Présence de bactéries méthanogènes méthylotrophes

OCEANOLOGICAACTA 1987- VOL.10- W 2 tar-----
Présence de bactéries
méthanogènes méthylotrophes
dans les sédiments profonds
Bactéries sulfato-réductrices
Méthanogènes méthylotrophes
Sédiments profonds
Sulfate-reducing bacteria
Methylotrophic methanogens
Deep-sea sediments
du détroit de Makassar (Indonésie)
RÉSUMÉ
ABSTRACT
INTRODUCTION
Danielle G. MARTY, Jean E. GARCIN
Microbiologie Marine, CNRS, Université de Provence, 3, place Victor-Hugo, F 13331 ,
Marseille Cedex 3, France.
Reçu le 16/6/86, révisé le 19/9/86, accepté le 6/10/86.
La compétition entre les bactéries sulfato-réductrices et les bactéries méthanogènes
pour l'utilisation de substrats communs (hydrogène et acétate), a longtemps été
considérée comme
l'un des principaux facteurs contrôlant la méthanogénèse dans les
sédiments marins.
De récentes études ont montré que les méthylamines, et plus
particulièrement la triméthylamine, pouvaient constituer des précurseurs méthanogènes
« non-compétitifs >> quantitativement importants dans certains écosystèmes marins.
Les cinq espèces méthanogènes méthylotrophes marines décrites actuellement,
ont
toutes été isolées de sédiments peu profonds. Au cours de la mission « Misedor » du
N/0 « Jean Charcot » en.Indonésie, nous avons pu mettre en évidence la présence de
bactéries méthanogènes dégradant les méthylamines,
dans les sédiments d'une fosse
océanique de 2 000
rn de profondeur, dans le détroit de Makassar.
Oceanol. Acta, 1987, 10, 2, 249-253.
Occurrence of methylotrophic methane-producing bacteria in deep-sea
sediments collected in Makassar Strait (Indonesia)
Competition for hydrogen and acetate between sulfate reducing and methane produ-
cing bacteria has generally been recognized as one of the major factors controlling
methanogenesis in anoxie marine sediments. Recent studies have shown
that methyla-
rnines,
and trimethylamine in particular, could be significant "non-competitive"
methane precursors in a variety of marine systems. Recently five methylotrophic
methanogenic bacteria were isolated from shallow marine sediments.
During the
"Misedor" cruise of the R.V. "Jean Charcot" in Indonesia, we detected methanogenic
bacteria able to produce methane from methylamines, in sediments collected from an
oceanic trench at a depth of 2 000 rn, in the Makassar Strait.
Oceanol. Acta, 1987, 10, 2, 249-253.
La sulfato-réduction et la méthanogénèse sont des pro-
cessus microbiens particulièrement importants dans les
environnements anoxiques, où ils constituent les étapes
finales majeures de la minéralisation de la matière orga-
nique (Mountfort, Asher, 1981; Senior et al., 1982).
Jusqu'à ces dernières années, il était admis que les
bactéries méthanogènes étaient toutes capables de
pro-
duire du méthane par réduction du gaz carbonique
avec l'hydrogène (Balch et al., 1979). Par conséquent,
la
plupart des dénombrements et des mesures d'activité
de la microflore méthanogène ont utilisé H2 -C0
2
comme substrat, ce qui a pu fausser quelque peu les
conclusions tirées
quant aux caractéristiques des popu-
lations méthanogènes dominantes in situ (King, 1984 a).
Les études réalisées avec des traceurs radioactifs (carbo-
nate et acétate) ont montré que, dans les sédiments .
marins, le méthane provenait principalement de la
réduction du carbonate. Toutefois, après épuisement
du sulfate présent, l'acétate, précurseur méthanogène
potentiel, est utilisé
par les bactéries méthanogènes, ce
0399-1784/87/02 249 05/$ 2.50/@ Gauthier-Villars 249

O. G. MARTY. J. E. GARCIN
qui implique l'existence, dans les sédiments marins, de
bactéries méthanogènes capables d'utiliser des substrats
méthylés (Warford et
al., 1979; Senior et al., 1982).
