GINETTE LAMONTAGNE ÉTUDES QUANTITATIVES ET FONCTIONNELLES SUR L'INCORPORATION DE DIVERS ALLÈLES DE LA MOLÉCULE HIADR DE L'HÔTE DANS L'ENVELOPPE DU VIH-1 Memoire présenté à la Faculté des études supérieures de l'université Laval pour l'obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.) Département de microbiologie Faculté de médecine Université Laval Août 1997 O Ginette Lamontagne, 1997 1*1 ofCanada National Library Bibliothèque nationale du Canada Acquisitions and Bibliographic Services Acquisitions et services bibliographiques 395 Welrington Street Ottawa ON K IA ON4 395. me Wellington Ottawa ON K1A O N 4 Canada Canada The author has granted a nonexclusive licence allowing the National Library of Canada to reproduce, loaq distribute or seIl copies of this thesis in microfom, paper or electronic formats. L'auteur a accordé une licence non exclusive permettant à la Bibliothèque nationale du Canada de reproduire, prêter, distribuer ou vendre des copies de cette thèse sous la forme de microfiche/nlm, de reproduction sur papier ou sur format électronique. The author retains ownership of the copyright in this thesis. Neither the thesis nor substantial extracts fiom it may be printed or otherwise reproduced without the author's permission. L'auteur conserve la propriété du droit d'auteur qui protège cette thèse. Ni la thèse ni des extraits substantiels de celle-ci ne doivent être imprim6s ou autrement reproduits sans son autorisation. Résumé Nous avons évalué l'incorporation de la pro tCine H U - D R (CMH-II) polymorphique cellulaire dans I'enveloppe du VIH-1. À cette fin, nous avons mis au point un système de production de stocks viraux ayant incorporé dans leurs enveloppes une des trois mol~cules à rester, HIA-DR 1, HU-DR4 et HLA-DRw53. Ces stocks diffèrent uniquement par la présence de l'une ou l'autre des molécules mentionnées ci-haut. Premièrement, nous avons mesuré I'eficacitt de l'incorporation des molécules HLA-DR1, HLA.DR4 et HLA-DRw53 dans ce système. Suite B cela, nous avons quantifié ces molécules par virus. Enfin, nous avons analysé leurs effets sur la biologie du WH-1.Nous avons réussi à démontrer que l'infectivité du VIH-1 augmente lorsqu'il y a présence à sa surface d'une des trois molécules provenant des divers allèles du CMH-II. Cependant, une petite vanarion d e I'augrnentation d'infecrivité est observée dépendamment de L'allèle en question. Nos expériences ont apporté des renseignements quant à l'importance d u polymorphisme do CMH-II dans la pathogénèse du WH-1. Avant-P ropos Mon projet de recherche s'est effectué dans le laboratoire de recherche du Dr. Tremblay localisé dans le Centre de Recherche e n Infectiologie. J'ai réalisé mes travaux grâce à I'appui considérable de cenaines personnes dont je fais mention. Je tiens à remercier le Dr. Michel Tremblay pour son apport significatif de connaissances e n virologie, ses multiples conseils tant scientifique que général, et sa disponibilité. J'ai apprécié sa perception enthousiaste des découvertes à venir et son jugement critique. Sa contribution a t t é un outil indispensable à ma préparation pour une camère en recherche et j'ai pris un grand plaisir à travailler sous sa direction. Aussi, je remercie mes collègues de travail, le Dr. Benoît Barbeau, Dr. Réjean Cantin, et Jean-François Fortin pour leur participation dans la conceptualisation du projet, l'ap- proche scientifique et la résolution de questions techniques qui sont survenues. Je tiens aussi à remercier Sylvie Perron qui a su rendre le P3 fonctionnel et stocké en tour temps. À l'équipe entière d u Dr. Tremblay, je suis reconnaissante car elle a su créer une ambiance de travail dé tendue et plaisan te. Je dois un grand merci à Maurice Dufour, qui a analysé par cytofluorométrie d e flux touces les échantillons d e cellules transfectées. Je prends aussi cette occasion pour remercier le Dr. Michel Bergeron pour son leadership e t ses conseils et critiques professionnels. À Xavier, ma fille, Amaryllis, et ma famille, merci pour votre soutien moral, votre humour divertissant et votre gaicé immuable durant des périodes exigeantes que nous avons vécues. Table des matières Résumé ........,...........................................................................................................................II Avant-Propos ..........................................................................................................................III Table des matières ...........................................................- Index des figures et tableaux ..................VI Liste des abbréviations ............................*................................................... 1...... Chapitre 1 .Introduction ......................................................... 1 1.1. Les genéralités sur le WH-1 .................... . 1.1.1: La classification ......... .,.... ......................................................1 . . . ......................................................2 1.1 -2: La morphologie .................... 1.1.3. L'organisation génomique ......................................................................3 1.1-4: Le cycle réplicatif ..................................................................................4 1.1.4.1. L'attachement ............................. .............................................4 1.1.4.3. La transcription inverse et I'integration ..................... ...... 5 1.1.4.4. L'expression génique d u VIH-1 ................. ....7 1.1.4.4.1 : La structure du LTR ................................................7 1.1.4.4.2: La régulation temporelle de l'expression génique ................................................................ 11 ............. 13 1.1.4.5. Les protéines accessoires ........................... 1.1A.6: L'assemblage. le bourgeonnement et la maturacion ..............................,........................ ..........................14 ....16 1A.5. La pathogénèse de I'infecrion ..................................................... ....... 16 1.1.5.1 : L'entree du virus et l'intégration ......................... 1.1.5 -2: La dynamique de l'infection ..................................................19 1.1.5.3. La progression de l'infection ..................................................24 1.2: L'incorporation des molécules de la cellule hôte ...........29 dans l'enveloppe d e la particule du MH-1 .............................................. .................29 1.2.1 : La dtcouverte du phénomène ...................................... .................31 1.2.2. Le rôle des molCcules incorporees ............................... 1.2.2.1. Les fonctions lors de 11attachement/l'encr6e ........................ 31 1.2.2.2. Autres fonctions des molécules incorportes ........................34 Index des figures et tableaux ............................................... Figure 1. Structure morphologique du VIH-1 Figure 2. Structure génomique du WH-I Figure 3A. Représentations structurales du LTR du VIH-1 ..............................................8 Figure 3B. Représentations fonctionnelles du LTR du VIH-1 .......................................-10 ...............2 ........................... ........................-....................4 Figure 4A/B. Expression temporelle des gènes du VIH-1 .................... Figure 5. Figure 6. Évolution temporelle d e marqueurs biologiques importants lors de l'infection par le MH-1 ................. 12 ............21 L'analyse par cytofluorométrie des cellules 293T transfectées avec le pHXB-Luc ec les plasmides codant pour la molécule HLA-DR1, HU-DR4 ou HL.-DRw53 ..............................................................................................43 r Tableau 1. Tableau 2. La détection à Ifaide de billes magnétiques des glycoprotéines HLA-DR1 ,-DR4, -DRw53 dérivées de l'hôte associées aux particules Hm-Luc ............................................ La quantification par ultracentrifugation des glycoprotéines HLA-DR1, -DR4 et -DRwS3 de l'hôte associees aux particules entières du HXB-LUC............................................. Figure 7. 46 ................................................47 Lfinfectivicé des particules HXB-Luc pourvues HLA-DR1, HLA-DR4 ou HLA-DRw53 dans la lignée lymphoïde cible Jurkat-tat ....................... ................................ . . ...49 Liste des abbréviations ADCC Cytotoxicité cellulaire anticorps dépendance ADN Acide désoxyribonucltique ADNc Acide dtsoxyribonucléique complémentaire AEW Acide ribonucléique M a s e Hydrolase de l'acide ribonucléique ARNm Acide ribonucléique messager ARNt Lys Acide ribonucléique de transfert d e la lysine ATP Adénosine tri-phosphare bDNA Acide désoxyribonucléique réticulé CA Capside CMH-II Complexe majeur d'histocompatibilité de classe II CMV Cytomégalovirus CPA Cellule présentatrice d'antigènes CPI Complexe de pré-in regration Fe Lv Oncornavirus felin Fv Virus de la leucémie d e Fnend gP Glycoprotéine GPI Glycosylphosphatidylinosicol HLA-DR Antigène des leucocytes humain dfisotype DR HTLV-1 Virus T-lymphotropique humain d e type 1 ICAM- 1 Molécule d'adhésion in tercellulaire I 1FN-g Interféron de rype gamma IkB Inhibiteur kappa B IN Intégrase IR Courtes sequences répédes inversées kDa kiloDaIton LC Cellules de Langerhans LFA- 1 An t i g h e associé aux fonctions lymphocytaires LTR Lony e s stquences répétées terminales MA Matrice MA-P Matrice p hosphorylée NASBA Amplification d'acides nucléiques baste sur la séquence NC Nuclc5ocapside NF-kB Facteur nucléaire kappa B NLS Séquences de localisation nucléaire PBMC Cellules mononucléaires de sang périphérique PBS Site de liaison d e l'amorce Pol ADN polymérase QC-PCR Réaction e n chaîne d e polymérisation quantitative et compétitive RT Transcriptase inverse SIDA Syndrome d'immunodéficience acquise Vif Virion infectivity factor WH Virus d e l'immunodéficience humaine VIS Virus de l'immunodéficience simienne VP~ Protéine virale R accessoire VPU Viral protein U TCGF Facteur de croissance des cellules T Chapitre 1 : Introduction 1.1 :Les généralités sur le VIH-1 classification La maladie du syndrome de I'immunodéficience acquise (SIDA) a tre dtcrite pour la première fois au débuc des années 80. Le SIDA se caractérise par une imrnunosuppression profonde e t un ensemble de syndromes cliniques menant souvent A des conditions fatales. En 1983, son agenc étiologique a t t t identifié par Montagnier et ses collaborateurs à l'Institut Pasteur. D'autres ttudes qui ont suivit par les Cquipes de Gallo et Levy ont confirmées cette découverte [l-31. 11 a été nommé e n 1986 par l'International Cornmittee on Taxonomy of Vinises comme étant le virus de l'immunodéficience humaine (VIH). Environ vingt millions de personnes dans le monde entier sont infectées par le VIH e t plus de trois millions de personnes ont déjà développé la maladie du SIDA [4]. Au Canada, 1% de la mortalité est causée par cette maladie [5]. Dans l'histoire médicale moderne, le SIDA a galvanise les soucis ec les efforts de tous, mtdecins, scientifiques et la population e n général. Actuellement, il n'existe pas d'immunisation prophylactique ni de cure pour la maladie associée au VIH [4]. Le W H est classifié dans la grande famille des Re'tr~& des virus animaux, à cause des séquences génomiques homologues, d'une structure virale commune et d'un patron de réplication caractéristique de ce groupe 161. Plus précisément, le VIH est membre de la sous-famille des Lmtkinnnaepuisque le virus manifeste une infection d'évolution lente, persiste et se répand malgré les dtfenses de l'hôte [6, 71. Un sous-type qui direre du WH-1 par sa structure génomique et son antigénicité a tté identifié en Afrique occidentale (aussi localise en Amérique du Sud, e n Europe et aux États-unis) qu'on a nommé le VIH-2. Les deux virus peuvent aboutir à la maladie du SIDA, mais ce rapport traite du VIH-1 puisque c'est le type qui est le plus répandu dans le monde e t par conséquent le plus étudié [8,9]. 1.1.2 La morphologie La morphologie particulière du VIH-I est commune a tous les knthinitae (voir Figure 1). Ce virus a un noyau en forme de cone tronque compost des protéines de nucléocapside p24, p17, p9 et p6, produites lorsque la p r o c h e Gag precurseur de 55 kDa est clivé par la protéase virale. Les protéines p6 et p9 forment ensemble le noyau et sont associées d'une manière rapprochée au génome. Le polypeptide p24 phosphorylc5 est le composant majeur de la couche interne d e la nucléocapside (CA). La surface interne de la bicouche lipidique est couverte par la protéine pl7 myristyl6e qui forme la matrice (MA) de la structure virale et qui est virale pour l'intégrité du virion car elle stabilise les composantes externes et internes du virion. A l'intérieur de la capside se trouve un dimère de molécules ÇI'ARN identiques à sirnple brin. Le matériel génomique est associé étroitement avec diverses enzymes préformés comme la transcrip rase inverse (RT), I'intégrase (IN) et la protéase [8,10, 111. Figu r e 1 : Structure morphologique du VIH-1 Trdnscripti invetse Matrice pl 7 Capside p24 Bicouche lipidique Dans l'ensemble, le virion forme une structure enveloppée, icosat5dnque. L'enveloppe virale, d'un diamètre de 100 nm, est composée d'une bicouche lipidique dérivée lors du bourgeonnement de la membrane plasmidique de I'hôte. A la surface de l'enveloppe existe 72 protubérances fonn6es de trimères et de tktramères de deux glycoprotéines majeures de I'enveloppe, la gp120 et la gp41 synthéds6es suite au clivage de la a 1 6 0 par une proréase cellulaire [IO]. La glycoprotéine à la surface externe est la gp120. La gp41 est la glycoprotéine transmembranaire mais certaines parties des portions centrale et Nfterminal de cette protéine se présentent à l'exttrieur du virion. La gp120 et la gp41 sont Mes de façon non covalente. La portion N' terminal de la gplZO à la surface virale contient les sites de liaison des récepteurs cellulaires ainsi que les sites primaires de neutralisation [8, 10-121. 