Outils enzymatiques en techniques de biologie moléculaire

Techniques en bio mol BH 04
Semestre 4
Techniques en biologie moléculaire
I.
Introduction
Technique nécessaires dans toute la bio
Permet d’avoir une bonne connaissance du génome.
DNA
Transcription
rRNA
mRNA tRNA
Ribosome
Traduction
Protéine
Techniques de plus en plus pointues. On verra les principales. Ces connaissances permettent un
progrès dans la recherche fondamentale, en bio et en médecine.
A.




Composition et structure des génomes
Structure des gènes
Fonctionnement des gènes (régulation)
Fonction des gènes
B.





II.
Recherche fondamentale
Recherche appliquée
Biomédical
Production de molécules à intérêt
Thérapeutique
Forensique
Biotechnologies
Rappels simples
L’ADN est une molécule double brin, en hélice, maintenue par des liaisons hydrogènes. Elle a une
capacité de réplication semi conservative. Ceci produit 2 molécules identiques à la parentale. Cette
capacité de réplication est à la base de toutes les techniques de biologie moléculaire.
L’ARN est composé d’un seul brin, la plupart du temps, mais on peut le trouver sous la forme de
double brin.
1
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Schémas dessin de base des acides nucléiques et des 5 bases azotées.
La synthèse de l’ADN se fait toujours dans le sens 5’-3’.Toutes les polymérases fonctionnent dans ce
sens. Ne pas oublier d’indiquer la polarité des molécules quand on écrit une séquence d’ADN.
Schémas appariement de bases.
La distance entre 2 bases est de 0,34 nm. Il y a 10 paires de bases pour un pas d’hélice (hélice B).
330 Dalton = masse moléculaire d’un nucléotide.
660 Dalton = masse moléculaire d’une paire de bases.
Pas de A avec un C ou un T avec un G car il faut une taille bien spéciale pour l’hélice. Il faut donc une
base purique avec une base pyrimidique.
L’ADN est double brin, mais il peut être simple brin. Un ADN simple brin ou un ARN peut former des
structures spécifiques de façon locale, dans le cas ou deux séquences complémentaires se suivent, et
sont séparées par une partie qui ne s’apparie pas : Structure en tige-boucle.
Possibilité de circulariser la molécule. Ces molécules circulaires ont une structure particulière. En
effet, à cause des tensions, les molécules deviennent surenroulées. Un cercle circulaire ouvert est
possible si un des deux brins est coupé. Il existe donc 3 formes principales : forme linéaire, forme
circulaire surenroulée (fermée), forme circulaire relâchée (ouverte).
III.
Les propriétés physicochimiques de l’ADN
A.
La viscosité des solutions d’ADN
Elle n’a pas tellement d’intérêt pour l’étude fondamentale, mais elle a un intérêt pour la
manipulation. Les molécules d’ADN sont extrêmement visqueuses. L’ADN linéaire est plus visqueux
que l’ADN circulaire. L’absorption UV maximale est à 260 nm pour l’ADN, comme pour l’ARN. Pour
l’ADN double brin, la densité optique à 260 nm vaut 1, et donne 50 μg/mL pour une cuve de 1cm.
Pour l’ARN, la densité optique à 260 nm vaut 1, et donne 40 μg/mL. Si un ADN double brin devient
simple brin (qui se comporte comme un ARN), on le verra sur l’absorption.
B.
Les charges de l’ADN
L’ADN fortement chargé, c’est un polyanion très chargé. Il est possible de faire de l’électrophorèse
sur un gel. La migration se sous l’effet d’un champ électrique de la cathode vers l’anode.
C.
La dénaturation
La dénaturation, et la renaturation sont la deuxième grande propriété de l’ADN, à la base de toutes
les techniques. Si on chauffe une molécule d’ADN, on élimine les liaisons hydrogène, et donc l’ADN
double brin devient simple brin.
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Densité optique
Double brin
séparation
20°C
simple brin
90°C
100°C température
On détermine la température de fusion : T°m
La température de fusion T°m est une spécificité d’une molécule d’ADN donnée : plus la molécule est
longue, plus elle a de liaisons, et donc plus elle est stable, et plus elle est dure à dénaturer. Dans le
cas de 2 ADN identiques, plus un ADN est riche en GC, plus il va être stable. Des bases
complémentaires peuvent se renaturer, à condition de refroidir lentement. On peut définir
l’hybridation/renaturation, qui dépend aussi du nombre de liaisons hydrogènes. On peut déterminer
TH, qui est la température d’hybridation. C’est la température optimale de renaturation, à laquelle la
renaturation se fait le plus vite. Elle est inférieure de 15-20°C à T°m pour de longues molécules
(>100nt), et de 5°C pour des molécules de 20 nucléotides.
+
5’ 3’
5’
5’ 5’ 5’
renaturation
5’ 3’
3’ 5’
Dénaturation
3’
3’
sonde
3’ 3’ 3’
hybridation
3’ 5’
5’
5’ 3’
3’
3’ 5’
5’
Pour avoir de l’hybridation, le critère essentiel est la complémentarité. La concentration relative des
produits est le facteur favorisant la renaturation ou l’hybridation. L’hybridation permet de repérer les
appariements, grâce à la notion de sonde, en marquant la sonde avec un composé fluorescent, ou un
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marquage radioactif. On peut faire des hybrides ADN-ADN, mais aussi des ADN-ARN (stabilité +), et
ARN-ARN (stabilité ++).
D.
Réplication
La réplication utilise la DNA polymérase, qui est capable de copier de l’ADN, et elles ont besoin
d’ADN matrice, ce sont donc des DNA polymérases DNA dépendantes. Il faut une amorce 3’OH pour
pouvoir commencer la réplication. Un ADN nu ne peut pas être la matrice de la synthèse d’un autre
brin. Il faut une amorce pour pouvoir commencer la réplication. C’est un oligonucléotide, une courte
séquence d’ADN qui a de la complémentarité avec l’ADN matrice. On peut donc hybrider par
complémentarité l’amorce sur la matrice. On a donc une séquence 3’OH libre, qui permet de
répliquer. Une DNA polymérase ne peut pas fonctionner s’il n’y a pas d’amorce. L’hybridation est liée
à la température. La température est donc le principal facteur de toutes les techniques de biologie
moléculaire.
A 99% les DNA polymérases sont DNA dépendantes. Il existe quelques cas particuliers.
E.
