caracterisation morphologique, phenotypique et moleculaire des

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UNIVERSITE PARIS-EST CRETEIL VAL DE MARNE
FACULTE DE MEDECINE DE CRETEIL
<<<<><><><><><><>>>>
ANNEE 2015-2016
N° 2016UPEC1026
THESE
POUR LE DIPLOME D'ETAT
DE
DOCTEUR EN MEDECINE
Discipline : Anatomie et cytologie pathologiques
-----------er
Présentée et soutenue publiquement le 1 juin 2016
à CRETEIL (PARIS EST CRETEIL)
------------
Par Ariane LECLAIRE ALIRKILICARSLAN
Née le 01/04/1987 à PARIS 14
-------------
CARACTERISATION MORPHOLOGIQUE, PHENOTYPIQUE
ET MOLECULAIRE
DES LOCALISATIONS CUTANEES
DE LYMPHOME T ANGIO-IMMUNOBLASTIQUE
PRESIDENT DE THESE :
M. Philippe GAULARD
LE CONSERVATEUR DE LA
BIBLIOTHEQUE UNIVERSITAIRE
DIRECTEUR DE THESE :
M. Nicolas ORTONNE
Signature du
Président de thèse
Cachet de la bibliothèque
universitaire
Remerciements
A Monsieur le Docteur Nicolas Ortonne qui a dirigé ce travail. Je le remercie
chaleureusement pour son encadrement, son enseignement et sa disponibilité tout
au long de cette étude.
A Monsieur le Professeur Philippe Gaulard, qui me fait l’honneur d’être président du
jury et pour son enseignement hors pair de l’hématopathologie.
A Madame le Docteur Anaïs Pujals pour sa participation active au projet et son
accueil durant mon semestre en pathologie moléculaire.
A Madame le Docteur Saskia Oro qui a accepté de participer au jury.
A Madame le Docteur Aurélie Dupuy, sans qui cette étude n’aurait pu aboutir. Merci
pour ton aide précieuse depuis le tout début, en particulier concernant les
manipulations, les réponses à mes nombreuses questions et la relecture.
A toute l’équipe, médecins, techniciens et secrétaires du service de pathologie de
l’hôpital Henri Mondor ainsi qu’à Madame Nadine Martin, de l’équipe INSERM.
A toutes les personnes travaillant au sein des services d’anatomie pathologique dans
lesquels je suis passée durant mon internat et qui ont participé d’une manière ou
d’une autre à ma formation : hôpital de Montfermeil, hôpital Robert Debré, hôpital
Foch, hôpital René Huguenin, hôpital de la Pitié-Salpétrière, hôpital Henri Mondor et
hôpital Cochin.
A mes parents, mon mari, toute ma famille et mes proches pour leur soutien sans
faille durant ces longues années d’étude.
A mon fils qui a partagé mes bras avec l’ordinateur durant les premières semaines
de sa jeune vie pour la rédaction de cette thèse.
Remerciements à la Société Française de Dermatologie (SFD) pour l’octroi d’une
bourse de recherche au titre de l’appel d’offre 2015.
A Madame le Professeur Béatrice Vergier et Monsieur le Docteur Alistair Robson
pour nous avoir fourni des échantillons de l’étude.
2
Table des matières
I.
Introduction ......................................................................................................... 6
A. Le lymphome T angio-immunoblastique : clinique ..................................... 6
B. Pronostic et traitement .................................................................................. 6
C. Les manifestations cutanées du lymphome T angio-immunoblastique.... 7
D. Un lymphome T dérivé des cellules TFH...................................................... 7
E. Caractéristiques histologiques et immuno-histochimiques des LAI sur
biopsie ganglionnaire ........................................................................................... 8
F. Caractéristiques histologiques et immuno-histochimiques des LAI sur
biopsie cutanée ................................................................................................... 13
G. Développement de lymphome B au cours du LAI ..................................... 13
H. Caractéristiques moléculaires des LAI ...................................................... 14
1. Clonalité et cytongénétique ......................................................................... 14
2. Mutations..................................................................................................... 14
II.
Objectifs de l’étude .......................................................................................... 21
III. Matériel et Méthodes ...................................................................................... 22
A. Patients ......................................................................................................... 22
B. Etudes histopathologique et immunohistochimique ................................ 24
C. Etude moléculaire ........................................................................................ 27
1. Les conditions de PCR ................................................................................ 28
2. Les conditions de RT-qPCR ........................................................................ 29
D. Corrélations entre le groupe morphologique, l’expression des marqueurs
TFH dans la peau et la présence d’une mutation RHOA ou IDH2 ................... 32
IV. Résultats ......................................................................................................... 33
A. Analyse histopathologique ......................................................................... 33
B. Analyse phénotypique ................................................................................. 38
C. Analyse moléculaire .................................................................................... 45
1. Mutation RHOA p.Gly17Val......................................................................... 45
2. Mutations IDH2 p.Arg172Lys et p.Arg172Ser ............................................. 46
D. Comparaison entre le profil morphologique, l’expression des marqueurs
TFH en immunohistochimie et la présence d’une mutation RHOA p.Gly17Val
50
V. Discussion ........................................................................................................ 54
VI. Bibliographie ................................................................................................... 61
3
Table des illustrations (Figures)
Figure 1 – Modèle théorique de la pathogénèse du LAI------------------------------------ 11
Figure 2 – Mutation RHOA p.Gly17Val dans le lymphome T angio-immunoblastique
-------------------------------------------------------------------------------------------------------- 18
Figure 3 - Mutations de RHOA dans les lymphomes T périphériques ------------------ 19
Figure 4 - Diagramme de flux de l'étude--------------------------------------------------------- 23
Figure 5 - Mise au point de la technique de PCR allèle spécifique pour la recherche
de mutation RHOA p.Gly17Val -------------------------------------------------------------- 30
Figure 6 - Principe de la PCR allèle spécifique ARMS -------------------------------------- 31
Figure 7 – Exemples d’infiltrats cutanés des groupes morphologiques 1, 2 et 3 ----- 36
Figure 8 - Exemples de localisations cutanées de LAI ------------------------------------- 37
Figure 9 - Phénotypes de localisations cutanées de LAI ----------------------------------- 41
Figure 10 - Lymphome composite de type lymphome B diffus à grandes cellules
EBV+ associé à une localisation cutanée de LAI --------------------------------------- 42
Figure 11 - Lymphome composite de type lymphome B plasmocytoïde associé à une
localisation cutanée de LAI ------------------------------------------------------------------- 43
Figure 12 – Localisation cutanée de LAI avec immunohistochimie IDH2 R172K
positive --------------------------------------------------------------------------------------------- 44
Figure 13 - Résultats de PCR RHOA p.Gly17Val sur échantillons cutanés et
ganglionnaires ------------------------------------------------------------------------------------ 49
4
Table des illustrations (Tableaux)
Tableau 1 - Diagnostics différentiels du lymphome T périphérique, sans autre
spécificité (PTCL, NOS) ................................................................................................................. 12
Tableau 2 - Résultats des études de prévalence de la mutation RHOA p.Gly17Val
dans les lymphomes T périphériques ...................................................................................... 20
Tableau 3 – Résumé des résultats de l’étude phénotypique ................................................. 35
Tableau 4 - Résultats de l’étude immunohistochimique pour l’ensemble des cas
étudiés et en fonction du groupe morphologique de lymphome T angioimmunoblastique ................................................................................................................................ 40
Tableau 5 - Résultats de l’analyse moléculaire pour la recherche de mutation RHOA
p.Gly17Val (paires peau/ganglion chez le même patient et biopsies cutanées
seules)..................................................................................................................................................... 47
Tableau 6 - Résultats de l’analyse moléculaire cas par cas pour la recherche de
mutation RHOA p.Gly17Val, IDH2 p.Arg172Lys et p.Arg172Ser ............................... 48
Tableau 7 - Comparaison entre l’expression des marqueurs TFH en
immunohistochimie et la présence d’une mutation RHOA p.Gly17Val.................... 52
Tableau 8 – Comparaison entre l’expression des marqueurs TFH et la présence
d’une mutation RHOA ou IDH2 en fonction du groupe morphologique................... 53
5
I.
Introduction
A. Le lymphome T angio-immunoblastique : clinique
Le lymphome T angio-immunoblastique (LAI) a été décrit initialement sous
l’appellation de « lymphadénopathie angio-immunoblastique avec dysprotéinémie »
par Frizzera, Moran et Rappaport en 1974. L’hypothèse était qu’il représentait une
réponse cellulaire B trop importante et atypique mais il a été suggéré dès 1979 par
Shimoyama qu’il s’agissait en réalité d’un lymphome T (1).
Le
lymphome
T
angio-immunoblastique
est
un
des
lymphomes
T
périphériques les plus fréquents dans les pays occidentaux. Il représente environ
20% des cas mais moins de 2% de l’ensemble des lymphomes non hodgkiniens, du
fait de la forte prévalence des lymphomes B. Il atteint le plus souvent des patients
âgés de plus de 60 ans. L’incidence est proche chez les hommes et chez les
femmes. Le LAI est une maladie systémique qui se traduit par des adénopathies
périphériques multiples, une fièvre, un amaigrissement et des manifestations autoimmunes. La rate, le foie et la moelle osseuse sont fréquemment envahis. Une
pleurésie avec toux ou dyspnée ou une ascite ne sont pas rares. Il existe une
hypergammaglobulinémie dans les stades avancés de la maladie. Les autres
anomalies biologiques fréquentes sont la présence de complexes immuns circulants,
une anémie hémolytique, une thrombocytopénie, et des auto-anticorps, en particulier
un facteur rhumatoïde positif et des anticorps anti-muscle lisse (2).
B. Pronostic et traitement
Le pronostic est péjoratif avec une survie médiane est inférieure à 3 ans dans
la plupart des études. Les patients décèdent souvent de complications infectieuses.
L’apparition d’un lymphome B à grandes cellules est également possible.
Les traitements actuels, peu efficaces, sont basés sur des polychimiothérapies
de type CHOP (Cyclophosphamide, Doxorubicine, Vincristine et Prednisone). Des
essais cliniques évaluant l’intérêt des thérapies ciblées adjuvantes sont en cours. Ils
6
incluent des inhibiteurs de mTor, d’IDH1 et 2, des anti-CD30. Un essai clinique ayant
évalué l’ajout de Rituximab (anti-CD20) à la polychimiothérapie classique n’a pas
montré de réels bénéfices pour les patients recevant ce traitement (38).
C. Les manifestations cutanées du lymphome T angio-immunoblastique
Environ la moitié des patients présentent une éruption cutanée et des
arthralgies. Les manifestations cutanées peuvent être inaugurales et très
symptomatiques si bien que les patients sont parfois orientés en première intention
vers un dermatologue. Elles sont cliniquement peu spécifiques, ressemblant aux
dermatoses inflammatoires et peuvent être confondues avec une éruption virale, une
connectivite ou une toxidermie, en particulier un exanthème maculo-papuleux ou un
syndrome DRESS (Drug Reaction with Eosinophilia and Systemic Symptoms).
Les patients présentent le plus souvent des signes cutanés de type rash
(éruption maculo-papuleuse), mais des plaques érythémato-squameuses, une
urticaire,
des lésions papulo-vésiculaires,
purpuriques
ou pétéchiales, une
érythrodermie et des nodules ont également été décrits (3) (4). Le prurit semble très
fréquent (1).
Il est difficile mais indispensable pour la prise en charge des patients de faire
le diagnostic de ce lymphome, dont le pronostic est très défavorable et pour lequel il
n'y a pas aujourd'hui de traitement efficace, le plus tôt possible.
