Engrailed - Laboratoire Matière et Systèmes Complexes

MSC MATIÈRE ET SYSTÈMES COMPLEXES UMR 7057 associée au CNRS et à l'Université
Paris 7
Par2e I (Jean-­‐Pierre Henry) Jeudi 10 février : Cours I.1 Introduc2on des différents modèles animaux Jeudi 3 mars : Cours I.2 Les cellules souches Jeudi 17 mars : Cours I.3 Le modèle de la drosophile Jeudi 31 mars et 28 avril : Cours I.4 et I.5 Quelques mécanismes généraux Par2e II (Vincent Fleury) Jeudi 5 mai : Cours II.1 Mouvements morphogéné2ques lors des premières étapes de la forma2on des vertébrés Jeudi 19 mai : Cours II.2 Rec2fica2on des induc2ons de différen2a2on parles contraintes, ou comment les champs de contraintes forcent les types cellulaires à bien habiller l'embryon. INTRODUCTION À LA BIOLOGIE DU DÉVELOPPEMENT -­‐3-­‐ Le modèle Drosophile: Comment sont exprimés et synchronisés les gènes, « Une musique de JS Bach » Jean-­‐Pierre HENRY 17 Mars 2011 Résumé du cours précédent •  L’idenXté d’un type cellulaire est donné par les gènes exprimés (transcrits) et les protéines traduites •  La sélecXon des gènes à transcrire se fait par l’intermédiaire des facteurs de transcrip2on qui reconnaissent des séquences régulatrices sur l’ADN en amont du gène •  La « signalisaXon » met en foncXonnement (posiXf ou négaXf) les facteurs de transcripXon •  Les facteurs épigénéXques stabilisent les choix de gènes •  Un type cellulaire correspond au choix d’un programme dans le patrimoine généXque •  Le développement peut être vu comme un enchainement de programmes allant vers un but bien défini La drosophile L’animal préféré des biologistes du développement Les avantages de la drosophile •  Génome connu contenant 13 600 gènes (homme: 25 000) •  4 chromosomes: c’est sur la drosophile que TH Morgan (Prix Nobel 1933) établit les bases de la généXque et les premières cartes •  Il existe de très nombreux mutants: actuellement, mutagénèse chimique avec l’EMS (méthylaXon de l’ADN) •  On peut faire de la transgénèse: introduire un gène dans un animal •  On sait sélecXonner des gènes affectant le développement Le cycle de vie de la drosophile •  C ’est un peXt (1-­‐2 mm) insecte diptère, trouvé sur les fruits; autre nom: mouche du vinaigre •  Elle s’élève facilement sur milieu nutriXf; reproducXon rapide: une semaine •  L’œuf (en haut, 0,5 mm) donne une larve (24 h), puis deux autres larves (milieu) et la pupe (en bas) Echelle: 0,1 mm Le développement de l’embryon (1) •  l’œuf est asymétrique: le micropyle est l’entrée du spermatozoïde, c’est le pôle antérieur; la concavité et les filaments indiquent la face dorsale •  l’œuf est entouré de deux membranes; la plus externe est rigide; elle peut être reXrée pour suivre le développement Le développement de l’embryon (2) Les premières divisions: la blastula •  Après la première division, il n’y a pas de membrane séparant les noyaux •  Les divisions conXnuent sans individualisaXon des cellules: on a un synci2um •  Après la neuvième division, les noyaux migrent en périphérie •  Après 3 heures, les membranes apparaissent •  Ce comportement est spécifique de la drosophile: il est intéressant car il permet des échanges faciles de signaux entre les noyaux, par diffusion •  Les noyaux étant périphériques pour la plupart, le développement peut être approximé en 2 dimensions La « cellularisaXon » •  Au stade synciXal, la plupart des noyaux sont périphériques, avec au centre le vitellus; on est à la division 14 (environ 15 000 noyaux) •  Les membranes apparaissent à parXr de la membrane du synciXum La gastrulaXon (1) •  Ceke étape suit la blastulaXon: les cellules des 3 Xssus primordiaux ont été spécifiées et elle forment des régions 2D; la gastrulaXon les met en place •  Chez la drosophile, le mésoderme forme une bande étroite sur l’axe antéropostérieur de la face ventrale •  Il va former un tube à parXr duquel les cellules vont essaimer pour former les « Xssus mou » •  Le tube digesXf se forme à parXr de 2 invaginaXons ectodermiques; le tube moyen sera endodermique GastrulaXon (2) •  Chez la drosophile, on observe des mouvements importants de l’ectoderme (bandeleke germinaXve) qui passe de la face ventrale à la face dorsale, avant de se rétracter •  Une autre caractérisXque