Des caractéristiques thermodynamiques et cinétiques
favorisent
les bactéries sulfata-réductrices par rapport
aux bactéries méthanogènes pour l'utilisation de l'acé-
tate et de l'hydrogène (Lovley, Klug, 1983 a; Robinson,
Tiedje, 1984). Dans
les sédiments marins ou intertidaux,
biotopes où la concentration en sulfate est relativement
élevée, la sulfata-réduction est donc
le processus domi-
nant, au détriment de la méthanogénèse (Mountfort,
Asher, 1981; Oremland, Polcin, 1982).
Des études récentes effectuées sur les bactéries métha-
nogènes méthylotrophes marines ont mis en évidence
l'importance du rôle que pourraient jouer des précur-
seurs méthanogènes méthylés tels que le méthanol et
les méthylamines dans des sédiments où la sulfato-
réduction est active ( Oremland et al., 1982; Lovley,
Klug, 1983 b; Winfrey, Ward, 1983). En particulier, la
triméthylamine, qui provient de la décomposition de la
choline et de la glycine bétaïne, deux composés synthéti-
sés par de nombreux organismes marins, présente
l'avantage d'être peu ou pas utilisée par
les bactéries
sulfata-réductrices. La triméthylamine pourrait donc
constituer un précurseur méthanogène quantitative-
ment important dans les sédiments marins (King,
1984 a; 1984 b; Sowers et al., 1984). Cependant, des
études comparant
les pools de triméthylamine présents
dans les sédiments et l'activité des bactéries méthanogè-
nes méthylotrophes, sont encore nécessaires pour pou-
voir quantifier le rôle de ces bactéries dans les écosystè-
mes océaniques.
E112o
Mer de .Java
Mer de Bali
..
. . ..
•t
250
La présence de bactéries méthanogènes capables de
métaboliser
les méthylamines pouvant influer fortement
sur la quantité de méthane produit dans certains bioto- j
pes sédimentaires, nous avons cherché à mettre en ··
évidence des bactéries méthanogènes présentant de tel-
les potentialités cataboliques dans les sédiments préle-
vés dans le détroit de Makassar (Indonésie) au cours
de la mission pluridisciplinaire « Misedor » du
N/0
«Jean Charcot» (décembre 1984).
MATÉRIEL ET MÉTHODES
La mission Misedor a permis l'étude de
19 stations de
prélèvement (fig.
1) entre 50 et 2 500 rn de profondeur,
situées soit à proximité des
îles Lima, soit sur trois
radiales au large
du delta de la Mahakam (Est-Kali-
mantan). Les prélèvements de sédiments superficiels
(niveaux étudiés: 0-2 cm, 4-6
cm, 10-12 cm et 18-
20 cm) ont été effectués à l'aide d'un carottier Reineck
court.
Le sédiment profond (niveaux étudiés: 50 cm,
150 cm, 250 cm, 400 cm et 600 cm) a été prélevé à
l'aide d'un carottier Kullenberg.
Le potentiel d'oxydo-réduction a été mesuré avec une
électrode (Ag/AgCl) à pointe de pénétration.
Les dénombrements des différentes populations bacté-
riennes anaérobies (bactéries hétérotrophes anaérobies,
sulfata-réductrices et méthanogènes) ont été réalisés
sur
les sédiments de 9 stations de prélèvement. Ces
dénombrements ont été effectués en milieu liquide selon
la technique du nombre
le plus probable en ensemen-
çant trois tubes par dilution dans un milieu préparé
selon la technique de Hungate (1969) :
&120°
..
Figure 1
e Localisation des stations de prélèvement
(mission << Misedor » du N/0 << Jean Char-
cot», décembre 1984). 0 Études bactériolo-
giques.
e Location of samp/ing stations ("Misedor"
cruise of the R. V. "Jean Charcot", December
1984). 0 Bacteriological studies.