D. Un lymphome T dérivé des cellules TFH
Les études d'expression génique à haut débit ont permis de montrer que les
cellules néoplasiques du LAI ont un profil d'expression superposable aux cellules T
« helper folliculaires » (TFH), qui seraient leur contrepartie histogénétique normale
(5)(6). Les cellules TFH correspondent à une sous population de cellules T
auxiliaires particulières, présentant un phénotype qui les distingue des autres
populations T.
7
Les cellules TFH expriment la chimiokine CXCL13 et son récepteur CXCR5
(7)(8), qui interviennent dans le recrutement des cellules B dans les centres
germinatifs, dans l’activation des cellules B, leur expansion et la différenciation
plasmocytaire. CXCL13 joue le rôle de médiateur dans l’expansion des cellules
folliculaires dendritiques et l’adhésion des cellules B aux capillaires, ayant pour
conséquence l’entrée des cellules tumorales dans le centre germinatif du ganglion
lymphatique (2).
Les autres marqueurs classiques exprimés par les cellules TFH sont des
facteurs de transcription (BCL6, c-maf) (9) et des molécules de surface, associées
en particulier à la co-stimulation du TCR (CD279/PD1 (programmed death 1), et
CD278/ICOS (Inducible T-Cell COStimulator)) (10)(11), ou SAP (SLAM-Associated
Protein)(12)(13). ICOS et PD1 appartiennent à la famille des récepteurs de costimulation du TCR qui régulent l’activation des lymphocytes T (1).
E. Caractéristiques histologiques et immuno-histochimiques des LAI sur
biopsie ganglionnaire
Dans les atteintes ganglionnaires, les lymphomes T angio-immunoblastiques
se présentent histologiquement au niveau ganglionnaire sous la forme d’un infiltrat
diffus et polymorphe effaçant partiellement l’architecture ganglionnaire avec
fréquemment une infiltration péri-ganglionnaire, mais épargnant les sinus souscorticaux. Dans les formes caractéristiques, l’infiltrat associe des lymphocytes T
néoplasiques de taille moyenne ayant un cytoplasme clair abondant, mêlés à des
petits lymphocytes, des histiocytes, des immunoblastes, des polynucléaires
éosinophiles et des plasmocytes. Les cellules néoplasiques s’organisent souvent en
groupes autour des follicules. Il s’y associe une hyperplasie vasculaire, une
prolifération péri-vasculaire de cellules folliculaires dendritiques et de grands
immunoblastes B infectés par l’EBV. Le réseau formé par les cellules folliculaires
dendritiques, que l’on peut visualiser à l’aide d’antigènes spécifiques (CD21, CD23)
est souvent hyperplasique.
8
Trois architectures sont décrites dans le ganglion selon la présence de
follicules hyperplasiques (type 1), de follicules « déplétés » (type 2) ou l'absence de
follicule (type 3) (12). Elles pourraient témoigner de stades évolutifs différents.
Les cellules néoplasiques sont des lymphocytes T matures CD45RO+,
TCRαβ+, CD4+, CD8-. Elles expriment les antigènes de la lignée T (CD2, CD3, CD5
et CD7) mais des pertes antigéniques peuvent être observées. Une perte
d’expression ou une expression diminuée est le plus souvent notée pour le CD3, le
CD4 ou le CD7 (12). Les marqueurs de différenciation TFH pouvant être détectés en
immunohistochimie sur coupes en paraffine sont exprimés de façon variable (BCL6,
CXCL13, PD1, ICOS). Une expression de l’endopeptidase CD10 est observée dans
la majorité des LAI au niveau ganglionnaire.
La préservation des fonctions TFH par les cellules néoplasiques explique
probablement pourquoi les malades ont des anomalies portant sur la lignée B,
incluant une hypergammaglobulinémie et le développement d'une auto-immunité.
Les grandes cellules B associées aux infiltrats néoplasiques (immunoblastes ayant
donné le nom à la maladie) sont le plus souvent infectées par l’EBV et sont
détectées dans la majorité des cas au niveau ganglionnaire (Figure 1). Les cellules B
EBV+ montrent une latence de type 2 ou 3, avec expression de LMP1 et le plus
souvent EBNA2 en immunohistochimie et des transcrits EBER détectables par
hybridation in situ (39).
L’environnement du LAI comporte des lymphocytes T CD8+ réactionnels.
En raison de la faible proportion de cellules tumorales et des nombreuses
cellules réactionnelles, ces lymphomes sont souvent confondus avec d’autres types
de lymphomes ou des maladies non néoplasiques.
Le principal diagnostic différentiel est le lymphome T périphérique, sans autre
spécificité (PTCL,NOS), de différenciation TFH. D’assez nombreux lymphomes T
non classables présentent en effet des caractéristiques les rapprochant des LAI, en
particulier phénotypiques (« PTCL,NOS AITL-like») (14). Il s’agit d’une catégorie
hétérogène de lymphomes T matures ganglionnaires et extra-ganglionnaires qui ne
correspond à aucune autre entité de lymphomes T matures dans la classification
9
OMS 2008. Ce lymphome est difficile à situer d’un point de vue nosologique par
rapport au LAI, malgré l’expression de marqueurs de différenciation TFH (Tableau 1).
Parmi ces PTCL,NOS de différenciation TFH, un sous groupe particulier a été
individualisé dans la classification de 2008 sous l’appellation de « lymphome T
folliculaire ».
Les
lymphadénopathies
réactionnelles
sont
également
un
diagnostic
différentiel à évoquer. Dans ce cas, il n’y aura pas de cellules atypiques, pas
d’expression des marqueurs TFH en immunohistochimie et pas de réarrangement
monoclonal des gènes du TCR.
10
Figure 1 – Modèle théorique de la pathogénèse du LAI
Les cellules B EBV+ présentent les protéines virales EBV (EBNA-1) en association
avec les molécules du CMH de classe II, régulées par le ligand CD28 (B7). Elles
fournissent des signaux de co-stimulation pour l’activation des cellules TFH. Les
cellules TFH expriment CXCR5 et CXCL13. CXCL13 facilite le recrutement des
cellules B dans le ganglion par interaction avec les veinules post-capillaires à
endothélium haut (high endothelial veinules, HEV) et les capillaires dans les centres
germinatifs. Les cellules B se développent dans le paracortex et s’activent. Certaines
cellules B paracorticales associées à l’EBV se transforment par la suite et exposent
au risque de développement d’une population B monoclonale. Les cellules
dendritiques CD21+ se développeraient à partir des hautes veinules endothéliales.
Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, et al., ed. WHO Classification of Tumours of
Haematopoietic and Lymphoid tissues (ed 4th). Lyon; 2008 (2)
11
Tableau 1 - Diagnostics différentiels du lymphome T périphérique, sans autre
spécificité (PTCL, NOS)
Maladie
Etude immunohistochimique
CD4>CD8
Lymphome T
Perte antigénique T fréquente (CD7, CD5, CD4/8,
périphérique, sans
CD52)
autre spécificité
CD30-/+
(PTCL,NOS)
CD56-/+
CD10-, BCL6-, CXCL13-, PD1CD4+ ou mix CD4/CD8
Lymphome T angio-
CD10+/-, BCL6+/-, CXCL13+, PD1+
immunoblastique (LAI)
Hyperplasie des CFD
Cellules immunoblastiques B CD20+ EBV+
Lymphome
lymphoblastique T
CD4+, CD25+, CD7CD30-/+, CD15-/+
FoxP3+/-
Lymphome
CD30+, ALK+/-
anaplasique à grandes
EMA+, CD25+, granules cytotoxiques+
cellules
CD4+/-, CD3-/+, CD43+
Lymphome B riche en
Grandes cellules blastiques B CD20+ dispersées sur un
cellules T
fond riche en lymphocytes T CD3+ réactionnels
Architecture préservée
Hyperplasie
Mix CD4/CD8
de la zone T
Cellules B CD20+ dispersées
CD25 et CD30 variables
Légende :
CFD = cellules folliculaires dendritiques
12
F. Caractéristiques histologiques et immuno-histochimiques des LAI sur
biopsie cutanée
Les infiltrats cutanés survenant au cours du LAI ont longtemps été considérés
comme réactionnels et non spécifiques. Les critères morphologiques observés dans
le ganglion sont rarement trouvés dans la peau, où l’infiltrat est souvent peu
abondant. Cependant, l’identification des cellules néoplasiques dans les lésions
cutanées des malades avec un LAI suggère qu’il s’agit d’envahissements
spécifiques. Ces observations reposent sur l'analyse de clonalité. Cette recherche
ainsi que la caractérisation du phénotype TFH des cellules T cutanées, en particulier
l'expression de CXCL13, permet de retrouver la même population que dans le
ganglion (15). Les caractéristiques histopathologiques et phénotypiques des lésions
cutanées de LAI sont toutefois très peu décrites dans la littérature.
Sur le plan morphologique, différents aspects peuvent être observés, incluant
des petits infiltrats périvasculaires lymphocytaires peu abondants, avec ou sans
polynucléaires éosinophiles, avec ou sans atypie cytonucléaire, des infiltrats denses
avec lymphocytes atypiques et même des aspects de vascularite leucocytoclasique
(15)(3). Des formes inhabituelles peuvent être observées, comme par exemple un
épidermotropisme simulant un mycosis fongoïde (31).
Sur le plan phénotypique, on retrouve une population immunoblastique B
EBV+ de façon inconstante. La présence de cellules EBV+ peut également être
variable chez une même personne (16). L’expression de CD10 est également
fluctuante. Les autres marqueurs de différenciation TFH, en dehors de CD10 et
CXCL13, n'ont jamais, à notre connaissance, été étudiés sur une série significative
de cas. De même, aucune étude moléculaire n'a pour le moment été effectuée sur
biopsies cutanées.
G. Développement de lymphome B au cours du LAI
Le développement d’un lymphome B au cours d’un LAI est possible dans tous
les organes et a été décrit dans la peau. Une partie des patients atteints de LAI va
13
développer une lymphoprolifération B associée à l’EBV. Dans la plupart des cas, il
s’agit d’un lymphome B diffus à grandes cellules EBV+ plus rarement EBV- ou des
tumeurs à cellules plasmocytaires (12). Les cellules TFH expriment CXCL13 qui
serait un des médiateurs moléculaires majeurs et aurait un rôle important dans le
recrutement et l’activation des cellules B, en stimulant l’expansion des cellules B et la
différenciation plasmocytaire (12). La réactivation du virus EBV se produit dans un
contexte de réponse immune dérégulée, qui favorise à la fois l’expansion des
cellules TFH et des cellules B.
H. Caractéristiques moléculaires des LAI
1.
Clonalité et cytongénétique
Un réarrangement clonal des gènes du récepteur T peut être détecté dans 75
à 90% des cas (2). Il existe un réarrangement clonal des gènes du BCR
(immunoglobuline) dans 25 à 30% des cas. L’absence de clone T dans 10 à 25%
des cas est considérée comme la conséquence de la faible proportion de cellules
tumorales dans certains cas, se heurtant à la sensibilité des techniques actuellement
utilisées.
Des aberrations cytogénétiques clonales (trisomies 3, 5 et 21, des gains du
chromosome X et des pertes du bras long du chromosome 6) sont retrouvées dans
plus de 90% des lymphomes T angio-immunoblastiques. A ce jour, ces anomalies
n’ont été étudiées que dans les localisations ganglionnaires (2).
2.