Le gène
Région codante
ATG
Stop
ORF
5’
3’
3’
5’
Promoteur
AUG
5’
Stop
3’
M
Brin transcrit
= brin codant
= brin -
brin non transcrit
= brin non codant
=brin +
ORF = Open Reading Frame
AUG n’est jamais au début de l’ARN
1.
Cadre de lecture
5’ ACGCCGACTACGCAT 3’
2.
Clonage
Au sein d’une population d’ADN :
1. Repérer la séquence particulière (gène)
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2. Isoler le gène
3. Amplifier le gène : insérer le gène dans un vecteur (qui est capable de s’auto-répliquer)
IV.
Méthodes d’analyse
A.
Extraction d’acides nucléiques
Cellule/tissus
phénol/chloroforme
centrifugation
Phase aqueuse
Interphase
Phase organique
Le phénol dénature les protéines qui précipitent dans l’interphase. Le phénol et le chloroforme sont
assez toxiques. On peut faire un précipité dans le fond du tube en ajoutant 2 volumes d’éthanol, 150
mM de NaCl, pour un volume de mélange.
L’absorption à 260 nm et à 280 nm doit être mesurée, car les protéines absorbent à 280 nm. Ensuite,
il faut faire le rapport 260/280, qui vaut 2 pour un ADN pur.
B.
Electrophorèse
Supports : gel d’agarose ou gel de polyacrylamide. L’électrophorèse permet d’évaluer la présence et
la taille de l’ADN : plus la taille est grande, plus la migration sera faible. La migration sur gel d’agarose
dépend de la structure, la plus rapide sera la molécule d’ADN circulaire ouverte, ensuite ce sera la
forme linéaire, et la plus lente sera la forme circulaire fermée. Pour de tout petits ADN ou ARN, la
vitesse dépend de la composition en bases. Le gel de polyacrylamide est utilisé pour le séquençage.
V.
Outils enzymatiques en techniques de biologie moléculaire
A.
Les enzymes de restriction
Elles coupent l’ADN double brin, et sont généralement inefficace sur l’ADN simple brin ou l’ARN. Elle
coupe en un site de restriction, spécifique de chaque enzyme. Ce sont des endonucléases. Les sites
de restriction sont en général de 4 à 6 paires de bases. Les sites de restriction sont en général des
palindromes. Fréquence de coupure par les enzymes de restriction. Les enzymes de restrictions sont
utilisées généralement pour le clonage. On coupe le génome en petits morceaux, et on se pose la
question de savoir la taille moyenne des morceaux.
Fréquence de coupure
5’
GATC
¼¼¼¼
3’
coupe enzyme de restriction
¼ 4= 1/256
¼ 6= 1/4096
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B.
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Origine
Micro-organismes. La bactérie crée l’enzyme de restriction. Si un site de restriction est présent sur le
virus, son ADN sera dégradé. C’est un moyen de défense de la bactérie.
Wiki : On pense que le rôle physiologique est de procurer aux micro-organismes une défense contre
les ADN exogènes (notamment contre les bactériophages); il s'agirait d'un système immunitaire
primaire.
C.
Nomenclature
EcoRI : E  genre
co  espèce
R  souche RYB
I  première souche extraite
D.
Isoschizomères
Enzyme de restriction extraites d’organismes différents mais reconnaissant la même séquence.
Wiki : Enzyme de restriction reconnaissant la même séquence-cible qu'une autre enzyme de
restriction.
E.
Les différents types de coupures
Une enzyme peut couper l’ADN de 2 manières différentes. Le premier type de coupe est la coupure
franche, c'est-à-dire que les deux brins seront coupés au même endroit, avant ou après des bases
appariées. Le deuxième type de coupe est la coupure à extrémités débordantes (à bouts collants),
l’enzyme coupe en décalé sur l’ADN, en reconnaissant la même séquence sur chaque brin. L’ADN ne
reste pas apparié, les 2 brins se séparent. Il faut distinguer les coupures 3’ débordantes / 5’
rentrantes des 5’ débordantes / 3’ rentrantes. Il y a 3 catégories d’enzymes. Les enzymes de type 2,
qui ont un site de reconnaissance, et coupe sur ce site. Les enzymes de type 1 et 3 se fixent à un
endroit et coupent plus loin.
Wiki : Selon la relation spatiale entre la séquence reconnue et le lieu de coupure, il est possible de
distinguer trois types d'enzymes de restriction. Les enzymes de type I et de type III reconnaissent une
séquence d'ADN spécifique et coupent en un endroit aléatoire, en général assez éloigné du site
reconnu. Les enzymes de type II, les plus utilisées, reconnaissent une séquence spécifique et coupent
en un endroit spécifique de cette séquence.
F.
La méthylation de l’ADN
L’ADN doit être méthylé par les méthylases. Elle reconnaît une séquence spéciale (AAGCTT), et la
méthyle. Si une enzyme de restriction coupe cette séquence, et qu’elle est méthylée, elle ne la
coupera pas. La méthylase est utile pour protéger l’ADN de ses propres enzymes de restriction.
Cependant, l’ADN des virus n’est pas méthylé, et donc il sera coupé.
G.
Utilisation des enzymes de restriction
Permet de manipuler de l’ADN, c’est l’étape essentielle pour le clonage d’un gène. Sans enzyme de
restriction, pas de clonage. Permet aussi de faire la cartographie de restriction. La cartographie de
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restriction permet de positionner les sites de restriction. Techniquement c’est simple : on prend un
ADN, on rajoute une enzyme de restriction, et on effectue une électrophorèse, qui permet de
positionner les sites. On peut faire une carte pour un ADN assez restreint.
Exemple : on considère un ADN circulaire, de forme surenroulée
NT
A
B
C
B+C
NT : non traité
A : pas d’enzyme de restriction
B : 1 fragment linéaire, migration
moins rapide
C : 2 coupes, la taille de 2 fragments
est égale au fragment B
B+C
Schéma 1
H.
Intérêt
1.
Spécificité
Par définition, une enzyme de restriction est spécifique d’une séquence d’ADN donné. Permet de
repérer si des ADN peuvent avoir des séquences communes.
Schéma 2
2.
Manipulation
Le séquençage a tellement pris d’importance que l’on a l’information sur la séquence très
rapidement. On donne la séquence à un logiciel, et il nous donne les sites de restriction.
3.