est la segmentaXon, qui fait apparaître clairement la structure finale de l’adulte GastrulaXon Face ventrale Face latérale Un prix Nobel bien mérité •  Le prix Nobel de Physiologie et Médecine a été akribué en 1995 à l’Allemande ChrisXane Nüsslein-­‐Volhard et à l’Américain Eric Wieschaus, d’une part et à l’Américain Edward B Lewis, d’autre part •  Les premiers ont, jeunes chercheurs, travaillé ensemble pour découvrir les gènes du développement chez la drosophile. Leurs travaux, faits à l’EMBL (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg) sont la base d’une grande parXe de cet exposé •  Le second a découvert les gènes homéoXques qui donnent leur individualité aux segments de la drosophile; nous verrons ce travail en fin d’exposé La déterminaXon des axes du corps Le GPS du développement Des gènes maternels contrôlent le développement •  L’œuf est asymétrique •  On a indiqué sur l’œuf les territoires correspondant à la larve •  3 mutaXons maternelles sont indiquées qui produisent des anomalies/déléXons le long de l’axe antéro-­‐
postérieur •  Dans l’œuf, les régions affectées sont en rouge •  Comment agissent ces mutaXons qui n’affectent que le développement? L’axe antéro-­‐postérieur: le gène bicoid (1) •  Quand ce gène est muté, la mère est normale, mais l’embryon perd son extrémité antérieure •  Si on pique l’avant (perte de cytoplasme), on a un phénotype (aspect) type bicoid (muté) •  Si du cytoplasme de la parXe antérieure est injecté à l’avant d’un mutant bicoide, le phénotype est corrigé •  Si l’injecXon est faite au centre, 2 parXes symétriques Un produit du gène bicoid doit être présent dans la par2e antérieure L’axe antéro-­‐postérieur: le gène Bicoid (2) •  L’ARN produit du gène maternel bicoid est lié à la parXe antérieure de l’embryon •  Il est traduit en une protéine localement •  Ceke protéine diffuse longitudinalement; elle est dégradée de manière uniforme •  Il y a un gradient stable de ceke protéine Bicoide •  Le gradient établit une « polarité » qui permet aux noyaux du synciXum de disXnguer avant et arrière •  La protéine Bicoide porte une informaXon d’organisaXon, c’est un « morphogène » Le modèle du drapeau français (L Wolpert) •  Les différences de concentraXon du morphogène dues à la diffusion permekent à des cellules iniXalement idenXques d’avoir des desXns différents •  L’existence de seuils de lecture met en route des programmes généXques différents •  La protéine Bicoide est un facteur de transcrip2on •  Ce facteur va permekre l’acXvaXon de gènes de l’embryon Rappel de généXque moléculaire •  Un gène acXf est un gène qui est transcrit en un ARN messager •  Cet ARN messager est traduit dans le cytoplasme en une protéine •  Les facteurs de transcripXon régulent posiXvement/négaXvement la transcripXon •  Ils se combinent à des séquences régulatrices de l’ADN Robustesse du concept •  Si des cellules prennent des décisions sur la base de la concentraXon de Bicoid, avec quelle précision mesurent elles ceke concentraXon pour être sures que les voisines prennent la bonne décision? Forme du gradient •  Quelle est la plus peXte différence de concentraXon détectable, tenant du bruit dû à l’arrivée au hasard des molécules isolées? Mesure de Bicoid dans le noyau •  Quel niveau de précision est requis pour que le système est des réponses différenXelles? Différence d’output pour différents noyaux du même embryon •  Quelle est la reproducXbilité des concentraXons absolues de Bicoid d’un embryon à l’autre? •  Pour Thomas Gregor: Probing the limits to posiXonal informaXon, la réponse est: système robuste (Gregor et al (2007) Cell,130, 153) Axe antéro-­‐postérieur •  D’autres gènes maternels interviennent dans la déterminaXon de l’axe antéro-­‐postérieur: nano, torso, caudal •  Ils sont responsables des phénotypes vus précédemment; par exemple: torso est exprimé aux extrémités ; en son absence, les deux spécialisaXons aux extrémités (acron, telson) disparaissent •  Les mécanismes de ces gènes sont différents de celui de bicoid •  À la fin de ce stade, on a deux gradients de protéines: –  Le gradient de Bicoid, de l’avant vers l’arrière –  Le gradient de Caudal, de l’arrière vers l’avant •  La protéine Caudal est aussi