Caractéristiques et implications cliniques ESR1

Mémoire pour l’obtention du diplôme d’études
spécialisées d’oncologie médicale
Caractéristiques et implications cliniques
de la détection des mutations circulantes
du gène ESR1 chez des patientes traitées
pour un cancer du sein métastatique en
progression sous anti-aromatase
Présenté par Laëtitia Augusto, le 24 Juin 2017
Sous la direction de Monsieur le Professeur Frédéric DI FIORE et Monsieur le
Docteur Florian CLATOT
Unité de Formation et de Recherche de médecine pharmacie
Université de ROUEN
Rapporteur : Pr Antoine Adenis, université de Lille
1
Table des matières
I.
GLOSSAIRE ..................................................................................................................................3
II.
INTRODUCTION ...........................................................................................................................4
III.
RATIONNEL DE L’ETUDE...........................................................................................................6
IV.
MATERIEL ET METHODES ........................................................................................................8
V.
a.
Patients ...............................................................................................................................8
b.
Echantillons sanguins...........................................................................................................8
c.
Détection par droplet digital Polymerase Chain Reaction (ddPCR) .......................................9
d.
Seuil de positivité ................................................................................................................9
e.
Analyse statistique ............................................................................................................ 10
RESULTATS ................................................................................................................................ 11
a.
Caractéristiques et suivi des patientes ............................................................................... 11
b.
Statut mutationnel à progression ...................................................................................... 11
c.
Valeur pronostique ............................................................................................................ 12
d.
Valeur prédictive des traitements ultérieurs à la progression sous AA ............................... 14
d.1
Traitement post progression par chimiothérapie ........................................................... 14
d.2
Traitement post progression par hormonothérapie ....................................................... 14
e.
Cinétique ESR1 avant progression...................................................................................... 15
f.
Cinétique ESR1 après progression ...................................................................................... 16
VI.
DISCUSSION .......................................................................................................................... 17
VII.
CONCLUSION......................................................................................................................... 20
VIII.
BIBLIOGRAPHIE : ................................................................................................................... 21
IX.
ANNEXES: .............................................................................................................................. 25
2
I. GLOSSAIRE
AA : Anti Aromatase
ADN : Acide DésoxyriboNucléique
ASCO : American Society of Clinical Oncology
CHB : Centre Henri Becquerel
cfDNA : ADN libre circulant
ctDNA : ADN tumoral circulant
dPCR : digital Polymerase Chain Reaction
ddPCR : droplet digital Polymerase Chain Reaction
ESR1 : Estrogen Receptor 1
FVA : Fraction Variant Allélique
HER2 : Human Epidermal growth factor Receptor 2
HR : Hazard Ratio
IC : Intervalle de Confiance
IRON : équIpe de Recherche en ONcologie
LBD : domaine de liaison au ligand
mESR1 : Mutation ESR1
NGS : Next Generation Sequencing
PI3K : PhosphoInositide 3-Kinase
RH : Récepteurs Hormonaux
RO : Récepteur Œstrogènes
RR : Risque Relatif
SBR : Scarff-Bloom-Richardson
SG : Survie Globale
SSR : Survie Sans Récidive
Tp : Temps à la progression sous AA
Tp-6 : 6mois avant progression sous AA
Tp-3 : 3mois avant progression sous AA
Tp+3 : 3mois après progression sous AA
3
II. INTRODUCTION
Le cancer du sein se situe au 1er rang des cancers incidents chez la femme. Ainsi,
54 062 nouveaux cas de cancer du sein ont été diagnostiqués en 2015 en France
métropolitaine(1). Environ 11 913 femmes en décèderaient faisant de ce cancer la
première cause de mortalité féminine par cancer en France (Projection Inca 2015).
On remarque, sur ces dernières années, une hausse du taux d’incidence
parallèlement à une diminution de la mortalité. Le dépistage organisé, une prise en
charge plus précoce ainsi que l’amélioration de la thérapeutique peuvent expliquer
au moins en partie cette évolution inverse. Il est important de distinguer les cancers
du sein localisés, des cancers du sein métastatiques. Ces derniers représentent 10%
des cas de cancer du sein au diagnostic, mais 20 à 30% des cancers initialement
localisés deviendront secondairement métastatiques.
Différents facteurs pronostiques du risque de rechute métastatique et du décès ont
été identifiés au plan clinique et histologique. Ainsi, la taille tumorale(2), l’atteinte
ganglionnaire ou non(3), l’âge de la patiente(4) et le caractère inflammatoire ou non
de la tumeur sont les principaux facteurs pronostiques cliniques du cancer du sein.
Sur le plan histologique, les principaux facteurs pronostiques sont le grade de Scarff,
Bloom et Richardson(5), la qualité des marges d’exérèse(6), la présence ou non
d’embole vasculaire(7) et le Ki67(8). L’amplification du gène HER2 présente dans 15
à 20% des cancers du sein constitue un critère de mauvais pronostique mais prédit
une réponse au traitement par anticorps monoclonaux anti-HER2(9). La présence de
récepteurs hormonaux (RH) à la surface des cellules tumorales est retrouvée dans
70% des cancers du sein et est un facteur de bon pronostique(10). Leur présence
conditionne la réponse à l’hormonothérapie et en fait un facteur prédictif majeur(11).
Le traitement par hormonothérapie représente un axe thérapeutique de choix chez
les patientes suivies pour un cancer du sein lors de la phase adjuvante d’un
traitement local, mais également lors de la phase métastatique dès la 1ère ligne(12).
Après la ménopause, la sécrétion d’hormones par les ovaires décline rapidement et
la principale source d’œstrogènes provient alors de la conversion périphérique des
androgènes d’origine surrénalienne (andostenedione et testostérone) par
l’aromatase présente dans le foie, le muscle, les follicules pileux, le tissu adipeux et
les cellules tumorales. Les inhibiteurs de l’aromatase (AA) permettent ainsi de
supprimer cette activité. Actuellement, le traitement par AA en première ligne du
cancer du sein avancé est associé à un taux de réponse global de 32%, une survie
sans progression (SSP) de 9,4 mois et une survie globale (SG) de 34 mois(13) et
constitue un traitement de référence. Cependant, malgré une bonne efficacité initiale,
l’émergence de résistances secondaires ou acquises est inéluctable et aboutit à une
progression tumorale. Cette hormonorésistance survient en moyenne 8 à 11 mois
après l’instauration du traitement et correspond à l’apparition de résistance en lien
avec la pression thérapeutique (14). En 1997, est mis en évidence pour la première
fois une mutation de novo située au niveau du gène codant les récepteurs aux
œstrogènes (RO) (15). Les RO appartiennent à la famille des récepteurs nucléaires
caractérisés par la segmentation en 5 régions communes nommées A/B, C, D, E et F
(Figure 1).
4
Ces régions participent à la formation des domaines fonctionnels suivants :
-
le domaine N-terminal (région A et B) qui a pour principal rôle l’activation de la
transcription,
le domaine de liaison à l'ADN ou DBD (région C) qui comme son nom l’indique
participe à la liaison à l’ADN et joue un rôle dans la dimérisation des
récepteurs,
la région charnière (région D) qui a la capacité de changer de conformation
après fixation du ligand et ensuite permet au récepteur de migrer dans
le noyau cellulaire,
la région C-terminale (région E et F) qui a pour rôle principal la fixation du
ligand ; on parle de domaine de liaison au ligand ou LBD.
Figure 1 : Structure des récepteurs aux œstrogènes
Des études plus récentes réalisées à partir de séquençage de tumeurs ont montré
que les mutations au niveau du gène codant le RO (Estrogen Receptor 1 ou ESR1),
rares sur les tumeurs primitives, pourraient expliquer des résistances secondaires à
l’hormonothérapie (16), ce d’autant que ces mutations affectent le LBD du gène
ESR1(17). En effet, plusieurs études indépendantes ont analysé des métastases de
patientes présentant un cancer du sein devenu hormonorésistant(17–19). Ces
études retrouvent des mutations récurrentes d’ESR1 essentiellement au niveau des
codons 537 et 538 de l’exon 8 en particulier chez des patientes traitées par AA. Dans
ces travaux, la fréquence estimée de mutations ESR1 acquises était comprise entre
20 et 50% pour des patientes présentant un cancer du sein métastatique avec un
taux de mutation très faible, voire nul, au sein de la tumeur primitive (0 à 3%). Sur le
plan fonctionnel, les mutations du gène ESR1 sont responsables d’une modification
conformationnelle du récepteur aux œstrogènes entrainant ainsi une activité de
transcription indépendante du ligand(17). A noter que les mutations situées au
niveau des codons 537 et 538 représentent 74% des mutations décrites (20). Les
mutations ESR1 sont ainsi le reflet d’une hormonorésistance(21) survenant sous
l’effet d’un traitement par AA en phase métastatique. Leur implication n’est
actuellement pas démontrée lors d’une hormonorésistance acquise sous
Tamoxifène(21).
5
III. RATIONNEL DE L’ETUDE
Si le concept de mutations ESR1 acquises dans le tissu métastatique sous l’effet des
AA a été suggéré par ces différents travaux, les questions concernant l’utilité de leur
recherche ainsi que les modalités de cette détection ont été rapidement soulevées.
Concernant ce dernier point, la réalisation de biopsies de métastases est un geste
invasif potentiellement risqué qui ne peut donc servir d’outil de suivi en cours de
traitement. C’est dans ce contexte que le concept de biopsie liquide a émergé
comme voie la plus appropriée (22,23). Parmi les méthodes de détection disponibles,
la technique de digital polymerase chain réaction (dPCR) nous a semblée être la plus
adaptée à la pratique clinique compte tenu de sa sensibilité lui permettant de
détecter de faibles taux de mutations (24,25) et de son coût. Notre équipe a été l’une
des premières à travailler sur la détection des mutations ESR1 au niveau circulant.
Ainsi, une étude pilote de faisabilité(26) de détection des mutations circulantes ESR1
a été menée par l’équIpe de Recherche en Oncologie (IRON). Les objectifs du travail
ont été de développer la dPCR pour la détection des mutations ESR1 et de comparer
le séquençage par technique Sanger au séquençage par dPCR sur métastase et
plasma prélevé de manière concomitante. Pour ce faire, nous avions sélectionné 7
patientes suivies pour un cancer du sein métastatique RH+ en progression sous AA
après une stabilité ou réponse tumorale initiale d’un minimum de 6 mois. Nous
disposions pour chacune de ces patientes, de manière concomitante aux
échantillons plasmatiques héparinés, d’un échantillon de tissu tumoral initial avant
toute exposition à un traitement et de métastases pleurales prélevées au moment de
la progression sous AA. Le séquençage Sanger sur métastase a ainsi permis
d’identifier 4 patientes mutées (3 mutations différentes D538G, Y537N, Y537S) sur
l’ensemble des 7 patientes. La technique de dPCR sur métastase, plus sensible, a
permis de mettre en évidence 6 patientes mutées (dont 1 avec double mutation). La
même analyse par dPCR réalisée sur ADN tumoral circulant retrouvait 4 mutations
chez les 6 patientes mutées (Tableau 1).