Autres enzymes
a)
DNase I
Enzyme coupant l’ADN : DNase I (endonucléase). Permet d’introduire un groupement radioactif dans
l’ADN, et d’étudier l’interaction ADN-protéine : on prend de l’ADN, et on le chauffe. On obtient des
fragments de taille différente suivant l’endroit de coupure de la DNase I. On fait ensuite une
électrophorèse en gel de polyacrylamide. Puis on fait une autoradiographie. On peut en déduire que
la DNase a une affinité avec l’ADN, et déterminer les positions des sites de restriction.
b)
Nucléase S1
C’est une exonucléase. Elle ne coupe que les ADN simple brins. Si on a un ADN partiellement double
brin, et qui a les extrémités débordantes simples brin. En traitant la molécule par la S1, la
dégradation ne se fera que sur les parties simples brins, pour produire des ADN parfaitement coupés.
Elles fonctionnent aussi sur des hybrides ADN/ARN.
c)
Exonucléase III
Wiki : L'exonucléase est une nucléase, une enzyme qui coupe l'ADN ou l'ARN à partir d'une
extrémité, un nucléotide à la fois, et dans un sens : 5' vers 3' ou l'inverse.
Par exemple, l'exonucléase III fonctionne à partir de l'extrémité 3' (sauf si celle ci est protubérante).
Cette enzyme catalyse l'hydrolyse séquentielle des nucléotides d'un ADN double brin dans le sens
3'5'. Elle libère des monodesoxynucléotides à partir de l'extrémité 3'd'un ADN bicaténaire. Elle est
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inactive sur ADN simple brin. Elle agit sur des ADN double brins obtenus par coupure franche avec
des enzymes de restriction ou sur ADN double brin dont les extrémités 3'(OH) sont en retrait.
d)
Ligase
La ligature se fait avec des ligases, qui recollent les morceaux d’ADN coupés. C’est une enzyme
capable de refaire une liaison phosphodiester 5’-3’. On peut associer n'importe quel type d’ADN, elle
ne s’occupe pas de la séquence, du moment qu’elle a des extrémités 5’ et 3’. Dans le cas de
séquences à extrémités débordantes, la ligase peut recoller des extrémités complémentaires. Elle a
besoin d’ATP.
Wiki : En biochimie, une ligase est une enzyme qui catalyse la jonction de deux molécules ("ligation"
ou « coller entre elles ») par de nouvelles liaisons covalentes avec hydrolyse concomitante de l'ATP
ou d'autres molécules similaires. Elles sont classées EC 6 dans la classification EC. De nombreuses
ligases sont connues sous le nom de « synthases » ou « synthétases » vu qu'elles synthétisent de
nouvelles molécules. Dans les laboratoires de biologie moléculaire, une des ligases les plus utilisées
est l'ADN ligase. On l'utilise pour interconnecter des fragments d'ADN.
e)
Phosphatase
Elles éliminent les extrémités phosphates en 5’, et elles les transforment donc en groupement OH.
L’ADN a alors une extrémité 3’OH et une extrémité 5’OH. Ceci empêche de lier des ADN. Ce qui
permet de marquer radioactivement. La kinase fait l’inverse.
f)
DNA polymérase DNA dépendante
Enzyme recopiant l’ADN. On compte l’ADN polymérase I.
Wiki : http://fr.wikipedia.org/wiki/ADN_polym%C3%A9rase
g)
DNA polymérase RNA dépendante
Transcriptase inverse. Rétrovirus. ADNc (enzyme de la transcriptase inverse), c’est une copie (c) de
l’ARNm.
Schéma 3
Protocole :



VI.
RNase H : élimine l’ARN dans les hybrides ARN/ADN.
E. coli DNA polymérase I : synthétise l’ADN à partir de l’ARN amorce.
E. coli DNA ligase : reforme les liaisons phosphodiester rompues.
Les plasmides
http://www.inrp.fr/Acces/biotic/biomol/outilsbm/html/plasmide.htm
http://www.univ-tours.fr/genet/gen001300_fichiers/CHAP5D/GEN05D1EC35.HTM
http://cgdc3.igmors.u-psud.fr/microbiologie/rappelplasmides.html
http://www.techno-science.net/?onglet=glossaire&definition=1034
Manque début de cours
Un plasmide est un vecteur de clonage. Dans les molécules d’ADN, on insère une molécule d’intérêt.
C’est le moyen le plus facile de propager de l’ADN. On utilise alors une enzyme restriction. Propriétés
générales des plasmides : les petits fragments d’ADN circulaire présent dans la cellule bactérienne.
Leur réplication est indépendante du génôme et cycle cellulaire de la bactérie. La taille est de 4 à 7
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kb. Il se réplique dans des espèces particulières de bactéries. Résistance à Ab. Pour expérimentateur,
c’est essentiel. Un plasmide ne se développe que dans une espèce de bactéries, pas dans une autre.
Le premier qui a été trouvé est pBR322. Il a une région très importante pour qu’il puisse se multiplier,
c’est la région Ori. C’est une séquence d’ADN qui permet l’initiation de la réplication. Les gènes
nécessaires à la réplication sont portés par le gène, pas par le plasmide. pBR322 porte 2 gènes
de résistance : AmpR et TcR. Si on associe un insert à ce plasmide, on aura moyen de sélectionner le
plasmide. Sans plasmide, il n’y aurait pas eu de biologie moléculaire. D’un point de vue expérimental,
le but est d’insérer une amorce d’ADN.
Voir schéma 1
On veut « rendre les cellules compétentes ». On les place dans CaCl2 qui permet à l’ADN de rentrer
facilement dans une cellule. Il y a un faible taux de réussite. Une cellule bactérienne ne peut être
transformée que par une molécule de plasmide. C’est une restriction à la sur transformation. Sans ça,
il n’y aurait pas de clonage. Les molécules d’ADN linéaire ne transforment que très peu par rapport à
l’ADN circulaire. Quand on fait une ligation, on a un mélange de produits (plasmide, insert, plasmide
+ insert), et le seul que l’on utilise c’est celui avec l’insert et le nouveau plasmide.
Phénotypiquement, on ne distingue pas le plasmide seul du plasmide avec insert. Cependant, on veut
faire la distinction. Il a donc fallu une grande évolution technologique, pour faciliter le travail de
l’expérimentateur.
A.
Gènes de sélection
pBR322 : 2 gènes : Amp et Tc. Pour pouvoir les distinguer, on utilise la propriété des 2 gènes de
résistance. On va couper les plasmides par une enzyme qui coupe par exemple un site de restriction
dans le gène de Tc. On ne peut mettre qu’un seul antibiotique sur une boite de pétri.
