T H È S

.
THÈSE
En vue de l'obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE
Délivré par L’Université Toulouse III – Paul Sabatier
Discipline ou spécialité : Pharmacologie
Présentée et soutenue par Anne-Sylvie KESTEMAN
Le 14 décembre 2009
Titre : Influence des facteurs associés à une antibiothérapie de type métaphylactique sur les relations
pharmacocinétiques/pharmacodynamiques (PK/PD) des antibiotiques.
Conséquences sur les schémas posologiques et sur l’émergence de résistance
JURY
Monsieur le Professeur Alain BOUSQUET-MELOU
Examinateur
Monsieur le Professeur Pascal GUSTIN
Rapporteur
Monsieur le Professeur Georges HOUIN
Examinateur
Madame le docteur Isabelle KEMPF
Rapporteur
Monsieur le Docteur Michel LAURENTIE
Examinateur
Monsieur le Professeur Pierre-Louis TOUTAIN
Examinateur
Membre invité : Madame Agnès PERRIN-GUYOMARD
Ecole doctorale : Biologie-Santé-Biotechnologies
Unité de recherche : UMR 181 Physiopathologie et Toxicologique Expérimentales, INRA, ENVT
Laboratoire d’Etudes et de Recherches sur les Médicaments Vétérinaires et les Désinfectants, AFSSA
Directeur(s) de Thèse : Monsieur le Professeur Pierre-Louis TOUTAIN
Monsieur le Docteur Michel LAURENTIE
Monsieur le Professeur Alain BOUSQUET-MELOU
Rapporteurs : Monsieur le Professeur Pascal GUSTIN
Madame le docteur Isabelle KEMPF
A Madame le Docteur Isabelle KEMPF, et Monsieur le Professeur Pascal GUSTIN, qui ont
accepté de consacrer de leur temps à la lecture et à l’appréciation de ce manuscrit, qu’ils
trouvent ici le témoignage de notre respectueuse gratitude.
A Monsieur le Professeur Georges HOUIN, qui nous a fait l’honneur d’accepter de faire partie de
notre jury de thèse. Qu’il soit assuré de nos plus sincères remerciements.
A Messieurs les Professeurs Alain BOUSQUET-MELOU et Pierre-Louis TOUTAIN, qui nous ont
accueillie comme doctorante, nous ont aidés et guidés tout au long de ces années de thèse avec
rigueur et optimisme. Qu’ils soient assurés de notre sincère reconnaissance.
A Messieurs les Docteurs Michel LAURENTIE et Pascal SANDERS, qui nous ont accueillie au sein
de leur laboratoire. Qu’ils soient assurés de tout notre respect et de toute notre reconnaissance.
A tous les membres de l’équipe « Antibiothérapie et Antibiorésistance » de l’UMR 181 qui ont
contribué à la réalisation de ce travail : Madame Nathalie ARPAILLANGE, Madame le Docteur
Véronique DUPOUY, et Madame Sylvie PUEL. Sincères remerciements.
A toute l’équipe zootechnie de l’UMR181 : Monsieur Sylvain BRUYAS, Monsieur Jean-Pierre GAU,
Monsieur Joseph MALIGOY, Monsieur Patrice ROUBY et Monsieur René SCHAN. Un grand merci
pour leur aide précieuse.
A tous les membres de l’unité Pharmacocinétique Pharmacodynamique du LERMVD de l’AFSSA de
Fougères qui m’ont accueillis chaleureusement et ont contribué à la réalisation de ce travail :
Madame Annick Brault, Madame le Docteur Mireille BRUNEAU, Mademoiselle Pamela LOUÂPRE,
pour sa bonne humeur et sa disponibilité, Madame Jacqueline MANCEAU, et Madame Catherine
POIRIER. Sincères remerciements.
1
A Madame Agnès PERRIN-GUYOMARD, pour ses conseils, son soutien, ses critiques toujours
constructives, pour s’être investie dans ce travail de fourmi, en souvenir de toutes ces boîtes
ensemencées et comptées un très grand merci.
A l’équipe zootechnie du LERMVD, Monsieur Stéphane MARTEAU, Monsieur Jean-Guy ROLLAND,
mes deux anges gardiens de Fougères. Un grand merci pour leur précieuse aide durant les phases
animales, pour leur inventivité, pour leur bonne humeur et leur soutien durant les longues
journées d’expérimentation.
A toute l’équipe des thésards, anciens et actuels à Toulouse : Julie ANTIC, Delphine BIBBAL
pour sa bonne humeur et toutes nos discussions, Séverine COLLET pour son aide précieuse sur la
dernière ligne droite, Aude FERRAN ma binôme, pour tous ses conseils, son immense patience et
ces heures passées enfermées dans notre bocal !, Elizabeth JEUNESSE, Julien LEGHAIT, pour
son initiation à la pose de cath, son calme et son optimisme et Béatrice ROCQUES, bon courage à
elle qui débute. Merci à tous pour votre bonne humeur et les tous les bons moments passés
ensemble.
A Fougères : Emmanuel BAZIN, Julie DAVID, merci de m’avoir initiée aux joies du pays
fougerais, pour nos ballades, tous ces moments où l’on a refait le monde, et pour m’avoir accueilli
chez elle de façon si spontanée !, Stéphanie FAURE, et Jérôme HENRI, merci à tous pour votre
accueil et tous ces bons moments passés ensemble.
A tous les membres de l’AFSSA Fougères, pour leur bonne humeur et leurs encouragements, avec
une mention spéciale aux « Cantine’s squatters » avec qui j’ai passé d’excellent moments
musicaux.
A tous les membres de l’UMR181, pour toute l’aide indispensable, qu’elle soit technique,
administrative ou scientifique qu’ils m’ont apportée, leur soutien, leur bonne humeur et leurs
encouragements. Un immense merci.
A ma famille pour leur amour, leur soutien et leurs encouragements tout au long de mes études.
A Emmanuel pour son amour, pour sa confiance et ses conseils
2
AVANT PROPOS
Ces travaux de thèse ont fait l’objet, à l’heure actuelle, des publications et communications
suivantes :
PUBLICATIONS
A.-S. KESTEMAN, A PERRIN-GUYOMARD, M. LAURENTIE, P. SANDERS, P.-L. TOUTAIN
and A. BOUSQUET-MELOU
Emergence of Resistant Klebsiella pneumoniae in the Intestinal Tract during
Successful Treatment of Klebsiella pneumoniae Lung Infection in Rats.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010 Jul; 54(7):2960-64
A.-S. KESTEMAN, A.A. FERRAN, A PERRIN-GUYOMARD, M. LAURENTIE, P. SANDERS,
P.-L. TOUTAIN and A. BOUSQUET-MELOU
Influence of Inoculum Size and Marbofloxacin Plasma Exposure on the Amplification
of Resistant Subpopulations of Klebsiella pneumoniae in a Rat Lung Infection Model.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2009 Nov; 53(11):4740-48
A.A. FERRAN, A.-S. KESTEMAN, P.-L. TOUTAIN and A. BOUSQUET-MELOU
Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Analysis of the Influence of Inoculum Size on the
Selection of Resistance in Escherichia coli by a Quinolone in a Mouse Thigh Bacterial
Infection Model.
Antimicrobial Agents Chemotherapy. 2009 Aug;53(8):3384-90
COMMUNICATIONS ORALES
A.-S. KESTEMAN, A.A. FERRAN, A PERRIN-GUYOMARD, M. LAURENTIE, P. SANDERS,
P.-L. TOUTAIN and A. BOUSQUET-MELOU
Influence of Inoculum size and Dosing Regimen on the Selection of Marbofloxacin
Resistant Mutants in Experimental Rat Klebsiella pneumoniae Lung Infection.
11th International Congress of the European Association for Veterinary Pharmacology and
Toxicology (EAVPT), 2009, Leipzig, Germany
A.-S. KESTEMAN, A PERRIN-GUYOMARD, M. LAURENTIE, P. SANDERS, P.-L. TOUTAIN
and A. BOUSQUET-MELOU
Impact d’une fluoroquinolone sur la flore pathogène et la flore commensale intestinale
dans un modèle d’infection pulmonaire par Klebsiella pneumoniae chez le rat
dixénique.
Journée d’Animation Scientifique du département santé animale de l’INRA, 2009, Port
d’Albret, France
A.-S. KESTEMAN, A.A. FERRAN, A PERRIN-GUYOMARD, M. LAURENTIE, P. SANDERS,
P.-L. TOUTAIN and A. BOUSQUET-MELOU
Influence of inoculum size and dosage regimens on the selection of marbofloxacin
resistant mutants in experimental rat Klebsiella pneumoniae lung infection.
4th International conference on Antimicrobial Agents in Veterinary Medicine (AAVM), 2008
Prague, République Tchèque
3
A.-S. KESTEMAN, A.A. FERRAN, A PERRIN-GUYOMARD, M. LAURENTIE, P. SANDERS,
P.-L. TOUTAIN and A. BOUSQUET-MELOU
Influence of inoculum size on the selection of marbofloxacin resistant mutants in
experimental rat Klebsiella pneumoniae lung infection.
4th European Network of Excellence for Zoonoses research annual meeting (Med-Vet-Net),
2008, St Malo, France
POSTERS
A.-S. KESTEMAN, A PERRIN-GUYOMARD, M. LAURENTIE, P. SANDERS, P.-L. TOUTAIN
and A. BOUSQUET-MELOU
Impact of Marbofloxacin Dosing Regimen on Intestinal Flora in a Dixenic Rat Model
with Klebsiella pneumoniae Lung Infection.
11th International Congress of the European Association for Veterinary Pharmacology and
Toxicology (EAVPT), 2009, Leipzig, Germany
A.-S. KESTEMAN, A.A. FERRAN, A PERRIN-GUYOMARD, M. LAURENTIE, P. SANDERS,
P.-L. TOUTAIN and A. BOUSQUET-MELOU
Influence of inoculum size and dosage regimen on the selection of marbofloxacin
resistant mutants in experimental Klebsiella pneumoniae lung infection in rats.
3rd Symposium on Antimicrobial Resistance in Animals and the Environment (ARAE), 2009,
Tours, France
A.-S. KESTEMAN, A.A. FERRAN, A PERRIN-GUYOMARD, M. LAURENTIE, P. SANDERS,
P.-L. TOUTAIN and A. BOUSQUET-MELOU
La taille de l’inoculum influence la sélection de mutant résistant à la marbofloxacine
dans un modèle expérimental d’infection pulmonaire chez le rat par Klebsiella
pneumoniae.
Journée Doctorants de l’AFSSA, 2008, Maison-Alfort, France
A.-S. KESTEMAN, A.A. FERRAN, V. DUPOUY, P.-L. TOUTAIN and A. BOUSQUET-MELOU
Influence of inoculum size on the selection of marbofloxacin resistant mutants in
experimental rat Klebsiella pneumoniae lung infection.
2nd Symposium on Antimicrobial Resistance in Animals and the Environment (ARAE), 2007,
Tours, France
A.-S. KESTEMAN, A.A. FERRAN, A PERRIN-GUYOMARD, M. LAURENTIE, P. SANDERS,
P.-L. TOUTAIN and A. BOUSQUET-MELOU
Influence du schéma d’administration des fluoroquinolones sur l’émergence de
bactéries résistantes dans la flore pathogène et la flore commensale du tube digestif.
Journée Doctorants de l’AFSSA, 2007, Maison-Alfort, France
4
Table des matières
TABLE DES MATIERES
AVANT PROPOS................................................................................................ 3
TABLE DES MATIERES .................................................................................. 5
TABLE DES ILLUSTRATIONS....................................................................... 9
LISTE DES ABREVIATIONS ........................................................................ 11
INTRODUCTION ............................................................................................. 15
CHAPITRE 1 – ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE........................................... 21
1.1. LES ANTIBIOTIQUES EN MEDECINE VETERINAIRE.......................................... 21
1.1.1. Utilisation des antibiotiques en médecine vétérinaire ............................................. 21
1.1.2. Impact de l’antibiothérapie vétérinaire sur la santé humaine ................................. 23
1.2. LES FLUOROQUINOLONES ...................................................................................... 25
1.2.1. Présentation générale des fluoroquinolones ............................................................ 25
1.2.2. Mode d’action des fluoroquinolones ........................................................................ 26
1.2.3. Propriétés pharmacologiques des fluoroquinolones................................................ 28
1.2.4. Utilisation des fluoroquinolones .............................................................................. 29
1.2.5. Un exemple de fluoroquinolone vétérinaire : la marbofloxacine............................. 32
1.3. MECANISMES DE RESISTANCE AUX FLUOROQUINOLONES.......................... 35
1.3.1. Mécanisme de tolérance phénotypiques ................................................................... 35
1.3.2. Diminution de la perméabilité de la membrane externe .......................................... 36
1.3.3. Protéines d’efflux...................................................................................................... 37
1.3.4. Mutations des enzymes cibles ................................................................................... 38
1.3.5. Résistance plasmidique............................................................................................. 40
1.4. LES ETUDES PHARMACOCINETIQUE-PHARMACODYNAMIQUE DES
ANTIBIOTIQUES : EXEMPLE DES FLUOROQUINOLONES ....................................... 43
1.4.1. Les principaux paramètres PK/PD utilisés .............................................................. 43
1.4.2. Un nouvel indice PK/PD : le temps dans la fenêtre de sélection ............................. 47
1.4.3. Facteurs influençant les indices PK/PD................................................................... 50
1.5. ECOSYSTEME INTESTINAL ET ANTIBIOTHERAPIE........................................... 55
1.5.1. Composition de la flore commensale du tube digestif.............................................. 55
1.5.2. Resistance à la colonisation ..................................................................................... 55
1.5.3. Impact de l’antibiothérapie sur la flore digestive .................................................... 56
1.5.4. Emergence de bactéries résistantes dans la flore digestive chez l’animal et
conséquences en termes de santé publique......................................................................... 56
1.5.5. Impact de l’utilisation des fluoroquinolones sur la flore commensale .................... 58
1.6. LES MODELES D’ETUDES DE L’IMPACT DES ANTIBIOTIQUES SUR LA
FLORE INTESTINALE........................................................................................................ 61
1.6.1. Paramètres étudiés ................................................................................................... 61
1.6.2. Les modèles in vitro.................................................................................................. 61
1.6.3. Les études cliniques chez l’Homme .......................................................................... 63
1.6.4. Les modèles animaux à flore totale (conventionnels) .............................................. 64
1.6.5. Les modèles animaux à flore contrôlée ou gnotoxénique......................................... 64
1.7. CONCLUSIONS ET OBJECTIFS DE LA THESE....................................................... 67
5
Table des matières
CHAPITRE 2 - ETUDE EXPERIMENTALE ............................................... 71
2. IMPACT DE LA MARBOFLOXACINE SUR LA FLORE
PATHOGENE ................................................................................................... 71
2.1. INTRODUCTION.......................................................................................................... 71
2.2. ETUDE DE LA BACTERIE UTILISEE ....................................................................... 73
2.2.1. Problématique et objectifs ........................................................................................ 73
2.2.2. Matériels et méthodes............................................................................................... 73
2.2.3. Résultats.................................................................................................................... 74
2.2.4. Conclusions .............................................................................................................. 75
2.3. IMPACT DE LA CHARGE BACTERIENNE SUR L’EMERGENCE DE BACTERIES
RESISTANTES A LA MARBOFLOXACINE .................................................................... 77
2.3.1. Problématique et objectifs ........................................................................................ 77
2.3.2. Matériels et méthodes............................................................................................... 77
2.3.3. Résultats.................................................................................................................... 80
2.3.4. Conclusion ................................................................................................................ 83
2.4. IMPACT DE LA CHARGE BACTERIENNE SUR LA CINETIQUE DE LA
MARBOFLOXACINE CHEZ LE RAT ............................................................................... 85
2.4.1. Problématique et objectifs ........................................................................................ 85
2.4.2. Matériels et méthodes............................................................................................... 85
2.4.3. Résultats.................................................................................................................... 87
2.4.4. Conclusion ................................................................................................................ 90
2.5. ETUDE DE LA RELATION ENTRE LES INDICES PK/PD ET L’EMERGENCE DE
BACTERIES RESISTANTES .............................................................................................. 91
2.5.1. Problématique et objectifs ........................................................................................ 91
2.5.2. Matériels et méthodes............................................................................................... 91
2.5.3. Résultats.................................................................................................................... 92
2.5.4. Conclusion ................................................................................................................ 96
2.6. DISCUSSION ................................................................................................................ 99
2.6.1. Influence de la charge bactérienne sur la pharmacocinétique ................................ 99
2.6.2. Influence d’un traitement métaphylactique ou curatif sur le devenir de l’infection et
l’émergence de résistance .................................................................................................. 99
2.6.3. Etude PK/PD .......................................................................................................... 100
2.6.4. Conclusion .............................................................................................................. 104
2.7. ARTICLE 1 .................................................................................................................. 107
CHAPITRE 3 - ETUDE EXPERIMENTALE ............................................. 121
3. IMPACT D’UN TRAITEMENT A LA MARBOFLOXACINE SUR LA
FLORE DU TUBE DIGESTIF ...................................................................... 121
3.1. INTRODUCTION........................................................................................................ 121
3.2. IMPACT DE LA CHARGE BACTERIENNE SUR LA CINETIQUE
D’ELIMINATION DE LA MARBOFLOXACINE DANS LES FECES .......................... 123
3.2.1. Problématique et objectifs ...................................................................................... 123
3.2.2. Résultats.................................................................................................................. 125
3.2.3. Conclusion .............................................................................................................. 126
3.3. ETUDE DES MICROORGANISMES IMPLANTES................................................. 127
3.3.1. Problématique et objectifs ...................................................................................... 127
6
Table des matières
3.3.2. Matériels et méthodes............................................................................................. 127
3.3.3. Résultats.................................................................................................................. 128
3.3.4. Conclusion .............................................................................................................. 128
3.4. IMPACT DE DIFFERENTS SCHEMAS POSOLOGIQUES DE
MARBOFLOXACINE SUR LA FLORE COMMENSALE .............................................. 129
3.4.1. Problématique et objectifs ...................................................................................... 129
3.4.2. Matériels et méthodes............................................................................................. 129
3.4.3. Résultats.................................................................................................................. 133
3.4.4. Conclusion .............................................................................................................. 137
3.5. DISCUSSION .............................................................................................................. 139
3.5.1. Impact de la charge bactérienne sur l’élimination de la marbofloxacine dans les
fèces .................................................................................................................................. 139
3.5.2. Impact des différentes modalités de traitement antibiotique sur la flore pathogène
au niveau du site infectieux .............................................................................................. 140
3.5.3. Impact des différentes modalités de traitement sur la flore commensale du tube
digestif .............................................................................................................................. 141
3.5.4. Colonisation du tractus digestif par la bactérie pathogène et émergence de
résistance .......................................................................................................................... 142
3.5.5. Conclusion .............................................................................................................. 144
3.6. ARTICLE 2 .................................................................................................................. 147
DISCUSSION GENERALE ........................................................................... 157
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES...................................................... 165
TITRE ET RESUME EN ANGLAIS ............................................................ 181
7
8
Table des illustrations
TABLE DES ILLUSTRATIONS
Tableaux
Tableau 1 : Fluoroquinolones utilisées chez l’animal en France (d’après le Dictionnaire des
Médicaments Vétérinaires 2009) ............................................................................ 30
Tableau 2 : Valeurs des AUC/CMI et AUC/MPC qui limitent l’émergence de bactéries
résistantes aux fluoroquinolones dans différents modèles in vitro et in vivo.......... 49
Tableau 3 : Population bactérienne totale et pourcentage d’animaux porteurs de R-2×MIC et
R-8×MIC 96 h après l’initiation des différents traitements à la marbofloxacine pour
le petit et le grand inoculum.................................................................................... 81
Tableau 4 : Paramètres pharmacocinétiques estimés pour la population étudiée .................... 87
Tableau 5 : AUC0-24 et AUC0-96 pour les différentes doses de marbofloxacine testées............ 90
Tableau 6 : Valeurs des différents indices PK/PD après l’administration de 16, 64 ou
100 mg/kg de marbofloxacine en administration unique ou fractionnée. ............... 92
Tableau 7: Quantité moyenne de marbofloxacine excrétée dans les fèces des animaux infectés
par un petit ou un grand inoculum. ....................................................................... 125
Tableau 8 : Population bactérienne totale et pourcentage d’animaux porteurs de KP résistantes
dans les poumons 7 jours après l’initiation du traitement à la marbofloxacine. ... 133
Tableau 9 : Quantité d’E. coli résistantes, de KP et de KP résistantes dans les fèces des
animaux infectés par le petit inoculum de KP, 4 et 7 jours après l’initiation du
traitement à la marbofloxacine.............................................................................. 136
Tableau 10 : Quantité d’E. coli résistantes, de KP et de KP résistantes dans les fèces des
animaux infectés par le grand inoculum de KP, 4 et 7 jours après l’initiation du
traitement à la marbofloxacine.............................................................................. 136
Figures
Figure 1 : Relations entre l’administration d’antibiotique et l’exposition des flores
bactériennes chez l’animal. ..................................................................................... 16
Figure 2 : Structure des quinolones.......................................................................................... 25
Figure 3 : Effet des quinolones sur l’ADN gyrase et la topoisomérase IV.............................. 27
Figure 4 : Schéma général du mode d’action des quinolones .................................................. 28
Figure 5 : Structure chimique de la marbofloxacine ................................................................ 32
Figure 6 : Les différentes familles de pompes à efflux ............................................................ 38
Figure 7 : Présentation des principaux paramètres PK/PD utilisés en antibiothérapie. ........... 44
Figure 8 : Fluoroquinolones et AUC/CMI ............................................................................... 45
Figure 9 : Relation entre différents indice PK/PD et l’efficacité des fluoroquinolones .......... 46
Figure 10 : La Fenêtre de Sélection ......................................................................................... 48
Figure 11 : Effet des indices PK/PD seuils sur la population majoritaire sensible et sur la
population minoritaire résistante............................................................................. 48
Figure 12 : Impact du niveau d’exposition dans la fenêtre de sélection sur la sélection de
mutants résistants, in vivo........................................................................................ 50
Figure 13 : Isolateurs souples pour l’élevage d’animaux axéniques........................................ 65
Figure 14 : Croissance in vitro de Klebsiella pneumoniae ATCC 43816................................ 75
Figure 15 : Cinétique de la marbofloxacine en fonction de la taille de l’inoculum ................. 88
Figure 16 : Simulation des profils de concentration de marbofloxacine pour les différents
schémas posologiques ............................................................................................. 89
Figure 17 : Relation entre Cmax/CMI et l’émergence de bactéries résistantes.......................... 93
Figure 18 : Relation entre le TMSW et l’émergence de bactéries résistantes............................. 94
9
Table des illustrations
Figure 19 : Relation entre le T>MPC et l’émergence de bactéries résistantes ............................ 95
Figure 20 : Relation entre le rapport T>MPC/TMSW et l’émergence de bactéries résistantes...... 97
Figure 21 : Quantité de marbofloxacine excrétée dans les fèces en fonction des doses
administrées........................................................................................................... 125
Figure 22 : Evolution de la population fécale d’E. faecium au cours du temps..................... 134
Figure 23 : Evolution de la population fécale d’E. coli au cours du temps ........................... 135
10
Liste des abréviations
LISTE DES ABREVIATIONS
ABC
ATP binding cassette
AFSSA
Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments
ATCC
American Type Cell Culture
AUC
Aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps
BHI
Brain Hearth Infusion
CFU
Colony Forming Unit
Cl
Clairance plasmatique
CLSI
Clinical and Laboratory Standards Institute
Cmax
Concentration Plasmatique maximale
CMB
Concentration Minimale Bactéricide
CMI
Concentration Minimale Inhibitrice
E. coli
Escherichia coli
E. faecium
Enterococcus faecium
ENVT
Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse
EOPS
Exempt d’Organisme Pathogène Spécifique
FQ
Fluoroquinolone
FS
Fenêtre de Sélection
HEPA
High Efficiency Particulate Air Filter
HFA
Human Flora Associated
HPLC
Chromatographie en phase liquide à haute performance
INRA
Institut National de la Recherche Agronomique
K. pneumoniae
Klebsiella pneumoniae
KP
Klebsiella pneumoniae
LERMVD
Laboratoire d’Etudes et de Recherches sur les Médicaments Vétérinaires
et les Désinfectants
LMR
Limites Maximales de Résidus
LOQ
Limite of quantification
MAE
Malt Extract Agar
MAR
Multiple Antibiotic Resistance
MATE
Multiple Antimicrobial and Toxin Extrusion
MDR
Multi Drug Resistant
MFS
Major Facilitator Superfamily
MH
Mueller Hinton
MPC
Mutant Prevention Concentration
MRP
Multidrug Resistance-related Protein
MSW
Mutant Selection Window
11
Liste des abréviations
P. aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa
P-gp
P-Glycoprotéine
PK/PD
Pharmacocinétique/Pharmacodynamie
PMQR
Plasmid Mediated Quinolone Resistance
Qnr
Quinolone Resistance
QRDR
Quinolone Resistance Determining Region
RND
Resistance-Nodulation-Division
S. aureus
Staphylococcus aureus
S. pneumoniae
Streptococcus pneumoniae
SMR
Small Multidrug Resistance
T>MPC
Temps supérieur à la MPC
T1/2
Temps de demi-vie
TA
Toxine-Antitoxine
TGY
Trypticase Glucose Yeast extract
Tmax
Temps d’occurrence de la concentration plasmatique maximale
TMSW
Temps passé dans la fenêtre de sélection
UMR
Unité Mixte de Recherche
12
INTRODUCTION
13
14
Introduction
INTRODUCTION
Les travaux de recherche présentés dans ce document ont été réalisés au sein de
deux structures : le Laboratoire d’Etudes et de Recherches sur les Médicaments Vétérinaires
et les Désinfectants, LERMVD, situé à l’AFSSA de Fougères et l’UMR 181 de Physiologie et
Toxicologie Expérimentales INRA, ENVT, située à l’Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse.
L’unité Pharmacocinétique-Pharmacodynamie du LERMVD, animée par le
Docteur Michel Laurentie, étudie le développement des outils d’analyse pharmacocinétique
et pharmacodynamique afin d’optimiser les posologies des antibiotiques vis-à-vis de la
résistance aux antibiotiques sur des modèles in vitro et in vivo.