6
Sefrioui et al, International Journal of Cancer, 2015
Tableau 1 : Mutations ESR1 détectées par séquençage Sanger ou dPCR sur
métastases et par dPCR sur plasma
Les résultats obtenus ont corroboré l’hypothèse selon laquelle la technique de dPCR
sur sang circulant permettait d’identifier les mutations ESR1 de manière simple,
sensible, spécifique et peu couteuse. Concernant notre pratique clinique,
l’identification de mutations ESR1 pourrait modifier les modalités de prise en charge
des patientes. Nous nous sommes alors demandé si certains traitements seraient
plus efficaces que d’autres après progression sous AA chez des patientes présentant
une mutation ESR1. Nous nous sommes également questionné sur la possibilité
d’une détection circulante, en amont de la progression clinique. Enfin, la question de
l’impact de la présence d’une mutation ESR1 sur la survie a également été soulevée.
Dans ce contexte, l’objectif de notre étude était de déterminer la valeur pronostique
et prédictive de la présence d’une mutation circulante ESR1 au moment de la
progression sous AA et de suivre la cinétique d’apparition des mutations au niveau
circulant. Pour les besoins de ce travail réalisé au sein du groupe IRON, ma
contribution personnelle a été de réaliser l’ensemble du recueil de données cliniques
et biologiques après avoir sélectionné les patientes en fonction des critères
d’inclusions prédéfinis. Sur le plan technique, j’ai contribué à la recherche et au
désarchivage des prélèvements biologiques congelés et stockés avant de participer
en partie aux analyses biologiques par dPCR. Enfin, j’ai pu contribuer à la réalisation
de l’analyse statistique ainsi qu’à l’écriture de l’abstract et de l’article (joints en
annexes).
7
IV.
MATERIEL ET METHODES
a. Patients
Les patientes ont été sélectionnées à partir des réunions de concertation
pluridisciplinaire hebdomadaires d’oncologie générale du centre Henri Becquerel
(CHB) de Janvier 2010 à Décembre 2012 inclus. Toutes les patientes de plus de 18
ans suivies pour un cancer du sein RH+ localement avancé inopérable ou
métastatique présentant une progression clinique, radiologique et/ou biologique en
cours de traitement par première ligne d’AA associé ou non à une thérapie ciblée
étaient incluses. Les patientes pouvaient avoir reçues un ou plusieurs traitements
antérieurs par chimiothérapie, tamoxifène ou fulvestrant. En cas de précédente
exposition aux AA lors de la phase adjuvante, un délai de 2 ans minimum devait être
respecté entre la fin de l’exposition à l’AA et l’évolution métastatique.
Pour chaque patiente, les facteurs pronostiques cliniques et histologiques étaient
recueillis, ainsi que l’évaluation clinique, biologique et radiologique après chaque
ligne de nouveau traitement (stabilité, progression ou réponse partielle). L’ensemble
de ces données étaient obtenues à partir des comptes rendus d’hospitalisations ou
de consultations.
b. Echantillons sanguins
Au CHB, chaque patiente bénéficie d’un prélèvement sanguin concomitant à
l’évaluation clinique réalisée tous les 3 à 6 mois. Dans notre étude, toutes les
patientes possédaient un échantillon sanguin au moment de la progression clinique
et/ou biologique en cours de première ligne de traitement par AA. En cas de mutation
détectée à Tp (Temps à progression), les prélèvements disponibles à Tp-6 (Tp6mois), Tp-3 (Tp-3mois) et Tp+3 (Tp+3mois) étaient analysés (Figure 2). Les
échantillons de sang ont été recueillis dans des tubes héparinés puis traités dans un
délai de deux heures après la collecte, centrifugés une fois à 2000g (10 min) à 4°C et
stockés à -20°C. Toutes les patientes sélectionnées avaient signé un formulaire de
consentement permettant la conservation et l'étude de leurs échantillons biologiques.
Cette étude a été approuvée par le Comité d’Ethique Institutionnel du Centre Henri
Becquerel (N° d’enregistrement 1503B).
Figure 2 : Schéma des différents temps de prélèvements
8
c. Détection par droplet digital Polymerase Chain Reaction (ddPCR)
L’ADN a été extrait de 0,4 à 2 ml de plasma hépariné à l'aide du kit QIAamp
Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Germany) puis élué dans un volume de
30µL et conservé à -20 °C jusqu’à l’étape de quantification. La quantification d’ADN
double brin a été réalisée par une méthode colorimétrique utilisant le kit Quant-iT™
PicoGreen® dsDNA Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA) et par fluoromètre microplaque
de type Twinkle LB970 (Berthold, Bad Wildbad, Germany). Nous avons utilisé la
plateforme de droplet digtal PCR (Qx200® droplet digital PCR system, Bio-rad
laboratories, Hercules, CA, USA) afin de détecter la présence de mutations
circulantes ESR1 dans des échantillons de plasma. Quatre nanogrammes de cfDNA
ont été préamplifiés avec 2 µl d’héparinase (New England iolabs, Ipswich, MA). Nous
avons utilisé un Taqman SNP genotyping assay (Life Technologies, Carlsbad, CA)
pour la détection des mutations ESR1 : Y537N, Y537S, Y537C et D538G. Les
conditions de cycle de PCR et la composition des réactifs sont décrits en annexes
(Annexe 1).
Le nombre total de copie d’ADN était compris entre 200 et 2000 copies / µl pour
chaque réaction. Au moins trois puits de contrôle négatif sans ADN ont été inclus
dans chaque test. Chaque ADN mutant a été dilué en série avec de l’ADN de type
sauvage (expériences réalisées en triple) pour évaluer la linéarité et la
reproductibilité de ces méthodes.
d. Seuil de positivité
Le bruit de fond, noté LOD pour « limit of detection » est défini par la concentration
minimale de l'allèle mutant qui peut être détectée à partir d'un témoin négatif. Pour
évaluer le bruit de fond de notre méthode, la charge de l'allèle a été mesurée à partir
de 10 échantillons d’ADN libre circulant (cfDNA) préamplifiés et extraits de plasmas
héparinés témoins provenant de patients indemnes de cancer du sein. Ces plasmas
témoins ont été prélevés, analysés et stockés dans les mêmes conditions que nos
tubes de patients utilisés dans l’étude. Basé sur Hindson et al., nous avons défini
pour chaque mutation un seuil pertinent pour discriminer les statuts positifs et
négatifs(25). La fraction de variant allélique (FVA) a été définie comme étant la
proportion de copies d'ADN mutants par rapport à la somme des copies d'ADN
mutants et d’ADN de type sauvage obtenus par ddPCR.
Les échantillons prélevés au moment de la progression sous AA ont été considérés
comme mutés si au moins deux analyses par ddPCR indépendantes réalisées par
deux opérateurs indépendants trouvaient une FVA au-dessus du seuil de mutation.
Les analyses de ddPCR ont toutes été effectuées en aveugle sans connaitre les
données cliniques. En raison d’une quantité de plasma restante parfois insuffisante,
certains échantillons à Tp-6, Tp-3 et Tp+3 n’ont été analysés qu’une seule fois par
ddPCR.
9
e. Analyse statistique
Le critère principal était l’évaluation de la survie globale en fonction du statut
mutationnel ESR1 circulant au moment de la progression sous AA. Dans l'hypothèse
que 30% des patientes possèdent une mutation ESR1 au moment de la progression
sous AA et que 70% des patientes présentant une progression sous AA (27)
mourront au cours des 3 années suivantes (28), nous avons calculé qu’il fallait au
moins 121 patientes (29) pour détecter un hazard ratio (HR) d’au moins deux fois le
risque de l'autre groupe avec une puissance de 80% et un risque alpha de 5% en
utilisant le modèle de Cox.
Les critères secondaires regroupaient la fréquence de mutation circulante ESR1 au
moment de la progression sous AA, et la survie sans progression de Tp à
l’instauration d’une nouvelle ligne thérapeutique.
Enfin, nous avons décrit la cinétique des mutations circulantes ESR1 avant et après
progression sous AA.
Les facteurs pronostiques de SSP et SG ont été déterminés parmi les variables
suivantes : le temps entre l’évolution métastatique et la progression sous AA, le
performance statut au moment de la progression, le taux de cfDNA à la progression,
la présence d’une mutation circulante ESR1 au moment de la progression, un âge
supérieur à 65 ans à progression sous AA, le nombre de lignes de traitement avant
l'introduction d’AA, la durée d'exposition à l’AA et le type de traitement après
progression sous AA.
Les comparaisons entre les groupes ont été effectuées en utilisant le test du chi 2 ou
le test de Wilcoxon. La SG a été calculée à partir de Tp jusqu’à la date du décès
toutes causes confondues. La SSP a été calculée à partir du temps Tp jusqu’ à la
date de la progression clinique et/ou biologique (ou la mort toute cause confondue)
après la nouvelle ligne de traitement suivant la progression sous AA. Les patientes
décédées à Tp ont été exclues de l'analyse de survie. Les courbes de survie ont été
calculées en utilisant la méthode de Kaplan-Meier et comparées avec le test du logrank. L'analyse multivariée a été réalisée en utilisant le modèle de Cox. Toutes les
analyses statistiques ont été effectuées en utilisant la version du logiciel R 3.0.1.
10
V. RESULTATS
a. Caractéristiques et suivi des patientes
Au total, 156 patientes ont été incluses dans l’étude. Compte tenu d’une quantité
insuffisante d’ADN circulant, 12 patientes ont été exclues. Trois patientes sont
décédées dans les jours suivants la progression, elles ont été exclues de l’analyse
en survie (Figure 3).
b. Statut mutationnel à progression
Lors de la progression sous AA, 44 patientes (30,6%) avaient au moins une mutation
circulante ESR1. Au total, 63 mutations ont été retrouvées, D538G et Y537S étaient
les deux plus fréquentes avec un nombre respectif de 24 et 21 mutations. Les
mutations Y537N et Y537C étaient présentes respectivement dans 16 et 2
échantillons. Parmi les 44 patientes mutées, 28 avaient une mutation circulante
unique, 13 avaient une double mutation et 3 avaient une triple mutation circulante.