Schéma 2
Les gènes Tc n’est alors plus efficace pour une partie de la population, qui va mourir en présence de
l’antibiotique. On prend une colonie que l’on repique. On va ensemencer le repiquage d’une cellule
sur une première boite quadrillée qui contient de l’Ampicilline, et sur l’autre boite quadrillée qui
contient de la tétracycline. On peut alors trouver sur les boites soit une résistance, soit une
sensibilité. Si on trouve une sensibilité, on a trouvé le caractère qui nous intéresse, et donc la
molécule recherchée.
On a essayé de faire évoluer cette technique trop lourde et contraignante.
On remplace le gène Tc par un gène qui code pour la β-galactosidase. Ce gène est appelé lac Z. Le
principe est le même. On insert le fragment dans le gène β-galactosidase. On met alors sur le milieu
de culture un substrat (β-galactoside) appelé X gal. Il va être utilisé par l’enzyme. L’avantage, c’est
qu’on peut utiliser le X gal en présence d’Ampicilline. Son intérêt, est que quand il réagit (que le gène
n’est pas coupé), il va donner une couleur bleue à la bactérie. On ne va donc garder que les colonies
blanches. On appelle cela la culture blanc-bleu.
La dernière évolution est de remplacer le gène β-galactosidase par un gène toxique. Ce gène tue la
cellule quand il est exprimé. Si l’on intègre un ADN dans ce gène, seules les bactéries résistantes à
l’Amp et qui ont le gène toxique coupé peuvent survivre, les autres sont tuées soit par Amp, soit par
le gène toxique.
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B.
Semestre 4
Autres caractéristique
Pour ouvrir le plasmide, on utilise des sites de restriction. La caractéristique est la suivante : plus il y a
de sites d’enzymes de restriction, plus le plasmide est facile à cloner. L’expérimentateur aura
plusieurs choix pour couper le plasmide. Ces enzymes groupées sur le plasmide le sont dans une zone
appelée MCS (multiple cloning site). On veut ensuite extraire le plasmide de la bactérie : à partir
d’une cellule bactérienne qui contient le plasmide on fait une lyse, qui libère l’ADN, puis on fait une
dénaturation à la soude, qui dénature l’ADN, et le petit plasmide va rester circulaire. On fait une
précipitation, et on aura notre plasmide en solution.
Il existe 2 catégories de plasmide :
1.
Les vecteurs de clonage
Molécules de plasmide utilisées pour cloner et pérenniser un ADN, pour amplifier celui-ci. Dans nos
expériences précédentes, on n’a fait qu’amplifier l’ADN, l’insert était silencieux.
2.
Les vecteurs d’expression
Ils permettent l’expression du gène que l’on a incorporé dans le plasmide. Ils doivent avoir une
particularité supplémentaire par rapport aux vecteurs de clonage. On doit l’insérer en aval d’une
séquence promoteur. De cette manière, le promoteur va être reconnu par l’ARN polymérase, et va
produire les protéines correspondant au gène intégré. Le promoteur est dit inductible,
l’expérimentateur peut à loisir commander la production de la protéine. En générale, l’inducteur est
de l’IPTG, qui permet à la bactérie de produire l’ARN et la protéine. Ca permet aussi de produire des
protéines toxiques.
A coté de ces vecteurs procaryotes, on a pu produire des vecteurs eucaryotes.
Le principe est le même. L’intérêt est de faire fonctionner un gène dans une cellule eucaryote. On
extrait le plasmide que l’on réintroduit dans des cellules eucaryotes. C’est la transfection. Le
promoteur est différent, il est capable de fonctionner dans une cellule eucaryote. Le promoteur
eucaryote va pouvoir fonctionner. On peut étudier la fonction des gènes.
Une fois que la protéine est produite, il faut la purifier. Pour cela, on rajoute à l’insert une petite
séquence d’ADN, qui va représenter un tag. Par exemple, on rajoute à la cellule 6 histidines, en fin.
On fait passer ce lysa bactérien sur une colonne de nickel, qui retient uniquement la queue de 6
histidines.
C.
Stratégie de clonage
On va coller 2 molécules d’ADN. On a une enzyme qui intervient : la ligase. On va d’abord devoir
découper l’ADN avec des enzymes de restriction. D’un point de vue pratique, on va d’abord préparer
l’insert, découpé par 2 sites EcoRI
10
Techniques en bio mol BH 04
Semestre 4
EcoRI
EcoRI
EcoRI
+ EcoRI
+ EcoRI
électrophorèse
EcoRI
EcoRI
élution
Ligation
Schéma 3
Supposons que le plasmide n’ait pas de site EcoRI :
Schéma 4
Conclusions du schéma 4 : impossibilité de faire les liaisons AC et GT. On parle alors d’incompatibilité.
Quelques fois, l’expérimentateur n’a pas le choix. Si l’on fait la stratégie précédente, c’est impossible.
On peut utiliser la propriété qui dit que si les extrémités 3’ et 5’ sont proches, elles peuvent se coller,
dans le cas de coupures à bouts francs. Si l’on a incompatibilité, il faut transformer les sites de
restrictions, en les passants d’extrémités collantes à extrémités franches.
Pour transformer une extrémité à bouts collants en extrémités à bouts francs, on utilise la nucléase
S1. Elle coupe les nucléotides en trop. On peut aussi utiliser la DNA polymérase, qui comble les vides.
Schéma 5
Le problème, c’est que l’on obtient un plasmide avec un insert, mais on n’a plus de site de restriction,
ni BamHI, ni EcorRI. Si l’on traite par la DNA polymérase, le site de restriction n’y est plus non plus.
Donc quand on transforme un site de restriction, en général, on le perd. La question est donc
« comment préserver au moins un des 2 sites ? ». La démarche est simple : l’insert qui porte EcoRI,
on va lui mettre une DNA polymérase. Le plasmide qui porte BamHI, on le coupe par S1. Ceci
conserve le site EcoRI. Si l’on veut garder BamHI, il faut inverser les ajouts (BamHI  DNA poly ;
EcoRI  S1).
Les isoschizomères sont les enzymes de restriction différentes qui reconnaissent le même site de
restriction.
Par exemple : KpnI et Acc56I
GGTACC
CCATGG
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D.