L’équipe « Antibiothérapie et Antibiorésistance » de l’UMR 181, animée par le
Professeur Alain Bousquet-Mélou étudie la problématique de l’antibiorésistance chez les
animaux à deux niveaux :
- L’émergence de résistance chez les pathogènes cibles d’une antibiothérapie,
dont les enjeux concernent la santé animale, et
- L’émergence de résistance dans la flore commensale digestive, avec ses
conséquences potentielles en santé humaine via la contamination de la chaîne alimentaire
et/ou l’environnement. Les enjeux touchent ici à la santé publique et à la sécurité sanitaire
des aliments.
La Figure 1 illustre les enjeux liés au contrôle simultané de la résistance au niveau
d’un foyer infectieux et de la flore commensale digestive. Mon travail de thèse fait le lien
entre les différentes thématiques des deux équipes avec une première partie du travail
portant sur les relations Pharmacocinétiques-Pharmacodynamiques (PK/PD) associées à
l’émergence de résistance au niveau des pathogènes cibles et une deuxième partie portant
sur la résistance des bactéries de la flore commensale digestive. Ce travail a été réalisé
sous la direction des Professeurs Alain Bousquet-Mélou et Pierre-Louis Toutain au sein de
l’UMR181 ainsi que des Docteurs Michel Laurentie et Pascal Sanders au sein du LERMVD.
Il est actuellement reconnu que le développement constant des antibiotiques en
médecine vétérinaire, et notamment celui des fluoroquinolones, est associé à une
augmentation de la résistance à ces antibiotiques au niveau de la flore pathogène du site
infectieux et de la flore commensale du tube digestif. Le contrôle de l’antibiorésistance pour
ces deux flores constitue un double enjeu pour la santé animale et la santé publique, les
bactéries commensales du tube digestif pouvant jouer un rôle de réservoir de bactéries
résistantes transmissibles à l’Homme via la chaîne alimentaire ou l’environnement. Une
stratégie de lutte contre l’antibiorésistance consiste à élaborer des schémas posologiques
15
Introduction
garantissant à la fois un effet bactéricide et la prévention de l’émergence de souches
résistantes.
Antibiotique
Biophase
Pathogène
d'intérêt
vétérinaire
SANG
Circulation
Résistance chez l’animal
= Echec thérapeutique
= Enjeu de Santé Animale
Bile
Sécrétions
intestinales
Contenu digestif
Flore commensale
Pathogènes zoonotiques
résistants (salmonelles,
campylobacters spp)
Gènes de résistance
Exposition de
l'environnement
Chaîne
alimentaire
H
O
M
M
E
Résistance chez
l’homme
= Enjeu de Santé
Publique
Figure 1 : Relations entre l’administration d’antibiotique et l’exposition des flores
bactériennes chez l’animal.
Le développement de la résistance aux antibiotiques au niveau des flores cibles (foyers infectieux)
et non cibles (flore commensale digestive) aura un impact sur la santé animale et la santé publique.
La fraction de l’antibiotique atteignant le tube digestif exerce une pression de sélection importante
sur les bactéries de l’écosystème du tube digestif distal. Cela peut conduire à l’émergence de
résistance de germes zoonotiques (Salmonelle, E. coli, …) et/ou la constitution d’un réservoir de
gènes de résistance chez des bactéries non pathogènes pour l’homme mais qui peuvent servir de
vecteur de diffusion à ces gènes de résistance vers l’environnement ou la chaîne alimentaire.
L’antibiothérapie en élevage est pratiquée selon trois modalités : l’usage curatif,
consistant à traiter des animaux présentant des signes cliniques d’infection, l’usage
métaphylactique, consistant à traiter tous les animaux d’un groupe lorsqu’une faible
proportion d’entre eux présente des signes cliniques d’infection et l’usage prophylactique
qui consiste à traiter tous les animaux d’un groupe avant même l’occurrence d’une infection.
L’antibiothérapie de type métaphylactique est particulièrement controversée, car il lui est
reproché d’induire une surconsommation des antibiotiques, ce qui favoriserait l’émergence
de bactéries résistantes, ce dernier point n’étant pas prouvé.
Le rationnel de la métaphylaxie, également appelée « prévention en milieu infecté »,
repose sur l’hypothèse que, au moment de l’intervention, tous les individus du groupe sont
déjà infectés ou le seront dans un délai très bref, et qu’il est plus favorable, et surtout plus
pratique, de traiter au cours de la phase d’incubation avant que les symptômes de la maladie
ne se soient manifestés. En effet, cette phase d’incubation se distingue de la phase clinique
par le statut physiopathologique des animaux et par la population bactérienne cible. Le
statut physiologique des animaux est très important car le développement de l’infection et
ses manifestations cliniques ont un impact sur i) les capacités de défense de l’organisme,
16
Introduction
ii) la consommation alimentaire (anorexie associée au syndrome fébrile) ce qui interdit ou
limite un traitement par voie orale et iii) l’exposition de l’animal pour une dose donnée, la
pharmacocinétique des antibiotiques pouvant être altérée par la fièvre.
La taille de la population bactérienne (inoculum) cible présente au niveau du site
infectieux à l’initiation de l’antibiothérapie diffère également entre d’un traitement de type
métaphylactique et un traitement de type curatif. La précocité du traitement par rapport aux
signes cliniques d’infection permet à l’antibiotique d’agir sur une faible population
bactérienne alors que cette population est plus importante avec une initiation de
l’antibiothérapie plus tardive comme c’est le cas lors d’un traitement de type curatif. De plus,
les principales résistances aux fluoroquinolones étant liées à des mutations ponctuelles sur
les gènes codant pour leurs cibles et sous l’hypothèse d’un taux de mutation constant, une
augmentation de la taille de l’inoculum bactérien est associée à l’augmentation de la
probabilité de la présence de mutants résistants dans la population bactérienne.
Les facteurs précités (pharmacocinétique, taille de la population bactérienne, statut
physiopathologique, système immunitaire) ont un impact sur l’efficacité des antibiotiques. En
effet ils interviennent sur les deux paramètres clefs du schéma posologique : l’exposition et
les concentrations efficaces. En termes de santé publique ils peuvent donc être impliqués
dans le développement de résistances. A ce titre il n’est pas évident que les antibiothérapies
curatives soient la meilleure stratégie d’utilisation des antibiotiques en élevage.
Dans ce contexte, notre hypothèse de travail est que la stratégie métaphylactique
offre plusieurs caractéristiques favorables en termes d’usage prudent des antibiotiques.
Dans une première partie du travail de thèse (chapitre 2) nous avons donc choisi d’étudier
l’influence
des
facteurs
caractéristiques
de
la
métaphylaxie
sur
les
relations
Pharmacocinétiques-Pharmacodynamiques (PK/PD) des antibiotiques sur la flore pathogène
cible et d’en déduire les schémas posologiques adaptés à la métaphylaxie afin d’apporter un
bénéfice en terme d’efficacité clinique et bactériologique, de contrôle de l’émergence de
pathogènes résistants et de consommation globale d’antibiotiques dans les élevages.
Dans un deuxième temps, compte tenu des conséquences réelles et potentielles pour
la santé publique, il nous a paru pertinent de nous intéresser également à l’impact des
différents types d’antibiothérapies sur la flore commensale du tube digestif des animaux
traités. Dans une seconde partie du travail de thèse (chapitre 3) nous avons donc étudié
l’émergence de bactéries commensales résistantes, ainsi que des bactéries pathogènes
résistantes au niveau du tube digestif des animaux traités selon une antibiothérapie de type
curative ou métaphylactique.
17
18
Chapitre 1
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
19
20
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Les antibiotiques en médecine vétérinaire
CHAPITRE 1 – ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
1.1. Les antibiotiques en médecine vétérinaire
Les antibiotiques utilisés en médecine humaine et vétérinaire appartiennent aux
mêmes familles, à l’exception de quelques sous familles spécifiques de la médecine
humaine.
Les traitements antibiotiques ont pour objectifs la maîtrise des maladies, la
restauration ou le maintien du bien-être animal et la prévention de la transmission des
agents pathogènes aux autres animaux voire à l’Homme.
1.1.1. Utilisation des antibiotiques en médecine vétérinaire
En médecin vétérinaire, il existe quatre usages possibles des antibiotiques, chacun
ayant un objectif précis (202, 203).
1.1.1.1. L’usage curatif
L’usage curatif ou thérapeutique, consiste à traiter individuellement les animaux qui
présentent des signes cliniques d’infection, c'est-à-dire à traiter une infection bactérienne
existante. L’objectif majeur est d’obtenir la guérison de ces animaux cliniquement malades et
d’éviter la mortalité. En général le traitement est individuel et il est mis en œuvre chez les
animaux domestiques, et les grands animaux de rentes (vaches laitières, …). Le plus
souvent, le traitement antibiotique est donné par voie orale ou par voie parentérale.
Dans le cas d’une antibiothérapie de type curative, à l’initiation du traitement, il est
généralement admis que la charge bactérienne est importante (118, 176) étant donné que
les animaux ont déjà développé des symptômes cliniques.
1.1.1.2. L’usage métaphylactique
Les traitements individuels sont souvent impossibles pour les grands élevages
d’animaux tels que les bandes de porcs, de volailles ou de veaux. Lorsqu’une infection
contagieuse se déclare chez quelques animaux dans un élevage à grand effectif, l’ensemble
du groupe (la case pour les porcelets, le lot, …) est traité, c’est ce qu’on appelle la
métaphylaxie ou prévention en milieu infecté. Cet usage permet de traiter les animaux
21
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Les antibiotiques en médecine vétérinaire
soumis à la pression infectieuse alors qu’ils sont encore en phase d’incubation ou lorsque
les manifestations cliniques sont très discrètes. La métaphylaxie est généralement mise
en œuvre à partir d’un seuil d’atteinte des animaux au sein du lot de 10-15% de l’effectif.
Une antibiothérapie précoce sur la totalité des animaux du groupe (lot, parquet, …)
peut permettre de réduire le nombre d’animaux malades et/ou la mortalité et peut diminuer la
quantité d’antibiotique qui aurait été nécessaire pour traiter un grand nombre d’animaux
malades présentant des signes cliniques d’infection.
Généralement, les traitements métaphylactiques se font par administration dans l’eau
de boisson ou dans l’aliment. Ce type d’administration comporte certains risques tels que :
une non homogénéité de la préparation antibiotique-nourriture, une incompatibilité de la
substance avec les composés de la nourriture ou une insolubilité dans l’eau de boisson. De
plus, une prise insuffisante de l’antibiotique, résultant de la diminution de la prise alimentaire
et hydrique due au syndrome fébrile, ou à la modification du goût de l’aliment ou de la
boisson peut conduire à une mauvaise exposition des animaux car la dose individuelle n’est
pas contrôlée.
Lors d’une antibiothérapie de type métaphylactique, les animaux traités ne sont
probablement porteurs que d’une faible charge bactérienne étant donné qu’ils ont peu ou
pas encore développé de signes cliniques d’infection. Pour les traitements métaphylactiques,
le germe impliqué est connu a priori ainsi que ce que sera le devenir de la pathologie si rien
n’est fait.
1.1.1.3. L’usage prophylactique
Les antibiothérapies prophylactiques sont mises en place lors de situations critiques
c'est-à-dire lors de présence d’un facteur de risque très souvent associées au
développement d’infections. Il s’agit notamment de périodes associées à un stress comme
lors de transports, de regroupement d’animaux provenant d’élevages divers ou du sevrage,
mais aussi lors de traitements chirurgicaux. Elles peuvent être appliquées de façon
individuelle ou sur un groupe d’animaux. Les animaux traités ne présentent alors aucun
signe clinique d’infection mais la connaissance a priori des infections se développant dans
ces situations permet de choisir une classe d’antibiotique adaptée à la prévention des
infections dues aux bactéries les plus fréquemment rencontrées. La principale différence
entre la métaphylaxie et la prophylaxie est que lors d’une prophylaxie il n’y a pas encore de
germe impliqué mais seulement un facteur de risque.
22
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Les antibiotiques en médecine vétérinaire
1.1.1.4. Facteurs de croissance
Les antibiotiques peuvent être utilisés dans l’aliment au titre d’additifs en vue
d’améliorer la croissance et les performances des animaux, sans que les mécanismes à
l’origine de l’amélioration de ces performances aient été clairement élucidés (52). Cet usage
fait l’objet de nombreuses critiques et il est totalement interdit au sein de l’union Européenne
depuis 2006 (211).
1.1.2. Impact de l’antibiothérapie vétérinaire sur la santé
humaine
1.1.2.1. Résidus de traitement et flore intestinale humaine
Des résidus d’antibiotiques sont parfois retrouvés dans le lait ou la viande, lorsque,
après un traitement antibiotique préventif ou thérapeutique des animaux, l'éleveur n'observe
pas le temps d’attente prescrit par la législation. Chez certains animaux il est possible de
retrouver des résidus antibiotiques même après le temps d’attente officiel mais ce risque est
très faible.
Les résidus d’antibiotiques présents dans les denrées animales représentent un
danger dont les risques associés sont d’ordres allergique, toxicologique, microbiologique et
industriel. Ces résidus peuvent notamment perturber la flore intestinale humaine. En effet,
même à très faibles doses les antibiotiques ingérés ont un impact sur l’écologie de la flore
intestinale comme cela a été montré in vitro (28) et in vivo (39, 173, 174), ce qui peut
comporter certains risques pour la santé humaine (voir paragraphe 1.5.). C’est pourquoi, de
nombreux pays surveillent la quantité de résidus d’antibiotiques dans les produits animaux et
évaluent ces différents risques afin de fixer des limites maximales acceptables de résidus
(LMR). De ce fait, l’impact des résidus retrouvés dans les produits animaux sur l’Homme est
théoriquement nul. En France en 2007, seuls 0.4% des échantillons testés sur 4401 n’étaient
pas conformes aux LMR pour les antibiotiques (1).
1.1.2.2. Diffusion des bactéries résistantes entre l’animal et l’Homme
Les agents antimicrobiens couramment utilisés pour traiter ou prévenir des infections
bactériennes chez les animaux appartiennent essentiellement aux mêmes classes de
composés que ceux utilisés en médecine humaine. De plus, les bactéries isolées chez les
animaux et celles isolées chez l’Homme, que ce soit lors d’une infection ou en situation de
colonisation, partagent les mêmes mécanismes de résistance. Cela est un argument
23
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Les antibiotiques en médecine vétérinaire
extrêmement solide de l’absence d’étanchéité entre le monde animal et les populations
humaines.
Les animaux de rente et les animaux de compagnie, comme les humains, peuvent
être des réservoirs de bactéries résistantes et le développement de bactéries résistantes
peut se produire aussi bien chez l’Homme que chez l’animal. La dissémination de ces
bactéries résistantes entre les différents hôtes (animal-animal, humain-humain, animalhumain ou humain-animal) peut se produire par contact direct ou par contact avec des
matières contenant des bactéries (salive, fèces, …) mais peut également se produire par la
contamination de la nourriture, de l’air ou de l’eau. Lorsqu’elle atteint un nouvel hôte, la
bactérie peut coloniser ou infecter. Elle peut alors disséminer ses gènes de résistance aux
bactéries présentes (commensales ou pathogènes) mais également recevoir elle-même des
gènes de résistance d’autres bactéries.
La diffusion de bactéries résistantes aux antibiotiques de l’animal à l’Homme est donc
non seulement possible, mais de nombreux arguments attestent de sa réalité pour certains
pathogènes. Dès 1969 un rapport de Swann au Royaume Uni a attiré l’attention sur le
potentiel de dissémination via la chaîne alimentaire des bactéries résistantes issues
d’animaux traités par des antibiotiques (216). Depuis, différentes études ont mis en évidence
des transferts d’entérobactéries résistantes (E. coli, Salmonella et Campylobacter) de
l’animal à l’Homme via la chaîne alimentaire ou via un contact direct, conduisant à
l’établissement d’un réservoir de gènes de résistances (125, 223-225).
Cependant, les bactéries zoonotiques résistantes sont les seules dont on peut dire
avec certitude qu’elles passent de l’animal à l’Homme (Salmonelles, Campylobacter,
entérocoques et E. coli) (158, 233), principalement via la chaîne alimentaire car il n’y a pas
de contamination inter-humain pour ce pathogène. Cela dit, il est important de considérer
qu’il peut y avoir un portage asymptomatique de certaines de ces bactéries chez l’Homme et
que, par conséquent, toutes les infections zoonotiques ne sont pas forcement dues à une
contamination directe via les animaux ou les produits animaux (153).
24
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Présentation des Fluoroquinolones
1.2. Les fluoroquinolones
1.2.1. Présentation générale des fluoroquinolones
Les quinolones, ou acide pyridine-β-carboxylique, forment une large classe
d'antibactériens de synthèse. Le premier composé de ce groupe, l'acide nalidixique a été
décrit pour la première fois en 1962. Cependant, les premières quinolones développées ont
eu une application clinique limitée (infections urinaires) due à leur faible absorption lors d’une
administration orale, à une activité antibactérienne modérée, à une liaison aux protéines
importantes et à une toxicité importante (23). Dans les années 1980, l’addition d’une
molécule de fluor en position 6 et la substitution pipérazine en position 7 a augmenté
l’activité des ces composés ainsi que leur absorption orale et leur distribution dans les tissus
(12). Les molécules portant un groupement fluor sur le noyau quinolone forment le groupe
des fluoroquinolones (Figure 2).
Figure 2 : Structure des quinolones
Le groupe R (Bleu) est généralement un groupe pipérazine; si la molécule est liée à un fluor (F), il
s'agit d'une fluoroquinolone.
Les fluoroquinolones sont des antibiotiques à large spectre qui sont devenus très
utilisés en médecine humaine et vétérinaire au fur et à mesure de l’émergence de résistance
vis-à-vis des autres antibiotiques. En 2007, la consommation de fluoroquinolones en France
a été de 4.7 tonnes dont 42% pour les bovins, 32% pour les volailles, 16% pour les porcs et
10% pour les animaux de compagnie (34). Sur la même période, 2% et 11% des Escherichia
coli isolées de volailles et de porcs étaient résistantes aux fluoroquinolones (données
AFSSA 2007).
Les quinolones sont classées en quatre générations basées sur leur activité et leur
spectre d’action. En médecine vétérinaire, seules les 3 premières générations de quinolones
sont utilisées, les fluoroquinolones de 4ème génération étant réservées à la médecine
humaine.
25
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Présentation des Fluoroquinolones
Les quinolones de première génération, comme l’acide nalidixique ou l’acide
oxolinique, du fait de leurs faibles concentrations sériques, étaient réservées aux infections
urinaires (12).
Les quinolones de deuxième génération, qui sont des fluoroquinolones, comme la
ciprofloxacine, la norfloxacine ou l’ofloxacine en médecine humaine et la fluméquine en
médecine vétérinaire ont une activité plus importante sur les bactéries à Gram négatif ainsi
que contre certains pathogènes atypiques. Ces substances ont une bonne biodisponibilité
orale. Leur principal inconvénient est leur efficacité limitée envers les bactéries à Gram
positif.
Les
fluoroquinolones
de
troisième
génération,
comme
la
gatifloxacine,
la
grepafloxacine, la levofloxacine, la moxifloxacine ou la sparfloxacine en médecine humaine
et la danofloxacine, l’enrofloxacine, la difloxacine, l’orbifloxacine, l’ibafloxacine ou la
marbofloxacine en médecine vétérinaire ont une activité étendue aux bactéries à Gram
positif.
Les fluoroquinolones de quatrième génération, comme la gémifloxacine ou la
trovafloxacine ont un spectre d’activité étendu aux bactéries anaérobies.
1.2.2. Mode d’action des fluoroquinolones
Lorsqu'elles ont diffusé dans le cytoplasme, les fluoroquinolones vont inhiber de
manière sélective la réplication de l'ADN bactérien. Les fluoroquinolones ciblent deux
enzymes parentes appartenant à la famille des topoisomérases II et qui sont impliquées
dans la synthèse de l’ADN bactérien : l'ADN-gyrase (généralement cible principale chez les
bactéries à Gram négatif) et la topoisomérase IV (généralement cible principale chez les
bactéries à Gram positif) (106). Les nouvelles fluoroquinolones comme la gatifloxacine et la
moxifloxacine possèdent les deux activités (82).
L’ADN Gyrase, est composée de deux sous-unités GyrA codées par le gène gyrA et
de deux sous-unités GyrB codées par le gène gyrB. Elle introduit un super-enroulement
négatif dans la double hélice d’ADN bactérien en amont de la fourche de réplication (124).
Cette activité est essentielle pour l’initiation de la réplication de l’ADN bactérien et pour la
transcription.
La topoisomérase IV a une activité de décaténation qui permet la séparation des
chromosomes répliqués à la fin d’une séquence de réplication (3, 243). Elle est composée
de 4 sous-unités homologues de celles de la gyrase, deux sous-unités ParC (homologues de
GyrA) et deux sous-unités ParE (homologues de GyrB) encodées par les gènes parC et
parE respectivement.
26
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Présentation des Fluoroquinolones
La structure et la fonction de l’ADN gyrase et de la topoisomérase IV sont présentées
de façon schématique dans la Figure 3.
ADN gyrase
GyrA GyrA
GyrB GyrB
ADN superenroulé
ADN relaché
Quinolone
ADN caténé
ADN décaténé
ParC ParC
ParE ParE
Topoisomérase IV
Figure 3 : Effet des quinolones sur l’ADN gyrase et la topoisomérase IV
Les quinolones bloquent les activités de l’ADN gyrase et de la topoisomérase IV en stabilisant le
complexe enzyme-ADN. Ceci agit comme une barrière pour les autres enzymes comme l’ADN
polymérase et l’ARN polymérase.
D’après Hooper, 1999 (106).
Les fluoroquinolones interagissent avec le complexe enzyme-ADN (la gyrase ou la
topoisomérase IV), ceci crée des changements conformationnels qui entraînent l’inhibition de
l’activité normale de l’enzyme (58). La mort cellulaire induite par les fluoroquinolones passe
par deux étapes. La première est réversible (bactériostatique, Figure 4, d), elle consiste en la
formation du complexe quinolone-enzyme-ADN qui bloque la progression de la fourche de
réplication et inhibe ainsi la synthèse de l’ADN bactérien (143). Ceci induit une réponse de
type SOS qui conduit à la filamentation puis à la mort de la bactérie. La seconde étape, qui
conduit à la fragmentation des chromosomes, requiert des concentrations de quinolone plus
importantes. Les complexes quinolone-enzyme-ADN qui sont répartis tout le long du
chromosome entraînent des cassures de l’ADN afin de libérer les contraintes, dues au
super-enroulement ce qui conduit à la fragmentation du chromosome et à la mort cellulaire
(57, 58, 105) (Figure 4).
27
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Présentation des Fluoroquinolones
ADN
DNA-gyrase
Topoisomérase IV
Quinolone
Quinolone de
première génération
Fluoroquinolone
Mort cellulaire
Figure 4 : Schéma général du mode d’action des quinolones
a) Formation d’un complexe ternaire Quinolone-enzyme-ADN
b) Liaison des quinolones aux sous-unités GyrA ou ParC
c) Coupure du premier brin d’ADN et formation d’un complexe de clivage
d) Coupure du deuxième brin d’ADN (correspond à l’activité bactériostatique)
e) Coupures des doubles brins (mort cellulaire)
f) Coupures des doubles brins par dissociation des sous-unités (mort cellulaire)
D’après Drlica et al. 1997 (58)
1.2.3. Propriétés pharmacologiques des fluoroquinolones
La liaison des fluoroquinolones aux protéines plasmatiques est généralement faible,
inférieure à 30 % pour la ciprofloxacine, l’ofloxacine, la péfloxacine, la norfloxacine et la
marbofloxacine. Les fluoroquinolones pénètrent bien dans les tissus et le volume de
distribution important suggère une concentration de ces substances dans les tissus.
Le temps de demi-vie d’élimination des fluoroquinolones dépend de la substance et
de l’espèce cible. Néanmoins, un temps de demi-vie d’élimination relativement long fait des
fluoroquinolones des substances idéales pour des administrations toutes les 24 ou 48 h.
L’élimination se produit par les voies rénales et non rénales (voie hépatique et gastrointestinale). Pour la plupart de ces substances, le métabolisme compte pour moins de 20%
de l’élimination (235).
28
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Présentation des Fluoroquinolones
L’élimination intestinale des fluoroquinolones passe principalement via la voie
transépithéliale étant donné que 1 à 3 % de la dose administrée est éliminée via la sécrétion
biliaire (209, 236). L’excrétion intestinale des fluoroquinolones semble se produire via des
mécanismes complexes combinant la diffusion passive et le transport actif. Différentes
études ont montrés que cette excrétion intestinale passe notamment par les Pglycoprotéines (P-gp) ainsi que les MRP (Multidrug Resistance-related Protein) (133, 193,
239).
1.2.4. Utilisation des fluoroquinolones
Chez l’homme, les fluoroquinolones sont utilisées pour traiter de nombreuses
infections, incluant les infections urinaires, les prostatites, les maladies sexuellement
transmissibles, les infections du tractus digestif et du tractus respiratoire, les infections
osteo-articulaires et les infections cutanées et des tissus mous (50, 235). Un autre domaine
d’indication vise la microflore digestive. Il s’agit des traitements des entérites bactériennes,
des décontaminations sélectives, ou des prophylaxies des diarrhées du voyageur. Les
fluoroquinolones sont notamment utilisées en prophylaxie chez les patients suivant une
chimiothérapie, afin de diminuer le risque d’infections opportunistes par les bactéries
commensales du tube digestif. Elles sont également utilisées en prophylaxie chez les
patients immunodéprimés pour décontaminer le tube digestif, avant une chirurgie ou pour
prévenir la survenue d’une péritonite chez les patients cirrhotiques (50, 92).
Chez l’animal, elles sont utilisées pour le traitement d’infections respiratoires à
Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica et Mycoplasma bovis chez les bovins et à
Actinobacillus pleuropneumoniae, Mycoplasma hyopneumoniae et Pasteurella multocida
chez le porc. Elles sont également indiquées dans le traitement des gastroentérites à
Escherichia coli K99 chez le veau et pour le traitement du syndrome mammite-métritesagalactie chez la truie. Chez les carnivores domestiques, les fluoroquinolones sont indiquées
dans le traitement des pyodermites, des infections respiratoires et des infections du tractus
urinaire dues à E. coli ou à Proteus mirabilis, mais peuvent également être administrées en
prophylaxie chirurgicale (Tableau 1).