La présence d'une mutation ESR1 circulante n’était pas liée à un sous-groupe de
population. A noter que le temps d'exposition médian aux AA était significativement
plus long chez les patientes présentant une mutation ESR1 circulante que chez les
patientes non mutées (15 mois et 10,5 mois, respectivement, p = 0,02).
Figure 3 : Diagramme de l’étude
11
c. Valeur pronostique
Le suivi médian à partir de l'initiation de l'AA était de 40 mois [4-94]. Au moment de
l'analyse, 111 patientes étaient décédées, 33 étaient en vie, et aucune patiente
n’était perdue de vue. Parmi les 144 patientes, 3 patientes (une mutée et deux nonmutées) sont décédées dans les jours suivants la progression et ont été exclues de
l'analyse de la survie.
Parmi les 141 patientes analysées, la survie globale médiane était significativement
plus faible en cas de détection d’une mutation circulante ESR1 : 15,5 mois [2-44]
contre 23,8 mois [2-70]; p = 0,0006 ; HR = 1,9 IC [1,2 -3,1] (Figure 4).
Figure 4 : Survie globale en fonction du statut mutationnel
Cette valeur pronostique péjorative a été confirmée en analyse multivariée (HR =
1,9 ; p = 0,002 IC [1,3-3]) (Tableau 2). Les autres principaux facteurs pronostiques
péjoratifs étaient :
 Un performance status > 1 (HR = 3 ; p <0,0001 IC [1,9 à 4,7])
 Une quantité d'ADN total circulant élevée (au-dessus de la médiane)
(HR = 1,8 ; p = 0,006 IC [1,2 à 2,7]).
12
Tableau 2 : Analyse en survie globale : facteurs pronostiques
Concernant la SSP, celle-ci était diminuée chez les patientes mutées ESR1 avec une
médiane de 5,9 mois comparativement à 7,0 mois pour les patientes non mutées (p
= 0,002 ; HR = 1,7 IC [1,1-2,6] (Figure 5).
Figure 5 : Survie sans progression en fonction du statut mutationnel
13
En analyse multivariée, si l'on considérait la survie sans progression, avoir une
mutation circulante ESR1 et avoir reçu plus d'une ligne de chimiothérapie avant
l'introduction d’AA étaient les 2 facteurs de mauvais pronostiques retrouvés (p =
0,008 ; HR = 1,7 IC [1,2-2,5] et p = 0,009 ; HR = 2.3 IC [1,2 au 4,1], respectivement)
(Tableau 3).
Tableau 3 : Analyse en survie sans progression : facteurs pronostiques
d. Valeur prédictive des traitements ultérieurs à la progression sous AA
Après progression sous AA, la plupart des patientes ont reçu un traitement par antiœstrogènes (tamoxifène ou fulvestrant, 51 patientes) ou par chimiothérapie (58
patientes). L'ajout d'everolimus ou d’un inhibiteur de Her2 était moins fréquent (14 et
2 respectivement). Huit patientes ont bénéficié d’un changement d’AA, 4 patientes
n’ont eu aucune modification du traitement malgré la progression, 3 patientes étaient
décédées à la progression et 4 patientes ont reçu d'autres traitements. Concernant
l’ensemble des patientes, qu’elles soient mutées ou non mutées, il n’a pas été mis en
évidence de différence significative en terme de SSP ou SG en fonction des
traitements reçu après progression sous AA.
d.1
Traitement post progression par chimiothérapie
Chez les patientes traitées par chimiothérapie après progression sous AA, nous
avons mis en évidence une SG médiane de 16 mois chez les patientes mutées
contre 27 mois chez les patientes non mutées (p = 0,014 ; HR = 2,0 IC [1,01-4,0]).
Des résultats similaires ont été observés en SSP. En effet, la SSP médiane étaient
de 7 mois en cas de mutation contre 9 mois sans mutation (p = 0,009 ; HR = 1,9 IC
[1,01-3,6]).
d.2
Traitement post progression par hormonothérapie
Chez les patientes traitées par une hormonothérapie hors AA, seule une tendance à
une diminution de la SG et SSP en cas de mutation a été retrouvée. La SG médiane
était de 12 mois en cas de mutation contre 26 mois sans mutation (p = 0,09 HR = 1,7
IC [0,9-3,3]) et la SSP médiane était de 5 mois en cas de mutation contre 6 mois
sans mutation (p = 0,17 ; HR = 1,4 IC [0,8-2,8]).
14
Nous avons alors combiné les patientes ayant été traitées par chimiothérapie et
celles traitées par hormonothérapie hors AA. Il est apparu de manière significative
une altération de la SG en cas de mutation ESR1 : 16 mois contre 27 mois chez les
patients non mutées (p = 0,002 ; HR = 1,9 CI [1,1-3,0]).
Enfin, en ce qui concerne les patientes qui avaient été traitées par AA, ou par AA +
everolimus, après progression sous AA, le nombre limité de patientes n’a pas permis
d’analyse fiable. Cependant, même si cela reste une tendance, nous mettons en
évidence une amélioration de la SG chez les patientes non mutées (SG = 42 mois
versus 23 mois p = 0,17, HR = 2,1 IC [0,5-8,4]) par rapport aux patientes mutées.
Nous retrouvons notamment chez les 11 patientes non mutées traitées par AA +
everolimus une SG médiane particulièrement longue de 46 mois.
e. Cinétique ESR1 avant progression
Parmi les 44 patientes présentant une mutation circulante ESR1 au moment de la
progression sous AA, des échantillons de plasma étaient disponibles à Tp-3 ou à Tp6 dans 43 cas. En cas de mutations doubles ou triples, la mutation prédominante
était retenue pour l’analyse ultérieure.
Parmi ces patientes, nous avons pu analyser les échantillons à la fois à Tp-3 et à Tp6 pour 20 d’entre elles, tandis que ces patientes étaient sous AA et ne présentaient
pas encore de progression clinique. Parmi les 20 patientes, 15 (75%) avaient une
mutation circulante ESR1 détectable avant la progression clinique, et dans la plupart
des cas, le taux de mutation augmentait à 3 mois (p = 0,02 ; entre Tp-6 et Tp-3 et p =
0,0087 entre Tp -3 et Tp,) (Figure 6). A noter que 2 patientes avaient une diminution
du taux de mutation entre Tp-3 et Tp. Parmi nos échantillons, 8 patientes analysées
présentaient des mutations doubles (n=6) ou triples (n=2) et possédaient des
prélèvements à la fois à Tp-3 et Tp-6. Chez 5 d’entres elles (62%) la mutation
prédominante était détectable avant Tp. Les mutations non prédominantes étaient le
plus souvent non détectables (7/10 mutations) à la fois à Tp-6 et Tp-3 ou à une
valeur inférieure à celle de la mutation prédominante. Chez une des patientes, la
mutation Y537S est devenue prédominante à Tp alors que la mutation D538G avait
un taux plus élevé à la fois à Tp-6 et Tp-3. Chez une autre patiente, une diminution
du taux d’une mutation contrastait avec l'apparition d'une autre suggérant une
évolution dissociée de 2 sous-clones.
15
Figure 6 : Détection pré clinique des mutations circulantes ESR1. Rouge =
Progression tumorale au moment du prélèvement. Bleu= Stabilité ou réponse
tumorale au moment du prélèvement
f. Cinétique ESR1 après progression
Enfin, nous avons également étudié l'évolution du taux de mutation circulante ESR1
dans les échantillons de plasma après progression sous AA.
Nous disposions alors pour 33 des 44 patientes mutées (75%) de plasma à Tp+3.
Parmi elles, 16 (48%) étaient en progression clinique, tandis que les autres
présentaient une stabilité ou une réponse partielle. Toutes les patientes (n = 6, 18%)
présentant une augmentation de la quantité de mutation ESR1 circulante au bout de
3 mois étaient en progression clinique. En revanche, chez les 27 patientes
présentant une diminution de la quantité de mutation ESR1 circulante, 10 (37%)
étaient en progression clinique (Figure 7). Par ailleurs, 3 patientes ne présentaient
aucune mutation détectable et pourtant avaient une progression clinique.
Figure 7 : Evolution des mutations circulantes ESR1 après changement de
thérapeutique. Rouge = Progression tumorale au moment du prélèvement. Bleu=
Stabilité ou réponse tumorale au moment du prélèvement.
16
VI.
DISCUSSION
Notre étude a montré que la mutation circulante ESR1 était détectable chez 30,6%
des femmes suivies pour un cancer du sein métastatique lors de la progression sous
AA. Nous avons également montré que la présence de cette mutation circulante était
un facteur de mauvais pronostic tant en SSP qu’en SG. Notre étude n’a pas permis
d’identifier un rôle prédictif de la mutation mais nos analyses ont pu être biaisées par
le nombre insuffisant de patient. Enfin, l’étude de la cinétique s’est révélée
prometteuse puisqu’elle retrouve un taux de détection pré clinique de 75%.
Dans notre étude, sur 144 patientes 30,6% possédaient au moins une mutation du
gène ESR1. Des taux similaires sont retrouvés dans la littérature si l’on retient les
études aux critères comparables. En effet, il a été décrit 37% de mutations du gène
ESR1 dans l’étude de Spoerke et al. (30), 28,6% dans l’étude de Chandarlapaty et al
(31). et 25,3% dans l’étude de Fribbens et al. (32) pour un total respectif de 153, 541
et 395 patients. De même le caractère polyclonal des mutations ESR1 et le taux de
double (29,5%) et triple mutation (6,8%) est proche de celui précédemment rapporté
(26,32,33). Notre étude a retrouvé un taux de mutation ESR1 D538G de 54,5 %,
Y537S de 47,7%, Y537N de 36,4% et Y537C de 4,5%.
Notre travail a permis de montrer que la présence d’une mutation ESR1 chez les
femmes suivies pour un cancer du sein métastatique en progression sous 1 ère ligne
d’hormonothérapie apparaissait clairement comme un facteur de mauvais
pronostique en SG (15,5 M versus 23,8 M ; p = 0,0006) et en SSP (5,9 M versus 7,0
M ; p = 0,002). L’analyse de sous groupe de l’essai clinique BOLERO 2 (n = 541)
retrouvait également des résultats en ce sens avec une SG de 20,7 mois chez les
patientes mutées contre 32,1 mois pour les patientes non-mutées (p <0,0001)(31).