1.1.3L'organisation génomique Une particule virale infectieuse contient deux brins idenriques dlARN, chacun d'environ 9,2 kb très complexe (voir Figure 2) [4, 101. Chaque brin est apparié à un A . de transfert spécifique de l'hôce qui provoque la synthèse de l'ADN. La version d'ADN du &nome est le provirus intégré dans l'ADN de I'hôte. Une partie de la structure génomique du VIH-1 est commune à tous les rétrovirus. Ainsi la séquence nucléotidiquegag code pour les polypeptides structuraux de la nucléocapside, mv code pour les glycoprotéines de l'enveloppe tandis quepoleode pour la transcriptase inverse, l'endonucléase et des protéases nkcessaires pour la réplication virale [IO]. En plus d e ces gènes typiques retrouvés chez tous les rétrovirus e n ghéral, le VIH-1 contient au moins six autres @es: vpr, noif,pu, f a , rew et nef. k s produits de ces gènes régularisent la réplication virale de plusieurs façons. II est probable que l'action concertée de ces génes additionnels contribue h la pathogénicite observée chez le VIH-1 [4,8, 10, 131. Aux deux extrémitks des cadres de lecture ouverts d e I'ADN proviral se trouvent les longues séquences répétées terminales (LTR), de plusieurs centaines de paires de bases. Le rôle du LTR, surtout celui du bout 5' terminal, est de réguler la transcription des gènes [4, 101. 5 de l'infection par le VIH-1 suggère que suite à la liaison de la gp120 au CD4,la gp41 insère son bout N' terminal hydrophobe dans la membrane cellulaire initiant la fusion entre l'enveloppe virale et celtulaire 141. Mais, plusieurs études récentes démontrent que des facteurs autre que le récepteur primaire CD4 sont necessaires pour la fusion. En effet, certaines cellules humaines exprimant un niveau 6levé de CD4 ne sont pas infectées par le VIH-1. De plus, certaines cellules animales qui expriment la moltcule CD4 humaine à leur surface ne sont pas infectées. Des études avec des hybrides somatiques résultant de la fusion entre des cellules d e rongeur qui expriment le CD4 humain ec des cellules humaines CDCnégatives suggèrent qu'un facteur de surface cellulaire sur les cellules humaines est nécessaire pour l'entrée virale [8, 23-25]. Récemment, on a dtcouven ce cofacteur qui est nécessaire pour la fusion/llentrée et la réplication dans les cellules CD4+. Le cofacteur principal qui permet une infection par des souches du WH-I primaires macrophage-tropique est le CC-CKRS, un récepteur pour les chimiokines D (RANTES, MIP-laet MIP-1B) [26-301. Ces chimiokines inhibent l'infection de cellules T CD4+ par ces souches au stade d e I'entrée virale et bloquent la fusion de l'enveloppe virale et la membrane cellulaire [29, 311. La Fusine sert de second récepteur pour l'entrée d'isolats tropiques pour les lignées cellulaires Tkransformées [28, 31,321. 11 est possible que les cofacteurs, en indragissant avec la gp120 et le CD4, aident à rapprocher la peptide d e fusion d e la gp41 à la membrane plasmique cellulaire de l'hôte induisant la fusion. Suite à cela, le processus d'entrée continu, c'est-à-dire qu'il y a formation d'un pore de fusion et transfert du complexe nucléoprottique viral vers l'intérieur de la cellule initiant le cycle d'infection 1221. 1.1.4.3 La transcription inverse et I'integration Lorsque le WH-1 est entre dans la celiule, plusieurs 6vènemencs intracellulaires s'en suivent menant à I'intdgration d'une forme provirale du VIH-1 dans le génome de la cellule hôte. Dans le cytoplasme, I'ARN viral, toujours associe aux protéines de la capside dégradée, 6 est soumis B la transcription inverse et la RNase H, deux activités effectuees par la RT,un enzyme du complexe nucltoprotéique de préint6gration (CPI)de grande taille (160s). Initialement, I'ARNt se lie au site d'atrachemen t de l'amorce (PBS, pour p n n wM n g d e ) d e I'ARN genomique, le brin +, et sert d'amorce pour la synthkse d u brin - d'ADN comple- mentaire. La transcriptase inverse vient ajouter des désoxynucltotides à l'amorce. Pour que la synthèse de l'ADN puissent continuer, I'ARN recopié est degrade par une nuclease, la m a s e H. Éventuellement, IfADN monocaténaire néoformé est converti e n ADN bicadnaire. Maintenant, le CPI du WH-1 contient de l'ADN viral en association avec les antigènes d e la MA, d e l'IN e t de la RT, d e la protéine virale R accessoire (Vpr) mais non pas les antigènes d e la CA [33-351. Ensuite ces copies, ADNc (brin -), de I'ARN viral (brin +), au sein du complexe, sont transportées activement dans le noyau de la cellule hôte, un processus requerrant de I'ATP [34, 361. Des protéines virales e t cellulaires, associées au complexe, possèdent des séquences de localisation nucltaire (NLS) permettant d'emprunter des pores nucléaires. C'est la protéine MA du VIH-1 qui contient une stquence de localisation nucléaire à son bout N' terminal et qui, lorsque conjuguée à une protéine httérologue, dirige l'imporration du complexe dans le noyau [37]. Mais pour qu'il y ait translocation de la protéine MA vers le noyau certains de ses résidues tyrosine et sérine doivent être phosphoryles avant et durant l'infection virale, permettant la dissociation de la protéine avec la membrane (MA-P). La protéine Vpr joue aussi un rôle moins bien défini dans l'importation du complexe dans le noyau [35]. Grâce à l'activité de I'inttgrase virale, l'intégration de I'ADN viral, a lieu dans I'ADN de l'hôte. Donc, la protéine intégrase agissant en trans est essentielle pour l'intégration, mais les courtes séquences répétées inverstes appelées IR, qui limitent les LTR de I'ADN viral, sont aussi indispensables. L'intkgrase engendre des extr6mitts 3'OH au niveau des séquences IR d e I'ADN afin d e préparer les brins pour l'intégration dans I'ADN cellulaire. . Subséquemment, il y a perte de deux nucléotides 5' non-appariés proviram. La liaison covalente de I'ADN viral aux extrémités 3' proviraies à l'ADN cellulaire est catalysée par l'intégrase. Enfin, des enzymes cellulaires ou un complexe impliquant l'IN et la RT rtalisent probablement la reparation des trous des bouts 5' du provirus et d e I'ADN cible [38]. Cette intkgration ne requiert aucune synthèse de l'ADN cellulaire [36,37]. De cette manière, le virus réussi à se répliquer dans des cellules différenciées telles q u e les macrophages (monocytes, macrophages tissulaires, cellules tipithéliales CD4+ humaines, cellules dendritiques folliculaires et les cellules microgliales) 134, 361. De plus, le site d'intégration n'est pas toujours choisi aléatoirement car il semble exister une préférence gouvernée par l'accessibilitk du domaine d'insertion [38,39]. 1.1.4.4 L'expression génique La transcription des gènes de I'ADN proviral intégré est régularisée par les sequences nommées dong terminal repeam (LTR),qui limitent chaque extrémité des gènes structuraux viraux. Cependant, I'activitk du LTR de l'extrémité 5' est beaucoup plus importante en raison des nombreux éléments de régulation qui sly trouvent. 1.1.4.4.1 La structure du LTR Dans le &nome du WH-1, le LTR de gauche s'étend de la région -454 à +184 et peut être séparé en trois régions majeures de régulation; la région modulatrice, qui se limite aux nucléotides -454 à -78, la région noyau, de -78 à + l et l'élément tar, de +1 à +60 (401 (voir Figure 3A). La transcription du LTR se produit de la même manière que chez tous les promoteurs trancrits par I'ARN polymérase II (pol II) cellulaire. Des facteurs de transcription viraux et cellulaires viennent se lier d'une façon particulière aux sites dans le promoteur LTR, qui eux varient dans leur arrangement, formant des complexes multiprotéiques uniques. Ce phénomène permet d'obtenir un niveau élevé de spécificict nécessaire pour la régularisation des patrons complexes de l'expression génique (40, 411. F i g u r e 3A : Représentations structurales du LTR du VIH-1 MODULATORY I l II CURE 1I 11 TAR La région modulatrice Cette région permet d e regulariser positivement ou négativement la transcription d u LTR qui est influencée par l'état d e la cellule. Elle est composée d'une rkgion discale et d'une région enhancer. Dans la région distale se trouvent un nombre de sites d e liaisons pour des facteurs d e transcription cellulaires ayant un effet positif (ex: Myb, AP-1, NF-AT, LEF-1) ou ayant un effet nCgatif tels que USF et COUP. Cependant, seule la région enhancer sera traitée ci-après étant donné son importance dans la régularisation. L'élément de la region modulatrice du LTR du VIH-1 le plus érudit est la région enhancer. Cetce dernière est constituée de deux séquences identiques conservées d e dix paires d e bases nommées des motifs NF-KB incluses dans la région -109 et -79 [40]. Nabel et Baltimore furent les premiers à définir le rôle du NF-KB, situé dans la région de la régularisation de la transcription du LTR,en démontrant une correlation directe entre une augmentation de l'activité de liaison du NF-icB à l'ADN proviral et une augmentation d e 50X de I'activité transcriptionnelle dirigée par le LTR du VIH-I lors de l'activation des cellules T 1421. Le facteur d e transcription cellulaire, NF-KB, est présent ubiquitairement et il est compost de sous-unites formant des homo- ou htterodimères, d e la famille R~I/NF-KB.Les sous-unités les mieux érudiées sont la p50 et la p65 (RelA) mais il existe aussi la p52, la c-Re1 et la RelB. Le NF-KB participe dans plusieurs processus biologiques tels que la réponse immunitaire ou inflammatoire, la différentiation des cellules lymphoïdes, la r6iguIarisation de la croissance cellulaire et la rt5plication virale [43,44]. Son activité est constitutivement élevée dans les cellules B e t certaines lignées d e cellules T et d e monocytes/macrophages. Cependant la plupart des cellules n'ont pas d'activité de liaison constitutive du NF-&. II faut souligner que I'activitti du NF-KB est fortement induite par l'infection du VIH-1 [44,45]. Dans plusieurs lignees cellulaires, l'activité du NF-KB est haurement contrôlée par la liaison d e la p65 avec une moltcule inhibitrice, IkB. L'interaction 1KB:NF-KBmasque le signal de localisation nucléaire d e la p65, il s'ensuit donc que le NF-KB est retenu dans un complexe protéique inactif dans le cytoplasme. La dissociation du complexe 1-KB:NF-KB semble initiée par la phosphorylation du IKB et peut être le NF-KB. Lorsque la sous-unit6 NF-KB esr relâchée, il y a translocation de la p65 conjointement avec la p50 vers le noyau et activation de la transcription [43-451. L'utilisation de mutants constitués de gknes rapporteurs sous le contrôle du LTR [42] ou de virus recombinants [46] a démontré la contribution d e chacun des motifs régulateurs, SPI et NF-@ dans la réplication du VIH-1. Brièvement, la protéine NF-KB se lie à la protéine SPI et ensemble elles forment un complexe avec le LTR pour induire la transcription virale (voir Figure 3B). Plus récemment, k a m i et son équipe ont comparé le rôle que joue le NF-KB dans les signaux d'activation du LTR dans des celIules T CD4+ humaines et dans une lignée de ceIlules T lymphoblastoïdes transformées. Dans les cellules T primaires au repos, seulement la sous-unit6 p50 est presente dans des extraits nucléaires et non pas la p65, et il n'existe qu'une faible activité du LTR. Cependant dans les cellules T CD4+ activées I'activité du LTR, dtpendant du NF-KB, est tlevée. Donc, ils concluent que dans les lymphocytes CD4+ non-s tirnulés I'environnemen t cellulaire ne permet qu'une faible activité du LTR du WH-1 par opposition aux cellules accivees où se produit une forte expression des gènes d u VIH-1 [47]. Figure 3 B : Représentations fonctionnelles du LTR du WH-1 La région noyau La région noyau du promoteur du VIH-1, q u i est apparentee aux promoteurs eucaryotiques transcrits par pol II, contient trois sites d e liaison e n tandem du facteur d e transcription cellulaire ubiquiraire SPI, cette region s'étend d e -78 2 4 6 . La protéine SPI semble stabiliser la liaison de d'autres facteurs au LTR En aval d e cette derniére skquence, se trouve une séquence consensus TATA (région -27 à -23) et des éléments initiateurs particuliers auxquels se lient des facteurs généraux de la transcription nommés astaart site region» (SSR)(régions -2 3 +8 et de +32 à f 4 1 ) . Tous les éltments mentionnés ci-haut sont essentiels pour un niveau basal d'activité du promoteur [40,43, 451. La régionTAR La région trans-activating response element (TM),unique au WH,débute au site d'initiation de la transcription de I'ARN viral catalysee par pol II. On réfère souvent cette région comme les udownstream elementsm. Elle est composée des éléments LBP-1, IST et TAR inclusivement. Lorsque ce dernier élément est synch&ist e n ARN, il y a formation d'une structure .stem-loopm qui s'étend de +1 à +60. C'est un enhancer et son rôle principal est de recruter la proteine trans-activatrice virale Tat au promoteur [40]. Lors de son action, la transcription du provirus est augrnentke d'environ 1000 fois [48]. Des mutations dans l'élément TAR n'ont pas d'influence sur le taux de transcription basale mais la trans-activation par Tat est éliminée. 11 semble que Tat agir via TAR pour augmenter la formation de complexes d'initiation sur le promoteur du VIH-1 et stabiliser les complexes lors de I'élongation des chaînes d'ARNm [49]. 1.1.4.4.2 La régulation temporelle d e l'expression génique L'expression génique du WH-1 se divise en deux phases, celle des gènes régulateurs précoces et celle des gènes structuraux tardifs [IO] (voir Figure 4). L'activation de la cellule hôte infectée déclenche la transcription du Lors du stade précoce, les types LTR du VIH-1. de produits prédominants de la transcription qui sont transportés à l'extérieur du noyau sont les ARN messagers (ARNm) multi-épissés d'une taille d'environ 2 kb. La traduction d e ces ARNm abouti a la formation des protéines de régulation Tat, Nef et Rev. Tat et Nef agissent sur les séquences génomiques pour regulariser la suite de la transcription. La protéine qnegative factor. (Nef)est produit à tous les stades de l'expression génique virale [SOI. Cette protéine est nécessaire pour la production d'un taux tlevé de réplication virale e t des évidences suggèrent qu'elle est multifonctionnelle. Ainsi, elle est impliquée dans la regulation ntgative du CD4 (le récepteur viral) d e la surface cellulaire, I'alt6ration de I'acrivation des cellules T par le biais de certaines voies de signalisacion et l'augmentation de l'infectivité virale [5 11. Figure 4A : Expression temporelle des gènes du VIH-1 Expression des gènes précoces régulateun LTR LTR Nef Rev (Proniines régulatrices) v (Proréines smctudes, produites en faible qwnaé) Figure 4 B : Expression temporelle des gènes du VIH-1 Expression des gènes tardifs structuraux LTR NRE LTR TAR 1 Tmalpdon Production der virions; Lyse de k teliule infeccéé. 