29
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Présentation des Fluoroquinolones
Tableau 1 : Fluoroquinolones utilisées chez l’animal en France (d’après le Dictionnaire des
Médicaments Vétérinaires 2009)
PRINCIPE
ACTIF
NOM
ESPECES
DEPOSE
VOIE
CIBLES
en France
FORMES
INDICATIONS
telles que proposées par la firme
FLUOROQUINOLONES DE 2EME GENERATION
Veaux
Bovins
Ovins
Caprins
Porcins
VO
Bolus
Poudres orales
Lapins
IM
Suspension
injectable
Chiens
Chats
VO
Comprimés
Flumisol®
Veaux
Volailles
VO
Solution buvable
Salmonellose, Pasteurellose, Colibacillose
(K99)
Flumival®
Veaux
Volailles
VO
Solution buvable
Salmonellose, Pasteurellose, Colibacillose
(K99)
Flumiquil®
Fluméquine
Porcs
Flumix®
VO
Prémélange
médicamenteux
Ibaflin®
Chien
Affections à germes sensibles à la
fluméquine
Infections respiratoires à Pasteurella
multocida, Actinobacillus
pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis
Entérites à Escherichia coli et Salmonella
Infection septicémiques à Aeromonas
salmonicida, Yersinia ruckeri et Vibrio
anguillarum
Poissons
Ibafloxacine
Salmonellose, Pasteurellose, Colibacillose
(K99)
Infections à Bordetella, Klebsiella et
certains staphylocoques
VO
comprimés
Infection dermique à staphylocoques, E.
coli et Proteus mirabilis
Infection du tractus urinaire à Proteus spp. ,
Enterobacter spp., E. coli ou Klebsiella spp.
Infection de l’appareil respiratoire supérieur
à staphylocoques, E. coli ou Klebsiella spp.
FLUOROQUINOLONES DE 3EME GENERATION
A180®
Bovins
SC
Solution
injectable
Advocine®
25
Bovins
Porcins
IM
Solution
injectable
Danofloxacine
Infections respiratoires à Pasteurella
multocida, Manheimia heamolytica,
Mycoplasma bovis
Entérites à E.a coli chez le veau
Infections respiratoires à Pasteurella
multocida, Manheimia heamolytica,
Mycoplasma bovis
Infections respiratoires à Actinobacillus
pleuropneumoniae et Pasteurella multocida
Entérites à E. coli chez le veau et le
porcelet
SC
Solution
injectable
VO
Comprimés
Bovins
SC
Solution
injectable
Poules
Dindes
VO
Chiens
Difloxacine
Dicural®
Infections aiguës et non compliquées du
tractus urinaire par E. coli ou
Staphylococcus spp.
Pyodermites superficielles par
Staphylococcus intermedius
Infections respiratoires à Pasteurella
multocida, Manheimia heamolytica,
Mycoplasma bovis
Infections respiratoires à E. coli ou
Solution buvable Mycoplasma gallisepticum
Infections à Pasteurella multocida
30
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Présentation des Fluoroquinolones
PRINCIPE
ACTIF
NOM
ESPECES
DEPOSEen
VOIE
CIBLES
France
FORMES
INDICATIONStelles que proposées par
la firme
Infections des voies respiratoires
supérieures
Chat
VO
Comprimés
Veaux
Bovins
VO
SC
IM
Porcins
VO
SC
IM
Bolus
Solution buvable
Solution
Bolus
Solution buvable
Solution
injectable
Poules
Dindes
VO
Lanflox®
Poules
Dindes
VO
Solution buvable
Quinoflox®
Poules
Dindes
VO
Infections respiratoires dues
à Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma
Solution buvable synoviae et E. coli.
Chien
Baytril®
Bolus
Infections de l’appareil urinaire à E. coli et
Proteus mirabilis
Pyodermites superficielles et profondes
Infections respiratoires à Pasteurella
multocida, Manheimia heamolytica
Infections respiratoires à Actinobacillus
pleuropneumoniae, Pasteurella multocida
et Mycoplasma hyopneumoniae
Infections respiratoires à Mycoplasma
synoviae ou Mycoplasma gallisepticum
Solution buvable Infections digestives ou génitales à E. coli
Enrofloxacine
Infections respiratoires dues à E.
coli et/ou Mycoplasma gallisepticum
Infections génitales dues à E. coli
Veaux
SC
IM
Solution
injectable
Infections respiratoires à Pasteurella
multocida, Manheimia heamolytica
Porcins
SC
IM
Solution
injectable
Infections respiratoires à Actinobacillus
pleuropneumoniae, Pasteurella multocida
et Mycoplasma hyopneumoniae
Volailles
VO
Revoflox®
Tenotryl®
Infections respiratoires à Mycoplasma
Solution buvable synoviae ou Mycoplasma gallisepticum
Infections digestives ou génitales à E. coli
Chiens
Xeden®
Marbofloxacine
Marbocyl®
VO
Comprimés
Infections des voies urinaires basses
(associées ou non à une prostatite) et
hautes provoquées par Escherichia coli ou
Proteus mirabilis
Pyodermites superficielles et profondes.
Chats
Infections des voies respiratoires hautes
Veaux
Infections respiratoires à Pasteurella
multocida, Manheimia heamolytica,
Mycoplasma bovis
Infections respiratoires à Actinobacillus
pleuropneumoniae, Pasteurella multocida
et Mycoplasma hyopneumoniae
Chats
VO
Bolus
VO
Comprimés
SC
IV
Solution
injectable
VO
Comprimés
SC
IV
Solution
injectable
Chiens
Infections cutanées et sous-cutanées
(plaies, abcès, phlegmons)
Plaies infectées et abcès
Prévention des infections chirurgicales
Pyodermites superficielles et profondes
Infections de l’appareil urinaire à E. coli et
Proteus mirabilis associées ou non à une
prostatite ou une épididymite
Infection de l’appareil respiratoire
Plaies infectées et abcès
Infections basses du tractus urinaires
Prévention des infections chirurgicales
31
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Présentation des Fluoroquinolones
1.2.5. Un exemple de fluoroquinolone vétérinaire : la
marbofloxacine
1.2.5.1. Propriétés chimiques
La marbofloxacine est une fluoroquinolone de troisième génération possédant une
structure plane qui lui permet de s’intercaler entre les chaînes de molécule d’ADN (Figure 5).
La structure de base de la molécule est constituée d’un noyau quinolone, d’un groupement
carboxylique en C6, d’un atome de fluor et d’un cycle pipérazine. C’est une molécule
amphotère. Le groupement quinolone lui confère son activité antibactérienne dirigée
essentiellement contre les bactéries à Gram négatif. L’atome de fluor élargit son spectre
d’activité aux bactéries à Gram positif et le cycle pipérazine étend encore le spectre aux
Pseudomonas et aux Mycoplasmes (107).
L’adjonction d’un groupement méthyl en position para sur le cycle pipérazine permet
d’augmenter son volume de distribution et sa liposolubilité. Elle se distingue des autres
fluoroquinolones par son cycle oxadiazine qui confère à la molécule une durée de demi-vie
d’élimination prolongée et une bonne biodisponibilité (107).
Figure 5 : Structure chimique de la marbofloxacine
Sa formule chimique est : Acide 9-fluoro- 2, 3-dihydro- E-méthyl- 10(4-méthyl-1-piperazinyl)- 7-oxo7H- pyrido(3,2,1 –ij) (4,1,2) benzoxadiazine- 6 carboxylique
Son poids moléculaire est de 362.36 g.mol-1
La marbofloxacine est éliminée lentement chez le veau pré-ruminant (T1/2 = 59 heures) et le porc (T1/2 = 8-10 heures), plus rapidement chez les bovins ruminants (T1/2 = 47 heures). Elle est éliminée principalement sous forme active, pour 2/3 par voie urinaire et
pour 1/3 par voie fécale. Le temps de demi-vie varie selon les espèces (< 14 h en général).
La marbofloxacine pénètre dans le cytoplasme des bactéries à Gram positif par diffusion. Le
passage de la membrane externe des bactéries à Gram négatif se fait par la complexation
des ions magnésium qui provoque une désorganisation des lipopolysaccharides ou par un
passage actif à travers des protéines transmembranaires appelées porines.
32
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Présentation des Fluoroquinolones
1.2.5.2. Propriétés pharmacocinétiques, pharmacodynamiques
La marbofloxacine a un large spectre d’action, orienté contre les bactéries à Gram
négatif, à Gram positif et les mycoplasmes.
Elle
est
rapidement
absorbée
après
une
administration
sous-cutanée
ou
intramusculaire et sa biodisponibilité varie entre 62% et 100% selon la voie d’administration.
Le temps pour atteindre le pic de concentration plasmatique est court (inférieur à 2 h). La
diffusion dans l’organisme de cette substance est large ; le volume de distribution à
l’équilibre est d’environ 1.3 L/kg. Elle est faiblement liée aux protéines plasmatiques (moins
de 10% chez le porc et le rongeur, moins de 30% chez les bovins) (70).
33
34
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Mécanismes de résistance aux fluoroquinolones
1.3. Mécanismes de résistance aux fluoroquinolones
La résistance aux fluoroquinolones passe par trois mécanismes principaux : i)
l’altération des cibles enzymatiques de la substance et/ou ii) l’altération de l’accès de la
substance à ces enzymes due à une imperméabilité de la membrane et/ou iii) une
surexpression des systèmes pompe à efflux. Récemment, des éléments mobiles, de type
plasmidique, porteurs de différents gènes de résistance aux fluoroquinolones ont également
été observés. De plus, un autre mécanisme peu étudié peut entrer en jeu dans la résistance
aux fluoroquinolones, le phénomène de tolérance aux antibiotiques.
1.3.1. Mécanisme de tolérance phénotypiques
Lorsqu’une population bactérienne génétiquement homogène est exposée à une
concentration suffisante en antibiotique, la plupart de ces organismes meurent, mais une
fraction de cette population peut survivre à ce stress. Contrairement à des bactéries
mutantes résistantes, ces organismes persistants restent sensibles et ont une CMI
inchangée vis-à-vis de l’antibiotique. J. Bigger (17) fut le premier à décrire ce phénomène en
1944. Au cours de son étude, il a observé que, in vitro, la pénicilline ne stérilisait pas
totalement une culture de Staphylocoque. Lorsqu’il a replacé ces bactéries qui avaient
survécu à l’antibiotique, qu’il nomma « bactéries persistantes », dans du milieu frais celles-ci
étaient de nouveau sensibles à la pénicilline (17).
Les bactéries persistantes sont dues à des bactéries préexistantes en quiescence qui
ne sont pas sensibles aux antibiotiques (11). Ce sont des variants phénotypiques de la
population sauvage. Elles se trouvent en faible quantité lors de la croissance exponentielle
d’un inoculum (10-6-10-5 par inoculum), mais leur nombre augmente lorsque la culture entre
en phase stationnaire (11, 17). Ce phénomène est sans doute une stratégie de protection
déployée par les bactéries pour survivre lors de conditions défavorables telles que le
manque de nutriment, le stress ou l’exposition à un antibiotique. Leur implication d’un point
de vu clinique est très important puisqu’on les trouve notamment dans les biofilms (126). De
plus chez les patients immunodéprimés, cette population bactérienne tolérante à
l’antibiotique peut être à l’origine d’une recroissance bactérienne étant donné que le système
immunitaire de l’individu n’est pas capable de les éliminer.
Moyed et al. (156) furent les premiers à réaliser une étude moléculaire sur les
bactéries persistantes dans une population d’E. coli. Cette étude à permis d’identifier un
gène appelé hipA (high persistence) dont la mutation entraîne une augmentation du nombre
de bactéries résistantes à la pénicilline de 100 à 1000 fois (156). HipA est une toxine régulée
35
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Mécanismes de résistance aux fluoroquinolones
par le répresseur HipB, avec qui elle forme un complexe toxine-antitoxine (TA). HipA est une
protéine kinase (40) qui inhibe la synthèse de macromolécules (119), mais son mécanisme
d’action exact est encore mal connu.
La surexpression d’autres toxines telles que RelE (113), YgiU (204) et MazF (226)
peut augmenter la formation de cellules persistantes, mais également la surexpression de
protéines de choc thermique (heat shock) telles que DnaJ et PmrC (226). Récemment, un
nouveau gène de persistance, phoU, à été identifié. Les bactéries chez qui ce gène est
inactivé montrent une plus grande activité métabolique et une plus forte sensibilité aux
différents stress, physiques ou chimiques (132).
1.3.2. Diminution de la perméabilité de la membrane externe
Pour atteindre leurs cibles qui sont cytoplasmiques, les fluoroquinolones doivent
traverser la paroi cellulaire et la membrane cytoplasmique des bactéries. Dans le cas des
bactéries à Gram négatif, les fluoroquinolones doivent, en plus, traverser la membrane
externe de la bactérie.
Pour traverser la membrane externe, les quinolones ont deux possibilités : passer à
travers des porines spécifiques ou diffuser à travers la bicouche lipidique. La paroi
bactérienne n’offre qu’une faible barrière à la diffusion des petites molécules comme les
quinolones, qui ont des poids moléculaires entre 300 et 400 daltons (106), mais seules les
molécules ayant une forte hydrophobicité peuvent traverser la bicouche lipidique (31).
Dans le cas des bactéries à Gram négatif, la diminution sur leur membrane externe
des protéines impliquées dans la diffusion de la substance, comme les porines OmpA,
OmpC et OmpF pour E. coli (100, 101, 178) et OmpK pour K. pneumoniae (4, 53), entraîne
une diminution de l’accumulation des fluoroquinolones dans le cytoplasme. L’expression de
ces porines est soumise à la régulation de l’opéron Mar.
Les mutants résistants MAR (Multiple Antibiotic Resistance) peuvent être
sélectionnés par la tétracycline, le chloramphénicol et les fluoroquinolones (36, 106). Les
mutations de marR qui résultent d’une diminution du répresseur MarR entraînent une
augmentation de l’expression de MarA, un activateur de la transcription qui augmente
l’expression de micF et d’autres locus. Le gène micF code pour un ARN anti-sens qui induit
une réduction de l’expression de la porine OmpF (37). Chez K. pneumoniae, le gène ramA
confère le même phénotype que marA chez E. coli (86). Le phénotype multi résistant des
mutants MAR implique également la surexpression de pompes à efflux (voir paragraphe
suivant).
36
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Mécanismes de résistance aux fluoroquinolones
La diminution de la diffusion des fluoroquinolones dans la cellule contribue à la
résistance bactérienne vis-à-vis de ces substances (106). Les mutants MAR pouvant être
sélectionnés par plusieurs classes d’antibiotique le risque de sélection de ces mutants
augmente.
1.3.3. Protéines d’efflux
Un autre mécanisme de résistance possible afin de limiter l’accumulation de
fluoroquinolone dans le cytoplasme consiste à faire ressortir la substance de la bactérie.
Ceci se produit par l’expression de pompes à efflux associées à la membrane qui peuvent
prendre en charges différentes molécules, d’où leur nom de « Multi Drug Resistant » (MDR)
(Figure 6). Ces pompes MDR font ressortir de façon active la substance antibiotique en
dehors de la cellule ce qui entraîne une réduction de l’activité des fluoroquinolones et
confère à la bactérie un faible niveau de résistance (106) (Figure 6).
Les pompes à efflux MDR responsables d’une résistance aux quinolones les mieux
connues à ce jour sont MexAB-OprM pour P. aeruginosa (129, 131), AcrAB-TolC pour E. coli
(138), qui appartiennent toutes les deux à la super famille des RND (Resistance-NodulationDivision) et NorA pour S. aureus (221, 238) qui appartient à la super famille des MFS (Major
Facilitator Superfamily).
La majorité des pompes à efflux qui ont une importance clinique font partie de la
super famille RND. AcrB et ses homologues sont les principales pompes à efflux chez les
bactéries à Gram négatif. Elles s’associent à deux autres protéines pour former un complexe
tripartite qui peut exporter de nombreuses substances dont les antibiotiques, les
antiseptiques, les anti cancéreux et les composés toxiques (anionique, cationique, zwitterion
et neutre) grâce à un gradient de protons. La plus décrite pour E. coli est AcrAB-TolC (138)
et récemment AcrAB-KocC à été décrite pour K. pneumoniae (127).
Ces pompes à efflux sont, le plus souvent, sous le contrôle de régulateur, répresseur
ou activateurs (130). L’induction de mutations dans ces gènes de régulation augmente
l’expression de ces pompes à efflux et contribue à l’acquisition de résistance aux quinolones
comme cela a été montré pour les mutations nalB, nfxB, nfxC et nalC chez P. aeruginosa
(130). Des opérons comme MarRAB, qui codent pour différents gènes marA (activateurs),
marB, marC et marR (répresseurs), ou SoxRS régulent le niveau d’expression de AcrAB
(166) et de certaines autres pompes à efflux chez E. coli (5, 161, 166) ainsi que le gène
ramA chez K. pneumoniae (86). Une mutation de ces opérons induit le phénotype MAR chez
les bactéries.
37
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Mécanismes de résistance aux fluoroquinolones
D’autres familles de protéines capables d’effluer plusieurs substances ont été
décrites. Certaines requièrent l’hydrolyse de l’ATP pour fonctionner comme la famille ABC
(ATP Binding Cassette) et d’autres requièrent un gradient de proton comme les pompes :
MFS, « Small Multidrug Resistance » (SMR) et les pompes « Multidrug And Toxic Efflux »
(MATE) (99, 121, 122, 130, 180).
L’expression des pompes à efflux peut être induite de façon transitoire par différents
facteurs de stress environnementaux tel qu’un changement de pH ou un changement
osmotique (162) ce qui peut être le cas au niveau du site infectieux (137, 186). La diminution
de la concentration intracellulaire en antibiotique peut prédisposer l’organisme bactérien à
l’émergence de mécanismes de résistance adaptatifs à plus fort niveau de résistance (103,
135, 144, 145, 165).
Figure 6 : Les différentes familles de pompes à efflux
Illustration schématiques des différentes familles de pompes à efflux, MFS (Major Facilitator
Superfamily), ABC (ATP Binding Cassette) et RND (Resistance-Nodulation-Division)
D’après Murakami, 2008
1.3.4. Mutations des enzymes cibles
L’altération des enzymes cibles peut être due à des mutations spontanées de l’ADN
gyrase ou de la topoisomérase IV (82). Ces mutations se font par paliers successifs et
peuvent être combinées avec une diminution de l’expression des porines et/ou à une
surexpression des pompes à efflux. Le niveau de résistance varie en fonction de la mutation
et de l’espèce bactérienne.
38
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Mécanismes de résistance aux fluoroquinolones
1.3.4.1. Mutation de l’ADN gyrase
L’ADN gyrase est la cible principale des fluoroquinolones chez les bactéries à Gram
négatif. Les mutations peuvent affecter la sous-unité GyrA ou la sous-unité GyrB. La majorité
des mutations se produisent dans la partie N-terminale des sous-unités GyrA et GyrB
appelée « Quinolone Resistance Determining Region » (QRDR), localisée sur l’acide aminé
Ala67-Gln106 pour la GyrA (241) et Asp426-Lys447 pour la GyrB (242). Pour la GyrA, les
mutations apparaissent le plus souvent sur les codons 83 et 87 qui sont proches du site actif
de l’ADN gyrase qui permet la liaison de la sous-unité à l’ADN lors de la réaction
enzymatique (241). Ces mutations entraînent une diminution de la liaison des quinolones au
niveau du site d’action de l’enzyme et donc peuvent conduire à une diminution de la
sensibilité à ces antibiotiques (232). Une mutation simple de GyrA chez E. coli confère
généralement un faible niveau de résistance aux fluoroquinolones. Une mutation
supplémentaire de GyrA et/ou de la topoisomérase IV (ParC le plus souvent) est nécessaire
afin d’obtenir un haut niveau de résistance (229). Les mutations les plus fréquentes dans
cette région sont Ser83Phe, Ser83Leu et Asp87Asn chez E. coli (33, 177).
Les mutations de la sous-unité GyrB se produisent moins souvent que celles de
GyrA. Elles affectent un domaine analogue au QRDR de GyrA. Les mutations les plus
connues chez E. coli sont Asp426Asn et Lys447Glu. Il n’est pas certain que cette mutation
de GyrB touche la liaison de la molécule à l’ADN comme pour GyrA (242). In vitro, pour E.
coli, la fréquence de mutation pour gyrA (232) est similaire à celle de gyrB (157), mais in
vivo, les isolats cliniques portant la mutation gyrA semblent avoir une prévalence plus
importante que ceux de gyrB (72). La mutation gyrB semble également conférer un niveau
de résistance moins important que les mutations de GyrA (106).
Les mutations de l’ADN gyrase, sur les sous-unités GyrA ou GyrB, peuvent
également se produire chez les bactéries à Gram positif, mais chez la majorité d’entre elles
l’ADN gyrase est une cible secondaire des fluoroquinolones. En effet, chez ces bactéries, les
altérations de la sous-unité GyrA ou de GyrB sont toujours trouvées en association avec une
mutation préalable de la topoisomérases IV et elles confèrent aux bactéries un plus fort
niveau de résistance que la seule mutation de la topoisomérase IV (106, 120). Pour les
bactéries à Gram positif, les mutations de la GyrA se trouvent le plus souvent sur les codons
83 et 84 (169).
1.3.4.2. Mutation de la topoisomérase IV
Les mutations de la topoisomérase IV ont été étudiées de façon plus importante chez
les bactéries à Gram positif, particulièrement chez S. aureus and S. pneumoniae étant
39
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Mécanismes de résistance aux fluoroquinolones
donné que la topoisomérase IV est une cible secondaire des fluoroquinolones chez les
bactéries à Gram négatif (115).
Comme pour l’ADN gyrase, les altérations peuvent survenir dans chacune des sousunités. La mutation de ParC se produit plus fréquemment que celle de ParE et semble jouer
un rôle plus critique dans le développement de résistance (160). Les mutations de la sousunité ParC se produisent dans un domaine analogue au QRDR, avec le plus souvent une
mutation Ser80Phe/Tyr (106). Le mécanisme de résistance résultant de cette mutation
semble également être dû à une diminution de l’affinité de la molécule pour sa cible (106).
Chez les bactéries à Gram négatif, on ne trouve les mutations de ParC et ParE qu’en
présence d’une mutation préalable de l’ADN gyrase. Les mutations de la topoisomérase IV
associées à celles de la gyrase confèrent aux bactéries un fort niveau de résistance (22,
120). Chez E. coli ce sont les mutations du codon 80 qui sont les plus fréquemment
identifiées pour ParC avec le plus souvent une substitution Ser80Ile (33, 72, 73, 89, 116,
195).
1.3.5. Résistance plasmidique
Jusque récemment, il était considéré que la résistance aux fluoroquinolones était
uniquement portée par des mutations chromosomiques. Cependant, plusieurs études ont
montré qu’elle peut également être portée par des éléments génétiques mobiles comme les
plasmides (164, 190). Ceux-ci offrent un mécanisme rapide pour la dissémination horizontale
et verticale de déterminants de résistance pour les espèces bactériennes (188).
1.3.5.1. Les protéines Qnr
Le premier plasmide médiateur de résistance aux quinolones (PMQR, « Plasmid
Mediated Quinolone Resistance ») a été décrit dans une souche K. pneumoniae par
Martinez-Martinez et al. (146). Tran et al. ont montré que ce plasmide contenait le gène qnr
codant pour une protéine Qnr de 218 amino acides qui protège l’ADN gyrase de l’action des
quinolones (220). Ce gène est flanqué d’ORF513 ce qui suggère que le gène qnr pourrait
être localisé dans un intégron. Le mécanisme par lequel QnrA protège l’ADN gyrase n’est
pas encore bien connu. Il semblerait que la protéine Qnr se lie à l’ADN gyrase ou à la
topoisomérase IV ce qui empêche la liaison de l’enzyme sur l’ADN. Ceci minimise les
opportunités pour les quinolones de stabiliser un complexe de clivage enzyme-ADNquinolone.
40
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Mécanismes de résistance aux fluoroquinolones
Il existe différentes familles de la protéine Qnr : QnrA, QnrB, QnrS etc. … (190). Très
souvent la présence du gène qnr est identifiée dans des souches porteuses d’autres
mécanismes de résistance comme les betalactamases à spectre étendu CTX-M ou des
mécanismes d’efflux. Le niveau de résistance aux fluoroquinolones dû à la présence de ce
plasmide est faible, mais il peut faciliter la sélection de souches avec un niveau de
résistance plus élevé, notamment lorsque ces plasmides sont associés à des mutations de la
topoisomérase (192). Ceci a été confirmé par différentes études épidémiologiques qui ont
montré que très souvent, les souches bactériennes résistantes porteuses d’une mutation sur
un gène cible étaient également porteuses d’un plasmide qnr (134, 170).
1.3.5.2. L’enzyme AAC(6’)-Ib-cr
Les enzymes entraînant une résistance à un antibiotique par une modification de la
structure de l’antibiotique sont spécifiques de chaque classe d’antibiotique et ont co-évolué
avec la substance qu’ils inactivent. Les fluoroquinolones étant des substances de synthèse,
il était considéré jusqu’à récemment qu’il n’existait pas d’enzyme naturelle capable de
modifier les fluoroquinolones. Cependant, en 2006, Robicsek et al. ont décrit une enzyme
capable de modifier les fluoroquinolones, l’enzyme AAC(6’)-Ib-cr (191). Cette enzyme est un
variant de l’aminoglycoside-acetyltransférase qui entraîne une résistance à la tobramycine,
l’amikacine et à la kanamycine. Le changement de deux codons dans cette enzyme lui
confère la capacité de N-acétyler la ciprofloxacine ainsi que la norfloxacine au niveau de leur
substituant pipérazine. Les autres quinolones n’ayant pas d’azote non substitué sur leur
substituant pipérazine, elles ne sont pas affectées par cette enzyme (190). AAC(6’)-Ib-cr a
été retrouvé avec une forte prévalence sur des plasmides PMQR, souvent en association
avec qnr dans une population d’animaux de compagnie et de production en Chine (139).
Comme pour la protéine Qnr le niveau de résistance conférée par ce plasmide est
faible, mais il peut faciliter l’émergence de bactéries avec un niveau de résistance plus
élevée.