Dans une analyse de sous-groupe de l'essai clinique PALOMA-3 (n = 395) une SSP
de 7,3 mois en cas de mutation contre 9,2 mois était retrouvée pour les patientes
non-mutées (p = 0,02)(32). Spoerke ne trouvait aucune différence lié à la mutation
ESR1 (30).
En dehors d’une moins bonne réponse à la poursuite d’un traitement par AA(21), la
valeur prédictive d’une mutation ESR1 sur le traitement reçu après progression sous
AA n’était pas clairement établit. Dans notre étude, plusieurs molécules ont été
instaurées après progression sous AA : le tamoxifène, le fulvestrant ou la
chimiothérapie. La présence d’une mutation ESR1 n’a pas été associée à une
réponse différentielle selon les traitements reçus. Cependant, le nombre limité de
patientes dans chaque sous groupe de traitement (tamoxifène n=34, fulvestrant n=17
ou chimiothérapie n=58) et le caractère rétrospectif de l’analyse ne permettent pas
de conclure formellement.
Le fulvestrant est largement utilisé en situation d’hormonorésistance chez des
patientes suivies pour un cancer du sein métastatique. Récemment, l’étude SoFEA
qui a inclus des patientes suivies pour un cancer du sein métastatique
hormonorésistant a montré chez les patientes mutées ESR1, un bénéfice significatif
en SSP du fulvestrant (seul ou associé à l’anastrozole) par rapport à l’exemastane
(5,7 M versus 2,6 M, p=0,02). Chez les patientes non mutées, il n’existait pas de
différence significative entre ces 2 traitements. L’étude PALOMA 3 a comparé
17
fulvestrant + palbociclib à fulvestrant seul chez des patientes traitées pour un cancer
du sein métastatique et ayant progressé sous AA. Les auteurs ont rapporté un
bénéfice en survie lors de l’utilisation du fulvestrant seul chez les patientes mutées
avec une SSP de 3,6 mois. La SSP chez les patientes non mutées était de 5,4 mois.
Concernant le bras de traitement par fulvestrant + palbociclib, il a été démontré chez
les patientes mutées ESR1 et non mutées une amélioration de la SSP par rapport au
bras de traitement par fulvestrant seul (respectivement SSP = 9,4 M versus 3,6 M
(p=0,002) et SSP = 9,5 M vs 5,4 M (p<0,001)).
Actuellement en phase métastatique, une des options thérapeutiques en cas
d’hormonorésistance est l’ajout d’un traitement par inhibiteur de mTor(27). L’essai
clinique BOLERO 2 qui s’adressait à des patientes ayant progressé sous letrozole ou
anastrozole a mis en évidence une augmentation de la SSP chez les patientes non
mutées dans le bras exemestane + everolimus versus exemestane seul (8,5 M
versus 3,9 M, p<0,001). Concernant les patientes mutées ESR1, il a été décrit une
augmentation de la SSP chez les patientes mutées D538G (5,8 M versus 2,7 M,
p<0.001) mais ce bénéfice n’a pas été retrouvé chez les patientes mutées Y537S
(4,17 M vs 4,14 M, p=0,95). Ces résultats suggèrent donc une réponse possiblement
différente selon le type de mutation ESR1 envisagée. D’un point de vue préclinique,
Toy et al. ont récemment montré que les mécanismes de résistances et leurs
conséquences fonctionnelles pouvaient en effet être différents en fonctions du type
de mutations ESR1. Ils ont notamment décrit une activation constitutionnelle
maximale du RO chez les patientes mutées Y537S conférant ainsi une résistance au
fulvestrant in vivo. Des antagonistes des RO plus puissants tels que l’AZD9496
permettraient d’obtenir une meilleure efficacité que le fulvestrant chez les patientes
mutées Y537S(34). A l’inverse, d’autres mutations comme E380Q ou S463P seraient
plus sensibles à l’inhibition apportée par le fulvestrant.
Ces résultats préliminaires nécessitent d’être confirmés mais placent le fulvestrant,
seul ou en association avec le palbociclib et l’everolimus comme des traitements
prometteurs chez les patientes porteuses de la mutation ESR1. L’ensemble de ces
données soulignent l’importance de connaitre le statut mutationnel ESR1 au moment
de la progression sous AA afin d’orienter la prise en charge thérapeutique.
La possibilité d’une détection pré-clinique des mutations ESR1 avait été suggérée
par notre équipe (26). Notre nouveau travail, grâce à de nombreux échantillons
disponibles, a permis d’établir de façon originale la cinétique des mutations ESR1 à
Tp-6, Tp-3 et Tp pour 20 patientes. Nous observons ainsi que 75% des mutations
ESR1 sont détectables avant même toute progression clinique. Se pose alors la
question de l’intérêt sur la SSP et la SG d’un changement précoce de traitement
levant ainsi la pression de sélection établie par les AA. Ainsi, l’étude de phase III
PADA-1 vient de débuter (NCT03079011) et prévoit de recruter 800 patientes
traitées en première ligne métastatique d’un cancer du sein RH+ par AA +
palbociclib. Un suivi tous les 2 mois sera réalisé, et en cas d’apparition d’une
mutation ESR1 circulante (attendue pour 200 patientes), une randomisation entre
poursuite de l’association AA + palbociclib ou un relais vers du fulvestrant +
palbociclib sera proposé. Les co-objectifs primaires de cette étude sont l’analyse de
la toxicité des associations hormonothérapie + inhibiteur cdk4/6, ainsi que la
comparaison de la SSP entre les deux bras explorés en cas de mutation. Cette étude
18
d’ampleur permettra donc de mieux suivre l’émergence des mutations ESR1, mais
également d’évaluer le potentiel bénéfice à un changement thérapeutique précoce
basé sur un marqueur tumoral circulant.
Dans notre étude, après progression sous AA, nous avons analysé l’évolution des
taux circulants de mutation ESR1 à tp+3 en fonction du traitement reçu et de
l’évolution clinique. En cas d’augmentation du taux de mutation, il était retrouvé une
progression clinique chez 100% des patientes (n=6). Ces résultats sont compatibles
avec ceux rapportés par Takeshita et al.(11 progressions sur 13 patientes)(35).
L’inverse n’était cependant pas vrai dans notre étude. En effet, la diminution du taux
de mutation n’était pas nécessairement liée à une réponse clinique. Spoerke et al.
ont également décrit une baisse du taux de mutations alors que les patientes
présentaient une maladie stable ou en progression. Ils ont émis l’hypothèse d’une
hétérogénéité tumorale avec l’idée que certaine lésions porteuses de mutations
ESR1 répondaient alors que d’autres lésions (dont ils ne disposaient pas de
marqueur biologique) progressaient(30). Une telle hétérogénéité moléculaire et une
évolution génétique parallèle des différents sites métastatiques en cours de
traitement a déjà été mise en évidence lors du traitement par un inhibiteur de PI3K
chez des patientes suivies pour un cancer du sein(36).
Enfin, un des problèmes clés de l'analyse des mutations circulantes est la définition
rigoureuse d'un seuil positif. En effet, il n'y a pas de consensus sur cette définition.
Wang et al. parlaient d’échantillon positif si la fréquence des allèles était supérieur à
0 après soustraction du bruit de fond, si 2 tests positifs étaient détectés à plusieurs
reprises, et si la fréquence de l'allèle était supérieur au bruit de fond ajusté sur au
moins 3 tests indépendants(37). Pour Schiavon et al., une mutation était considérée
comme positive s’il y avait au moins la présence de mutants ESR1 sur 2 tests(21).
Enfin, Takeshita et al. mettaient l'accent sur l'augmentation du taux de mutation
ESR1 entre 2 échantillons plutôt que de définir un seuil positif basé sur un seul
point(35). Il est impératif d’établir une définition fiable et commune à tous dans
l’optique d’une utilisation clinique quotidienne. L’étude prospective FMER,
actuellement en cours dans notre centre et au centre François-Baclesse a pour
objectif, entre autres, de proposer une définition stricte et reproductible du seuil de
positivité des mutations ESR1 afin de valider cette pratique en routine.
Même si les implications définitives nécessiteront les résultats d’essais prospectifs,
les contours de la recherche de mutations circulantes ESR1 se précisent : probable
intérêt en situation métastatique soit durant une exposition à des AA, soit au moment
de la progression sous AA. Cette analyse permettra certainement de proposer un
traitement spécifique à partir des molécules déjà disponibles, ou des nouvelles
hormonothérapies en cours de développement. Par ailleurs, plusieurs questions
restent entières.
En premier lieu, rappelons que la principale délivrance d’AA se fait lors de la phase
adjuvante. Or, aucune étude ne s’est intéressée à l’incidence des mutations ESR1
circulantes en fin de traitement adjuvant. Au moment de la rechute métastatique,
Schiavon a décrit une prévalence de mutations ESR1 plus faible chez les patientes
exposées aux AA en adjuvant par rapport aux patientes traitées uniquement en
phase métastatique par AA (5,8% versus 36,4% p=0,0002). Elle a alors émis
l’hypothèse qu’en situation de maladie micro-métastatique, la charge tumorale était
19
trop faible pour permettre d’identifier une mutation ESR1 et pour laisser aux AA la
place d’exercer leur pression de sélection et donc de sélectionner un clone
majoritaire mutant. Il est possible qu’il existe différents mécanismes d’acquisition
d’hormonorésistance. Dans ce contexte l’étude rétrospective ERASE a été mise en
place au centre Henri Becquerel afin de définir le taux de mutation ESR1 en fin de
traitement adjuvant par AA et à la rechute.
Par ailleurs, les mutations ESR1 n’expliquent qu’une part seulement des
mécanismes d’hormonorésistance. De nouveaux mécanismes moléculaires
potentiellement traçables au niveau circulants ont récemment été décrits. Ainsi,
Magnani et al. ont décrit l’émergence de l’amplification CYP19A1 in vivo dans des
modèles résistants aux AA. Cette amplification confère aux RO une indépendance
vis-à-vis des œstrogènes et ainsi une diminution de la sensibilité aux AA. Basé sur
leurs études in vivo, ils ont suggéré que l'amplification CYP19A1 pourrait apparaître
en cours de traitement par inhibiteurs réversibles, mais être antagonisée par un
inhibiteur irréversible comme l’exemestane. Concernant l’amplification CYP19A1, un
taux de 21,5% a été retrouvé parmi les patientes qui rechutaient et qui avaient été
traitées en adjuvant par AA contre seulement 4% chez des femmes n’ayant pas été
traitées par AA en adjuvant, suggérant ainsi un rôle des AA dans la sélection de
clones mutants (38).