1 Tel que mentionne prkcecédemment, la protéine Tat, essentielle pour la réplication, agit à plusieurs niveaux, c'est-à-dire en favorisant l'initiation et I'élongacion de la transcription. Tar trans-active fortement l'expression d e tous les gènes viraux e n se liant au TAR (trans activating response element) . Grâce A l'action de Tat, la protéine Rev du WH-1 est produite davantage et ses effets prendront d e l'ampleur. Tout comme Tat, Rev est aussi essentielle la réplication virale puisqu'elle assure la transition entre la synthèse de produits de gènes régulateurs précoces et de gènes structuraux tardifs en altérant l'équilibre d u transport d ' M m I'exterieur du noyau. Plus précisément, elle exerce un contrôle au niveau d e la post-transcription e n augmentant le transport vers le cyroplasme et la traduction dtARNrn mono et non-épisse codant pour les produits des gènesgog,,pol, et mv, les protéines structurales et enzymatiques virales [IO, 50, 5 11. Somme toute, les deux phases de la transcription auront pour effet de régulariser, via Rev, I'expression des g h e s régulateurs du VIH-1 et de limiter I'expression de protéines structurales du WH-1 dans le but d'amoindrir la reconnaissance d e ces dernières par le sysdme immunitaire [4]. 1.1-4.5 Les protéines accessoires En contraste, les gènes o p , oif et vpr codent pour des facteurs discrets pour la croissance virale dans les systèmes in vitro e t sont donc nommé communément des protéines accessoires. Cependant, le degré éleve de conservation d e ces produits suggère qu'ils ont des rôles essentiels in vivo. Un produit d'un gène tardif, wiral protein UN (Vpu) est une phosphoproteine intégrale d e la membrane qui s'associe surtout avec les membranes internes d e la cellule. Cette proréine a une double action. La première action est la régularisation négative du CD4, accomplie lorsque la Vpu intéragit avec le domaine cytoplasmique des molécuIes CD4 retenues dans le RE, e t déclenche leur dégradation precoce. Ceci a pour effet 1 d'augmenter le transport intracellulaire et la maturation de la protéine Env. La deuxitme action du Vpu, indépendante de la premikre, est la stimulation du bourgeonnement des vinons à la surface d e la cellule infectée [SOI. La protéine -virion infecrivity factor. (Vif) est un produit de gène tardif, present dans les cellules infectées mais non associé aux particules virales matures. Elle agit indirectement au moment d e l'assemblage des vinons afin de permettre la formation d e particules compttentes pour les étapes primaires de l'infection. Plus précisément, elle aurait un rôle dans l'empaquetage correct du noyau nuclc5oprotéique des virions et dans la synthèse de l'ADN proviral dans la cellule cible [SOI. Une tcude a démontré que Vif n'est pas toujours requise, seulement dans certaines lignées cellulaires, où elle compense pour des facteurs cellulaires absents pour assurer la production de particules virales infectieuses [52]. La petite protéine basique xviral protein RN (Vpr) s'associe avec les particules virales et s'accumule dans le noyau de cellules infectées. Elle est impliquée dans i'intéraction virus-cellule hôte. En association avec la protéine d e la matrice (MA), Vpr joue un rôle fondamental dans le processus d'infection des cellules différentiees, au niveau de la voie d'importation nucléaire du complexe de préintégration. Cette protéine peut aussi perturber le cycle cellulaire. Elle induit l'arrêt de la croissance e t la differentiation e n causant une accumulation de cellules dans la phase G2 et par ce moyen, empêche l'établissement de l'infection chronique du VIH-1 dans les lymphocytes T [SOI. 1.1.4.6 L'assemblage, le bourgeonnement et (a maturation Lorsque les protéines virales sont synthétisées dans le cytoplasme, l'assemblage des particules virales infectieuses s'en suit. Une fraction des ARN non-épissés complets transcrits du génome proviral est instree dans le complexe nucltoprotéique formé d e protéines du noyau codtes par gag et d'enzymes codes parpol requis pour le prochain cycle d'intégration. Les ARNm des gènes gag e t pol font partis d'une autre fraction d ' M complets transportés dans le cytoplasme [33]. La region gag-pu1du génome du VIH-1 est représenté dans un seul M m non-épissé codant pour deux prottines: la protéine précurseur, Pr55 Gag et la protéine de fusion Gag-Pol (160 kDa) synthétisées à un ratio d e 10-20:l. C e dernier précurseur est clive par une protéase virale pour donner les protéines matures depol responsable de la transcription inverse et l'intégration. Le gènepol et le gène en amont, gog se chevauchent donc pour qu'il y ait production de la prodine d e fusion gagpol grâce a un changement de cadre de lecture du ribosome tors d e la transcription. (531. Les proteines Gag et Gag-Pol s'attachent par la myristylation à la paroi interne de la membrane cytoplasmique. Dès lors, elles forment des bourgeons immatures. C'est précistment à ce stade que I'ARN complet viral ainsi que les prottines Vpr et Vif se joignent à la capside en formation [54]. Enfin, une fraction des ARN est convertie, suite à Ifépissage, e n ARNm qui donnera naissance aux pro téines majeures de l'enveloppe, la gp 120 et la gp41 [33]. La capside est alors enveloppée par la membrane cytoplasmique de l'hôte riche en proteines Env et autres et relâchée par la cellule par un processus d e bourgeonnement. C'est grâce aux interactions entre les proteines précurseurs Gag et Gag-Pol qu'il y a extrusion du virus de la membrane. Tel que mentionné précédemment, la protéine Vpu est impliqute dans l'assemblage du virion. Une &ude révèle que le VIH-1 recombinant Vpu négatif mène à une accumulation d e protéines virales associées à la cellule et à une inhibition du bourgeonnement des virions (551. L'on propose que l'action de la protéase virale de cliver les pr6curseurs est déclenchte lorsqu'une certaine concentration d e Gag et Gag-Pol dans les virions est atteinte. Le résultat de ceci est la production d e virions, c'est-à-dire de particules virales matures et infectieuses prêtes à répéter le cycle réplicatif du VIH-1.La production des virions matures est associée 3 la lyse cellulaire [IO, 551. 1.1.5 La pathogenese de l'infection par le V l K l 1.1 5 1 L'entrée du virus et l'intégration La transmission d'un virus peut être fortement influencée par la quantité d e virus infectieux dans le fluide corporel et le degré d e contact avec ce dernier. Des études épidémiologiques ont dtmontré que les modes d e transmission du MH-1 d'un individu à un autre déterminent les caractéristiques de la maladie du SIDA. Les trois voies principales d e transmission sont: 1) le rapport sexuel, oii le virus présent dans le sperme accède par les muqueuses le parcenaire non infecté La quantité d e virus dans les fluides génitaux influence la transmission sexuelle. Néanmoins, d'autres fluides corporels ne représentent pas des sources potentielles de transmission tels la salive, la transpiration, l'urine, les excrétions, le fluide synovial, les fluides de lavage bronchoalvéolaire, le fluide amniotique et les larmes où l'on trouve rarement de grandes quantités de virus. Toutefois. le fluide cérébrospinal aurait parfois des quantités élevées de virus [8]. La transmission du VIH-1 par les fluides génitaux a probablement lieu via les cellules infectées étant donné leur grand nombre. Aussi, la variation dans ce nombre fair varier le potentiel d'infection entre partenaires. Des etudes épidémiologiques indiquent que des ulcérations seraient des points d'entrée du virus dans le vagin ou le canal anal, mais ces ulcérations n e semblent pas nécessaire pour I'infection des muqueuses rectales [8]. En Afrique et en Asie, la majorité des cas d'infections par le VIH se produisent par la transmission sexuelle entre partenaires hét~rosexuelset un facteur d e risque identifié sont les ulcérations génitales causées par les maladies vénériennes [4, 81. 2) l'inoculation d'un individu avec du sang infecté ou des produits sanguins (ex.: les aiguilles partagées par les drogués) De grands efforts ont été fait pour quantifier le WH-1dans le sang étant donné le risque important de transmission du SIDA par ce fluide corporel. Lors d'une infection primaire, le virus libre s'y retrouve en grand nombre. Substquemment, le nombre diminue dans l'espace d e quelques semaines. Dans le sang d'individus infectes asymptomatiques, il y a prdsence d e virus libres et d e cellules infectées par le virus, ces dernières étant plus nombreuses. De plus, chaque cellule peut produire plusieurs milliers de particules infectieuses par jour. Enfin, le nombre d e cellules infecttes et de virus libres s'élève dramatiquement lorsque le stade symptomatique est atteint [a]. Il existe un risque mineur chez les receveurs de transfusion dans un milieu clinique grâce à la venue de tests d e dépistage d'anticorps anti-WH-l dans le sang de donneurs e t les produits sanguins. Chez les hCmophiles, la transmission du VIH-1 est presque totalement éliminée étant donné la nouvelle étape d e chauffage des facteurs VI et IX avant ou après la lyophilisation [8]. 3) la transmission d e la mère à I'enfant La transmission du VIH-I de la mère à l'enfant a lieu dans 11 à 60% des nouveauxnées de mères infectées. Cette voie représente la majorité des cas pkdiatriques du SIDA. 11 semble que la transmission peut avoir lieu *in uterom, durant l'accouchement ou encore lors de I'altaicement. Il semblerait que le taux de virémie, des caract6nstiques particulières des souches du WH-1 et les anticorps antiviraux présent chez la mère sont des déterminants dans la transmission du virus [a]. En résumé, l'infection a lieu lorsqu'il y a échange des fluides corporels tels que le sang, le sperme ou les fluides vaginaux [4,8]. - Les principaux groupes à risque pour dkvelopper le SIDA sont les maies homo ou bisexuels, les drogués, les partenaires hétérosexuels de membres appartenant à d'autres groupes à risque et les bébés naissants de mères infectées. Les cellules de Langerhans (LC) épithéliales représentent une source potentielle de contact cellulaire initial par infection vaginale. Dépendamment du sous-type du WH-1 et de son tropisme pour les LC,l'efficacité de la transmission hétérosexuelle du VIH1 varie [56]. Les LC sont des cellules dendritiques migratoires dérivées d e la moelle osseuse. Elles représentent une population d e ceIlules pr6sentatrices d'antigènes (CPA) très efficaces localisées dans l'épithélium squameux stratifié comme la peau et les parois muqueuses. Les cellules LC agissent comme des guetteurs à l'interface de l'environnement e t d e l'hôte et surveillent les antigènes étrangers qui migrent via les voies lymphatiques afférentes vers les ganglions lymphatiques où se canalisent les tissus différenciés. Dans ce contexr, les LC sont parmi les cellules les plus puissantes et efficaces à prksenter des antigènes aux lymphocytes T CD4+ et CD8+ qui circulent normalement dans les ganglions lymphatiques. Une hypothèse suggère que les LC des muqueuses deviennent infectées, sont transportées grâce aux voies afférentes dermiques lymphatiques vers les tissus lymphatiques e t transmettent le virus aux cellules T. Une étude démontre q u e les LC e t les celluies dendritiques (DC) qui ont subit une infection primaire transmettent rapidement le virus aux cellules T accivkes non infectées. La coculcure de ces cellules aboutit à une production importante de virus qui nécessite un con tact cellule-cellule d'une courte période (30 min.). Cependant la CO-culturedes cellules T infectées e t des cellules T cibles non infectées mène à une production faible de virus, même s'il s'agit d'un virus T-tropique. Donc en plus d'être les cibles importantes de l'infection par le WH-1,les LC et les DC jouent probablement un rôle cl6 dans la disstmination précoce du virus dans les cellules T qu'elles rencontrent dans la peau ou les tissus lyrnphariques [57]. Même s'il existe une ambiguire au niveau du premier type cellulaire infecté, le site primaire d'infection est connu. Suite son transport du site d e premier contact cellulaire via les voies lymphatiques, le virus se loge dans les ganglions lymphatiques. À ce stade le virus est soumis à la réponse immunologique normale genérée impliquant les CPA et les cellules T [58]. 1.1 5.2La dynamique de l'infection À cause de la biologie très complexe du VIH-1, les manifestations cliniques d e I'infection sont très variables. Même si parfois l'infection initale est asymptomatique, généralement un grand nombre de patients manifestent un syndrome du WH-1 aigu qui survient environ 2 à 6 semaines suite à l'exposition au virus. Pendant cette période initiale, le virus se réplique abondamment dans les ganglions lymphatiques et est détectable dans le sang e t le fluide ctrébrospinal. Lors de cette période, le nombre de cellules CD$+ augmente [4,8]. Suite à ce premier stade, une phase de latence clinique débute, qui peut durer jusqu'à environ 10 ans. Durant cette période, la virémie est réduite considérablement dans le sang. L'explication dtmodée pour cette réduction était qu'une attaque par le système immunitaire était responsable. Quelques mois après I'infecrion, le compte de CD$+ demeure un peu élevé. Le nombre d e CD4+ augmente des niveaux presque normaux dans le sang. Par la suite, les cellules CD4+ semble diminuer progressivement malgr6 le fait que le virus libre extracellulaire disparaît des fluides corporels. II y a une progression cons- tante de la maladie dans les tissus lymphoïdes avec des nombres croissants de cellules T CD4+, macrophages et cellules dendritiques folliculaires infectées. La lymphadénopathie géntralisée peut se développer lors de ce stade mais le système immunitaire est compétent à combattre les infections. Des signes et symptômes variés peuvent survenir et persister des années avant le développement du SIDA [4, 81. Au moment où l'individu développe des symptômes, le compte de cellules CD4+ est diminué et les niveaux du VIH-1 dans le sang est élevé en comparaison avec la phase asymptomatique. Au même moment, il y a une diminution de la réponse antivirale cellulaire des cellules CDS+. À ce point, le virus s'est transformé et a des caractéristiques distinctes du virus récupéré suite à la primo-infection. 