MËTHANOGËNES MËTHYLOTROPHES DANS DES SËDIMENTS PROFONDS
• milieu de base (en g/1) : KH
2
P0
4 0,41;
Na
2H-
P04.7H20 0,53; NH
4Cl 0,030;
NaCl20; CaCl2.2H20
0,11; MgCl2.6H20 0,11;
NaHC0
3 5;
Na
2S.9H20 0,3;
cystéine 0,3; résazurine 0,001; extraits de levure 1; bio-
trypcase
1; oligo-éléments (Ben-Bassat et al., 1981)
(10 ml);
• les bactéries hétérotrophes anaérobies ont été culti-
vées en tubes dans
le milieu de base enrichi en extraits
de levure et peptone (respectivement 4 et 5
g/1), sous
atmosphère N2
-C0
2 (80-20%). Après 8 jours d'incuba-
tion à 20°C,
les tubes positifs sont ceux présentant un
trouble bactérien;
• les bactéries méthanogènes non méthylotrophes ont
été dénombrées en tubes contenant le milieu de base
enrichi en formate
(5 g/1), sous atmosphère H2 -C0
2
(80-20 %) ; les bactéries méthanogènes méthylotrophes
ont été dénombrées en tubes contenant le milieu de
base enrichi en acétate (3
g/1), méthanol (5 mlfl) et
triméthylamine (12 ml/1), sous atmosphère NrC0
2 (80-
20%). Après un mois d'incubation à 20°C, les tubes
positifs sont ceux
dont l'atmosphère contient du
méthane; Je méthane est détecté par chromatrographie
en phase gazeuse .à catharomètre (Marty, 1983);
• les bactéries sulfato-réductrices ont été dénombrées
en tubes contenant le milieu de base dans lequel les
réducteurs soufrés
(Na
2S et cystéine)
ont été remplacés
par du citrate de titane (Zehnder, Wuhrmann, 1976)
(19 mlfl), et enrichi en formate (2 gfl), lactate (2 g/1),
acétate (2 g/1), FeC1
2 (2
g/1) et Na
2
S0
4
(1 g/1), sous
atmosphère H2
-C0
2 (80-20%). Après 8
jours d'incuba-
tion à 20°C,
les tubes positifs sont ceux contenant un
précipité de sulfure de fer.
RÉSULTATS
Parmi
les populations bactériennes anaérobies étudiées
(fig. 2),
les bactéries hétérotrophes anaérobies se déve-
loppant sur milieu peptoné, avec des effectifs variant
entre 2.103 et 2.104 bactéries
par millilitre de sédiment,
sont les plus abondantes
et les plus ubiquistes, puisque
présentes dans les sédiments des 9 stations et à tous les
niveaux sédimentaires étudiés. Les bactéries sulfato-
réductrices,
dont les effectifs sont plus restreints (6
à 250 bactéries/ml), sont toujours présentes dans les
sédiments superficiels, mais disparaissent rapidement
avec l'enfouissement, et sont généralement absentes au-
delà de
50 cm. Le nombre limité de bactéries sulfato-
réductrices présentes est compatible avec l'état faible-
ment réduit de ces sédiments qui, dans la majorité des
cas, ne permettent pas
le développement de populations
bactériennes méthanogènes.