VII. CONCLUSION
Notre étude a clairement illustré le potentiel clinique de la recherche de mutations
circulantes ESR1 par dPCR dans la prise en charge des cancers du sein
métastatiques RH+ hormonorésistants. La détection d’une mutation circulante ESR1
lors de la progression sous AA chez ces patientes est un facteur majeur et
indépendant de mauvais pronostique. Le suivi de la cinétique des mutations ESR1
permet de détecter une résistance pré-clinique aux AA. Désormais, la confirmation
de ces résultats, la question d’un changement précoce de traitement en cas
d’apparition de mutation circulante et l’évaluation de nouveaux traitements
spécifiques tels que des modulateurs des RO plus puissants sont aujourd’hui des
questions posées dans le cadre d’essais prospectifs.
20
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24
IX.
ANNEXES:
Annexe 1 : Conditions de cycle de PCR et la composition des réactifs
Les conditions de digital PCR ont été optimisées pour identifier la température
optimale d'hybridation / extension pour chaque mutation, en utilisant l'ADN de type
sauvage ensemencé avec un oligonucléotide synthétique mutant inséré dans le
plasmide pMT (Invitrogen, GeneArtTM, Carlsbad, CA).
25
Annexe 2: Abstract ASCO 2016 présenté en communication orale
Prognostic and predictive value of circulating ESR1 mutations in metastatic breast
cancer patients (mBC) progressing under aromatase inhibitor (AI) treatment
L Augusto1, N Sarafan-Vasseur2,3, A Perdrix2,4, L Beaussire2,3, J Delacour2,3, D Sefrioui2,3,5, C Calbrix4,
JM Picquenot4,6,T Frebourg3, F Jardin6, F Di Fiore1,2,3,5 , F Clatot1,2,6
(1)Oncologie Médicale, Centre Henri Becquerel; (2) Equipe de Recherche en Oncologie (IRON); (3) INSERM
U1079; (4) Bio-pathologie, Centre Henri Becquerel; (5) Oncologie digestive, CHU Rouen; (6) INSERM U918
Background: We recently reported that the detection of somatic and circulating
activating ESR1 mutations is related to AI resistance in hormone receptor positive
(HR+) mBC (Sefrioui et al., 2015). We aimed to evaluate the predictive and
prognostic values of circulating ESR1 mutations detection at time of progression in
mBC patients under AI.
Methods: This study is a monocentric retrospective analysis of all consecutive
patients treated with first-line AI for HR+mBC from 2008/01 to 2010/12. ESR1
circulating mutations rates (D538G, Y537S/N/C) were assessed by droplet digital
PCR on plasma samples at progression. The impact of the mutational status on OS,
PFS and clinical response to subsequent treatments was determined by univariate
and multivariate analysis.
Results: A total of 144 HR+mBC patients was analyzed. Median follow-up from
initiation of AI was 40 months (range 4-94). At progression, 44 patients (30.6 %)
presented at least one ESR1 circulating mutation (D538G 54%, Y537S 45%, Y537N
34%, Y537C 4%). Median OS after progression was 15 months (2-44) for mutated
patients vs 24 months (2-70) for non-mutated patients (HR=1.9; p=0.006). For the
whole population, performance status>1 (HR=3.0; p<0.0001), circulating ESR1
mutation (HR=1.9; p=0.002), and high level of cfDNA (H=1.8; p=0.006) were
independent prognostic factors for OS. The mutational status was also independently
related to a worse PFS (HR=1.7; p=0.008). After progression, 56 patients were
treated by chemotherapy, 55 by fulvestrant/tamoxifen, 14 by AI + everolimus and 19
by no or other modalities. The detection of circulating ESR1 mutation was
independently related to a worse OS and PFS in the chemotherapy group (HR=2.0
for both; p=0.04 and p=0.03, respectively). A trend for a worse OS was also observed
for mutated patients treated by fulvestrant/tamoxifen (p=0.09). Among mutated
patients, no difference was observed in PFS and OS between the different treatment
groups.
Conclusion: Circulating ESR1 mutation detection at progression under AI is a strong
and independent prognostic factor of OS in HR+mBC patients. This detection seems
predictive of a worse outcome in any subsequent treatment.
26
Annexe 3: Article paru dans Oncotarget en Octobre 2016
27
Oncotarget, Vol. 7, No. 46
www.impactjournals.com/oncotarget/
Priority Research Paper
Kinetics, prognostic and predictive values of ESR1 circulating
mutations in metastatic breast cancer patients progressing on
aromatase inhibitor
Florian Clatot1,2,3, Anne Perdrix3,4, Laetitia Augusto1, Ludivine Beaussire3,5, Julien
Delacour3,5, Céline Calbrix4, David Sefrioui3,5,6, Pierre-Julien Viailly2, Michael
Bubenheim7, Cristian Moldovan1, Cristina Alexandru1, Isabelle Tennevet1, Olivier
Rigal1, Cécile Guillemet1, Marianne Leheurteur1, Sophie Gouérant1, Camille Petrau1,3,
Jean-Christophe Théry1,5, Jean-Michel Picquenot1,2,4, Corinne Veyret1, Thierry
Frébourg5, Fabrice Jardin2, Nasrin Sarafan-Vasseur3,5,* and Frédéric Di Fiore1,3,5,6,*
1
Department of Medical Oncology, Henri Becquerel Centre, Rouen, France
2
INSERM U918, Henri Becquerel Centre, Rouen, France
3
EquIpe de Recherche en Oncologie, Rouen, France
4
Department of Biopathology, Henri Becquerel Centre, Rouen, France
5
INSERM U1079, Faculty of medecine, Rouen, France
6
Department of Gastroenterology, Rouen University Hospital, Rouen, France
7
Department of Biostatistics, Rouen University Hospital, Rouen, France
*
These authors have contributed equally to the work
Correspondence to: Florian Clatot, email: [email protected]
Keywords: ESR1 mutation, digital PCR, breast cancer, aromatase inhibitor, kinetics
Received: October 12, 2016
ABSTRACT
Accepted: October 24, 2016Published: October 27, 2016
Purpose: To assess the prognostic and predictive value of circulating ESR1
mutation and its kinetics before and after progression on aromatase inhibitor (AI)
treatment.
Patients and methods: ESR1 circulating D538G and Y537S/N/C mutations were
retrospectively analyzed by digital droplet PCR after first-line AI failure in patients
treated consecutively from 2010 to 2012 for hormone receptor-positive metastatic
breast cancer. Progression-free survival (PFS) and overall survival (OS) were
analyzed according to circulating mutational status and subsequent lines of treatment.
The kinetics of ESR1 mutation before (3 and 6 months) and after (3 months) AI
progression were determined in the available archive plasmas.
Results: Circulating ESR1 mutations were found at AI progression in 44/144
patients included (30.6%). Median follow-up from AI initiation was 40 months (range
4-94). The median OS was decreased in patients with circulating ESR1 mutation than
in patients without mutation (15.5 versus 23.8 months, P=0.0006). The median PFS
was also significantly decreased in patients with ESR1 mutation than in patients
without mutation (5.9 vs 7 months, P=0.002). After AI failure, there was no difference
in outcome for patients receiving chemotherapy (n = 58) versus non-AI endocrine
therapy (n=51) in patients with and without ESR1 mutation. ESR1 circulating
mutations were detectable in 75% of all cases before AI progression, whereas the
kinetics 3 months after progression did not correlate with outcome.
Conclusion: ESR1 circulating mutations are independent risk factors for poor
outcome after AI failure, and are frequently detectable before clinical progression.
Interventional studies based on ESR1 circulating status are warranted.
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74448
Oncotarget
INTRODUCTION
circulating ESR1 mutations [9, 15, 16]. Nevertheless,
the predictive value of circulating ESR1 mutation at
progression on AI and its potential use in daily practice
remains unclear.
In light of these results, circulating ESR1 mutation
detection may be a surrogate marker of AI resistance.
In this context, based on archive plasmas we evaluated
the prognostic and predictive values of circulating ESR1
mutation detection in HR+MBC patients and analyzed its
kinetics before and after progression on AI.
Endocrine therapy with either tamoxifen or
aromatase inhibitors (AIs) is a key treatment in postmenopausal hormone receptor positive (HR+) metastatic
breast cancer (MBC) which has a median time before
progression of less than one year [1]. An emerging
activating mutation in the estrogen receptor gene (ESR1),
which leads to a ligand independent receptor activity,
is one of the major molecular events involved in AI
resistance [2, 3]. First reported in 1997 [4], these mutations
have been recently described as (i) an acquired alteration,
with a presence in primary tumour in less than 2% of cases
[5, 6]; (ii) frequent, with a detection rate approximately
20% in metastases of HR+MBC patients progressing after
endocrine therapy [7, 8]; and (iii) recurrent, with 4 hotspot mutations (D538G, Y537S/N/C) contributing to 74%
of all ESR1 acquired mutations [5].
Since 2015, several studies have shown that ESR1
mutation detection in circulating tumour DNA (ctDNA)
was clinically relevant and correlated with mutational
status on metastasis [9-11]. In this context, digital PCR
based-methods [12, 13] appear to be a more simple and
sensitive approach for ESR1 detection in ctDNA than
next-generation sequencing (NGS) techniques [13, 14]. In
large retrospective cohorts, ESR1 mutations were found
specifically in HR+ MBC patients treated by AI and were
highly predictive of a lack of sensitivity to subsequent
AI exposure [9]. Recently, some studies have reported a
worse outcome after progression on AI with detectable
RESULTS
Patients characteristics and follow-up
A total of 156 HR+MBC patients were included
in this study. Due to the small amount of plasma DNA,
the ESR1 mutation status could not be performed for
12 patients. Therefore, the analysis was performed on
144 patients (Figure 1). The main characteristics of the
population are summarized in Table 1.