11acquiert les proprietts associées avec la virulence de l'hôte c'est-&-dire un éventail de cellules cibles plus large, une cinétique d e replication plus rapide, et une cytopathogénicité pour les cellules CD4+. Aussi, il semblerait que le virus résiste à la neutralisation et devient sensible i certains anticorps ~enhancing-qui favorisent I'infection. Avec une réduction du contrôle immunologique de I'infection par le VIH-1 en cours, les souches virales plus virulences prennent la relève, se répliquent e n grand nombre ec éliminent un grand nombre de cellules CD4+. Évenruellement, ils éliminent toute possibilité d'un contrôle efficace d'infections opportunistes. Au stade terminal. les cellules CD8+ ainsi que les cellules CD4+ diminuent en nombre. Le diagnostique du SIDA se fonde sur des évidences d e laboratoire et par la présence d'une variétt d'infections opportunistes, des néoplasmes, d e la cachexie et par une dégénération du système nerveux central [4, 81. Une variété d e techniques de laboratoire d'immunologie clinique sont employées afin de diagnostiquer et suivre la progression d e I'infection du WH-1. Les anticorps dirigés concre les proteines virales p24 e t gp120 apparaîssent dans le sérum environ deux à douze semaines suite à la primo-infection (Voir Figure 5). Les antigènes viraux p24 sont normalement présent jusqu'à trois mois suivant I'infection et ensuite ils réapparaissent des anntes plus tard lorsque le SIDA se ddveloppe. Le test d e laboratoire le plus commun pour mesurer la progression d e la maladie du VIH est celui du compte de cellules T CD4+ périphériques. Tel que mentionné ci-haut, il y a une chute initiale du taux de cellules T CD4+ dans le sang e t par la suite une baisse constante avec les années. Lorsque le compte est sous le seuil minimum de 250 cellules/mm3, le risque complications est élevé (voir R y re 5) [4, 8, 581. du SIDA avec toutes ses 21 F i g u r e 5 : Évolution temporelle d e marqueurs biologiques importants lors de l'infection par le VIH-1 Semaines Années Dans le passé, pendant le stade de latence, les mesures avec des methodes moins sophistiquées indiquaient une virémie réduite. L'explication pour ceci était qu'il y avait une réplication virale plus lente e t une réponse immunitaire antivirale active (81. Par contre, avec la venue d e nouveaux outils plus sensibles, il semble que la rkplication virale soi t très active à tous les stades de la maladie. Lors des débuts de la recherche sur le virus du SIDA, les donnees d'hybridation insiru suggéraient que seulement 1/10 000 à 1/100 000 leucocytes périphériques d'un individu (sunout les lymphocytes T CD4+) etaient infectées par le WH. Subséquemment, avec la venue du PCR quantitatif, le nombre d e cellules T CD4+ infecttes par le virus s'élevait à 1/10 chez les patients sidéens e t 1/1000 chez les individus asympromatiques. II faut retenir que le rapport du nombre de cellules T CD4+ infectées dans le sang et le nombre de cellules T CD4+ total infectées par le WH dans le corps (ex: les tissus lymphoïdes) n'est pas bien défini. De plus, les PBMC ne représente que 1 à 3% des lymphocytes totaux [8]. Les nouvelles methodes d'analyse des niveaux sanguins du VIH-1 (la virémie) permettent d e mieux définir la dynamique de Pinfection. Il existe au moins quatre approches pour la quantification des niveaux d'ARN du WH-1 dans le sang, soient le *Quantitative Competi tive Polymerase Chain Reactiom (QC-PCR),le ~ N u c l e i c Acid Sequence-Based Amplification» (NASBA), le ~Branched-ChainDNA* (b-DNA) et la methode Amplicor. L'essai b-DNA, un peu moins sensible que les autres méthodes PCR mentionnées, permet de détecter une virémie aussi faible que 10 000 copies dlARN/rnl de plasma et produit une réponse linkaire sur une echelle atteignant un nombre de copies de plus d'un million [59]. Tel que décrit précédemment, lors de la pathogénèse du VIH-1, une augmentation de la charge virale corrèle avec une déplétion de lymphocytes T CD4+ et la progression de la maladie, cependant i1 existe peu d'informations sur la cinétique du tumover du virus et des lymphocytes T CD4+ in oivo. Les essais décrits ci-haut et l'emploi d'inhibiteurs puissants de la réplication du VIH-1 (de la transcriptase inverse e t de la protéase) qui pertubent le rapport de productionfélimination du virus ont permis de découvrir que lors du stade de latence il y a une force réplication du VIH-I in Diva. De plus, la virémie du VIH-1 est maintenue par u n mécanisme dynamique impliquant des cycles continuels d'infection et de réplication e t un tumover rapide de cellules. Enfin les chercheurs concluent que la source principale de la production virale doit résider dans une population d e cellules autre que les PBMC,telle que les cellules du système lymphoréticulaire [60,611. Des donntes supplémentaires sur la cinétique du VIH-1 in oioo démontrent que les cellules infectées ont en moyenne une durée de vie de 2.2 jours, les virions du plasma ont u n e durée de vie de 0,3 jours, la moyenne totale de production du VIH-1 est d e 10,3 X IO9 virions/jour, la durée minimale du cycle de vie du WH-1in oivo est d'une moyenne de 1,2 jours et le temps d e génération moyenne du VIH-1 est de 2,6 jours. Ces résultats clarifient plusieurs aspects de la cinetique de la pathogénèse du WH-1[ 6 2 ] . Jusqu'à tout récemment, le meilleur prédicteur de la progression de la maladie du SIDA demeurait le pourcentage ou le nombre absolu de cellules T CD4+ en circulation. Cependant, un marqueur pouvant aider à évaluer le risque impliqut avant une destruction considérable du système immunitaire était grandement souhaitable. Une Ctude recente suggère la virémie comme outil d e diagnostique dans la détermination du stade d e la maladie du SIDA car la charge virale (mesurée en concentration dtARN du WH-1) semble e n association ttroite avec la phase de la maladie [63]. Une étude subséquente a démontré que la charge virale du plasma &ait une technique plus fidèle que le décompte des cellules T CD4+ pour prédire l'évolution de la maladie et la mort chez les patients, incluant ceux pour qui le compte d e CD4 h i c normal. Donc, dans le milieu clinique, la virémie permet une meilleure dttermination du prognostique. Chez un individu donné, le compte en cellules T CD4+ se situant dans n'importe quel échelle de cellules T CD4+ est un faux indicareur du niveau de virémie. L'étude a démontré q u e les individus ayant une charge virale plus élevée lors de l'entrée dans l'étude (la date de primo-infection est inconnue et n'est pas nécessaire), progressent g6néralemenc plus rapidement vers la phase terminale du SIDA et la mort [63]. 1.1.5.3 La progression de l'infection La vue d'ensemble des dtficiences immunologiques: Le lymphocyte T4 est consideré comme la cellule essentielle lors de I'induction des fonctions immunologiques. Ainsi, une altération de sa fonction mène à une diminution des signaux inductifs aux autres cellules impliquées dans la réponse immunitaire. En conséquence, une anomalie générale immunitaire peut être causée par un défaut d'un type cellulaire [18]. Les mécanismes responsables d'effets cytopathologiques: II est connu que lors de la réplication active du WH-1, il y a mort de la cellule hôte. Cependant le mécanisme exact qui est responsable d e la diminution du nombre de cellules T CD4+ reste à clarifier. Une explication d e l'effet cytopathologique du VIH-1 serait une accumulation de grandes quantités &4DN viral non intégré dans la cellule infectee. Un autre mécanisme proposé est une perméabilité accrue d e la membrane cellulaire lorsque de grandes quantités de virus sont produites et que ces virus bourgeonnent à la surface cellulaire. Diverses évidences appuient l'hypothèse selon laquelle la molécule CD4 et l'enveloppe du virus ont des rôles dans l'effet cytoparhoiogique observé dans les cellules T CD4+ infectées. Il est possible que la densité du récepteur représente un facteur qui détermine la présence ou le degré de la cytopathologie du virion. Un mécanisme important dans la mon cellulaire par l'infection par le WH-1 impliquant la molécule CD4 et la protéine de l'enveloppe est la fusion cellulaire. Le niveau élevé d'expression du gène m du VIH-1 dans les ceHules T CD4+ infectkes mène la fusion cellulaire de la cellule infectee avec des cellules T4 avoisinantes non-infecttes. Le resultat est la formation de cellules géantes mulitinuclées (syncyrium) qui sont composées de cellules infectees e t non-infectées. La cytoi- yse et la mort des cellules fusionnees se produisent après environ 48 heures. Certains chercheurs ont suggéré une réponse autoimmune pour expliquer la c~topathologieassociee à l'infection par le VIH-1 1181. 25 Tous les effets cytopathologiques directs mentionnes ci-haut peuvent-ils expliquer e n totalité la dtplétion de cellules T CD4+? II semble que des mécanismes indirects soient aussi impliqués dans la déplétion progressive du nombre de cellules T CD4+. Cette hypothèse se fonde sur le fair que seulement une quantitt mineure d e cellules (1/105)dans le sang périphtrique expriment du virus peu importe le temps donne suite a l'infection. Mais il faut noter que des proportions de cellules plus importantes peuvent logées des vims en phase de latence [Ml. En plus d'une déplétion quantitative des lymphocytes TCD4+, un défaut fonctionnel de la cellule T CD4+ est une autre anomalie immunologique retrouvée chez les individus infectés par le WH-1. II a tte démontre que les sous-ensembles de cellules T CD4+ sont dtficientes dans leur rôle de reconnaissance et de réponse aux antigènes solubles chez les patients sideens et cecte déficience apparaît très tôt dans l'évolution d e la maladie [ 181. Les sidéens présentent aussi des anomalies au niveau de la fonction des cellules B qui se manifeste par l'activation polyclonale, I'hypergammagIobulinémie, les complexes immuns e n circulation et les autoanticorps. Le défaut humoral est manifesté surtout par son incapacite à produire une réponse d'immunoglobuline M (IgM) adéquate face & une provocation antigénique [18 ]. Le nombre de cellules marural killerm (NK) en circulation n'est pas réduite significativement chez les individus infectés et ces cellules se lient à leur cellules cibles comme en temps normal. Cependant, leur capacite cytotoxique est diminuée et ceci peut s'expliquer par un effet secondaire sur cette population d e cellules qui dépend des signaux inducteurs provenant des cellules T CD4+ déficientes [18]. Des preuves d e plus en plus nombreuses suggèrent un rôle majeur pour les monocytes/macrophages dans la propagation et la pathogénèse de l'infection au WH-1.Ces cellules phagocytaires peuvent intemaliser le virus. Certains sous-ensembles de monocytes expriment l'antigène de surface CD4 et peuvent donc se lier à l'enveloppe du VIH-1. Dans le cerneau, le monocyte/rnacrophage est le cype cellulaire majoritairement infecté par le VIH-1. Cet état de fait pourrait être responsable du dtveloppernent des manifestations neuropsychiatriques associées l'infection. De plus, les macrophages alvtolaires pulmonaires infectées jouent peut-être aussi un rôle dans la pneumonie inters titielle observe chez certains sidéens [64]. Parmi les anomalies fonctionnelles re~rouvéeschez les monocytes des patients sidéens, il y a un chimiotactisme déficient et une élimination amoindrie d e certains organismes. La déficience des signaux inducteurs de la cellule T4 et I'infection directe des monocytes sont probablement responsables de ces anomalies [64]. Le rôle majeur joué par les monocytes demeure le fait qu'ils servent de réservoirs pour le virus dans le corps. Contrairement au lymphocyte T4, le monocyte échappe aux effets cytopathologiques du VIH-1 de façon à ce que le virus puisse non seulement survivre dans la cellule mais se faire transporter vers une variété d'organes corporels tels que le poumon et le cerveau. En plus de véhiculer le virus à travers tout l'organisme, il est fort probable que le monocyte serve en tanc que producteur important de virions dans l'hôte infecté 1641. Les effets cytopathologiques de I'infection par le VIH-1 sont spécifiques pour les cellules qui expriment le récepteur viral CD4.Des chercheurs ont observe que suite à une surinfection et une accumulation d'ADN, il y a formation de syncytium e t la lyse cellulaire. Ceci n'est qu'un rnkcanisme qu'emploi le virus pour detruire le syst&meimmunitaire [64]. Parmi d'autres modèles qui tentent d'expliquer la diminution de la population de lymphocytes T CD4+ figurent I'apoptose ou la mort cellulaire programmée. Un groupe de chercheurs ont démontre qu'en oligomérisanc la gp120 sur les cellules T CD4+ et en activant le TCR ceci menait ii la mort cellulaire induite par activation. Cette mon avait les mêmes caractéristiques que I'apoptose. Ce phénomène est une forme active de la mon cellulaire physiologique qui requiert la synthèse d'ARN e t de proteines ainsi que l'activation d'endonucléases endogènes pouvant cliver la chromatine d'ADN entre les nucléosomes. Deux autres etudes appuient ce modèle. Le premier groupe a démontré que la population de cellules T CD4+ d'individus asymptomatiques infectes par le VIH-1 ne répondait pas aux stimuli via le TCR par des superantigènes ou par un mitog2ne car un processus d e mort cellulaire était en cours toujours avec les même caractéristiques que l'apoptose. Le second groupe a observé qu'en mettant cette population cellulaire en culture la mort cellulaire programmée se produisait [65-671. Enfin, un autre groupe propose un modèle impliquant les superantigènes pour expliquer cette mort ou délttion de cellules T CD4+. Ce groupe a observe qu'il y avait une délécion de sous-population de cellules T qui expriment certains VB donnés chez les personnes infectées par le WH-1.Ils suggèrent que le virus code un superantigène qui envoit un signal d'anergie en intéragissant spécifiquement avec I'ensemble des stquences VB et élimine ce groupe de cellules 1681. Cependant, il s'avère nécessaire de mentionner que d'autres hypothèses existent qui décrivent la déficience immunitaire occasionnée suite à une infection au WH-1 mais elIes ne seront pas élaborées puisque le sujet dépasse les limites de cet ouvrage. Une réponse conventionelle de l'hôte contre l'infection virale est la production d'anticorps qui s'attachent au virus et l'inactivent ou le neutralisent. La cible majeure des réponses d'anticorps humoraux demeure l'enveloppe du VIH-1. Les protéines que Iton croit surtout impliquées dans cette neutralisation sont la gp120, la portion externe de la gp41 et même la protéine du noyau p17. Plusieurs chercheurs ont trouvé la présence d e faibles niveaux d'anticorps neutralisant anti-VIH-1 chez des individus infect&. Ces observations peuvent refléter le fait que le virus échappe à la neutralisation par la rtponse immunitaire humorale. De plus, lors de la progression de la maladie, les anticorps neutralisants semblent être remplacés par des anticorps eenhancing. pouvant favoriser l'infection [8]. Certains anticorps (isotypes IgGl ) dirigés contre les pro ttines de l'enveloppe gp 120 et gp41 induisent la réponse cytotoxicité cellulaire anticorps dependante (ADCC). Lors de ce processus, les cellules qui ont iileur surface un anticorps lie à un antigène sont reconnus par les cellules effectrices NK qui porrent les récepteurs Fc ou par d'autres monocytes et sont détruites par un mécanisme cytotoxique impliquant probablement des cyrokines. Les chercheurs ont observé qu'il existe une diminution de la fonction d e ce type cellulaire surtout avec la progression de la maladie lors d'infection par le WH-1, et ceci semble refléter une réduction de la production du facteur cytotoxique NK e t une distribution défective de la cubuline [8]. Dans les individus infectes par le VIH-1, on a rapporte la présence d'anticorps pouvant rehausser l'infection virale via soit le récepteur du complément ou soit le récepteur du Fc. Ces complexes virus-anticorps e n circulation sont infectieux e t ne sont pas détruits dans les lysosomes des macrophages. La raison pour cet état d e fait réside dans l'affinité relative que possède l'anticorps pour la protéine d e l'enveloppe virale e t la manière avec laquelle les complexes sont dissociés afin de devenir infectieux à l'intérieur de la cellule. D'autres études indiquent que certains anticorps neutralisant ou non peuvent lyser le VIH-1 par la fixation du cornplCrnent [8]. Les reponses cellulaires des CD4+ semblent aussi diminuées tôt lors d e l'infection par le WH-1. Les cellules T CD4+ humaines peuvent être divisées e n deux groupes, les T H 1 et les TH2. Les cellules TH1 secrètent l'IL2 e t I'IFN-y, alors que les cellules TH2 secrètent I'IL4, l'IL5 et l'IL-IO. On a emis I'hypoth2se voulant que les cytokines de ces deux sous-ensembles jouent un rôle immunorégulateur dans l'infection par le VIH-1 et peuvent agir sur la progression vers le SIDA [SI. En plus des cellules NK, une autre composante du systerne immunitaire contrôle les celIuIes infectées par un virus, à savoir les cellules CD8+ cytotoxiques (CTL). La réponse 2! classique dépend du HLA et requiert un contact cellule-cellule. Cette rtponse joue probablement un rôle considérable dans le contrôle de l'infection par le VIH-1. L':étude d e cette réponse antivirale indique que les lymphocytes CD8+ peuvent tuer des cellules qui expriment plusieurs différentes protéines du VIH-1 telles que la R T I'W le noyau et les protéines accessoires. Ces CD€?