Semestre 4
Efficacité
 Ligation
facilement éliminée : pas de résistance
On traite le plasmide par la phosphatase alcaline. Il va avoir alors 2 extrémités OH en 5’ et 3’. La
ligase fait une liaison phosphodiester, mais vu qu’il n’y a plus de phosphate, elle ne peut pas. On
empêche donc le plasmide de se refermer. La ligase va faire une liaison phosphodiester. Il n’y a pas
de sens d’intégration de l’ADN.
VII. Sondes nucléotidiques
Sonde : ADN/ARN
Une sonde sert à repérer des fragments de gène spécifiques. La réaction entre sonde et cible est une
hybridation. La sonde soit être marquée soit radioactivement, soit par fluorescence. Une sonde peut
avoir 2 grandes utilisations : caractériser la structure des gènes (en combinaison avec la cartographie
de restriction), cribler de banques d’ADN (cibler un gène spécifique). L’ADN doit être simple brin si on
l’utilise comme sonde. Il faut donc d’abord dénaturer un ADN double brin pour pouvoir l’utiliser
comme sonde. Nous ne parlerons ici que de sondes à ADN. Il y a 2 catégories de sondes à ADN, qui
dépendent de l’utilisation que l’on veut en faire : les sondes oligonucléotidiques (jusqu’à 30-40
bases, très petites séquences, fabriquées par synthèse chimique), et les sondes à ADN (fragments de
gènes ou gènes entiers, pas de limite de taille). L’hybridation repose sur la température. Les sondes
sont plus facilement manipulables quand elles sont longues.
Comment introduit-on un marquage dans une sonde ?
A.
La technique de marquage
Il faut pouvoir repérer la sonde associée à la cible. Il faut utiliser un isotope. On parle de marquage
chaud quand on introduit un marquage radioactif. Le marqueur le plus utilisé est le phosphore 32
(32P), qui émet des rayons β- dures. Ce sont des rayons puissants, mais arrêtables par quelques
millimètres de plastique. Il est facilement détectable. La période est de 14 jours. C’est un avantage et
un inconvénient, avantage parce qu’il est facile d’éliminer la radioactivité (au bout d’un an, il n’y a
plus de radioactivité). On cherche à les remplacer par des marqueurs froids, des marqueurs
fluorescents, mais l’appareillage est couteux, et c’est moins facilement détectable.
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B.
Semestre 4
Les différents types de marquage
1.
Les sondes oligonucléotides
Ce sont des petites séquences d’ADN, réalisées par synthèse chimique, la synthèse de ces sondes est
très simple, fabriquée par des sociétés spécialisées, par des ordinateurs. Les extrémités sont des OH.
On peut alors facilement introduire un phosphate radioactif, puisque l’ADN est déphosphorilé. On
ajoute donc des dATP marquées au 32P sur le P γ, et le phosphore est transféré sur l’extrémité 5’.
2.
Il y a 2 techniques :
Les sondes à ADN
a)
Nick translation ou « déplacement de brèches »
Cette technique nécessite d’utiliser un ADN double brin pour le marquage. On utilise de la DNase I
pour faire des brèches. On travaille à température basse, de 0 à 4°C. Ensuite on fait agir une autre
enzyme : la Klenow polymérase, qui va dégrader l’ADN présent dans les brèches en le remplaçant par
d’autres bases. On utilise souvent du dCTP ou du dATP pour introduire de la radioactivité, et ici, le
phosphore radioactif est l’α. On obtient alors un ADN radioactif sur ses 2 brins. Avant d’utiliser cet
ADN comme sonde, il faut le dénaturer par la chaleur. On fait bouillir la sonde à 100°C. L’ADN
s’ouvre, et on peut l’utiliser.
b)
Random priming ou l’amorçage au hasard.
Elle est plus robuste et plus facile à utiliser. C’est la plus utilisée. Elle repose également sur l’action
d’une polymérase, mais il n’y a pas de DNase. On part encore d’un ADN double brin que l’on
dénature préalablement (100°C) pour le rendre simple brin. Cet ADN va être mis en présence
d’oligonucléotides de synthèse, qui font en général 6 bases. Ces oligonucléotides représentent toutes
les combinaisons possibles. C’est un mélange de 4096 molécules différentes. Cette séquence sert
donc d’amorce, et donc on va pouvoir commencer la synthèse d’ADN. Si l’on met un nucléotide
radioactif, on va intégrer la radioactivité, le plus souvent par des dCTP ou des dATP.
Si l’on compare les 2 méthodes, on pourrait par exemple faire des marquages des extrémités.
Cependant, on ne le fait pas sur des fragments longs, car on a une meilleure sensibilité en
incorporant de la radioactivité tout le long plutôt qu’aux extrémités. On cherche à avoir la meilleure
sensibilité possible, on appelle cela l’activité spécifique d’une sonde, c’est la quantité de radioactivité
incorporée par unité de masse.
Fixation sur gel, dans des colonnes de sepharose/sepharolex. Ca permet de séparer l’ADN radioactif
des nucléotides qui n’ont pas été incorporés. On dépose donc les fragments et on récolte les
molécules. Ce sont les molécules d’ADN qui sortent les premiers, dans le cas d’une colonne à
exclusion, parce que les nucléotides sont retenus dans des billes, alors que l’ADN passe à coté. On
mesure l’activité, qui présente 2 pics, l’un pour la sortie d’ADN, l’autre pour la sortie de nucléotides.
Le problème que présentent ces 2 techniques est lié à la séparation des 2 brins. En effet, en
hybridant les brins d’ADN, ils peuvent s’apparier de nouveau, ce qui diminue la sensibilité et
l’efficacité de ces sondes. Les sondes à ARN sont beaucoup plus efficaces.
C.
La cartographie génomique
On appelle la technique de cartographie génomique la technique de Southern. On cherche à faire la
carte de restriction d’un gène, directement à partir d’une carte génomique. On fait une carte de
13
Techniques en bio mol BH 04
Semestre 4
restriction pour connaître la structure d’un gène, localiser les introns et les exons, localiser les
séquences régulatrices, mettre en évidence le polymorphisme qui peut être lié à des mutations
ponctuelles, des délétions, des re-manipulations… Si l’on pouvait faire ça sur tous les gènes sans les
cloner, ce serait un énorme gain. Pour le faire, il faut prendre une cellule, en extraire l’ADN
génomique, et prendre un gène d’intérêt. On fait la cartographie de cette région directement sur
l’ADN sans avoir à l’isoler. On applique des enzymes de restriction qui découpent en fragments. On
fait ensuite une électrophorèse qui permet de déterminer des tailles de fragments. On peut utiliser
cette technique sur un plasmide, mais pas sur un génome complet. On a des problèmes de :
1.