ESR1 mutational status at AI progression
At the time of AI progression (tp), at least one
circulating ESR1 mutation was detectable in 44 patients
(30.6%). Overall, 63 mutations were found; D538G and
Y537S were the two most frequent (24 and 21 samples,
Figure 1: Diagram of the study
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74449
Oncotarget
Table 1: Baseline characteristics of patients with circulating ESR1 mutation versus patients without mutation
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74450
Oncotarget
respectively), whereas Y537N and Y537C were detected
in 16 and 2 samples, respectively. Among the 44 patients
with mutation, 28 had a single circulating mutation, 13
had a double mutation and three had a triple mutation. The
presence of a circulating ESR1 mutation was not related
to patient characteristics except for the median time of
AI exposure, which was significantly longer in patients
with ESR1 mutations than in patients without mutation
(15 vs 10.5 months, respectively, P = 0.02). The overall
concordance between the 2 independent ddPCR analyses
for each mutation was 98% (564 concordances over 576
analyses performed in duplicate).
Figure 2: Progression-free survival (PFS) and overall survival (OS) after progression on first-line of aromatase
inhibitor according to ESR1 mutation status. A. PFS of patients with or without ESR1 mutation. B. OS of patients with or without
ESR1 mutation
Figure 3: Overall survival (OS) after progression on first-line of aromatase inhibitor according to ESR1 mutation
status and post-progression treatment. WT : wild-type. CT : chemotherapy. Tam: Tamoxifen. Ful : Fulvestrant.
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74451
Oncotarget
ESR1 mutational status at AI progression and
outcome
PFS of 7 months in case of mutation versus 9 months
without mutation (P = 0.009, HR = 1.9 CI [1.01-3.6]).
When considering non-AI endocrine therapy, a trend
over a worse survival in case of mutation was observed
(median OS of 12 months in case of mutation versus 26
months without mutation, P = 0.09 HR = 1.7 CI [0.9-3.3]
and median PFS of 5 months in case of mutation versus
6 months without mutation, P = 0.17, HR = 1.4 CI [0.82.8]) (Figure 3). When combining patients who received
either chemotherapy or non-AI endocrine therapy after
progression under AI, the median OS was significantly
lower in patients with circulating ESR1 mutation (16
months) than in patients without mutation (27 months; P
= 0.002, HR = 1.9 CI [1.1-3.0]), confirming that the worse
impact of circulating ESR1 mutation observed over the
whole population of the study was not related to patients
receiving an AI-based treatment after progression.
Concerning the patients who were still treated by
AI, or by AI plus everolimus, after progression under
first-line of AI, the few number of patients analyzed and
the heterogeneity of treatments received provide hardly
interpretable data. Nevertheless, a trend over a better
survival was observed in case of patients without mutation
(median OS of 42 months without mutation versus 23
months with mutation, P = 0.17 HR = 2.1 CI [0.5-8.4]).
In particular, the 11 non-mutated patients treated by
AI+everolimus had a particularly long median OS of 46
months.
The median time of follow-up from AI initiation
to progression was 40 months (range 4-94). At time of
analysis, 111 patients (77%) died and the 33 remaining
were still under follow-up. Three patients (one mutated
and two non-mutated) died at tp and were excluded for
the survival analysis. Among the 141 patients analyzed,
the median overall survival (OS) was significantly lower
in patients with circulating ESR1 mutation (15.5 months,
range 2-44) than in patients without mutation (23.8
months, range 2-70; P = 0.0006, HR = 1.9 CI [1.2-3.1],
Figure 2B). The prognostic value of circulating ESR1
mutation at AI progression was confirmed in multivariate
analysis (P = 0.002, HR = 1.9 CI [1.3-3]). A WHO
performance status > 1 (P < 0.0001, HR = 3 CI [1.94.7]); and a level of cell-free circulating DNA above the
median value (HR = 1.8, P = 0.006 CI [1.2-2.7]) were
also identified as independent prognostic factors of OS.
A worse progression free survival (PFS) was observed in
patients with ESR1 mutation, with a median of 5.9 months,
compared to 7.0 months for patients without mutation (P =
0.002, HR = 1.7 CI [1.1-2.5]). In the multivariate analysis
of PFS, the presence of circulating ESR1 mutation and a
prior line of chemotherapy before AI introduction were
identified as independent prognostic factors of worse
outcome (P = 0.008, HR = 1.7 CI [1.2-2.5] and P = 0.009,
HR = 2.3 CI [1.2-4.1], respectively) (Figure 2A).
Circulating ESR1 mutation kinetics before
progression
Predictive value for subsequent lines of treatment
based on circulating ESR1 mutations detection at
AI progression
Of the 44 patients presenting a circulating ESR1
mutation at AI progression, plasma samples were
available at 3 months before progression (tp-3) or 6 months
before progression (tp-6) in 43 cases. In case of double or
triple mutations, the predominant one was retained for
subsequent analysis. For the 20 patients with samples at
both tp-3 and at tp-6, 15 (75%) had detectable circulating
ESR1 mutations before AI progression, and in most
of the cases, the amount increased over 3 months (P =
0.02, between tp-6 and tp-3 and P = 0.0087 between tp-3 and
tp) (Figure 4). Of note, 2 patients had a decrease in the
mutation amount between tp-3 and tp. For the 8 patients
analyzed presenting double or triple mutations and with
samples at both tp-3 and at tp-6, 5 (62%) patients had the
predominant mutation detectable before tp whereas nonpredominant mutations were usually non-detectable (7/10
mutations) at both tp-6 and tp-3 or at a lower amount than
the predominant one. For one patient, a Y537S mutation
became predominant at tp while the D538G mutation had
a higher rate at both tp-6 and tp-3. For another patient, a
decrease of a mutation contrasted with the appearance of
another one suggesting a dissociated evolution of 2 subclones.
After progression on AI, 51 patients received a nonAI endocrine therapy (34 tamoxifen and 17 fulvestrant),
and 58 were treated with chemotherapy. The addition
of everolimus or a Her2 inhibitor was used in only 14
and 2 patients, respectively. Finally, 8 patients were
switched from one AI to another, 4 had no modification
of AI treatment despite progression, 3 patients died at
progression as previously mentioned and 4 patients
received other treatments. The ESR1 mutational status
at AI progression did not selectively predict for better or
worse outcome according to whether chemotherapy or
non-AI endocrine therapy was given, since we observed
similar PFS and OS between patients treated with
chemotherapy-based regimens versus non-AI endocrine
therapies in both mutated and non-mutated subgroups.
Overall, patients with ESR1 circulating mutation presented
a worse OS than did patients without mutation regardless
of treatment. Indeed, under chemotherapy, a median OS
of 16 months was observed in case of mutation versus
27 months without mutation (P = 0.014, HR = 2.0 CI
[1.01-4.0]). Similar results were observed in PFS: median
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74452
Oncotarget
Circulating
progression
ESR1
mutation
kinetics
after
tp and tp+3 while the predominant mutation at tp remained
stable as well as the clinical evaluation at tp+3. For the 12
other patients, all the predominant and non-predominant
mutations varied in the same direction between tp and tp+3.
Circulating ESR1 mutation kinetics after AI
progression were analyzed in the 33/44 patients with
mutation (75%) who had samples available at tp+3. Among
them, 16 (48%) had a clinical progression, whereas the
others had disease control or a response to the subsequent
line of treatment. All patients (n = 6, 18%) presenting with
an increase in circulating ESR1 mutation at 3 months had
disease progression. In contrast, among the remaining
27 patients presenting a decrease of circulating ESR1
mutation, 10 (37%) experienced disease progression
(Figure 5). In particular, 3 patients had no detectable
mutation despite a clinical progression. For the 13
patients analyzed presenting double or triple mutation
and with samples available at tp+3, only one patient (8%)
had an increase of non-predominant mutations between
DISCUSSION
Our results show that the detection of circulating
ESR1 mutation is relevant during AI exposure in
HR+MBC patients. The present study, based on 144
patients, demonstrates the feasibility of ESR1 detection in
ctDNA and its clear association with AI resistance and a
poor outcome for both PFS and OS. Furthermore, to our
knowledge, we report for the first time that circulating
ESR1 mutations are detectable before clinical progression
in approximatively 75% of patients. Taken together, our
results highlight that ESR1 mutation monitoring in ctDNA
may help for decision making and early treatment change
in MBC patients.
Figure 4: Pre-clinical detection of circulating ESR1 mutation. This figure represents all the 20 patients for whom we had
available plasmas at progression (tp), 3 months (tp-3) and 6 months(tp-6) before progression. Red color means a clinical progression at the time
of mutational analysis whereas blue color means a stable or responding disease at the time of mutational analysis. To allow comparisons,
the amount of circulating mutation have been normalized to 100 % for the time of progression. Circulating rates 3 (dark blue) or 6 (light
blue) months before clinical progression are given in percentage of the value observed at progression.
Figure 5: ESR1 circulating mutation evolution after progression and treatment change. This figure represents all the 33
patients for whom we had plasma samples available 3 months after progression. The bottom of the figure indicates the post progression
treatment received (AI: aromatase inhibitor, EVE: everolimus). The abscissa line is the normalized circulating ESR1 mutation amount at
time of progression. The bars represent the relative variation of this mutation amount 3 months after progression. The color of the bars is
related to the clinical evolution observed 3 months after progression: blue color means stability or response and red color means a disease
progression.
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74453
Oncotarget
At progression, we observed an ESR1 mutation
frequency of 30.6%, which is consistent with those
previously reported: 37% among 153 cases [11], 28.8%
among 541 cases [16] and 25.3% among 395 patients
[15]. In this study, ESR1 mutations were also frequently
polyclonal as previously reported [9, 10, 12, 14, 15,
17]. To note, the mutation frequency reported may be
influenced by the number of ESR1 mutations analyzed
in each study, which usually vary from 2 [16] to 7 [15].
Therefore, the analysis in our study of 4 mutations may
have underestimated the ESR1 mutation frequency.
Our results showed that circulating ESR1 mutation
is associated with significantly worse outcomes with a
difference of 8.3 months for OS and 1.1 months for PFS
compared to patients without mutation. Similar results
have been recently reported in a sub-group analysis of
the BOLERO 2 trial (n = 541, OS of 32.1 months for
patients without mutation vs 20.7 months for patients with
mutation, P < 0.0001) [16], and in a sub-group analysis
of the PALOMA-3 trial (n = 395, PFS of 9.2 months
for patients without mutation vs 7.3 months in cases of
mutation, P = 0.02) [15]. In contrast, Spoerke et al. did not
find any difference related to ESR1 mutation [11].
Surprisingly, in this study the median time of AI
exposure during the metastatic setting was significantly
longer in patients with ESR1 mutations than in patients
without mutation whereas it has not been reported
previously. If confirmed, this result suggests that
mechanisms for primary resistance to AI (progression in
the first 3 or 6 months of AI exposure) may not be related
to the emergence of an ESR1 mutation. When considering
the OS from the introduction of AI, a significantly worse
outcome in case of circulating ESR1 mutation was still
observed (median OS of 37 months in case of mutation
versus 47 without mutation, P = 0.027 HR 1.5 CI [0.992.4]).