+ se trouvent en grand nombre à la période asymptomatique mais diminue du moins dans leur activité antivirale avec la progression de la maladie. Pour le moment, le rôle des CTL n'est pas bien défini dans l'infection par le W H 4 [8]. En plus d'avoir une propriété cytotoxique, les cellules CD8+ peuvent supprimer la réplication du VIH-1 dans les cellules CD4+ et ceci sans affecter des marqueurs d'activation sur les cellules CD4+ ni tuer les cellules infectées par le virus. Cette suppression paraît être avant ou pendant la transcription de I'ARN et peut impliquer une cytokine produite par les cellules CD8+. Son activité varie selon les sujets et décroit dans les patients atteints du SIDA. Cette perte d'activitt n'est pas bien comprise et peut refléter soir une rkduction du nombre d'un sous-ensemble cellulaire particulier ou une perte de sa fonction [8]. 1.2: L'incorporation des molécules de la cellule hôte à la surface de la particule du VIH-1 1.2.1 La découverte du ph6nomene Tel q u e mentionné dans la section 1.4.6, au moment du bourgeonnement du VIH-1 à la surface de la cellule hôte, le virus acquiert une partie de la membrane cytoplasmique. Lors de ce processus, les protéines virales gp120 et gp41 semblent prc5férentiellement incorporés. Cependant plusieurs ttudes dtmoncrent qu'une varitté d e protéines cellulaires sont aussi incorporées. Par exemple, les premiers tests enzymatiques (ELISA) sur les sérum de patients pour la détection des anticorps anti-WH-l ont révélé la présence de plusieurs faux-positifs. Ces patients n'étaient pas infectés par le VIH-1 mais avaient dans 30 leur sérum des anticorps anti-HLA-DR4. Des études subséquentes ont demontré qu'il s'agissait d'anticorps allospécifiques. Ces anticorps peuvent être produits lorsqu'une personne reçoit une transplantation ou une transfusion. Les anticorps reconnaissaient le CMH contenu dans les stocks viraux utilists pour ces tests [ 6 9 ] . Ces stocks viraux provenaient des cellules humaines et de ce fait, les vinons avaient incorporés des molécuIes celluiaires qui ont servi de cibles pour les anticorps allospécifiques [70-721. Le phénomène a été observé non sedement chez le VIH-1 mais aussi chez le VIS [72]. Avant même la découverte du phénomène d'incorporation chez le WH-1, plusieurs études ont identifié un phénomène semblable chez d'autres virus tel que le HTLV-1. Il semble que lorsque ce virion bourgeonne, il accapare préférentiellement le récepteur de - l'interleukine-1 ou le T-ceIl growth factor (TCGF), l'antigène Tac [73]. De la même manière, un groupe de chercheurs a observé que les virus à ARN tumorigène, -feline oncornaviruses~ (FeLV) cultivés dans une lignee cellulaire lymphoblastoïde humaine incorporaient dans leur enveloppe des albanrigènes HLA [74]. Des études plus anciennes ont démontré que les molécules du CMH sont aussi incorporées dans le virus de la leucémie de Friend (FV) lorsque les particules virales sont produites sur des cellules murines [75],ainsi que par un virus aviaire [76].Des travaux aussi accomplis par le groupe étudiant le FeLY ont prouvé qu'il est possible de neutraliser le virus iil'aide d'antiséra félin dirigé contre des ailoantigènes de leucocytes [77]. Des molécules cellulaires de l'hôte telles que la 82-microglobuline (02m)[78]et un isoforme distinct de l'actine [79] ont aussi étE retrouvé chez le cytomégalovirus humain (CMV) de la famille des Herpesviridae. En ce concerne le WH-1,il existe une multitudes de preuves appuyant le concept d'incorporation de molécules cellulaires d e l'hôte par le virus. Voici des exemples de molécules: plusieurs déterminants du CMH II (HM-DR, HLA-DP et HM-DQ), 31 DZ-microglobuline, 0 4 3 , CD55, CD59, CD63, CD71 et les molécules d'adhtsion ICAM-1, LFA-I et CD44 [70-72,BO-901. Toutefois, il semble qu'il y a une certaine sélectivite l'égard de l'incorporation d e molécules par le VIH-I c'est-à-dire que seulement quelques types moleculaires de la surface cellulaire d e l'hôte sont incorports. Une équipe de chercheurs ont examine I'associacion d e protéines cellulaires de Shôte avec le VIH et le VIS. Ils ont trouvé que le niveau d'expression d'une molécule ne prédit pas correctement son niveau d'incorporation. Par exemple la protéine tyrosine phosphatase transmembranaire, CD45,n'est pas incorporée même s'il s'agir de la molécule en plus grand nombre à la surface des leucocytes [91]. 1.2.2 Le rôle des molecules incorporées Plusieurs scientifiques suggèrent des rôles fonctionnels pour les protéines de la cellule hôte acquises par les virions. Lors des premières études examinant cette question, des chercheurs ont postulé que les molécules incorporées avaient des effets sur le rropisme viral et la progression de l'infection [73. 771. En outre, dans le cas de la 82-microglobuline capturée par le CMV,les chercheurs suggèrent qu'elle aurait peut-être un rôle protecteur contre la neutralisation [78]. Concernant le WH-1,de plus en plus d e preuves sont avancées pour appuyer I'exis tence d'un rôle pour ces molécules cellulaires incorporées. Afin de me ttre l'accent sur les fonctions plausibles au moment de l'attachement e t de la fusion du virus à la cellule cible, les études citees ci-après traitant de ces étapes précéderont les études portant sur toutes les autres étapes. 1 2.2.t Les fonctions lors de l'attachement, l'entrée Les molécules d'adhésion sont parmi les molécules retrouvées à la surface virale. En temps normal, elles permettent aux cellules de se rapprocher et de s'adhérer entre elles. Donc, il est plausible qu'elles occasionnent une meilleure adhésion du virus à sa cellule cible. Cependant, deux conditions doivent être remplies pour que ceci se produise; il est nécessaire q u e la molécule incorporee soit dans son eut actif et que la cellule cible exprime à sa surface son contre-recepteur. II est concevable que les molécules d'adhésion auraient un rôle majeur à jouer au moment d e l'attachement du virus à sa cellule cible puisqu'un a sheddingw ou perte de la protéine virale gp 120 se produit régulièrement [92]. Parmi les quelques études qui ont prouvées un rôle pour ces molécules d'adhksion au stade de l'attachement, l'étude de rkférence est celle par Arthur et son kquipe. 11s ont établi d'une manière évidente I'existence du phénomène d'incorporation des molécules HLA-DR et B2-microglobuline. En plus d e cela. ces scientifiques ont réussi à inhiber I'infection par le virus avec des anti-sera dirigés contre les molCcules en question [8O].Grâce à cette étude et le principe qu'elle soulève, il a été possible de concevoir une forme d e vac- cination innovatrice. L'équipe de Castilleti ont trouvé un moyen de rendre le virus plus infectieux. Il est connu qu'en traitant la lignée U937 avec l'interféron-y (IFN-y), ceci mène à une hausse de l'expression des molécules de surface H U - D R et ICAM-1, deux molécules d'adhésion. En cultivant du virus dans ces conditions, ils ont obtenu une souche plus virulente pour les cellules-CDCnégatives que la souche originant de cellules non-traitees [84]. Une autre étude suggère que la molécule CD44 incorporée favorise un meilleur attachement du virus aux cellules ayant le récepteur de la molécule [93]. Certains chercheurs ont démontré que les molécules incorporées peuvent influencer indirectement le processus d'attachement et d e fusion. Par exemple, le prétraitement de cellules avec des anticorps dirigés contre des molécules d'adhésions peut inhiber l'infection 1941. Conséquemment, l'on peut penser que les molécules la surface cellulaire jouent le rôle de récepteurs de proteines présentes à la surface virale. Les travaux d'une autre équipe de chercheurs appuient la notion d'un rôle majeur des molécuies 33 d'adhésion incorporées par le VIH-1. En ajoutant d e l'anticorps anti-LFA-1 a un sérum neu- tralisant, ils ont rehaussC son pouvoir neutralisant [95]. Le phénomène d'incorporation de moltcules cellulaires de l'hôte dans l'enveloppe du VIH-I est mal défini. Par exemple, peu d'équipes d e recherche ont etudié le phénomène d'incorporation au niveau quanti tatif. On assumair d'après quelques observations que le niveau d'incorporation pouvait être modifié dtpendamment du type cellulaire [96]ou encore de l'ktat de la cellule [Ml.Ces études ont contribué e n quelque sorte à nos connaissances du phknomène d'incorporation e n identifiant des paramttres ii evaluer. II reste à savoir la nature precise d e ces paramètres. Notre propre équipe de recherche a déjà réussi à démontrer plusieurs faits au sujet d e l'incorporation. Parmi les molécules de surface d e la cellule hôte, nos données indiquent que les molécules HLA-DR du CMH-II sont les plus nombreuses. Les isotypes HLA-DPet DQ sont aussi presents mais en plus petites quantités. De plus, nous avons trouvé que l'incorporation dCpend à la fois de la souche virale et de la lignée cellulaire productrice [811. En ce qui concerne le rôle joué par les molécules du CMH-II au niveau de I'infectivité virale, nous avons noté une augmentacion du rapport vitesse/efficacité d e I'entrEe virale. De plus, la cinétique de l'infection était plus rapide. Donc, la molécule est fonctionelle et a un rôle à jouer dans les événements prkcoces du cycle de vie du WH-I [97]. Suite à cette étude, nous avons trouvé que le HLA-DR du CMH &ait responsable de la modification observée dans le cycle réplicatif du virus. Nous demontrons que le HLA-DR1 rehausse I'activite du WH-1. L'infectivité a augmente d'un facteur d e 1,6 2,3 e t avons trouvé une cinttique d'infection virale plus rapide 198). Nous concentrons aussi nos effort sur la recherche du rôle de la molécule, ICAM-1. Nous lui avons déterminé un rôle fonctionnel lorsqu'elle est incorporée dans . 34 l'enveloppe du WH-1 1991. Cette molécule augmente l'infectivité du virus de 4,6 à 9,8 fois en se liant à son récepteur LFA-1 sur les cellules cibles. En étudiant la cinétique de l'infection, on a conclu que l'effet positif était probablement associe A une augmentation de l'efficacité des étapes précoces du cycle rtplicatif du VIH-1. 1-2.2.2 Autres fonctions des mol6cules incorpor6es Dans la section précédente, les rôles fonctionnels dans l'attachement et I'entree virale des molécules incorporées ont é t é abordés. Ici, il sera plutôt question d e leur rôles dans d'autres étapes. En premier lieu, les molécules incorporees peuvent avoir une fonction protectrice comme c'est le cas pour le CD55 e t le CD59 présents A la surface virale. Ce sont des protéines de contrôle du complément, liées au GPI. Elles confèrent une certaine protection au virus contre la virolyse par le complément [90]. De plus, une expérience révèle que les molécules HLA-DR incorporées à la surface virale peuvent présenter des superantigènes aux lymphocytes T [100]. Dans la section 1.5.3, ce point a été soulev6 comme un moyen que possède le virus pour éliminer l'ensemble des lymphocytes T CD4. 1.3: Les objectifs de recherche Grâce aux études précédentes sur le phénomène d'incorporation d e molécules de l'hôte dans l'enveloppe du VIH-1, nous avons maintenant une meilleure compréhension du sujet. Mais en ce qui concerne le HLA-DR il reste des questions auxquelles il faut répondre telles que 1) Quel est le niveau d'incorporation des différentes allèles du HLA-DR? 2) Quel rôle joue le polymorphisme du HLA-DR incorport5 dans le contexte de 11infectivit6 du VIH-l? Afin de clarifier ces points nous avons exécuté des expériences quanti tacives et qualitatives qui sont décri tes ci-dessous. 1.3.1 Les études quantitatives Notre premier objectif t t a i t de mesurer le niveau d'incorporation par immunocapture et ultracentrifugation des molécules HM-DRI, -DR4 et -DRw53 sur les particules du VIH-1 par le biais de stocks viraux produits qui ont incorpores une des trois molécules. 1.3.2 Les études qualitatives II a déjà été question de l'importance accordée aux moltcules incorporées dans le cycle replicatif du WH-1 à la section 2.2. Plus précisément, il est connu que les molécules HM-DR polymorphiques ont une affinité differente pour le CD4 et que le HM-DR est I'isotype principalement incorpore dans t'enveloppe virale [81, 1011. Prenant ces faits e n considération, nous avons choisi d'analyser d e quelle maniére la présence des différents allèles du HLA-DRmodifient les propriétés biologiques des panicules virales du WH-1. 