1.3.5.3. La pompe à efflux QepA
Un autre mécanisme de résistance plasmidique aux fluoroquinolones a été décrit
récemment par Yamane et al. qui ont identifié un plasmide porteur du gène d’une pompe à
efflux, QepA (240). Cette pompe à efflux est fortement similaire à celles de type MFS. Des
plasmides portant le gène de la pompe à efflux QepA ont été retrouvés dans des souches
bactériennes humaines (172) et animales (139).
41
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Mécanismes de résistance aux fluoroquinolones
De la même façon que pour la protéine Qnr et l’enzyme AAC(6’)-Ib-cr, le niveau de
résistance conférée par ce plasmide est faible, mais il peut faciliter l’émergence de bactérie
avec un niveau de résistance plus élevé (172, 240).
1.3.5.4. Les toxines plasmidiques
Afin d’éviter la perte de plasmides aux cours des divisions cellulaires, les bactéries
disposent d’un système d’élimination post ségrégation appelé système Toxine-Antitoxine
(TA) porté par un plasmide. Dans la bactérie, le gène de la toxine code pour une protéine
stable ayant une longévité accrue comparée à la protéine codée par le gène de l’anti-toxine
qui elle, est labile. Si une cellule fille produite au cours de la division ne porte pas le plasmide
TA, elle n’est pas capable de produire l’anti-toxine, la toxine peut alors se lier à sa cible dans
la bactérie ce qui entraîne la mort de celle-ci (97). Si ce système est connu depuis
longtemps, ce n’est que récemment qu’il a été identifié sur des plasmides de résistance et
notamment des souches E. coli (91, 97). Les toxines CcdB et ParE (à distinguer de la sousunité ParE de la topoisomérase IV) codées par ces plasmides ont toutes les deux comme
cible la sous-unité GyrA de l’ADN gyrase. De ce fait, elles ont une fonction similaire à celles
des fluoroquinolones et de la protéine QnrA. Une exposition de la cellule à une faible
quantité de toxines peut avoir un effet analogue à une exposition de la bactérie à des
quantités subinhibitrices d’antibiotique et entraîner la sélection de résistance. La résistance à
ces toxines permet à la bactérie de contourner le système TA ou alors d’acquérir de
nouveaux plasmides du même groupe permettant le flux de gènes à partir de l’ADN
bactérien (69). Au moins une résistance croisée toxine-fluoroquinolone à été décrite chez E.
coli. Dans cette souche, une sur-expression de la protéine intrinsèque GyrI entraîne une
tolérance de la bactérie vis-à-vis de CcdB mais lui confère également une diminution de sa
susceptibilité aux fluoroquinolones (32). En effet, GyrI interagissant avec l’ADN gyrase, elle
inhibe ainsi la formation du complexe fluoroquinolone-gyrase-ADN.
42
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Etudes PK/PD des antibiotiques, exemple des FQ
1.4. Les études pharmacocinétique-pharmacodynamique
des antibiotiques : exemple des fluoroquinolones
L’efficacité d’un traitement antibiotique ne se mesure pas uniquement par la guérison
clinique mais également par l’élimination de la bactérie du site d’infection. En effet, si
l’élimination de la bactérie n’est pas obtenue à la fin du traitement, cette population crée un
risque de rechute chez le sujet traité mais aussi un risque de dissémination de souches
résistantes vers d’autres sujets (49).
La relation quantitative entre les paramètres pharmacocinétiques tels que l’aire
sous la courbe (AUC) ou le pic de concentration (Cmax) et les paramètres bactériologiques
tels que la concentration minimale inhibitrice (CMI) permet de construire les indices PK/PD.
L’utilisation des indices PK/PD pour décrire, prédire et comprendre les relations entre le
déroulement d’un traitement et son efficacité au plan clinique et bactériologique a été
développée dans les années 1940-1950 par le Dr Harry Eagle (7).
La relation entre les traitements antibiotiques et l’élimination des bactéries peut être
étudiée par différents types de modèles in vitro et in vivo sur des animaux de laboratoire ou
lors d’étude cliniques.
1.4.1. Les principaux paramètres PK/PD utilisés
Les antibiotiques sont catégorisés sur la base d’indices PK/PD qui sont les plus
prédictifs de leur efficacité. Les principaux paramètres PK/PD utilisés pour les antibiotiques
sont le temps de maintien d’une concentration supérieure à la CMI (T>CMI), le rapport de la
concentration plasmatique maximale sur la CMI (Cmax/CMI) et le rapport de l’aire sous la
courbe des concentrations plasmatiques sur la CMI (AUC/CMI) (Figure 7). Le choix de ces
indices est déterminé par le type d’antibiotique, à savoir s’ils sont « temps dépendants » ou
« concentration dépendants ». Les agents dits « temps dépendants », sont des substances
pour lesquelles l’augmentation de la bactéricidie se produit sur une gamme étroite de
concentrations jusqu’à atteindre un plateau, la bactéricide augmente en fonction de la durée
effective de maintient des concentrations au niveau de ce plateau. Au contraire, pour les
agents dits « concentration dépendants » la bactéricidie se produit sur une large gamme de
concentrations et elle augmente lorsque les concentrations augmentent. Les indices PK/PD
sont traditionnellement utilisés afin de connaître les schémas posologiques nécessaires pour
traiter l’infection, mais récemment l’attention s’est portée sur les études PK/PD afin de
trouver les indices les plus prédictifs de la prévention de l’émergence de bactéries
résistantes lors d’une antibiothérapie.
43
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Etudes PK/PD des antibiotiques, exemple des FQ
Les fluoroquinolones sont des antibiotiques dit « concentration dépendants », les
indices PK/PD qui sont les plus prédictifs de l’efficacité de ces substances sont donc
l’AUC/CMI et le rapport Cmax/CMI.
Concentration
d’antibiotique
Cmax
AUC
CMI
Temps
T>CMI
Figure 7 : Présentation des principaux paramètres PK/PD utilisés en antibiothérapie.
La courbe des concentrations plasmatiques d’antibiotique représentée en fonction du temps permet
de visualiser l’Aire sous la courbe (AUC), le pic de concentration plasmatique (Cmax) ainsi que le
temps passé par les concentrations au dessus de la CMI (T>CMI).
1.4.1.1. AUC/CMI
Afin de déterminer lequel des deux paramètres, entre le rapport AUC/CMI ou le
rapport Cmax/CMI, était le plus prédictif de l’activité des fluoroquinolones, Madaras-Kelly et al.
(140) ont étudié l’activité antimicrobienne de la ciprofloxacine et de l’ofloxacine contre P.
aeruginosa en faisant varier les pics de concentrations et la demi-vie d’élimination, mais en
gardant les mêmes AUC. Leurs résultats ont montré que l’AUC/CMI était le paramètre
PK/PD le plus prédictif de l’efficacité des fluoroquinolones avec un effet maximum pour des
valeurs du rapport ≥ 100 h (140).
In vivo, les données compilées de différents modèles animaux d’infection montrent
que des rapports d’AUC/CMI inférieurs à 30 h sont associés à une mortalité de plus de 50%
contrairement à des valeurs d’AUC/CMI supérieures à 100 h et que, pour optimiser le taux
de survie, les concentrations de quinolone doivent être en moyenne 4 fois la CMI pour
chaque 24 h de traitement (44). Différentes études in vivo ont confirmé ces résultats (8, 42,
43, 83, 112) (Figure 8, Figure 9 panel A) avec cependant des variations de la valeur seuil du
rapport AUC/CMI, les valeurs variant de 100 à 125 h pour les bactéries à Gram négatif et de
25 à 35 h pour les bactéries à Gram positif.
Les valeurs d’AUC/CMI semblent également être corrélées à la probabilité du
développement de bactéries résistantes durant le traitement antibiotique. Dans une étude de
Thomas et al., des rapports < 100 h sont associés avec l’émergence de résistance chez
44
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Etudes PK/PD des antibiotiques, exemple des FQ
82.4% des souches alors que des rapports > 100 h ne sont associés à l’émergence de
résistance que dans 9% des souches (218). Ces résultats ont été confirmés par une étude
du traitement à la lévofloxacine d’une infection de la cuisse par P. aeruginosa chez la souris
pour laquelle des valeurs d’AUC/CMI ≥ 157 h (AUC/CMI = 110 h) sont associées à la
prévention de l’émergence de bactéries résistantes (112).
Figure 8 : Fluoroquinolones et AUC/CMI
Relation entre la diminution de la charge bactérienne (log10 CFU) par cuisse ou par poumons pour
différents pathogènes après 24 h de traitement par différentes doses de plusieurs fluoroquinolones.
D’après Andes et al. (2002) (8)
Chez l’Homme, une étude rétrospective sur la ciprofloxacine administrée par voie
intraveineuse a montré que des valeurs d’AUC/CMI supérieures à 125 h correspondent à
une amélioration clinique satisfaisante chez des sujets sévèrement malades, infectés par
des bactéries à Gram négatif et que des valeurs > 250 h réduisent le temps moyen
d’éradication à 1.9 jours au lieu de 6.6 jours pour des valeurs d’AUC/CMI comprises entre
125 et 250 h (83). Une seconde étude portant sur la levofloxacine a montré une éradication
bactérienne pour des valeurs d’AUC/CMI ≥ 87 h (60).
Les différentes études in vitro, in vivo et cliniques montrent indiscutablement une
relation entre l’AUC/CMI et l’efficacité des fluoroquinolones ainsi que la prévention de
l’émergence de bactéries résistantes, mais la détermination d’une valeur seuil semble
difficile. De plus, une étude récente de Firsov et al. a montré que des valeurs usuelles,
prédictives d’une bonne efficacité sur les souches sensibles peuvent accroître le risque de
mutants résistants (80).
Les variations des valeurs seuils de l’AUC/CMI sont dues à différents facteurs. Tout
d’abord les objectifs des études ne sont pas les mêmes, certains auteurs cherchant à obtenir
une bactériostase et d’autres une diminution de la charge bactérienne de 1 à 3 log. D’autre
part, les charges bactériennes de départ peuvent varier mais également le statut
immunologique pour les infections expérimentales in vivo et l’état de santé des patients pour
45
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Etudes PK/PD des antibiotiques, exemple des FQ
les études cliniques. Tous ces facteurs, comme nous le verrons plus loin (paragraphe 1.4.3.)
peuvent influencer la valeur des indices PK/PD. De plus, ces études ne sont souvent
réalisées qu’avec un seul schéma posologique or, le fractionnement de la dose (par exemple
1 g, 4 fois par jour au lieu de 4 g, 1 fois par jour) fait considérablement varier le Cmax ce qui
peut donc influencer les résultats.
Figure 9 : Relation entre différents indice PK/PD et l’efficacité des fluoroquinolones
Relation entre l’AUC24/MIC (A), le Cmax/CMI (B), et le T>MIC (C) et le nombre de S. pneumoniae
ATCC par cuisse (log10 CFU/cuisse) après 24 h de traitement à la gatifloxacine dans un modèle
murin d’infection. Chaque symbole représente la moyenne de 2 cuisses par souris, la ligne
discontinue représente la charge bactérienne présente à l’initiation de l’antibiothérapie.
D’après Andes et al. (2002) (9)
1.4.1.2. Cmax/CMI
En 1987, Blaser et al. (19) ont suggéré que le rapport Cmax/CMI était un paramètre
important pour prédire l’efficacité clinique des fluoroquinolones. En effet, en utilisant un
modèle in vitro sur différentes espèces bactériennes (E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa
et S. aureus), ils ont observé une recroissance bactérienne dans les 24 h lorsque le rapport
Cmax/CMI était  8 pour l’enoxacine avec une augmentation de la CMI de 4 à 8 fois par
rapport à la population de départ (19). Ces résultats ont été confirmés in vitro pour la
ciprofloxacine par l’équipe de Dudley en 1991 (61), mais également sur différents modèles in
vivo ainsi que lors d’essais cliniques (9, 59, 181). Ces différentes études ont montré une
relation entre le rapport Cmax/CMI et l’efficacité des fluoroquinolones mais également une
relation entre le rapport Cmax/CMI et la prévention de l’émergence de mutants résistants pour
des fortes valeurs de ce rapport. Cependant, comme pour l’AUC/CMI, la valeur seuil du
rapport Cmax/CMI varie d’une étude à l’autre.
Comme nous l’avons vu dans le paragraphe précédent, d’autres travaux ont montré
que le rapport Cmax/CMI n’était pas l’indice PK/PD le plus prédictif de l’efficacité des
fluoroquinolones (9, 140) (Figure 9 panel B). Il semblerait pourtant que celui-ci, lorsqu’il est
≥ 10, devient l’indice le plus prédictif de l’efficacité des fluoroquinolones alors qu’en dessous
de ce seuil, c’est l’AUC/CMI qui est l’indice le plus prédictif (59, 83, 181).
46
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Etudes PK/PD des antibiotiques, exemple des FQ
1.4.1.3. T>CMI
Le temps passé par les concentrations plasmatiques au dessus de la CMI (T>CMI) est
le paramètre PK/PD le plus important pour les antibiotiques « temps dépendants » (41). En
revanche, pour les antibiotiques « concentration dépendants », comme les fluoroquinolones,
différentes études ont montré une faible corrélation entre le T>MIC et l’efficacité du traitement
antibiotique (8, 9) (Figure 9 panel C).
1.4.2. Un nouvel indice PK/PD : le temps dans la fenêtre de
sélection
1.4.2.1. La fenêtre de sélection
Dans les années 90, Baquero a suggéré qu’il existait une gamme de concentrations
« dangereuses » dans laquelle la sélection de mutants résistants était plus fréquente (13,
14). Cette idée a conduit à la définition d’une fenêtre de sélection (FS) des mutants
résistants appelée « Mutant Selection Window » (MSW). L’hypothèse de la FS postule que,
pour chaque combinaison antibiotique-pathogène, il existe une gamme de concentrations
d’antibiotique dans laquelle une amplification sélective des mutants résistants spontanés est
plus fréquente (244).
La FS est limitée par deux valeurs seuil. La limite inférieure est la plus faible
concentration d’antibiotique qui inhibe la croissance des bactéries sensibles majoritaires,
c'est-à-dire la concentration minimale inhibitrice (CMI). La limite supérieure de la FS, appelée
MPC (Mutant Prevention Concentration), est la concentration d’antibiotique qui inhibe la
croissance des mutants résistants de premier niveau (Figure 10). Au dessus de la MPC la
prolifération sélective de mutants résistants nécessite une ou des mutations supplémentaires
de la bactérie, autrement dit la MPC correspond à la CMI des mutants résistants de premier
niveau. (21, 54). La détermination de la MPC pour un antibiotique donné requiert l’exposition
à l’antibiotique d’un inoculum bactérien plus important que celui ordinairement utilisé pour la
détermination de la CMI (i.e. 1010 CFU/mL versus 105 CFU/mL) (21). Le choix de la taille de
l’inoculum de départ à 1010 CFU/mL est basé sur différentes considérations. Premièrement
1010 CFU/mL est une population assez grande pour pouvoir contenir une sous-population de
mutants résistants de premier niveau si la fréquence de mutation est > 10-8. Et
deuxièmement, lors d’une infection la charge bactérienne dépasse rarement 1010 CFU/mL.
47
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Etudes PK/PD des antibiotiques, exemple des FQ
Concentration
d’antibiotique
MPC
Fenêtre de
sélection = MSW
= CMI des
bactéries
résistantes
CMI
Temps
T>MPC
TMSW
Figure 10 : La Fenêtre de Sélection
La fenêtre de sélection ou « Mutant Selection Window » (MSW) correspond à la gamme de
concentrations comprises entre la CMI et la MPC de la bactérie. Pour ces concentrations, les
bactéries sensibles à l’antibiotique sont éliminées alors que celles qui sont résistantes à
l’antibiotique peuvent toujours croitre. La fenêtre de sélection fait apparaître deux nouveaux indices
PK/PD, le temps passé par les concentrations au dessus de la MPC (T>MPC) ainsi que le temps
passé dans la fenêtre de sélection (TMSW).
Plusieurs études in vitro et in vivo ont vérifié l’hypothèse d’une amplification sélective
des mutants résistants spontanés plus prononcée lorsque les concentrations d’antibiotique
se trouvent dans la FS (21, 128, 244, 245) (Tableau 2).
La notion de FS peut être prise en compte dans l’analyse PK/PD afin de prévenir
l’émergence de mutants résistants en remplaçant l’AUC/CMI par l’AUC/MPC (Figure 11), les
valeurs obtenues pour ces deux paramètres dans différentes études in vitro et in vivo sont
résumées dans le Tableau 2.
Figure 11 : Effet des indices PK/PD seuils sur la population majoritaire sensible et sur la
population minoritaire résistante
a) La population bactérienne non encore exposée à un antibiotique contient une majorité de
bactéries sensibles (cercles blancs) et une petite sous-population mutante résistante (cercles
noirs).
b) Quand l’exposition à l’antibiotique dépasse la valeur seuil de l’AUC24/CMI (AUC24 à l’équilibre)
au dessus de laquelle les mutants résistants, mais pas les bactéries sensibles peuvent
survivre, on observe un enrichissement de la sous-population mutante.
c) Quand l’exposition à l’antibiotique dépasse la valeur seuil de l’AUC24/MPC au dessus de
laquelle les mutants résistants comme les bactéries sensibles sont tuées, l’acquisition de
mécanisme de résistance est quasiment nulle.
D’après Zhao et al. (245)
48
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Etudes PK/PD des antibiotiques, exemple des FQ
Tableau 2 : Valeurs des AUC/CMI et AUC/MPC qui limitent l’émergence de bactéries résistantes aux
fluoroquinolones dans différents modèles in vitro et in vivo.
Espèce
bactérienne
Substance
utilisée
Modèle
expérimental
AUC24/CMI
(h)
AUC24/MPC
(h)
S. aureus
Levofloxacine
In vitro dynamique
In vitro
S. aureus
Moxifloxacine
In vitro dynamique
S. aureus
Gatifloxacine
In vitro dynamique
S. aureus
Ciprofloxacine
In vitro
S. aureus
E. coli
S. pneumoniae
E. coli
ABT452
Marbofloxacine
Moxifloxacine
Ciprofloxacine
Levofloxacine
69
36
59
60
89
69
87
69
44
20
22
Non
déterminée
(79, 80)
(25)
(80)
(80)
(81)
(80)
(27)
(79)
(75)
(246)
(168)
P. aeruginosa
S. pneumoniae
Moxifloxacine
300
37.5
(71)
S. aureus
Levofloxacine
In vitro
In vitro dynamique
In vitro dynamique
In vitro
Infection de la cuisse
chez la souris
Infection pulmonaire
chez le lapin
Cage tissulaire chez
le lapin
200
125
220
240
310
240
580
240
1408
100
350
107*
18*
(47)
110*
Réf.
(112)
* calculée à partir des concentrations libres
1.4.2.2. Le temps dans la fenêtre de sélection : TMSW
Le concept de fenêtre de sélection a conduit à l’établissement d’un nouveau
paramètre PK/PD : le temps durant lequel les concentrations d’antibiotique sont dans la
fenêtre de sélection, appelé TMSW (Figure 10). En effet, différentes études in vitro (75, 78, 80)
et in vivo (76) ont montré qu’il existait une association entre le temps d’exposition d’une
population pathogène dans la fenêtre de sélection et l’enrichissement de la sous-population
mutante résistante. Notamment, Firsov et al. ont montré que, pour limiter l’émergence de
mutants résistants, les concentrations d’antibiotique devaient passer moins de 20% du
temps entre chaque administration dans la FS (80).
Cependant, la relation entre le temps passé dans la FS et l’émergence de résistance
a récemment été remise en question (25, 26, 104). Des publications ont souligné que le
niveau des concentrations dans la FS, c'est-à-dire à la limite supérieure ou inférieure de la
FS, pourrait aussi jouer un rôle important dans l’enrichissement de la sous-population
mutante (47, 78) (Figure 12).
49
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Etudes PK/PD des antibiotiques, exemple des FQ
A
B
Figure 12 : Impact du niveau d’exposition dans la fenêtre de sélection sur la sélection de
mutants résistants, in vivo
Impact de différents niveaux d’exposition de lévofloxacine dans la FS (A) sur la proportion de
mutants résistants (B) Lors d’un traitement à la lévofloxacine dans un modèle de cage tissulaire
infectée par S. aureus, chez le lapin.
D’après Cui et al. en 2006 (47)
1.4.3. Facteurs influençant les indices PK/PD
1.4.3.1. Les modèles expérimentaux et les études cliniques
Les modèles d’études peuvent être in vitro, in vivo ou cliniques. Traditionnellement
les mesures in vitro, comme celle de la CMI, sont utilisées pour prédire l’issue d’une
antibiothérapie. Cependant, si ces mesures sont un bon indicateur de la sensibilité
bactérienne à l’antibiotique, elles ne permettent pas d’obtenir l’information nécessaire à la
détermination de la dose et du schéma posologique de l’antibiotique. En effet, elles ne
donnent une information que sur une taille de population bactérienne précise (105 CFU/mL)
exposée à une concentration fixe d’antibiotique, et n’informent ni sur l’effet de la variation
des concentrations d’antibiotique ni sur la variation de la taille de la population bactérienne
en fonction du temps au niveau du site infectieux. De plus, l’effet du système immunitaire sur
le devenir de l’infection n’est pas pris en compte.
Les modèles in vivo permettent de compléter les résultats obtenus in vitro et sont
essentiels pour l’évaluation des agents antibactériens ainsi que pour le choix de la dose et
du schéma posologique. Il existe une large variété de modèles animaux qui permettent
d’évaluer les paramètres PK/PD d’une antibiothérapie. Ils permettent de comprendre la
relation entre les concentrations plasmatiques d’antibiotique et l’activité de celui-ci au niveau
du site infectieux, de voir l’impact du système immunitaire, de confirmer les valeurs seuil
obtenues durant les études in vitro et d’évaluer l’émergence de résistance in vivo.
50
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Etudes PK/PD des antibiotiques, exemple des FQ
Il existe plusieurs facteurs qui influencent les études PK/PD, certains sont communs
aux différents types d’études et d’autres sont spécifiques. Le premier point qui est source de
variation est le critère choisi pour déterminer l’efficacité de l’antibiotique. En effet selon les
études l’objectif peut être la bactériostase, une diminution de la charge bactérienne de un ou
plusieurs log, l’absence d’émergence de bactéries résistantes ou encore la guérison ou la
survie de l’individu (pour les études in vivo et cliniques). De plus la durée du traitement pour
l’obtention de ces différents objectifs diffère également d’une étude à l’autre. Par exemple,
dans un modèle d’infection de la cuisse par S. pneumoniae chez des souris, Mattoes et al.
ont observé une efficacité maximale pour des valeurs d’AUC/CMI de 30 à 40 h (149) alors
qu’Andes et al. en utilisant le même modèle d’infection ont obtenu des résultats légèrement
différents. S’ils ont observé un effet bactériostatique pour des rapports de 52 h, pour obtenir
une diminution de 1 log le rapport nécessaire était de 1.2 à 2.1 fois plus important et pour
une diminution de 2 log plus de 5.5 fois supérieur et souvent le rapport excédait 100 h (9).
Un second point important, qui sera discuté dans le paragraphe 1.4.3.3., est la
charge bactérienne de départ car elle peut être faible, importante ou inconnue (cas des
études cliniques). Enfin, les points plus spécifiques des études in vivo et cliniques sont le
statut physiopathologique de l’individu, celui-ci pouvant faire varier les paramètres
pharmacocinétiques et le statut immunologique (qui sera également détaillé dans le
paragraphe suivant).
1.4.3.2. Le statut immunologique
La limite principale des modèles in vitro ou de certains modèles in vivo est qu’ils ne
tiennent pas compte de la réponse du système immunitaire, celle-ci étant inhibée au cours
de certains essais in vivo menés sur les rongeurs, afin de mieux mettre en évidence l’action
propre de l’antibiotique.
Le statut immunologique du patient (Homme ou animal) influence de façon
importante les indices PK/PD. En effet, lors du traitement d’une infection, l’antibiotique n’agit
pas seul et le système de défense, notamment immunitaire, du patient joue un rôle
prépondérant dans le traitement de l’infection, notamment en éliminant les bactéries
persistantes. Plusieurs études ont montré que les valeurs des indices PK/PD associées à
une
issue
favorable
de
l’infection
étaient
plus
importantes
chez
les
animaux
immunodéprimés que chez les animaux immunocompétents (45, 149). Andes et al. (9) ont
évalué l’efficacité de la gatifloxacine dans un modèle d’infection de la cuisse chez la souris
neutropénique et non neutropénique. Les valeurs du rapport AUC/CMI nécessaires afin de
diminuer de 1 log la charge bactérienne ont été de 62 h pour les souris immunocompétentes
51
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Etudes PK/PD des antibiotiques, exemple des FQ
versus 129 h pour les souris immunodéprimées. Les mêmes résultats ont été obtenus avec
un modèle d’infection pulmonaire (9).
1.4.3.3. La charge bactérienne
Les procédures de routine de mesure in vitro sont standardisées, pour l’évaluation de
la CMI par exemple, l’inoculum testé doit être de 105 CFU/mL. Or, chez les individus
malades, la charge bactérienne peut être beaucoup plus importante. En effet, lors d’une
étude clinique, König et al. (118) ont observé que la charge bactérienne dans des
échantillons prélevés chez des individus malades était toujours supérieure à 106 CFU/mL
avec une concentration moyenne de 2  108 CFU/mL (118). D’autres études expérimentales
chez des rongeurs (87) ou cliniques chez l’homme (18) confirment que la charge bactérienne
peut atteindre 109-1010 CFU/mL lors d’une infection. Dans leur étude, König et al. (118) ont
observé une augmentation de la concentration minimale bactéricide (CMB) de la
ciprofloxacine pour les échantillons issus d’individus malades par rapport aux CMB obtenues
pour un inoculum de 105 CFU/mL. In vitro, une étude portant sur l’efficacité de plusieurs
fluoroquinolones sur des inoculums de tailles différentes a montré que des concentrations
bactéricides (capables de tuer les bactéries) sur un inoculum de 106 CFU/mL étaient
seulement bactériostatiques (capables d’inhiber la croissance des bactéries) sur un inoculum
de 1010 CFU/mL (222). Ces résultats ont été confirmés par Mizunaga et al. (151) qui ont
montré que des concentrations égales à 2 fois la CMI étaient bactéricides sur un inoculum
de 106 CFU/mL de S. aureus ou P. aeruginosa alors que des concentrations comprises entre
2 et 16 fois la CMI ne l’étaient pas pour un inoculum de 108 CFU/mL. La charge bactérienne
présente au moment d’une antibiothérapie a donc un impact sur les valeurs utilisées pour
construire les indices PK/PD. Cet impact sur les paramètres PK/PD a été confirmé in vivo
par Jumbe et al. (112) qui ont montré que l’augmentation d’un facteur 10 de la charge
bactérienne (de 107 à 108 CFU/mL) nécessitait des valeurs du rapport AUC/CMI 2 à 6 fois
supérieures pour obtenir le même effet bactéricide.