In our study, post-AI progression treatment was
mainly based on tamoxifen, fulvestrant or chemotherapy.
To date, the addition of everolimus to AI [18] and, more
recently, the addition of palbociclib to fulvestrant [19]
has provided additional treatment options. Considering
the sample size of patients analyzed for subsequent line,
in our cohort, no particular treatment (chemotherapy,
tamoxifen or fulvestrant) overcame the worse prognosis
for patients with ESR1 mutation. To note, this study was
not randomized and therefore subject to biases in treatment
allocation and was not powered enough for detecting
a predictive value for each of the post progression
treatment used. Concerning the addition of everolimus,
Chandarlapaty et al. reported no PFS improvement for
patients with the Y537S mutation but with a low number of
cases in each arm; whereas wild-type patients or patients
harbouring the D538G mutation had a better outcome
when they were treated with AI + everolimus than with AI
alone [16]. Concerning the potential use of palbociclib, a
longer PFS for patients treated by fulvestrant + palbociclib
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compared to fulvestrant + placebo, both for ESR1 wildtypes and patients with mutation, has been reported [15].
In our study, no benefit of fulvestrant over tamoxifen
was observed even if such a difference would be hardly
detectable with the small sample sizes analyzed (n = 17
and n = 34, respectively). In contrast, the retrospective
analysis of patients included in the randomized SoFEA
study revealed that among the 63 patients with ESR1
circulating mutation, a significantly better PFS was
observed when a fulvestrant-based treatment was given,
rather than exemestane (9.4 months versus 3.6 months,
respectively, P = 0.002) [15]. Spoerke reported a similar
outcome with the use of fulvestrant for patients with or
without the ESR1 mutation [11]. Moreover it has also been
recently suggested that outcome after progression on AI
treatment may be related to specific ESR1 mutations [15].
Due to the numerous ESR1 mutations, only large studies
will be powered enough to answer this issue, which was
not the case of our study. It is important to note that 26%
of the mutations reported in the Spoerke et al. study were
E380Q, for which the implication in the AI resistance
has not been clearly established [20]. Thus, a dedicated
analysis of mutations related to AI resistance, located on
the codons 537 and 538, may have modified the survival
analysis in this study. Moreover, pre-clinical data have
shown that ESR1 mutated cells show a partial resistance
to fulvestrant in particular at clinical doses [2, 20]. More
potent ESR1 antagonists, such as AZD9496, have recently
been reported to be more effective than fulvestrant
(even used at supra-clinical doses) or tamoxifen in preclinical ESR1 mutant breast tumour models [21]. Finally,
unless not continuing single AI treatment, no definitive
recommendation can be made on post-AI treatment
based on the presence of a ESR1 circulating mutation
after progression on AI. Interestingly, the association of
palbociclib to AI does not seem to prevent emergence of
ESR1 mutations [22].
One of the strengths of our study was the availability
of plasma samples at progression on AI, both before and
after progression. Although we had previously reported the
potential interest of ESR1 mutation monitoring in plasma
[12], the present study is the first, to our knowledge, that
provides kinetics patients with ESR1 mutation at tp-6, tp-3
and tp. Our results indicate that 75% of the mutations are
already detectable when patients have not yet progressed.
Even if this pre-clinical detection rate has to be confirmed
by larger studies, it supports the potential interest of early
treatment change based on the emergence of circulating
mutation of resistance. The circulating mutation detection
before clinical progression has already been reported
after early breast treatment. In this study, 12 out of the 15
patients (80%) who relapsed had a detectable circulating
mutation many months before clinical progression [23].
Nevertheless, this study was not restricted to HR+ tumors
and used a patient-specific digital droplet PCR (ddPCR)
assay designed after a massively parallel sequencing of
74454
Oncotarget
the primary tumor. A restricted analysis of few recurrent
mutations as performed in our study will be easier to
transfer to daily practice. Concerning the increase in
mutation amount observed in our study while patients
are still receiving AI therapy, we can hypothesize that
stopping AI before clinical progression may improve
patient outcomes by interrupting the selection pressure.
Nevertheless, this quantitative result must be interpreted
cautiously because it was based on a retrospective
analysis. We will need to collect prospective data of
circulating mutation emergence, including analysis
during progression and non-progression to determine the
clinical relevance before an interventional study. Such
a prospective study is currently ongoing in our centre
(NCT02473120).
We also analyzed plasma samples at tp+3, while
patients were receiving various treatments. In contrast
to a homogeneous evolution of ESR1 circulating
kinetics before progression, after the end of AI exposure,
we observed that ESR1 mutation variation is more
heterogeneous. Indeed, we found that an increase in the
amount of mutation was related to progression for 100%
of the patients, as also reported by Takeshita et al. (11
progressions in 13 patients) [10]. Due to the low number
of patients analyzed, this value may be overestimated.
In contrast, a decrease in the amount of mutation was
related to various clinical outcomes. Similar results have
recently been reported by Spoerke who suggested that all
metastatic lesions may not harbour ESR1 mutations and
may have different responses to post-AI treatment [11].
Such molecular heterogeneity and the parallel genetic
evolution of separate metastatic sites under treatment
have already been demonstrated under a PIK3 inhibitor
in breast cancer patients [24]. In this context, ctDNA has
been reported as probably more accurate than circulating
tumor cells (CTC) to explore tumor heterogeneity by
blood analysis [25].
One of the key issues in the circulating mutation
analysis is a rigorous definition of a positive threshold;
however, there is no consensus regarding that definition.
Wang et al. called a sample positive if: (a) the allele
frequencies were > 0 after subtraction of background
noise; (b) > 2 mutant droplets were repeatedly detected;
and (c) allele frequency was > noise adjusted LOD for
at least 3 independent assays [17]. For Schiavon et al.,
a mutation was considered positive with at least 2 ESR1
mutant droplets [9]. Finally, Takeshita et al. focused on
an increase in the amount of ESR1 mutation between 2
samples rather than defining a positive threshold based on
only one point [10]. In our opinion, mutation criteria must
be reliable before potential clinical use.
In conclusion, the present study highlights the
potential clinical value of using ddPCR to monitor
circulating ESR1 mutation during AI treatment for
HR+MBC patients. We showed that the presence of
circulating ESR1 mutations is an independent factor for
www.impactjournals.com/oncotarget
poor outcome in AI failure and that these mutations are
also detectable before clinical progression. Although
ddPCR provides quick and robust results, a standardized
and validated definition of a mutated sample needs to be
investigated before its potential use in daily practice. To
improve the outcomes in patients with ESR1 mutation,
dedicated trials are also warranted, to test the potential
benefit of an early treatment change in cases of circulating
mutation emergence, and also to test specific treatments,
such as ESR1 modulators that are more potent than
tamoxifen or fulvestrant, or the addition of palbociclib.
PATIENTS AND METHODS
Patients
All consecutive patients who were treated in our
centre between 2010 and 2012 for HR+ MBC and who
had clinical progression during first-line AI treatment were
retrospectively included. Clinical progression was decided
by our local Breast Tumor Board and based on either
progression by RECIST criteria or symptomatic worsening
despite radiographically stable disease. Previous non-AI
treatment for metastatic disease was allowed. Patients who
had previously been exposed to AI in an adjuvant setting
were eligible if there was at least a two-year delay between
the end of treatment and the diagnosis of metastatic
relapse. Patients’ clinical and histological baseline
characteristics were collected, as were the outcomes of
subsequent lines used after AI progression. In our centre,
routine biological analyses are performed every 3 months
for MBC patients, as well as CT-scan. Remaining plasmas
after biological analyses are stored in our plasma bank.
Therefore plasma samples were collected prospectively
in consecutive HR+MBC patients, but the design of the
study and the analyses were performed retrospectively. All
patients signed a consent form allowing the conservation
and study of their biological samples. The study was
approved by the Institutional Review Board of the Henri
Becquerel Center (registering order 1503B).
Circulating ESR1 status at AI progression and
kinetics
All patients underwent blood sampling at the time
of AI progression (tp) for ESR1 mutation detection. In
cases of detectable circulating ESR1 mutation at tp, the
kinetics of circulating mutations were analyzed in blood
samples that were collected concomitant to the physical
examinations 3 or 6 months before (tp-3; tp-6) and after (tp+3)
AI progression, respectively.
74455
Oncotarget
Plasma DNA extraction
(Supplementary Table 3). All data were analyzed using the
QuantaSoft software (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) and
were manually reviewed to provide precise interpretation
of data points. The variant allele fraction (VAF) was
defined as the proportion of mutant DNA copies relative to
the sum of mutant and wild-type DNA copies obtained by
ddPCR. Samples at tp were considered mutated if at least
two independent ddPCR analyses by two independent
operators found a VAF above the mutation threshold.
ddPCR analyses were all performed blindly from clinical
data. Samples at tp-6, tp-3 and tp+3 were analyzed on one or
two runs according to the available samples.
Blood samples were collected in heparinized tubes
and processed within two hours after collection with one
centrifugation at 2000 g (10 min) at 4°C before storage
at 20°C. DNA was retrospectively extracted from 0.4
to 2 mL of stored heparinized plasma using a QIAamp®
Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Germany).
Double-stranded DNA quantification was performed by
a fluorimetric method using a Quant-iT™ PicoGreen®
dsDNA Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and
a Twinkle LB970 microplate fluorometer (Berthold, Bad
Wildbad, Germany).
Statistical analysis
Droplet digital PCR (ddPCR) analysis
The primary endpoint was to evaluate the overall
survival (OS) according to circulating ESR1 mutation
status at the time of AI progression. OS was calculated
from tp to the date of death from any cause. Blinded to
the project outcome and considering that 30% of patients
would have an ESR1 mutation at progression on AI [27]
and that 70% of the patients at progression on AI would
die during the 3 following years [28], we determined that
at least 121 patient records would have to be retrieved
[29] to detect a hazard ratio of at least 2 between mutated
and non-mutated ESR1 patients with a power of 80%
and an alpha of 5% using the Cox model to test group
homogeneity. For secondary endpoints, we analyzed the
frequency of circulating ESR1 mutation at progression
on AI, PFS and OS from tp and under subsequent lines.