1.3.3 Les glycoprotéines du CMH-II Ce sont les molécules du CMH-II qui constituent la majoritt des protéines cellulaires présentes dans l'enveloppe du VIH-1 [71, 72, 801. La fonction physiologique des molécules du CMH-II est de présenter à la surface des CPA des peptides principalement d'antigènes extracellulaires afin qu'ils soienr reconnus par les cellules T auxiliaires CD4+. L'on porte beaucoup d'intérêt sur la présence physique des molécules du CMH-II dans l'enveloppe lipidique du virus étant donné que le CMH-II et le VIH ont quelque chose e n commun, la molécule CD4 sert d e recepteur dans les deux cas [102]. Les moltcules du CMH-IIsont des glycoprotéines hétc5rodimèriques polygéniques et polymorphiques. L'isotype HLA-DR a un gène codant pour sa chaîne a (34 kDa) et trois possibilités de génes codant pour sa chaîne B (28 kDa).Elle est polyrnorphique, c'est-à-dire qu'elle a plusieurs allèles pour ses chaînes B. La molécule CMH-II est exprimte à la surface 36 des cellules CPA telles que les cellules T (activées i , h o ou in uitro), les cellules B, les rnonocytes/macrophages, les cellules c5pithCliales du thymus, les cellules de Langerhans, les cellules dendritiques et les microgliales [ 1031.11 est donc fon plausible que le VIH-1 incorpore ces molécules lorsqu'il bourgeonne car ce dernier infecte préférentiellement les cellules T activkes [104], les macrophages [ 105-1071 et les cellules de Langerhans [108]. Nous avons donc vérifié si les molécules polymorphiques HLA-DRI, HLA-DR4 e t HIA-DRw53peuvent faire varier les propriétés biologiques du WH-1, particulièrement au niveau d e I'infectivi te. Chapitre 2 : Matériels et méthodes 2.1: Les cellules Les cellules RAJI sont une lignée d e lymphocyte B qui contient le virus Epstein-Barr et des chercheurs ont rapporté qu'elles expriment un niveau éleve des molécules du CMH- II à leur surface 11091. Le Dr. R-P. Sékaly a fourni les cellules RAJI (Institut de Recherches Cliniques d e Montréal, Qué., Can.). Les ceIIules Sup-Tl [Il01 sont des cellules T qui expriment un faible niveau des molécules du CMH-II (résultars non publiés). Les cellules lymphoïdes CD4+ humaines Jurkat-tat [ I l l ] expriment la protéine transactivatrice, Tat, du VIH- 1. Nous avons culrivé cou tes les cellules mentionnées ci-hau t dans un milieu de culture RPMI-1640 (Gibco-BK, Burlington, Ont., Can.), contenant du sérum de veau foetal 10% (SVF;Hyclone Laboratories, Logan, Ut., US.), de la glutamine (ZmM), de la pénicilline G (100 U/ml), et de la streptomycine (100 pdml). Ces lignées cellulaires ont éte obtenues du AIDS Research and Reference Reagent Program, AIDS Division, Narional Instim te of Allergy and Infeccious Diseases, NIH (Rockville, MD., US.). La lignée cellulaire 293'13 qui exprime l'antigène grand T du virus simien 40 [Il21 a été cultivée dans le milieu <<Dulbeccomodified Eagle medium. (DMEM, Gibco-BRL, MD., US.) contenant du SVF IO%, de la glutamine (ZmM), de la pénicilline G (100 U/mI), et de la streptomycine (100 &ml). Les cellules 293T n'expriment pas de molecules du CMH-II (résultats non publiés). Le Dr. W C. Greene a fourni les cellules 293T (Institut Gladstone, San Francisco, Ca., US.). 2.2: Les plasmides Les vecteurs d'expression eukaryotique pRSV5 neo DRa, qui code pour la chaîne a monomorphique du H U - D R 1113) et pRSV3 neo DRIB, DR670 (DR4B), et DRwS3B, qui codenc chacun pour la chaîne B polymorphique du HLA-DR [114] sont des dons du Dr. R.-P. Skkaly (Institut de Recherches Cliniques de Montréal, Qut., Can.). Les deux r. gènes HLA-DR sont sous le contrôle d u LTR du virus du sarcome d e Rous. Le plasmide proviral pHXB-Luc origine du plasmide pHXB-2D dans lequel le &ne nef a t t é délétk et remplacé par le gène rapporteur de la luciferase [Ils]. Le Dr. D. Baltimore nous a fourni c e clone moléculaire infectieux du VIH-1 (Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Ma., US.). 2.3: La préparation des stocks viraux par transfection Toutes les transfections ont étC exécutées selon un protocole modifié de transfection au calcium phosphate [116]. Une expérience typique de transfection a été effectuée e n utilisant 10 pg de pHXB-Luc en présence ou absence de 1,25 pg d u plasmide p W S neo DRa e t un des trois plasmides pRm3 neo DRIB, DR4B ou DRw530. Les préparations plasmidiques ont été mélangées avec 25 pl de CaCl, 2,5 M et le volume a t t é complété à 250 pi avec d e 11H20.Cette préparation d'ADN a et6 ajoutée délicatement à 250 pl du tampon HBS 2x (pH 7,05)(NaCl 280 mM,HEPES 50 m M et Na,HPO, 1,s mM),et incubée à la température d e la piéce pour 4 min. La solution totale a été déposte sur une monocouche semi-confluente d e cellules 293T qui ont été préincubées 24h avant I'iniriation d e la transfection dans des plaques de six puits (Falcon, Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ., US.) (5xlOS/puits dans 3 ml d e DMEM, 10% SVF). À 16h post-transfection, les cellules ont été lavées deux fois avec 3ml du tampon PBS (Phosphate buffered saline) (pH 7,4) et ont t t C incubées pour 24h dans 3 ml de DMEM contenant 10% d e SVE Les surnageants contenant les virions ont été filtrés à travers une membrane d'acétate cellulaire (de faible liaison protéique) de 0,45 Pm (Millipore, Bedford, Ma., US.), aIiquotés en fractions de 500 pl et congelés ii -85°C jusqu'à leur utilisation. Tous les stocks viraux ont été standardisés pour le contenu e n virions à l'aide d'un essai commercial pour la proteine p24 (Organon Teknika, Durham, NC., US.). La standardisation e n terme du contenu e n p24 est basé sur l'observation suivante: dans d e telles préparations d e virus, la grande majorkt5 de la protéine p24 virale est associee aux particules VIE-1 entières. En effet, notre équipe a dejà évaluC que plus de 95% de la p24 est culotable e n se servant de conditions d'ultracentrifugation suffisantes pour stdirnenter des virus entiers. (Heraus mode1 Contifùge 28RS. 12000 rpm pour 90 min. à 4°C). Les quantités de pz4 obtenues dans les préparations HXB-Luc (sans cellules) suite à ces expériences de transfection variaient entre 100-500 nglmi. La CO-transfectionde pHXB-Luc, p W S neo DRa et pRSV3 neo DRlB, DR4f3, ou DRw53B a mené ii la production des stocks viraux nommés HXB-Luc HLA-DRl/POS, -DR4/PûS, ou -DRw53/POS puisque ces virions possèdent la molécule allèlique HLA-DR provenant de I'hôte. La transfection de cellules 293T uniquernenc avec le pHXB-Luc a mené à la production des préparations virales nommées HXB-Luc HM-DR/NEG puisque les glycoprotéines HLA-DR ne sont pas incorporées dans l'enveloppe d e tels virions. 2.4: Les anticorps Lors d e nos études, nous avons utilisé, l'anticorps monoclonal 31-90-25, qui reconnaît la protCine majeure p24 de la capside du VIH-1, l'anticorps monoclonal L243,qui est sptcifique pour un déterminant nonpolymorphique du dimère du HLA-DR [117] e t l'anticorps monoclonal 2.06, qui est dirigk contre le HU-DR monomorphique [118]. Tous ces anticorps monoclonaux ont été isolts de surnageants de cultures d'hybridomes ec purifiés par la chromatographie d'affinité avec la protéine G-Sépharose selon les instructions du manufacturier (Gibco-BRL). Les hybridomes ont été obtenus de I'herican Type Culture Collection (Rockville, MD., US.). 31-90-25 et L 2 4 3 ont été biotinylts en s e servant du NHS-LC-Biotin suivant les instructions du fournisseur (Pierce, Rockford, Il., US.). 2.5: L'analyse par cytofluorométrie des antigènes a la surface cellulaire - -- - - -- - - L'expression des HLA-DRl, HLA-DR4 et HM-DRw53 à la surface de cellules 293T transfectées de façon transitoire a été mesurée au moyen d'un anticorps anti-HM-DR, le L 243. Brièvement, IO6 cellules 293T transfectées ont été incubtes pour 30 min. ii 4°C avec 100 pl de PBS contenant 1 pg de L-243,suivi de deux lavages au PBS 500 pl. Les celluies du culot ont t t 6 resuspendues dans 100 pl d e PBS contenant 1 pg de I'anticorps d e chihre anci-souris immunoglobuline G conjugué au ffuorescCine isothiocyanate (FITC) (IgG; Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Wesr Grove, Pa., US.). Enfin, les cellules ont ét6 lavées deux fois dans du PBS ec ont ét6 resuspendues dans 300 pl PBS contenant 1% (w/vol) paraformaldéhyde avant l'analyse par cytofluorométrie (EPICS XL; C o d ter Corporation, Miami, FI., US.). Les contrôles consistaient e n l'utilisation d'anticorps monoclonaux commerciaux du même isorype e t non spécifiques (Sigma, Sc. Louis, Mo., US.). 2.6: L'immunodétection des molécules cellulaires HLA-DRI, HLA-DR4 et HLA-DRw53 acquisent par le virus La présence de glycoprotéines HLA-DRl, -DR4 et -DRw53 de l'hôte. sur les particules VIH-1 produites par transfection transitoire des cellules 2931, a été mesurée en se servant de billes magnétiques liées à des anticorps tel que décrit auparavant [8l]. Brièvement, 12,5x106billes magnétiques (Biomag, Fc specific, PerSeptive Diagnostics Inc., Cambridge, MA., US.), déjà liées à l'anticorps anti-HIA-DR 2.06, ont 6cé incubées avec des quantités équivalentes de virus HXB-Luc HLA-DRI/POS, -DR4/POS, -DRw53/POS, HXB-Luc HM-DRINEG ou un contrôle positif, NIA-3, exprimant un niveau élevé de HLA-DR dilué 1/10, standardisés e n terme de la protéine de la capside p24 virale (2,500 pg de pZ4) dans un volume final d e 1 ml du milieu d e furarion (PBS + 0,1% albu- mine de sCmm d e veau). Le mélange de billes e t de virus a ttt5 incube pour l h à 4°C sur une plaque rotative. Les billes ont été lavées cinq fois dans le milieu de fixation avec un système d e séparation magnétique et ont t t é resuspendues dans 100 pl du milieu d e f u t i o n . La quantité d e particules VIH-I immunocapmrtes a t t e evaluée en mesurant le contenu en protéines p24 virales associkes aux les billes magnétiques. 41 2.7: L'ultracentrifugation des particules virales La quantite de HLA-DRl, HIA-DR4, HLA-DRw53 et de pz4 associees au virus en entier a été déterminée au moyen de 100 pl d'un gradient de sucrose 20% qui a tté ajouté Zi 500 pl de sumageant filtré provenant de la culture de cellules 293T transfectes avec le pHXB-Luc et le p m 5 neo DRla et pRSV3 neo DRlB, DR4B, DRw53B. Ce mklange a été ultracentrifugé 12000 rpm, pour une durée de lh30 à 4°C. Suite cela, 500 pl de sumageant a été rtcuptré, le IO0 pl de gradient de sucrose a été jeté, et le culot a 6té resuspendu dans 100 pl de RPMI-1640. Le culot e t le sumageant ont et6 évalués pour leur composition en terme de p24 à l'aide d'un essai commercial pour cette protéine (Organon Teknika, Durham, N.C., US.) et en terme de HLA-DR à I'aide d'un essai mis au point par norre equipe. En bref, 5 &ml d'un premier anticorps de souris anri-HM-DR, DA6.147, dans 0,l M de campon de carbonate-bicarbonate (pH 9,6)a été mis dans des plaques ~ m i c m t i t r e s ~ ELISA (Immulon 2, Dynatech, US.). Ces plaques ont tté incubées la nuit ii 4°C. Ensuite, les plaques ont été lavées trois fois avec le tampon PBS contenant 0,0596Tween 20 (PBST). Les sites non occupés ont été bloqués par du PBST contenant 1% BSA (Albumine de sérum bovin) . et les plaques ont tté incubées à 37°C pour 30 min. Par la suite, les plaques ont été lavées trois fais à nouveau. Une solution stock standard de HM-DR purifié a été ajouté en duplicata d'une stne de sept concentrations, la première de 62,5nglml, la suivante d'une dihtion de 1/2 ainsi de suite. Les échantillons des molécules HLA-DR associées aux virus ont été dilué et ajouté aux puits pures et 1/10 e n duplicata dans du PBST contenant 1,0% BSA. Un tampon de lyse PBST contenant 0,5% Triton X-100 et 0,2% thimerosal à une concentration de 1/5 avant une incubation à 37°Cpour 60 min. . Les plaques ont été lavées à nouveau et un deuxième anticorps de souris anci-HM-DR biotinylé, L-243, a été ajouré (1:2000). Suite à une incubation de 60 min. à 37'C, les plaques ont é d lavées avec du PBST et un conjugué streptavidine-peroxidase de raifort a tté ajou tC (1:8OOO). Après 30 min. d'incubation ii la température de la pièce, le substrat d e peroxidase T M B a &téajouté et les plaques ont tté incubées pour un autre 30 min. B la température de la pièce. La réaction a été arrêtee en ajoutant 1M H,PO, e t I'absorbance à 450 nm a été mesurée à l'aide d'un lecteur de plaque microtitre. 2.8: L'infection virale et l'essai de la luciférase Dans une plaque de culture tissulaire à fond plat de 96 puirs (Microtest III, Wlcon. Becton Dickinson, Lincoln Park, N.J., US.), 1x105cellules cibles ont été incubées à 37'C dans un atmosphere de 5% CO2 avec des quantités 6quivalentes d e HXB-Luc HLA-DRl/POS, HM-DR4/POS, HM-DRw53/POS ou HLA-DWEG (1,s ng de p24) dans un volume final de 200 pl de milieu de culture supplémenté. Après une période d'incubation de 72h. l'activité de la luciférase a étC évaluée de la même façon que décrite auparavant [119]. Briévernent, 100 pl de surnageant sans cellules a &té prélevk de chaque puirs et 25 pl de tampon de lyse de la culcure cellulaire 5x (125 m M Tris phosphate [pH 7,8], 10 m M DTT, 5% Triton X-100, et 50% glycérol) a et6 ajoute avant l'incubation à la température de la pièce pour 30 min. Par la suite, un aliquot de lysat cellulaire (20 FI) a été melangé à 100 pl de tampon d'essai de la luciférase [20mM Tricine, 1,07 mM (MgCOJ4. Mg(OH)Z.5H30, 2,67 m M MgSO,, 0.1 mM EDTA, 270 pM coenzyme A, 470 pM luciférine, 530 y M ATP, et 33,3 mM DTT]. L'émission de la Lumière produire par la réaction a été mesurée au compteur de liquide à scintillation (modèle LS 6500TA; Beckman Instruments Canada Inc., Mississauga, On., Can.). Chapitre 3: Résultats La prodwtim de nirions HXB-Luc qui dr%fmmt pur hz p r k t ou Eab=e de chuune ah g/rcoprotetm dë15~é.kde thôte HU-DRI, HHLDR4 et HU-DRaP53. Afin de verifier si l'incorporation de ces divers allèles peuvent modifier I'infectivite du VIH-1, nous avons développé un système d'expression transitoire qui a permis la production d e particules virales infectieuses possédant ou ne possCdant pas à la surface un des trois allèles e n question provenant de la membrane cellulaire. Dans cet essai, des vinons dépourvus de la molécule HLA-DR polymorphique ont été produits par une transfection d e cellules 293T avec un clone moléculaire infectieux du génome du VIH-1 tandis que les virions pourvus de soit la molécule HU-DRl, -DR4, ou -DRw53 ont ét6 produits par une CO-transfectionavec le même clone proviral du WH-1ainsi que des plasmides codant pour la chaîne a du HLA- DR et pour la chaîne f3 de soit la molécule HLA-DRI, HLA-DR4ou HLA-DRw53. Les préparations virales d e telles transfections cellulaires nous ont permises de déterminer si les propriétés intrinsèques du WH-1 sont influencées par l'acquisition des trois types d e glycoprotéines HLA-DRdérivées de l'hôte de la même manière. En vue de mesurer quantitativement tout changement dans les étapes prbcoces du cycle réplicatif du VIH-1, nous avons profité du clone moleculaire