Mutations
De nombreux travaux ont permis ces dernières années de mettre à jour des
anomalies moléculaires récurrentes dans les LAI. Des mutations de gènes impliqués
dans les modifications épigénétiques de l'ADN sont présentes à des fréquences
variées dans les LAI. Ces anomalies incluent des mutations de TET2 (Ten-Eleven
Translocation 2) identifiées dans 47% des cas, d’IDH2 (Isocitrate dehydrogenase 2)
dans 20 à 45% et de DNMT3A (DNA-methyltransferase 3A) dans 26 à 33%. Ces
mutations ne sont pas spécifiques du LAI et sont décrites par ailleurs dans d’autres
hémopathies ou cancers solides (17)(18)(19)(20)(21)(22). Les mutations de TET2
14
sont présentes dans 38% des lymphomes T périphériques (20). Les mutations de
TET2, DNMT3A et IDH1/2 ont d’abord été identifiées dans les hémopathies
myéloïdes avant d’être retrouvées dans les LAI et dans les PTCL,NOS AITL-like
(23)(24). Les mutations des gènes IDH1 et 2 ont initialement été décrites dans les
tumeurs gliales. Elles sont retrouvées dans des sites différents dans les hémopathies
myéloïdes et dans les LAI. Dans les lymphomes T angio-immunoblastiques, il s’agit
d’une mutation hétérozygote, localisée très majoritairement en position Arg172 alors
que dans les hémopathies myéloïdes elle est retrouvée en position Arg172 et Arg140
(19). De plus, les mutations TET2 et IDH2 ne sont pas retrouvées simultanément
dans les hémopathies myéloïdes alors qu’elles peuvent coexister dans les
hémopathies lymphoïdes. La présence de la mutation IDH2 n’influence pas la
progression de la maladie et la survie des patients atteints de LAI (19).
Récemment, des mutations somatiques de RHOA (Ras HOmolog family
member A) ont été mises en évidence dans plus de deux tiers des LAI (53-71%)
(25)(26)(15), constituant l'anomalie moléculaire la plus fréquente avec la mutation de
CD28 (15).
La mutation du gène RHOA est retrouvée en association avec des mutations
de TET2 (15)(25). Seule la mutation hétérozygote c.50G>T, p.Gly17Val a été mise
en évidence dans les LAI et les PTCL,NOS AITL-like (15). Contrairement aux
anomalies portant sur les gènes régulant l’épigénétique, elle n’est pas retrouvée
dans d’autres hémopathies (25)(26). On note qu’une mutation RHOA c.14C>G a été
identifiée dans le lymphome de Burkitt et d’autres sites de mutations de RHOA sont
retrouvés fréquemment dans les cancers gastriques diffus (27). Des mutations
RHOA p.Cys16Arg, p.Thr19Ile, p.Gly17Glu, p.Asp120Tyr ont été identifiées une fois
chacune par Palomero et al. dans les lymphomes T périphériques (26).
La mutation RHOA p.Gly17Val est détectée dans 62% des PTCL,NOS AITLlike mais n’est pas retrouvée dans les PTCL,NOS sans aspect de LAI (25). Yoo et
collaborateurs retrouvent également cette mutation dans les lymphomes de type
PTCL,NOS et NK/T mais à des fréquences beaucoup plus faibles que dans les
lymphomes T angio-immunoblastiques (Tableau 2).
RHOA code pour une GTPase appartenant à la famille RAS qui régule des
processus biologiques divers, contrôle la structure et la dynamique du cytosquelette
15
d’actine et la formation des fibres de stress ainsi que l’adhésion cellulaire. Elle est
impliquée également dans la polarisation cellulaire dans de nombreux types
cellulaires (26). Cette GTPase interagit en particulier avec le cytosquelette en aval de
la voie de signalisation du TCR. D’un point de vue fonctionnel, le rôle de RHOA dans
l’oncogénèse reste cependant très mal compris. Palomero et collaborateurs
suggèrent que la mutation de RHOA entrainerait un gain de fonction avec soit une
activité constitutive soit une activité « dominant-negative » (26) alors que SakataYanagimoto et collaborateurs considèrent que le gène RHOA sauvage pourrait être
considéré comme un suppresseur de tumeur dans la lignée T (28). (Figure 2).
Comme dans d’autres cancers, le développement des cellules néoplasiques
des LAI se ferait selon un processus multi-étapes, « pas à pas ». De façon
intéressante, la mutation de RHOA a été identifiée uniquement dans les cellules
tumorales alors que les mutations TET2 et DNMT3A sont retrouvées à la fois dans
les cellules tumorales, dans les cellules hématopoïétiques non tumorales et les
cellules pré-tumorales. De plus, un tiers des cas de LAI mutés RHOA/TET2 portent
également une mutation d’IDH2 (25)(26). Les mutations IDH2 semblent apparaître
plus tard que les mutations de TET2 et seraient un événement plus tardif dans la
plupart des cas de PTCL (27) (Figure 3).
Ces observations suggèrent que les mutations de TET2 et DNMT3A se
produiraient en amont de celles portant sur RHOA et IDH2, dans une ou des cellules
souches hématopoiétiques ou des progéniteurs hématopoïétiques multipotents. De
plus, Sakata-Yanagimoto et collaborateurs soulignent que la fréquence des
mutations de RHOA est statistiquement plus faible que celle de TET2 dans les
échantillons portant les 2 mutations, renforçant l’idée que la mutation RHOA
p.Gly17Val a lieu plus tard que les mutations de TET2 (27). Ainsi, la mutation de
TET2 précèderait la perte de fonction de RHOA (et/ou IDH2), selon une séquence
oncogénétique qui semble assez spécifique du LAI et des PTCL,NOS AITL-like
apparentés. Dans ce modèle, la mutation de RHOA jouerait un rôle important dans
l’évolution clonale des cellules précancéreuses vers les cellules cancéreuses
constituant un évènement « driver » (25)(27).
16
La mutation p.Gly17Val de RHOA semble jouer un rôle important dans la
pathogénèse des LAI (« mutation driver ») (15), mais elle n’entrainerait pas
d’expression clinique ou pathologique particulière de la maladie (29).
L’ensemble de ces données suggèrent que la détection de la mutation RHOA
p.Gly17Val pourrait servir de marqueur diagnostique en faveur du LAI ou d’un
PTCL,NOS AITL-like dans les situations difficiles. Dans la mesure où le LAI
comporte
souvent
un
important
infiltrat
inflammatoire
accompagnateur,
le
pourcentage de cellules tumorales dans le ganglion et à fortiori dans la peau est
souvent faible. Cette approche nécessite donc l’utilisation d’une méthode de
détection très sensible.
17
Figure 2 – Mutation RHOA p.Gly17Val dans le lymphome T angioimmunoblastique
Ras HOmolog gene family member A (RHOA) agit comme un « interrupteur »
moléculaire, dans le cycle d’activation entre le GDP inactif et le GTP actif. RHOA est
activé spécifiquement par les facteurs GEF (guanine exchange factors) et inactivé
par les protéines GTPase-activating (GAPs). La mutation RHOA p.Gly17Val altère la
capacité de liaison GTP/GDP et inhibe l’activation de la forme sauvage de RHOA en
séquestrant les facteurs d’activation GEF en amont.
Sakata-Yanagimoto M, Enami T, Yokoyama Y, Chiba S, Disease-specific mutations
in mature lymphoid neoplasms: recent advances. Cancer Sci. 2014 Jun (30)
18
Figure 3 - Mutations de RHOA dans les lymphomes T périphériques
(a) Structure de la protéine RHOA. Les altérations de RHOA identifiées par
amplicons ciblés dans les échantillons de PTCL (n=64). Les cercles multiples
pour le même acide aminé représentent des cas multiples du même variant.
(b) Répartition des mutations RHOA (rouge) dans toutes les catégories de
PTCL, dans les PTCL-NOS et dans les LAI (AITL).
(c) Distribution des mutations de RHOA (p.Gly17Val), TET2, DNMT3A, et IDH2
dans les groupes majeurs de PTCL (LAI n=30, PTCL-NOS n=17, lymphomes
anaplasiques à grandes cellules ALK+ n=4, lymphomes anaplasiques à
grandes cellules ALK- n=2). Les cases colorées indiquent la présence d’une
mutation dans les gènes (lignes) des échantillons (colonnes).
Palomero T, Couronne L, Khiabanian H, et al. Recurrent mutations in epigenetic
regulators, RHOA and FYN kinase in peripheral T cell lymphomas. Nat Genet,
2014;46:166–170 (26)
19
Tableau 2 - Résultats des études de prévalence de la mutation RHOA
p.Gly17Val dans les lymphomes T périphériques
Type de
lymphome
Yoo et al. (15)
Palomero et al. (26)
Sakata-Yanagimoto
et al. (25)
Pourcentage de cas
présentant une mutation
RHOA p.Gly17Val
Nombre total
de cas étudiés
LAI
53,3
45
PTCL-NOS
7,7
13
NK/T
15
20
LAI
67
35
PTCL-NOS
18
44
LAI
70,8
72
PTCL-NOS
17,2
87
20
II.
Objectifs de l’étude
Il existe très peu d’études ayant analysé de façon précise les caractéristiques
histopathologiques et le profil phénotypique des lésions cutanées spécifiques de LAI.
Par ailleurs, les anomalies moléculaires décrites au niveau ganglionnaire n’ont
jamais été recherchées au niveau cutané jusqu’à ce jour.
Les objectifs de cette étude sont de :
● Définir les caractéristiques morphologiques des localisations cutanées
spécifiques de LAI.
● Evaluer la prévalence des différents marqueurs diagnostiques utilisables en
immunohistochimie sur coupes en paraffine : TFH, pan-T et virus EBV.
● Rechercher les mutations de RHOA (p.Gly17Val) et IDH2 (p.Arg172Lys et
p.Arg172Ser) dans les paires peau-ganglion provenant d’un même malade.
● Rechercher des mutations de RHOA (p.Gly17Val) et IDH2 (p.Arg172Lys et
p.Arg172Ser) dans des prélèvements cutanés isolés.
21
III.
Matériel et Méthodes
A.
Patients
Nous avons inclus dans notre étude des patients atteints d’un lymphome T
angio-immunoblastique, qui présentaient une éruption cutanée au moment du
diagnostic ou au cours de l’évolution de la maladie. Ils ont été sélectionnés
rétrospectivement entre septembre 1995 et mars 2016 à partir du recrutement de
l’hôpital Henri Mondor (cas du site et cas issus de relectures dans le cadre du réseau
Lymphopath). D'autres cas provenant du St John’s hospital de Londres, dans le
cadre d'une collaboration avec le Dr Alistair Robson (n=6) et du CHU de Bordeaux
(n=6) fournis par le Pr Béatrice Vergier ont également été inclus. Dans tous les cas,
le diagnostic de LAI avait été fait sur biopsie ganglionnaire en accord avec les
critères de la classification OMS 2008.
Parmi les 49 patients inclus initialement, 3 ont été exclus car nous n’avons pas
pu identifier de cellules tumorales dans la peau, que ce soit après examen
histologique ou par l’étude de clonalité T. Les 3 cas exclus présentaient un infiltrat
lymphocytaire non spécifique pour l’un, une vasculite lymphocytaire pour l’autre et
une réaction médicamenteuse (syndrome DRESS) pour le troisième. Huit patients
appartenaient à une étude précédente concernant CXCL13 et CD10 (8).
