure 3). 123 Control Earthworm 2500 2000 1500 1000 500 0 Figure 1: Expression of Pht1.3 gene in the roots of Arabidopsis thaliana with (black bars) or without (grey bars) earthworms Aporrectodea caliginosa. Vertical bars indicate s.e.m. (n=3) Relative expression of Pho1 gene (a.u) tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Relative expression of Pht1.3 gene (a.u) Chapitre II Control Earthworm 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 Roots Leaves Figure 2: Expression of Pho1 gene in the roots of Arabidopsis thaliana with (black bars) or without (grey bars) earthworms Aporrectodea caliginosa. Vertical bars indicate s.e.m. (n=3) 124 Control Earthworm 2500 2000 1500 1000 500 0 Figure 3: Expression of Pht2.1 gene in the roots of Arabidopsis thaliana with (black bars) or without (grey bars) earthworms Aporrectodea caliginosa. Vertical bars indicate s.e.m. (n=3) Relative expression of S19 gene (a.u) tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Relative expression of Pht2.1 gene (a.u) Chapitre II Control Earthworm 2000 1500 1000 500 0 Roots Leaves Figure 4: Expression of S19 gene in the roots of Arabidopsis thaliana with (black bars) or without (grey bars) earthworms Aporrectodea caliginosa. Vertical bars indicate s.e.m. (n=3) Earthworms effect on phosphate content in Arabidopsis tissus and soils The elementary analyses (figure 4) reveals that earthworms enhance significantly (p<0.05) the phosphate concentration in root tissues and almost significantly in the aerial parts (p<0.10). In the root system, the improvement of phosphorus uptake is dramatic: an icrease of 70%. In the aerial parts, the rise appears to be more temperate. 125 Chapitre II P concentration (g kg-1) 8 * 7 6 5 Control Earthworms 4 3 2 1 ** 0 Roots Leaves tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Figure 4: Phosphorus concentration in the leaves and the roots of Arabidopsis thaliana in absence (grey bars) or in presence of earthworms Aporrectodea caliginosa (black bars). Vertical bars indicate SD (n=3). Significant differences between earthworms vs control as evaluated by t-test: one asterisk indicate a p value <0.1 and two asterisk a p value <0.05. Regardless of the treatments, the pH is inclined to increase in the soils at the end of the experiment. However, earthworms tended to limit the pH rise. Compared to the control, the avaibility of phosphorus is significantly enhanced by the interaction Arabidopsis × earthworms (p = 0.0056). Treatment pH Total P (%) Available P (%) Initial soil 5.88±0.06 a 0.477±0.027 a 0.036±0.002 a Final soil + A. thaliana 6.22±0.14 b 0.466±0.006 b 0.031±0.002 b Final soil + A. thaliana + earthworms 5.91±0.09 a 0.476±0.003 a 0.037±0.003 a Table 2: pH, total and available phosphorus content in initial soil (i.e. at the beginning of the experimentation), final soil with Arabidopsis thaliana (i.e. at the end of the experimentation) and final soil with Arabidopsis thaliana and earthworms. The means from these analysis (n=3) and s.e.m. are presented. Different letters within a row indicate a significant difference at P= 0.05 with the Student t-test. 126 Chapitre II Discussion Earthworms enhance the phosphate uptake machinery The three genes studied here appeared to answer to earthworm presence. At the root level, the high affinity Pht1.3 transporter is over-expressed compared to the no-earthworm treatment. Usually, this gene has been shown to be induced by a phosphate starvation (Rausch and Bucher 2002), but in our case the plant phosphorus content did not indicate a starvation level. Moreover, earthworms appeared to also boost the Pho1 gene which is involved in the loading of the phosphorus into the xylem. This overexpression could indicate a better transfert of the phosphorus into the aerial part. The P concentration into the leaves, which was higher than in the control plant, strengthens this hypothesis. Finally, earthworms appeared to enhance the transcription of the chloroplastic transporter Pht2.1. A better phosphorus status in chloroplast tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 will positively affect the photosynthesis. Earthworms enhance the phosphorus availability At the end of the experiment, phosphorus availability appeared to be higher with earthworms compared to the control. This result confirms those previously observed by Mansell et al. (1981) who have shown that earthworm could enhance by two or three-fold the phosphorus availability at the surface casts. This enhancement is due to the dissolution of phosphate rock during the digestion of soil mixing into earthworm gut (Mackay et al. 1982). Moreover, a recent study has shown that earthworms enhance acide and alkaline phosphatase activity in their casts and burrows (Le Bayon and Binet, 2005). Concerning the total phosphorus, its concentration globally decrease at the end of the experimentation compared to the initial concentration. Nevertheless, this decrease is more important without earthworms. Earthworm activity has probably led to a better turn over of the phosphorus and has reduced the loss due to watering. Conclusion Our results show the strong effect of earthworms on phosphorus uptake, accumulation and availability. The Arabidopsis presented elevated concentration of this element in both their shoot and root system. This better accumulation appeared to be due to two phenomenon. First, a better availability of phosphorus into the soil due to earthworm activity and second a better uptake and translocation of the phosphorus into the plant caused by an overexpression of the 127 Chapitre II high affinity transporter Pht1.3, a gene involved in xylem loading Pho1 and the chloroplastic transporter Pht2.1. These results can explain the biomass gain frequently observed in the plant grown in presence of earthworms. References Abel S, Ticconi CA, Delatorre CA (2002) Phosphate sensing in higher plant. Physiologia Plantarum 115: 1-8. Abel S, Ticconi CA, Delatorre CA (2002) Phosphate sensing in higher plant. Physiologia tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Plantarum 115: 1-8. Bieleski RL, Ferguson IB (1983) Physiology and metabolism of phosphate and its compounds. In A Lauchli, RL Bieleski, eds, Encyclopedia of Plant Physiology, Vol 15a. Springer Verlag, Berlin, pp 422-449 Daram P, Brunner S, Persson B, Amrhein N, Bucher M (1998) Functional analysis and cell-specific expression of a phosphate transporter from tomato. Planta 206: 225-233. Daram P, Brunner S, Rausch C, Steiner C, Amrhein N, Bucher M (1999) Pht2;1 encodes a low affinity phosphate transporter from Arabidopsis. Plant Cell 11: 2153–2166. Furihata T, Suzuki M, Sakurai H (1992) Kinetic characterization of two phosphate uptake systems with different affinities in suspension-cultured Catharanthus roseus protoplasts. 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Planta tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 216: 23–37. 129 130 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 ARTICLE N°3 : I n f l ue nc e d u v e r de t e r re A p o r r e c t o d e a c a l i g i no s a s ur l ’ a b s o r p t i o n e t l ’ a c c u mu l a t i o n d u f e r c h e z l a p l a n t e A r a b i d o p s i s t h a l i a na 131 132 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Chapitre II -Avant proposCette étude fait l‘objet d‘un article en cours de rédaction intitulé : « Le ver de terre Aporrectodea caliginosa force la nutrition en fer de la plante modèle Arabidopsis thaliana ». Une fois terminé, cet article sera soumis dans Journal of Experimental Botany. Le fer étant le troisième élément limitant la croissance et le développement des plantes après l‘azote et le phophore, il nous a paru opportun d‘étudier les effets du ver de terre Aporrectodea caliginosa sur l‘ensemble des transporteurs impliqués dans son absorption mais tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 également sur les transporteurs intracellulaires, responsables entre autres du maintien de l‘homeostasie du fer dans le végétal. Expérimentation Le protocol expérimental employé est le même que celui utilisé pour l‘expérience précédente sur le phosphore. Dans cette expérience, neuf gènes impliqués dans l‘absorption et l‘homéostasie du fer ont été étudiés : - le gène AHA2 codant pour une pompe à proton qui a pour but d‘acidifier la rhizosphère, - le gène FRO2 codant pour une ferric reductase qui permet la réduction de la forme Fe3+ et la chélate, - le gène IRT1 codant pour un transporteur transmembranaire de la forme Fe 2+ du fer - le gène FIT1 codant pour un facteur de transcription qui entraine la surexpression du gène FRO2 et bloque la dégradation de la protéine IRT1 - les gènes NRAMPs 1,2,3,4 et 6 codant pour des transporteurs membrananires intracellulaires du fer. Pour compléter ces analyses moléculaires, l‘activité de la protéine FRO2 a également été mesurée. 133 Chapitre II Résultats et discussion Comme observé dans le chapitre I, les vers de terre ont fortement affecté la biomasse racinaire des plantes d‘Arabidopsis thaliana qui a diminué de moitié. Malgré cette diminution drastique du système racinaire, les dosages des teneurs en fer ont montré une augmentation de 40% de l‘accumulation de fer dans les parties sous-terraines et une formidable augmentation de 100% dans les parties aériennes des plantes d‘Arabidopsis cultivées en présence des vers de terre. A l‘échelle moléculaire, cette accroissement de l‘absorption est accompagnée d‘une légère augmentation de la quantité de transcrits AHA2 (+20%) mais surtout par une considérable augmentation de l‘accumulation de transcrits FRO2 (+1000%) et Fit1 (+40%) tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 comparativement aux plantes témoins. La surexpression du transcrit FRO2 a pu être corrélée à une augmentation de l‘activité Fe(III) chélate-reductase de la protéine résultante (+200%).En revanche, l‘accumulation des transcrits du transporteur IRT1 n‘est pas modifiée en réponse aux vers de terre. L‘accumulation de transcrits codant cinq transporteurs membranaires de type NRAMPs a également été analysée dans les racines et les feuilles. Dans les racines, l‘accumulation des transcrits NRAMP2 augmente de 55% et celle des transcrits NRAMP3 de 80%. Seuls les transcrits NRAMP4 apparaissent sous-exprimés en réponse aux vers de terre. Dans les parties aériennes, ce sont les transcrits NRAMP1 et NRAMP6 (plus 50% et 25% respectivement) qui ont été le plus sur-exprimés en réponse aux vers de terre. Ainsi, malgré un système racinaire considérablement réduit par rapport aux plantes témoins et une disponibilité inchangée du fer dans leur substrat de culture, les plantes d‘Arabidopsis thaliana cultivées en présence de vers de terre sont parvenues à accumuler d‘importantes quantités de fer dans leurs tissus et plus particulièrement dans leurs parties aériennes. Ce phénomène peut s‘expliquer par la formidable augmentation de l‘activité de la protéine FRO2 qui a augmenté la disponibilité en Fe2+. En effet, la principale limitation dans les processus d‘absorption de cet élément est due au fait qu‘il est majoritairement sous la forme ferrique (Fe3+), non assimilable par les végétaux. L‘étape de réduction des ions ferriques en ions ferreux est connue pour être la plus limitante dans la voie d‘acquisition de cet élément. Cependant, cette protéine est normalement induite en réponse à une carence en fer (Robinson et al. 1999), carence inexistante dans nos plantes d‘Arabidopsis étant donné que les concentrations déterminés dans les tissus sont supérieures à 100mg kg-1 de MS, valeur seuil déterminée par Marschner (1988) pour une croissance optimale. 134 Chapitre II Plusieurs études ont tenté de mettre en évidence le rôle des phytohormones dans l‘induction des gènes de réponses aux carences en fer. L‘application d‘auxine ne semble pas influencer l‘expession de ces gènes bien qu‘elle semble responsable de plusieurs modifications morphologiques au niveau du système racinaire, telles que la formation de poils absorbants ou encore le développement des cellules de transfert (Schmidt et al. 2000). En revanche, l‘application d‘ACC, le précurseur de l‘éthylène, induit une surexpression des transporteurs FRO2, IRT1 et FIT1 lorsque les plantes poussent sur un milieu modéremment concentré en fer (10µM) mais n‘a aucun effet sur un milieu fortement concentré. Conclusion tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Pour conclure, l‘augmentation de l‘absorption et de l‘accumulation du fer en réponse aux vers de terre est probablement liée à la présence de composés phytohormonaux relargués dans la rhizosphère. Ces composés semblent stimuler l‘assimilation du fer et produisent également des réponses systémiques étant donné que des modifications de l‘accumulation de certains transcrits NRAMPs ont été observées dans les feuilles. Cependant, il apparaît difficile de savoir si ces variations sont bien le fait des composés phytohormonaux ou s‘il s‘agit d‘un effet indirect résultant simplement d‘une meilleure concentration en fer dans les tissus liée à l‘optimisation du système d‘assimilation du fer au niveau des racines. 135 Chapitre II Earthworm Aporrectodea caliginosa forces iron nutrition in Arabidopsis thaliana Abridged title: impact of earthworms on iron uptake and accumulation Ulrike JanaA, Judicaelle BrunetA, Daniel LaffrayA, Anne RepellinA,B A Ecophysiologie Moléculaire, équipe Interactions biologiques dans les Sols, UMR 7618 Bioemco Faculté des Sciences et Technologie, Université Paris Est - Créteil, 61 Av. du Général de Gaulle, F-94010 Créteil cedex. B Corresponding author; E-mail: [email protected] [email protected] [email protected] tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 [email protected] Keywords: iron uptake, NRAMP, Arabidopsis thaliana, Aporrectodea caliginosa Introduction Iron is the fourth most abundant element in the lithosphere. Despite its usual elevated concentration in soils, its availability can be very low in aerobic medium or at neutral pH. Most of the time, iron is under the form Fe 3+ or complexed with hydroxide anions to form oxyhydroxyde polymers that limit its bioavability for plant (Guerinot and Li, 1994). According to Briat and Vert (2004), iron is the third most limiting element in growth and development of plant after nitrogen and phosphorous. Under a concentration of 50g kg-1 dry weight, plants are considered in Fe deficiency (Marschner, 1995). Nevertheless, this element is essential for plant growth and development because it is required for nitrogen fixation, respiration, photosynthesis, DNA synthesis (ribonucleotid reductase) and hormone synthesis such as lypoxygenase. Moreover, as a transition metal, this element is directly involved in many oxydo-reduction reactions. Angiosperms have developed two different strategies in order to improve iron uptake. The strategy I is used by all the graminaceous species and the strategy II by all the dicotyledons and the non graminaceous plants. Graminaceous species are able to chelate the iron ferric form with the help of phytosiderophores (PS) which are released into the rhizosphere to form a complex Fe(III)-PS (Römheld and Marschner 1986). This complex is then able to enter into the root cells thanks to the specific transporter YS1 (Yellow Strip 1), isolated for the first time in maize (Curie et al., 2001).Next, the separation of the complex and the iron reduction occur into the cell. 136 Chapitre II For the other plant species, iron is first reduced to its ferrous form and then transported to the cell. This strategy is realized in three steps. First a proton pump (AHA2), localized around the apical part of the root (Marschner et al. 1986), acidifies the medium (Romheld et al. , 1984). Then, a ferric chelate reductase (FRO2) enhances the reduction of the ferric iron. Finally, the reduced iron is transported into the cell by the protein IRT1 belonging to the ZIP transporter family (Mäser et al., 2001). Moreover recent studies have shown that the FRO2 and IRT1 are regulated by a ―Fer-like Iron deficiency induced Transcription factor 1‖ (FIT1) in Arabidopsis (Bauer et al. 2007). This transcription factor appears to regulate FRO2 at the level of mRNA accumulation and IRT1 at the level of protein accumulation (Colangelo and Guerinot 2004). Into the plants, several other transporters which present a high affinity for iron have been characterized like the NRAMP proteins (Natural Resistance Associated Macrophage Protein). tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 In Arabidopsis thaliana, six genes coding for these tranporters have been identified. They are regrouped in two families. The first includes AtNRAMP1 and AtNRAMP6 and the second the AtNRAMP2-5. Some studies in heterologous systems have shown that the expression of NRAMP1,3 and 4 allowed a growth restoration in yeast mutants deficient for iron and manganese transport (Curie et al., 2000; Thomine et al., 2000). NRAMP1 and NRAMP3 are mainly expressed in the roots whereas NRAMP4 is principally expressed in the aerial parts. A recent study has shown that the protein NRAMP 3 is localised on the tonoplaste (Thomine et al., 2003) and could be involved in the remobilisation of the iron kept into the vacuole in iron deficiency conditions. Concerning AtNRAMP1 and 6, they are probably involved in the transport to the chloroplast due to a plastidic signal which has been identified . A deficiency in iron involves an overexpression of all the genes implied in iron uptake at the root level (Hell and Stephans, 2003) and in other tissues in order to maintain the homeostaty (Vert et al., 2003). The root system morphology changes in order to enhance the uptake area: the number and the length of the root hairs increase and transfer cells appear (Schmidt 1999). Hormones like ethylene and auxin are probably involved in iron deficiency responses. Several researcher teams reported their increase in such case (Morgan and Hall, 1962; Römheld and Marschner, 1986; Romera et al., 1999). Auxin, ethylene or ABA applications mime all the morphological deficiency responses (Schmidt and Bartels, 1996). For example, the application of an analogous to the auxin, the 2,4 dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), on Fe sufficient Plantago lanceolata stimulates the formation of root hairs and transfer cells but affect poorly iron reduction (Schmidt and Bartels, 1996). It is now well known that earthworms affect plant growth and biomass by several mechanisms. First, they accelerate the mineralization of the soil organic matter and increase 137 Chapitre II the nutrient availability (Lee, 1985). In second, they interact with the soil micro-organisms particularly the plant growth promoting bacteria which synthetize phytohormon-likecompounds and these activities increased in earthworm casts (Pederson and Hendrikson, 1993). Moreover, earthworms have been shown to improve