un facteur de transcripXon DéterminaXon maternelle de l’axe dorso-­‐ventral Dorsal est un facteur de transcrip2on avec un gradient d’ac2vité V -­‐> D •  Le produit du gène dorsal, la protéine Dorsal, est présente dans le cytoplasme de toutes les cellules du synciXum, sous une forme complexée •  Un récepteur de la membrane, Toll, peut libérer la protéine Dorsal de son complexe, quand il est acXvé (lié à son ligand) •  Le ligand de Toll est une protéine peu abondante, localisée à la face ventrale •  L’acXvaXon de Toll, libère Dorsal, qui rentre dans le noyau •  Dorsal est un facteur de transcripXon La mise en route des gènes de l’embryon L’axe dorso-­‐ventral La protéine Dorsal: un morphogène (1) •  Les Xssus primordiaux (ecto, méso et endoderme) vont se mekre en place à la gastrulaXon •  Ils sont spécifiés au stade blastula •  La différenciaXon commence dans le synciXum, sous l’influence de la protéine Dorsal •  La plus forte concentraXon induit les gènes embryonnaires twist et snail, spécifiques du mésoderme •  De plus faibles concentraXons induisent rhomboid et le neuroectoderme (système nerveux) •  La proteine Snail inhibe l’expression ventrale de rhomboid La protéine Dorsal: un morphogène (2) •  Plus dorsalement, on trouve exprimés les gènes decapentaplegic et tolloid, spécifiques de l’ectoderme dorsal, et zerknülit, spécifique de l’amnioséreuse (membrane extra-­‐
embryonnaire) •  L’expression de ces gènes est inhibée par la protéine Dorsal •  C ’est la concentraXon de Dorsal qui détermine le desXn des cellules: c’est un morphogène d’origine maternelle réglant l’expression des gènes embryonnaires •  Une différence d’un facteur 2 oriente un choix mésoderme/
neuroectoderme Mécanisme d’acXon différenXelle de Dorsal •  En amont de twist, l’ADN a Dorsal est un facteur de transcripXon: les gènes twist et decapentaplegic possèdent en amont des séquences d’ADN régulateur avec une affinité pour ces protéines un site de basse affinité pour Dorsal •  La fixaXon sur ce site acXve la transcripXon •  En amont de decapentaplegic, il y a un site de haute affinité pour le même facteur •  La fixaXon sur ce site inhibe l’expression •  Si le gradient de Dorsal est modifié (à droite), decapentaplegic n’est pas exprimé et le mutant n’a ses éléments dorsaux Autres mécanismes •  Il existe d’autres mécanismes complétant Dorsal •  Par exemple, des interacXons protéine-­‐protéine concourent à établir un gradient assez pentu pour l’expression de la protéine Décapentaplégic •  À la date de l’expression de ceke protéine, la blastula est cellularisée: les noyaux sont isolés les uns des autres •  Décapentaplégic n’est pas un facteur de transcripXon, mais une protéine sécrétée agissant sur des récepteurs membranaires (signalisaXon) •  Décapentaplégic va déterminer le desXn des cellules de l’amnioséreuse et de l’ectoderme dorsal: c’est un morphogène La mise place de l’axe dorso-­‐vental permet la gastrulaXon •  Ceke étape a permis la spécificaXon des Xssus primordiaux: la gastrulaXon va les mekre en place •  La gastrulaXon est le passage du 2D à la 3D La mise en route des gènes de l’embryon L’axe antéro-­‐postérieur: Depuis bicoid jusqu’à l’individualisaXon des segments La route vers la segmentaXon •  Depuis le gradient de protéine Bicoid (codée par la mère), on va avoir 4 séries de gènes embryonnaires qui vont intervenir séquenXellement •  La première série est celle des gènes « gap » qui vont définir des régions larges le long de l’axe AP Les gènes gap •  Ces gènes vont s’exprimer en bandes le long de l’axe AP (le cas de hunchback est parXculier) •  Ils sont appelés gap, car en leur absence, on observe des défauts en bande •  Ils codent tous des facteurs de transcripXon, qui sont des protéines instables, diffusant peu (expression en cloche) •  Ceke phase se fait avant la cellularisaXon: les facteurs vont être vus par les noyaux périphériques L’expression de hunchback est contrôlée par Bicoid •  On peut « imager » l’acXvaXon de hunchback (bossu) •  Ceke acXvaXon dépend de l’ADN régulateur en amont du gène (en haut) •  Elle dépend aussi du gradient de Bicoid (en bas) •  Une variaXon d’un facteur x2 fait passer le gène de Off à On L’expression de krüppel est contrôlée