Au total, 46 biopsies provenant de 43 malades (23 hommes, 14 femmes et 6
données manquantes) ont été incluses dans l’étude. L’âge moyen était 69,2 ans (3987 ans). Les patients pour lesquels nous avions des renseignements cliniques
présentaient les lésions cutanées suivantes : exanthème maculeux et/ou papuleux
(n=13), plaques infiltrées ou annulaires (n=3), nodules (n=6), prurit (n=2) et
ulcérations buccales pour un patient.
Pour 14 patients, nous avions à la fois une biopsie ganglionnaire et une
biopsie cutanée. Le diagnostic de lymphome T angio-immunoblastique sur le
ganglion a été confirmé de nouveau par un expert (Pr P. Gaulard). Ces 14 cas ont
fait l’objet d’une étude à la fois phénotypique et moléculaire afin de comparer les
caractéristiques des deux localisations (Figure 4).
22
Figure 4 - Diagramme de flux de l'étude
Légende :
NI = non interprétable
Flèche : Une paire peau-ganglion avec étude moléculaire non interprétable pour la
biopsie ganglionnaire mais avec des résultats interprétables pour la biopsie cutanée,
secondairement inclus dans le groupe des prélèvements cutanés isolés
23
B.
Etudes histopathologique et immunohistochimique
Les biopsies ont été fixées en formol (ou AFA pour les prélèvements les plus
anciens) et incluses en paraffine. Elles ont fait l’objet de coupes au microtome à une
épaisseur de 3 µm. L’étude morphologique a été effectuée sur lames colorées par
l’hématoxyline-éosine-safran.
Pour
les
études
immunohistochimique
et
en
hybridation in situ, des coupes sur lames SuperFrost+ ont été effectuées.
Nous avons utilisé les anticorps monoclonaux suivants pour l’étude
immunohistochimique : CD2 (clone AB75, Novocastra Menarini), CD3 (clone
F.7.2.38, Dako), CD4 (clone 4B12 Leica), CD5 (clone 4C7, Novocastra Menarini),
CD7 (clone LP15, Leica), CD8 (clone C8/144B, Dako), CD10 (clone 56C6, Leica),
CD20 (clone L26, Dako), BCL6 (clone LN22, Menarini), ICOS (rabbit polyclonal,
Spring Biosciences), PD1 (clone Nat105, Abcam) et CXCL13 (clone 53610, RandD
Systems). Les marquages ont été réalisés avec l’automate BOND III (Menarini-Leica)
avec révélation chromogénique par la diaminobenzidine (DAB).
Pour les marquages par hybridation in situ, nous avons utilisé pour la
détection de l’EBV une sonde spécifique reconnaissant les transcrits 1 et 2 de l’ARN
du virus Epstein-Barr (Bond ISH EBER probe, Leica).
Pour les chaines légère d’immunoglobulines, nous avons utilisé des sondes
spécifiques (Bond ISH Kappa/Lambda probe, Leica).
Dans tous les cas, le marquage a été fait après traitement enzymatique dans
l’automate BOND III (Menarini-Leica) avec révélation chromogénique par la
diaminobenzidine (DAB).
Sur 23 biopsies cutanées incluses en paraffine, nous avons réalisé avec l’aide
de Mme Nadine Martin (INSERM, U955 Equipe 9) une étude immunohistochimique
supplémentaire spécifique de la forme mutée p.Arg172Lys de IDH2 (Anticorps
NewEAST dilué à 1/100). La technique était faite manuellement avec incubation de
l’anticorps primaire 1h à température ambiante puis révélation avec un système
polymère
couplé
à
la
peroxydase
(Envision
anti
souris
K4000,
Dako.)
secondairement révélé par la DAB. Les lames étaient pré-traitées par la chaleur en
tampon EDTA pH9 pendant 30 minutes au bain Marie.
24
Les analyses morphologique et immunohistochimique ont été effectuées par
deux anatomopathologistes (ALA, NO) à l’aide d’une fiche standardisée (Excel) qui
recueillait les données suivantes :
-
Epidermotropisme (absence ou présence, abcès de Pautrier, syringotropisme,
folliculotropisme)
-
Signes inflammatoires épidermiques (absence, lésions eczématiformes,
lésions lichénoïdes, lésions psoriasiformes, pustules)
-
Densité de l’infiltrat tumoral (1 : cellules dispersées, 2 : cellules cohésives, 3 :
infiltrat dense en nappes)
-
Profondeur
de
l’infiltrat
tumoral
(derme
superficiel,
derme
profond,
hypoderme)
-
Topographie de l’infiltrat (péri-vasculaire, péri-annexiel, diffus, en bande sousépidermique)
-
Lymphocytes atypiques (absence, présence de cellules claires étirées, autre :
grandes cellules, cellules de Sézary)
-
Cellules inflammatoires d’accompagnement (polynucléaires neutrophiles,
éosinophiles, plasmocytes, histiocytes isolés ou en granulomes épithélioïdes)
-
Vascularite (absence, vascularite leucocytaire, vascularite lymphocytaire)
L’infiltrat tumoral était classé dans l’une des 4 catégories suivantes en fonction de
sa morphologie. Les groupes morphologiques ont été établis en fonction de notre
expérience.
-
Groupe 1 : infiltrat péri-vasculaire avec quelques cellules atypiques,
ressemblant à une dermatose inflammatoire
-
Groupe 2 : infiltrat péri-vasculaire dense avec présence de cellules atypiques
-
Groupe 3 : infiltrat dense avec aspects semblables à ceux observés dans le
ganglion (infiltrat dense avec cellules atypiques, hyperplasie vasculaire et
cellules inflammatoires d’accompagnement)
-
Groupe 4 : architecture inhabituelle ou association à un autre type de
lymphome (lymphome composite T ou B)
Concernant l’étude immunohistochimique, les données suivantes étaient notées :
-
Présence ou perte d’expression des marqueurs lymphocytaires T classiques
(CD2, CD3, CD5, CD7, CD4, CD8)
25
-
ratio CD4/CD8 (≤1, compris entre 1 et 2, > 2 et < 5, ≥5)
-
Présence ou absence de cellules B CD20
-
Semi-quantification des cellules exprimant les marqueurs TFH (CXCL13,
ICOS, PD1, CD10, BCL6) (absence, ≤5%, >5% et <50%, ≥50%)
-
Présence ou absence de marquage IDH2 R172K en faveur d’une mutation
d’IDH2 identifiable in situ.
La présence du virus EBV par hybridation in situ (sondes EBER) a également été
étudiée.
Les
cas
montrant
une
population
de
cellules
plasmocytaires
ou
plasmocytoïdes abondantes (nappes cohésives) ont fait l’objet d’une étude de
l’expression des chaînes légères d’immunoglobulines κ et λ par hybridation in situ.
26
C.
Etude moléculaire
Nous avons recherché la mutation RHOA p.Gly17Val sur 23 biopsies
cutanées. Parmi ces biopsies, nous avions dans 13 cas à la fois une biopsie cutanée
et une biopsie ganglionnaire (paire peau/ganglion). Nous avons utilisé comme
contrôles des prélèvements ganglionnaires de LAI issus de la cohorte TENOMIC
pour lesquels le statut mutationnel RHOA p.Gly17Val (muté ou non) était connu ainsi
que le patient présentant le syndrome DRESS (contrôle négatif pour l’analyse des
biopsies cutanées) et la lignée cellulaire Jurkat, transfectée stable avec une
construction portant la mutation RHOA p.Gly17Val (contrôle positif).
Parmi les 23 biopsies précédentes, 22 prélèvements ont également fait l’objet
d’une recherche de mutation IDH2 p.Arg172Lys et 21 ont été étudiés pour la
mutation IDH2 p.Arg172Ser.
Nous avons recherché uniquement la mutation de RHOA et deux types de
mutations de IDH2 et non celles de TET2 et DNMT3A pour des raisons techniques. Il
s’agit en effet de mutations ponctuelles récurrentes (« hotspots ») que l’on peut
chercher plus facilement d’un point de vue technique, en l’occurrence par PCR
spécifique d’allèle.
Nous avons délimité sur les lames HES les zones contenant plus de 20% de
cellules tumorales. Nous avons ensuite macrodisséqué ces zones sur les blocs de
paraffine et réalisé 5 coupes à 8 µm d’épaisseur. L’ADN était extrait à l’aide de
l’automate Maxwell 16IVD (Promega, Charbonnières-les-Bains, France) et du kit de
purification d’ADN Maxwell® 16 FFPE Plus LEV (Promega). L’ADN était ensuite
quantifié par spectrophotométrie avec l’appareil Nanodrop ND-1000 (Thermo Fisher
Scientific Inc., Waltham, MA, USA). L’ADN de la lignée cellulaire Jurkat (2x10 6
cellules) a été extrait à l’aide du kit Qiamp DNA mini (Qiagen).
Les sondes ont été conçues par le Dr Aurélie Dupuy (INSERM U955 équipe
9). La mise au point de la technique a été réalisée à l’aide d’échantillons issus de la
cohorte TENOMIC sur des cas de LAI mutés ou non, dont le pourcentage de
mutation RHOA p.Gly17Val était connu (Figure 5).
27
Nous avons utilisé deux amorces sens qui détectaient les variants sauvage et
muté RHOA p.Gly17Val et également deux amorces sens pour les variants sauvage
et muté de IDH2 p.Arg172Lys mais une amorce commune anti-sens (R1) pour
RHOA sauvage et muté p.Gly17Val. Différentes amorces anti-sens ont été utilisées
pour le variant sauvage (IDH2 Reverse R3) et muté p.Arg172Lys IDH2 (IDH2
Reverse R1) pour la détection par la technique standard de PCR sur gel d’agarose.
Une RT-qPCR a aussi été réalisée pour détecter la mutation RHOA p.Gly17Val avec
une seconde amorce anti-sens (R2). Pour les PCR spécifiques d’allèles RHOA et
IDH2, l’extrémité 3’ était spécifique du site muté et un mésappariement interne a été
introduit sur le second nucléotide de l’extrémité 3’ pour vérifier la spécificité. Pour la
RT-qPCR (RHOA), une sonde interne (6FAM en 5’ et MGBNFG Quencher en 3’ de
life technologies a été utilisée pour augmenter la spécificité (Figure 6).
1.
Les conditions de PCR
Les amplicons de PCR pour RHOA ont été produits avec de l’AmpliTaq Gold
(ThermoFisher Scientific) dans un volume final de 20 µl comportant 40 ng d’ADN, 10
µM d’amorces, 2 µl d’AmpliTaq gold master mix, 25mM de MgCl2 et 10 mM de
dNTPs.
Les conditions de PCR conditions étaient les suivantes : 1 cycle de 5 min à
95°C, suivi de 45 cycles de 30 sec à 95°C, 30 sec à 58°C et 45 sec à 72°C, et pour
finir 5 min à 72°C. La taille des amplicons (132pb) a été contrôlée par dépôt sur un
gel d’agarose à 2%.
Pour l’amplification d’IDH2, les amplicons de PCR ont été produits avec de
l’AmpliTaq Gold (ThermoFisher Scientific) dans un volume final de 20 µl comportant
20 ng d’ADN, 10 µM d’amorces, 2 µl d’AmpliTaq gold master mix, 25mM de MgCl2
et 10 mM de dNTPs.
Les conditions de PCR conditions étaient les suivantes : 1 cycle de 5 min à
95°C, suivi de 40 cycles de 30 sec à 95°C, 30 sec à 60°C et 45 sec à 72°C, et pour
28
finir 5 min à 72°C. La taille des amplicons (213pb) a été contrôlée par dépôt sur un
gel d’agarose à 2%.
2.