the nitrogen uptake (Jana et al. 2009) and to increase the expression of a leaf nitrate transporter and a root pump H +-ATPase of maize plantlets (Quaggiotti et al., 2004). The authors concluded that this phenomenon was triggered by the auxin-like compounds present in earthworm casts. The objective of the present work is to study the iron metabolic pathway in response to the earthworms Aporrectodea caliginosa, in the model plant Arabidopsis thaliana in order to see if, like it was observed for the nitrogen, earthworm presence could increase the uptake of this tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 element. Materials and methods Soil collection The sandy cambisol soil used in this experiment was collected at the ―Centre de Recherche en Ecologie Expérimentale et Prédictive‖ (CEREEP, Saint-Pierre-Lès-Nemours, France). Before to be used, it has been sieved at 2mm and dried at 25°C during one week. Soil iron content was determined at the beginning and the end of the experiment (in three microcosms of each treatment) by a KCl extraction. Earthworms Aporrectodea caliginosa earthworms were collected at the IRD (Institut de Recherche pour le developpement, Bondy, Seine Saint Denis, France). Adults with a well developed clitellum and similar size were added to the microcosms at a density of 1.4g of earthworms per microcosm which corresponded to an average of four earthworms. This introduction occurred four weeks before the plantlets introduction in order to allow earthworms to digest a part of the soil. Plant growth and microcosm preparation Arabidopsis thaliana (L.) Heynh ecotype Columbia has been used during this experiment. Seeds were germinated on petri dishes which contained the sandy cambisol soil. When cotyledons were fully open (6 days after germination), plantlets were transferred individually to microcosms. These growth units consisted in 10 cm diameter, 16 cm-high pots filled with 1.3 kg of the sandy cambisol soil. Soils were maintained at 80% field capacity with deionised 138 Chapitre II H2O. Plant growth was carried out under controlled conditions (Conviron growth chamber, Canada): 20±1°C and 18±1°C day and night temperatures, 60% ± 5% relative humidity, 100 mol m-2 s-1 PPFD for 10 h per day. Treatments Two treatments were applied to the Arabidopsis: plant alone (control) or plant with earthworms (earthworm treatment). For these two treatments nine replicates were implemented. Moreover two additional treatments were carried out without plant: soil alone and soil with earthworms with three replicates for each. Plant sampling and total RNA extraction tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 At the apparition of the floral buds (around 21 days after the plantlet transfer), total leaf and root materials were collected from three of the six replicates, weighted, washed rapidly into three different baths (triton 5%, ethanol 10% and sterilized water), snap-frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C. Total RNA extraction was carried out using RNeasy Plant Minikit (Qiagen, France) on 100 mg and 50 mg of fresh leaf and root material, respectively, following the manufacturer‘s instructions. DNAse (Promega, France) treatment was applied to all RNA extracts. RNA quantification was done at 260 nm, using a ND-1000 Nanodrop spectrophotometer (Starlab, USA) and RNA were homogeneised at 100 ng µL-1. cDNA synthesis and expression analysis First strand cDNA synthesis was performed in 20 L reactions on 150 ng of homogeneised total RNA using 4 units of Omniscript reverse transcriptase (Qiagen, France) and 10 µM of oligo-dT primers according to the manufacturer‘s instructions. Transcript abundance of the five NRAMP genes and the four genes involved in iron uptake was analyzed by semiquantitative PCR using 1 L of cDNA obtained from the leaves and roots of control and treated plants with the primers shown in Table I. The S19 gene was used as reference gene. Gene expression (arbitrary unit, a.u.) was correlated with intensity of transcript accumulation and was measured using the Quantity-One software (Bio-Rad, France). 139 Chapitre II Table I Nucleotidic sequences and melting temperatures of the ten primers used for the RT-PCR reaction Primer sequences (5‘-3‘) tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Gene name NRAMP1 (AtNR1-f) (AtNR1-r) NRAMP2 (AtNR2-f) (AtNR2-r) NRAMP3 (AtNR3-f) (AtNR3-r) NRAMP4 (AtNR4-f) (AtNR4-r) NRAMP6 (AtNR6-f) (AtNR6-r) (AtFIT1-f) FIT1 (AtFIT1-r) (AtAHA2-f) AHA2 (AtAHA2-r) (AtFRO2-f) FRO2 (AtFRO2-r) (AtIRT1-f) IRT1 (AtIRT1-r) (AtS19-f) S19 (AtS19-r) ATTCTTGGGTTCGCAGG ACATTTTGTGAGTCTCTTGAA TTGGAGGCGGGCTTCTTC ATTCAGAAAACCGCCCATTAT CATTCGCTTGGATGTTTG GCAACCCACAACTCCA GGACAGAGATAGCGGACACC CTAAGACTCCAATCGCCC CCCATTTGCTTTAGTCCCA ATACCCATAATAAGTCCACCAAT GCTCCTGATGCTCAAAAGACTC CACACCAATCTCACATAAAACCC GAGGAGTTGATTGAAAAGG GACACCATCACCAGTTATTC TCTGAAAAAGATTCTACTTGAGG TCTTAGCCAAACCAGATGAA GCAATCTCTCCAGCAACTTC TGAGGATTACGAAGATTGCTAT TCCAGGAAGCAGTTCGTTATTGAT CTGGTGATGCCAAGAAGAAGTGA Tm 51°C 58°C 52°C 56°C 56°C 58°C 52°C 53°C 54°C 60°C Determination of FRO2 activity The quantitative determination of the ferric reductase activity was performed as described by Schmidt (1994). The ferrozine solution contains 0.5mM of Ferrozine (FZ, disodium salt of 3(2-pyridyl)-5,6-bis(4-phenylsulfonic acid)-1,2,4-triazine, Sigma, France), 0.5mM of Fe(III)EDTA, 0.5mM of CaCl2 and 20mM of MES at pH 5.5. The whole plants were extracted from the soil of the microcosms, then rapidly cleaned with a tap of deionised water and then were put into 25 mL of the ferrozine solution during 20 minutes. Ferrozine reacts with the ferrous iron to form a complex Fe(II)(FZ) 3 with a magenta colour. The reduction activity was measured with a spectrophotometer at A562 and the reduction rate was calculated using Beer Lambert low with the coefficient extinction of 25 200 M-1 cm-1. The activity was then expressed in µmol of Fe(III) reduced per g of dry weight and per hour. Iron content in Arabidopsis tissues At the apparition of the floral bud, three plants per treatment were harvested. The rosette and the roots were collected separately, carefully washed, dried for one week at 50°C in a oven and pulverised with a mortar and a pestle. 140 Chapitre II Iron content in the aerial and subterranean parts of Arabidopsis was then determined by radial-ICP by the INRA ―Unité de Service et de Recherche en Analyses Végétales et Environnementales‖ in Villenave d‘Ornon (France). Analysis Statistical differences were tested using student‘s t-test. Results Earthworm effect on Arabidopsis biomass Earthworms have reduced by an half the biomass of the root systems (figure 1) and this reduction appeared to be significant (p = 0.045) On the other hand, no difference was 250 Dry weight (mg) tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 recordered for the aerial biomasses of the two treatments. 200 Control Earthworms 150 100 ** 50 0 Leaves Roots Figure 1: Leaf and root biomass in Arabidopsis thaliana plants with (black bars) or without (control; grey bars) earthworms Aporrectodea caliginosa. Vertical bars indicate s.e.m. (n=3) and the two asterisks indicate a p value <0.05 Erthworm effects on iron uptake pathway in the roots of Arabidopsis thaliana The observations of the transcript accumulation of the four genes (FIT1, AHA2, FRO2 and IRT1) involved in iron uptake (figure 2) showed that earthworms affected iron uptake pathway. The proton pump Aha2 transcript accumulation presented a slightly increase in response to the earthworm presence but the major rise concerned the transcription factor Fit1 and the ferric reductase Fro2: they showed a strong increase of 40% and more than 100% in the transcript accumulation respectively. The iron transporter IRT1 was not affected by the treatment. 141 Chapitre II (b) 3500 3000 2500 2000 control 1500 earthworms 1000 500 Relative expression of Fit1 gene (a.u) Relative expression of Aha2 gene (a.u) (a) 3500 0 400 100 0 control 1500 earthworms 1000 500 2500 500 200 2000 (d) 600 300 2500 0 control earthworms Relative expression of Irt1 gene (a.u) Relative expression of Fro2 gene (a.u) tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 (c) 3000 2000 1500 control earthworms 1000 500 0 Figure 2: Expression of Aha2 (a), Fit1 (b), Fro2 (c) and Irt1 (d) genes in the roots of Arabidopsis thaliana with (black bars) or without (control; grey bars) earthworms Aporrectodea caliginosa. Vertical bars indicate s.e.m. (n=3) Earthworms enhanced significantly the activity of the Fe(III) chelate reductase in Arabidopsis thaliana (figure 3). The ferric reductase activity of this protein in plants grown with earthworms was three time higher than in the control plants. This data appears to be coherent with the previous results concerning the overaccumulation of Fro2 transcript observed in presence of earthworms. 142 Fe(III) reduction rate (µmol/g DW/ h) Chapitre II 6 5 4 Control 3 Earthworms 2 ** 1 0 Figure 3: Activity of the ferric chelate reductase (FRO2) in roots of Arabidopsis thaliana with (black bars) or tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 without (control; grey bars) earthworms Aporrectodea caliginosa. Vertical bars indicate s.e.m. (n=3) and the two asterisks indicate a p value <0.05 Earthworm effect on Arabidopsis thaliana NRAMP transporters The effects of earthworms on the expression of NRAMP genes were studied on five of the six genes of this family. As Nramp5 gene is poorly documented and its functions in plant remain unknown at this date, it was excluded from this study. Several noteworthy changes in transcript accumulation were observed in response to earthworm treatment. Earthworms presence led to an over accumulation of Nramp1 and Nramp6 transcripts only in the leaves of Arabidopsis (50% and 25% more respectively) whereas their expression remained almost unchanged in the root system. In the other hand, the main changes in Nramp2 and Nramp3 expression occured in the subterranean parts with a 55% and 80% rise respectively for the transcript accumulation with the earthworms. Conversely earthworms tended to decrease the Nramp4 gene expression in the roots. 143 3000 2500 2000 control earthworms 1500 1000 500 0 (c) 500 400 300 control earthworms 200 100 0 Leaves Roots (e) 3000 2500 2000 control earthworms 1500 1000 500 0 Leaves (b) 2500 2000 1500 control earthworms 1000 500 0 Leaves Roots Roots Roots Relative expression of Nramp4 gene (a.u) Relative expression of Nramp3 gene (a.u) Relative expression of Nramp6 gene (a.u) tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Leaves Relative expression of Nramp2 gene (a.u) (a) 3500 Relative expression of S19 gene (a.u) Relative expression of Nramp1 gene (a.u) Chapitre II (d) 4000 3500 3000 2500 2000 control earthworms 1500 1000 500 0 Leaves Roots (f) 2000 1800 1600 1400 1200 control 1000 earthworms 800 600 400 200 0 Leaves Roots Figure 4: Expression of Nramp1 (a), Nramp2 (b), Nramp3 (c), Nramp4 (d), Nramp6 (e) and S19 gene (using as a reference gene) in the leaves and the roots of Arabidopsis thaliana with (black bars) or without (control; grey bars) earthworms Aporrectodea caliginosa. Vertical bars indicate s.e.m. (n=3) Earthworm effects on iron uptake and accumulation in Arabidopsis thaliana The elemental analyses for iron content in Arabidopsis thaliana roots and leaves revealed that earthworms have significantly affected the iron content in roots and leaves (figure 5). Compared to the control plants, earthworms treated plants have doubled the iron concentration in their aerial part (p = 0.04). In the root system, a 40% increase was observed with the worms. This data was considered to be nearly significant (p = 0.06). Moreover this over concentration in leaves was correlated with an increase of the translocation factor (i.e. 144 Chapitre II the ratio between iron concentration in shoot and in roots): 13% of this element is translocated Fe concentration (mg kg -1 DW) to the shoot in presence of earthworms against 8% for the control plants (data not shown). 10000 7500 * 5000 2500 ** 0 Leaves tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Control Earthworms Roots Figure 5: Iron concentration in the leaves and the roots of Arabidopsis thaliana with (black bars) or without (control; grey bars) earthworms Aporrectodea caliginosa. Vertical bars indicate s.e.m. (n=3). Significant differences between earthworm treatment vs control were evaluated by t-test: one asterisk indicates a p value <0.1 and two asterisks a p value <0.05 Effects of earthworms on iron content in soil Regardless of the treatments, the pH is inclined to increase in the soils at the end of the experiment. Iron and its available part decreased significantly (p<0.05) compared to the initial soil except for the final soil with Arabidopsis thaliana. The presence of Arabidopsis contributed to decrease the iron loss whereas earthworms appeared to have no consistent effect in iron retention. Table 2: pH, total iron content and available iron in initial soil (i.e. at the beginning of the experiment), final soil, final soil with earthworms, final soil with Arabidopsis thaliana and final soil with Arabidopsis thaliana and earthworms. The means from these analysis (n=3) and s.e.m. are presented. Different letters within a row indicate a significant difference at P= 0.05 with the Student t-test. Treatment pH Total Fe (%) Available Fe (%) Initial soil 5.88±0.06 a 3.34±0.09 a 1.86±0.01 a Final soil 6.43±0.09 b 3.15±0.07 b 1.77±0.04 b Final soil + earthworms 6.23±0.02 c 3.05±0.14 b 1.70±0.08 b Final soil + A. thaliana 6.22±0.14 b,c 3.31±0.10 a 1.82±0.06 b Final soil + A. thaliana + earthworms 5.91±0.09 a,c 3.22±0.02 a,b 1.75±0.03 b 145 Chapitre II Discussion In this study, the effects of the earthworm Aporrectodea caliginosa on iron uptake and accumulation in Arabidopsis plantlets were investigated through the expression and enzymatic activity of several genes involved in iron uptake and iron homeostasis and the determination of iron contents in plants and soils. The analyses of iron content in Arabidopsis tissues indicated an enhancement of the Fe uptake due to earthworm presence. This accumulation seems to principally result from a greater disponibility of the ferric form due in first to an increase of the proton pump transcription and in second to an enhancement of the ferric chelate reductase (FRO2) at the transcriptional level and at its enzymatic activity level, probably mediated by the rise of the transcriptional factor Fit1. tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Usually, Fro2 gene expression is induced by an iron deficiency (Robinson et al. 1999; Hell and Stephan 2003) but the concentrations found in the different organs (1000 mg kg-1 which corresponds to 17.8 µmol/g DW in the leaves in the earthworm treatment) reveal no deficiency stage. Moreover the gene Nramp2 was also over expressed in presence of earthworms and Curie et al. (2000) have shown that this gene was more expressed when the iron concentration was sufficient in the cell and decreased when the plants were in iron deficiency conditions. At last, the drastic diminution of Arabidopsis root biomass does not suit with a deficiency phenotype (Gastal and Lemaire 2002; Schmidt 1999). However this reduction in root biomass led to a decrease in soil environment exploration. This might contribute to enhance the iron uptake metabolism in order to maintain a great iron concentration in all the tissues. The NRAMP3 and 4 root expressions present also some contratsting responses. These two genes are known to be overexpressed in answer to an iron deficiency (Lanquar et al. 2005; Thomine et al. 2003; Thomine et al. 2000), but compared to the control, earthworms doubled the expression of Nramp3 whereas they decreased by one third Nramp4 expression. As it was observed in the roots, earthworms also enhanced the expression of the gene Nramp2 in the leaves. Moreover, an over expression of Nramp1 was also observed. Although the role of this gene hasn‘t been yet clearly established, it is supposed to be involved in iron homeostasis (Curie et al. 2000) and it might assume the compartimentation of the free cytosolic iron to the vacuole or to the plasts (Bode et al. 1995). This forced iron uptake and accumulation do not appear to be due to an effect of earthworms on iron availability since the soil analyses have clearly demonstrated that earthworms have no effect on this parameter. Schmidt et al. (2000) have studied the activity of the root ferric 146 Chapitre II reductase on different Arabidopsis mutant. They have shown that in three ethylene overproducers, (eto1, eto2 and eto3), the enzymatic activity of this protein was amplified compared to the wild type. Moreover, Luciena et al. (2006) have tested the effects of the addition of the ethylene precursor ACC on Fe sufficient Arabidopsis (grown with 40µM Fe) and they observed no substantially increase for the transcript AtFRO2, AtIRT1 and AtFRU (also called FIT1). Nevertheless, in low-Fe plant (grown with 10µM Fe), the expression of these three genes is increased considerably by ACC addition at a level nearly as high as those observed in a iron deficiency Arabidopsis. Together, these results suggest that the precursor of ethylene strengthens the molecular answer to iron deficiency. Thereby, it is possible that the increase in iron uptake by Arabidopsis thaliana with earthworms is due to a production of exogenous ethylene or its associated precursor. Some humic substances have been extracted tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 from earthworm casts (Nardi et al. 1994). These substances have been shown to contain 0.5% of IAA (Indol-3 Acetic Acid, Muscolo et al. 1998). Moreover, these humic substances galvanize Ba and Na uptake and the proteins involved in nitrogen uptake (Vaughan and MacDonald, 1976). This last result was subsequently confirmed by Nardi et al. (2000) who showed an enhancement in the nitrate uptake and specially the nitrate flux from the roots to the leaves in Zea maize. Concerning the Nramp gene expressions and specially Nramp 3 and Nramp 4, although it is known that their expression increase in answer to iron deficiency, their regulation is currently poorly characterized. Nramp4 might be regulated by an iron sensing system as its expression is lower in the earthworm treatment where iron concentration is high. On the other hand, Nramp 3 might be regulated by hormonal signals which could explain its higher concentration. To conclude, the iron uptake and accumulation enhancement observed in this study is probably triggered by some phytohormone like compounds released in the rhizosphere. As well as stimulate the iron uptake, these compounds also produce systemic answer (i.e. in the leaves) which is traduced by some modifications in NRAMP transcript accumulation. However, it is difficult to know if the observed changes resulted from a change in iron status or is caused by the earthworm humic substances. 