La charge bactérienne présente à l’initiation d’une antibiothérapie peut avoir un effet
sur l’émergence de bactéries résistantes. En effet, la résistance aux fluoroquinolones par
mutation sur les gènes codant pour les cibles (GyrA, ParC) peut survenir spontanément dans
une population bactérienne à une fréquence d’environ 10-6 à 10-8 (21). L’augmentation de la
charge bactérienne au niveau du site infectieux augmente donc la probabilité d’avoir une
sous-population résistante présente avant qu’aucun traitement aux fluoroquinolones n’ait été
administré. Dans ces conditions, une exposition à l’antibiotique qui va permettre l’éradication
des bactéries sensibles majoritaires peut induire une amplification de la sous-population
52
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Etudes PK/PD des antibiotiques, exemple des FQ
résistante déjà présente avant le traitement ce qui entraîne l’émergence de bactéries
résistantes au cours de l’antibiothérapie. Des résultats récents de notre équipe sur un
modèle in vitro dynamique (75) ainsi que sur un modèle d’infection de la cuisse chez des
animaux neutropéniques (76) montrent en effet que la charge bactérienne présente à
l’initiation du traitement antibiotique joue un rôle sur la probabilité d’émergence de résistance
au cours du traitement. Ces résultats ont été confirmés récemment dans un modèle in vitro
par Singh et al. (205).
En plus d’avoir un impact direct sur les paramètres pharmacodynamiques, la variation
de la charge bactérienne peut également entraîner des variations des paramètres
pharmacocinétiques par son impact sur le statut physiopathologique de l’individu malade.
Différentes études ont montré une diminution de la clairance et une augmentation du temps
de demi-vie d’élimination chez des animaux infectés (110, 175). Ceci pourrait être expliqué
par l’altération des voies d’élimination de l’antibiotique par une diminution de l’activité du
métabolisme hépatique, du flux sanguin rénal et du taux de filtration glomérulaire dus à la
production d’endotoxines par les bactéries (96). De façon plus générale, les infections sont
associées à un état inflammatoire et il a été montré que l’inflammation était capable d’altérer
la pharmacocinétique de nombreux médicaments (74, 110, 133, 154).
53
54
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Ecosystème intestinal et antibiothérapie
1.5. Ecosystème intestinal et antibiothérapie
1.5.1. Composition de la flore commensale du tube digestif
La flore intestinale forme un écosystème complexe comportant environ 1014 microorganismes recouvrant près de 400 espèces bactériennes dont la composition varie en
fonction de la localisation dans le tube digestif et en fonction de l’individu. C’est un élément
actif de la physiologie intestinale, avec des fonctions métaboliques, un rôle de barrière et de
stimulation du système immunitaire intestinal. Le colon abrite la densité microbienne la plus
forte du tube digestif (109-1011 bactéries par mL chez l’Homme) constituée de façon
dominante de genre anaérobies stricts (114). A côté de cette flore résidente, il peut exister
chez certains individus, une flore dite allochtone ou transitoire, qui sauf circonstances
pathologiques, ne s’implante pas dans le tube digestif.
Chez les animaux, l’anatomie du tube digestif et les flores intestinales qui y résident,
sont variables d’une espèce animale à l’autre et, comme chez l’Homme, elles varient en
fonction des stades physiologiques et de l’alimentation.
La flore intestinale de l’Homme comme celle des animaux est un environnement
privilégié en termes de compartiment de sélection et d’amplification de bactéries résistantes
et de gènes de résistance.
1.5.2. Resistance à la colonisation
Les bactéries de la flore intestinale assurent un rôle de barrière en s’opposant à
l’implantation et à la multiplication des micro-organismes d’origine exogène. Ce rôle de
barrière, appelé résistance à la colonisation, est principalement assuré par la flore
anaérobie. L’effet drastique de cette barrière provoque une élimination rapide d’une souche
exogène tandis qu’un effet permissif permet à une souche exogène de se maintenir, parfois
très longtemps, mais à un niveau de population tel que cette souche exogène ne peut pas se
développer (55, 56, 196).
Les mécanismes de résistance à la colonisation sont encore mal connus. Ils font
probablement intervenir une compétition entre les micro-organismes pour les substrats tels
que les constituants alimentaires ou les mucines, les sites d’adhésion sur la muqueuse
intestinale ou encore par la production de substances inhibitrices comme les bactériocines
ou d’autres impliquées dans les phénomènes de « quorum sensing » (212).
D’autres facteurs participent à cette résistance à la colonisation, tels que les facteurs
anatomiques et physiologiques (péristaltisme, sécrétion salivaire, acidité gastrique, …) ainsi
que le système immunitaire.
55
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Ecosystème intestinal et antibiothérapie
1.5.3. Impact de l’antibiothérapie sur la flore digestive
Les antibiotiques sont une cause majeure de perturbation de l’équilibre de
l’écosystème intestinal. En effet, dans le cas d’une antibiothérapie, une fraction de la dose
d’antibiotique administrée peut être excrétée sous forme active par voie biliaire ou excrétée
par la muqueuse intestinale. A cette fraction s’ajoute, en cas d’administration orale, la
fraction non absorbée qui peut suffire à altérer l’équilibre écologique microbien de la flore
intestinale. Les effets observés chez l’hôte peuvent être alors (66) :
i)
l’élimination des bactéries sensibles aux concentrations actives de l’antibiotique
atteinte dans le tube digestif.
ii)
la sélection et la prolifération de bactéries résistantes au sein de la flore endogène.
iii) la colonisation du tractus digestif par des micro-organismes exogènes résistants.
Plusieurs facteurs interviennent sur l’intensité des modifications de l’écosystème
intestinal au cours d’un traitement antibiotique donné, notamment la concentration
d’antibiotique qui atteint la lumière intestinale, l’activité intrinsèque de la substance sur les
bactéries qui composent l’écosystème, la fixation de la substance à des composants du bol
alimentaire (protéine, cellulose) et son inactivation éventuelle dans le contenu intestinal
(214). En effet, les concentrations d’antibiotiques présentes dans la lumière intestinale sont
notablement différentes des concentrations sériques qui servent à définir la sensibilité ou la
résistance des souches bactériennes d’un point de vue thérapeutique, ce qui donne lieu à
l’observation d’effets apparemment paradoxaux de certains antibiotiques sur l’écosystème
intestinal.
1.5.4. Emergence de bactéries résistantes dans la flore digestive
chez l’animal et conséquences en termes de santé
publique
De nombreuses études chez l’animal ont montré une augmentation de la prévalence
de la résistance au sein des bactéries de la flore commensale après l’administration
d’antibiotique quelle que soit la classe utilisée (15, 51, 85, 148). En effet, lors d’une
antibiothérapie, les bactéries résistantes à l’antibiotique peuvent être sélectionnées, et elles
peuvent alors coloniser le tube digestif (210). Une étude portant sur 10 fermes ayant un
historique d’utilisation d’antibiotique à buts thérapeutiques différents a montré que le
pourcentage de souches fécales d’E. coli résistantes était plus important dans les fermes où
l’utilisation d’antibiotiques était considérée comme élevée (215).
56
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Ecosystème intestinal et antibiothérapie
Les bactéries isolées chez les animaux et chez l’Homme partagent les mêmes
mécanismes de résistance, ceci est un argument en faveur de l’absence d’étanchéité entre
les populations bactériennes d’origine humaine et animale. Les flux de bactéries résistantes
ainsi que de gènes de résistance peuvent donc a priori s’effectuer dans les deux sens.
1.5.4.1. Emergence de bactéries zoonotiques résistantes
Un traitement antibiotique peut permettre l’émergence ou la sélection de bactéries
zoonotiques résistantes dans le tube digestif des animaux (142, 234). Ces bactéries peuvent
être transmises à l’Homme par les aliments qu’il consomme et être responsables de toxiinfections alimentaires (68) (voir paragraphe 1.1.2.2). En effet, la viande peut être
contaminée par les bactéries intestinales durant la préparation des carcasses dans les
abattoirs. Ces bactéries peuvent également être transmises par contact avec les animaux ou
indirectement par d’autres voies. Les bactéries du genre Campylobacter et Salmonella sont
les principales bactéries responsables de gastroentérites d’origine zoonotique et la viande
fait partie des sources de contamination de l’Homme. En général, les diarrhées bactériennes
zoonotiques de gravité faible ou modérée ne sont habituellement pas traitées avec des
antibiotiques. Les patients âgés, bactériémiques ou les malades à risque de complication
peuvent cependant être traités avec des antibiotiques.
Le fait que ces bactéries d’origine zoonotique soient résistantes aux antibiotiques
peut avoir plusieurs conséquences (152) :
i)
On peut assister à un échec thérapeutique.
ii)
Les bactéries zoonotiques résistantes seraient à l’origine d’infections plus invasives et
d’une augmentation de la mortalité des patients.
iii) Si des bactéries zoonotiques résistantes contaminent un individu soumis à une
antibiothérapie, elles auront un avantage sélectif pour coloniser le tube digestif de cet
individu.
En termes de santé publique, le premier enjeu de l’utilisation des antibiotiques chez
les animaux est donc de limiter leur impact sur l’émergence et la sélection de bactéries
zoonotiques résistantes dans leur tube digestif.
1.5.4.2. Emergence de bactéries commensales résistantes
Le traitement antibiotique peut aussi permettre l’émergence ou la sélection de
bactéries commensales résistantes dans le tube digestif.
57
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Ecosystème intestinal et antibiothérapie
La dissémination des déterminants génétiques de la résistance portés par une
bactérie commensale peut être considérable puisque la résistance peut être transférée
verticalement (à la descendance) ou horizontalement (aux autres lignées bactériennes) si
ces déterminants génétiques sont situés sur des éléments génétiques mobiles. Ces
échanges peuvent survenir entre souches résidentes de la flore intestinale provenant
d’espèces identiques, différentes voire éloignées (227). Le tube digestif des animaux devient
alors un réservoir de gènes de résistance à l’antibiotique administré.
Les bactéries commensales d’origine animale peuvent potentiellement se retrouver
dans le tube digestif de l’Homme et même si elles n’y sont que de façon transitoire, elles
peuvent alors éventuellement transférer des gènes aux bactéries commensales humaines.
L’écosystème intestinal humain se trouverait donc enrichi de déterminants génétiques de
résistance d’origine animale, potentiellement transmissibles à des bactéries pathogènes
(197). Une étude récente de Johnson et al. a montré une grande similarité entre les E. coli
résistantes retrouvées chez l’Homme (bactériémie ou fèces) et les E coli sensibles et
résistantes retrouvées dans les fèces de poulet alors qu’ils observaient une différence
phylogénétique entre les souches sensibles et résistantes chez l’Homme ce qui les a conduit
à l’hypothèse d’une contamination via la chaîne alimentaire (111).
1.5.5. Impact de l’utilisation des fluoroquinolones sur la flore
commensale
1.5.5.1. Etude chez les animaux
Il existe peu d’études sur l’effet direct de l’utilisation des fluoroquinolones sur la flore
commensale chez l’animal. Chez le porc, il a été montré qu’un traitement à l’enrofloxacine
par voie orale ou intramusculaire aux doses usuelles entraînait un développement rapide de
la
population
coliforme
résistante
aux
fluoroquinolones
quelle que
soit
la
voie
d’administration et que cette résistance persistait durant au moins deux semaines après
l’arrêt du traitement (234). Cette étude a été confirmé lors de traitement de truies par la
fluméquine. Ce traitement a entraîné une augmentation de la sous-population d’E. coli
résistante aux fluoroquinolones chez les truies ainsi que dans leur descendance, mais dans
une moindre mesure. Cette émergence d’E. coli résistantes aux fluoroquinolones n’a été que
transitoire et la flore sensible aux fluoroquinolones a été restaurée dans les 2 mois qui ont
suivi l’arrêt du traitement (15).
Ces résultats sont en contradiction avec ceux de Pultz et al. (182) qui observent chez
des souris traités aux fluoroquinolones la suppression des bactéries à Gram négatif de la
flore intestinale mais pas d’émergence de résistance au sein de cette population (182).
58
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Ecosystème intestinal et antibiothérapie
1.5.5.2. Etude chez l’Homme
De nombreuses études in vitro et in vivo ont révélé l’impact des fluoroquinolones sur
la flore bactérienne intestinale humaine. Les fluoroquinolones ont un effet négatif variable sur
la flore commensale aérobie et anaérobie avec un retour plus ou moins rapide au niveau
basal à l’arrêt du traitement (28, 198). Les auteurs de ces études ont notamment observé un
effet marqué de la lévofloxacine sur la flore aérobie à Gram négatif, comme cela avait déjà
été décrit par Edlund et al. (62). In vitro, Carman et al. (28) ont montré que même de faibles
doses de ciprofloxacine entraînaient une diminution de la population d’E. coli et de
Bacteroides fragilis mais qu’elles avaient un impact limité sur la population d’entérocoques.
L’utilisation de fluoroquinolones est également un facteur de risque de portage fécal
de bacilles à Gram négatif résistants (189, 237). L’utilisation des quinolones peut
sélectionner des souches E. coli résistantes particulièrement lorsqu’elles sont utilisées en
prophylaxie chez les patients neutropéniques ou pour le traitement d’infections urinaires (29,
94, 171). Dans leur étude Carman et al. (28) ont observé, au cours du traitement,
l’émergence de bactéries résistantes de façon importante pour la population de Bacteroides
fragilis mais de façon sporadique pour la population d’E. coli. Ces résultats ont été confirmés
par différentes études réalisées chez des volontaires sains qui ont montré que l’émergence
de bactéries à Gram négatif résistantes au cours d’un traitement aux fluoroquinolones était
rare (62, 65, 214).
Différents facteurs, telle que les expositions répétées aux fluoroquinolones ou une
colonisation préexistante du tractus intestinal pourraient expliquer l’émergence de bacilles
résistants à Gram négatif observée dans différentes études (35, 95, 108, 147, 159, 170, 214,
231). Certains auteurs suggèrent également que la colonisation du tube digestif de l’Homme
par des bacilles à Gram négatif pourrait se produire via la chaîne alimentaire en se basant
sur certaines données telle une étude portant sur 455 enfants n’ayant jamais été traités par
des fluoroquinolones montrant que 3.1% d’entre eux étaient porteurs de bactéries à Gram
négatif résistantes à la ciprofloxacine (184).
59
60
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Les modèles d’études de la flore intestinale
1.6. Les modèles d’études de l’impact des antibiotiques
sur la flore intestinale
La majorité des vertébrés naissent sans aucune flore et ils acquièrent une flore
intestinale très rapidement après la naissance. La nature complexe et dynamique de
l’écosystème intestinal en fait un écosystème très difficile à étudier. En effet, il est difficile de
reproduire un milieu dans lequel plus de 400 espèces bactériennes ont été comptabilisées,
d’autant plus qu’environ 40% d’entre elles ne sont pas cultivables en laboratoire. Il existe
cependant différents modèles d’études in vitro ou in vivo plus ou moins complexes qui
permettent d’évaluer l’impact des antibiotiques sur la flore commensale du tube digestif.
1.6.1. Paramètres étudiés
Lors de l’évaluation de l’impact d’une antibiothérapie sur la flore du tube digestif
différents points peuvent être étudiés :
Le premier paramètre étudié est le dénombrement et le suivi dans le temps des
différentes populations bactériennes présentes ainsi que le suivi des marqueurs
biochimiques du métabolisme bactérien. L’évolution de ces paramètres est étudiée au cours
du traitement puis après l’arrêt de celui-ci.
Comme nous l’avons vu précédemment, une perturbation de l’équilibre de la flore du
tube digestif peut entraîner la croissance d’une population pathogène endogène maintenu à
un niveau très faible ou la colonisation du tube digestif par un pathogène exogène ingéré.
Ces perturbations peuvent être mesurées par des études de « challenge ». Elles consistent
à administrer par voie orale aux animaux, traités ou ayant été traités par un antibiotique, une
bactérie exogène et à rechercher ensuite si celle-ci s’implante dans le tube digestif des
animaux ou si elle est éliminée. Les tests de challenge peuvent être également réalisés in
vitro.
Le dernier paramètre important étudié est l’émergence de bactéries résistantes dans
le tube digestif. Pour cela un suivi des CMI des différentes populations peut être effectué au
cours du traitement puis après l’arrêt de celui-ci.
1.6.2. Les modèles in vitro
Il existe différents types de modèles d’études in vitro de la flore intestinale, les
modèles statiques, les systèmes de culture en fermenteur, ou bioréacteur, semi continus et
continus.
61
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Les modèles d’études de la flore intestinale
Les modèles statiques consistent à placer une suspension de fèces dans une
atmosphère anaérobie. Ce sont des modèles très simples mais qui ne permettent que de
très courtes études (sur 1 ou 2 h) étant donné les changements très rapides des conditions
du milieu de culture (pH, potentiel rédox, …).
Les systèmes de culture semi-continus consistent en un compartiment placé en
condition anaérobie stricte à l’intérieur duquel se trouve un milieu de culture s’approchant de
la composition du milieu intestinal. Le pH et la température de ce milieu de culture sont
continuellement contrôlés et il est renouvelé régulièrement mais de façon discontinue. Ce
système a été mis au point pour l’étude de la flore du colon humain par Miller et al. en 1981
(150).
Les systèmes de culture à flux continus ont d’abord été développés par Slyter et al.
dans les années 60 afin d’étudier les populations bactériennes du rumen (206). Plus tard,
Veilleux et al. en 1981 ont développé sur le même principe un modèle permettant d’étudier la
microflore du rat (228), puis Edwards et al. en 1985 ont transposé le modèle afin d’étudier la
microflore humaine. Ce système de culture à flux continu reprend le principe du système de
culture semi-continu. La différence se situe au niveau du taux de renouvellement du milieu
de culture qui dans le cas d’un système continu est renouvelé en permanence afin de
reproduire le flux intestinal. Ce flux continu permet de maintenir une population bactérienne à
peu près constante, l’hypothèse étant que la persistance de la population bactérienne
dépend uniquement de la différence entre le taux de croissance et le taux d’élimination du
système. Ce modèle a été amélioré par Gibson et al. en 1988 qui l’ont complété en reliant
trois compartiments distincts afin de reproduire les principales conditions nutritionnelles et
environnementales que l’on peut retrouver dans le colon proximal et distal humain (88).
Que ce soit un modèle de culture à flux semi-continu ou continu, le milieu peut être
inoculé par des bactéries particulières, ou alors par une flore totale provenant de fèces
humains ou animaux.
L’ensemble des avantages et des limites de ces modèles in vitro ont fait l’objet d’une
revue par Rumney et al. en 1992 (194). Comme tous les modèles in vitro les principales
limites de ces modèles sont dues à l’absence d’intégration dans le système physiologique.
Premièrement, le milieu de culture utilisé, bien que complexe, reste une simplification de la
diversité des nutriments présents dans le tube digestif. Il manque notamment à ce milieu les
mucines ainsi que les cellules desquamées de la muqueuse digestive. Deuxièmement, les
bactéries présentes dans le milieu ne se trouvent pas dans leur « habitat naturel », elles sont
en suspension dans le système alors que dans le système digestif une partie des bactéries
adhèrent à la muqueuse intestinale et sont alors protégées par les sécrétions intestinales
(93). Ceci peut entraîner, in vitro, une plus forte exposition des bactéries à l’antibiotique,
d’autant plus que, contrairement à ce qui se passe in vivo, l’antibiotique ne peut pas se lier à
62
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Les modèles d’études de la flore intestinale
la matière fécale dans le modèle in vitro (63). Enfin, ces modèles ne prennent pas en compte
les facteurs tels que l’immunologie intestinale et l’absorption des métabolites bactériens ou
de l’eau, ce dernier point a pour conséquence que ces modèles correspondent plutôt à un
modèle de diarrhée.
Malgré les limites qui viennent d’être évoquées, les modèles de culture à flux continu
reproduisent de façon intéressante une partie des relations présentes in vivo entre la
microflore et le système intestinal (84). De plus, ils apportent une grande flexibilité aux
études sur la flore. En effet, ils permettent d’utiliser des substances toxiques ou radioactives
ce qui est difficile in vivo. Ils permettent également de contrôler un certain nombre de
facteurs environnementaux comme le pH, la disponibilité du substrat et la vitesse du flux.
Enfin leur principal avantage pour l’étude de l’impact d’un traitement antibiotique est de
pouvoir suivre en temps réel à la fois la composition bactérienne de la flore et la quantité
d’antibiotique présente au contact des bactéries, ainsi que la sensibilité des bactéries à cet
antibiotique.
1.6.3. Les études cliniques chez l’Homme
Les modèles d’études les plus complets sur l’impact des antibiotiques sur la flore
commensale intestinale sont bien entendus ceux réalisés sur flore totale. Ces études
peuvent être effectuées sur des volontaires sains (77, 163) ou sur des patients malades (29,
94). L’avantage principal de ces études est évidemment d’obtenir des résultats en
« conditions réelles », particulièrement pour les études réalisées sur des patients malades,
sans toutes les limites inhérentes aux études in vitro ou in vivo.
Cependant ces études présentent également des limites, dont la principale concerne
la difficulté d’interprétation des résultats étant donné la grande variabilité interindividuelle de
la flore, mais également une variabilité inter-jour chez un même individu. Cela entraîne la
nécessité d’avoir une cohorte de volontaires ou de patients importante et qui doit être suivie
sur un intervalle de temps assez long. Un deuxième point limitant pour ces études est la
difficulté du contrôle de l’environnement lié au risque de contamination des individus par la
nourriture (contamination microbiologique ou en présence de résidus antibiotiques), ou entre
individus (contamination croisée) (194). Enfin, les difficultés techniques de ces approches
sont importantes et limitent le plus souvent la prospection à quelques bactéries.
63
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Les modèles d’études de la flore intestinale
1.6.4. Les modèles animaux à flore totale (conventionnels)
L’étude de l’impact des antibiotiques sur la flore commensale intestinale peut être
effectuée sur la flore d’animaux conventionnels (rongeurs ou porcs le plus souvent) sains
(15, 109, 215) ou malades (90).
Par rapport aux études cliniques chez l’Homme, les études sur les animaux
conventionnels permettent d’avoir un environnement et une nourriture contrôlée ce qui
permet de limiter les variations inter et intra-individuelles de la flore. Elles permettent
également l’étude de la flore lors de situation physiopathologique précise lorsque les études
sont réalisées sur des modèles animaux atteints de certaines pathologies comme le diabète
par exemple.
Cependant, on retrouve les mêmes limites pour les modèles animaux conventionnels
que celles rencontrées lors des études cliniques chez l’Homme. En plus des différents points
énoncés dans le paragraphe 1.6.3., il est important de noter que la microflore des animaux
de laboratoire est différente de celle de l’Homme ou de l’espèce cible de l’antibiotique. Les
résultats obtenus sont donc difficilement extrapolables à l’Homme ou à l’espèce cible. Enfin,
à notre connaissance, une seule étude a évalué l’impact d’un traitement antibiotique sur la
flore d’animaux infectés (90) or comme nous l’avons vu précédemment, le statut
physiopathologique de l’animal peut faire varier les conclusions quant à l’impact de
l’antibiothérapie sur la flore commensale.
1.6.5. Les modèles animaux à flore contrôlée ou gnotoxénique
En plaçant des cobayes et des souris nés par césarienne en milieu stérile et en les
alimentant avec de la nourriture stérile, Cohendy fut le premier à montrer, dès 1912, que la vie
était possible sans « microbes » (38). Ces animaux, qui ne sont confrontés à aucune flore sont
stériles et sont dit axéniques (du grec xénos = étranger et "a" privatif). Ce n’est que plus tard, en
1928, que des lignées d’animaux axéniques ont été développées et que l’étude de la flore
commensale sur ce modèle animal a débuté.
Les colonies d’animaux axéniques sont le plus souvent des rongeurs. Après
naissance par césarienne, ils sont maintenus dans des isolateurs souples stériles (Figure 13)
à l’abri des bactéries, champignons, protozoaires et virus. Il est également possible d’obtenir
des porcelets et des poussins axéniques et de les maintenir en animalerie stérile.
La capacité de garder des animaux axéniques fournit un modèle très intéressant pour
la manipulation et la simplification de l’écosystème bactérien. Les animaux axéniques
peuvent être colonisés par une (monoxénique), deux (dixénique) ou plusieurs espèces
bactériennes ils deviennent alors gnotoxéniques (du grec gnotos = connu et bio = la vie). Les
64
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Les modèles d’études de la flore intestinale
animaux gnotoxéniques ont donc une flore connue et contrôlée qui est facile à étudier. On
peut également implanter chez ces animaux une flore plus complexe animale ou humaine.
Dans le cas de l’implantation d’une flore humaine, les animaux sont dits HFA pour « Human
Flora Associated » (174). Il est également possible d’implanter une flore d’origine porcine,
les animaux sont alors appelés PFA (Pig Flora Associated) (102), ou encore une flore de
poulet (185).
Figure 13 : Isolateurs souples pour l’élevage d’animaux axéniques
L’intérieur de l’isolateur est ventilé sous pression positive avec un filtre à air HEPA (High Efficiency
Particulate Air Filter) (A), les animaux sont manipulés à l’intérieur de l’isolateur à l’aide de gants (B).
Une double porte latérale (C) formant un sas permet de faire entrer des éléments stériles (eau,
nourriture, instrument, …) dans l’isolateur.