Les conditions de RT-qPCR
Les réactions de qPCR ont été effectuées dans un volume final de 20 µl
comportant 20 ng d’ADN, 10 µM d’amorces, 4µM de sonde fluorescente et 10µl de
TaqMan Gene Expression Master Mix (ThermoFisher Scientific) dans les conditions
suivantes : 1 cycle de 2 min à 50°C, 1 cycle de 10 min à 95°C, puis 45 cycles de 15
sec à 95°C, 1 min à 60°C à l’aide de l’automate Step One plus system (Applied
Biosystem).
29
Figure 5 - Mise au point de la technique de PCR allèle spécifique pour la
recherche de mutation RHOA p.Gly17Val
Les études de PCR ont été réalisées avec des échantillons d’ADN provenant
de patients avec un lymphome T angio-immunoblastique dont le statut mutationnel
était connu. Les patients 1 à 10 présentent une mutation RHOA p.Gly17Val avec une
fréquence allant de 3% (patient 4) à 38% (patient 10). Les résultats des patients 11 à
20 montrent une absence de mutation RHOA. La PCR RHOA p.Gly17Val est
spécifique de la mutation avec des résultats pertinents pour les contrôles positifs et
négatifs. La PCR wild type (non mutée) est positive pour tous les échantillons,
reflétant la présence de cellules non mutées issues du micro-environnement.
30
Figure 6 - Principe de la PCR allèle spécifique ARMS
31
D.
Corrélations entre le groupe morphologique, l’expression des
marqueurs TFH dans la peau et la présence d’une mutation RHOA ou
IDH2
Nous avons également regardé s’il existait un lien entre l’expression des
marqueurs TFH en immunohistochimie en fonction du groupe morphologique et la
présence d’une mutation RHOA p.Gly17Val ou IDH2 p.Arg172Ser ou p.Arg172Lys.
Pour ce faire, nous avons classés les cas selon le groupe morphologique (1,
2, 3 ou 4) auquel ils appartenaient et nous avons recueilli les résultats de l’étude
immunohistochimique des marqueurs TFH. Les 5 marqueurs TFH que nous avons
pris en compte étaient BCL6, CD10, ICOS, CXCL13 et PD1. Nous avons considéré
l’immunomarquage positif lorsque plus de 5% des cellules tumorales exprimaient le
marqueur (score 2 ou 3). Nous avons ensuite considéré comme positive l’expression
des marqueurs TFH lorsque 4 ou 5 marqueurs étaient exprimés. L’expression était
considérée partielle lorsque 2 ou 3 marqueurs étaient exprimés et l’expression
négative lorsque un seul ou aucun marqueur n’était présent en immunohistochimie.
Nous avons ensuite pris en compte la présence ou non d’une mutation RHOA
p.Gly17Val ou IDH2 p.Arg172Ser ou p.Arg172Lys. Pour finir, nous avons calculé le
nombre de cas par groupe pour lesquels il y avait une expression positive ou partielle
des marqueurs TFH ou la présence d’une mutation RHOA ou IDH2.
32
IV.
Résultats
A.
Analyse histopathologique
Les résultats de l’étude phénotypique sont résumés dans le tableau 3.
Des signes inflammatoires épidermiques étaient observés chez un peu moins
d’un tiers des patients. Il s’agissait d’une dermatose lichénoïde ou de remaniements
eczématiformes dans la plupart des cas. Nous avons également observé dans un
cas la présence d’une ulcération par nécrose ischémique et dans un autre cas une
hyperplasie épidermique. Un épidermotropisme a été retrouvé chez 7 patients sur les
43 biopsies analysables (16%) avec présence de micro-abcès de Pautrier dans trois
cas. Un syringotropisme était visible sur une autre biopsie.
La densité de l’infiltrat tumoral était variable. L’infiltrat était le plus souvent
constitué de cellules cohésives (38%). Un infiltrat dense, en nappes était retrouvé
dans un tiers des cas (35%) et dans un peu plus d’un quart des cas analysés (27%),
l’infiltrat était fait de cellules tumorales dispersées. Dans la moitié des cas, les
cellules tumorales infiltraient le derme sur toute sa hauteur, dans 20% des cas
uniquement le derme superficiel et dans 2,5% des cas uniquement le derme profond.
Dans un quart des cas, le derme profond et l’hypoderme étaient envahis.
L’hypoderme était rarement atteint (2,5%).
Dans la plupart des cas, les cellules tumorales avaient une disposition périvasculaire (82%). Il existait fréquemment une disposition péri-annexielle (49%). Un
infiltrat diffus était présent dans 24% des cas et plus rarement on observait une
disposition en bande sous-épidermique (6,5%), semblable à ce qui est observé dans
les lymphomes T épidermotropes de type mycosis fungoïdes.
Des lymphocytes atypiques étaient présents dans plus de la moitié des cas
sous la forme de cellules claires étirées ou de grandes cellules/cellules sézariformes.
Dans 70% des cas, des cellules inflammatoires d’accompagnement étaient
mêlées à l’infiltrat tumoral. Il s’agissait de polynucléaires neutrophiles (12%) ou
33
éosinophiles (16%), de plasmocytes (32%) et le plus souvent d’histiocytes formant
parfois des granulomes épithélioïdes (40%).
Des images de vascularite n’ont été retrouvées que dans un cas mais sur 5
biopsies nous avons observé une angiogénèse, classiquement décrite dans les
atteintes ganglionnaires.
Nous avons ensuite classé les localisations spécifiques de lymphome T angioimmunoblastique en 4 groupes en fonction des caractéristiques morphologiques
observées.
Nous avons observé autant de cas (11 cas sur 35, soit 31%) appartenant aux
groupes morphologiques 1 et 2, tels que définis dans le paragraphe matériel et
méthodes et illustrant des infiltrats d’aspect peu spécifique (groupe 1) ou pouvant
faire suspecter un lymphome à un pathologiste expérimenté (groupe 2). Dans notre
étude, seulement 12% des cas ont été classés dans le groupe morphologique 3,
c’est-à-dire réunissant les paramètres morphologiques utilisés pour le diagnostic des
localisations ganglionnaires de LAI (figure 7). Les cas restants (26%) ont été classés
dans le groupe 4, regroupant les autres modes d’infiltration. Nous avons observé
dans 2 cas, un infiltrat en bande sous-épidermique simulant un mycosis fongoïde
(figure 8). Dans un autre cas, nous avons observé un infiltrat diffus et monomorphe
fait de grands lymphocytes T atypiques. Des lésions d’allure inflammatoire ont été
observées, incluant des aspects de vascularite lymphocytaire, urticaire ou des
lésions
infectieuses
herpétiques
avec
présence
de
virus
HSV
en
immunochistochimie, dans un cas à chaque fois. Dans 4 cas, il existait un lymphome
composite associant au lymphome T angio-immunoblastique un lymphome B, de
type plasmocytoïde dans 2 cas et de type lymphome B diffus à grandes cellules
EBV+ dans les 2 autres cas (figures 10 et 11).
34
Tableau 3 – Résumé des résultats de l’étude phénotypique
Epidermotropisme :
Valeur (%)
Remaniements épidermiques
16%
Commentaires
Abcès de Pautrier (n=3)
Folliculotropisme (n=1)
Syringotropisme (n=1)
Lésions inflammatoires :
Eczématiforme
Lichénoïde
Autre
29%
7%
10%
10%
Remaniements dermiques
Densité de l’infiltrat :
1 (faible, cellules dispersées)
2 (cellules cohésives)
3 (infiltrat dense, en nappe
27%
38%
35%
Topographie de l’infiltrat :
Péri-vasculaire
Péri-annexielle
Diffuse
En bande sous-épidermique
82%
49%
24%
6,5%
Profondeur de l’infiltrat :
Derme superficiel
Dermes superficiel et profond
Derme profond
Totalité du derme et hypoderme
Derme profond et hypoderme
20%
50%
2,5%
25%
2,5%
Présence de lymphocytes atypiques:
Lymphocytes clairs étirés
Autres (grandes cellules/cellules sézariformes)
Les 2 types
60%
58%
34%
8%
Cellules inflammatoires d’accompagnement:
Polynucléaires éosinophiles
Polynucléaires neutrophiles
Plasmocytes
Histiocytes/granulomes
70%
16%
12%
32%
40%
Remaniements vasculaires:
Vascularite
Angiogénèse
2%
11%
Groupe morphologique
Groupe 1 (infiltrat périvasculaire non spécifique)
31%
Groupe 2 (infiltrat dense périvasculaire atypique)
31%
Groupe 3 (similaire LAI ganglionnaire)
12%
Groupe 4 (autres)
26%
En bande : n=2
Grandes cellules : n=1
Lésions inflammatoires : n=3
Lymphome composite :
- Plasmocytoide : n=2
- DLBCL EBV+ : n=2
DLBCL = lymphome B diffus à grandes cellules
35
Figure 7 – Exemples d’infiltrats cutanés des groupes morphologiques 1, 2 et 3
A. Infiltrat cutané du groupe morphologique 1. Infiltrat lymphocytaire périvasculaire
discret du derme superficiel sans atypie lymphocytaire marquée
B. Infiltrat cutané du groupe morphologique 2. Infiltrat lymphocytaire modéré à
marqué avec lymphocytes clairs étirés.
C et D. Infiltrat cutané du groupe morphologique 3. C : infiltrat lymphocytaire dense
atteignant l’ensemble du derme, composé de lymphocytes clairs mêlés à des
polynucléaires éosinophiles, des petits lymphocytes et des vaisseaux à endothélium
turgescent. D : infiltrat dense composé de lymphocytes mêlés à des histiocytes
parfois multinucléés et des vaisseaux à endothélium turgescent.
36
Figure 8 - Exemples de localisations cutanées de LAI
A et B : LAI épidermotrope montrant un infiltrat sous-épidermique en bande
composé de lymphocytes atypiques avec des noyaux irréguliers, hyperchromatiques.
Présence de cellules épidermotropes alignées sous la membrane basale ou
groupées en amas semblables à des micro-abcès de Pautrier.
C et D : Localisation cutanée de LAI faite de plages de grandes cellules suggérant
une transformation de haut grade.
37
B.
Analyse phénotypique
Les résultats de l’étude immunohistochimique sont résumés dans le tableau 4
et des illustrations représentatives des aspects phénotypiques des groupes
morphologiques 1, 2 et 3 et des lymphomes composites sont présentées dans les
figures 9, 10 et 11.
Les pertes antigéniques T étaient inconstantes. Le CD2 et le CD5 étaient
conservés dans tous nos échantillons. Le CD7 était l’antigène le plus souvent perdu
dans les cellules tumorales, dans plus d’un tiers des cas. Le CD3 était perdu dans
seulement 3 biopsies de notre cohorte (7%).
Dans plus de 80% des cas, le ratio CD4/CD8 était supérieur à 1. Ainsi dans un
cas sur 5, la population T CD8+ réactionnelle était autant voire plus abondante que la
population tumorale T CD4+. Dans deux tiers des cas (67%), ce ratio était supérieur
à 2 et dans 44% des cas il était supérieur à 5.