147 Chapitre II References Bauer P, Ling HQ, Guerinot ML. 2007. FIT, the FER-LIKE IRON DEFICIENCY INDUCED TRANSCRIPTION FACTOR in Arabidopsis. Plant Physiology and Biochemistry 45: 260–261. Briat JF and Vert G. 2004. Acquisition et gestion du fer par les plantes. Cahiers de l’Agricultures 13: 183-201. Colangelo EP, Guerinot ML. 2004. The essential basic helix-loop-helix protein FIT1 is required for the iron deficiency response. Plant Cell 16: 3400–3412 Connolly EL, Fett JP, Guerinot ML. 2002. Expression of the IRT1 metal transporter is controlled by metals at the levels of transcript and protein accumulation. 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Expérimentation L‘ancien site minier d‘Ouche, localisé près du village de Massiac (Cantal, France) est fortement contaminé à l‘arsenic et à l‘antimoine. L‘objectif de cette étude est d‘évaluer le degré de contamination en arsenic, antimoine et autres métaux lourds des quatre plateformes du site minier dans lesquelles ont été sédimentés les résidus miniers. De plus, l‘ensemble des espèces végétales présentes sur le site ont été identifiées et les concentrations en arsenic et en antimoine ont été déterminées dans leurs différents organes par spectrométrie d‘absorption atomique dans un four graphite. Les facteurs de bioconcentration et de translocation ont été calculés dans le but d‘identifier les espèces accumulatrices ou simplement tolérantes à ces métalloïdes. Résultats et discussion Au vu des analyses élémentaires des sédiments miniers, les quatre lagunes apparaissent fortement polluées : les concentrations moyennes en antimoine et en arsenic atteignent respectivement 3250 g Sb kg-1 et 650 g As kg-1. Malgré ces concentrations élevées et un pH très acide (3,15 en moyenne) une végétation clairsemée est tout de même parvenue à se développer. Au total, douze espèces ont été recensées : trois espèces arbustives (pin sylvestre, 155 Chapitre III bouleau, chêne pubescent), une espèce arborée (genêt à balai), deux espèces de jonc (un brome et un jonc épars), un trèfle, un plantain et quatre graminées. En ce qui concerne les espèces arborées, les pins et le chêne accumulent beaucoup plus d‘antimoine et d‘arsenic que les bouleaux. Ces derniers présentent un faible facteur de bioconcentration et de translocation suggérant qu‘ils se comportent comme des espèces excluant l‘arsenic et l‘antimoine. Les concentrations en arsenic relevées dans les différents organes des pins sylvestre sont équivalentes à celles trouvées par l‘équipe de Pratas (Pratas et al. 2005) sur une espèce proche : le pin maritime. En revanche, les concentrations en antimoine de nos pins sylvestres sont cent fois supérieures à celles qu‘ils ont rélevées sur leur site. Les deux espèces de joncs quant à elles présentent un pattern d‘accumulation similaire tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 pour l‘arsenic et l‘antimoine. Elles possèdent des facteurs de bioconcentration de l‘arsenic et de l‘antimoine très élevés : 25 et 5 respectivement. En revanche, pour ces deux éléments, le facteur de translocation vers les parties aériennes est très faible (entre 0,1 et 0,2%). Le genêt et le plantain présente un comportement similaire à celui observé pour les bouleaux, c'est-à-dire un faible facteur de bioconcentration et un faible facteur de translocation des polluants vers les parties aériennes. Parmi les Poacées, Agrostis, Bromus et Calamagrostis repondent de façon similaire aux polluants : elles accumulent d‘importantes quantités d‘arsenic et d‘antimoine dans leurs racines mais n‘exportent que faiblement les polluants vers leurs parties aériennes. Enfin, l‘unique trèfle recensé sur le site présente des concentrations élevées en arsenic et en antimoine (supérieures à 100 ppm) dans tous ses organes. Conclusion Au vu des fortes concentrations de polluants présentes dans les sédiments, la stratégie de réhabilitation employée sera la phytostabilisation. Cette méthode nécessite des espèces végétales avec un très faible taux de translocation (Cunningham et al. 1995). Pour stabiliser les résidus miniers, en limitant l‘érosion éolienne et en créant une barrière qui stoppera le transfert des polluants, le site sera recouvert par un substrat inerte et recouvert par les plantes natives identifiées sur le site. Aussi, il apparaît essentiel de favoriser la propagation des bouleaux et au niveau du tapis végétal, les lignées locales de Plantago et Deschampsia pourraient être employées. 156 Chapitre III Presentation of an old mining site in Ouche (Cantal, France), polluted by arsenic and antimony, and strategies concerning its rehabilitation U. Janaa, V. Chassanya, G. Bertranda, M. Castrec-Rouelleb, E. Aubryb, S. Boudsocqc, D. Laffraya and A. Repellina, c a Equipe Interaction Biologique dans les sols (IBIOS), UMR 7618 Bioemco, Univesrité Paris- est Créteil, 61 avenue du Général de Gaulle, 94010 Créteil, France. b Equipe Géochimie organique et inorganique de l‘Environnement (GOME), UMR 7618 Bioemco, Jussieu, 75004 Paris, France. tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 C Equipe Biodiversité et fonctionnement des Ecosystèmes (Bioemco), UMR 7618 Bioemco, Ecole Normale Supérieure, 46 rue d‘Ulm, 75230 Paris Cedex 05, France. Abstract The mining site of Ouche (Cantal, France) is highly polluted by two metalloids: antimony and arsenic. In the waste residues, concentrations of these two elements can reach 3250 g Sb kg-1 and 650 g As kg-1. Some patches of vegetation are present on the site in which plant species have been identified and analysed in order to determine their content in pollutant and the strategy they use to survive The more widespread strategy used by these plants is the accumulation of the two pollutants into their root system. It is the case for most of the herbaceous species and the bulrushes. Second is the exclusion strategy applied by the birches, the brooms and one herbaceous species: Deschampsia flexuosa. In the last case, some species uptake the pollutants up to their aerial parts like Pinus sylvestris, Quercus pubescens and Trifolium sp.. To stabilise the mine wastes by limiting the wind blow and to create a border which stop the transfer of the pollutant towards the population and the fauna, this site will be covered by an innocuous substrate and then a vegetation cover with the native plants identified on the site will be created. 157 Chapitre III 1. Introduction The environmental impact of metal mining operations can be quite extensive. Beside leaving visual scares in the landscapes, many metal mining operations have also left behind open tailings with varying levels of associated metal contaminants, depending on the efficiciency of the mineral separation process (Tordoff et al., 2000). These tailings are prone to eolian dispersion and water erosion and therefore constitute a hazard to wildlife and humans near the sites or even at significant distances from the tailings sites (Smith and Bradshaw 1972; Mendez et al. 2007). Despite their usually low pH and lack of normal soil structure (Wong et al. 1998; Krzaklewski and Pietrzykowski 2002; Ye et al. 2002), mine tailings sometimes harbor some level of vegetation cover. Furthermore, the plants can be tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 tolerant to a large range of pollutants (Pratas et al., 2005). It is therefore very important to identify and propagate these plant species since they can be useful for reclamation of contaminated areas (Tordoff et al. 2000). There is a large variety of mineral resources in the Massif Central region of France. Major products include zinc, copper, lead and antimony. The industrialization era has led to the development of many mine workings in the region and most operations were closed down during the 1970s. They now remain as open tailings piles with all the problems associated with such structures. The present study deals with one of these abandoned mining sites, the Ouche site, exploited over several centuries for its antimony ore. Because removing or disposing of the tailings is not an option for this site, the establishment of a vegetation cover could become a viable management alternative to reduce spread of toxicants either through eolian dispersion or water erosion. This procedure, named phytostabilization, can be safely achieved by using native plants that do not accumulate the toxic elements in their shoot tissues but rather in their roots to aid in the precipitation of toxic elements in the root zone (Cunningham et al. 1995). The present study therefore examines the relationships between the levels of antimony and arsenic, as a co-extracted product, in the tailings and those measured in the plants found growing on them in order to identify the species best suited for phytostabilisation purposes. 158 Chapitre III 2. Materials and methods 2.1 Site description, historic and current status The Ouche mining site where the present study was conducted is located in the Centre of France (03°10‘44‘‘ E, 45°16‘19‘‘ N), in the Massif Central mountains, on a hillside (altitude 570 m). Administratively, it belongs to the municipality of Massiac, County Cantal (Région Auvergne) (Fig. 1). The climate in the area is sub-continental with an annual precipitation of around 600 mm and average annual temperature of 9.5°C (1°C in winter and 18°C in summer). The geological background is composed of stibine veins embedded in Hercyanian metamorphic bedrock composed of biotite ans sillimanite gneiss. Due to an abundance of minerals, the area was the main mining region for metals in tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 metropolitan France. The Massiac mines, to which the Ouche site belongs, were the first ones to be mined for antimony in the country. Their exploitation started as early as the mid 1600‘s. However, the main veins were discovered much later, at the end of the 19th century. The Ouche site, primarily an antimony ore processing operation, has been mined until 1971. It has been one of the most productive of the Massiac mines, with a total of approximately 9,000 t of extracted antimony. During operation, waste products from the ore processing were discharged outside as semi-liquid sludge into four successive slimes dams (thereafter denoted platforms P1-P4) where they were left to sediment (Fig.1). Today these tailings piles represent a total surface of 1.3 ha with an average thickness of 10-15 m, hence an approximate volume of 50,000 m3. Since its closure in 1971, the site has never been fenced and has been regularly used as a training site by all-terrain motorcyclists. Due to the absence of a responsible authority (faulty respondent), the site was placed in the trust of the French government agency ―Agence de l‘Environnement et de la Maîtrise de l‘Energie, ADEME) for its rehabilitation, in 1999. 159 Chapitre III LEGEND NW Permanent pound temporary wetland area Vegetation patch P4 Sample points P2 P3 P1 SE tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Section NW-SE Figure 1: Sampling locations of sediments and plants in the study area. The four platforms are indicated by the letter P. 2.2 Floristic inventory and plant sampling A comprehensive floristic inventory of the Ouche site was conducted in June 2008. The site was explored using zigzag transects with a visual scanning radius of ~5 meters in each direction. Each platform was thoroughly searched until new species were no longer discovered. For tree species, three adult specimens per platform were used for sampling. For the less common shrub species, three individuals were sampled over the entire site. For uncommon herbaceous species (with less than five specimens on the site), a single individual was collected. The different organs of each specimen were collected separately (e.g. leaves, branches, trunk and roots for adult trees). All plant samples and roots particularly were thoroughly cleaned with demineralised water in order to remove all particulate residues. Samples were then oven-dried at 40°C for two weeks before grinding in mortars using pestles. 2.3 Mineralization and elemental analysis of plant samples Ground plant samples (0.1g) were mineralized by addition of 2mL of suprapur nitric acid (65% m/v; Merck, France) and heated at 220°C during 72 hours. One mL of hydrogen peroxide (30% v/v; Merck, France) was then added and heat (220°C) was applied for 24 hours. Arsenic and antimony analyses of the mineralized plant samples were made by 160 Chapitre III graphite furnace atomic absorption spectrometry on a Unicam 989 QZ spectrometer, in the presence of a nitrate-nickel modifier (Table 1). Table 1: Furnace parameters for arsenic and antimony analyses Drying Vaporisation Atomization Cleaning a Temperature/°C 100 1000 a /1200b 2700 a /2500 b 2900 a /2700 b Ramp time/s 4 a /5 b 140 a /150 b Hold time/s 30 10 3 3 Gaz flow (L/s) 0.2 0.2 0 0.2 Read + - for arsenic determinations, b for antimony determination 2.4 Sampling of mine tailings tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Tailing samples were collected from each of the four platforms, following a method derived from that of Pratas et al. (2005). Quickly, samples were collected at 0.5 m, 1.0 m and 1.5 m from a reference point, in each of the four cardinal orientations. Three depths were systematically considered: 0 m (surface), 0.2 m and 0.5 m. Samples corresponding to a same distance from the reference point and to a same depth were pooled. Therefore, final samples each corresponded to four sub-samples, in order to minimize soil heterogeneity (Pratas et al. 2005). Samples were dried at 40°C during two weeks, ground to a powder and sieved with a 22 mm mesh screen. 2.5 Mine tailings analysis Standard (pH, CEC, organic matter and nitrogen contents) and elemental analyses of mine tailings sampled at the Ouche mining site have been made at the ‗Laboratoire d‘Analyse des Sols‘ (LAS, INRA Arras, France). Total arsenic contents were determined by hybrid generation atomic absorption spectrometry (HG-AAS). Total antimony contents were determined by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS). Other elements were determined by inductively coupled plasma atomic emission spectrometry (ICP-AES). 3. Results 3.1 Mine tailings analyses Throughout the site, tailings had a highly acidic pH (2.4<pH<3.9). They exhibited very low CEC (CEC = 4 cmol g-1), little organic matter (OM = 12 g kg-1) and minimal nitrogen content (total N = 0.5 g kg-1). 161 Chapitre III In the 16 tailings samples analysed over the entire Ouche site, average levels of total antimony (Sb) and arsenic (As) were 2615 mg kg-1 and 578 mg kg-1, respectively, (Table 2). Unsurprisingly, these concentrations were very high in comparison to levels normally found in soils, several hundreds to three thousand times over accepted standards for As and Sb respectively (Swaine 1955 in Mendez 2007, ref). Furthermore, the two pollutants were uniformly distributed between the four platforms and no concentration gradient was observed in the 0.5 m-profiles (Table 2), suggesting that As and Sb are poorly mobile elements. In addition to Sb and As, several other metallic elements (Fe, Co, Cr, Cu, Ni, Zn) were detected in the tailings (Table 2). All were present in low concentrations (i.e. below reported soil plant toxicity levels; references in Mendez). All were more concentrated in the lower layers of the tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 tailings, suggesting that, contrary to As and Sb, they had mobility (Table 2). Table 2: Soil data for different trace element at the study site (mg kg -1). Element Depth (m) 0 Antimony 0.2 0.5 0 Arsenic 0.2 0.5 0 Iron 0.2 0.5 0 Co 0.2 0.5 0 Cr 0.2 0.5 0 Cu 0.2 0.5 0 Ni 0.2 0.5 0 Zn 0.2 0.5 Mean 3246.425 2229.125 2491.539 593.43 536.41 641 14642.6 13798.33 24069.23 1.01 1.1 10.92 37.47 43.5 51.55 3.66 12.15 14.92 1.155 1.62 27.46 10.48 11.48 62.86 Median 3140 2204.5 2500.77 584.5 507.5 641 13750 13650 24000 1 1 10.65 34.95 43.8 52.7 3.45 3.1 12.5 1.075 1 27.8 9.97 8.245 49.6 Max 5780 3250 3820 815 843 852 21100 21800 30500 1.11 1.91 18.5 55.8 52.6 76.4 6.08 64.1 43.2 1.79 5.41 43.7 16.2 46.9 158 Min 2010 1460 1290 413 322 460 11900 6630 17400 1 1 2.86 30.9 31.6 26.4 2.54 1.82 7.08 1 1 6.12 7.78 5.66 20.3 SD 963 493 659 109.37 152.64 100.57 2647.12 4966.61 3859.92 0.03 0.27 4.45 6.64 5.85 15.23 1.11 19.03 9.87 0.23 1.34 10.72 2.30 11.30 38.37 n 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 16 162 Chapitre III 3.2 Floristic inventory report at the Ouche mining site and plant metal content analysis Despite their poor characteristics, the tailings supported the establishment of a sparse plant cover. The landscape was therefore mostly barren with several patches of vegetation evenly distributed over the four platforms of the site. No stream was found within the site. However, a permanent pound was found at one edge of platform P1 and a temporary wetland area was observed on platform P3 (Fig.1). In 2008, the flora of the site included a total of 12 plant species representing seven botanical families (Table 3). The vegetation patches were dominated by adult pine trees (Pinus sylvestris L.; average of 10 adult specimens per platform) and birch trees (Betula tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 pendula Ehrh.; average of five adult specimens per platform). Very few downy oak (Quercus pubescens Willd.) specimens were found, all at a very early developmental stage (less than 15 cm in height, data not shown). The bulrush Juncus effusus L. speckled the surroundings of the temporary pond in P3 and was found nowhere else. On the other hand, the second bulrush identified on the site (Luzula sylvatica L.) was not present around the wetland areas but within the vegetation patches. Few species were represented by single specimens. The common broom (Cytisus scoparius (L.) Link) was observed on P4, the clover (Trifolium sp.) specimen was found at the inside edge of P1 and the common plantain (Plantago major L.) was found outside the vegetation patches in P4. For each species of the Poaceae family, less than five specimens were counted. They were mainly present on P3 and P4, essentially within the vegetation patches (Table 3). 