Finally, we described the kinetics of the circulating ESR1
mutation before and after AI progression. The prognostic
factors of PFS and OS were determined in relation to
the following variables: age, time delay from metastatic
evolution to AI progression, WHO performance status at
AI progression, cfDNA amount at progression, circulating
ESR1 mutation at AI progression, prior lines of treatment
before AI introduction, duration of AI exposure, and type
of treatment after AI progression. Comparisons between
groups were made using the chi-squared test or the
Wilcoxon test. Patients who died at tp were excluded from
survival analysis. Univariate analysis and survival curves
were calculated using the Kaplan-Meier method and
compared using the log-rank test. Multivariate analysis
was performed using the Cox model and a backward
method. All statistical analyses were performed using the
R software version 3.0.1.
Droplet-based dPCR (ddPCR ) platform (Qx200
ddPCR System, Bio-rad Laboratories, Hercules, CA,
USA) was used for detection of mutant circulating DNA in
plasma samples. Four ng of circulating-free DNA (cfDNA)
was preamplified as previously described [12]. Custom
Taqman SNP genotyping assay (Life Technologies,
Carlsbad, CA) for the detection of ESR1 mutations
Y537N, Y537S, Y537C and D538G (references and
functional annotations of the ESR1 mutations cited in that
paper are available in the Supplementary Table 1). PCR
cycling conditions and reagent compositions are described
in Supplementary Table 2. Digital PCR conditions were
optimized to identify the optimal annealing/extension
temperature for each mutation, using wild-type DNA
spiked with a mutant synthetic oligonucleotide inserted
into pMT plasmid (Invitrogen, GeneArtTM,Carlsbad, CA,
USA). Both for ddPCR assays optimization and samples
analysis, the total copy number systematically comprised
between 200 and 2000 copies/µL per reaction. In the case
of an initial low copy number, 2 µL of heparinase (New
England iolabs, Ipswich, MA, USA) was added to preamplification to reach the recommended copy number. At
least 3 negative control wells with no DNA were included
in every run. In case of too low amount of copy number
despite use of heparinase, mutation detection could not be
performed and the corresponding patient was excluded.
We serially diluted in triplicate ESR1 mutant
synthetic oligonucleotide into wild-type DNA to determine
the ddPCR limit of detection (LOD), linearity and
reproducibility (Supplementary Figure 1). Background
noise is the minimum concentration of the mutant allele
that can be differentiated from a negative control. To
assess the background noise of our method, the allele
burden was measured in 10 preamplified cfDNA extracted
from healthy control heparinized plasma samples collected
in the same conditions as the patient samples. Using the
method of Hindson et al. [26], we defined the relevant
threshold for each mutation to discriminate positive versus
negative samples according to the reaction conditions
TM
www.impactjournals.com/oncotarget
®
Abbreviations
AI: Aromatase inhibitor
CI: Confidence interval
CTC: Circulating tumor cell
cfDNA: Circulating free DNA
ctDNA: Circulating tumor DNA
74456
Oncotarget
ESR1: Estrogen receptor gene
HR: Hazard Ratio
HR+: Hormone receptor positive
MBC: Metastatic breast cancer
NGS: Next generation sequencing
OS: Overall survival
PFS: Progression free survival
tp: time of AI progression
tp-6: 6 months before time of AI progression
tp-3: 3 months before time of AI progression
tp+3: 3 months after time of AI progression
VAF: Variant allele fraction
WHO: World Health Organization
in Oncotarget.
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10.1038/ng.2822.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank the patients who provided us the
biological samples used in that study. We also thank the
Henri Becquerel Center, the INSERM U 918 and U 1079
units for their financial and technical support. We thank
Novartis for the research grant provided for that study.
3. Robinson DR, Wu Y-M, Vats P, Su F, Lonigro RJ, Cao
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57: 1244-9.
Florian Clatot received a financial support from
Novartis in name of his institution. The authors have no
other conflict to declare with regard to the manuscript
submitted.
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FUNDING
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portraits of human breast tumours. Nature. 2012; 490: 6170. doi: 10.1038/nature11412.
This work was mainly supported by the Henri
Becquerel Centre; and in part by Novartis.
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Conception and design: FC, AP, DS, NSV, FDF
Development of methodology: FC, AP, LB, JD, CC,
PJV, MB, DS, TF, FJ, NSV, FDF
Acquisition of data: FC, LA, LB, JD, CC, CM, CA,
IT, OR, CG, ML, SG, CP, JCT, JMP, CV, NSV, FDF
Analysis and interpretation of data: All the authors
Writing and revision of the manuscript: All the
authors
Administrative, technical or material support: JMP,
CV, TF, FJ, FDF
Study supervision: FC, AP, LA, LB, JD, CC, DS,
NSV, FDF.
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Editorial note
This paper has been accepted based in part on peerreview conducted by another journal and the authors’
response and revisions as well as expedited peer-review
www.impactjournals.com/oncotarget
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Oncotarget
CURRICULUM VITAE
Laetitia Augusto
Née le 09/01/1989
2 rue Fontenelle
76570 Pavilly
[email protected]
0685703210
TITRES ET FONCTIONS HOSPITALIERES
INTERNAT D’ONCOLOGIE MEDICALE :
Mai 2017 - Novembre 2017 : Oncologie médicale, CLCC Henri Becquerel, Rouen
(Chef de service Pr Di Fiore)
Novembre 2016 - Mai 2017 : Hépato-gastro-entérologie, CHU Rouen
(Chef de service Pr Michel)
Mai 2016 - Novembre 2016 : Hépato-gastro-entérologie, CHU Rouen : non validé,
congé maternité (Chef de service Pr Michel)
Novembre 2015 - Mai 2016 : Anatomopathologie, CLCC Henri Becquerel, Rouen
(Chef de service Dr Picquenot)
Mai 2015 - Novembre 2015 : Radiothérapie et physique médicale, CLCC Henri
Becquerel, Rouen (Chef de service Pr Dubray)
Novembre 2014 - Mai 2015 : Oncologie médicale, CLCC Henri Becquerel, Rouen
(Chef de service Dr Veyret)
Mai 2014 - Novembre 2014 : Hématologie clinique, CLCC Henri Becquerel, Rouen
(Chef de service Pr Tilly)
Novembre 2013 - Mai 2014 : Oncologie médicale, CHI Eure-Seine, Evreux
(Chef de service Dr Hili)
Juillet 2013 - Novembre 2013 : Faisant fonction d’interne, service de Psychiatrie,
CHU d’Amiens (Chef de service Pr Loas)
EXTERNAT DE MEDECINE :
2010-2013 : Externat, stages hospitaliers au CHU d’ Amiens
TITRES UNIVERSITAIRES ET FORMATIONS
DIPLOMES UNIVERSITAIRES
2016-2017 :
- DU de Carcinologie Clinique, Institut Gustave Roussy, en cours de validation
2015-2016 :
- Master 1 Sciences Médicales et Pharmaceutiques : UE Stage et mémoire,
laboratoire Pr Jardin, Unité Inserm U918
2013-2014 :
- Master 1 Sciences Médicales et Pharmaceutiques : UE Méthodes moléculaires en
génétique médicale: application au cancer
COURS DE DES
2016-2017 :
- Cours DES
- Cours DES
- Cours DES
- Cours DES
« Oncogériatrie »
« Oncologie thoracique » validé par cours DUCC
« Gynécologie » validé par cours DUCC
« VADS » validé par cours DUCC
2015-2016 :
- Cours DES « Sarcomes et tumeurs conjonctives »
- Cours DES « Neuro-oncologie »
- Cours DES « Sénologie »
2014-2015 :
- Cours DES « Peau, ACUP, tumeurs endocrines »
- Cours DES « Cancer colo-rectal »
- Cours DES « Prostate »
2013-2014 :
- Cours DES « Oncologie urologique »
- Cours DES « Oncologie digestive »
2012-2013 :
- Cours DES « Cancer du col et corps utérin »
- Cours DES « Oncogériatrie »
CONGRES ET FORMATIONS
2015-2016 :
- Formation EFEC : Prise en charge des cancers de l’ovaire
- Formation EFEC : Prise en charge des cancers de prostate
- Francophones d’Oncologie Médicale, Lille
CURSUS, FORMATION PROFESSIONNELLE
Juin 2013 :
- Examen National Classant
2010-2013:
- Externat à la faculté de médecine d’Amiens
2009-2010 :
- DCEM1 à faculté de médecine d’Amiens
2008-2009 :
- PCEM2 à faculté de médecine d’Amiens
2007-2008 :
- PCEM1 à faculté de médecine d’Amiens
2007 :
- Baccalauréat S option SVT mention Très Bien (Lycée F. Truffaut, Oise)
TITRES ET TRAVAUX SCIENTIFIQUES
PUBLICATIONS :
- Kinetics, prognostic and predictive values of ESR1 circulating mutations in
metastatic breast cancer patients progressing on aromatase inhibitor
Florian Clatot1,2,3, Anne Perdrix3,4, Laetitia Augusto1, and Frédéric Di Fiore1,3,5,6,*
OncoTarget, Octobre 2016
- ESR1 mutations in breast cancer
Florian Clatot, Laetitia Augusto, Frédéric Di Fiore
Aging, Editorail, Janvier 2017
COMMUNICATIONS
- Poster présenté au Cancéropôle Nord-Ouest à Deauville en juin 2016: Valeur
prédictive et pronostique de la détection d’une mutation circulante ESR1 chez des
patientes traitées pour un cancer du sein métastatique en progression sous anti
aromatase (AA)
L Augusto1, N Sarafan-Vasseur2,3, A Perdrix2,4, L Beaussire2,3, J Delacour2,3, D Sefrioui2,3,5, C Calbrix4, JM Picquenot4,6,T
Frebourg3, F Jardin6, F Di Fiore1,2,3,5 , F Clatot1,2,6
- Communication orale à l’ASCO 2016 (Dr Clatot) : Prognostic and Predictive Value
of Circulating ESR1 Mutations in Metastatic Breast Cancer Patients (mBC)
Progressing Under Aromatase Inhibitor (AI) Treatment
L. Augusto, N. Sarafan-Vasseur, A. Perdrix, L. Beaussire, J. Delacour, D. Sefrioui, C. Calbrix, JM Picquenot, T. Frébourg, F.
Jardin, F. Di Fiore, F. Clatot
DIVERS
- Secrétaire de l’Association des Jeunes Oncologues Rouennais (AJOR), 2014-2016
- Organisation de soirées d’enseignements en oncologie pour les internes
- Cours aux élèves infirmières de l’IFSI du Rouvray : Cancérogénèse, 2014