HXB-Luc, dans lequel le gène nCfa été partiellement délété et remplacé par le gène rapporteur codant pour la luciférase. Suite à la transfection dans une lignée cellulaire productrice, ce clone moléculaire conduit à la production d e virus infectieux. De plus, ces virus peuvent être utilisés pour infecter les cellules exprimant le récepteur CD4 et le degré d'infection peut ê t r e analysé quantitacivement en mesurant l'activité d e la luciférase. Les panicules recombinantes du VIH-1 codant pour la IucifErase (HXB-Luc) pourvues ou non d e la molecule HLA-DR polymorphique dérivEe d e la cellule hôte, ont été générées par la transfection au calcium phosphate d'une lignée cellulaire humaine embryonnaire de rein, 2931: Il n'y a aucune expression dttectable des isotypes du MHC-II (HM-DR, -DP ou -DQ) dans ces cellules (données non montrées). L'expression des allèles du H U - D R à la surface des cellules 293T a tté accomplie en transfectant p W 5 neo DR a et p W 3 DR1 i3, piWLneo DR67 û (DR4B) ou p w n e o DRw53 O. En se semant de ces vecteurs d'expression de mammifères on obtient une expression de surface du HU-DR1, -DR4 ou -DRw53 e t a m donnt que le polymorphisme allelique du HM-DR est situé dans la chaîne f3 tandis que la chaîne a est monomorphique [120]. La prochaine Crape a été l'analyse par cytofluorométrie dans le but d e vérifier Irexpression adtquate des allèles du HLA-DR la surface des cellules 2933 transfectées de façon transitoire. Comme l'indique la Figure 6, aucun allele n'était detectable sur les cellules 293T seulement transfecdes avec le pHXB-Luc (Fig. 6A) alors que la grande majorité des celIules 293T sont positives pour la molécule HLA-DRl, -DR4 ou DRw53 suite à la cotransfection avec soit le pHXB-Luc, p W 5 neo DR a e t pRSC! 3 DR1 B ou pRSI! neo DR67 B ou pRSI! neo DRw53 i3 (la valeur moyenne de la fluorescence est 6,9, 9 3 , 7,9 respectivement) (Fig. 6B, C, D). Dans une étude précédente, notre équipe a obtenu des cellules 293T exprimant le HU-DR1à un haut niveau (95%) et exprimant du virus à un niveau de 88%. On a assumé qu'étant donné le pourcentage plus Clevé de ceIlules exprimant le HM-DR1 que les cellules exprimant du virus, c'était raisonable de déduire qu'un haut pourcentage de particules HXB-Luc seront relarguées d e cellules 293T HLA-DR1 positive [98]. Cette étude nous permet donc de postuler que la même situation prévaut dans la présente étude. Afin de s'assurer q u e les vinons produits des cellules 293T exprimant un des trois allèles ont acquit correctement ces différentes composantes d e la surface cellulaire d e l'hôte, nous avons réalisé des c h d e s d'immunocapture de virus à l'aide de billes magnétiques liées à un anticorps spécifique pour la molécule d'interêt. Après plusieurs lavages des billes magnétiques, nous avons mesuré les virus captures e n mesurant le contenu e n p24 avec un essai enzymatique. Pour faire ce test, les billes magnétiques ont été liées avec l'anticorps monoclonal 2.06 qui est difige contre un épitope monomorphique du HLA- 4 D R En parallèle, le contrôle négatif consistait de billes magnttiques coupltes à 110RT3,un anticorps spécifique pour une mol6cule absente de la surface des cellules 293T (données non montrbes) . Figure 6 :L'analyse par cytofluoromttrie des cellules 293T transfectees avec le p m - L u c et les plasmides codant pour la molécule HU-DR1, HU-DR4ou HM-DRw53 Cellules positives L'analyse par cytofiuorométrie des ccllulcs 293T rransfectics avec Ic pHXB-Luc et l'un Figure 6 des plasmides codanr la molCculc HLA-DRI, HLA-DR4ou HM-DRw53. Les cellules 293T ont Cc6 transfecttcs avec le pHXB-Luc (A) ou CO-transfcctbcsavec le pHXB-Luc, p W S nco DRa et p W 3 DRlb (B) ou p W 3 neo DR67b (C) ou p W 3 nco DRw53 (D).Nous avons utilist un marqueur, l'anticorps L-243 pour détecter le HLA-DR la surface cellulaire (A, B, C ct D). Ensuite. nous avons incubé les ccllulcs dans la prtscnce d'un anticorps anti-souris dc chèvre conjugud à la fluorescéine isothiocyanare (A, B. C et D) avant l'analyse par cytoffuoromttric. Lignes conrinues (celluies non transfeccées); lignes pointilltes (celluIes uansfecttcs). Tel que présenté dans le Tableau 1, nous avons obtenu des niveaux de background du virus capturés lorsque nous nous sommes servi des billes magnttiques couplées à I'OKT3. Les billes magnétiques liées au 2.06 n'ont capruré que tres peu de virus provenant de cellules 293T transfecrées uniquement avec le pHXB-Luc (60 pdml). À l'opposé, les billes magnétiques couplées au 2.06 ont capturé un niveau de deux 2 quatre fois plus grand de virus originant d e cellules 293T cotransfectées avec pHXI3-Luc, p W neo DR a et p W 3 DR1 B ou p W . n e o DR67 B ou p W n e o DRw53 B (150, 265, 270 pglml respectivement). Mais il est important de souligner que le contrôle positif, NIA-3 dilué à 1/10 a été capturé très efficacement en comparaison de la souche HXB-Luc. Somme toute, les résultats d e cet ensemble d'expériences indiquent que les glycoprotéines HM-DRl, -DR4 et DRw53 sont présentes physiquement à la surface des particules HXB-Luc produites de cellules 293T HLA-DR1, -DR4 ou -DRw53 positives. Par conséquent, ce système d'expression transitoire est approprié pour la production d e particules VIH-1 pourvues ou non dans l'enveloppe lipidique des glycoprotéines HU-DR polymorphiques de la membrane cellulaire de l'hôte. T a b l e a u 1 : La détection à l'aide de billes magnétiques des gIycoprot6ines HU-DR1, -DR4, -DRw53 dérivées de l'hôte associées aüx particules HXB-Luc La préparation de virus La capture du VIH-la par billes magnétiques couplés aux - - a ~ e résulrars s d'une expérience sont présentts par Ics moyennes +/- les déviations standards d'CchantilIons cn duplicata. Les vaieurs sont exprimées en picogramrnes dc p24. En vue de confirmer les résultats semi-quantitatifs de I'immunocapture et d'obtenir des résultats plus précis, nous avons opte pour la méthode d e l'ultracentrifugation quantitative de nos particules virales provenant d'un des ensembles cellulaires 293T CO-transfectéesavec pHXB-Luc et soit le HLA-DR1, -DR4 ou -DRw53. Cette mtthode nous a permis de quantifier le nombre exact de HLA-DR associé au virus. Cette technique a été réalisée à l'aide d'un gradient de sucrose 20% qui sépare par la densite le virus entier de débris cellulaires e t d e molécules solubles [elles q u e la gplZO. Nous avons ultracenrrifugé des échantillons de virus provenant de cellules CO-rransfectees avec pHXB-Luc, pRSV neo DR a et p W 3 DR1 B ou p W n e o DR67 B ou p W n e o DRw53 B à 12 000 rpm à 4°C pour lh30. Par la suite nous avons resuspendu le culot contenant le virus et I'avons quantifie en terme d e p24 et H U - D R par deux essais enzymatiques différents. Comme l'indique le Tableau 2, nous avons obtenu des quantités similaires de chaque allèle sur les différents virus: HXB-Luc HLA-DRlfPOS, HXB-Luc HU-DR4/POS et HXB-Luc HLA-DRw531POS à 54, 50 et 35 molécules de HLA-DR respectivement. 11 n'y avait pas de HLA-DRassocié au virus H U - D R négatif. Donc les résultats suggèrent que chaque allèle est incorporé par les particules virales à un niveau plus ou moins comparable. T a b Ieau 2 : La quantification par ultracentrifugation des glycoprotéines HU-DR1, H U DR4 et HM-DRw53 de l'hôte associées avec des particules entières du HXB-Luc. Particule ( # molécules HLA-DWvirus Les résultats d'une expérience ont i t t calcul& 1I'aidc de Dmrrit'si~chanqui permet de d6terrniner Ic nombre de molécuIes HLA-DRou p24 dans l'&hantiIlon à partir de la masse dc i'échantillon en terme de HLA-DRou p24 déreminte par ÉLISA. Le nombre de moltculcs HLA-DR/virus se calcule ensuite comme ceci. En assumant qu'il existe environ 1200 pZ4/virus [122] nous sommes en la mesure de calculcr le nombre précis de molécules HLA-DR/virus par une règle de trois. L'infection mi& et temzi de b hrcY&c~se. Afin d'accomplir la transcription du gène rapporteur d e la luciférase codé par HXB-Luc, le virus doit non seulement entrer ou pénecre r la cellule cible mais le &nome doit s'intégrer dans les chromosomes de I'hôte. Pour cette raison, la dttection d'un signal de la luciférase est indicatif d'un cycle d e réplication du VIH-1 presque complet. Dans une étude précedente [98], nous avons vérifié si I'infection des cellules sensibles au HXB-Luc menait a un simple cycle d'infection. Nous avons accompli ceci en employant la lignée cellulaire, Jurkat-ult, un dérive de la lignée cellulaire Jurkat E6-1, qui exprime de façon stable la protéine transactivatrice virale Tat [121]. Cette lignée cellulaire a et6 utilisée car la présence d e la prodine virale Tat dans la cellule cible affecte positivement la transcription du gène de la Iuciférase codé par le virus. De plus, il n'y a pas d'expression de la moitcule HLA-DR 2 la surface cellulaire des Jurkat-ta, ce qui signifie que le virus bourgeonnant d e ces cellules n'incorporera pas d e telles molécules cellulaires. Cette propriété est d'une grande importance puisque les panicules virales produites suite à l'infection des cellules Jurkat-rat par le HXB-Luc n'acquièreront pas des glycoprotéines HU-DR. L'absence de la molécule cellulaire HLA-DRest critique car il y a une possibilité que les molécules HLA- DR incorporées dérivées de l'hôte participent aux evénements initiaux du cycle réplicacif du virus. Enfin dans cette même etude nous avons détermint à l'aide d e la drogue antivirale MT que les phénomènes de réinfection étaient minimes. L'infectidé ddu VIH-2 augmente uvec b p r k e da trok a l / h de tkotype HU-DR ceI2uhire incorporé h m tmeIoppe virak. Écant donné que la seule difference entre les quatres préparations du HXB-Luc était la présence ou l'absence d'un des trois allèles de la molécule HLA-DR dérivée d e I'hôte (HXB-Luc HU-DRI/POS, HXB-Luc HLA-DR4/POS, HXB-Luc HLA-DRw53fPOS et HXB-Luc HLA-DR/NEG), tout changement dans les propriétés biologiques de tels virions serait directement ou indirectement relié ii la présence d e ces glycoprotéines de I'hôte incorporées dans l'enveloppe virale. Lors de l'étude précédente [98] nous avons compare I'infectivitt des par- 41 ticules HXB-Luc pourvues ou non des glycoprotéines HLA-DR1 celiulaires dans différentes lignées cellulaires CD4 positives. Nous avons éxécuté les expériences d'infection en s e servant de quantites equivalente de chaque stock viral normalisé pour le contenu e n pZ4, et nous avons dkterminé l'activité de la luciferase dans les lysats cellulaires après 72h d'incubation 37°C.Nous avons observé des augmentations de 1,4, 1,7 et 1,8 fois de I'infectivité avec les virus HXB-Luc HLA-DRI/POS, HXB-Luc HLA-DR4/POS et HXB-Luc HLA-DRw53/POS respectivement, en mesurant 11activit6de la luciférase dans les cellules Jurkat-fatinfectées (Fig.7). Ces résultats indiquent que ['effet potentialisateur sur le processus d'infection virale, contrôlé par les glycoprot6ines polyrnorphiques cellulaires, incorporées à la surface virale, est genéré par tous les allèles testes. F i g u r e 7 : L'infectivité des particules H)(B-Luc pourvues HLA-DRI, HLA-DR4ou HLA-DRw53 dans la lignée lymphoïde cible Jurkat-tat Figure 7 La capacité infectieuse des particules EM3-Luc poumues de HLA-DR1, HLA-DR4 ou HIA-DRw53 dans la lignée lymphoïde cible Jurkat-rat. Nous avons infecté certc lignée avcc le virus HXB-LUCHLA-DR/NEG OU HXB-LUCHLADRl/POS ou HXB-LUCHLA-DR4POS ou HXB-Luc HLA-DRw53POS (1,s ng de p24) e t nous I'avons incube pour une durée de 72h A 37°C.Nous avons rncsuri I'activiti dc la luciferase des lysats cellulaires. Lcs résultats d'une expérience sont prisends par les moyennes +/les dkviarions standards d'6chantiIlons cn triplicata. Particules virales 5 Lors de l'étude précédente [98],nous avons vtrifié si la hausse de I'infectivité virale, causte par les glycoprotéines HLA-DR1 dérive de l'hôte associ6es au VIH-1 n'ttait pas un tpiphenomène qui pourrait être relit aux stocks viraux utilises pour les études. D'autres ttudes pour confirmer ou infirmer cet hypothèse ont et6 faites avec des préparations de virus provenant de trois transfections indépendante. La même procédure d'infection a été suivie et le résultat etait vraisemblablement identique. Nous avons donc assurnt pour l'étude actuelle que la hausse en infectivité que nous observions était rkelle sans tout de même comparer des stocks viraux de transfections indépendantes. Chapitre 4: Discussion générale, Conclusions et Perspectives L'objectif principal de cette étude etait d16valuer le rôle biologique joue par les molecules HLA-DRl, HM-DR4 et HM-DRw53 de la cellule hôte lorsqu'elles sont acquises par le VIH-1. Sachant que le recepteur majeur cellulaire pour le VIH-1 est la molécule CD4,qui s'avère aussi le ligand physiologique naturel pour le HLA-DR [123], ceci nous a porté à croire qu'une interaction entre chacunes des rnolecuies polymorphiques et le CD4 pouvait avoir lieu. Notre Cquipe a déjà démontré que le HLA-DR1 interagit avec le CD4 pour augmenter l'infectivité du VIH-1 [98]. La raison qui nous a poussé à concentrer nos ttudes sur I'isotype HLA-DRplutôt que les isorypes -DP ou -DQ se base sur le fait q u e certe molécule est retrouvée en plus grand nombre 3 la surface virale [80,8l, 881. De plus, l'étude d e Fleury et ses collaborateurs nous a incité à postuler que le polymorphisme du HM-DR pourrait aussi modifier I'infecrivité virale. En effet, ces derniers ont démontré avec un système d'intéraction cellule-cellule que I'affinice de divers allèles du HM-DR varie pour ia molécule CD4 [101]. Lors de nos études nous avons utilisé le clone moléculaire infectieux pHXB-Luc qui contient le gène rapporteur de la luciferase de PhotiinurpyraIii inséré à la place du gène nt$ Les données d e nos études préckdentes [98] indiquaient que les particules virales HXB- Luc pouvaient être utilisees pour mesurer de manière sensible et quantitative la réplication virale. Cette propriété nous a permis d16valuerle rôle que peuvent jouer les molécules HLADR1, -DR4 e t DRw53 dans le cycle réplicatif du VIH-1. La production de particules WH-I possèdant l'une des trois molécules cellulaires H U - D R à leur surface a été exécutée e n cotransfectant les cellules 293T avec le plasmide HXB-Luc et les vecteurs d'expression eucaryotique codant pour les chaînes a et B du HLA-DR1, HLA-DR4 ou HLA-DRw53. Nous avons aussi produit des virus dépourvus de telles composantes de l'hôte en transfetant les cellules uniquement avec le pHXB-Luc. De cette façon, nous avions à notre disposition des preparations virales de la même scuche du WH-1 qui ne différaient que par la prksence ou l'absence des molécules cellulaires HLA- DR1, -DR4 ou -DRw53 incorporees dans