163 Chapitre III tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Table 3: Arsenic and antimony concentration (mg k-1, DW) in different plant organs collected at the mine tailing at Ouche mine site Scientific name Family Pinus sylvestris (L.) Pinaceae Betula pendula (Ehrh.) Betulaceae Quercus pubescens (Willd.) Fagaceae Juncus effusus (L.) Juncaceae Luzula sylvatica (L.) Juncaceae Cytisus scoparius (L.) Link Fabaceae Trifolium sp. (L.) Fabaceae Plantago major (L.) Plantaginaceae Agrostis sp. (L.) Poaceae Bromus sp. (L.) Poaceae Camalagrostis sp. (Schrad.) Rchb. Deschampsia flexuosa (L.) Poacea Poaceae Organ Root Trunk Branch Needle Root Trunk Branch Leaf Root Stem Leaf Root Leaf Root Leaf Root Leaf Root Bolt Leaf Root Leaf Root Leaf Root Leaf Root Leaf Root Leaf n 12 12 12 12 12 12 12 12 1 1 1 3 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Total As 63.0±22 0.4±0.1 29.0±9 48.0±16 40.8±17.4 0.5±0.2 2.7±0.5 11.0±3.7 65.4 115.6 30.5 425.6±138.5 28.9±0.3 543.0 50.6 28.6 28.9 177.3 159.9 208.0 34.9 6.9 148.8 18.9 225.2 9.2 94.8 7.9 90.2 43.7 Total Sb 507.0±293.0 1.8±0.5 153.0±23.0 184.0±99.0 69.8±30.7 2.1±0.5 14.0±3.2 17.9±11.3 475.3 371.2 183.0 319.7±15.1 35.7±6.7 325.2 73.0 14.4 40.0 106.5 131.3 264.1 76.6 17.6 117.4 10.0 253.0 12.4 141.7 10.0 72.0 26.1 3.3 Plant metal content analysis Sb and As contents and root to shoot translocation factors (TF) were determined for the collected plant specimens to assess their potentials as phytostabilizers (Tables 3 and 4). When biological repeats were analyzed (i.e. for pine and birch specimens), results showed a high degree of variability, as is usually the case under uncontrolled experimental conditions (Baroni et al. 2000; Murciego et al. 2007). In light of the fact that plant-available As and Sb were not analyzed in the Ouche tailings, the actual root accumulation coefficients (RAC) could not be determined. However, a thorough analysis of bibliographical data showed that 164 Chapitre III the proportion of plant bioavailable As and Sb is usually extremely low in comparison to the total metal concentrations (0.05-2.73% and 0.006-2.10% for As and Sb, respectively; Bech et al. 1997; Marques et al. 2009; Murciego et al. 2007; Baroni et al. 2000). The most conservative percentages were thus used to calculate the projected RAC, for both elements (Table 5). All organ considered, pine and oak trees accumulated higher amounts of both As and Sb than birch trees, as shown by their low RAC, particularly for Sb (Table 5). Similarly, TF values for both pollutants were lower in birch trees than in pine trees (Table 4). These results suggest that the birch trees behaved as As and Sb excluders, compared with pines and oaks. The absence of reported data on As and Sb accumulation capacity of birch trees prevented us from supporting this hypothesis. The pine As values found at the Ouche site were equivalent tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 to those found by Pratas et al. (2005) in a related species, the maritime pine (Pinus pinaster Aiton). On the other hand Sb concentrations in the pines of the Ouche site were a hundred times higher than those found in maritime pines by Pratas et al. (2005). The two bulrush species presented similar accumulation patterns for As and Sb: they appeared to be rhizo-accumulators characterized by very high RAC values. Comparatively, low amounts of the pollutants were found in their shoots, hence their low TF values (Tables 35). Our accumulation values were different from those obtained previously by Freitas et al. (2004) in which As accumulation in the roots of the two bulrushes was only 8.5 mg As kg -1 DW and 23.5 mg As kg-1 DW, respectively, in a soil contaminated at approximately 200 mg As kg-1. The common broom and plantain specimens, like the birch trees presented low amounts of both As and Sb in their roots and leaves (Tables 3-5). Plantago lanceolata, a related species, has previously been described as an antimony hyper-accumulator (Baroni et al. 1995). Cytisus sp., on the other hand, has been described as a poor antimony accumulator (Murciego et al. 1995). Among the Poaceae specimens, Agrostis, Bromus and Camalagrostis responded similarly to the pollutants with relatively high amounts of both As and Sb in the roots (hence their elevated RAC values) and low amounts in the leaves (hence their low TF values). Agrostis tenuis and Bromus sp. were both previously identified as a hyper-accumulators of arsenic and nickel, with reported plant levels up to 3470 mg As kg-1 DW and 1467 mg Ni kg-1 DW (Porters and Peterson 1975; Freitas et al. 2004). The other Poaceae specimen Deschampsia had higher TF values than the formers (Table 4). Meharg and Macnaire (1991) concluded that this species was tolerant to As due to a poor arsenate influx. 165 Chapitre III The clover specimen stood out against all other herbaceous individuals with comparatively higher As and Sb contents in all three organs tested, particularly in the leaves (Table 3). As a result, it showed high TF and RAC values (Tables 4 and 5). No other reported data was found on clover potentials as phytoaccumulators. tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Table 4: Translocation factor (TF) for As and Sb Specie Pinus sylvestris Betula pendula Quercus pubescens Juncus effusus Luzula sylvatica Cytisus scoparius Trifolium sp. Plantago major Agrostis sp. Bromus sp. Camalagrostis sp. Deschampsia flexuosa TF for As 0.66±0.20 0.32±0.13 0.47 0.09±0.03 0.09 1.01 1.17 0.20 0.13 0.04 0.08 0.48 TF for Sb 0.31±0.22 0.20±0.13 0.17 0.11±0.03 0.22 0.36 2.48 0.23 0.09 0.05 0.07 0.36 Table 5. As and Sb root accumulation coefficients (RAC; mg kg -1) for the plants growing at the Ouche mining site. Values were determined as As or Sb root concentration relative to projected plant-available As or Sb concentrations in the tailings. Projected concentrations were obtained using reported percentages of plant-available As and Sb in soils, 2.7% and 2.1% respectively. Species Pinus sylvestris Betula pendula Quercus pubescens Juncus effusus Luzula sylvatica Cytisus scoparius Trifolium sp. Plantago major Agrostis sp. Bromus sp. Camalagrostis sp. Deschampsia flexuosa projected RACAs 4.0±1.6 2.1±1.1 4.1 26.6±8.7 34 1.8 11.1 2.2 9.3 14.1 5.94 5.6 projected RACSb 9.1±5.2 1.3±0. 6 8.5 5.7±0.3 5.8 0.25 1.9 1.4 2.1 4.5 2.5 1.3 166 Chapitre III 3. Discussion and conclusion Our study clearly shows that the four platforms of the Ouche mining site are homogenously contaminated with high levels of arsenic and antimony. Furthermore, these contaminants were poorly mobile over a 0.5m-deep profile, confirming previous studies (Edwards et al. 1995). This suggests a low for drainage of the pollutants into ground waters. As is generally the case in tailings material, the Ouche mine tailings present characteristics hardly compatible with the development of a vegetation cover (Wong et al. 1998; Krzaklewski and Pietrzykowski 2002; Ye et al. 2002): their contents in phytotoxic As and Sb exceeded reported soil plant toxicity levels, they hardly contained any organic matter and were extremely acidic, with pH values far below the optimal plant growth range of pH 5.0 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 to 7.5 (Marschner, 1995). Yet we found plants were established on this site. Its poor floral biodiversity suggested that only a selected number of plant species had the capacity of adapting to this environment. Therefore, we set out to assess the potentials of all represented species as phytostabilizers. General attributes of plant species used in this context are adaptability and tolerance to the pollutant(s) and poor accumulation capacities, particularly in the shoots (Tordoff et al. 2000; Mendez et al. 2007). Some plants being perennials and the other well advanced into their development cycle at the time of the inventory, it is most likely that they all were adapted to this harsh environment. One exception is the downy oak that was not observed at an adult stage. Considering that plants growing on non contaminated soil accumulate between 0.0001 and 0.2 mg kg -1 of arsenic and between 0.01 and 1.5 mg kg-1 of antimony (Bowen 1979), it appears that all the plants of the site were slightly contaminated overall. However, separate analyses for the root and the shoot systems showed that with the exception of the two legume specimens (Trifolium sp. and Cytisus scoparius) and the Poaceae specimen Deschampsia flexuosa, all other plants were mostly root accumulators. Among these, various accumulation capacities were observed: some species stood out as hyper-root accumulators like Pinus sylvestris, the Poaceae plants (minus Deschampsia flexuosa) and mostly the two bulrushes Luzula sylvatica and Joncus efuses. Others, like the birch trees, Plantago major and Deschampsia flexuosa responded by limiting accumulation of both As and Sb. Phytostabilization requires that plants with poor root to shoot translocation factors are established on the sites being reclaimed (Cunningham et al. 1995). According to this, the pine trees of the Ouche site should be eliminated and only the birch trees should be maintained on 167 Chapitre III site. To complete the covering of the tailings, it is conceivable to use the local lines of Plantago and Deschampsia since they were the most outstanding herbaceous excluders for the two pollutants. However, the establishment of the plant cover would most likely strongly benefit from amendments to reduce tailings acidity. Over As and Sb contents, acidity could well be the main parameter impeding plant growth. Since metal accumulators are exceptions rather than the rule, it is absolutely essential to carry follow-up investigation on the potential of the Ouche bulrushes Luzula sylvatica and Joncus efuses in rhizofiltration settings. As for clover and pine trees, their high As and Sb accumulation capacities could become useful for phytoextraction purposes. Acknowledgements tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 This work was supported by Agence de l‘Environnement et de la Maîtrise de l‘Energie (convention n°0772C0044). References Baroni, F., Boscagli, A., Di Lella, L. A., Protano, G., Riccobono, F., 2004. Arsenic in soil and vegetation of contaminated areas in southern Tuscany (Italy). Journal of Geochemical Exploration 81: 1-14. Baroni, F., Boscagli, A., Protano, G. and Riccobono, F., 2000. 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Chemosphere tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 47:1103–1111. 170 Chapitre III Données complémentaires: tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Photographies illustrant l’ancien site minier d’Ouche (Cantal, France) Figure 13 : Première plateforme (juin 2009). Le paysage a visiblement été modelé par les activités des moto-crosseurs. Figure 14 : Wagonnet, témoin des anciennes activités minières du site. 171 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Chapitre III Figure 15 : Ilot de végétation en majorité constitué de Pins sylvestres. Figure 16 : Wagonet partiellement enfoui sous les sédiments contaminés par les moto-crosseurs. 172 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Chapitre III Figure 17 : Photographie des sédiments contaminés à l’arsenic et à l’antimoine. 173 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Chapitre III 174 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 PROJET D’ARTICLE N°6 Ef f e t s d u v e r de t e r re Ap o r r e c t o d e a c a l i g i n o s a s ur l a p h y t o e x t r a c t i o n d e l ’ a r s e n i c e t d e l ’ a n t i mo i n e p a r l a pl a nt e A r a b i d o p s i s t ha l i a na 175 176 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Chapitre III -Avant proposCe travail fait l‘objet d‘un article en cours de rédaction intitulé : « Réponses physiologiques de la plante Arabidopsis thaliana à l‘interaction entre vers de terre et polluants métalloïdiques (arsenic et antimoine). Cet article sera soumis à la revue scientifique « Journal of Environmental and Experimental Botany ». Les expériences présentées dans le chapitre II ont montré que les vers de terre pouvaient augmenter les capacités d‘absorption d‘Arabidopsis thaliana, notamment pour le phosphate et le fer, en stimulant l‘expression de gènes codant des transporteurs à haute affinité pour ces éléments. Nous avons utilisé les sédiments miniers du site d‘Ouche comme source pour ces deux métalloïdes. A l‘heure actuelle, les mécanismes moléculaires responsables de tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 l‘absorption de l‘antimoine n‘ont pas été caractérisés. En revanche, les transporteurs du phosphate semblent impliqués dans l‘absorption des ions arsénites. De ce fait, il apparaît donc possible que les vers de terre puissent influencer la phytoextraction de ces éléments et plus particulièrement celle de l‘arsenic. L‘objectif de cette expérience est d‘étudier les propriétés phytoextractrices d‘Arabidopsis en réponse au ver Aporrectodea caliginosa pour deux éléments non essentiels à sa croissance. Des mesures physiologiques sont également effectuées sur les plantes soumises aux polluants. Arabidopsis thaliana n‘étant pas une espèce métallophyte, elle ne parvient pas à se développer sur les sédiments miniers d‘Ouche, trop fortement contaminés en arsenic et en antimoine. Ceux-ci sont donc dilués avec le substrat dépourvu d‘arsenic et d‘antimoine utilisé dans les expériences précédentes : le cambisol sableux de Fol-Juif. Lors d‘expériences préliminaires, la capacité d‘Arabidopsis à pousser sur différentes dilutions de sédiments pollués a donc été évaluée. La dilution 25% (c'est-à-dire celle combinant 25% de sédiments pollués et 75% du cambisol sableux, m/m) apparaît comme optimale pour observer les effets des polluants sur les plantes tout en permettant une bonne croissance de la plante et limiter la mort des vers de terre. Expérimentation Deux types de substrats de culture ont été introduits dans les microcosmes : le cambisol sableux de Fol-Juif et les sédiments miniers contaminés à l‘arsenic et à l‘antimoine (150 mg As kg-1 et 500 mg Sb kg-1), dilués dans le substrat de Fol-Juif. Quatre traitements sont mis en place avec ces substrats : 177 Chapitre III - substrat non pollué + Arabidopsis thaliana (traitement C) - substrat non pollué + Arabidopsis thaliana + vers de terre (traitement CE) - substrat pollué + Arabidopsis thaliana (traitement P) - substrat pollué + Arabidopsis thaliana + vers de terre (traitement PE) Chaque traitement inclut 9 réplicats biologiques. Les plantules d‘Arabidopsis sont repiquées dans les microcosmes six jours après leur germination. Le remplissage des microcosmes avec les deux substrats, leur réhydratation et l‘introduction des vers de terre s‘effectue un mois avant le repiquage des plantules. Les unités de culture sont ensuite déposées dans une chambre phytotronique et l‘humidité des substrats est maintenue à 80% de la capacité au champ. Un suivi phénologique est assuré dès le repiquage des plantules : le diamètre des rosettes tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 des plantes d‘Arabidopsis puis la hauteur de leurs hampes florales sont mesurées trois fois par semaine. Les réponses physiologiques à la présence des vers de terre et des polluants sont évaluées par différents paramètres tels que la fluorescence foliaire, les échanges gazeux, les teneurs relatives en eau et les concentrations foliaires en chlorophylles totales. A la fin de leur cycle, les plantes d‘Arabidopsis sont récoltées, séchées et pesées. Les concentrations en arsenic et en antimoine de chaque organe (racines, feuilles, tiges et graines) sont déterminées par un spectromètre à absorption atomique dans un four graphite. Résultats et discussion La présence d‘antimoine et d‘arsenic dans le substrat de culture retarde très fortement la croissance et le développement des plantes d’Arabidopsis thaliana. En effet, comparé aux plantes cultivées sur le substrat exempt de polluant, les plantes d‘Arabidopsis du traitement P forment leur bourgeon floral avec 30 jours de retard, soit 68 jours après leur transfert dans les microcosmes. De façon surprenante, les vers de terre accentuent ce retard, puisque les plantes cultivées en leur présence présentent un délai supplémentaire de 10 jours comparativement aux plantes du traitement P. Cependant, après cette longue phase végétative, les plantes du traitement P reprennent une croissance identique à celle des plantes témoins : aucune différence significative n‘a été constaté pour le diamètre maximal des rosettes (c'est-à-dire le diamètre mesuré lors de l‘apparition du bourgeon floral) entre les traitements C et P, ni pour la hauteur maximale des hampes florales mesurées à la fin du cycle des plantes d‘Arabidopsis. En revanche, la croissance des plantes du traitement PE reste affecté jusqu‘à la fin du cycle : 178 Chapitre III la taille maximale de la rosette est diminuée de 33% par rapport aux plantes du substrat exempt de polluant et la hauteur des hampes florales de 60%. Ces changements au niveau phénologique ont été accompagnés par des modifications de la production et de l‘allocation de la matière sèche. Dans le traitement P, l‘arsenic et l‘antimoine diminuent la longueur maximale du système racinaire ainsi que sa biomasse mais n‘affectent pas la biomasse aérienne des plantes. En revanche, la combinaison vers de terre/polluant s‘avère particulièrement néfaste pour les plantes d‘Arabidopsis : comme pour le traitement P, nous avons observé une forte diminution de la longueur du système racinaire et de sa biomasse, mais dans le cas présent, la biomasse aérienne est également touchée et diminue de 60% comparé aux biomasses des plantes du traitement C. Au niveau physiologique, la présence des polluants n‘a pas affecté les teneurs relatives en tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 eau. En revanche, les concentrations de chlorophylles totales ont diminué de 50% dans les deux traitements (P et PE). Il est possible que la présence des polluants ait contribué à inhiber la biosynthèse des chlorophylles (Stobart et al. 1985 ; Stiborova et al. 1986) ou à accélérer leur dégradation (Luna et al. 1994). Cependant, cette diminution de la concentration en chlorophylles ne semble pas affecter les plantes du traitement P qui, dès l‘apparition du bourgeon floral, présentent des valeurs de photosynthèse nette, de conductance stomatique et de transpiration similaires à celles mesurées chez les plantes témoins. Cette « bonne santé physiologique » est également confirmée par les mesures de fluorescence foliaire : le rapport Fv/Fm, qui traduit l‘efficacité photochimique du photosystème II, reste supérieur à 0,80 tout au long du cycle et le rapport Fv/Fo, qui est un indicateur de la capacité photosynthétique (Vernay et al. 2007), n‘est pas significativement différent de celui mesuré dans les plantes du traitement C. En plus des modifications phénotypiques, la physiologie des plantes d‘Arabidopsis du traitement PE est également affectée par la présence de l‘antimoine et de l‘arsenic. La photosynthèse nette reste 20% en dessous des valeurs mesurées pour le traitement P et 50% en dessous des valeurs mesurées chez les plantes du traitement CE. De même, le rapport Fv/Fm ne cesse de décroître tout au long du cycle des plantes et passe en dessous de la valeur seuil de 0.80 dès l‘apparition du bourgeon floral. Cette diminution régulière s‘explique par une augmentation croissante de la fluorescence minimale (F0) ce qui traduit un problème dans le transfert d‘énergie des photons des antennes collectrices vers le photosystème II. Le dosage des concentrations en arsenic et en antimoine permet de mieux comprendre l‘effet délétère des vers de terre. En effet, ces analyses ont révélé une très forte augmentation de l‘accumulation des polluants comparativement aux plantes ayant poussé sans ver : les vers 179 Chapitre III de terre ont doublé l‘accumulation de l‘arsenic dans les racines (200 mg As kg -1 MS pour le traitement PE et 100 mg As kg-1 MS pour le traitement P) et ont multiplié par 4.5 celle de l‘antimoine (450 mg Sb kg-1 MS pour le traitement PE et 100 mg Sb kg-1 MS pour le traitement P). En revanche, les concentrations mesurées dans les feuilles ne sont pas influencé par leur présence et reste faible par rapport à celle mesurées dans les racines : moins de 40 mg kg-1 MS pour les deux polluants. Ainsi, le transfert des polluants vers les parties aériennes ne semblent donc pas influencer par les concentrations retrouvées au niveau des racines. Conclusion Cette expérience met donc en évidence le rôle de catalyseur qu‘ont les vers de terre pour tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 les processus de phytoextraction. L‘accumulation de cette grande quantité de polluant a probablement entraîné des phénomènes de compétition avec des éléments essentiels, notamment le phosphore dont la structure est analogue à celle de l‘arsenic, ce qui a pu affecter de façon indirecte la croissance et les paramètres photosynthétiques des plantes d‘Arabidopsis (Prasad et Strzalka 2002). Il apparaît désormais nécessaire de tester l‘effet du ver Aporrectodea sur des espèces hyperaccumulatrices telles que par exemple la fougère hyperaccumulatrice d‘arsenic, Pteris vittata, afin de vérifier la validité et l‘universalité de ce modèle. 