La comparaison entre des souris qui ont été colonisées de façon conventionnelle et
celles qui ont été maintenues axéniques a révélé une action de la microflore sur la
maturation de l’intestin (16). Chez les animaux axéniques on observe des variations
anatomiques, physiologiques et biochimiques attribuées à l’absence de microflore. Smith et
al. en 2007, ont réalisé une revue très complète sur les principales différences entres les
animaux axéniques et conventionnels (207). Les différences observées montrent notamment
une atteinte du système immunitaire, une réduction du profil d’expression des gènes de la
muqueuse épithéliale intestinale notamment pour les gènes contribuant à la sur-régulation
de la sécrétion de substances antibactériennes à la surface intestinale ainsi que pour les
gènes centraux de la régulation du métabolisme et diminution du métabolisme ainsi que du
volume sanguin. Ceci pourrait entraîner des variations des paramètres pharmacocinétiques
plasmatiques chez les animaux axéniques.
Si les animaux gnotoxéniques sont intéressants pour l’investigation de la flore
commensale, il faut garder à l’esprit que ce modèle est un système simplifié. Dans la plupart
des études une ou deux souches bactériennes seulement sont implantées et le plus souvent
il n’y a pas de population anaérobie. Or celle-ci peut jouer un rôle très important dans la
prévention de l’émergence de bactéries résistantes comme nous l’avons vu paragraphe
1.5.2. Le statut gnotoxénique peut également avoir un impact sur la flore implantée. Par
65
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Les modèles d’études de la flore intestinale
exemple, une diminution du temps de génération a été observée pour la souche E. coli BJ4
par Rang et al. dans un modèle monoxénique par rapport à la même souche implantée chez
des souris conventionnelles (187).
Bien que ce modèle ait certaines limites, les animaux gnotoxéniques sont un
excellent modèle d’étude. Ils permettent d’étudier une flore plus ou moins complexe,
humaine ou animale sans les variabilités dues à l’environnement et l’alimentation,
(contaminations microbiologique, présence de résidus d’antibiotiques) mais tout en
conservant les conditions écologiques intestinales proches de celles du sujet, Homme ou
animal, étudié. En effet, plusieurs études ont montré que la flore implantée restait
comparable à la flore administrée et que les conditions écologiques intestinales de la souris
reproduisent celles présentes chez l’Homme (98, 141).
Cependant si à ce jour plusieurs études sur l’impact des antibiotiques sur la flore
commensale ont été réalisées chez ces animaux, à notre connaissance, aucune n’a pris en
compte le facteur infectieux. En effet, les études sont toujours réalisées sur des animaux non
malades or, comme nous l’avons déjà vu dans le paragraphe 1.4.3. l’état physiopathologique
de l’animal peut influencer les résultats de la cinétique de l’antibiotique et donc l’impact des
antibiotiques sur la flore commensale.
66
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Conclusions et objectifs de la thèse
1.7. Conclusions et objectifs de la thèse
La synthèse bibliographique a mis en évidence que la sélection de bactéries
résistantes chez l’animal lors d’un traitement antibiotique pouvait avoir des conséquences
importante sur la santé publique humaine et que les différentes modalités de traitement,
curative ou métaphylactique, pouvaient influencer l’émergence de ces résistances.
L’objectif de ce travail de thèse a donc été d’évaluer l’implication de ces différentes
modalités de traitement dans l’émergence de bactéries résistantes. Différents schémas
posologiques ont été étudiés afin d’évaluer l’émergence de bactéries résistantes lors d’une
antibiothérapie vétérinaire aussi bien au niveau du site infectieux qu’au niveau de la flore
commensale du tube digestif de l’animal.
Nous avons choisi de travailler avec un modèle de rats gnotoxéniques afin de
pouvoir étudier simultanément au niveau du site infectieux et de la flore commensale du
tube digestif l’impact d’un traitement antibiotique sur l’émergence de bactéries résistantes.
En effet, une étude sur animaux gnotoxéniques de taille plus importante (tel que des porcs)
était plus difficilement envisageable matériellement.
Nous nous sommes intéressés dans ce travail à l’impact des fluoroquinolones car
l’utilisation de cette classe d’antibiotique est en expansion aussi bien en médecine humaine
que vétérinaire en raison de l’émergence d’un grand nombre de bactéries résistantes aux
autres substances antibiotiques. Dans ce contexte, il serait judicieux de développer une
stratégie qui permette de limiter l’émergence et la dissémination de bactéries résistantes aux
fluoroquinolones afin de préserver l’efficacité de ces substances.
Les objectifs de cette thèse ont été :
 de déterminer l’impact des différentes modalités d’antibiothérapie, curative ou
métaphylactique, sur l’émergence de bactéries résistantes.
 de déterminer les indices PK/PD associés à la prévention de l’émergence de
résistance.
 d’évaluer l’impact de différents schémas posologiques d’une fluoroquinolone
sur l’émergence de bactéries résistantes au niveau de la flore commensale digestive
dans un modèle d’infection.
Dans la première partie de ce travail expérimental (Chapitre 2), nous avons
développé un modèle d’infection pulmonaire chez le rat permettant de reproduire les
modalités de traitement antibiotique de type curatif ou métaphylactique. Nous avons ensuite
testé, sur ce modèle, différents schémas posologiques de marbofloxacine afin de mieux
67
Chapitre 1 – Etude bibliographique : Conclusions et objectifs de la thèse
comprendre les relations PK/PD associées à l’émergence de bactéries résistantes aux
fluoroquinolones.
Dans une seconde partie de ce travail (Chapitre 3), nous avons transposé ce modèle
à des animaux axéniques chez qui nous avons implanté deux souches bactérienne issue
d’une flore d’origine porcine. Ceci nous a permis d’évaluer dans le cadre d’une
antibiothérapie de type curatif ou métaphylactique, l’impact de différents schémas
posologiques de marbofloxacine sur l’émergence de bactéries résistantes dans la flore
commensale d’animaux atteints d’une infection pulmonaire.
68
Chapitre 2
ETUDE EXPERIMENTALE
Impact de la marbofloxacine
sur la flore pathogène
69
70
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
CHAPITRE 2 - ETUDE EXPERIMENTALE
2. Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
Cette partie s’appuie sur l’article : « Influence of Inoculum Size and Marbofloxacin
Plasma Exposure on the Amplification of Resistant Subpopulations of Klebsiella pneumoniae
in a Rat Lung Infection Model. » paru dans le journal Antimicrobial Agents and
Chemotherapy (voir paragraphe 2.7.).
2.1. Introduction
Dans ce chapitre, nous avons voulu comparer l’impact d’un traitement de type
métaphylactique et d’un traitement de type curatif sur le devenir d’une infection et
l’émergence de résistance dans un modèle d’infection pulmonaire chez le rongeur.
Pour réaliser cette étude nous avons commencé par caractériser la bactérie utilisée
pour l’infection. Nous avons ensuite développé un modèle reproductible d’infection
pulmonaire chez le rat initié par deux inoculum de tailles différentes, une faible et une forte
afin
de
reproduire
la
charge
bactérienne
présente
à
l’initiation
d’un traitement
métaphylactique (faible charge) ou curatif (forte charge). Sur ce modèle nous avons testé
différentes doses de marbofloxacine selon deux modalités d’administration. Enfin nous
avons étudié la pharmacocinétique de la marbofloxacine dans les conditions précises de
notre modèle afin de déterminer l’indice PK/PD le plus prédictif de l’émergence de bactéries
résistantes.
Les résultats obtenus au cours de ces différentes études seront présentés dans 4
parties distinctes avant d’être discutés dans la dernière partie de ce chapitre.
71
72
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
2.2. Etude de la bactérie utilisée
2.2.1. Problématique et objectifs
Chaque souche bactérienne a sa propre sensibilité face à un antibiotique donné ce
qui va conditionner les résultats des analyses PK/PD.
L’objectif de cette étude était de déterminer in vitro les paramètres de croissance,
la concentration minimale inhibitrice (CMI) de marbofloxacine ainsi que la
concentration de marbofloxacine prévenant l’apparition de premiers mutants (MPC) de
la souche qui servira pour l’initiation du modèle d’infection pulmonaire chez le rat :
Klebsiella pneumoniae ATCC43816 (KP).
2.2.2. Matériels et méthodes
2.2.2.1. Courbe de croissance in vitro de Klebsiella pneumoniae
ATCC43816
Trois suspensions de KP (C1, C2 et C3) contenant 105 CFU/mL réalisées dans du
bouillon Mueller Hinton (MH) ont été placées à l’étuve à 37°C. A t = 0, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h,
8h, 10h, 14h, 16h, 18h, 20h, 22h, 24h et 36h un dénombrement bactérien a été réalisé.
Le dénombrement des bactéries a été réalisé à partir d’un prélèvement de 100µL qui
a été dilué plusieurs fois au 10ème. Dix microlitres de chaque dilution ont ensuite été déposés
sur une gélose MH sans antibiotique (3 dépôts par dilution). Après une incubation de 18 h à
37°C, les colonies formées à l’emplacement de chaque dépôt ont été comptées si leur
nombre était inférieur à 15. La moyenne du nombre de colonies des 3 dépôts issus de la
même dilution a ensuite été calculée et multipliée par le facteur de dilution afin d’obtenir le
nombre de bactéries par millilitre. La limite de détection était de 100 CFU/mL.
2.2.2.2. Evaluation de la sensibilité de Klebsiella pneumoniae
ATCC43816
 Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI)
La détermination de la CMI de la marbofloxacine a été réalisée dans du bouillon
Mueller-Hinton (MH) selon la méthode de microdilution préconisée par le CLSI (Clinical and
Laboratory Standards Institute). Un inoculum de 5.105 CFU/mL a été mis en contact avec
une gamme de concentrations d’antibiotiques obtenue par une série de dilutions au demi. La
CMI a été fixée en considérant la concentration minimale en marbofloxacine qui a inhibé
73
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
toute croissance visible après une incubation de 18 heures à 35°C. La détermination de la
CMI pour la marbofloxacine a été réalisée 3 fois, lors d’expériences indépendantes.
 Détermination de la Concentration prévenant les mutants (MPC)
La concentration prévenant les premiers mutants a été déterminée selon une
méthode précédemment décrite (21).
Des colonies de K. pneumoniae ensemencées la veille sur une gélose MH ont été
mises en suspension dans 150 mL de bouillon MH. Après une incubation à 37°C pendant
18 h, la suspension a été centrifugée à 3000 g pendant 10 minutes. Le surnageant a été
éliminé et les bactéries ont été lavées 2 fois dans 20 mL de NaCl à 0.9% avant d’être
reprises dans 1.5 mL de NaCl. La suspension obtenue contenait environ 1011 CFU/mL. Cent
microlitres de cette suspension (correspondant à un inoculum de 1010 CFU) ont ensuite été
ensemencées sur des géloses MH supplémentées avec différentes concentrations de
marbofloxacine (2 géloses pour chaque concentrations). Après 48 h d’incubation à 37°C, les
colonies qui se sont développées sur les géloses ont été dénombrées. La MPC a été fixée
en considérant la concentration minimale en marbofloxacine nécessaire pour qu’aucune
colonie ne se développe. La détermination de la MPC pour la marbofloxacine a été réalisée
3 fois, lors d’expériences indépendantes.
2.2.3. Résultats
2.2.3.1. Courbe de croissance
Les résultats de la courbe de croissance ont montré une phase de latence de la
bactérie entre 0 et 1 h suivie d’une phase de croissance exponentielle de la population
bactérienne entre 1 et 6 h puis d’une phase stationnaire autour de 109CFU/mL, 6 h après la
mise en culture (Figure 14).
2.2.3.2. Etude de sensibilité
La CMI et la MPC de KP ATCC 43816 pour la marbofloxacine ont été évaluées à
0.032 µg/mL et 0.256 µg/mL respectivement.
74
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
1010
CFU/mL
108
106
104
102
0
4
8
12
16
20
24
28
32
36
40
temps (h)
C1
C2
C3
Figure 14 : Croissance in vitro de Klebsiella pneumoniae ATCC 43816
Croissance de Klebsiella pneumoniae ATCC 43816 sur 36 h à partir de 3 inoculums de
105 CFU/mL C1, C2 et C3) dans du bouillon MH. Les résultats des 3 inoculums sont représentés
(C1, C2 et C3). Les 3 phases caractéristiques de la croissance (latence, exponentielle, stationnaire)
peuvent être observées.
2.2.4. Conclusions
La croissance de la souche KP ATCC 43816 est rapide (temps de latence dans le
bouillon MH < à 2 h). La CMI ainsi que la MPC de cette souche pour la marbofloxacine sont
peu élevées par rapport aux valeurs du CLSI (0.032 µg/mL et 0.256 µg/mL respectivement)
ce qui indique que cette souche bactérienne est sensible à la marbofloxacine.
75
76
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
2.3. Impact de la charge bactérienne sur l’émergence de
bactéries résistantes à la marbofloxacine
2.3.1. Problématique et objectifs
Lors d’une antibiothérapie préventive ou curative la taille de la charge bactérienne
présente à l’initiation du traitement varie et différentes études in vitro ont montré l’impact de
la taille de l’inoculum sur l’activité des fluoroquinolones. Or, la plupart des études in vivo pour
évaluer l’activité des fluoroquinolones ont été menées sur des animaux infectés par une
seule taille d’inoculum bactérien. Il nous a donc paru nécessaire de vérifier l’impact de ces
deux modalités thérapeutiques sur un modèle in vivo. Il n’existait aucun modèle d’infection
pulmonaire de rongeurs maitrisé dans le laboratoire, nous avons donc fait le choix de réaliser
cette étude sur un modèle précédemment décrit : une infection pulmonaire chez le rat par
KP. Nous avons choisi de ne pas immunodéprimer les animaux afin d’avoir un modèle le
plus représentatif des infections naturelles.
Dans cette étude nous avons voulu évaluer l’impact de différents schémas
posologiques de marbofloxacine sur l’émergence de bactéries résistantes lors d’une
antibiothérapie curative ou métaphylactique. D’autre part, le concept de « one shot » a été
récemment développé en médecine vétérinaire. Il consiste à traiter les animaux en
administrant en une seule fois l’équivalent de la dose administrée habituellement sur
plusieurs jours. Par exemple, pour la marbofloxacine la dose usuelle de 2 mg/kg pendant 4
jours est remplacée par une dose unique de 8 mg/kg. Nous avons donc comparé l’impact de
cette modalité d’administration de l’antibiotique et l’administration classique répétée sur
l’émergence de bactéries résistantes au cours du traitement.
L’objectif de cette étude était double :
i)
Développer, un modèle reproductible d’infection pulmonaire initiée par
différentes charges de KP chez le rat afin de reproduire les conditions
présentes à l’initiation d’une antibiothérapie curative ou métaphylactique.
ii)
Evaluer dans ce modèle d’infection l’influence de différents schémas
posologiques de marbofloxacine sur l’émergence de bactéries résistantes.
2.3.2. Matériels et méthodes
2.3.2.1. Bactéries et antibiotique
La bactérie Klebsiella pneumoniae ATCC 43816 a été utilisée pour réaliser les
infections pulmonaires.
77
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
L’antibiotique utilisé a été la marbofloxacine sous forme de poudre, aimablement
fournie par le laboratoire Vetoquinol (Lure, France) pour la phase in vitro et le MarbocylND
10% (Vetoquinol, Lure, France) pour le traitement des animaux.
2.3.2.2. Préparation de l’inoculum bactérien
Quelques colonies de KP ont été ensemencées dans 50 mL de bouillon MH. La
suspension obtenue a été placée à l’étuve pour la nuit puis centrifugée à 3000 g pendant 10
minutes. Les bactéries ont ensuite été remises en suspension dans du NaCl 0.9% afin
d’obtenir une suspension finale contenant 21010 CFU/mL. Cette suspension correspondant
au grand inoculum a ensuite été diluée au 10 000ème afin d’obtenir la suspension
correspondant au petit inoculum de 2106 CFU/mL.
La taille de chaque inoculum ainsi que sa composition en bactéries résistantes a été
vérifiée de la même façon que pour les bactéries prélevées dans les poumons (voir
paragraphe 2.3.2.6., Etude bactériologique).
2.3.2.3. Animaux
Pour cette étude, des rats mâles OFA (Charles River, L’arbresle, France), pesant de
200 à 270g ont été utilisés. Les animaux ont été hébergés à 2 ou 3 par cage à température
ambiante avec un cycle jour/nuit de 12 h. Une période d’acclimatation d’au moins 2
semaines avant le début de l’expérimentation a été respectée. Les animaux ont eu un accès
libre à la nourriture (Harlan, T2014, Gannat, France) et à l’eau.
2.3.2.4. Infection pulmonaire par Klebsiella pneumoniae
L’infection pulmonaire par Klebsiella pneumoniae a été réalisée selon la méthode
précédemment décrite par Bakker-Wounderberg et al. (10).
Les animaux ont été anesthésiés avec un mélange kétamine / médétomidine
(ImalgenND 1000, Merial SAS, Villeurbanne, France / DomitorND, Pfizer, Paris, France). La
trachée a été canulée et les poumons ont été inoculés avec 0.05 mL de la suspension saline
contenant 2  106 CFU/mL KP, soit un inoculum de 105 CFU in toto (Groupe A) ou de la
suspension saline contenant 2  1010 CFU/mL KP, soit un inoculum de 109 CFU in toto
(Groupe B).
Pour chaque groupe (A et B), 4 animaux témoins n’ont reçu aucun traitement
antibiotique et 3 animaux témoins ont été sacrifiés juste avant le début du traitement à la
78
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
marbofloxacine afin d’obtenir la quantité moyenne de bactéries contenues dans les poumons
au moment de l’initiation du traitement.
2.3.2.5. Traitement Antibiotique
Le traitement à la marbofloxacine (MarbocylND, Vetoquinol, Lure, France) a débuté
4 h (Groupe A) ou 24 h (Groupe B) après l’inoculation de KP dans les poumons. La
marbofloxacine a été administrée par voie sous cutanée dans un volume de 0.3 mL.
Les animaux ont été traités suivant deux modalités d’administration : la dose de
marbofloxacine a été administrée en une seule prise ou divisée en 4 administrations sur 4
jours. Pour le groupe A, une dose unique de marbofloxacine de 16 mg/kg a été testée selon
les deux modalités d’administration. Pour le groupe B, 3 doses de marbofloxacine ont été
testées selon les deux modalités d’administration : 16, 64 et 100 mg/kg.
Les animaux ont été euthanasiés par une injection intrapéritonéale de pentobarbital
sodique (DolethalND, Vetoquinol, France) 96 h après l’initiation du traitement à la
marbofloxacine. Les poumons ont alors été prélevés de manière stérile et homogénéisés
dans 10 mL de NaCl 0.9%. Les homogénats obtenus ont été centrifugés 10 min à 3000g
puis lavés deux fois dans du NaCl 0.9% afin d’éliminer les traces éventuelles d’antibiotique.
Chaque groupe de traitement était composé de 10 à 12 rats.
2.3.2.6. Etude bactériologique
Afin de dénombrer la population bactérienne totale dans les poumons, les
homogénats de poumons ont été dilués successivement au 10ème et les différentes dilutions
ont été déposées sur des géloses MH sans antibiotique, contenant 10% de charbon actif et
10% de sulfate de magnésium utilisés pour piéger l’antibiotique; 3 dépôts de chaque dilution
ont été réalisés pour chaque animal.
Pour le dénombrement des sous-populations bactériennes résistantes dans les
poumons, 100 µL de chaque homogénat de poumons, non dilués, ont été ensemencés sur
des
géloses
Mac
Conkey
supplémenté
avec
0.064 µg/mL
ou
0.256 µg/mL
de
marbofloxacine. Pour chaque concentration de marbofloxacine 2 géloses ont été
ensemencées.
Le dénombrement des bactéries totales a été effectué après une nuit d’incubation à
37°C comme décrit paragraphe 2.2.2.1. Le dénombrement des bactéries résistantes a été
effectué après 24 h d’incubation à 37°C. Si les colonies étaient trop petites, l’incubation était
poursuivie pendant 24 heures. La moyenne du nombre de colonies des 2 boîtes issues du
79
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
même homogénat a été calculée afin d’obtenir le nombre de bactéries par poumons. La
limite inférieure de détection a été de 100 CFU/poumons, les bactéries ont été considérées
comme étant éradiquées en dessous de ce seuil. Les bactéries se développant en présence
de 0.064 µg/mL de marbofloxacine ont été nommées R-2×MIC et celles se développant en
présence de 0.256 µg/mL ont été nommées R-8×MIC.
La proportion de bactéries résistantes pour chaque sous-population (R-2MIC et R8MIC) a été calculée en divisant le nombre de bactéries résistantes se développant sur les
géloses additionnées de 0.064 ou 0.256 µg/mL de marbofloxacine par le nombre de
bactéries totales se développant sur gélose sans antibiotique.
2.3.3. Résultats
2.3.3.1. Infection par le petit inoculum - 105CFU
Les populations bactériennes totales qui ont été retrouvées dans les poumons des
animaux témoins du groupe A (105 CFU) 4 h et 96 h après l’inoculation de KP, ainsi que les
pourcentages d’animaux porteurs de bactéries résistantes R-2MIC et R-8MIC sont
présentées dans le Tableau 3.
Les petits inoculums (2 × 106 CFU/mL) qui ont servi pour l’inoculation des animaux du
groupe A n’ont jamais contenu de bactéries résistantes à 0.064 ou 0.256 µg/mL de
marbofloxacine au moment de l’inoculation dans les poumons.
A l’initiation du traitement antibiotique (4h après l’inoculation de KP), la population
bactérienne dans les poumons des animaux infectés par le petit inoculum a été, en
moyenne, de 5.4±0.1 log10 CFU/poumon. Dans cette population nous n’avons retrouvé
aucune bactérie résistante à 0.064 ou 0.256 µg/mL de marbofloxacine.
Les 3 animaux témoins non traités ont présenté, 4 jours après l’infection, une charge
bactérienne comprise entre 4.2 et 11.2 log10 CFU/poumon.
2.3.3.2. Infection par le grand inoculum -109CFU
Les populations bactériennes totales qui ont été retrouvées dans les poumons des
animaux témoins du groupe B (109 CFU) 4 h et 96 h après l’inoculation de KP, ainsi que les
pourcentages d’animaux porteurs de bactéries résistantes R-2MIC et R-8MIC sont
présentées dans le Tableau 3.
Les grands inoculums (2 × 1010 CFU/mL) qui ont servi pour l’inoculation des animaux
du groupe B contenaient entre 2.1 et 5.0 log10 CFU/mL résistantes à 0.064 µg/mL de
marbofloxacine et entre 1.1 et 2.2 log10 CFU/mL résistantes à 0.256 µg/mL.
80
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
A l’initiation du traitement antibiotique (24 h après l’inoculation de KP), la population
bactérienne totale dans les poumons des animaux infectés par le grand inoculum était en
moyenne de 10±0.4 log10 CFU/poumon. Dans cette population nous avons retrouvé entre 3.2
et 3.4 log10 CFU/poumon résistantes à 0.064 µg/mL de marbofloxacine (R-2×MIC) et entre
2.75 et 3.06 log10 CFU/poumon résistantes à 0.256 µg/mL de marbofloxacine (R-8×MIC). En
prenant en compte le nombre total de bactéries et le nombre de bactéries résistantes R2×MIC et R-8×MIC à l’initiation du traitement antibiotique, nous avons calculé que les
proportions initiales de ces deux sous-population résistantes étaient comprises entre 10-7 et
10-8.
Tous les animaux témoins non traités à la marbofloxacine sont morts dans les 72
heures qui ont suivi l’inoculation de KP.
Tableau 3 : Population bactérienne totale et pourcentage d’animaux porteurs de
R-2×MIC et R-8×MIC 96 h après l’initiation des différents traitements à la
marbofloxacine pour le petit et le grand inoculum.
Contrôles non traités
A l’initiation 96h après
du
l’initiation du
traitement
traitement
Petit inoculum
n
Animaux morts
log10 CFU/poumons
(moyenne ± SD)
R-2×MIC
R-8×MIC
Grand inoculum
n
Animaux morts
log10 CFU/poumons
(moyenne ± SD)
R-2×MIC
R-8×MIC
Dose totale de marbofloxacine (mg/kg)
Administration fractionnée
Administration unique
16
64
100
16
64
100
3
0/3
4
0/4
10
0/10
-
-
10
0/10
-
-
5.40.1
9.463.8
0.91.4†
-
-
0.31.0†
-
-
0%
0%
75%
50%
0%
0%
-
-
0%
0%
-
-
3
0/3
4
4/4
11
0/11
11
0/11
10
0/10
10
4/10 b
12
0/12
9c
3/12 c
7.30.7
6.80.8
6.20.4
7.51.3
7.50.7
6.60.6 c
100%
55%
55%
27%
10%
0%
90% b
70% b
92%
50%
42% c
0% c
a
100.4
-
100%
100%
nd
nd
a
a
†
Pour le calcul de ces moyennes, la valeur 0 log10 CFU a été assignée aux poumons pour lesquels les bactéries
étaient indétectables.
a
Les 4 animaux sont morts dans les 72 heures suivant l’inoculation de KP.
b
Les 4 animaux morts entre 72 et 96 heures sont considérés comme porteurs de bactéries résistantes et sont
inclus dans le calcul des pourcentages d’animaux porteurs de R-2×MIC et R-8×MIC dans les poumons.
c
la mort de ces 3 animaux survient durant les 24 heures qui suivent l’administration de la marbofloxacine. Ces 3
morts sont considérées comme étant dues à la toxicité de la forte dose de marbofloxacine administrée en dose
unique sur des animaux malades. Ces animaux ne sont pas inclus dans le calcul des pourcentages d’animaux
porteurs de KP résistantes dans les poumons.
- : non déterminé
Les animaux morts n’on pas été pris en considération pour le calcul de la population moyenne de bactérie dans
les poumons.
81
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
2.3.3.3. Effet des différents schémas posologiques de marbofloxacine
sur la population bactérienne totale
Les populations bactériennes totales qui ont été retrouvées 96 h après l’initiation des
différents traitements antibiotique dans les poumons des animaux du groupes A (105 CFU) et
du groupe B (109 CFU) sont présentées dans le Tableau 3.
Pour le petit inoculum (Groupe A), la dose de 16 mg/kg, fractionnée ou non, a conduit
à une diminution significative de la population de KP dans les poumons des animaux traités.