par Hunchback •  Hunchback est un facteur de transcripXon exprimé selon un gradient de concentraXon •  L’ADN régulateur de krüppel possède 2 sites de fixaXon de Hunchback avec des affinités différentes, acXvateur et répresseur •  La transcripXon de krüppel se fait dans une fenêtre de concentraXon •  Dans un mutant de bicoid, il n’y a pas de synthèse de Hunchback embryonnaire, mais seulement de la protéine maternelle: on n’a pas de bande de krüppel •  Pour la définiXon des bandes, il faut ajouter des effets de type répression des gènes les uns sur les autres L’étape suivante: les gènes « pair-­‐rule » •  On est toujours sur la blastula non cellularisée •  C ’est le premier stade d’appariXon de structures périodiques les parasegments Les g
ènes «
p
air-­‐rule »
Marquage de protéines Echelle: 0,1 mm •  À ce stade, 14 parasegments sont visibles •  Les gène pair-­‐rule sont exprimés dans un parasegment sur deux (7 fois) •  Des exemples sont: even-­‐skipped (bleu) et fushi tarazu (brun); ils codent des facteurs de transcripXon FormaXon du patron : la deuxième bande even-­‐skipped (1) •  L’expression du gène est contrôlée par les concentraXons des facteurs de transcripXon codés par les gènes Gap •  Bicoid et Unchback acXvent dans une bande large •  Giant et Krüppel définissent les bordures antérieure et postérieure La défini2on des parasegments ne fait pas appel à un phénomène périodique FormaXon du patron : la deuxième bande even-­‐skipped (1) •  Dans la région de l’ADN régulateur (environ 500 paires de bases), en amont du gène (à 1 000 paires de bases), il y a de nombreux sites de liaison de protéines codées par les gènes Gap •  Certaines liaisons sont acXvatrices d’autres inhibitrices: l’acXvité du gène résulte de ceke combinatoire •  Elle est traduite spaXalement; l’expression de ces gènes est transitoire Ensuite: les gènes de segmentaXon •  À ce stade, la blastula est cellularisée •  Les gènes de segmentaXon vont « fixer » les parasegments et abouXr à une segmentaXon Le gène engrailed •  Ce gène est contrôlé par les gènes pair-­‐rule •  Il s’exprime à l’avant de chaque parasegment, marqué par un sillon transitoire •  Contrairement aux gènes précédents, son expression est stable •  IniXalement, il s’exprime dans une bande large d’une cellule •  On observe que les fronXères se redressent •  engrailed marque des fronXères que les cellules ne franchissent jamais La comparXmentaXon •  La fronXère « infranchissable » formée par les cellules exprimant engrailed indique que les cellules du parasegment sont sous un même contrôle généXque qui les empêche de se mélanger avec leurs voisines et qui contrôle leur descendance •  Ceke ensemble de cellules est défini pour toute la vie de l’insecte: larve, pupe, adulte •  Expériences de lignage cellulaire: la descendance d’une cellule d’un comparXment reste dans le comparXment •  Engrailed doit rester exprimé pendant toute la vie pour que la restricXon de lignage s’observe: c’est un gène sélecteur, sa présence est suffisante pour que des cellules acquièrent un phénotype spécifique Parasegments et segments •  engrailed définit un comparXment par son homogénéité généXque •  Les premiers observateurs ont défini la segmentaXon morphologiquement, par les denXcules apparaissant chez la larve plus âgée •  Pour eux, l’avant du segment correspond aux denXcules •  En fait, les denXcules sont produites par les cellules placées juste derrière les cellules engrailed •  Seuls les parasegments ont un sens biologique Les cellules engrailed sont à l’avant des parasegments et à l’arrière des segments Les gènes de segmentaXon (1) •  Outre engrailed, la segmentaXon est assurée par wingless et hedgehog •  Elle arrive après la cellularisaXon •  engrailed est un facteur de transcripXon, agissant sur les gènes de la cellule qui le synthéXse •  Les deux autres vont synthéXser des protéines qui vont acXver des voies de signalisaXon dans des cellules voisines •  Il y a une rétroacXon posiXve qui stabilise la fronXère Le facteur Engrailed ac2ve la transcrip2on de Hh; la protéine Hh ac2ve la transcrip2on de Wg dans la cellule voisine; la protéine Wg ac2ve la transcrip2on de engrailed Les gènes de segmentaXon (2) •  La pousse des