Concernant les marqueurs TFH, ICOS et PD1 étaient les marqueurs les plus
fréquemment exprimés, retrouvés dans 86% et 90% des cas respectivement. De
plus, ils étaient exprimés de façon significative dans plus de 5% des cellules
tumorales sur la majorité des prélèvements et dans plus de 50% des cellules
tumorales dans environ la moitié de nos échantillons. L’expression de CXCL13 était
également très fréquente (78%) mais le nombre de cellules tumorales positives était
plus variable. Dans un tiers des cas, ce marqueur était exprimé dans moins de 5%
des cellules tumorales et seulement dans un tiers des cas dans plus de 50% des
cellules tumorales. CD10 était exprimé dans environ la moitié des cas, mais comme
pour CXCL13, la proportion de cellules positives était souvent faible (80% des cas
comportant moins de 50% de cellules tumorales positives). BCL6 était retrouvé dans
8 cas sur 10 mais dans moins de 5% des cellules la plupart du temps, sans que l’on
sache de plus s’il s’agissait de cellules T néoplasiques ou de cellules B de
l’environnement (figure 9).
Trois quarts des échantillons étudiés comportaient des lymphocytes B CD20,
parfois sous forme d’immunoblastes. Des cellules B EBV+ ont été retrouvées dans
38
26% des échantillons, toujours sous la forme de cellules dispersées minoritaires, en
dehors des cas de lymphomes B EBV+.
Sur
les
23
biopsies
pour
lesquelles
nous
avons
effectué
une
immunohistochimie IDH2 p.Arg172Lys, seul un cas montrait un immunomarquage
positif (4%), suggérant la présence de la mutation correspondante à l’échelon
génique (figure 12).
39
Tableau 4 - Résultats de l’étude immunohistochimique pour l’ensemble des
cas étudiés et en fonction du groupe morphologique de lymphome T angioimmunoblastique
Phénotype lymphocytaire
classique
Valeur (%)
Tous les cas
(n=46)
Valeur (%)
Groupe 1
(n=11)
Valeur (%)
Groupe 2
(n=11)
Valeur (%)
Groupe 3
(n=4)
Perte antigénique T
CD2
CD3
CD5
CD7
0
7
0
36
0
0
0
18
0
18
0
45
0
0
0
25
<=1
>1-2
>2-<5
>=5
18
15
23
44
20
20
40
20
12
33
22
33
0
33
67
0
Présence de lymphocytes CD20+
76
80
70
75
Lymphocytes EBV+ (EBER)
26
10
9
75
Ratio CD4/CD8
Infiltrat tumoral – expression des marqueurs TFH
CD10 :
48
30
55
100
1
2
3
35
45
20
0
67
33
50
33
17
25
75
0
CXCL13 :
78
64
90
100
1
2
3
31
34
34
14
57
29
30
30
40
25
25
50
PD1 :
86
100
100
100
1
2
3
6
38
56
9
45,5
45,5
0
20
80
25
25
50
ICOS :
90
100
100
100
1
2
3
6
44
50
10
50
40
0
50
50
0
50
50
BCL6 :
82
82
100
75
1
2
3
79
21
0
89
11
0
80
20
0
33
67
0
Légende :
1 = ≤5% des cellules tumorales
2 = 5-50% des cellules tumorales
3 = ≥50% des cellules tumorales
40
Figure 9 - Phénotypes de localisations cutanées de LAI
A, B, C, D, E : infiltrats cutanés du groupe morphologique 1. Faible infiltrat
périvasculaire composé de lymphocytes (A) montrant des cellules CXCL13+
espacées
(B) et des nombreuses cellules PD1+ (C). Autre cas montrant des
lymphocytes T CD2+ (D) exprimant fortement le CD10 (E), soulignant leur nature
tumorale.
F, G, H, I, J. Infiltrats cutanés du groupe morphologique 2. Lymphocytes T CD5+ (G)
néoplasiques avec lymphocytes CXCL13+ dispersés (H) et nombreuses cellules
PD1+ (I) et ICOS+ (J)
K, L, M, N, O, P. Infiltrats cutanés du groupe morphologique 3. Une partie des
cellules CD5+ (M) sont des lymphocytes réactionnels CD8+ (L) et un nombre
significatif exprime CXCL13 (N), PD1 (O) et ICOS (P).
41
Figure 10 - Lymphome composite de type lymphome B diffus à grandes
cellules EBV+ associé à une localisation cutanée de LAI
A.
Infiltrat lymphocytaire dense de l’ensemble du derme. B. La plupart des
lymphocytes sont des cellules T exprimant CD3. C. La plupart des lymphocytes
expriment ICOS. D. Une proportion significative de lymphocytes sont des
lymphocytes B CD20+, le plus souvent groupés dans la partie inférieure du derme.
E. Dans le derme profond, l’infiltrat est formé des plages de grandes cellules
immunoblastes-like atypiques. F. Les cellules B atypiques immunoblastes-like
expriment fortement EBER en hybridation in situ.
42
Figure 11 - Lymphome composite de type lymphome B plasmocytoïde associé
à une localisation cutanée de LAI
A et B. Infiltrat lymphocytaire dense du derme organisé autour des vaisseaux
dermiques et des annexes. La majorité des lymphocytes expriment fortement PD1.
C et D. Les plasmocytes entourant les cellules T néoplasiques présentent une
restriction de la chaine légère κ en hybridation in situ
43
Figure 12 – Localisation cutanée de LAI avec immunohistochimie IDH2 R172K
positive
44
C.
Analyse moléculaire
1.
Mutation RHOA p.Gly17Val
Les résultats de l’étude moléculaire de RHOA sont résumés dans le tableau 5 et
l’ensemble des résultats de l’étude moléculaire (peau et ganglion pour la recherche
des mutations RHOA et IDH2) concernant chaque patient apparaît dans le tableau 6.
Au total, nous avons obtenu 18 échantillons de biopsie cutanée avec des
résultats de PCR interprétables. Sur ces 18 cas, nous avons retrouvé une mutation
RHOA p.Gly17Val dans 14 échantillons, soit 78% des cas.
En ce qui concerne les paires peau/ganglion, 11 paires de prélèvements
étaient interprétables (2 paires avec des résultats non interprétables en raison d’une
PCR wild type non concluante (suggérant une mauvaise qualité de l’ADN) et 1 paire
sans résultat pour le ganglion, considéré comme un prélèvement cutané isolé)
(Figure 13).
Dans 7 paires (64%), la mutation RHOA p.Gly17Val était présente à la fois
dans la peau et dans le ganglion. Dans deux paires, nous n’avons retrouvé aucune
mutation RHOA p.Gly17Val ni dans le ganglion ni dans la peau. Mais dans 2 cas, les
résultats de recherche de mutation RHOA p.Gly17Val entre les échantillons cutanés
et ganglionnaires étaient discordants : dans un cas, une mutation RHOA a été
identifiée au niveau ganglionnaire mais pas cutané et dans l’autre cas, la mutation
RHOA était présente au niveau cutané mais pas ganglionnaire. Le cas non muté au
niveau cutané avait fait l’objet d’une étude de clonalité T sur la peau, qui montrait un
profil monoclonal avec réarrangement du TCR, indiquant la présence effective des
cellules T néoplasiques in situ, à une proportion détectable par la technique de PCR.
Nous disposions des résultats d’étude de clonalité pour 10 prélèvements.
Dans 9 cas, un réarrangement monoclonal du récepteur T était présent au niveau
cutané. Pour le dernier cas, les résultats n’étaient pas interprétables.
Nous signalons qu’une mutation RHOA p.Gly17Val a été observée au
minimum une fois dans chacun des groupes morphologiques 1 à 4.
45
2.
Mutations IDH2 p.Arg172Lys et p.Arg172Ser
Nous avons recherché les mutations IDH2 p.Arg172Lys et p.Arg172Ser sur
les échantillons analysés précédemment. Nous avons retrouvé une mutation IDH2
p.Arg172Ser à la fois aux niveaux cutané et ganglionnaire dans une seule des 11
paires analysables (7%). Ce cas présentait également une mutation de RHOA.
Nous avons mis en évidence une mutation IDH2 p.Arg172Lys à la fois sur les
prélèvements cutané et ganglionnaire chez un même patient dans un cas. Dans un
autre cas, cette mutation n’a été retrouvée que sur la biopsie de peau alors qu’elle
était absente au niveau ganglionnaire.
Sur les échantillons cutanés sans prélèvement ganglionnaire associé, nous
n’avons jamais retrouvé de mutation IDH2 p.Arg172Lys ni p.Arg172Ser.
46
Tableau 5 - Résultats de l’analyse moléculaire pour la recherche de mutation
RHOA p.Gly17Val (paires peau/ganglion chez le même patient et biopsies
cutanées seules)
Paires peau / ganglion (n=11)
Peau mutée / ganglion muté
7 (64%)
Peau mutée / ganglion non muté
1 (9%)
Peau non mutée / ganglion muté
1 (9%)
Peau non mutée / ganglion non muté
2 (18%)
Biopsies cutanées isolées (n=7)
Peau mutée
6 (86%)
Peau non mutée
1 (14%)
Total (peau) (n=18)
Peau mutée
14 (78%)
Peau non mutée
4 (22%)
47
Tableau 6 - Résultats de l’analyse moléculaire cas par cas pour la recherche de
mutation RHOA p.Gly17Val, IDH2 p.Arg172Lys et p.Arg172Ser
Cas
Diagnostic
Groupe
morphologique
Peau
Peau
Peau
Ganglion
Ganglion
Ganglion
RHOA
G17V
WT
IDH2
R172K
WT
IDH
R172S
WT
RHOA
G17V
M
IDH2
R172K
WT
IDH2
R172S
WT
1
LAI
1
2
LAI
Recrutement
M
WT
WT
WT
WT
WT
3
LAI
2
M
WT
WT
M
WT
WT
4
LAI
2
M
WT
WT
NI
NI
NI
5
LAI
3
WT
M
WT
WT
WT
WT
6
LAI
4
M
WT
M
M
WT
M
7
LAI
4
M
WT
WT
M
WT
WT
8
LAI
1
M
WT
WT
M
WT
WT
9
LAI
2
M
NI
NI
M
WT
WT
10
LAI
1
M
WT
WT
M
WT
WT
11
LAI
2
NI
NI
NI
M
WT
WT
12
LAI
1
M
WT
WT
M
WT
WT
13
LAI
3
WT
WT
WT
14
LAI
2
M
WT
WT
15
LAI
4
M
WT
WT
16
LAI
4
NI
NI
NI
17
LAI
3
M
WT
WT
18
LAI
3
NI
NI
NI
19
LAI
2
M
WT
WT
20
LAI
2
M
21
LAI
WT
M
WT
M
CT 1
Lésion NS
WT
WT
WT
M
WT
CT 2
DRESS
WT
WT
WT
Légende :
M = cas muté
NI = résultat non interprétable
WT = cas non muté (sauvage)
LAI = lymphome T angio-immunoblastique
CT = contrôle
Lésion NS = lésion non spécifique
Les biopsies cutanées contrôles ont été réalisées chez des patients avec un
LAI prouvé au niveau ganglionnaire.
48
Figure 13 - Résultats de PCR RHOA p.Gly17Val sur échantillons cutanés et
ganglionnaires
Résultats pour 6 cas pour lesquels de l’ADN extrait à la fois du ganglion et de la
peau et de 4 contrôles (3 ganglions dont 2 avec mutation RHOA et un non muté), et
de la lignée cellulaire Jurkat modifiée portant la mutation RHOA p.Gly17Val.
Des résultats discordants entre la peau et le ganglion sont observés pour les cas 1
(ganglion muté seul) et 2 (peau mutée seule).
Légende :
GG = ganglion
P = peau
49
D.
Comparaison entre le profil morphologique, l’expression des
marqueurs TFH en immunohistochimie et la présence d’une mutation
RHOA p.Gly17Val
Nous avons également regardé s’il existait un lien entre l’expression des
marqueurs TFH en immunohistochimie en fonction du groupe morphologique et la
présence d’une mutation RHOA p.Gly17Val (Tableaux 7 et 8).