180 Chapitre III 1. Introduction Since the beginning of the Industrial Revolution, industrial and mining activities have contributed to soil pollution (Tordoff et al., 2000). In France, at the end of the year 2008, 4033 contaminated areas have been listed: 41% by hydrocarbons, 18% by acyclic hydrocarbons, 18% by lead and the last 23% are essentially contaminated by other metallic pollutants. In the region Auvergne (France), there are several antimony abandoned open mine sites contaminated with antimony and arsenic that present risks for human health and the environment (Smith and Bradshaw, 1972). As the volume of contaminated material is huge, the cost for the transport and chemical treatments are too high. As a result, alternative techniques like phytoremediation appear to be reasonable methods for the reclamation of tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 these sites (Flathman and Lanza, 1988). However, phytoremédiation takes times and is often limited by the biomass of the plant and the pollutant content they are able to accumulate. In this context, earthworms appear as potential catalysts of plant accumulation and biomass production. It is now well known that earthworms affect plant growth and biomass. First, they are involved in soil formation, accelerate mineralization of humic matter and increase nutrient availability (Lee, 1985). Moreover, they have been shown to enhance plant nitrogen content (Quaggiotti et al., 2004) and to affect positively the expression of several nutrient transporters. As a result, they often inoculated into degraded sites (Butt 1999). Moreover, few studies have shown that earthworms, Aporrectodea caliginosa, enhanced heavy metal availability for other invertebrates (Coeurdassier et al. 2007) and was able to enhance (Stephens et al., 1994) or to decrease (Zorn et al., 2005) heavy metal bioavailability for plants. In the present study, the effect of the earthworm Aporrectodea caliginosa has been tested on arsenic and antimony accumulation and resulting physiological impact on Arabidopsis thaliana has been studied. 2. Materials and methods 2.1 Soil characteristics Two substrates were used for the experiments. The first one was collected from the top layer of a sandy cambisol at the Centre de Recherche en Ecologie Expérimentale et Prédictive - CEREEP (Saint-Pierre-Lès-Nemours, France) and presents a pH of 5.88. The second one is 181 Chapitre III a mix with 75% of the sandy cambisol substrate and 25% of sediments highly contaminated with arsenic and antimony collected at the Ouche mining site (Ouche, Cantal, France). It contains at the beginning of the experiment 500 mg Sb kg-1, 150 mg As kg-1 and a pH of 4.39. 2.2 Earthworms Aporrectodea caliginosa of similar size with a well developed clitellum were chosen. In all earthworm treatments, approximately 1.7 g of worms (around four animals) were added to microcosms four weeks prior to the introduction of the plants (d0). Control microcosms (without earthworm) also were prepared and incubated for four weeks before d0. 2.3 Plant growth tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Arabidopsis thaliana (L.) Heynh ecotype Columbia seeds were germinated in Petri dishes containing the sandy cambisol. When cotyledons were fully open (six days after germination), plantlets were transferred individually to microcosms. Plant growth was carried out under controlled conditions (Conviron growth chamber, Canada): 20±1°C and 18±1°C day and night temperatures, 70% ± 5% relative humidity, 200 mol m-2 s-1 PPFD for 10 h per day. 2.4 Plant treatments Arabidopsis plantlets were transferred to different types of microcosms containing the sandy cambisol substrate with (treatment CE) or without earthworms (treatment C) or the mix between the cambisol and the sediments of the mining site with (treatment PE) or without earthworms (treatment P). Nine replicates were set up for each treatment combination. For both substrates, additional ―no-plant‖ control microcosms were set up (with or without earthworms). Three replicates were set up for each control. The distribution of the microcosms in the growth chamber was randomized and changed after each biweekly watering. 2.5 Photosynthetic and gas exchange measurements These experiments were carried out at three stages of the plant development: one week before the floral bud formation, at floral bud formation and one week after. For each treatment, three fully expanded leaves of similar age were selected for the measurement of net photosynthesis (PN), stomatic conductance (gs), evaporation (E) and internal concentration of CO2 (Ci). A portable photosynthesis measuring system CIRAS-II (PP System, Hitchin, UK) 182 Chapitre III was used in these experiments. A/Ci curves were established by measurement of the PN response to CO2 increase by step changes under 1500 µmol (photon) m-2 s-1 in the CO2 concentration with the narrow leaf assimilation chamber fitted with the CFM. The data of the Pn/Ci curves were used to estimate the maximum rate of carboxylation (Vc), the maximal electron transport rate (J max) and the dark respiration (Rd) using the model proposed by Farquhar et al. (1980) and modified by Sharkey et al. 2007. Leaf fluorescence measurements were performed on three attached leaves of three plants per treatment (n=9) using a plant efficiency fluorimeter (FMS1, Hansatech Instruments Ltd, UK). Before measurements, leaves were dark adapted for thirty minutes with leaf clips. Initial fluorescence (F0), maximal fluorescence (Fm), variable fluorescence (Fv) and the ratios Fv/Fm and Fv/F0 were determined according to Hansatech protocol. tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 All gas exchange and fluorescence measurements were made between 10.00 and 16.00 hour (i.e. two hours after light on in the growth chamber). 2.6 Chlorophyll content The chlorophyll content index (CCI) was determined with a portable chlorophyll meter (Optiscience, Japan). CCI data correspond to an average of three measurements on each leaf. Three plants per treatments and three leaves of each plant (n=9) were analysed. The sensor head was inserted on mesophyll tissue only, avoiding the major veins and all the damage areas. A standard curve (figure 1) was established in order to convert the CCI values into total extractable chlorophyll content per leaf area. The CCI was first determined for twenty two leaves of A. thaliana. Immediately after measurements, a disk, with a diameter similar to sensor diameter, was taken out from the area of CCI measurements on each leaf. The disk was then ground in the dark at 4°C with a mortar and a pestle and the chlorophyll was extracted in an 80% acetone solution (v/v). The absorbance of the chlorophyll solution was estimated with a spectrophotometer at 645 and 663 nm and the total chlorophyll content (chlorophyll a and b) was calculated using the method of Arnon (1949). 183 Chapitre III 40 y = 0,298x - 0,129 R² = 0,900 35 30 CCI 25 20 15 10 5 0 0 20 40 60 80 100 Total extractable chlorophyll (µg cm-²) Figure 1: Linear regression of chlorophyll content index (CCI) vs. total extractable chlorophyll (µg cm-²) in 22 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Arabidopsis thaliana leaves 2.7 Leaf water content Leaf relative water content was determined as (FW-DW)/(TW-DW) ×100, where FW is the fresh weight, DW is the dry weight and TW is the turgid weight of leaf tissues as measured after equilibration in deionised water during 24 hours, in the dark, at 4°C. 2.8 Determination of biomass production and of arsenic and antimony concentrations in plants For each treatment, plant biomass analysis was carried out on three of the nine replicates. Dry weight and maximal length of floral stems and roots were determined at the end of the plant cycle (two months after transfer of the seedlings to the microcosms for the non polluted substrate and three months for the plant cultivated on arsenic and antimony enriched substrate. Roots were washed to remove soil particles. Plant samples (0.1g) were ground and mineralized by addition of 2 mL of suprapur nitric acid (65% m/v; Merck, France) and heated at 220°C for 72 hours. Then, 1 mL of hydrogen peroxide (30% v/v; Merck, France) was then added and the solution heated (220°C) for a new 24 hours period. A nitrate-nickel modifier was added to the mineralized samples before analysis with a graphite furnace atomic absorption spectrometry (Unicam 989 QZ spectrometer, see Table 1 for furnace programming). 184 Chapitre III Table I: Atomic absorption spectrometry furnace parameters for arsenic and antimony analyses. Drying Temperature (°C) Ramp time(s)) Hold time (s) Gaz flow (L/s) Read 100 4 a /5 b 30 0.2 - 10 0.2 - a b a Vaporisation 1000 /1200 Atomization 2700 a /2500 b 3 0 + Cleaning 2900 a /2700 b 3 0.2 - a 140 /150 b for arsenic determinations, b for antimony determination. 2.9 Arsenic and antimony contents in the substrates Arsenic, antimony and pH in soils were determined by the ‗Laboratoire d‘Analyse des Sols‘ (LAS, INRA Arras, France). Total arsenic contents were determined by hybrid tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 generation atomic absorption spectrometry (HG-AAS). Total antimony contents were determined by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS). Other elements were determined by inductively coupled plasma atomic emission spectrometry (ICP-AES). 2.10 Determination of parameters related to phytoextraction In order to evaluate the plant ability to concentrate the pollutants in root system, the bioconcentration rate was calculated as the ratio between the pollutant concentration into the roots and the pollutant concentration in the soil. The translocation factor is defined as the ratio between pollutant in shoot and in root. 3. Results 3.1 Arsenic and antimony content in the polluted substrate Despite the dilution of the mine tailings with an uncontaminated soil, the resulting mixture still contained high levels of both arsenic and antimony compared with agricultural soils (Table II). In addition, the pH value of this mixture was relatively low (approximately 4.3). Whereas pH was stable during the experiment, arsenic and antimony contents decreased by 22% and 18%, respectively, in all treatments including the no-plant no-earthworm treatment. Neither the plants nor the earthworms had an impact on this phenomenon which could be attributed to leaching. To test a possibility of a concentration gradient in the microcosms, microcosms were divided between three layers (upper, middle and lower) that were analyzed independantly. Results show no statistical difference between the three layers. 185 Chapitre III So, the loss of arsenic and antimony was probably due to the volatilization of a part of these coumpounds and to the adsorption on the microcosms. Table II: pH values, arsenic and antimony contents in the polluted substrate at the beginning of the experiment (Initail) and at the end of the experiment (Final) in each treatment: Ps, polluted substrate alone, Ps + Ew, polluted substrate with earthworms, P, polluted substrate with plant, PE, polluted substrate with earthworms and plant. Initial pH Final Ps Ps Ps + EW P PE 4.3±0.07 4.78±0.04 4.76±0.03 4.94±0.11 4.77±0.04 As 150±10.61 117.22±13.17 Sb 129.28±4.19 116.46±11.86 117.77±16.66 500±48.08 408.11±49.34 431.44±16.84 398.33±42.35 399.70±42.35 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Each value represents mean of three replicates ±SD. 3.2 Accumulation of As and Sb in Arabidopsis plants As and Sb accumulation occurred mostly in the plant roots (Table 3). In addition, As and Sb root accumulation increased a 2.2-fold and a 4.2-fold, respectively, in the presence of the earthworms, as compared with the treatment P. As a result, bioconcentration rates (BR) determined at the end of the plants development cycles were higher with the earthworms (Table 3). The fact that the values were over 1 suggested that the root contents in As and Sb were higher than those in the substratum. Compared to roots, leaves accumulated on average 6-times less of both pollutants than the roots. In addition, earthworms had no impact on leaf accumulation levels (Table 3). As a result, translocation factors (TF) were lower in the presence of the earthworms. In bolts and seeds, the amounts of both As and Sb were just above technical detection limits (Table 3). 186 Chapitre III Table III: Arsenic and antimony concentration (mg kg-1 dry weight) in Arabidopsis thaliana grown on a polluted substrate with or without earthworms. Data shown are the mean of three plants ± SD. Treatment P As Treatment PE Sb As Sb Roots 88.33±5.03 110.67±14.74 190.67±73.52 477±163.40 Leaves 20.00±10.39 25.67±13.32 22.33±14.74 43.33±24.13 Bolts 2.00±1.00 2.33±0.58 2.00±0.00 2.43±1.12 Seeds 3.33±0.58 3.90±0.17 3.00±1.41 3.8±0.28 Translocation factor 0.23 0.23 0.12 0.09 Bioconcentration rate 0.51a/0.75b 0.21a /0.28b 1.12 a/1.62b 0.89 a/1.19b Each value represents mean of three replicates ±SD.a indicates the BCR calculated from concentration values found in the initial soil. b indicates the BCR calculated from concentration values found in the soil at the end of tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 the experiment. 3.3 Effects of earthworms and As/Sb on Arabidopsis growth and development Plants grown in the uncontaminated substratum with earthworms performed better than their no-earthworms counterparts in terms of rosette diameter, bolt length and overall biomass production (Fig. 2 and 3; Table 4). The presence of As and Sb in the substratum seriously delayed leaf growth. Rosette diameter remained under 40 mm for 40 days after transfer to the microcosms (DAT). Beyond 40 DAT, rosette enlargement rate increased to the level observed in the no-pollutant controls 40 days earlier (Fig. 2). The presence of earthworms increased the duration of the lagging period from 40 DAT to 60 DAT. In addition, rosette enlargement rate and final rosette diameter remained well inferior (by 33% approximately) to those observed in the other plants (Fig. 2). 187 Chapitre III Control 160,00 Earthworms Polluted substrate 140,00 Polluted substrate + earthworms rosette diameter (mm) 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Days after transplanting tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Figure 2: Effects of earthworms and As/Sb polluted substrate on rosette diameter of Arabidopsis thaliana. Grey triangles indicate control treatment (100% soil, no earthworm), grey circles: earthworm treatment (100% soil), black triangles: polluted substrate (50% soil and 50% As/Sb tailings, no earthworm) and black circles: polluted substrate (50% soil and 50% As/Sb tailings) with earthworms. Data shown are the mean of three plants ±SD. The measures were stopped at the apparition of the floral bud As and Sb affected Arabidopsis development by delaying floral transition by approximately 30 days, as compared to the no-pollutant controls (Fig. 3). As was observed with leaf growth, the plants that formed floral meristems showed bolt elongation rates equivalent to those found in the no-pollutant controls. The presence of earthworms increased the lagging period before floral bud development by 50 days, as compared to the no-pollutant controls (Fig. 3). As was the case with leaf growth, they reduced both bolt elongation rate and bolt final length (Fig. 3). Changes in plant phenology imposed by the pollutants were accompanied by changes in biomass production and biomass allocation patterns. As and Sb reduced root biomass and maximal root length but not shoot biomass at the end of the plant cycle (Table 4). Earthworms induced a reduction in maximal root length and root biomass production in the treatment CE. In plants exposed to both the earthworms and the pollutants (treatment PE), an additive effect on root development was observed and those plants ended up with small reduced root systems (Table 4). However, it is on the above-ground biomass production that the combined effects of earthworms and pollutants were mostly detrimental, with a 60% reduction in comparison with the treatment C. 188 Chapitre III Control Earthworms Polluted substrate 700 Polluted substrate + earthworms Length of the bolt stems 600 500 400 300 200 100 0 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 Days after transplanting tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Figure 3: Effects of earthworms and As/Sb polluted substrate on the length of the bolt stems of Arabidopsis thaliana. Grey triangles indicate control treatment (100% soil, no earthworm), grey circles: earthworm treatment (100% soil), black triangles: polluted substrate (50% soil and 50% As/Sb tailings, no earthworm) and black circles: polluted substrate (50% soil and 50% As/Sb tailings) with earthworms. Data shown are the mean of three plants ±SD. The measures were stopped at the apparition of the floral bud. Table IV: Variations in different morphological characteristics: maximal root and shoot length, root and shoot biomass and total biomass of Arabidopsis thaliana grown in an unpolluted substrate (C), in an unpolluted substrate with earthworms (CE), in a polluted substrate (P) and in a polluted substrate with earthworms (PE). The means of these analysis (n=3) and s.e.m. are presented. Different letters within a line indicate a significant difference at P=0.05 with the student t-test. Parameters Root length (cm) Root biomass (g plant-1) Shoot length (cm) Shoot biomass (g plant-1) Total biomass (g plant-1) Control Earthworms Polluted substrate 19.5±1.50 a 11±1.73 b 14.25±1.06 c 0.65±0.27 a 0.27±0.11 b 0.48±0.17 a,b 49.50±1.50 a 55.67±2.65 b 46±7.7 a 0.75±0.05 a 1.42±0.05 b 0.71±0.13 a 1.40±0.24 a 1.69±0.16 a 1.19±0.04 a Polluted substrate + earthworms 9.65±0.48 d 0.21±0.05 b 21.5±3.54 c 0.30±0.04 c 0.51±0.01 b 3.4 Water status RWC values were comprised between 75% and 95% all treatments considered. No particular trend was observed (figure 4). 