denXcules est réprimée par Wg : cuXcule lisse •  Elle suit le gradient de Wg et s’exprime en amont et loin de la bordure •  Dans un mutant Wg, Hh et engrailed ne s’expriment plus (à droite) •  On a des denXcules partout: Hedgehog = Hérisson •  Les denXcules sont dans tous les sens alors que dans le sauvage, elles étaient orientées vers l’arrière (polarité cellulaire planaire) La signalisaXon par les voies hedgehog et wingless •  Ces deux voies interviennent à de nombreux niveaux, non seulement chez la drosophile mais aussi chez les vertébrés •  Les protéines Hh ou Wnt se lient à des récepteurs sur la membrane des cellules •  Ceke liaison « acXve » le récepteur qui va émekre des signaux intracellulaires •  Ces signaux vont rentrer dans le noyau et en se combinant avec des facteurs de transcripXon, ils vont « acXver » la lecture de gènes Enfin, acquisiXon de l’idenXté de chaque parasegment: les gènes sélecteurs à homéodomaine •  Nous avons vu comment se met en place la segmentaXon •  Mais, les gènes impliqués sont les mêmes pour tous les segments •  Comment apparaît l’idenXté d’un segment? •  Il y a 14 segments:   3 céphaliques   3 thoraciques   8 abdominaux Les mutaXons homéoXques (E B Lewis) •  Ce sont des mutaXons dans lesquelles un segment change d’idenXté •  À gauche, mutaXon bithorax (au milieu): le comparXment antérieur de l’haltère est transformé en aile; bithorax + posbithorax (bas), les deux comparXments sont transformés •  En haut, antennapedia, une paire de pakes remplace les antennes Les complexes de gènes homéoXques •  Les gènes responsables de ces transformaXons bizarres ont été idenXfiés •  Ils forment des clusters le long de l’ADN, affectant l’ensemble des parasegments •  De manière surprenante, l’ordre des gènes sur le chromosome suit les mutaXons sur l’axe AP Comment en arrive-­‐t-­‐on là? •  Chez l’embryon avancé, on disXngue des peXts amas de cellules épithéliales, les disques imaginaux •  Ceux-­‐ci vont donner les principaux organes chez l’adulte •  Chaque disque imaginal porte l’idenXté de son parasegment •  Affecter celle-­‐ci affecte le devenir du disque Comment ça marche? le complexe bithorax (1) •  Les 3 composants du système bithorax sont exprimés dans plusieurs parasegments: o  ultrabithorax dans 5 à 12 o  abdominal A dans 7 à 13 o  abdominal B dans 10 à 14 •  Ceke distribuXon est iniXée par les gènes gap et pair-­‐rule •  Dans un mutant n’exprimant aucun des 3 gènes, tous les parasegments après le 4 ont le même phénotype, celui du segment 4 •  Ce segment apparaît comme déterminé par défaut Comment ça marche? (2) •  Si au triple mutant, on rajoute ultrabithorax seul, on a maintenant les segments 4, 5 et 6; tous les autres sont des 6 •  Si maintenant on a ultrabithorax et abdominal A, le phenotype est normal jusqu’à 9 •  Si seul a ultrabithorax manque, les segments 5 et 6 manquent •  La conclusion est que l’idenXté des segments est fixée par une combinaison des gènes homéoXques •  La même conclusion est vraie pour antennapedia Généralité des gènes homéoXques •  Ce sont des gènes sélecteurs: par leur effet, ils orientent le desXn d’ensembles cellulaires •  Ils interviennent dans le développement de nombreux organismes, homme inclus •  Ce sont des facteurs de transcripXon; on ne sait pas combien de gènes ils contrôlent •  Sur le plan moléculaire, ils sont caractérisés par leur domaine d’interacXon avec l’ADN qui a une structure conservée (environ 60 acides aminés), l’homéoboite Qu’avons nous appris? •  Le développement correspond à la mise en place, les uns après les autres, de différents programmes généXques: les facteurs de transcripXon et l’ADN régulateur, la signalisaXon sont les principaux acteurs •  Facteurs temporels: certaines étapes correspondent à des expressions transitoires permekant la venue de l’étape suivante, d’autres sont définiXves (gènes sélecteurs: gènes homéoXques,…) •  La « spaXalisaXon » fait appel à des gradients de substances morphogènes (ex.: Bicoid); la lecture de ces gradients s’explique bien par le modèle du drapeau français •  Les deux prochains cours porteront sur la lecture par les cellules de ces programmes Source principale de ce cours: Principles of development, Wolpert (2006)