Sensibilité
On prend un ADN génomique (3 milliards de paires de bases), la sensibilité au Bromure d’éthidium
n’est pas assez forte pour permettre de visualiser la séquence d’ADN donnée.
2.
Nombre de fragments obtenus
Si l’on prend une enzyme de restriction dont le site a 6 paires de bases, on aura une taille moyenne
des fragments de 4 kilo bases, et l’ordre de grandeur sera d’environ 1 million de fragments
différents. On en aura parmi eux 1 ou quelques uns qui correspondront à ce que l’on cherche.
Cependant, si l’on met sur gel ce million de fragments, la taille moyenne est de 4 kilo bases, on aura
par exemple des variations d’une base, et donc en électrophorèse, on n’aura pas de bandes
spécifiques, mais une trainée, qui contient le fragment du gène qui nous intéresse. Mr Southern a eu
une bonne idée, il voulait repérer de manière spécifique le fragment que l’on cherche. Pour cela, on
va hybrider l’ADN avec un fragment radioactif, ce qui va nous permettre de retrouver les bandes de
la séquence d’intérêt, en ré-augmentant la sensibilité de la méthode.





3.
Le principe de la méthode
On prend une cellule
On extrait l’ADN génomique
On fait agir les enzymes de restriction
On fait une électrophorèse en gel d’agarose
On fait réagir en incorporant des sondes radioactives.
Il y a 2 problèmes physiques qui vont se poser.
On travail en général autour de 65°C. Cependant, physiquement, l’ADN est en gel d’agarose. Et si l’on
fait chauffer l’agarose, il va se disperser. Donc l’ADN va sortir du gel. De plus, l’hybridation dans les
conditions précédemment décrites ne peut pas avoir lieu. En effet, la sonde est une molécule simple
brin, qui s’apparie sur l’ADN par complémentarité. Or l’ADN du gel est double brin. Donc la sonde ne
peut pas s’apparier. Il faut donc le dénaturer. Si l’on dénature l’ADN, on va pouvoir l’hybrider. Il faut
donc le chauffer. Mais l’agarose va fondre. Donc avant de faire l’hybridation, il faut le dénaturer, de
manière chimique, en le traitant à la soude.
Pour que l’ADN ne parte pas, on va remplacer le support de l’ADN, l’agarose, qui est mou, sur un
support solide. C’est ce qu’on appelle un transfert. C’est la base de la technique de Southern. On va
transférer cet ADN sur une membrane en nitrocellulose, ou en nylon chargé. On met sur ce support
un papier absorbant qui trempe dans une solution de transfert. Au dessus de ce gel, en contact avec
le gel, on met une membrane de nylon, qui épouse la forme. Au dessus, on met du papier absorbant,
avec un poids dessus.
14
Techniques en bio mol BH 04
Semestre 4
Le transfert est une hybridation. Une fois qu’on a obtenu l’ADN sur la membrane, on colle un film
par-dessus, et en faisant une autoradiographie, on n’obtient qu’une bande, correspondant à notre
fragment. Le principe de la pré-hybridation est de bloquer les sites non spécifiques. On prend par
exemple un ADN de poisson, on sature la membrane, de façon à ce qu’il ne reste que le site
correspondant à ce que l’on cherche.
Pour l’expérimentateur, on cherche à avoir l’expérimentation la plus rapide. On va donc se mettre
dans les conditions où l’expérience sera la plus rapide. Pour cela, il faut connaître les compositions en
bases (longueur, %GC), le pourcentage d’homologie (appariements, complémentarité). Tout cela
intervient su le T°m. Le premier critère d’hybridation est la concentration en sonde. Plus la sonde va
être concentrée, plus la réaction va être rapide. D’un point de vue pratique, la concentration en
sonde est toujours faible, et donc la vitesse d’hybridation va être faible. La conséquence est que si
l’on travaillait dans ces conditions, il faudrait plusieurs jours pour faire une réaction. La nucléation,
c’est quand la sonde va venir s’hybrider, sur une partie. Si le reste de la sonde n’est pas
complémentaire, on ne va pas pouvoir étendre la nucléation. Si la température augmente, la partie
son appariée fond. La sonde ne va se fixer définitivement que si tout est complémentaire. Ce
processus, plus il va être rapide, plus le processus d’hybridation va être rapide. Les chaines d’ADN on
plutôt tendance à se repousser qu’à s’apparier. Ce phénomène contrebalancé est défavorisé par les
bases chargées négativement sur la sonde et sur le brin. On va donc contrebalancer les charges
négatives, ce qui va favoriser la nucléation. On doit donc augmenter la concentration en sel NaCl, ce
qui neutralise les charges phosphates, et donc contrebalance les charges négatives. C’est un
processus en fermeture éclair. L’effet positif sur la vitesse a un effet négatif sur l’hybridation, car
l’augmentation de la concentration en sel diminue la spécificité. Une sonde est spécifique de sa cible.
La sonde doit s’hybrider à un endroit et à un seul. En ajoutant le sel, on va autoriser la sonde à
s’hybrider à des endroits non complémentaires. On perd de la spécificité. On va faire apparaître des
signaux anormaux. On dit qu’on est en faible stringence. On va donc diminuer le T°m de la sonde.
On veut maintenant éliminer les mauvais hybrides.
4.
Procédure du lavage
Pour faire ce lavage, on va diminuer la concentration en sel. On va donc repasser dans une condition
en forte stringence. Le T°m de ces mauvais hybrides est faible. On va repasser au dessus du T°m.
T°m = 81,5 + 16,6 (log NaCl) + 0,41 (%GC) - 500/L – ½ (100-h)
L : longueur de la sonde
5.
A
h : % homologie
La technique de Southern
A
2kb
A
3kb
A
1,5kb
A
4kb
A
5kb
15
Techniques en bio mol BH 04
Semestre 4
Pour un individu malade, si on élimine le 4ème A, on n’aura qu’un seul fragment détecté :
5,5
4
1,5
On peut dire que l’individu est homozygote, puisqu’il a 2 copies identiques. Dans les cellules
cancéreuses, le gène est recopié de nombreuses fois. Si le gène est amplifié :
6.