Des bactéries méthanogènes
ont pu être mises en évi-
dence dans les sédiments de trois stations seulement,
leurs effectifs variant entre 6
et 25 bactéries/ml. Des
bactéries méthanogènes utilisant H2
-C0
2
ou le formate
ont été détectées dans les sédiments de la station 13
(niveaux 0-2 cm, 4-6 cm, 10-12 cm et 18-20 cm) et de
la station 15 (niveaux 0-2 cm et 4-6 cm). Des bactéries
méthanogènes capables d'utiliser l'acétate,
le méthanol
251
NIVEAUX 0-2c:m 11-Dc• 1 0-12cm
Eh
•003mV •OOlmV +120mV •160mV
-1 llO mY -055mV -120mV -130n!V
NIVEAUX 0-2cm
't-6cm 10•12cm IB•20cm
0-2cm
11-Dcm
ID-12c,. IB-2Dcm
Eh
•OIIOIIIY
-150mV
-2115mV ·IIIDmY
-IB!imV
-175rnV
-155mV
-160mV
E •
l'o
2
! 10
NIVEAUX
0-2cm lt-l!cm
I0-12cm
18-20cm
0-2cm
'+-6c•
10•12cm
18•20cm
Eh
•070mV
-070mV
•llOmV
•150mV -OlOIIIY
-DG5mY
-115mV -llfOmY
• •
.~ ID
" 2
~ID
NIVEAUX D-2cm ll-6cm 10-12cm 18-2Dcm 0-2cm lit-Den~ I0-12cm 18-20cm
Eh •OBI!mV -120mV ·lltO...V ·170mV -OG7mV ·l:ZOmV ·130mV ·130mV
Figure 2
Répartition verticale des populations
bacté~e~nes anaérobie~ et du
potentiel d'oxydo-réduction (Eh) dans les sediments superf1crels (0-
20 cm) de 9 stations de prélèvement : • Bactéries hétérotrophes
anaérobies; ~ Bactéries sulfato-réductrices;
fi Bactéries méthano-
gènes non-méthylotrophes;
Iii! Bactéries méthanogènes méthylotro-
phes.
Vertical distribution of anaerobie bacterial populations and redox
potential (Eh)
in superficial sediments (0-20 cm) at 9 sampling sta!ions:
0 Heterotrophic anaerobie bacteria; E!i!l Sulfate-reducing bacter1a; If
Non-methylotrophic methanogenic bacteria; {l§1 Methylotrophic metha-
nogenic bacteria.
ou les méthylamines ont été mises en évidence dans les
sédiments superficiels de la station
11 (niveau 0-2 cm).
Les stations
13 et 15 sont situées sur la radiale sud au
large du delta de la Mahakam. La station 13 est située
sur le plateau continental à une profondeur
ete 50 rn,
alors que la station
15 se trouve sur le talus continental
à une profondeur de 250 m. La station 11 est située
près
du Sulawesi (Célèbes) dans une dépression océani-
que, à 1990
rn de profondeur. Dans ces trois stations,
les bactéries méthanogènes sont uniquement présentes
dans les couches sédimentaires les plus récentes, pou-
vant correspondre à des dépôts plus ou moins épais
suivant
la vitesse de sédimentation dans ces zones : 0- ·
2 cm dans la fosse océanique (station 11), 0-6 cm dans
la station 15, soumise aux apports fluviatiles de la
Mahakam, et 0-20 cm à l'embouchure de la Mahakam
(station 13) où la vitesse de sédimentation est la plus
élevée.
Une souche méthanogène a pu être obtenue en culture
pure à partir des tubes de dénombrement des bactéries
méthanogènes méthylotrophes de
la station 11 (niveau
0-2 cm). Cette souche se rattache au genre Methanosar-
cina par sa morphologie, et est capa?le de produire du

t
,.
D. G. MARTY, J. E. GARCIN
méthane à partir de H2 -C0
2, de l'acétate, du méthanol,
de
la monométhylamine, de la diméthylamine et de
la triméthylamine. En culture pure, cette souche
se
développe sur H2 -C0
2,
ce qui n'avait pu être observé
lors des cultures d'enrichissement initiales. On peut
supposer que cette réponse négative était due à une
consommation plus rapide de l'hydrogène
par des bac-
téries anaérobies non-méthanogènes, empêchant
le
développement de la souche méthanogène. Mais la
grande versatilité nutritionnelle de celle-ci, et surtout
sa capacité à métaboliser
les méthylamines, lui permet-
tent de
se développer simultanément avec les autres
populations bactériennes anaérobies, en utilisant des
substrats rarement utilisés par
les micro-organismes
hétérotrophes.