189 Chapitre III Control Earthworms Polluted substrate Polluted substrate + earthworms Leaves relative water content 120 110 100 90 80 70 60 30 35 40 45 50 Days after transplanting Figure 4: Effects of earthworms and As/Sb polluted substrate on the relative water content of Arabidopsis tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 thaliana. Grey triangles indicate treatment C(100% soil, no earthworm), grey circles: treatment CE (100% soil), black triangles: treatment P (50% soil and 50% As/Sb tailings, no earthworm) and black circles: treatment PE (50% soil and 50% As/Sb tailings). Data shown are the mean of three plants ±SD 3.5 Total chlorophyll content Without pollutant, the plants showed maximal chlorophyll contents (just over 80 µg cm -2) were observed around the time of floral induction (Fig. 6). They remained unchanged until about 58 DAT when monocarpic senescence developed. Earthworms seemed to delay senescence-related losses in chlorophyll contents (Fig. 6). The presence of As and Sb strongly reduced leaf chlorophyll contents. Regardless of the presence of earthworms, the pollutants limited leaf chlorophyll contents to approximately 30 µg cm -2 (Fig. 6). 190 Total extractable chlorophylls in µg cm-² Chapitre III Control Earthworms Polluted substrate Polluted substrate + earthworms 120 100 80 60 40 20 0 38 48 58 Days after transplanting 68 Figure 5: Effects of earthworms, antimony and arsenic on chlorophylls content in Arabidopsis thaliana. Grey tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 triangles indicate control treatment (100% soil, no earthworm), grey circles: earthworm treatment (100% soil), black triangles: polluted substrate (50% soil and 50% As/Sb tailings, no earthworm) and black circles: polluted substrate (50% soil and 50% As/Sb tailings) with earthworms. Data shown are the mean of three plants and three leaves per plant ± SD 3.6 Chlorophyll fluorescence The measurements of chlorophyll a fluorescence parameters characterizing the photochemical activity of the Arabidopsis grown in the free pollutant substrate and in the As/Sb contaminated substrate are summarized in figure 4. Measurements were realized seven days before the floral bud apparition, at the floral bud apparition and seven days after the floral bud apparition. Chlorophyll fluorescence was measured before floral transition (7 days prior to floral bud development), upon floral bud development and seven days later, in the four treatments (Figure 6). The plants were differing in age but at similar developmental stages. Fv/Fm ratios, which is the PSII photochemical efficiency in the dark adapted state with fully open PSII, were lower in the plants exposed to the pollutants. However, they were the lowest for the plants exposed to both the pollutants and the earthworms (Fig. 5) due to a strong increase of the minimal fluorescence (Fo) forward the culture duration. On the other hand, plants exposed to earthworms without pollutant had the highest Fv/Fm ratios. The variable chlorophyll fluorescence ratio (Fv/F0), known as a good indicator of changes in the rates of photosynthetic conversion (Maxwell and Johnson 2000; Vernay et al. 2007), varied with the treatments like the Fv/Fm ratio: treatment CE > treatment C > treatment P > treatment PE (Fig. 5). 191 Chapitre III 1700 260 1600 250 1500 240 1400 Fm Fo 270 Control Earthworms Polluted substrate Polluted substrate + earthworms 230 1300 220 1200 210 1100 200 1000 0,86 Control Earthworms Polluted substrate Polluted substrate + earthworms 0,82 0,80 0,78 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 0,76 Fv/F0 Fv/Fm 0,84 6,50 6,00 5,50 5,00 4,50 4,00 3,50 3,00 2,50 Control Earthworms Polluted substrate Polluted substrate + earthworms Control Earthworms Polluted substrate Polluted substrate + earthworms Figure 6: Effects of earthworms and antimony and arsenic on minimal fluorescence level (Fo), maximal fluorescence level (Fm), maximum quantum yield of photosystem II (Fv/Fm) and ratio of variable to minimal fluorescence (Fv/Fo) in Arabidopsis thaliana. Grey triangles indicate control treatment (100% soil, no earthworm), grey circles: earthworm treatment (100% soil), black triangles: polluted substrate (50% soil and 50% As/Sb tailings, no earthworm) and black circles: polluted substrate (50% soil and 50% As/Sb tailings) with earthworms. Data shown are the mean of three plants ±SD. The measures were done 7 days before the floral bud formation, at the floral bud apparition and 7 days later 3.7 Photosynthetic activity and gas exchange measurement As described for chlorophyll fluorescence measurements, net photosynthesis and gas exchange were measured on plants of similar development, at three time points: before floral transition (7 days prior to floral bud development), upon floral bud development and seven days later. In all plant treatments, net photosynthesis, stomatal conductance and leaf transpiration values were maximal at the time of the development of floral buds, with overall average values of 21, 261 and 1.9 µmol.m-2.s-1, respectively. Their subsequent decrease probably resulted from senescence-related processes. Among treatments and regardless of the time point, net photosynthesis, stomatal conductance and leaf transpiration values systematically ranked in the following order: treatment CE > treatment CE > treatment P > treatment PE (Table 4). 192 Chapitre III Table IV: Photosynthetic parameters determining by the A/Ci curves: rate of photosynthesis (Pn), stomatal conductance (Gs), transpiration rate (E), the maximum rate of carboxylation (Vc max), the PAR saturated rate of electron (Jmax) and the dark respiration rate (Rd). Pn (µmol.m-2.s-1) Gs (µmol.m-2.s-1) E (µmol.m-2.s-1) 2 -1 Pn (µmol.m- .s ) Gs (µmol.m-2.s-1) E (µmol.m-2.s-1) tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Pn (µmol.m-2.s-1) Gs (µmol.m-2.s-1) E (µmol.m-2.s-1) 7 days before the apparition of the floral bud C CE P 14.97±0.42 23.37±1.07 8.43±0.21 211.33±9.29 174±1 161.67±17.24 1.81±0.07 1.75±0.02 1.81±0.07 Apparition of the floral bud C CE P 21.27±0.93 31.17±0.06 18.73±0.15 248±1 382.67±1.53 249±18.68 1.99±0.06 2.45±0.06 2.00±1.03 7 days after the apparition of the floral bud C CE P 13.03±0.46 17.93±0.25 14.5±0.46 112.33±0.58 132.67±0.58 148.33±0.01 1.76±0.02 1.95±0.006 1.44±0.01 PE 6.1±0.36 70.33±4.93 0.64±0.05 PE 14.27±0.12 164.67±2.08 1.31±0.006 PE 12.1±0.26 106±0 1.25±0.02 Each value represents mean of three replicates ±SD. 4. Discussion In this study, the model system using the earthworm Aporrectodea caliginosa and the plant Arabidopsis thaliana, previously described in Jana et al. (2009) was used to determine the potential effects of earthworms on arsenic and antimony uptake by plants and the impact on some physiological characters. Arsenic and antimony have considerably delayed growth of Arabidopsis plants, that was by earthworms. After 30 days for the treatment P and 60 days for the treatment PE, the Arabidopsis recovered a growth rate similar to those observed in the non polluted substrate. This belated resumption is probably due to an immobilization, probably by root exudates, of all the arsenic and antimony available compounds. Following this hypothesis, the increased lag phase induced by earthworms would result from a positive effect of them on the toxic elements availability. It has been previously reported that following earthworm activity, the bioavailability of several heavy metals such as Zn, Pb, Fe, Cr and Co is changed significantly (Devliegher and Verstraete 1996; Ma et al. 2002; Abdul Rida 1996). Moreover, the elevated As and Sb concentration found in the root system of the treatment PE Arabidopsis agree with this hypothesis since these plants accumulated two and six times more arsenic and antimony respectively compared to their counterparts grown without earthworms (treatment P). Similar results were obtained on wheat with a range of trace metallic elements (Wen et al. 2004) with a greater accumulation of these elements in the root system when the earthworms Eisenia 193 Chapitre III fetida were present. Authors explained these observations by an enhancement of the water soluble forms of heavy metals. The root uptake of As and Sb is an active process and tranfert occurred since the two pollutants are also found into the aerial parts. Moreover, the presence of earthworm seems to boost the uptake machinery as the As and Sb concentration in the roots are higher than those found into the soil. Nevertheless, in the two treatment (P and PE), the content of As and Sb was always higher in the roots than in the shoots of Arabidopsis plants. This study has shown that arsenic and antimony once absorbed by the roots are poorly translocated and remained in the subterranean parts. These results agree with litterature since arsenic is known to be mainly stored in roots of plants: Quaghebeur and Rengel (2004) calculated that less than 3% of the arsenic in the plant was stored in the aerial parts. Another study using 46 plant species showed tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 that the translocation factor ranged between 0.01 and 0.09 (Raab et al. 2007). Zhao et al. (2008) proposed that the arsenate is rapidly reduced in arsenite, which is bound to phytochelatine and sequestred into the vacuole. The As and Sb in the substrate probably induced a competition for root assimilation and translocation with other essential elements that may affect indirectly the growth and the photosynthetical parameters (Prasad and Strzalka 2002). It can be pointed out that, regardless of the presence of earthworms, the two pollutants led to a significant decrease of the total chlorophyll content. However, despite this decrease, the fluorescence and the net photosynthesis were just slightly reduced in the treatment P whereas these parameters were strongly reduced with the earthworms by the formidable enhancement of As and Sb uptake. To conclude, our results showed that earthworms and especially Aporrectodea caliginosa can potentially be used in phytoremédiation as they considerably enhanced arsenic and antimony uptake by the plant. However, it appears essential to check the effects of earthworms on an hyperaccumulator species such as Pterris vittata (Ma et al. 2001) in order to verify if at the physiological level, the plant develops enhanced abilities to support the impact of the heavy metals on its photosynthetic metabolism. Acknowledgements This work was supported by Agence de l‘Environnement et de la Maîtrise de l‘Energie (ADEME, convention n°0772C0044). 194 Chapitre III References Abdul Rida AMM (1996) Concentrations et croissance de lombriciens et de plantes dans les sols contaminés ou non par Cd, Cu, Fe, Pb et Zn: interactions sol-lombriciens. Soil Biology and Biochemistry 28: 1029-1044. Arnon DI (1949) Copper enzymes in isolated chloroplastes. Polyphenol oxidase in Beta vulgaris. Plant Physiology 21: 1-15. 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Respiration Assimilation d'O2 (µmoles/m²/s) tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Temps (jours) 40 C 35 CE 30 P 25 PE 20 15 10 5 0 24 31 42 45 49 52 56 63 69 Temps (en jours) Figure 19 : Mesure de la respiration foliaire des traitements C (substrat sans polluant), CE (substrat sans polluant + vers de terre), P (substrat contaminé à l‘arsenic et à l‘antimoine) et PE (substrat contaminé + vers de terre). 200 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Partie 4 : Conclusion générale et perspectives 201 202 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Discussion générale et perspectives Discussion générale L‘objectif de ce travail de thèse a été de mettre en place un système expérimental couplant le ver de terre Aporrectodea caliginosa et la plante Arabidopsis thaliana dans le but de tester la valeur de cette combinaison pour dépolluer des résidus miniers contaminés à l‘antimoine et à l‘arsenic. Pour cela, des études préliminaires sur deux sols exempts de polluant ont tout d‘abord été conduites afin de mieux comprendre les mécanismes généraux de l‘action des vers sur la physiologie, la phénologie et les réponses moléculaires d‘Arabidopsis thaliana. Les réponses moléculaires étudiées correspondent à des variations dans l‘expression de gènes impliqués dans la contrainte cellulaire (SOD Cu/Zn et PLDα), dans la division cellulaire (ICK1 et HBT) et dans la fixation du CO2 (RubcS). Dans les sols, l‘un des principaux effets des vers de terre étant l‘amélioration de la tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 phytodisponibilité de nombreux minéraux, d‘autres expériences ont étudié l‘effet du ver de terre Aporrectodea caliginosa sur le métabolisme du fer et du phosphate chez les plantes d‘Arabidopsis ainsi que sur l‘accumulation de plusieurs autres micro et macro-éléments dans les racines et les parties aériennes. Ces études ont ensuite été élargies à l‘impact de deux métalloïdes (As et Sb) sur la phénologie et la physiologie de plantes d‘Arabidopsis thaliana en combinaison avec le ver de terre Aporrectodea caliginosa, par l‘intermédiaire de mesures de fluorescences foliaires, d‘échanges gazeux, de teneurs en chlorophylles et en en eau dans les feuilles. 203 Discussion générale et perspectives 1. Un nouveau système expérimental bouleversant l’étude des interactions vers / plantes Dans cette expérience, deux substrats de culture aux propriétés contrastées ont été étudiés : le premier est un leptosol calcaire, riche en azote et en matière organique et le second un cambisol sableux avec de faibles teneurs tant en azote qu‘en matière organique. Alors que le phénotype des parties aériennes des plantes d‘Arabidopsis cultivées sur le substrat riche n‘a pas été influencé par la présence des vers de terre, les plantes d‘Arabidopsis cultivées sans ver de terre sur le substrat pauvre ont développé un phénotype caractéristique de plantes carencées en azote : une floraison précoce, une petite taille, une faible biomasse et un faible rendement en graines à la fin de leur cycle (Mantelin et al. 2006, Remans et al. 2006). En revanche, la présence des vers de terre a annulé ces symptômes et le phénotype tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 observé sur ces plantes est statistiquement identique à celui observé sur le substrat riche. A l‘échelle moléculaire, l‘effet positif des vers de terre sur la production de biomasse dans le substrat pauvre correspond à une diminution des transcrits ICK1 et une augmentation des transcrits PLDα. Ceci suggère que le gain de biomasse est corrélé à une stimulation de la prolifération cellulaire dans les parties aériennes (Shpak et al. 2004). Un autre phénomène pouvant être corrélé au formidable gain de biomasse des plantes d‘Arabidopsis est la très forte augmentation de la concentration en nitrate dans le substrat de culture pauvre en présence des vers de terre. Cet enrichissement est très certainement dû à une amélioration des processus de minéralisation (Rizhiya et al. 2000) grâce à l‘activation de bactéries nitrifiantes lors de leur passage dans le tube digestif des vers de terre (Lavelle 1995). Ce phénomène concorde avec les précédentes hypothèses de Brown et al. (1999) selon lesquelles l‘un des principaux effets positifs des vers de terre sur la biomasse des plantes résulte d‘une minéralisation accrue de la matière organique du sol. L‘utilisation de deux substrats aux propriétés contrastées a permis de mettre en évidence un certain nombre d‘effets des vers de terre indépendants de la qualité du sol et a priori indépendant des processus de minéralisation. En effet, indépendamment de la nature du sol, les vers de terre ont systématiquement augmenté de façon significative les teneurs en azote par rapport au carbone dans les parties aériennes des plantes. Pour les plantes cultivées sur le substrat pauvre, ce phénomène peut facilement s‘expliquer par l‘augmentation de la teneur en nitrates (due à un accroissement de la minéralisation de la matière organique) et par une stimulation des processus d‘absorption de cet élément par les systèmes inductibles des racines. En revanche, dans le sol riche, la concentration en nitrates dans le substrat de culture 204 Discussion générale et perspectives n‘a pas été modifiée par la présence des vers de terre. Aussi, pour mieux comprendre l‘augmentation des teneurs en azote dans les tissus aériens des plantes d‘Arabidopsis cultivées en présence de vers de terre, il apparaît utile de se référer aux travaux menés par Quaggiotti et son équipe (2004). Ces chercheurs ont, comme nous, observé une diminution du rapport C/N dans les parties aériennes de plantules de maïs cultivés en présence de turricules de vers de terre. Ils ont pu montrer que ceci était dû à une stimulation de l‘influx d‘azote dans les plantules résultant de la présence de composés auxiniques dans les turricules (Tomati et al. 1988 ; Quaggiotti et al. 2004). Ces résultats, ainsi que ceux présentés dans ce travail de thèse montrent donc que la régulation de la nutrition minérale et plus particulièrement la nutrition azotée ne dépend pas forcément de l‘état minéral de la plante en présence de vers de terre. Tous ces résultats semblent indiquer le rôle important que pourraient jouer des molécules non- tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 végétales et cependant phyto-actives de type phytohormones dans les interactions plantes / vers de terre. Il a été préalablement démontré que des concentrations élevées en azote altéraient le métabolisme de l‘auxine dans les parties aériennes du soja (Caba et al. 2000 ; Watch-Liu et al. 2006). Nous avons observé des modifications qui pourraient relever de ce phénomène. En effet, dans les plantes d‘Arabidopsis exposées aux vers de terre (quel que soit le type de sol), une sur-accumulation des transcrits du gène HBT, impliqué dans les processus de la division cellulaire, a été observée. Or, l‘expression de ce gène est positivement régulée par l‘IAA (Acide Indole-acétique, Blilou et al., 2002). Il apparaît donc probable que sa surexpression ait été indirectement causée par la présence des molécules bactériennes de type auxinique qui perturbent la régulation des hormones endogènes. En plus d‘agir sur les processus mitotiques, les vers de terre semblent également diminuer de manière systémique les contraintes oxydantes dans les feuilles des plantes d‘Arabidopsis thaliana car le gène de la SOD Cu/Zn, un marqueur de ce type de contrainte (Sakamoto et al., 1995; Kaminaka et al., 1999), est moins exprimé en leur présence. Un autre effet général des vers de terre est la réduction drastique de la longueur et de la biomasse des systèmes racinaires qui conduit à un formidable accroissement du « shoot : root ratio ». Plusieurs phénomènes peuvent expliquer ceci. Tout d‘abord, en raison de l‘espace confiné dans lequel les vers évoluent, ceux-ci peuvent contribuer à limiter le développement racinaire en endommageant les jeunes racines. La quantité élevée de transcrit Pldα dans les racines de plantes exposées aux vers de terre abonde dans ce sens puisque ce gène est connu pour répondre, entre autre, aux blessures (Wang, 2002). Cependant, la limitation du développement des systèmes racinaires peut également s‘expliquer par l‘accumulation 205 Discussion générale et perspectives d‘auxine exogène dans la rhizosphère en réponse à l‘activité des vers de terre. En effet, l‘élongation des racines principales et leur ramification sont très sensibles à ce composé (Chadwick et Burg 1966 ; Benkova et al. 2003). Enfin, les vers de terre en améliorant la nutrition minérale, et plus particulièrement la nutrition azotée, permettent aux plantes d‘avoir des concentrations en éléments essentiels optimales pour leur croissance. Elles n‘ont donc pas à développer leur système racinaire. Le nouveau système expérimental mis au point dans ce travail met donc en évidence que la minéralisation de la matière organique et la libération de composés similaires aux phytohormones sont deux mécanismes complémentaires stimulés par la présence des vers de terre. Le fait que les plantes soient capables d‘intégrer ces deux processus à l‘échelle moléculaire met en évidence le potentiel énorme qu‘ont les vers de terre dans l‘ajustement du tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 phénotype des végétaux en réponse aux contraintes environnementales. De plus, associés à la plante modèle Arabidopsis thaliana, de précieux outils génétiques tels que les mutants sont disponibles pour mieux comprendre le dialogue moléculaire qui s‘instaure entre les vers et les plantes. 