La technique de Northern
On prend une cellule, on extrait les ARNm, et on fait une électrophorèse :
28S
18S
Sonde ADN
Transfert par membrane
Nylon +
Autoradiographie
4S
16
Techniques en bio mol BH 04
7.
Semestre 4
Banques d’ADN
a)
Clonage des gènes
L’objectif d’un clonage, qui correspond au fait que l’on veuille isoler un gène, et donc l’isoler de son
contexte génomique et de l’amplifier, afin d’en obtenir des quantités importantes, pour étudier sa
structure, ou en faire un outil de biologie. Le clonage passe par différentes étapes, qui correspondent
à la création de banques d’ADN.
3.102 pb
3kb
ADNg
découpage : on obtient un mélange de fragments
On construit ensuite la banque d’ADN, en mélangeant les fragments avec un vecteur, et on va
obtenir une collection de vecteurs, et un des vecteurs contient le gène d’intérêt.
Une banque d’ADN est une collection de fragments qui recouvrent l’ensemble du génome.
On fait ensuite un criblage de la banque, qui fait appel à l’utilisation des sondes. On repère quelle
bactérie possède le bon fragment
b)
Construction de la banque
Elle est obtenue par découpage de l’ADN génomique (ADNg). Ce sont des Banques d’ADN
génomique. Il existe un autre type de banques, les banques d’expressions, mais elles ne nous
intéressent pas ici.
Le découpage de l’ADN. Ensuite, le scientifique se pose la question de la quantité de travail à faire. En
effet, si l’on découpe en plus petites parties, il y a plus de fragments à analyser. En effet, si l’on fait
des fragments de 3kb, il y aura 106 fragments à analyser. Si l’on en fait de 30kb, on n’aura plus que
105 fragments à analyser. Il se pose donc un problème de taille.
Ensuite, on se demande quel type de vecteur utiliser, puisqu’il fait varier la taille aussi. La première
contrainte est d’avoir la plus grande taille possible pour limiter le travail, mais le vecteur marque une
taille maximale. On prend donc des fragments de 10 à 30kb.
N = [Ln (1 – p)] / [Ln (1 – T/G)]
10 kb
20 kb
30 kb
p : probabilité I : taille des fragments G : taille du génome
1,6.106
0,8.106
0,5.106
1ère notion ?
2ème notion : Le meilleur moyen de découper 1 ADN est de prendre une enzyme de restriction qui va
reconnaître la partie à couper.
17
Techniques en bio mol BH 04
E
E
E
Semestre 4
E
E
On veut une taille de 10kb. On a 3 enzymes :



E4 = 256pb
E6 = 4096pb
E8 = 65536pb
En utilisant E4, on est sûr de couper au hasard, même si la taille n’est pas très bonne.
VIII. Vecteurs
A.
Plasmides
On prend les fragments et les vecteurs, on fait une ligation. On obtient différents types de vecteurs.
On les met dans E. Coli. On en fait des colonies. E. Coli peut être transformé en plasmides. Mais là, on
a un mélange de plasmides, et la transformation est relativement faible. La re-transformation est
d’autant plus faible que la taille est forte. L’efficacité de transformation d’un plasmide est donc très
faible. Les plasmides qui font 15kb, ils vont être mal transformés. Le problème des plasmides est que
leur capacité de transformation est faible. 10kb est la taille limite de transformation d’un plasmide.
On les a donc peu utilisés en pratique.
B.
Bactériophage λ
Le bactériophage λ infecte E. Coli, il est tempéré, c'est-à-dire qu’il a une phase lytique et une phase
lysogénique. Une fois qu’il a infecté, il fait une lyse. Une plage de lyse apparaît, qui résulte d’une
infection bactérienne.
Tapis bactérien
Plage de lyse
Le virus s’intègre dans le chromosome.
ADN linéaire = 50kb
COS
complémentaires
COS
18
Techniques en bio mol BH 04
Semestre 4
Réplication
Phase précoce
Phase tardive :
Réplication cercle roulant :
COS
COS
COS
COS
COS
Protéines virales
ADN viral
Si on prend l’ARN viral, il va être divisé en 3 tiers. La partie centrale sert uniquement pour la phase
lysogénique (intégration et développement du virus). Donc si l’on élimine cette séquence, ça ne va
pas empêcher la phase lytique.
On élimine la partie centrale, et on la remplace par d’autres fragments. On les mets avec des
protéines virales, et on le mélange. On dépose la solution de phage, et chaque partie est remplie de
phages.
C.
Les cosmides
Taille dans fragment peu importante, technique lourde. Différence avec avantages dans plasmides et
phages (mais même comportement). Ils se comportent comme un phage dans les premières étapes,
et comme un plasmide dans les dernières. La structure de la molécule de cosmide est simple :
cos
cos
cos
E
+ Protéine de phage
E
ori
AMP
cos
E
E ori
AMP
cos
AmpR
Ori
40kb
Ligation
Les deux conditions sont : la présence de séquence cos, et que la taille entre les 2 séquences cos sont
compatibles avec la taille du génome d’un phage λ. L’intérêt est que la séquence de cosmide entre 5
19
Techniques en bio mol BH 04
Semestre 4
et 10 kb est suffisante, donc on va pouvoir insérer au minimum 40 kb de génome étranger.
L’ensemble des virions correspond à l’ensemble du gène.
On a donc un mélange de virion, et on le met en contact avec des bactéries :
cos
cos
Le cycle se referme.
cos
Amp
Ori
Elles présentent de grands avantages, donc on en trouve un grand nombre dans le commerce.
Il existe de nombreux autres vecteurs, comme par exemple les YAC (yeast artificial chromosome). Ce
sont des chromosomes modifiés de levure, et on les utilise pour séquencer les génomes.
IX.
Le criblage
C’est l’étape la plus importante. On utilise des sondes, qui doivent être complémentaires avec les
séquences recherchées. Cependant, on veut repérer un gène, parce qu’on ne le connais pas. Or on
ne connaît pas sa séquence, donc on ne connais pas la séquence de la sonde. Il y a 2 moyens de s’en
sortir, on utilise 2 types de sondes :

Les sondes-gènes orthologues
Un gène orthologue est un gène identique dans des espèces différentes. Or les gènes orthologues
sont relativement proches, donc les séquences sont très conservées. On peut donc les utiliser comme
sonde.

Des informations sur la protéine
Si l’on a des informations sur la protéine, on peut essayer de faire une sonde nucléique.
On réalise donc un criblage.
