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Evaluation d’une technique de puce à ADN permettant la détection rapide et la caractérisation moléculaire des gènes de résistances des entérobactéries Luce Bertaiola, Marie-Lise Tritten, Hans H. Siegrist et Reto Lienhard ADMED Microbiologie, La Chaux-de-Fonds, Suisse Objectif 2 Evaluer l’utilité de la technique d’amplification et d’hybridation sur puce à ADN « Check-MDR CT103 » (CT103) (Check-Points, Wageningen, Pays-Bas) dans un laboratoire régional non universitaire. 1 1 26 E. coli 42 Klebsiella sp. P. mirabilis Méthode Nous avons analysés 72 souches d'entérobactéries isolées dans notre laboratoire entre 2010 et 2012. Les phénotypes de résistance BLSE sont caractérisés par la synergie entre les disques AMC et ATM, FEP, CAZ ou CXM et le test des doubles disques avec acide clavulanique (a.clav). Une CMI à l’ERT >1mg/l ou le test de Hodge modifié positif identifient un phénotype carbapénèmase (carbase) possible. Parmi nos 5 carbases, deux sont des souches de référence (CQE). La synergie (>4mm) entre les disques de FOX avec et sans oxacilline (FOC) ou un MASTDISCS ID (MAST Diagnostic, France) positif identifie les souches AmpC. Les bactéries présentant des résistances inexpliquées ou de phénotype hyperOXY sont classées dans le groupe «négatif». L’ADN est extrait sur NucliSENS EasyMag (Biomérieux, Suisse). La mise en évidence des gènes de BLSE (CTX-M, TEM, SHV), AmpC plasmidiques (CMY-1/MOX, CMY2/FOX, DHA, ACC, ACT/MIR) et carbapénèmases (KPC, NDM, OXA-48, VIM, IMP) est réalisée avec le test CT103. H. alvei C. freundii Fig.1: Nombre d’espèces incluses dans l’étude 4% 21% 3% 1% 39% CTX M15-like CTX M9 Résultats Le CT103 a caractérisé génétiquement 91% des souches de manière concordante avec nos observations phénotypiques. Parmi les 72 souches, 4 présentent 2 types de résistance différents qui ont été correctement identifiés par le test. Sur 50 phénotypes BLSE, tous sont génétiquement identifiés. Les gènes prédominant sont CTX-M1 (39%), CTX-M15-like (33%) et CTX-M9 (21%). CT103 confirme 5 souches AmpC parmi les 11 suspectés et 4 entérobactéries du groupe carbapénémase parmi les 5 profils suspectés. Toutes les souches hyperOXY sont génétiquement caractérisées négatives par le test. ESBL CT 103 CTX M1 0 5 0 TEM104K 33% TEM 238S Fig.2: Pourcentage des gènes BLSE caractérisés génétiquement par le test CT103 20 Phénotype identifié ESBL AmpC Carbase Négatif 50 0 0 0 AmpC CTX M1-like 18 16 E. coli 14 K. peumoniae 12 10 8 0 6 4 Carbase 0 0 4 0 2 0 Négatif 0 6 1 10 CTX M1 CTX M15- CTX M9 like Tableau 1: Tableau comparatif montrant les résultats obtenus par caractérisation phénotypique et par caractérisation génotypique (CT103) CTX M1- TEM104K like TEM 238S SHV Fig.3: Répartition des gènes BLSE caractérisés par le test CT103 chez E. coli et K. pneumoniae Discussion La plupart des entérobactéries isolées présentant un profil de résistance inclus dans le kit ont pu être confirmées. La présence de souches ERT non sensibles (Enterobacter spp et Hafnia spp) peuvent présenter un test de Hodge modifié positif et nécessite un test de confirmation décisif. Six souches suspectées AmpC et une carbapénémase sont rendues négatives par le CT103 (Table 2). Il pourrait s’agir d’AmpC chromosomiques ou AmpC plasmidiques non inclus dans le panel du CT103. Le CT103 n’a détecté aucun génotype de résistance non suspecté ou non identifié avec les critères phénotypiques. Ce test nous a permis de détecter la première souche OXA-48 (K. pneumoniae) au sein du laboratoire. Mast différence FOX-FOC E.aerogenes AmpC ≤4mm nég nég 0.19 i AmpC nég AmpC réellement ? E. coli AmpC ≤4mm nég nég / S 0 nég AmpC réellement ? E. coli AmpC >4mm nég nég / S AmpC nég AmpC plasmidique non inclus dans CT103? E. cloacae AmpC >4mm nég nég / I Case Hyp. nég AmpC chromosomique, Case Hyp. E. coli AmpC >4mm nég nég / S Case Hyp. nég AmpC chromosomique, Case Hyp. K. pneumoniae négatif >4mm pos nég / S 0 nég AmpC chromosomique ? H. alvei AmpC ≤4mm pos nég 6 R Case Hyp. nég AmpC chrom., Case Hyp.+ carbase chromosomique ? Souche Antagonisme Synergie Disque CMI ERT Expert SIR CT103 IMP-CRO a.clav. ERT Commentaires Tableau 2: Tableau comparatif montrant les caractéristiques phénotypiques des 7 souches rendues négatives par le CT103 Abréviations: Case Hyp.: Céphalosporinase hyperproduite, FOX=cefoxitine, FOC= FOX+oxacilline, IPM= imipénème, CRO= ceftriaxone, ERT= ertapénème, Expert SIR= système expert du SIRSCAN (i2a, France) Conclusion 1) Nous observons une très bonne concordance entre les profils phénotypiques établis et les génotypes révélés par le CT103. Ce test représente une méthode précise, utile et efficace pour le suivi épidémiologique des souches. 2) Au sein de notre laboratoire, cette méthode permet l’identification et la confirmation rapide (dans les 2-3 jours) des carbapénémases plasmidiques. 3) L’EUCAST 2012 ne recommandant pas l’identification des AmpC ou BLSE, un test incluant les gènes de carbapénèmases seulement suffirait au besoin du laboratoire .