I'enveloppe virale. La qumttifmtion dès mu&& H U - D R puiymo~hi~tt~lr incatporéis a h tmtxhppe a+&. Depuis quelques annees, l'incorporation d e protéines cellulaires de l'hôte à la surface du VIH-1 est un sujet d'intérêt pour les chercheurs. Plusieurs ttudes font état d e la prCsence d e molécules cellulaires dans l'enveloppe virale. Certaines études ont démontre que la nature et la quantite de molécules incorporc5es pouvaient varier ce qui suggère qu'il existe une certaine sélectivité dans le processus d'incorporation. Tous ces faits ont incité notre équipe à invesriguer la cause d e la sélectivité dans le processus d'incorporation. Pour ce faire, nous avons développé un système d e quantification des molecules de surface cellulaire incorporées dans I'enveloppe du virus. Ce système est basé sur l'emploi de billes magnétiques auxquelles sont liées une variété d'anticorps. C e test comporte plusieurs avantages comparativement aux autres méthodes couramment employées telles que le HPLC [go], la microscopie tlectronique 1871 ou les anticorps adsorbés sur plaques [82]. Notre système a une sensibilité accrue, une meilleure spécificité, un temps d'essai relativement court et des faibles risques de danger lors des manipulations. Pour la prksence erude, nous avons choisi d'appuyer les résultats semi-quanritatifs d e I'immunocapture avec une méthode plus quantitative baste sur l'ultracentrifugation. Cette méthode permet de mesurer directement le nombre de molécules HL,-DR incorporées aux particules virales. À l'aide d e souches virales produites suite à la transfection d e cellules 293T et des deux méthodes décrites ci-haut nous avons pu estimer le nombre de molCcules HM-DR incorporées dans le WH-1. Les résultats de I'immunocapture indiquent que nous r6ussissons à capturer de 2 a 4 fois plus de virus lonqu'il y a présence d e l'une ou d e l'autre des molécules HLA-DR polymorphiques ii la surface virale en comparaison avec du virus 5: dépourvu de HLA-DR.Cependant, il faut souligner que le niveau d e virus capturé, même en présence du HM-DR etait faible pour la souche HXB-Luc si l'on considtre qu'on a utilisé 2500 pg de virus pour cet essai. À l'opposé, nous avons r6cuperé une quantice enorne du contrôle positif, à savoir la souche VIH-IW3. II faut souligner que le N W 3 est un clone moléculaire chimérique qui se divise e n deux moitié à un site unique EcoRl[124]. Sa portion 5' est dérivee du provirus NY5 tandis que sa portion 3' est originaire du provirus W. Sa portion 5' semble responsable de sa grande efficacité pour incorporer un plus grand nombre de protéines HLA-DR de l'hôte 181]. Les données d e I'ultracentifugation suggi5rent que le niveau de HM-DR1 associé au virus entier bourgeonnant des cellules 293T est plus faible que les estimations d'études precédentes. Par exemple l'équipe d e Larry O. Arthur a calculé qu'entre 375-600 HLA-DR se trouvaient à la surface d e mH-lIrIB provenant de cellules H9. Dans notre étude, le niveau d'incorporation des trois allèles HLA-DRI, -DR4 et -DRw53 est similaire avec 54, 50 et 35 molécules/virus respectivement. Cependant, il faut spécifier q u e deux études récentes démontrent que les stocks viraux amplifiés sur les cellules lymphoïdes comme H9 contiennent une force quantité de concaminants cellulaires q u i sont remplis de molécules de la cellule hôte [125-1261. Il est donc fort possible que dans l'étude du groupe de Larry O. Arthur le nombre de molkcuIes HLA-DR soi-disantes associées avec le VIH-1 soit surestimé, Nos résultats permettent de penser que le niveau d'incorporation dans le VIH-I est faiblement influencé par le polymorphisme allèlique du HLA-DR. En effet, la souche virale employée HXB-Luc n'a pas permis un niveau d'incorporation suffisant pour nous permettre de déceler des différences qui pourraient exister entre les allèles. Pour remédier à ce problème, il faudrait opter pour des transfections stables des divers allèles de la moltcule HM-DR pour pouvoir contrôler le niveau d'expression. De plus, il serait important d'utiliser une souche virale qui incorpore des niveaux supérieurs de la molécule HLA- DR. Nos résultats antérieurs démontrent hors de tout doute que la souche virale et la lignke cellulaire sont deux facteurs pouvant modifier le niveau d'incorporation de la molCcule HM-DR dans le VIH-1 [81]. Certaines evidences suggèrent que la matrice virale p 17 pourrait jouer un rôle dans le niveau d'incorporation des moltcules de l'hôte dans le MH-1. Un modéle propos6 est celui dit d'exclusion active/inclusion passive [54]. Selon ce modèle, les protéines d e la matrice virale et de la membrane cellulaire seraient intimement assocites aux zones de bourgeonnement et donc ne laisseraient pas la place aux protéines mem- branaires encombrantes ayant une queue cytoplasmique trop longue à ces sites. La moMcule HM-DR, qui posstde une courte queue cytoplasmique, ne serait donc pas exclue des particules virales. Ce modèle concorde avec nos observations puisqu'il suggère que le niveau d'incorporation du HLA-DR peut être simplement expliqué par le niveau d'expression cellulaire. Outre cette explication, il y a tout d e même une possibilité d'une interaction spécifique directe entre la matrice et les protéines incorporees virales et ceIlulaires. Dans l'étude actuelle nous avons obsewé que l'incorporation est sujet à une petite variation dépendammant de l'allèle du HLA-DR cellulaire exprimé. Le polymorphisme des différents allèles au niveau de la queue cytoplasmique est minime, c e qui suggère que la matrice p l 7 n'est peut être pas responsable de I'incorporation du HLA-DR. Puisque le polymorphisme du HL4-DR est imporran t dans certains domaines extracellulaires, il se peut que son incorporation dans Ie VIH-1 soit dépendance de son affinité pour la gpl20. Pour prouver ceci, il faudrait démontrer une association physique entre la gp120 et le HLA- DR. Une autre raison pour expliquer cette selectivitC ttant que 1e bourgeonnement du WH-1 s'effectue à des sites precis [127-1291 à la surface cellulaire et ces sites contiendraient certaines molécules fortement concentrées favorisant leur incorporation [85]. Afin d'identifier avec certitude la cause exacte permettant d'expliquer 55 l'incorporation sélective d e certaines rnoltcules d e l'hôte dans le VIH-1, plusieurs expériences pourraient être exécutées. II faudrait faire des essais comparant le niveau d e la gp120 et du HLA-DRpolymorphique de différents stocks viraux dans le but de déterminer s'il s'agit bien d'une association entre ces deux mol~cules.Aussi, il serait utile de verifier l'association qui pourrait exister entre le HU-DR polymorphique e t la matrice virale. À cette fin, l'on pourrait mesurer le contenu en HM-DR de virus ayant des mutations dans la matrice. Enfin, pour tester l'hypothèse des zones de bourgeonnements concentres e n HLA-DR, l'emploi de la microscopie confocale serait une possibilité. En marquant à la fois les antigènes viraux et le HLA-DRl'on reussirait à les examiner. Le rôlefonclionel dés aIIè2a HLA-DR incorporécr dam lenweIoppe m?&. Certaines Q u i pes de recherche ont étudié le rôle fonctionnel des rnoltcules de la cellule hôte présentes à la surface virale (80,88, 901. À l'aide des préparations de virus par transfection nous avions réussi à démontrer que la présence de chacun des allèles HLA-DRI, HLA-DR4et HM-DRw53 dérives d e l'hôte, incorporés à la surface du WH-1,mène 5 une augmentacion d e 1,4 à 1,8 fois d e I'infectivité virale. Étant donné que notre étude précédente [ 9 8 ] démontrait une hausse d'infectivité d e 1,6 à 2.3 pour le HLA-DR1 dépendamment de la lignée cellulaire testee nous avons presupposé qu'il y aurait une augmentarion variable semblable pour le HLA-DR4 et le HU-DRw53 et nous n'avons donc pas cesd d'autres lignees cellulaires lors d e la présente étude. La hausse d'infectivite ne semble pas spécifique pour une lignée cellulaire particulitre. De plus, nous avons dejà fait des études de cinétique pour le HLA-DR1 et avons conclu que l'avidité de la liaison du virus à la cellule cible était augmentée menant il des effets positifs sur les evènements precoces du cycle réplicarif viral tels que l'adsorption er les étapes d'entrée. En résumé, ces donnkes suggèrent q u e les glycoprotCines HM-DR1, HLA-DR4 et HLA-DRw53 sont biologiquement fonctionnelle puisqu'elles augmentent I'infectivité des particules du VIH-1. Nous postulons que l'augmentation de I'infectivité virale est due à des associations 5i spécifiques entre les molécules H U - D R sur les virions et le CD4 à la surface de la cellule cible. La constante d'association entre HLA-DR4et CD4 (Kd=3,2 x 10-6 M) [130] est assez faible si on la compare avec celle entre la gp120 et le CD4 (Kd=4x 10-9 M) [14]. La quantité de HLA-DR incorporCe dans le VIH-1 [80,81,88]est sans doute suffisante pour pallier à cette constante d e dissociation plus faible. Tel q u e decrit auparavant [98], nous avons suggért! que ces interactions additionnelles entre le virus et la cellule pourraient aboutir à une sorte d'effet welcrom où la rotalite des intéractions HLA-DR1, -DR4 ou -DRw53 au CD4 conduirait à un meilleur attachement du virus 2 sa cible. De cette façon, le virion serait avantagé puisque ces intéractions favonseraient la fusion. Notre équipe a déjà postulé que le niveau d'incorporation du HLA-DR dans le WH1 peut dépendre de l'allèle HLA-DR qui est incorporée [98].Si cette hypothèse s'avérait véridique, le scatut génétique de l'individu infecté pourrait alors influencer le niveau de HM-DR incorporé dans l'enveloppe virale. Sachant que le locus HLA-DR est tr&s polymorphique et que l'affinid du HU-DR pour le CD4 semble varier selon l'allèle HIA-DR en question [ 1011, nous pouvons imaginer que l'incorporation de certains allèles HLA-DR spécifiques à la surface du virus mènerait ii des changements d e I'infectivité du VIH-1. L'incorporation du HLA-DR dérivé d e l'hôte par le VIH-1 contribuerait ainsi à la progression de la maladie si l'on assume que les allèles HLA-DRà haute affinité pour le CD4 conduirait à une augmentation de I'infectivité du VIH-1. Certaines émdes épidémiologiques semblent appuyer cette hypothèse. Par exemple, certains rapports ont fourni des évidences d'une association entre les allèles ou haplotypes du CMH-II et la progression de la maladie [ l 3 1-1361. Une étude démontre une association entre l'allèle HM-DR1 e t le sarcome d e Kaposi, ou une corrélation entre HLA-DR3 et l'apparition d'infections opportunistes [137]. De plus, l'on associe la diminution rapide des cellules T CD4+ chez les hémophiles séropositifs ii certains phénotypes HLA tels que HLA-Ag, -DR1 et DR3 [138]. La présente étude suggère qu'il n'y a pas d'effet différent des alli?les HLA-DR incorporés sur I'infectivitc5 du virus. Il serait préferable de générer des transfectants stables pour mieux déceler des différences réelles d'incorporation des divers allèles dans l'enveloppe virale. De plus, il pourrait s'avérer necessaire de changer quelques paramètres tels que l'expression cellulaire du CMH-II et la souche virale employée afin d'améliorer le niveau d'incorporation du CMH-II il la surface virale. Par exemple, nous avons trouvé une incorporation satisfaisante des allèles chez la souche contrôle servie pour les infections. Si contrairement à ce que nous avons obtenu dans les expériences actuelles, nous obtenions une différence apparente de I'infectivitk par rapport aux divers allèles, à ce moment là il serait important de comprendre les mécanismes d'incorporation e n jeu. Somme toute, nous avons démontré que la prtsence des allèles HM-DRI, HIA-DR4et HLA-DRw53 3 la surface du VIH-I augmentent l'infectivité virale. Cette observation est très pertinente aux situations ia YiVO où la présence des virions possédant des molécules HLA-DR à leur surface peut jouer sur l'efficacité de la transmission et le développement du SIDA. II reste à vérifier si ces trois allèles ont des différences nettes dans leur capacité d'engendrer une augmentation de I'infectivité. Le but à long terme demeure l'accumulation d e connaissances pertinentes sur le VIH-1 afin de mettre sur pied une thérapie antirétrovirale plus efficace et moins toxique. 58 Nous avons tiré les conclusions suivantes de nos r6sultats: 1. Nous avons obtenu un niveau d'expression presque similaire des allèles du HLA-DRpar les 293T productrice en employant la mtthode de transfection. 2. Le protocole d'immunocapture nous a donnt un niveau d'incorporation presque équivalent pour les trois allèles de la molecule HLA-DR 3. À l'aide d e I'ultracentrifugation, nous avons reussi à calculer le nombre de HLA-DRpar virus pour les trois allèles. 4. À l'aide des infections de nos lignées Jurkar-fat, nous avons obtenu une hausse du niveau d'infectivité dans les trois cas (HM-DRI, -DR4 et -DRw53) variant entre 1,s et 2'0. 5. Dans l'ensemble, ces études suggèrent l'existence d'une fonction biologique pour ces crois allèles dans la virulence du VIH-1 e t montrent la nécessité d'adopter une stradgie de transfection stable des cellules hôtes afin de contrôler les paramètres énumtrés dans le résumé des perspectives suivantes. 59 Voici un rhume de nos perspectives: 1. Produire des transfectants stables qui expriment des niveaux similaires des trois allèles de la molécule HLA-DRpour pouvoir éliminer la vanabilite de l'expression des allèles à la surface cellulaire. De même tester une plus grande gamme d'allèles. 2. Identifier une souche virale qui incorpore un niveau optimal des allèles de la molecule HLA-DR, c e qui n'est pas le cas pour le HXB-Luc. En ce qui concerne la lignée productrice cellulaire, les 293T demeurent un bon choix puisqu'elles sont facilement transfectables et sont des cellules adherentes. 3. Déterminer plus précisément s'il existe une différence dans le niveau d'incorporation des divers allèles HLA-DR et quels sont les mécanismes en jeu. Est-ce qu'une association sélective et variable survient entre la matrice des panicules virales et les allèles du HLA-DR? Ceci peut être testé à l'aide de mutants de la matrice. Est-ce que le phénomène de bourgeonnement se produit à un sire d e concentration plus fort e n HLA-DR1, -DR4 et -DRw53 (CO-localisation)?La microscopie confocale peut permettre de répondre à cette question. Et enfin, exisce-il une association variable entre la gplZO et les allèles du HM-DR? En mesurant le niveau de ces molCcules on parviendra à répondre à cette dernière question. Références Bumé-Sinomsa; EL,C. CirmMn, R &y, MM Nageyre, S. C h r e I , 1: Grtcest, C.Dmgzcet, B.C. Axlér, RB. 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