Mettons que l’on est dans une bande de cosmides. On obtient des colonies, sélectionnées sur la base
de résistance à l’antibiotique. Chaque colonie possède une partie du gène différente. On va
20
Techniques en bio mol BH 04
Semestre 4
cependant devoir changer de support. Pour cela on va faire une réplique, en prenant un morceau de
tissus en velours que l’on appose sur la boite en exerçant une certaine pression. Les colonies vont
venir se coller, elles se détachent de la boite. Ensuite, on appose ce velours sur une boite, puis sur
une autre. On obtient alors de nouvelles colonies, images de la première. Puis sur une des 2 boites,
on dépose une membrane en nitrocellulose ou en nylon, qui épouse parfaitement la forme de la
boite. Une fois que l’on a retiré cette membrane, les cellules sont collées à la membrane. Ensuite, on
va devoir ouvrir les cellules, en les traitant au SDS qui lyse les membranes, et donc l’ADN va se fixer
sur la membrane, qui a de l’affinité pour l’ADN. On va en plus mettre de la soude, pour dénaturer
l’ADN. On fait ensuite une autoradiographie, puis on place le film sur la boite mère, et on peut ainsi
repérer les cellules d’intérêt.
Si l’on a une banque de phages, le principe est presque le même, mais on n’aura pas de colonies,
mais des plages de lyse (trous remplis de phages). Chaque plage de lyse correspond à 1 ADN. On
remet donc le velours, et on va les répliquer sur un tapis bactérien, et on obtient une copie.

Comment faire une sonde à partir d’une séquence protéique ?
Lorsque l’on a isolé la protéine, on a déterminé une séquence protéique complète ou totale. On veut
déterminer une séquence nucléique à partir d’une séquence protéique. On utilise pour cela le code
génétique. Cependant, le code est dégénéré. On peut donc déterminer une séquence, mais elle n’est
pas parfaite. Or la notion sonde cible repose sur une définition parfaite. La sonde sera toujours un
oligonucléotide, parce que l’on sait les synthétiser chimiquement facilement. La première question à
se poser est : quelle doit être la taille de la sonde ? Il faut que la sonde soit spécifique, et ne pas
s’hybrider n’importe où. Donc la taille doit être suffisante pour ne pas s’hybrider partout. Plus on
augmente la taille, plus on augmente la spécificité. On va s’arrêter quand on va être sûre qu’une
séquence donnée ne va pas être trouvée au hasard sur le génome. Donc quand la probabilité sera
supérieure à la taille. On calcule P0, qui est la probabilité de trouver une séquence :
P0 = (f/z)(a+t) x (1 – f/z)(c+g)
f = fréquence en AT
Q = P0 x ZN
N = taille du génome
n=a+t+c+g
n=
Q=
10
4700
12
280
14
16
16
1
18
0,06
20
4.10-3
Donc la taille moyenne des fragments est de 20. On a donc besoin d’une séquence d’au moins 7
acides aminés. Cependant, avec 7 acides aminés, on n’est pas certains de notre séquence. En effet,
les acides aminés peuvent avoir plusieurs séquences. Pour ceux qui n’ont qu’un seul codon, il n’y a
pas de problème. Mais on en a qui en on 2, 4 voire 6. Donc avec une séquence en acides aminés, on
ne peut être sûr de notre séquence. Et seule la séquence parfaite va se fixer. Supposons que l’on ait 7
acides aminés, et on veut en déduire 7 nucléotides. On suppose que chaque acide aminé ait 4
codons. Donc il faut en faire 46 (6 20 nucléotides, c’est 4x6+2. Or le dernier, ne changeant que sur son
dernier nucléotides, il ne compte pas). Donc sur les 46 = 4096 séquences, il n’y en a qu’une qui
21
Techniques en bio mol BH 04
Semestre 4
fonctionne. Si par chance on a 4 acides aminés avec 4 codons, et 2 avec 2 codons. On obtient donc
1024 séquences. On fait donc un cocktail de sondes qui contient obligatoirement la bonne séquence.
X.
Banques génomiques
Une banque d’expression correspond à une banque des ARN de cellules. On part d’une cellule, on
extrait les ARNm. On obtient une collection d’ADNc, on leur met des vecteurs, et on en fait des
banques. Les ADNc sont des copies des gènes. Le gène contient des exons, des introns, et des
portions régulatrices. Les ADNc n’ont que les exons.
Cependant, les ADNc sont spécifiques. Il faut donc choisir où l’on prend les gènes.
Le génome est identique dans toutes les cellules, à quelques exceptions près, donc on devrait
pouvoir prendre n'importe quelle cellule pour faire des banques. Si l’on veut faire une banque
humaine, on utilise des cellules placentaires (gratuit, grosses quantités, frais).
XI.
L’ultracentrifugation
Elles permettent d’obtenir des ADN de qualité. Il y en a 2 types : l’une est basée sur un gradient de
saccharose (gradient discontinu de saccharose en couches), la séparation se fait suivant la taille des
molécules ; l’autre est basée sur un gradient de chlorure de césium, la séparation se fait suivant la
densité des molécules, c’est un gradient continu (on prend un tube dans lequel on met l’ADN en
présence de chlorure de césium, et on mélange, l’ADN se distribue dans tout le tube. Après
centrifugation, on obtient un gradient, et l’ADN se place à l’endroit où il y a la même densité). On fait
une culture d’E. Coli sur un milieu en présence de phosphore 32, et donc on obtient une culture
marquée. On fait de même avec de l’azote 15 (non radioactif, apporte une densité supérieure). On
prend 100 µg d’ADN de la première solution, et on les met d’un coté en gradient de saccharose, et de
l’autre sur un gradient de chlorure de césium. On fait les centrifugations, puis on perce un trou au
fond des tubes, et on obtient des fractions, sur lesquelles on compte la radioactivité (CPM).
Saccharose 1h
Cpm
Saccharose 48h
Bas du tube
Haut du tube
Fraction
Chlorure de césium 1h
Chlorure de césium 48h
22
Techniques en bio mol BH 04
Semestre 4
On fait ensuite un mélange des deux, on refait les gradients, et on refait la même expérience :
1h
Chlorure de césium 48h
Il faut, pour voir la 2ème expérience, superposer l’absorbance.
Ensuite, on mélange les 2, on chauffe à 100°C, puis on diminue lentement la température, puis on
fait des gradients.
Chlorure de césium 48h
A
B
23