2. Aporrectodea caliginosa : une nutrition « forcée » ? Après avoir mis en évidence le formidable effet des vers de terre sur l‘absorption et l‘accumulation d‘azote dans les parties aériennes de plantes d‘Arabidopsis thaliana, nous nous sommes intéressés à leur impact sur l‘assimilation de deux autres éléments essentiels à la croissance et au développement des végétaux : le phosphore et le fer. Pour ces deux éléments, les vers de terre ont un effet positif, tant sur l‘absorption par les racines que sur l‘accumulation dans les parties aériennes. Pour le phosphore, des augmentations de 70% et 25% des concentrations en phosphore ont été observées dans les racines et l‘appareil aérien respectivement. Pour le fer, les vers de terre ont entraîné une augmentation de 40% de l‘accumulation racinaire et une augmentation de près de 100% de l‘accumulation dans les parties aériennes. Pour le phosphore, la forte accumulation est corrélée avec la surexpression du gène codant un transporteur racinaire à haute affinité pour le phosphate : le transporteur PHT1.3. Dans le cas du fer, le gène codant le principal transporteur impliqué dans l‘absorption de cet élément, le transporteur IRT1, n‘est pas surexprimé en réponse aux vers de terre. En revanche, ces derniers entraînent une surexpression du facteur de transcription FIT1. L‘expression du gène FIT1 est induite en réponse à une carence en fer (Colangelo et Guerinot 2004). De plus, 206 Discussion générale et perspectives ce facteur de transcription assure la régulation transcriptionnelle d‘une protéine impliquée dans la chélation et la réduction du fer de la solution du sol, la protéine FRO2, et favorise l‘accumulation du transporteur IRT1 en bloquant sa dégradation. En cohérence avec ces données, les vers de terre induisent également une surexpression du gène FRO2 dans les racines des plantes d‘Arabidopsis. De plus, l‘accumulation des ARN FRO2 est corrélée à une augmentation de l‘activité de la protéine correspondante. Il semble donc qu‘il y ait une relation directe entre l‘accumulation des transcrits FIT1, l‘augmentation des transcrits Fro2 et l‘augmentation de l‘activité de la protéine FRO2. Alors que dans la littérature, l‘ensemble de ces réponses moléculaires sont très souvent induites par une carence (Daram et al. 1998 ; Robinson et al. 1999 ; Thimm et al. 2001 ; Vert et al. 2002), nos résultats montrent que ce n‘est pas forcément le cas. En effet, d‘après les données fournies par les analyses élémentaires tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 dans les tissus des plantes d‘Arabidopsis les deux éléments sont présents en concentrations supérieures aux seuils assurant une croissance optimale et déterminés par Marschner (1988) : 2g kg-1 MS de phosphore et 0.11g kg-1 MS de fer. Comme cela a été décrit pour l‘azote, la stimulation de l‘expression des gènes impliqués dans l‘acquisition de fer et phosphate n‘est pas consécutive à une carence et pourrait donc être sous contrôle d‘hormones présentent dans la rhizosphère. Plusieurs études ont tenté de mettre en évidence l‘implication des phytohormones dans l‘induction des gènes de réponses aux carences en phosphate et en fer. L‘équipe de Schmidt (2000) a notamment montré une augmentation de l‘activité de la protéine FRO2 chez des mutants d‘Arabidopsis surproducteurs d‘éthylène. Plus récemment, Lucena et al. (2006) ont montré que l‘ACC (1-aminocyclopropane-1-acide carboxylique), le précurseur de l‘éthylène, augmente l‘accumulation des transcrits des gènes FRO2, IRT1 et FIT1 chez la plante Arabidopsis thaliana cultivée sur un milieu modérément concentré en fer (10µM) et n‘a aucun effet lorsque le milieu est fortement enrichi en fer. Dans nos expériences, les vers de terre n‘ont pas modifié la disponibilité en fer dans les substrats de culture et ont augmenté celle du phosphate. Il semblerait donc que ce soit les molécules similaires aux phytohormones, produites par les « Plant Growth Promoting Bacteria » qui soient à l‘origine des changements moléculaires observées et pas une limitation de la biodisponibilité en fer et en phosphore induite par les vers de terre. Nos résultats et ceux rapportés dans la littérature (Lee 1985) convergent pour montrer que les vers de terre influencent de manière positive les concentrations ainsi que la disponibilité de nombreux éléments essentiels à la croissance et au développement des plantes. De plus, ils 207 Discussion générale et perspectives contrôlent la production de composés bactériens similaires aux phytohormones tels que des auxines, des cytokinines et de l‘éthylène (Quaggiotti et al. 2004). Ces composés semblent avoir une forte incidence sur l‘expression de nombreux gènes chez la plante Arabidopsis thaliana et plus particulièrement sur l‘expression de gènes codant des transporteurs impliqués dans la nutrition minérale (figure 18). Ces deux aspects (disponibilité accrue en nutriments et stimulation des processus d‘assimilation) ont pour d‘augmenter conséquence considérablement les concentrations en différents macro- et micro-éléments (N, P, Fe, K, Mn) dans les tissus végétaux. De ce fait, nous avons donc décidé dans la troisième partie de ce travail de thèse d‘étudier leur incidence sur le devenir de deux polluants de type éléments tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 trace métalliques, l‘arsenic et l‘antimoine, dans notre système expérimental. FEUILLES Vacuole Chloroplaste Pi Fe2+ Fe2+ Fe2+ Pi NRAMP3 Noyau NRAMP6 S I G N A L Fe2+ NRAMP1 PHO1 Fe2+ Fe2+ Fe2+ Fe2+ Pi Pi TRANSCRIPTION Fe2+ Fe2+ NRAMP4 Xylème RACINES Pi Pi Vacuole Noyau Plaste S I G N A L Fe2+ Fe2+ S S Y Y S S T T É É MM I I Q Q U U E E Fe2+ Fe2+ TRANSCRIPTION NRAMP1 Fe2+ ATP NRAMP3 FIT1 Fe2+ ADP AHA2 Fe2+ IRT1 FRO2 H+ Fe3+ HPO42- NRAMP4 Fe2+ Fe2+ Hormones exogènes: - Auxine - Ethylène - Cytokinines PHT1.3 HPO42- Vers de terre PGPB Figure 20 : Schéma récapitulatif des effets des vers de terre sur l‘expression des gènes impliqués dans la nutrition en fer et en phosphate. Les flèches en pointillés rouges indiquent les gènes apparemment surexprimés en réponse aux vers de terre, les flèches en pointillés bleus indiquent les gènes apparemment sous-exprimés en présence des vers de terre. 208 Discussion générale et perspectives 3. Aporrectodea caliginosa : un catalyseur de la phytoextraction ? En absence de ver de terre, l‘arsenic et l‘antimoine affectent très fortement la croissance et le développement des plantes d‘Arabidopsis thaliana. Ces observations ont déjà été constatées sur d‘autres métaux lourds tels que le plomb, le nickel ou encore le cadmium (Bazzaz et al. 1974 ; Allison et Dzialo 1981 ; Sheoran et Singh 1993). Ce qui est surprenant est que la présence des vers de terre accentue ces effets. Par exemple, comparées aux plantes ayant poussé sur substrat pollué sans ver de terre, les plantes d‘Arabidopsis exposées aux vers de terre forment leur bourgeon floral avec 10 jours de retard. Certains paramètres physiologiques comme la teneur relative en eau dans les feuilles ne sont pas affectés par la présence des métalloïdes. En revanche, les polluants affectent fortement les concentrations en chlorophylles totales qui diminuent de 50%. Dans la tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 littérature, la baisse des teneurs en chlorophylles est souvent corrélée à une inhibition de la biosynthèse des chlorophylles (Stobart et al. 1985, Stiborova et al. 1986) ou à une accélération de leur dégradation (Luna et al. 1994) provoquées par la présence des métaux lourds. De même, la photosynthèse nette est fortement affectée par les polluants pendant la période végétative des plantes d‘Arabidopsis. Cette diminution de l‘activité photosynthétique a pu dans le cas du plomb être corrélée à une diminution de la taille et du nombre des stomates (Kosobrukhov et al. 2004). Cependant, à l‘apparition du bourgeon floral, les plantes cultivées sans ver de terre recouvrent des valeurs d‘assimilation et de conductance stomatique similaires à celles mesurées chez les plantes cultivées sur substrat sain. Cette reprise de l‘activité photosynthétique ne s‘applique pas aux plantes exposées aux métalloïdes et aux vers de terre. Le rendement quantique maximum du photosystème II (Fv/Fm) ainsi que le rapport entre la fluorescence variable et la fluorescence minimale (Fv/F0) diminuent très légèrement pour les plantes d‘Arabidopsis cultivées sans ver de terre tout au long de leur cycle (-1% et 10% pour Fv/Fm et Fv/F0 respectivement par rapport aux plantes d‘Arabidopsis témoins, sans ver et sans polluant), alors qu‘en leur présence, la diminution est beaucoup plus importante (5% et -30% pour Fv/Fm et Fv/F0 respectivement par rapport aux plantes d‘Arabidopsis témoins). Dans les deux cas, cette diminution est corrélée à une augmentation de la fluorescence minimale. Ce paramètre est connu pour être affecté par des contraintes environnementales telles que les métaux lourds qui entraînent des altérations structurelles dans les complexes pigments-protéines du photosystème II et limitent le transfert d‘énergie des photons des antennes collectrices au centres réactionnels (Vernay et al. 2007 ; 209 Discussion générale et perspectives Ouzounidou 1993). La figure 21 synthétise l‘ensemble des effets physiologiques de l‘arsenic et de l‘antimoine. Les vers de terre ont également influencé négativement l‘accumulation de matière sèche. En leur absence, la diminution de biomasse, par rapport aux témoins sans polluant, n‘a concerné que les systèmes racinaires (-25%). En revanche, avec les vers de terre, les biomasses racinaires et aériennes ont fortement diminué de 70% et 60%, respectivement. Pour conclure, la présence d‘arsenic et d‘antimoine dans les substrats de culture limite très fortement la croissance et le développement des plantes d‘Arabidopsis thaliana et la présence des vers de terre accentue ces effets. Cependant, après une longue période de « dormance » (quarante jours pour les plantes cultivées sans ver et soixante jours pour les plantes avec vers), les plantes sans ver de terre présentent des cinétiques de croissance tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 similaires à celles observées sur le sol témoin alors que les plantes cultivées avec les vers de terre conservent une croissance ralentie. Plusieurs mécanismes pourraient expliquer cette reprise tardive. Il est possible que les plantes d‘Arabidopsis aient nécessité une phase d‘adaptation à leur environnement contaminé en arsenic et en antimoine. Cette phase impliquerait une reprogrammation ontogénique majeure. Arabidopsis étant une plante robuste et très adaptable, elle y parvient (Mckay et al. 2003). Les vers de terre perturbant de toute évidence les équilibres hormonaux endogènes par des enrichissements en composés de même nature que les phytohormones, les plantes ont des difficultés à réorienter leur métabolisme en présence de ces flux hormonaux parasites et la phase d‘adaptation est donc plus longue. Il est également envisageable d‘émettre l‘hypothèse selon laquelle la croissance ralentie des plantes d‘Arabidopsis correspond à une phase d‘immobilisation des polluants dans le substrat afin de limiter leur bio-disponibilité. Dans ce cas, le délai supplémentaire avant la reprise de croissance en présence des vers de terre pourrait être expliqué le fait que les vers de terre semblent mobiliser l‘arsenic et l‘antimoine, et agiraient en cela à l‘inverse des plantes. L‘effet mobilisateur des vers de terre sur l‘arsenic et l‘antimoine du substrat est suggéré par les résultats des analyses des concentrations de ces deux métalloïdes. En effet, celles-ci révèlent que la présence des vers de terre a considérablement stimulé l‘accumulation racinaire en arsenic (200 ppm avec les vers de terre contre 100 ppm chez les témoins) et surtout en antimoine (450 ppm avec les vers de terre contre 100 ppm sans ver). De plus, l‘assimilation de ces deux éléments traces semble être un processus actif puisque les concentrations mesurées dans les racines exposées aux vers de terre sont supérieures à celles du substrat (Xu et al. 2007). Cependant, les vers de terre n‘ont pas d‘effet sur la mobilité in planta de ces 210 Discussion générale et perspectives éléments. En effet, les concentrations d‘arsenic et d‘antimoine dans les racines sont systématiquement supérieures à celles des feuilles avec des facteurs de translocation ne dépassant pas 0.2. Ces résultats renforcent les observations réalisées par différentes équipes de chercheurs qui ont démontré une très faible mobilité de l‘arsenic vers les parties aériennes (Quaghebeur et Rengel 2004 ; Raab et al. 2007). Ceci serait dû au fait que cet élément est rapidement réduit en arsénite, puis complexé à des phytochélatines et séquestré dans les vacuoles des cellules de racines (Zhao et al. 2008). Il est probable que l‘antimoine soit séquestré par des processus similaires mais aucune publication n‘a décrit ce processus à ce jour. Cette expérience montre bien que les vers de terre agissent comme des catalyseurs des tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 mécanismes de phytoextraction. Cependant, Arabidopsis thaliana, bien que robuste et adaptable, n‘étant pas une plante tolérante à l‘arsenic et à l‘antimoine, cette augmentation de la concentration en polluants dans son système racinaire et en moindre quantité dans ses parties aériennes affectent du coup sa croissance et son développement. 211 Discussion générale et perspectives Fm Fm Fm Fm F0 F0 F0 F0 hѵ hѵ hѵ tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 O2 Témoin H2O O2 Témoin + vers hѵ H 2O O2 O2 H2O Substrat pollué H2O Substrat pollué + vers Figure 21 : Schéma récapitulatif des effets du ver de terre Aporrectodea caliginosa et de deux polluants métalloïdiques, l‘antimoine et l‘arsenic, sur les réponses physiologiques et la croissance de la plante modèle Arabidopsis thaliana. L‘arsenic et l‘antimoine sont respectivement représentés par des croix rouges et bleues. La fluorescence initiale (F0) et la fluorescence maximale (Fm) des photosystèmes II des feuilles de chacun des traitements correspondent aux valeurs obtenues sept jours après l‘apparition du bourgeon floral. Le dégagement de dioxygène, lié aux réactions de photosynthèse est représenté par une flèche rouge et le flux de vapeur d‘eau transpiratoire par des flèches bleues. L‘intensité de ces deux phénomènes est proportionnelle à la taille de la police utilisée. 4. Conclusion Le système expérimental couplant la plante modèle Arabidopsis thaliana et le ver de terre endogé Aporrectodea caliginosa semble idéal pour approfondir les recherches concernant les interactions entre les vers de terre et les plantes. En effet, ce travail de thèse a mis en lumière le formidable effet positif des vers de terre sur les capacités d‘absorption de plusieurs éléments minéraux d‘Arabidopsis thaliana. De plus, les hormones végétales apparaissent comme les molécules clés du dialogue entre la macrofaune et le monde végétal. 212 Discussion générale et perspectives Ainsi ce travail de recherche ouvre de nombreuses perspectives dans le domaine de la phytoremédiation puisqu‘il permet de mettre en œuvre des processus d‘accumulation assistés tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 pour des éléments essentiels mais également pour des éléments traces métalliques. 213 Discussion générale et perspectives Perspectives Il apparaît essentiel d‘étudier au niveau transcriptomique, protéomique et métabolomique l‘ensemble des transporteurs impliqués dans le transport de l‘arsenic et de l‘antimoine en réponse aux vers de terre, notamment les transporteurs de type PHT1 et les aquaporines qui semblent être les principales voies d‘entrée de ces polluant dans les cellules végétales (Zhao et al. 2008). La glutathion réductase apparaît également comme une enzyme clé des processus de détoxification cellulaire : cette enzyme assure à la fois la réduction de l‘arsénite en arséniate et est à l‘origine de la formation des phytochélatines. Aussi, il serait judicieux d‘étudier les variations de l‘expression des gènes correspondant ainsi que leur activité enzymatique en réponse aux vers de terre afin de déterminer si les lombrics ont uniquement tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 un effet sur l‘influx de ces polluants dans les cellules ou si ils contribuent également à augmenter la tolérance cellulaire aux polluants. Une fois que l‘intégralité des réponses à ces deux métalloïdes de notre modèle aura été caractérisée, il apparaît essentiel de tester les vers de terre avec des plantes hyperaccumulatrices afin de vérifier l‘universalité de ce type de combinaison. 