Pour le grand inoculum (Groupe B), nous avons observé une réduction de la
population de KP dans les poumons des animaux d’au moins 2 log pour les 3 doses de
marbofloxacine quelle que soit la modalité d’administration (fractionnée ou non). Aucune
différence significative n’a été observée entre les différentes posologies. Avec la plus faible
dose de marbofloxacine (16 mg/kg) administrée en dose unique, 4 des 10 rats sont morts
entre 72 et 96 h après l’administration de marbofloxacine, alors que tous les animaux ont
survécu pour la même dose administrée de manière fractionnée. Pour la plus forte dose de
marbofloxacine (100 mg/kg) administrée en dose unique, 3 des 12 rats sont morts durant les
24 h qui ont suivi l’administration.
2.3.3.4. Effet des différents schémas posologiques de marbofloxacine
sur l’enrichissement des populations R-2MIC et R-8MIC
Les pourcentages d’animaux porteurs de R-2×MIC et R-8×MIC dans les poumons
96 h après l’initiation du traitement à la marbofloxacine pour les différents groupes et les
différents schémas posologiques sont présentés dans le Tableau 3. Chez tous les animaux
porteurs de bactéries résistantes 96 h après l’initiation du traitement, la proportion des deux
sous-populations résistantes R-2×MIC et R-8×MIC a été supérieure à 10-6 ce qui indique un
enrichissement de la population par rapport à la proportion présente à l’initiation du
traitement antibiotique (< 10-6).
Les rats du groupe A, infectés par le petit inoculum et traités par 16 mg/kg de
marbofloxacine, n’ont présenté aucune bactérie R-2×MIC ou R-8×MIC dans les poumons
96 h après l’initiation du traitement contrairement aux rats du groupe B, infectés par le grand
inoculum, chez qui nous avons retrouvé les deux sous-populations bactériennes résistantes
(R-2×MIC et R-8×MIC) dans les poumons. La fréquence des animaux porteurs de ces deux
sous-populations résistantes a été négativement associée à la dose de marbofloxacine. De
plus, pour la même dose totale de marbofloxacine, l’administration fractionnée de celle-ci a
semblé
limiter
l’enrichissement
des
sous-populations
résistantes
par
rapport
à
l’administration en dose unique.
82
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
2.3.4. Conclusion
Au cours de cette étude nous avons pu mettre au point un modèle d’infection
pulmonaire
simulant
les
conditions
présentes
à
l’initiation
d’une
antibiothérapie
métaphylactique ou curative. L’étude de différents schémas posologiques de marbofloxacine
sur ce modèle a montré l’impact bénéfique sur l’émergence de bactéries résistantes à la
marbofloxacine d’un traitement antibiotique précoce sur une faible charge bactérienne par
rapport à un traitement plus tardif sur une grande charge bactérienne.
Le traitement des animaux selon deux modalités, une administration fractionnée
« classique » de l’antibiotique ou une administration unique semble montrer qu’un traitement
« one shot » chez le rat favorise l’émergence de résistance par rapport à un traitement
classique si la dose d’antibiotique utilisée n’est pas suffisante.
83
84
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
2.4. Impact de la charge bactérienne sur la cinétique de la
marbofloxacine chez le rat
2.4.1. Problématique et objectifs
Plusieurs
études
ont
montré
que
les
infections
bactériennes
altèrent
la
pharmacocinétique de certaines substances (96) dont les fluoroquinolones (110, 175). Lors
d’un traitement métaphylactique l’état physiopathologique des animaux diffère de celui
d’animaux recevant un traitement curatif, qui présentent des signes cliniques d’infection
important. Cette différence des fonctions physiologiques entre des animaux porteurs d’une
faible charge bactérienne et ceux présentant une charge bactérienne plus importante peut
entraîner des variations des paramètres pharmacocinétiques entre ces animaux. Une étude
de notre équipe dans un modèle d’infection de la cuisse par E. coli chez des souris
neutropéniques a montré que la pharmacocinétique de la marbofloxacine était altérée par
l’infection et qu’il existait une importante différence d’exposition à l’antibiotique entre les
animaux infectés par un petit ou un grand inoculum ce qui a conduit à une grande variation
des paramètres PK/PD pour une même dose de marbofloxacine (76).
L’objectif de cette étude était d’évaluer les paramètres pharmacocinétiques de la
marbofloxacine dans les différentes conditions expérimentales de notre modèle.
Dans ce but nous avons réalisé une cinétique de la marbofloxacine sur des rats
infectés par un inoculum 105 CFU de KP par voie trachéale recevant un traitement précoce à
la marbofloxacine ainsi que sur des animaux infectés par un inoculum de 109 CFU recevant
un traitement plus tardif à la marbofloxacine.
2.4.2. Matériels et méthodes
2.4.2.1. Animaux
Pour cette étude, deux groupes (C et D) de rats mâles OFA (Charles River,
L’arbresle, France), pesant de 200 à 270g ont été utilisés. Les animaux ont été hébergés
individuellement, à température ambiante avec un cycle jour/nuit de 12 h. Une période
d’acclimatation d’au moins 2 semaines avant le début de l’expérimentation a été respectée.
Les animaux ont eu un accès libre à la nourriture (Harlan, T2014, Gannat, France) et à l’eau.
85
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
2.4.2.2. Cinétique de la marbofloxacine
Les prélèvements sanguins ont été collectés via un cathéter inséré dans la veine
fémorale gauche. La mise en place du cathéter a été réalisée sous anesthésie générale
(Kétamine / médétomidine : ImalgèneND 1000, Mérial SAS, Villeurbanne, France / DomitorND,
Pfizer, Paris, France).
Au moins 3 jours après la pose du cathéter, les rats ont été infectés, sous anesthésie,
par voie endo-trachéale par 0.05 mL d’un inoculum de 2  106 CFU/mL de KP, soit 105 CFU
(Groupe C) ou 0.05 mL d’un inoculum de 2  1010 CFU/mL de KP, soit 109 CFU (Groupe D).
Quatre heures après l’inoculation, les animaux du groupe C ont reçu une injection
sous cutanée de 4 ou 16 mg/kg de marbofloxacine. Les animaux du groupe D ont reçu une
injection sous cutanée de 4, 16 ou 100 mg/kg de marbofloxacine 24 h après l’inoculation de
KP. Chaque groupe de traitement a été composé de 2 à 4 animaux.
Les prélèvements sanguins (200µL) ont été collectés à 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24
et 48 heures après l’injection. Après chaque prélèvement, un volume équivalent de NaCl
0.9% a été administré dans le cathéter. Les prélèvements sanguins ont été centrifugés 10
min à 7000g à 4°C. Les plasmas obtenus ont été stockés à -20°C jusqu’au dosage.
2.4.2.3. Dosage de la marbofloxacine
Les échantillons de plasma ont été analysés par chromatographie en phase liquide à
haute performance (HPLC) (exc = 295 nm, em = 500 nm) (Agilent 1100) d’après la méthode
décrite par Schneider et al. (200). La marbofloxacine a été obtenue par une extraction
liquide-liquide : 0.1 mL de plasma ont été ajoutés à 1 mL de dichloromethane et agités
pendant 10 secondes. Deux cent microlitres d’un mélange MeOH (2%HCl)/H2O (90:10) ont
été ajoutés à la phase organique puis 100 µL du surnageant ont été injectés dans une
colonne C18e (Lichrospher, Merck, 5 µm 125x4 mm) avec un gradient d’élution d’acide
phosphorique (0.01M)-triethylamine (0.004M) (pH = 2)/Acetonitrile. La courbe de calibration
de la marbofloxacine a été établie sur la gamme de concentration de 20 à 500 ng/mL par un
modèle de régression linéaire. Les échantillons dont les concentrations étaient supérieures à
la gamme de concentrations de la courbe de calibration ont été dilués avant le dosage.
L’exactitude a varié de 104.1 à 107.5% et la variation de la précision intra-jour et inter-jour
était en dessous de 6.2% et 8.2% respectivement. La limite de quantification a été de
20 ng/mL.
86
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
2.4.2.4. Analyse pharmacocinétique
Les profils individuels de concentration en fonction du temps obtenus pour chaque
dose et chaque niveau d’inoculum ont été regroupés et analysés simultanément par un
logiciel d’analyse de pharmacocinétique de population (MONOLIX) (123). Les estimations
des paramètres pharmacocinétiques ont été réalisées à l’aide de MONOLIX version 2.1 avec
la méthode SAEM (Stochastic Approximation version of the Expectation Maximization
algorithm) et ont été obtenus à l’aide d’un modèle bi-compartimental extravasculaire, sans
lag-time suivant l’équation 1.
C t   A exp t  B exp  t  ( A  B) exp  Kat
Equation 1
où C t  est la concentration plasmatique au temps t, A, et B les constantes préexponentielles,  et  les constantes de vitesse et Ka la constante de vitesse d’absorption.
L’AUC0-96 et l’AUC24 ont été calculées par intégration de l’équation 1 respectivement
de 0 à 96 h et de 0 à 24 h. Le temps de demi-vie d’élimination (T1/2elim) a été calculé en
divisant le logarithme népérien de 2 par . Les données pharmacocinétiques obtenues ont
été utilisées pour vérifier la linéarité de la cinétique.
Afin de déterminer l’impact de la taille de l’inoculum sur les paramètres
pharmacocinétiques, un test LRT (Likelihood Ratio Test) a été utilisé en ajoutant la
covariable « taille de l’inoculum » suivi d’un test de  ².
2.4.3. Résultats
Les données pharmacocinétiques obtenues pour les différentes doses de
marbofloxacine et pour les différentes tailles d’inoculum ont été analysées simultanément
avec succès en utilisant le même modèle compartimental, indiquant une relation doseproportionnalité entre la cinétique de la marbofloxacine et le petit et le grand inoculum. Les
paramètres pharmacocinétiques du modèle sont donnés dans le Tableau 4.
Tableau 4 : Paramètres pharmacocinétiques estimés pour la population étudiée
Paramètres
Valeurs
-1
Coefficient de variation
Constante d’absorption (ka)
5.51 h
162%
Clairance apparente
0.6 L/h/kg
15.5%
T1/2elim
2.41 h
-
87
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
L’analyse de l’ensemble des données par le logiciel Monolix a montré qu’il n’existait
aucune différence significative des paramètres pharmacocinétiques entre le petit (Groupe C)
et le grand (Groupe D) inoculum recevant les mêmes doses. Cette absence de différence
peut être observée sur la Figure 15 qui montre les données de pharmacocinétiques qui ont
été obtenues avec les animaux des groupes C et D et la simulation qui a été obtenue par
Monolix après analyse simultanée des données obtenues pour les animaux infectés par le
Marbofloxacin (µg/mL)
petit et par le grand inoculum pour chaque dose.
10
4 mg/kg
A
1
0.1
0.01
Marbofloxacin (µg/mL)
0
4
8
12
16
20
10
24
28
32
36
40
44
16 mg/kg
48
temps (h)
B
1
0.1
0.01
Marbofloxacin (µg/mL)
0
4
8
12
16
20
100
24
28
32
36
40
44
100 mg/kg
48
temps (h)
C
10
1
0.1
0.01
0
4
8
12
16
20
24
28
32
36
40
44
48
temps (h)
temps (h)
Simulation Monolix
petit inoculum
grand inoculum
Figure 15 : Cinétique de la marbofloxacine en fonction de la taille de l’inoculum
Concentrations plasmatiques de marbofloxacine en fonction du temps après une administration
unique sous-cutanée d’une dose de 4 (A), 16 (B) ou 100 mg/kg (C) chez des animaux infectés par
5
9
inoculum de K. pneumoniae. La courbe représente
un petit (10 CFU) ou un grand (10 CFU)
la simulation des concentrations plasmatiques en fonction du temps obtenues à l’aide du logiciel
Monolix après analyse simultanée des données obtenues pour les animaux infectés par le petit et
par le grand inoculum pour chaque dose.
88
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
A l’aide de ce modèle nous avons pu simuler les profils de concentrations
plasmatiques pour les doses de marbofloxacine testées dans l’étude précédente
(paragraphe 2.3.). Le temps de demi-vie d’élimination étant de 2.41 h fait il n’y a pas de
phénomène d’accumulation de la marbofloxacine pour des administrations répétées toutes
les 24 h.
Les profils de concentrations de marbofloxacine prédites en fonction du temps pour
chaque dose de marbofloxacine en administrations fractionnées, 4  4, 4  16 et
4  25 mg/kg sont présentés dans la Figure 16 panel A et pour les administrations uniques
16, 64 et 100 mg/kg dans la Figure 16 panel B.
Concentration plasmatique de Marbofloxacine (µg/mL)
A
Administration fractionnée
102
101
100
MPC
10-1
CMI
10-2
10-3
0
24
B
48
72
96
16 mg/kg
64 mg/kg
100 mg/kg
Administration unique
102
101
100
MPC
10-1
CMI
10-2
10-3
0
24
48
72
96
Temps (h)
Figure 16 : Simulation des profils de concentration de marbofloxacine pour les différents
schémas posologiques
Simulation des profils des concentrations de marbofloxacine pour 3 doses de marbofloxacine (16,
64 et 100 mg/kg) avec deux schémas d’administration : fractionnée en 4 administrations sur 4 jours
(A) ou en administration unique (B). Le temps de demi-vie d’élimination (T1/2élim) est de 2.41 heures.
89
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
A l’aide de ce modèle, nous avons également calculé les AUC pour ces mêmes
doses. Nous avons calculé l’AUC0-24 pour les administrations fractionnées et l’AUC0-96 pour
les administrations uniques. Les valeurs obtenues sont reportées dans le Tableau 5.
Tableau 5 : AUC0-24 et AUC0-96 pour les différentes doses de marbofloxacine testées
Dose de marbofloxacine
Administration unique
AUC0-96 (h.µg/mL)
Administration fractionnée
AUC0-24 (h.µg/mL)
16 mg/kg
64 mg/kg
100 mg/kg
24.21
96.82
151.29
5.81
23.25
36.33
2.4.4. Conclusion
Cette étude montre que, pour notre modèle d’infection pulmonaire à KP, les
paramètres pharmacocinétiques de la marbofloxacine ne diffèrent pas entre les animaux
recevant un traitement de type métaphylactique ou curatif et on observe, pour les deux
groupes, une relation de dose-proportionnalité.
Les paramètres qui ont été obtenus au cours de cette étude nous ont permis de
simuler les différents schémas posologiques de marbofloxacine utilisés dans l’étude de
l’infection pulmonaire par KP chez le rat ainsi que de calculer les AUC correspondantes.
90
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
2.5. Etude de la relation entre les indices PK/PD et
l’émergence de bactéries résistantes
2.5.1. Problématique et objectifs
Dans la partie étude bibliographique nous avons vu qu’il existait plusieurs paramètres
PK/PD qui pouvaient être prédictifs de la sélection de bactéries résistantes aux
fluoroquinolones : le rapport AUC/CMI, le rapport Cmax/CMI et le temps dans la fenêtre de
sélection TMSW.
L’objectif de cette étude était d’analyser les différents paramètres PK/PD afin
d’identifier ceux qui permettent de prévenir la sélection de bactéries résistantes à la
marbofloxacine dans notre modèle d’infection quel que soit le schéma posologique
utilisé.
2.5.2. Matériels et méthodes
Les indices PK/PD qui ont été utilisés sont : l’aire sous la courbe (AUC) des
concentrations plasmatiques de marbofloxacine divisée par la CMI (AUC/CMI), le pic de
concentration plasmatique divisé par la CMI (Cmax/CMI), le temps durant lequel les
concentrations plasmatiques se trouvent au dessus de la MPC (T>MPC) ainsi que le temps
durant lequel les concentrations se trouvent dans la fenêtre de sélection (TMSW).
L’AUC/CMI et l’AUC/MPC ont été calculées en utilisant l’aire sous la courbe des
concentrations en fonction du temps à l’état d’équilibre sur 24 h pour l’administration
fractionnée de marbofloxacine, comme cela a été défini par Mouton et al. (155) et en utilisant
l’AUC0-96 pour les administrations uniques, comme cela a été suggéré par Toutain et al.
(219). Les valeurs de ces rapports sont donc présentées sous la forme 4  (AUC0-24/CMI)
pour l’administration fractionnée et sous la forme 1  (AUC0-96/CMI) pour l’administration
unique. Le T>MPC ainsi que le TMSW ont été calculés de la même façon, sur 24 h pour
l’administration fractionnée et sur 96 h pour l’administration unique. Etant donné que la
liaison aux protéines plasmatiques de la marbofloxacine est inférieure à 10% chez le rat (70),
les indices PK/PD ont été déterminés à partir des concentrations plasmatique totales.
Un modèle sigmoïde Emax d’inhibition (équation 2) a été utilisé pour décrire la relation
entre les indices PK/PD et les pourcentages d’animaux porteurs de bactéries résistantes
pour le groupe B (109 CFU) 96 h après le début du traitement antibiotique (WinNonlin version
5.2 ; Pharsight Corporation, Mountain View, CA).


Indice 

% animaux  Emax  1 

 
 Indice  ED50 
Equation 2
91
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
Où E max représente le pourcentage maximal d’animaux porteurs de bactéries résistantes,
Indice la valeur de l’indice PK/PD étudié,  le coefficient de sigmoïdicité ou coefficient de
Hill et ED50 la valeur de l’indice PK/PD qui permet d’atteindre 50% de la réduction maximale.
2.5.3. Résultats
Les différentes valeurs des indices PK/PD pour chaque schéma posologique sont
présentées dans le Tableau 6.
Tableau 6 : Valeurs des différents indices PK/PD après l’administration de
16, 64 ou 100 mg/kg de marbofloxacine en administration unique ou fractionnée.
Dose totale de
marbofloxacine (mg/kg)
TMSW
(%)
T>MPC
(%)
T>MPC / TMSW
AUC/CMI
(h)
AUC/MPC
(h)
Cmax/CMI
Administration fractionnée
16
64
100
50
67
60
16
33
40
0.31
0.49
0.67
4 × 189
4 × 756
4 × 1182
4 × 12
4 × 47
4 × 74
4 × 54
4 × 217
4 × 339
Administration unique
16
64
100
28
40
41
8
16
22
0.30
0.41
0.54
1 × 756
1 × 3026
1 × 4728
1 × 47
1 × 189
1 × 295
1 × 217
1 × 868
1 × 1357
2.5.3.1. AUC/CMI
Pour la plus faible dose de marbofloxacine, 16 mg/kg, les valeurs du rapport
AUC/CMI ont été de 4 × 189 h et 1 × 756 h pour l’administration fractionnée et unique. Ces
rapports ont été associés à un enrichissement des sous-populations R-2MIC et R-8MIC
pour les animaux infectés par le grand inoculum (groupe B) mais pas pour les animaux
infectés par le petit inoculum (groupe A) (Tableau 3, page 49).
Pour les animaux infectés par le grand inoculum (Groupe B), l’administration de
64 mg/kg de marbofloxacine de manière fractionnée ou unique a conduit à des valeurs
d’AUC/CMI de 4 × 756 h et 1 × 3026 h. Ces valeurs ont été associées à l’enrichissement des
deux sous-populations résistantes. Dans ce même groupe, seule la dose la plus importante
de 100 mg/kg, correspondant à des rapports de 4 × 1182 h et 1 × 4728 h pour
l’administration fractionnée et unique, a été associée à l’absence de détection de la souspopulation R-8MIC, mais pas de la sous-population R-2MIC (Tableau 6 et Tableau 3, page
49).
92
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
2.5.3.2. Cmax/CMI
Pour les animaux infectés par le petit inoculum (groupe A), les valeurs de Cmax/CMI
de 4  54 et 1  217 pour l’administration fractionnée et unique de 16 mg/kg de
marbofloxacine ont été associés à l’absence des deux sous-populations résistantes (Tableau
6 et Tableau 3, page 49).
Pour les animaux infectés par le grand inoculum (groupe B), nous avons observé que
plus la valeur du rapport Cmax/CMI était élevée, moins l’enrichissement des sous-populations
R-2MIC et R-8MIC était important si l’on considérait l’administration unique et fractionnée
séparément (Figure 17). L’absence d’enrichissement de la sous-population R-8MIC, mais
pas de la sous-population R-2MIC, a été observée pour des valeurs du rapport Cmax/CMI de
4  339 et 1  1357 obtenues après l’administration de 100 mg/kg de marbofloxacine en
Proportion de bactéries résistantes
dans les poumons
administration fractionnée ou unique (Tableau 6 et Tableau 3, page 49).
100
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
Bactéries résistantes à
0.064 µg/mL = R-2MIC
Bactéries résistantes à
0.256 µg/mL = R-8MIC








Pas de bactérie
résistante
0
400
800
1200
Pas de bactérie
résistante
0
Cmax/MIC
 Rat morts
16 mg/kg
400
800
1200
Cmax/MIC
Fractionnée
64 mg/kg
Unique
100 mg/kg
Figure 17 : Relation entre Cmax/CMI et l’émergence de bactéries résistantes
Proportion de bactéries R-2MIC, résistantes à 0.064 µg/mL de marbofloxacine et de bactéries R8MIC, résistantes à 0.256 µg/mL de marbofloxacine retrouvées dans les poumons des animaux
infectés par le grand inoculum (Groupe B) en fonction du rapport Cmax/CMI. Les proportions sont
représentées par un triangle lorsqu’elles sont obtenues après une administration unique et par un
cercle après une administration fractionnée. Les symboles se trouvant en dessous de la ligne
discontinue représentent les animaux sans bactéries résistantes détectables dans les poumons.
2.5.3.3. TMSW et T>MPC
 TMSW
L’administration des doses de façon fractionnée ou unique a eu un impact important
sur la valeur du TMSW. Pour les administrations uniques, les concentrations plasmatiques de
marbofloxacine sont restées 28, 40 et 41% du temps (sur 96 h) dans la fenêtre de sélection
93
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
pour les doses de 4, 16 et 100 mg/kg respectivement et pour les administrations
fractionnées, le TMSW a été de 50, 67 et 60 % (sur 24 h) (Tableau 6).
Aucune relation n’a été trouvée entre TMSW et l’enrichissement des sous-populations
R-2MIC et R-8MIC (Figure 18, panels A1 et A2), ni entre le TMSW et le pourcentage
d’animaux porteurs de R-2MIC et R-8MIC 96 h après l’initiation du traitement à la
marbofloxacine. (Figure 18, panels B1 et B2).
Bactéries résistantes à
0.064 µg/mL = R-2MIC
Bactéries résistantes à
0.256 µg/mL = R-8MIC
Proportion de bactéries
résistantes
A1
A2
100
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6




Pas de bactérie
résistante
0
20




100
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
40
60
Pas de bactérie
résistante
0
80
20
Pourcentage de rats porteurs
de bactéries résistantes
TMSW (%)
40
60
80
TMSW (%)
B1
B2
100
100
R² = 0.54
80
R² = 0.60
80
60
60
40
40
20
20
0
0
0
20
40
60
0
80
20
40
60
80
TMSW (%)
TMSW (%)
 Rat morts
16 mg/kg
Fractionnée
64 mg/kg
Unique
100 mg/kg
Figure 18 : Relation entre le TMSW et l’émergence de bactéries résistantes
A Proportion de bactéries R-2MIC, résistantes à 0.064 µg/mL de marbofloxacine (A1) et de
bactéries R-8MIC, résistantes à 0.256 µg/mL de marbofloxacine (A2) retrouvées dans les
poumons des animaux infectés par le grand inoculum (Groupe B) en fonction du TMSW. Les
proportions sont représentées par un triangle lorsqu’elles sont obtenues après une administration
unique et par un cercle après une administration fractionnée. Les symboles se trouvant en dessous
de la ligne discontinue représentent les animaux sans bactéries R-2MIC ou R-8MIC détectables
dans les poumons.
B Ajustement du modèle sigmoïde inhibiteur Emax entre le pourcentage d’animaux porteurs de R2MIC (B1) et de R-8MIC (B2) et le TMSW
Le TMSW a été calculé sur 24 h pour l’administration fractionnée et sur 96 h pour l’administration
unique.
94
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
 T>MPC
Comme pour le rapport Cmax/CMI, une relation a été observée entre le T>MPC et
l’enrichissement des sous-populations R-2MIC et R-8MIC uniquement lorsque l’on a pris
en compte séparément les deux modalités d’administration (fractionnée ou non) (Figure 19,
panels A1 et A2). L’ajustement du modèle inhibiteur Emax entre le T>MPC et le pourcentage
d’animaux porteurs de R-2MIC et R-8MIC (Figure 1, Panels B1 et B2) confirme que la
relation n’existe que si l’on regarde séparément l’administration unique (représentée par les
triangles) et l’administration fractionnée (représentée par les cercles). Deux sigmoïdes
différentes seraient nécessaires afin de décrire cette relation.
Bactéries résistantes à
0.064 µg/mL = R-2MIC
Bactéries résistantes à
0.256 µg/mL = R-8MIC
Proportion de bactéries
résistantes
A1
A2
100
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6




100
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6




Pas de bactérie
résistante
Pas de bactérie
résistante
0
10
20
30
40
0
50
10
Pourcentage de rats porteurs
de bactéries résistantes
T>MPC (%)
20
30
40
50
T>MPC (%)
B1
B2
100
100
R² = 0.87
80
R² = 0.93
80
60
60
40
40
20
20
0
0
0
10
20
30
40
50
0
10
20
30
40
50
T>MPC (%)
T>MPC (%)
 Rat morts
16 mg/kg
Fractionnée
64 mg/kg
Unique
100 mg/kg
Figure 19 : Relation entre le T>MPC et l’émergence de bactéries résistantes
A Proportion de bactéries R-2MIC, résistantes à 0.064 µg/mL de marbofloxacine (A1) et de
bactéries R-8MIC, résistantes à 0.256 µg/mL de marbofloxacine (A2) retrouvées dans les
poumons des animaux infectés par le grand inoculum (Groupe B) en fonction du T>MPC. Les
proportions sont représentées par un triangle lorsqu’elles sont obtenues après une administration
unique et par un cercle après une administration fractionnée. Les symboles se trouvant en dessous
de la ligne discontinue représentent les animaux sans bactéries R-2MIC ou R-8MIC détectables
dans les poumons.
B Ajustement du modèle sigmoïde inhibiteur Emax entre le pourcentage d’animaux porteurs de R2MIC (B1) et de R-8MIC (B2) et le T>MPC
Le T>MPC a été calculé sur 24 h pour l’administration fractionnée et sur 96 h pour l’administration
unique.