Sur les 19 biopsies cutanées analysées au niveau moléculaire, 16 ont pu être
comparées (13 cas avec expression des marqueurs TFH, 2 cas avec expression
partielle et 1 cas sans expression) car 3 biopsies présentaient des résultats
immunohistochimiques incomplets, avec un ou plusieurs marqueurs TFH non
interprétables.
Dans 77% des cas (10/13) les cellules tumorales exprimant les marqueurs
TFH en immunohistochimie (4 ou 5 marqueurs positifs) présentaient une mutation de
RHOA. Dans 3 cas sur 13, l’expression immunohistochimique des marqueurs TFH
était positive mais la recherche moléculaire s’est révélée négative. Lorsque
l’expression des marqueurs TFH était partielle (2 ou 3 marqueurs positifs sur les 5),
dans un cas nous avons retrouvé une mutation RHOA p.Gly17Val et dans l’autre cas
nous ne l’avons pas mise en évidence. Pour finir, le dernier cas ne présentait ni
mutation ni expression des marqueurs TFH en immunohistochimie. A noter qu’aucun
cas de notre série ne portait de mutation RHOA sans exprimer les marqueurs TFH
en immunohistochimie.
Il est intéressant de remarquer que les deux prélèvements cutanés sur
lesquels nous avons retrouvé une mutation IDH2 p.Arg172Ser ou p.Arg172Lys
présentaient chacun une positivité des marqueurs TFH en immunohistochimie.
Parmi les 11 cas du groupe morphologique 1, 3 cas (27%) avaient une
expression significative de marqueurs TFH et 6 (55%) une expression partielle. Trois
cas, exprimant au moins partiellement les marqueurs TFH en immunohistochimie
présentaient une mutation de RHOA. Dans les 11 cas du groupe 2, 4 cas (36%)
avaient une expression significative de marqueurs TFH et 5 cas (46%) une
50
expression partielle. Il est intéressant de noter que nous avons retrouvé une mutation
du gène RHOA dans un cas ne présentant pas d’expression des marqueurs TFH en
immunohistochimie. Pour les groupes morphologiques 3 et 4, tous les cas
présentaient
une
expression
au moins
partielle
des marqueurs TFH
en
immunohistochimie. Nous avons mis en évidence une mutation RHOA p.Gly17Val et
une mutation IDH2 p.Arg172Lys dans le groupe 3 sur 4 cas, soit 50% des cas et 3
mutations RHOA p.Gly17Val et une mutation IDH2 p.Arg172Ser sur les 9 cas du
groupe 4, soit 44% des cas.
51
Tableau 7 - Comparaison entre l’expression des marqueurs TFH en
immunohistochimie et la présence d’une mutation RHOA p.Gly17Val
Mutation +
Mutation -
Total
TFH +
10
3
13
TFH -
0
1
1
TFH partielle
1
1
2
Total
11
5
16
Légende :
TFH+ = expression des marqueurs TFH (4 ou 5 marqueurs) en
immunohistochimie
TFH- = absence d’expression des marqueurs TFH (0 ou 1 marqueur) en
immunohistochimie
TFH partielle = expression partielle des marqueurs TFH (2 ou 3 marqueurs) en
immunohistochimie
MUTATION + = présence d’une mutation RHOA p.Gly17Val
MUTATION - = absence de détection de la mutation RHOA p.Gly17Val
52
Tableau 8 – Comparaison entre l’expression des marqueurs TFH et la présence
d’une mutation RHOA ou IDH2 en fonction du groupe morphologique
TFH +
TFH p
TFH -
RHOA m
IDH2 m
TFH +/p ou
IDH2/RHOA m
Groupe 1
3 (27%)
6 (55%)
2 (18%)
3 (27%)
0
9/11 (82%)
4 (36%)
5 (46%)
2 (18%)
6 (55%)
0
10/11 (91%)
2 (50%)
2 (50%)
0
1 (25%)
1 (25%)
4/4 (100%)
Groupe 4 2 (22%)
7 (78%)
0
3 (33%)
1 (11%)
9/9 (100%)
11/35
20/35
4/35
13/16
2/14
32/35 (91%)
(32%)
(57%)
(11%)
(81%)
(14%)
(n=11)
Groupe 2
(n=11)
Groupe 3
(n=4)
(n=9)
Total
Légende :
TFH + = expression des marqueurs TFH (4 ou 5 marqueurs) en
immunohistochimie
TFH p = expression partielle des marqueurs TFH (2 ou 3 marqueurs) en
immunohistochimie
TFH - = absence d’expression des marqueurs TFH (0 ou 1 marqueur) en
immunohistochimie
RHOA m = présence d’une mutation RHOA p.Gly17Val
IDH2 m = présence d’une mutation IDH2 p.Arg172Ser ou p.Arg172Lys
53
V.
Discussion
Dans cette étude, nous avons étudié les caractéristiques morphologiques,
phénotypiques et moléculaires de la série la plus importante de localisations
cutanées de lymphome T angio-immunoblastique décrite à ce jour. Nous avons mis
en évidence la présence des mutations RHOA p.Gly17Val et IDH2 p.Arg172Lys et
p.Arg172Ser au niveau cutané, pour la première fois, à notre connaissance, dans
cette localisation.
Nous confirmons que les infiltrats cutanés de LAI sont de nature néoplasique,
puisque l’on peut identifier in situ la présence de cellules T exprimant des marqueurs
de différenciation TFH (CD10, BCL6, ICOS, PD1 et CXCL13) dans la majorité des
cas. En effet, 89% des cas que nous avons étudié présentaient une expression
positive (32% des cas avec 4 ou 5 marqueurs TFH exprimés) ou partielle (57% des
cas avec 2 ou 3 marqueurs TFH exprimés). Ces résultats ne sont pas attendus dans
des infiltrats T non néoplasiques.
Cependant, aucun de ces marqueurs n’est suffisant à lui seul pour
caractériser ce phénotype TFH et certains marqueurs peuvent être exprimés dans
d’autres lymphomes T cutanés, par exemple PD1 dans le syndrome de Sézary ou en
situation inflammatoire. Il est notamment logique de trouver des lymphocytes TFH
dans les infiltrats cutanés comportant des follicules lymphoïdes actifs (infiltrats
réactionnels et lymphome B cutané de la zone marginale).
La nature néoplasique des infiltrats cutanés de LAI avait déjà été soulignée
par des études antérieures, ayant montré la présence in situ d’un clone T tumoral ou
de cellules exprimant le marqueur CXCL13 (8). La prévalence des marqueurs de
différenciation TFH dans la peau est proche de ce qui est décrit dans les autres
localisations, en particulier dans les localisations ganglionnaires. Les marqueurs les
plus fréquemment exprimés étant PD1 et ICOS (43), et le plus rarement exprimé
CD10 (44). De façon intéressante, les cellules B EBV classiquement présentes dans
les ganglions et retrouvées dans près de 95% des cas (42), peuvent également être
recrutées in situ dans la peau et représenter un paramètre diagnostique d’intérêt.
Nous en avons trouvé dans 25% des cas. Il paraît donc recommandé d’effectuer une
54
étude des marqueurs TFH et de rechercher la présence du virus EBV sur les
biopsies cutanées des patients présentant un infiltrat non étiqueté suspect ou ayant
un LAI probable ou connu.
L’identification de pertes d’antigène pan-T ou « trous phénotypiques » est
classique dans les lymphomes T. Ces pertes antigéniques ne sont pas spécifiques
mais peuvent aider à distinguer un lymphome T d’un infiltrat réactionnel.
L’identification de pertes antigéniques est un argument phénotypique supplémentaire
en faveur du caractère néoplasique des lésions cutanées de LAI. Dans notre série, il
ressort une perte préférentielle de l’antigène CD7 dans plus d’un tiers des cas (36%)
suivie de la perte du CD3, beaucoup plus rare (7%). Le CD2 et le CD5 étaient
conservés dans tous nos prélèvements. Le Groupe d’Etude des Lymphomes de
l’Adulte (GELA) montrait sur 157 biopsies ganglionnaires, une expression dans 100%
des cas du CD3, 95% des cas du CD4, 91% des cas du CD2, 85% des cas du CD5,
et 50% des cas du CD7 (46). Dans le sang, il est classique et fréquent d’observer
une diminution de l’expression membranaire de CD3 en cytométrie de flux (45).
Concernant les marqueurs T, il y a dans certains cas de nombreuses cellules
T CD8 réactionnelles. Dans près d’un cas sur 5 (18%), nous avions un ratio
CD4/CD8 inférieur ou égal à 1, ce qui signifie que les lymphocytes T réactionnels
CD8+ étaient dans ces cas plus nombreux ou aussi nombreux que les lymphocytes T
CD4+. Dans ces situations, il peut être difficile de mettre en évidence les cellules
tumorales parmi les nombreuses cellules réactionnelles qui les accompagnent.
D’un point de vue morphologique, les infiltrats cutanés de LAI peuvent être
classés en quatre groupes, soulignant d’une part l’important polymorphisme des
lésions et d’autre part l’existence de formes morphologiquement très difficiles à
caractériser (groupe 1). Nous avions déjà rapporté par exemple que les infiltrats
cutanés de LAI peuvent être épidermotropes et ainsi simuler d’autres types de
lymphomes comme le mycosis fongoïdes (31). Dans notre série, 7 cas (16%) étaient
épidermotropes, dont trois présentaient des micro-abcès de Pautrier, classiquement
décrits dans le mycosis fongoïdes.
55
La plupart des cas du groupe 1 (9 cas sur 11), représentant environ un tiers
des biopsies, présentaient des marqueurs TFH positifs en immunohistochimie et ont
en pratique permis de confirmer le diagnostic de localisation spécifique de LAI. Les 2
autres cas présentaient une perte antigénique du CD7, très en faveur d’une
localisation tumorale et pour l’un des 2 cas, un réarrangement monoclonal du TCR
était mis en évidence.
Les échantillons classés dans le groupe 3, dont les aspects morphologiques
sont proches de ceux observés au niveau ganglionnaire et supposés mener
facilement au diagnostic, étaient peu nombreux et ne représentaient que 11% des
cas, soulignant la difficulté du diagnostic dans la peau.
Une situation où le diagnostic de localisation cutanée de LAI est certainement
la plus difficile est celle des lymphomes composites, où le contingent néoplasique B
peut se trouver au premier plan. Notre série comporte quatre lymphomes
composites, classés dans le groupe morphologique 4. Deux associent un lymphome
B diffus à grandes cellules EBV+ à un LAI et deux autres, un lymphome B
plasmocytoïde à un LAI. Il s’agit des 2 types histologiques les plus fréquents de
lymphome composite impliquant un lymphome angio-immunoblastique. On suppose
que la capacité immunosuppressive des lymphomes T rend possible la prolifération
et l’immortalisation des cellules B infectées par l’EBV (40). Les lymphomes
composites associant un lymphome B diffus à grandes cellules et un lymphome T
périphérique sont le plus souvent EBV+ (40). Nous avons visualisé des cellules
EBV+ après hybridation in situ dans les 4 lymphomes composites de notre série.