DISCUSSION
Les bactéries méthanogènes qui sont caractérisées par
des potentialités cataboliques très limitées, correspon-
dent aux bactéries les plus sensibles à l'oxygène connues
actuellement. La distribution et l'activité de
ces bacté-
ries sont donc restreintes aux environnements anoxi-
ques, dans lesquels des bactéries associées maintiennent
un faible potentiel redox et produisent des substrats
utilisables par
les bactéries méthanogènes. Si, dans les
écosystèmes sédimentaires lagunaires, estuariens ou lit- ·
toraux, la quantité de matière organique présente est
suffisamment importante pour permettre l'établisse-
ment de conditions anoxiques,
ceci est rarement le cas
dans
les sédiments océaniques profonds.
Une quarantaine d'espèces méthanogènes pouvant être
séparées en espèces méthylotrophes et non-méthylotro-
phes, ont été décrites et répertoriées au niveau interna-
tional (Dubach, Bachofen, 1985). La plupart de
ces
espèces sont capables d'utiliser uniquement H2 -C0
2
ou
H2 -C0
2 et
le formate. Certaines de ces souches non-
méthylotrophes ont été isolées de sédiments marins,
dont trois
de sédiments marins prélevés à plus de
1000 rn de profondeur, dans des zones qui se singulari-
sent par leur caractère anoxique : la Cariaco Trench
dans l'Océan Atlantique (Romesser et
al., 1979), la
Mer Noire (Romesser et
al., 1979) et les sources hydra-
thermales du Pacifique Est (Jones et al., 1983). Les
souches méthanogènes méthylotrophes sont plus rares;
parmi
les sept espèces connues actuellement, cinq sont
d'origine marine, et ont toutes été isolées de sédiments
prélevés à des profondeurs inférieures à 50
rn, en Médi-
252
terranée (Konig, Stetter, 1982), dans l'Océan Pacifique
(Sowers, Ferry, 1983; Sowers et
al., 1984), dans l'Océan
Indien (Zhilina, 1983), ou en Mer du Nord (Blotevogel
et al., 1986). Les études que nous avons effectuées
dans
le détroit de Makassar correspondent donc à la
première
mise en évidence de bactéries méthanogènes
méthylotrophes dans des sédiments marins profonds
(1990 rn). La présence de bactéries méthanogènes ben-
thiques dans cette dépression océanique sous-entend un
apport important de matière organique et une·sédimen-
tation rapide, permettant l'établissement de conditions
favorables au développement de bactéries méthanogè-
nes.
Dans les biotopes sédimentaires marins, les deux accep-
teurs terminaux d'électrons
les plus abondants sont le
carbonate et le sulfate. Les bactéries méthanogènes qui
réduisent
le carbonate en méthane, entrent en compéti-
tion défavorable avec
les bactéries sulfata-réductrices,
ces dernières utilisant l'hydrogène plus rapidement. Au
contraire,
les bactéries méthanogènes capables d'utiliser
des substrats tels que la triméthylamine, pour laquelle
la compétition est minimale ou inexistante, peuvent
se développer simultanément et indépendamment des
bactéries sulfata-réductrices, et pourraient donc jouer
un rôle plus important que celui qui a été attribué
jusqu'à présent aux bactéries méthanogènes dans la
minéralisation de la matière organique.
Les bactéries méthanogènes qui utilisent le carbonate
comme accepteur d'électrons, constituent
les maillons
ultimes du transfert des électrons produits par la
décomposition anaérobie de la matière organique. Par
contre,
les bactéries méthanogènes méthylotrophes qui
sont capables d'utiliser
les méthylamines comme seules
sources de carbone et d'énergie, agissent à un stade plus
précoce de la minéralisation de la matière organique, en
intervenant dans la fermentation des amines. De plus,
dégradant
les méthylamines en CH4, C0
2 et
NHt, ces
bactéries méthanogènes méthylotrophes interviennent
aussi bien dans
le cycle du carbone que dans le cycle
de l'azote.
Remerciements
Ce travail a été effectué dans
le cadre du Groupement
Scientifique « Misedor
».

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