214 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Références 215 216 tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Références Références A Abdul Rida AMM (1996) Concentrations et croissance de lombriciens et de plantes dans les sols contaminés ou non par Cd, Cu, Fe, Pb et Zn: interactions sol-lombriciens. Soil Biology and Biochemistry 28: 1029-1044. Abel S, Ticconi CA, Delatorre CA (2002) Phosphate sensing in higher plant. Physiologia Plantarum 115: 1-8. Abercrombie JM, Halfhill MD, Ranjan P, Rao MR, Saxton AM, Yuan JS, Stewart Jr tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 CN (2008) Transcriptional responses of Arabidopsis thaliana plants to As (V) stress. 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Après 30 minutes d‘incubation à 37°C, 0,8µl de TurboDNase sont ajouté au mélange réactionnel qui est à nouveau incubé à 37°C pendant 30 minutes. Le mélange réactionnel est incubé pendant cinq minutes à température ambiante après l‘ajout de 5µl de réactif d‘inactivation de la TurboDNase afin que celle-ci n‘interfère pas avec les réactions de PCR. Les échantillons sont ensuite centrifugés à 10000g pendant 2 minutes afin de culotter le réactif d‘inactivation de la TurboDNase. Le surnageant, constitué des ARNs totaux traités à la TurboDNase, est prélevé et transféré dans un nouveau tube. 244 Annexes Annexe 3 : Principe de mesures de l’analyseur Ciras-2 (PP System, Hansatech). A l‘entrée du Ciras-2, l‘air (dont le débit, l‘humidité et la concentration en CO2 sont contrôllés) est réparti entre deux circuits (figure 1). Le premier passe par la chambre de mesure (ou cuvette) dans laquelle se trouve le matériel végétal (dont la surface foliare a été préalablement établie). Le second, appelé circuit de référence assure une vérification des paramètres d‘entrée. A la sortie des deux circuits, l‘air est analysé en continu pour déterminer sa teneur en vapeur d‘eau et en dioxyde de carbone. La différence entre les deux circuits tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 correspond au teneur en CO2 et en vapeur d‘eau de la chambre de mesures. Dessicateur (-H2O) Chaux sodée (-CO2) We Ce Référence We Ue ● Ce Analyseur IRGA -H2O -CO2 Air Débitmètre Cartouche de CO2 We Ce Chambre de mesures Wo Uo ● Co Avec : We = fraction molaire de la vapeur d‘eau à l‘entrée de la cuvette Wo = fraction molaire de la vapeur d‘eau à la sortie de la cuvette Ce = fraction molaire de CO2 à l‘entrée de la cuvette Co = fraction molaire de CO2 à la sortie de la cuvette Ue = flux molaire entrant dans la cuvette Uo = flux molaire sortant de la cuvette Figure 1: Schéma simplifié des circuits d‘air du Ciras-2 (PP System Hansatech) A partir de ces paramètres, l‘analyseur IRGA va pouvoir calculer en continu la photosynthèse (A), la concentration en CO2 interne (Ci), la transpiration (E) et la conductance stomatique (Gs) du végétal. Les équations de calculs de E, A, Ci et Gs sont les suivantes : 245 Annexes Assimilation (A, photosynthèse nette) A= Ue 1 − We × × Co − Ce SF 1 − Wice Avec : SF = surface foliare et Wice = fraction molaire de la vapeur d‘eau à la température de point de rosée Transpiration (E) tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 E= Ue × Wo − We SF Conductance stomatique (Gs) Gs = E × Wi + Wo 2 Wi − Wo 1− Avec : Wi = fraction molaire de la vapeur d‘eau interne à la feuille Concentration interne en CO2 (Ci) Ci = E Co × Gs − 2 − A E Gs + 2 246 Annexes Annexe 4 : Projet d’article destiné à être publié dans les Comptes Rendus Biologies de l’Académie des Sciences Effects of the earthworms Aporrectodea caliginosa on nutrient availability, uptake and accumulation in two Arabidopsis species: thaliana and halleri Abridged title: impact of earthworms on nutrient uptake tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Ulrike JanaA, Daniel LaffrayA, Anne RepellinA,B A Ecophysiologie Moléculaire, équipe Interactions biologiques dans les Sols, UMR 7618 Bioemco Faculté des Sciences et Technologie, Université Paris Est - Créteil, 61 Av. du Général de Gaulle, F-94010 Créteil cedex. B Corresponding author; E-mail: [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] Keywords: plant nutrient uptake, Arabidopsis thaliana, Aporrectodea caliginosa 247 Annexes 1. Introduction Many studies have listed the effects of earthworms on different plant species (Brown et al. 1999; Scheu 2003). In more than 75% of the cases, they affect positively plant biomass. Several mechanisms have been indentified to explain this yield enhancement. Due to their activity, earthworms lead to some physical and chemical modifications into the soils: they usually decrease the size of mineral and organic particles (Joshi and Kelkar 1953), enhance the water infiltration rate and promote soil oxygenation (Carter et al. 1982). The activity of some micro-organisms and especially the plant growth promoting bacteria are also amplified after their transit into earthworm gut (Pederson and Hendrickson, 1993).Moreover, it has been demonstrated that earthworms increased soil fertility owing to an enhancement of the nutrient tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 mineralization and an improvement of the humification process. The humic substances present in earthworm casts affect plant growth. Different researches have shown that these molecules impact on nutrient availability. Studies on beet root disks have shown that humic substances increased the uptake of Na+ and Ba+ but had no effect on Ca2+ and Zn2+ uptake. The aim of this work is to determine the answers of two closed plant species which usually present different strategies at the hands of nutrient uptake: the model plant Arabidopsis thaliana and its metallophyte cousin Arabidopsis halleri. 2. Materials and methods Arabidopsis thaliana (L.) Heynh and Arabidopsis halleri (L.) seeds were germinated on Petri dishes. Seedlings of similar size with their two fully open cotyledons were transferred on the bases of one plant per microcosm into two different types of growth unit called microcosms containing the growing substrate, a sandy cambisol, which corresponds to the control or the growing substrate with 1.7g of earthworms Aporrectodea caliginosa which correspond to the earthworm treatment. Six replicates were implemented for each treatment. Plant growth was carried out under controlled conditions (Conviron growth chamber, Canada): 20±1°C and 18±1°C day and night temperatures, 70% ± 5% relative humidity, 400 mol m-2 s-1 PPFD for 10 h per day. At the apparition of the floral bud, i.e. 21 days after the transfer into the growth unit, all the plants are separately harvested, the rosette and the roots were collected separately, carefully 248 Annexes washed with deionised water, dried in a oven for one week at 50°C in a oven and pulverised with a mortar and a pestle. The elemental analyses for Al, Ca, Cu, Mg, Mn and K were then determined by radialICP at the INRA ―Unité de Service et de Recherche en Analyses Végétales et Environnementales‖ in Villenave d‘Ornon (France). 3. Results and discussion After 21 days of growth with or without earthworms, many changes occur concerning the nutrient uptake in the two Arabidopsis species. In Arabidopsis thaliana roots (figure 1) earthworms increase significantly copper and potassium content. In the other hand, they increase calcium concentration in Arabidopsis halleri roots and decrease the aluminium the presence of earthworms. Control Earthworms 100000 ** 10000 mg kg -1 DW tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 concentration (figure 2). The other mineral nutrients appear to not be significantly affected by 1000 100 * 10 1 Al Ca Cu Mg Mn K Figure 1: Aluminium (Al), Calcium (Ca), Copper (Cu), Magnesium (Mg), Manganese (Mn) and Pottassium (K) content in Arabidopsis thaliana roots in absence (grey bars) or in presence of earthworms Aporrectodea caliginosa (black bars). Vertical bars indicate SD (n=3). Significant differences between earthworms vs control as evaluated by t-test: one asterisk indicate a p value <0.1, two asterisks a p value <0.05 and three asterisk a p value <0.01. 249 Annexes Control Earthworms 100000 * mg kg -1 DW 10000 *** 1000 100 10 1 Al Ca Cu Mg Mn K Figure 2: Aluminium (Al), Calcium (Ca), Copper (Cu), Magnesium (Mg), Manganese (Mn) and Pottassium (K) content in Arabidopsis halleri roots in absence (grey bars) or in presence of earthworms Aporrectodea caliginosa (black bars). Vertical bars indicate SD (n=3). Significant differences between earthworms vs control as <0.01. Surprisingly, the main changes in mineral content mediated by the earthworms occurred in the leaves. In Arabidopsis thaliana (figure 3), an enhancement of the aluminium content (almost significant) and a slightly decrease in copper concentration was observed. In Arabidopsis halleri (figure 4), the changes are more numerous: earthworms increase significantly aluminium, calcium, magnesium and manganese. Control Earthworms 100000 10000 * mg kg -1 DW tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 evaluated by t-test: one asterisk indicate a p value <0.1, two asterisk a p value <0.05 and three asterisk a p value 1000 100 10 ** 1 Al Ca Cu Mg Mn K Figure 3 : Aluminum (Al), Calcium (Ca), Copper (Cu), Magnesium (Mg), Manganese (Mn) and Pottassium (K) content in Arabidopsis thaliana leaves in absence (grey bars) or in presence of earthworms Aporrectodea caliginosa (black bars). Vertical bars indicate SD (n=3). Significant differences between earthworms vs control as evaluated by t-test: one asterisk indicate a p value <0.1, two asterisk a p value <0.05 and three asterisk a p value <0.01. 250 Annexes 100000 Control Earthworms * mg kg -1 DW 10000 1000 *** ** ** 100 10 1 Al Ca Cu Mg Mn K Figure 4: Aluminum (Al), Calcium (Ca), Copper (Cu), Magnesium (Mg), Manganese (Mn) and Pottassium (K) tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 content in Arabidopsis halleri leaves in absence (grey bars) or in presence of earthworms Aporrectodea caliginosa (black bars). Vertical bars indicate SD (n=3). Significant differences between earthworms vs control as evaluated by t-test: one asterisk indicate a p value <0.1, two asterisk a p value <0.05 and three asterisk a p value <0.01. Only aluminium accumulation enhancement in aerial tissus appeared to be independent of the plant species. The uptake and accumulation of the others nutrients appeared to be plant specific. Then, it seems that earthworms do not only influe the availability of the nutrients present into the soil but also the molecular transporters involved in the mineral uptake. References Brown G, Pashanasi B, Villenave C, Patron JC, Senapati BK, Giri S, Barois I, Lavelle P, Blanchart E, Blakemore RJ, Spain AV, Boyer J (1999) Effects of earthworms on plant production in the tropics. In: P Lavelle, L Brussaard, P Hendrix, Eds. Earthworm management in tropical agroecosystems, Wallingford, 87–137. Carter A, Heinonen J, De Vries J (1982). Earthworms and water movement. Pedobiologia 23: 295-397. Joshi NV, Kelkar BV (1952) The role of earthworms in soil fertility. Indian Journal of Agriculture Science. Pederson JC and Hendrikson NB (1993) Effect of passage through the intestinal tract of detritivore earthworms (Lumbricus spp.) on the number of selected Gram-negative and total bacteria. 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Heynh and the endogeic temperate earthworms Aporrectodea caliginosa (Savigny) has been set up. This research work has three goals. First, identify the main metabolic pathway affected by earthworm presence and able to explain their positive effects on plant growth and development. Then, this research work focused on phosphorus and iron nutrition particularly by studing the molecular variation of several transporters of these elements. Lastly this system has been tested for phytoextraction of wastes from an old mining site polluted by arsenic and antimony. In the first part of this study, the mineralization process improvement appears to be a determining factor in Arabidopsis growth enhancement due to nitrogen increase in the shoots. Nevertheless, phytohormones producted by bacteria activated during their transit into earthworm gut seem to be involved in nitrate assimilation. At the molecular scale, earthworms enhance an overaccumulation of HBT transcripts involved in cell division and they seem to decrease the oxidative stress as SOD transcripts are underexpressed. The second part of this study focused on mineral nutrition. Results show that earthworms enhance significantly the uptake and accumulation of phosphorus, iron and other growth essential minerals. At the molecular scale, the nutrient uptake increase result in an increase of several transporters such as Pht1.3, which is a high affinity phosphate transporter and also an overexpression and an increase in enzymatic activity of the ferric chelate reductase protein FRO2. In the leaves, this experiment also show the overaccumulation of a phosphate chloroplastic transporter Pht2.1 and over expression of iron transporter belonging to the NRAMPS family, especially NRAMP1,2 and 6. Then, this system has been transposed to the phytoremédiation and earthworm effects have been tested on the phytoextraction properties of Arabidopsis. Earthworms allow a better uptake of arsenic and antimony. Nevertheless the pollutants tend to remain in the root system and are not translocated in the aerial part. This incredible increase in pollutant tissue concentration leads to a growth and development delay and affect the Arabidopsis photosynthetic activity. To conclude, this PhD work has first shown earthworm sensitivity of Arabidopsis. This innovative system offers new investigation possibilities in the interaction between earthworms and plant area, especially due to the large range of Arabidopsis mutants. Moreover, this work has also demonstrated the key role as catalysor that can play earthworms in order to optimize phytoremédiation process. Keywords: Arabidopsis thaliana, Aporrectodea caliginosa, arsenic, antimony, gene expression, gas exchange tel-00504377, version 1 - 20 Jul 2010 Résumé L‘arsenic et l‘antimoine bien que n‘étant pas recensés parmi les polluants majeurs de l‘environnement sont souvent retrouvés associés à d‘autres contaminants. En France, et plus particulièrement dans la région Auvergne, de nombreux sites miniers où s‘effectuait l‘extraction de l‘antimoine sont désormais à l‘abandon. Pouvant présenter des risques pour les populations avoisinantes, leur réhabilitation est donc une mission d‘intérêt public. L‘idée de ce travail de doctorat est de tester l‘effet d‘un catalyseur : le ver de terre sur l‘efficacité des processus de phytoremédiation. En tant qu‘« ingénieurs du sol », ils sont à la base des processus de pédogénèse et peuvent donc assurer la restructuration du sol. De plus, de nombreuses études ont montré leurs effets positifs sur la production de biomasse végétale. Cependant, les mécanismes moléculaires responsables de cette acroissement de production demeurent méconnus. Un système expérimental novateur, jamais utilisé en Ecologie des Sols et couplant la plante modèle Arabidopsis thaliana (L.) Heynh et Aporrectodea caliginosa (Savigny), un ver de terre endogé commun des régions tempérées, a été mis en place afin de 1) identifier les principales voies métaboliques modifiées en réponse aux vers de terre et pouvant expliquer leurs effets positifs sur la croissance et le développement des végétaux, 2) étudier la nutrition minérale en fer et en phosphate, notamment au niveau des variations d‘expression des transporteurs de ces deux éléments, 3) tester ce système pour la phytoextraction de sédiments, issus d‘un ancien site minier, contaminés à l‘arsenic et à l‘antimoine. Les résultats montrent que l‘amélioration des processus de minéralisation est déterminante dans l‘accroissement de la biomasse d‘Arabidopsis thaliana qui se traduit aussi par une élévation des teneurs en azote dans les parties aériennes. Cependant, la présence de phytohormones, produites par des bactéries activées par leur transit dans le ver de terre semble également impliquée dans le renforcement de l‘absorption d‘azote. A l‘échelle moléculaire, les vers entraînent une surexpression du gène HBT, impliqué dans la division cellulaire et semblent diminuer le stress oxydant puisque la quantité de transcrits SOD Cu/Zn diminue. Les résultats montrent de plus que les vers de terre augmentent de façon significative l‘absorption et l‘accumulation de fer, de phosphate et d‘autres minéraux essentiels à la croissance du végétal. Moléculairement, l‘augmentation de l‘absorption des nutriments se traduit par une augmentation de la transcription de certains gènes codant des transporteurs tels que PHT1.3, qui est un transporteur de haute affinité pour le phosphate. Une augmentation de la transcription et également de l‘activité de la protéine FRO2, qui est à l‘origine de la chélation et de la réduction du fer a été observée. Dans les feuilles, les vers de terre induisent de manière systémique la surexpression d‘un transporteur de phosphate localisé dans les chloroplastes, PHT2.1 et la surexpression de transporteurs du fer appartenant à la famille des NRAMPs, notamment NRAMP1,2 et 6. Dans le contexte d‘une problématique de phytoremédiation, l‘effet des vers de terre sur la capacité de phytoextraction d‘Arabidopsis a été testé et, il ressort clairement de cette étude que les vers de terre permettent une meilleure absorption d‘antimoine et d‘arsenic. Cependant, ces deux métalloïdes tendent à rester dans les racines et ne sont que faiblement transferrés vers les parties aériennes. Cette formidable augmentation des concentrations en polluants dans les racines entraîne un retard de croissance considérable et affecte, dans une moindre mesure cependant, l‘activité photosynthétique et les échanges gazeux d‘Arabidopsis. Ainsi, ce travail de thèse a donc tout d‘abord démontré la sensibilité aux vers de terre de la plante modèle Arabidopsis thaliana. Ce système expérimental novateur offre de nouvelles possibilités de recherches dans le domaine des études des interactions entre les vers de terre et les plantes, notamment en raison de la grande diversité de mutants d‘Arabidopsis. De plus, ce travail a également permis de démontrer le rôle crucial de catalyseur que peuvent jouer les vers de terre en vue d‘optimisation des processus de phytoextraction. Mots clés : Arabidopsis thaliana, Aporrectodea caliginosa, arsenic, antimoine, expression de gènes, échanges gazeux