Les cellules EBV+ sont détectées dans la plupart des localisations
ganglionnaires de LAI. Bien que l’infection/la réactivation virale apparaisse comme
une conséquence du déficit immunitaire, l’EBV pourrait jouer un rôle dans la
modulation des cytokines, des chimiokines et des récepteurs membranaires et
favoriser le développement du micro-environnement tumoral et la progression de la
maladie (12).Les cellules B EBV+ présentent les protéines virales EBV (EBNA-1) en
association avec les molécules du CMH de classe II, régulées par le ligand CD28
(B7). Elles fournissent des signaux de co-stimulation pour l’activation des cellules
TFH.
56
Il a été rapporté que l’expression de PD1 en immunohistochimie est
significativement corrélée avec la présence d’une mutation RHOA p.Gly17Val dans
les localisations ganglionnaires (33). Tous les cas mutés RHOA de notre étude (12
cas et 3 cas avec immunohistochimie non interprétable) présentaient un
immunomarquage
positif
pour
PD1,
à
l’exception
d’un
cas
pour
lequel
l’immunohistochimie s’est révélée négative.
De façon générale , nous observons une fréquence élevée de mutations
RHOA p.Gly17Val au niveau cutané, proche de ce qui a été décrit dans les
localisations ganglionnaires. En effet, près de 8 cas sur 10 (78%) des cas de notre
série présentaient une mutation RHOA p.Gly17Val. Ce chiffre semble appartenir à la
fourchette haute de ce qui est décrit dans la littérature au niveau ganglionnaire mais
le faible nombre de cas fait que ce résultat est à prendre avec précaution (18 cas
versus 35 à 72 cas).
Nous pouvons émettre l’hypothèse que les malades ayant un LAI muté pour
RHOA pourraient avoir une prédisposition à l’envahissement cutané. RHOA code
pour une GTPase impliquée dans le cytosquelette et l’adhésion cellulaire. Il est
envisageable qu’une mutation de RHOA puisse favoriser une perte de l’adhésion
cellulaire et une migration des cellules tumorales du ganglion vers des sites
périphériques tels que la peau.
Pour chaque groupe morphologique (de 1 à 4), nous avons retrouvé au moins
une fois une mutation RHOA p.Gly17Val. Cette recherche moléculaire pourrait
devenir un outil diagnostique précieux dans les cas difficiles, du groupe 1 en
particulier et comportant peu de cellules tumorales. Notre étude démontre par
ailleurs l’efficacité de la PCR même lorsque le prélèvement comporte peu de cellules
tumorales (groupes 1 et 2). En l’occurrence, dans seulement un cas (cas 11 du
tableau 6), nos résultats de PCR n’étaient pas interprétables sur le prélèvement
cutané. De façon intéressante, l’étude de clonalité avait permis de mettre en
évidence un réarrangement monoclonal du TCR sur ce même prélèvement. Un
réarrangement monoclonal des gènes du TCR serait présent dans 80% des cas de
LAI typique (35). Ces deux techniques pourraient donc s’avérer complémentaires
57
dans les cas atypiques ou présentant peu de cellules tumorales, ou les cas où l’ADN
est de mauvaise qualité. Il pourrait donc être recommandé d’effectuer la recherche
de mutation RHOA simultanément à l’étude de clonalité en pratique de routine.
Par ailleurs, nous avons observé de façon inattendue, 2 paires montrant des
résultats discordants concernant la mutation RHOA
p.Gly17Val entre
les
prélèvements cutané et ganglionnaire. Dans un cas, une mutation RHOA était
identifiée au niveau ganglionnaire mais pas cutané (alors que l’étude de clonalité
était interprétable et montrait un profil monoclonal) et dans l’autre cas, la mutation
RHOA était présente au niveau cutané mais pas ganglionnaire. Ces résultats
pourraient témoigner de l’hétérogénéité intra-tumorale. Les cellules tumorales
pourraient présenter un profil moléculaire différent, soit à l’intérieur d’un même site,
avec prédominance de cellules portant ou non une mutation ; soit entre deux sites
envahis par la même maladie mais dont le profil moléculaire ne serait pas le même.
Pour ce qui est d’IDH2 nous avons trouvé beaucoup moins de cas muté. Nous
avons mis en évidence 3 mutations IDH2 (1 mutation p.Arg172Ser et 2 mutations
p.Arg172Lys) sur les 16 prélèvements cutanés que nous avons étudié, soit 19%. Une
mutation IDH2 p.Arg172X était retrouvée dans 30% des LAI dans l’étude de SakataYanagimoto et collaborateurs (25). Cette discordance pourrait être due au fait que
nous n’avons étudié que les mutations p.Arg172Ser et p.Arg172Lys alors que
d’autres substitutions ont été décrites sur ce codon, même si la mutation IDH2
p.Arg172Lys semble de loin la plus fréquente dans les LAI. Dans l’étude de SakataYanagimoto et collaborateurs, les mutations IDH2 étaient toujours associées à des
mutations de RHOA et TET2 (25). L’auteur suggère que les mutations TET2
précèderaient celles de RHOA et/ou IDH2 dans la plupart des cas. Une hypothèse
serait donc que des mutations d’IDH2 ne seraient pas encore apparue dans les
échantillons que nous avons étudiés mais aucune donnée dans la littérature ne
permet de penser que les mutations de RHOA précèdent celles d’IDH2. Dans l’un
des 2 cas mutés IDH2, le prélèvement porte également une mutation de RHOA alors
qu’elle est absente sur l’autre échantillon. L’association des mutations RHOA et IDH2
est déjà décrite dans la littérature, suggérant que ces mutations ne sont
probablement pas « driver » malgré leur fréquence et rend cohérente l’hypothèse de
l’hétérogénéité intra-clonale pour la mutation de RHOA que nos résultats suggèrent.
58
En ce qui concerne l’étude immunohistochimique IDH2 R172K, nous n’avons
retrouvé qu’un cas positif, suggérant fortement la présence d’une mutation, sur une
seule des 23 biopsies cutanées étudiées. Ce résultat est en cours de validation à
l’échelle moléculaire. Parmi ces cas, 6 ont été étudiés en biologie moléculaire et les
résultats sont concordants avec une absence de marquage en immunohistochimie et
une absence de mutation en biologie moléculaire. Ces résultats sont faibles en
comparaison de la littérature qui retrouve une mutation IDH2 p.Arg172Lys dans 20%
des LAI au minimum. Nos résultats peuvent s’expliquer par des problèmes
techniques. En effet, cette immunohistochimie est très difficile à réaliser d’un point de
vue technique et certaines lames blanches que nous avons utilisées étaient
probablement trop anciennes, ce qui a pu se traduire par des résultats faussement
négatifs. Les cas qui ont été étudiés au niveau moléculaire pour lesquels le matériel
(tissus inclus et/ou ADN) reste suffisamment abondant bénéficieront d’une étude
immunohistochimique IDH2 R172K et inversement, pour compléter l’étude.
A côté des localisations cutanées de LAI, d’autres lymphomes cutanés
peuvent exprimer des marqueurs de différenciation TFH. C’est notamment le cas du
groupe encore provisoire dans la classification OMS 2008 des lymphomes T cutanés
primitifs CD4+ pléomorphes à petites et moyennes cellules. Ces lésions sont en
général unique et expriment volontiers CXCL13, PD1 et ICOS. Les cellules EBV+ ne
sont pas retrouvées. L’évolution est souvent favorable (41).
Il a par ailleurs été décrit des lymphomes TFH cutané primitifs. Ces
lymphomes, dont l’individualisation est encore sujette à débat, ne s’accompagnent
pas de manifestation systémique et semblent avoir une évolution indolente. Ils ont
été décrits à partir de petites séries de cas sous la forme d’infiltrats dermiques diffus
composés de lymphocytes CD4 pléomorphes, de taille moyenne à grande, de
nombreuses cellules B avec quelques immunoblastes. Au moins 2 marqueurs TFH
sont exprimés par les cellules tumorales parmi les 5 classiquement étudiés sur
coupes (CD10, BCL6, PD1, ICOS, CXCL13). De plus, dans la série de Battistella et
collaborateurs, aucun lymphome comportant des cellules EBV+ n’était retrouvé (32).
Il serait intéressant de rechercher les mutations classiquement décrites dans les LAI
59
pour savoir si ces deux types de lymphomes présentent des caractéristiques
moléculaires similaires.
Les localisations cutanées de LAI ont un large spectre de présentations
morphologiques, incluant dans un tiers des cas des infiltrats histologiquement peu
spécifiques et peu suspects de lymphome. A côté de la caractérisation phénotypique
à l’aide des marqueurs TFH et de l’identification des cellules B EBV+ associées au
lymphome T, la détection de la mutation RHOA p.Gly17Val apparaît comme un outil
intéressant pour le diagnostic des localisations de LAI dans la peau. Les résultats
moléculaires semblent aussi satisfaisants dans la peau qu’au niveau du ganglion.
Cette étude moléculaire pourrait aider à caractériser les LAI dans les formes à
présentations cutanées inaugurales, surtout lorsque les ganglions atteints sont
difficiles d’accès pour la biopsie, ainsi que pour le suivi des malades.
60
VI.
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ANNEE : 2015-2016
NOM ET PRENOM DE L’AUTEUR : ARIANE LECLAIRE ALIRKILICARSLAN
DIRECTEUR DE THESE : DR NICOLAS ORTONNE
PRESIDENT DE THESE : PR PHILIPPE GAULARD
TITRE DE LA THESE : CARACTERISATION MORPHOLOGIQUE, PHENOTYPIQUE ET MOLECULAIRE
DES LOCALISATIONS CUTANEES DE LYMPHOME T ANGIO-IMMUNOBLASTIQUE.
RESUME
INTRODUCTION
Environ 50% des malades avec un lymphome T angio-immunoblastique (LAI) ont une atteinte cutanée,
parfois inaugurale, souvent décrite comme une éruption peu spécifique cliniquement et
histologiquement, ressemblant souvent à une toxidermie. Les objectifs de l’étude sont de définir les
caractéristiques morphologiques, phénotypiques et moléculaires des localisations cutanées de LAI.
MATERIEL ET METHODE
Cette étude, rétrospective, multicentrique a porté sur 46 biopsies cutanées de malades avec un LAI et
s’est intéressée aux aspects morphologiques, phénotypiques (CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD20,
CD10, CXCL13, PD1, ICOS, BCL6, et transcrits EBER de l’EBV) et moléculaires (recherche de
mutations des gènes RHOA (p.Gly17Val) et IDH2 (p.Arg172Ser et p.Arg172Lys) par PCR spécifique
d’allèle).
RESULTATS
Les infiltrats étaient classés en 4 groupes morphologiques, incluant des infiltrats minimes, suspects ou
caractéristiques de LAI, ou des aspects rares comportant des lymphomes composites avec contingent B
plasmocytoïde ou associés à l’EBV. Les marqueurs de différenciation TFH étaient exprimés mais à des
fréquences variables : CD10 (48%), BCL6 (82%), PD1 (86%), CXCL13 (78%) et ICOS (90%). La
mutation de RHOA était fréquente, présente dans 78% des cas (14/18). Trois cas étaient mutés pour
IDH2 (2 p.Arg172Lys et 1 p.Arg172Ser).
DISCUSSION
Les localisations cutanées de LAI sont polymorphes. La caractérisation des cellules T néoplasiques peut
être assurée par l’analyse phénotypique (marqueurs TFH) et/ou la mise en évidence de mutations
génétiques décrites dans les localisations ganglionnaires, en particulier la mutation de RHOA.
MOTS-CLES :
-
Lymphome T cutané
Anatomopathologie moléculaire
Mutation ponctuelle
ADRESSE DE LA FACULTÉ DE MEDECINE DE CRÉTEIL : 8, Rue du Général Sarrail - 94010 CRETEIL
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