95
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
 Nouvel indice : T>MPC/TMSW
Nous n’avons pas observé de relation entre le TMSW ou le T>MPC pris séparément et
l’enrichissement des sous-populations R-2MIC et R-8MIC, lorsque nous avons pris en
considération les deux modalités d’administration, fractionnée ou unique. En revanche, en
considérant le rapport T>MPC/TMSW une relation a été mise en évidence (Figure 20, panels A1
et A2). Quel que soit la modalité d’administration (fractionnée ou unique), plus ce rapport
s’est approché de la valeur 1, plus l’enrichissement des deux sous-populations résistantes a
été limité. Cette relation a été confirmée par l’ajustement du modèle sigmoïde inhibiteur Emax
entre ce rapport et le pourcentage d’animaux porteurs de R-2MIC et R-8MIC (Figure 20,
Panels B1 et B2).
2.5.4. Conclusion
Dans notre modèle d’infection pulmonaire par KP, nous n’avons pas pu trouver une
relation entre les indices PK/PD usuels d’efficacité (AUC/CMI, Cmax/CMI, T>MPC et TMSW) et
l’enrichissement des deux sous-populations résistantes à la marbofloxacine R-2MIC et R8MIC lorsque nous avons étudié simultanément l’administration fractionnée et unique.
Par contre, la construction d’un nouvel indice, prenant en compte à la fois le temps
durant lequel les concentrations plasmatiques se trouvent au dessus de la MPC, c'est-à-dire
le temps pendant lequel les bactéries résistantes sont détruites ainsi que le temps durant
lequel les concentrations plasmatiques se trouvent dans la fenêtre de sélection, c'est-à-dire
le temps pendant lequel les bactéries résistantes peuvent être sélectionnées si elles sont
présentes nous a permis de trouver une relation entre ce nouvel indice (TMPC/TMSW) et
l’enrichissement des sous-populations résistantes.
96
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
Bactéries résistantes à
0.064 µg/mL = R-2MIC
Bactéries résistantes à
0.256 µg/mL = R-8MIC
A2
Proportion de bactéries
résistantes
A1




100
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6




100
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
Pas de bactérie
résistante
Pas de bactérie
résistante
0
0.2
0.4
0.6
0
0.8
0.2
Pourcentage de rats porteurs
de bactéries résistantes
T>MPC/TMSW
0.4
0.6
0.8
T>MPC/TMSW
B1
B2
100
100
R² = 0.99
80
60
60
40
40
20
20
0
R² = 0.97
80
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0
T>MPC/TMSW
0.2
0.4
0.6
0.8
T>MPC/TMSW
 Rat morts
16 mg/kg
Fractionnée
64 mg/kg
Unique
100 mg/kg
Figure 20 : Relation entre le rapport T>MPC/TMSW et l’émergence de bactéries résistantes
A Proportion de bactéries R-2MIC, résistantes à 0.064 µg/mL de marbofloxacine (A1) et de
bactéries R-8MIC, résistantes à 0.256 µg/mL de marbofloxacine (A2) retrouvées dans les
poumons des animaux infectés par le grand inoculum (Groupe B) en fonction du T>MPC/TMSW. Les
proportions sont représentées par un triangle lorsqu’elles sont obtenues après une administration
unique et par un cercle après une administration fractionnée. Les symboles se trouvant en dessous
de la ligne discontinue représentent les animaux sans bactéries R-2MIC ou R-8MIC détectables
dans les poumons.
B Ajustement du modèle sigmoïde inhibiteur Emax entre le pourcentage d’animaux porteurs de R2MIC (B1) et de R-8MIC (B2) et le T>MPC/TMSW.
Le T>MPC et le TMSW ont été calculés sur 24 h pour l’administration fractionnée et sur 96 h pour
l’administration unique.
97
98
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
2.6. Discussion
L’objectif de ce travail était d’évaluer l’influence des variations du statut
physiopathologique entre un traitement de type métaphylactique ou curatif sur la cinétique de
la marbofloxacine et l’émergence de résistance au niveau du site infectieux. Nous
souhaitions également évaluer la capacité des paramètres PK/PD (AUC/CMI, Cmax/CMI,
T>MPC et TMSW) à prédire l’enrichissement de 2 sous-populations résistantes (R-2MIC et R8MIC) dans un modèle d’infection pulmonaire chez le rat immunocompétent.
2.6.1. Influence de la charge bactérienne sur la
pharmacocinétique
Nous n’avons pas observé de différence pour les paramètres pharmacocinétiques de
la marbofloxacine entre les animaux porteurs d’une faible charge bactérienne et traités de
façon précoce et les animaux porteurs d’une charge bactérienne plus importante et traités de
façon plus tardive. Ces résultats sont en contradiction avec ceux obtenus précédemment
dans notre équipe sur un modèle d’infection de la cuisse chez la souris neutropénique. Cette
différence pourrait s’expliquer par les caractéristiques spécifiques de ces deux modèles
d’infection (poumons versus cuisse et KP versus E. coli) et/ou par une différence possible
dans le niveau d’inflammation.
2.6.2. Influence d’un traitement métaphylactique ou curatif sur le
devenir de l’infection et l’émergence de résistance
Chez les animaux traités de façon précoce ayant une faible charge bactérienne
(Groupe A), nous avons observé une forte diminution de la charge bactérienne totale dans
les poumons 96 h après l’initiation du traitement antibiotique quelle que soit la modalité
d’administration
(fractionnée
ou
unique).
De
plus,
nous
n’avons
pas
observé
d’enrichissement des sous-populations R-2MIC et R-8MIC. Chez ces animaux, la grande
amplitude de la charge bactérienne retrouvée chez les animaux témoins non traités de ce
groupe révèle une variabilité interindividuelle dans l’évolution de l’infection probablement due
au statut immunocompétent des animaux. Néanmoins, ceci n’a pas affecté notre étude étant
donné qu’à l’initiation du traitement, 4 h après l’inoculation de KP, le dénombrement
bactérien
dans
les
poumons
des
animaux
infectés
était
homogène
(5.4 ± 0.1 log10 CFU/poumon).
99
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
Avec une initiation plus tardive du traitement antibiotique, sur une population
bactérienne initiale beaucoup plus importante (Groupe B), nous avons observé une
diminution faible de la charge bactérienne totale présente dans les poumons. De plus, nous
avons mis en évidence dans les poumons de ces animaux un enrichissement des deux
sous-populations résistantes R-2MIC et R-8MIC. Cet enrichissement a varié en fonction
de la dose et du schéma d’administration de la marbofloxacine. Au sein de ce groupe
d’animaux, nous avons également observé la mort de 4 rats sur 10 entre 72 et 96 h après le
traitement à la marbofloxacine pour la plus faible dose de marbofloxacine (16 mg/kg)
administrée en dose unique. Au vu des signes cliniques d’infection de ces animaux, nous
avons attribué leur mort à l’infection. Nous avons également observé la mort de 3 animaux
sur 12 dans les 24 h qui ont suivi l’administration de marbofloxacine pour le groupe traité par
100 mg/kg en administration unique. Nous n’avons pas attribué la mort de ces 3 animaux à
l’infection bactérienne car elle est survenue plus tôt que pour les animaux ayant reçu
16 mg/kg en administration unique ou même que pour les animaux témoins non traités (i.e.
24 h versus 72-96 h). Bien qu’aucun effet indésirable, tels que des convulsions, n’ait été
observé nous avons attribué la mort des animaux traités par 100 mg/kg de marbofloxacine
en administration unique à une probable toxicité de la marbofloxacine sur des animaux
fortement malades.
La taille de la charge bactérienne à l’initiation du traitement antibiotique peut donc
jouer un rôle important sur le devenir de l’infection et l’émergence de bactéries résistantes.
Ceci confirme, chez des animaux immunocompétents, les résultats obtenus précédemment
in vitro sur E. coli, S. aureus et P. aeruginosa (75, 151) et in vivo sur E. coli chez des souris
immunodéprimées (76) et indique que ce paramètre est important à prendre en
considération lors des recommandations de schémas posologiques pour un antibiotique.
2.6.3. Etude PK/PD
2.6.3.1. Capacité de l’indice l’AUC/CMI à prédire l’émergence de
bactéries résistantes
Comme nous l’avons vu dans l’étude bibliographique (paragraphe 1.4.1.1., page 44),
plusieurs études ont suggéré que l’AUC/CMI était l’indice PK/PD le plus prédictif de
l’efficacité des fluoroquinolones pour les modèles d’infection pulmonaire et de la cuisse chez
des animaux neutropéniques et non neutropéniques (9, 19, 59, 230).
Dans notre étude, après 96 h de traitement, les valeurs d’AUC/CMI de 4  189 h et
1  756 h obtenues après l’administration fractionnée et unique de 16 mg/kg de
marbofloxacine ont été associées à une forte diminution de la charge bactérienne totale et à
100
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
la prévention de l’émergence des deux sous-populations bactériennes résistantes R-2MIC
et R-8MIC.
Pour le grand inoculum (Groupe B) des valeurs du rapport AUC/CMI plus élevées,
4  756 et 1  3026 h, ont été associées à l’émergence de résistance. Ce n’est qu’avec la
plus forte dose de marbofloxacine, 100 mg/kg, que nous avons observé la prévention de
l’enrichissement de la sous-population R-8MIC avec des valeurs du rapport AUC/CMI de
4  1182 et 1  4728 h. Cependant, en utilisant la MPC, qui correspond à la CMI des
bactéries R-8MIC, au lieu de la CMI de bactéries sensibles pour calculer le rapport
AUC/CMI, il est apparu que les valeurs de ce rapport (devenu AUC/MPC) associées à la
prévention de l’enrichissement de la sous-population R-8MIC était alors de 4  74 h ou
1  295 h. Ces valeurs l’AUC/MPC sont du même ordre de grandeur que celles des
AUC/CMI obtenues par Andes et al. (9) sur un modèle d’infection pulmonaire chez la souris
immunocompétente. Ces valeurs sont inférieures à celles observées pour la prévention de
l’émergence de résistance pour le petit inoculum, cependant nous n’avons pas testé de
doses inférieures à 16 mg/kg et un rapport AUC/CMI de 4  74 h ou 1  295 h sur le petit
inoculum aurait peut-être suffi à prévenir l’émergence de résistance dans ce groupe. En
d’autres termes, et comme cela a déjà été suggéré précédemment (245), pour être prédictif,
le rapport AUC/CMI doit prendre en considération la CMI de la sous-population ayant la
sensibilité la plus faible pour l’antibiotique et non pas la CMI de la population majoritaire.
De plus, l’enrichissement de la sous-population R-8MIC plus important pour les
administrations fractionnées que pour les administrations uniques semblent indiquer que,
pour une même exposition totale à la marbofloxacine (sur 96 h), le fractionnement de la dose
est bénéfique par rapport à l’administration en dose unique. Ceci suggère que
l’enrichissement des sous-populations résistantes est co-dépendant de l’exposition totale et
du temps durant lequel les concentrations plasmatiques se trouvent au dessus d’une
concentration critique.
2.6.3.2. Capacité de l’indice Cmax/CMI à prédire l’émergence de bactéries
résistantes
C’est uniquement en considérant les administrations fractionnées ou uniques
séparément que nous avons observé une relation entre le rapport Cmax/CMI et l’émergence
de bactéries résistantes uniquement (Figure 17, Tableau 6). En effet, pour l’administration
fractionnée un rapport de 339 a permis de prévenir l’émergence de bactéries résistantes
alors que pour l’administration unique un rapport de 868 a été associé à l’émergence de
bactéries résistantes.
101
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
Ces résultats soulignent un problème important. Pour une même exposition des
animaux (AUC similaires) les résultats peuvent être complètement différents selon les
schémas d’administration. Et pour un même rapport AUC/CMI ont peut observer ou non
l’émergence de résistance.
Les résultats de notre étude montrent que le rapport AUC/CMI ainsi que le rapport
Cmax/CMI sont prédictifs de l’émergence uniquement si l’on considère des modalités
d’administration (fractionnée ou unique) séparément. Il apparaît donc nécessaire de trouver
un indice plus universel capable de prédire l’émergence de résistance quelle que soit la
modalité d’administration ; c’est pourquoi nous avons testé la capacité d’un autre indice
PK/PD le TMSW à prédire l’émergence de résistance.
2.6.3.3. Capacité de l’indice TMSW à prédire l’émergence de bactéries
résistantes
Il a été montré précédemment in vitro (6, 46, 47, 75) et in vivo (76) pour les
fluoroquinolones, que le temps durant lequel les concentrations plasmatiques se trouvent
dans la fenêtre de sélection était associé à l’enrichissement de sous-populations
bactériennes résistantes. Cependant, dans notre étude, nous n’avons observé aucune
relation entre l’enrichissement de la sous-population R-8MIC et le TMSW. (Figure 18, page
94). Ceci est en accord avec les résultats obtenus précédemment in vitro sur S. aureus par
Campion et al. (25), bien qu’il soit important de noter que la cible principale des mutations
conférant une résistances aux fluoroquinolones diffère entre les bactéries à Gram positif et à
Gram négatif (58).
Comme nous l’avons vu dans l’étude bibliographique (paragraphe 1.4.2.2., page 49),
des études récentes suggèrent que l’incapacité du TMSW à prédire l’enrichissement des
mutants résistants pourrait être expliquée par l’influence du niveau des concentrations
plasmatiques dans la fenêtre de sélection (47, 78). En d’autres termes, pour un temps dans
la fenêtre de sélection donné, les situations ne sont pas équivalentes quand le temps passé
à l’extérieur de la fenêtre de sélection est en-dessous de la CMI ou au-dessus de la MPC.
Dans notre étude, pour l’administration fractionnée de 16 mg/kg de marbofloxacine, le temps
de demi-vie d’élimination de 2.41 h a conduit les concentrations plasmatiques à se trouver
en dessous de la CMI durant un certain temps alors que pour les deux autres doses (64 et
100 mg/kg), l’exposition à la marbofloxacine était majoritairement dans la partie supérieure
de la fenêtre de sélection (Figure 16). Ceci pourrait expliquer l’absence de relation entre le
TMSW et l’enrichissement de la sous-population R-8MIC. Pour ce qui est de l’administration
en dose unique, les profils pharmacocinétiques ont montré que le temps durant lequel les
concentrations de marbofloxacine se sont trouvées dans la fenêtre de sélection était
102
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
équivalent que pour les deux plus fortes doses (64 et 100 mg/kg), alors que ce temps était
moins important pour la plus petite dose (16 mg/kg).
Pour que la sélection de bactéries résistantes ait lieu lorsque les concentrations
plasmatiques de l’antibiotique sont dans la fenêtre de sélection il faut que quelques bactéries
résistantes soient présentes. La présence de ces bactéries résistantes à ce moment précis
dépend de ce qui s’est passé avant, c'est-à-dire du temps durant lequel les concentrations
plasmatiques se sont trouvées au-dessus de la fenêtre de sélection (T>MPC). En effet, si ce
temps est très long, toutes les bactéries résistantes sont éliminées avant que les
concentrations plasmatiques d’antibiotique se trouvent dans la fenêtre de sélection. Au
contraire, s’il est trop court, les bactéries résistantes ne sont pas toutes éliminées et peuvent
donc être sélectionnées lorsque les concentrations sont dans la fenêtre de sélection. C’est
pourquoi Il apparaît que la sélection de bactéries résistantes dépend à la fois de ces 2
paramètres : le T>MPC et TMSW. Nous avons donc décidé de construire un nouvel indice qui
prenait en compte ces 2 paramètres le rapport du T>MPC sur le TMSW.
2.6.3.4. Capacité d’un nouvel indice, le rapport T>MPC/TMSW, à prédire
l’émergence de bactéries résistantes
Dans notre étude, nous avons observé une relation entre ce nouvel indice,
T>MPC/TMSW, et l’enrichissement des sous-populations résistantes R-2MIC et R-8MIC
(Figure 20, page 97). Avec ce rapport il a été possible de discriminer les situations
caractérisées par un même TMSW mais avec différents niveaux de concentration
plasmatiques dans la fenêtre de sélection. Lorsque ce rapport augmente, le risque
d’enrichissement des sous-populations résistantes diminue. Il est également important
de noter que ce rapport permet une comparaison non biaisée entre l’administration
fractionnée ou unique d’une même dose étant donné que pour l’administration fractionnée le
rapport est le même qu’il soit calculé sur 24 h ou sur la durée totale du traitement (96 h).
Dans cette étude, nous avons également montré que la valeur de l’indice T>MPC/TMSW
associée à la prévention de l’émergence de résistance variait en fonction de la probabilité
d’avoir une sous-population résistante présente à l’initiation du traitement antibiotique. Avec
le petit inoculum (groupe A), les valeurs de ce rapport associées à la prévention de
l’enrichissement des sous-populations résistantes ont été de 0.31 et 0.30 pour
l’administration fractionnée et unique. Par contre, pour le grand inoculum, elles ont été de
0.67 et 0.54 respectivement. Par conséquent, il ressort de nos résultats que la situation la
plus favorable afin de limiter l’émergence de résistance est celle où la taille de l’inoculum (ou
charge bactérienne) à l’initiation du traitement est faible ou nulle comme lors des traitements
103
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
de type métaphylactique ou prophylactique. Dans un contexte curatif, caractérisé par une
probabilité plus importante d’être face à une grande charge bactérienne, nos résultats
suggèrent que la meilleure stratégie serait d’atteindre immédiatement des concentrations
plasmatiques d’antibiotique au-dessus de la MPC.
2.6.3.5. Impact de l’émergence des bactéries R-2MIC sur l’émergence
des bactéries R-8MIC
En plus de l’enrichissement de la sous-population R-8MIC, nous avons également
étudié la sous-population R-2MIC. Cette population est probablement due à une
surexpression des pompes à efflux chez les bactéries R-2MIC (136). Chez certains
animaux, nous avons observé un enrichissement de la sous-population R-2MIC sans
enrichissement simultané de R-8MIC et pour les deux plus fortes doses de marbofloxacine
(64 et 100 mg/kg), l’enrichissement de R-2MIC a été plus important pour l’administration
unique que pour l’administration fractionnée (Tableau 3). Ceci pourrait expliquer le
pourcentage d’animaux porteurs de R-8MIC plus important observé chez les animaux
traités par 64 mg/kg de marbofloxacine en administration unique que pour ceux traités par la
même dose en administration fractionnée. En effet, si l’enrichissement de la population R2MIC est plus important, la capacité de ces bactéries à survivre à des concentrations
d’antibiotique proches de la CMI peut favoriser l’émergence d’une nouvelle sous-population
plus résistante (comme la sous-population R-8MIC), comme cela a déjà été suggéré par
Louie et al. (136). Donc, dans notre modèle, malgré un impact identique sur la charge
bactérienne totale, une administration unique semble moins bénéfique pour prévenir
l’enrichissement d’une sous-population mutante que l’administration fractionnée de la même
dose. Une étude complémentaire afin de caractériser les mécanismes exacts de résistances
des bactéries R-2MIC pourrait apporter des informations intéressantes afin d’envisager des
stratégies limitant leur émergence et par conséquent limiter également l’émergence de
bactéries avec un niveau de résistance plus élevé comme les R-8MIC.
2.6.4. Conclusion
En conclusion, nos résultats montrent que la charge bactérienne à l’initiation du
traitement antibiotique joue un rôle critique sur le schéma de sélection des mutants KP
résistants. La probabilité plus faible d’avoir une sous-population résistante déjà présente à
l’initiation du traitement avec un petit inoculum limite l’enrichissement des sous-populations
résistantes. Dans le cas d’une grande charge bactérienne à l’initiation du traitement, nous
104
Chapitre 2 – Impact de la marbofloxacine sur la flore pathogène
avons montré la capacité du rapport T>MPC/TMSW à définir des caractéristiques pertinentes
d’exposition à l’antibiotique permettant de prévenir l’enrichissement de sous-populations
résistantes. Ce nouvel indice PK/PD pourrait contribuer à une sélection rationnelle plus
adaptée des schémas posologiques des antibiotiques.
Bien que ces résultats semblent intuitifs, cette étude est la première à présenter une
approche PK/PD rationnelle pour la sélection de schémas posologiques adaptés aux
contextes curatif et préventif. Nos résultats montrent que, dans le cas d’un traitement
antibiotique sur une charge bactérienne importante, le T>MPC doit être suffisamment long afin
de produire une diminution précoce de cette charge, ce qui permet de revenir à une situation
équivalente à un traitement sur un petit inoculum bactérien. Il apparaît que pour les
administrations en dose unique testées de marbofloxacine (qui mime les traitements dits
« one-shot » régulièrement recommandés en médecine vétérinaire), que le T>MPC n’est pas
assez long pour parvenir à ce but. Cependant le temps de demi-vie d’élimination de la
marbofloxacine chez les animaux domestiques peut être beaucoup plus important (supérieur
à 13 h) que celui du rat (2.41 h dans notre étude) et une dose unique administrée à des
espèces animales de plus grande taille pourrait conduire à un T>MPC plus important que celui
observé chez le rat.
Des études complémentaires sur différents modèles infectieux et modèles animaux
sont donc nécessaires afin de confirmer ce que nous avons observé dans notre étude et
pour quantifier les valeurs seuil du rapport T>MPC/TMSW chez les patients (humain et les
espèces animales domestiques cibles).
105
106
Chapitre 2 – Article 1
2.7. Article 1
Influence of Inoculum Size and Marbofloxacin Plasma Exposure on the
Amplification of Resistant Subpopulations of Klebsiella pneumoniae in a Rat
Lung Infection Model.
Anne-Sylvie Kesteman, Aude A. Ferran, Agnès Perrin-Guyomard, Michel Laurentie,
Pascal Sanders, Pierre-Louis Toutain and Alain Bousquet-Mélou
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2009 Nov; 53(11):4740-48
107
108
Chapitre 2 – Article 1
109
Chapitre 2 – Article 1
110
Chapitre 2 – Article 1
111
Chapitre 2 – Article 1
112
Chapitre 2 – Article 1
113
Chapitre 2 – Article 1
114
Chapitre 2 – Article 1
115
Chapitre 2 – Article 1
116
Chapitre 2 – Article 1
117
118
Chapitre 3
ETUDE EXPERIMENTALE
Impact d’un traitement à la marbofloxacine
sur la flore du tube digestif
119
120
Chapitre 3 – Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la flore du tube digestif
CHAPITRE 3 - ETUDE EXPERIMENTALE
3. Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la
flore du tube digestif
3.1. Introduction
Nous avons vu dans l’étude bibliographique que l’émergence de résistance
bactérienne au cours d’une antibiothérapie pouvait concerner le pathogène cible au niveau
du site infectieux, mais également les flores commensales, dont la flore digestive, cela en
raison de l’excrétion de l’antibiotique dans le tractus digestif qui expose de façon non
intentionnelle la flore normale de l’hôte et entraîne une pression de sélection.
L’étude présentée dans le chapitre précédent nous a permis de montrer un impact de
la modalité de traitement antibiotique, métaphylactique ou curative, sur le devenir de
l’infection et l’émergence de bactéries résistantes au niveau du site infectieux. De plus, nous
avons également montré, que pour la même dose totale de marbofloxacine, fractionner la
dose en 4 administrations journalières pouvait être bénéfique par rapport à l’administration
unique pour prévenir l’émergence de résistance au niveau du site infectieux.
Dans cette seconde étude expérimentale, nous avons voulu étudier l’impact d’un
traitement de type métaphylactique ou curatif sur la flore commensale digestive des animaux
soumis à une infection bactérienne. Nous avons choisi de travailler sur des animaux
axéniques chez qui nous avons implanté deux souches bactériennes, une souche
Escherichia coli et une souche Enterococcus faecium, provenant d’une flore intestinale
porcine afin d’obtenir un système d’étude de la flore simplifié. La souche E. coli retenue étant
une représentante de la population majoritaire à Gram négatif de la flore commensale
porcine et la souche E. faecium une représentante la population à Gram positif. Ces deux
souches peuvent également être à l’origine d’infections zoonotiques. Nous avons commencé
par caractériser les deux souches bactériennes porcines avant de les implanter dans le
tractus digestif des rats axéniques qui sont donc devenus dixéniques. Nous avons ensuite
transposé notre modèle d’infection pulmonaire à KP par une faible ou une forte charge
bactérienne à ces animaux dixéniques. Enfin, nous avons testé sur ces animaux différentes
doses de marbofloxacine suivant deux modalités d’administration, fractionnée ou unique.
Parallèlement nous avons étudié la cinétique de l’élimination de la marbofloxacine dans les
fèces d’animaux infectés par un petit inoculum et traités précocement ou infectés par un
grand inoculum et traités plus tardivement.
121
Chapitre 3 – Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la flore du tube digestif
Les résultats obtenus au cours de ces différentes études seront présentés dans 3
parties distinctes avant d’être discutés dans la dernière partie de ce chapitre.
122
Chapitre 3 – Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la flore du tube digestif
3.2. Impact de la charge bactérienne sur la cinétique
d’élimination de la marbofloxacine dans les fèces
3.2.1. Problématique et objectifs
Le système gastro-intestinal joue un rôle important dans l’élimination des
fluoroquinolones (208). L’excrétion biliaire de fluoroquinolones étant limitée à entre 1 et 3 %
de la dose administrée, le transport trans-épithélial est probablement la voie d’excrétion
intestinale la plus importante notamment via les P-glycoprotéines (P-gp) (30, 209, 236). Ces
substances peuvent donc exercer une pression de sélection sur la flore intestinale de
l’individu traité, c’est pourquoi il est important d’évaluer l’élimination de cet antibiotique dans
les fèces.
Nous avons vu précédemment (paragraphe 2.3.1) que l’infection pouvait jouer un rôle
sur les paramètres pharmacocinétiques d’une substance. Dans notre étude sur la cinétique
plasmatique de la marbofloxacine nous n’avons pas observé de différence significative entre
les animaux infectés par un petit inoculum et ceux infectés par un grand inoculum.
Cependant, le statut inflammatoire pouvant influencer l’expression des P-gp (179) nous
avons exploré l’impact de la modalité de traitement antibiotique, métaphylactique ou curative,
sur l’élimination de la marbofloxacine dans les fèces dans les conditions précises de notre
modèle d’infection pulmonaire.
L’objectif de cette étude était d’évaluer l’élimination de la marbofloxacine dans les
fèces de rats infectés par une faible charge bactérienne et traités de façon précoce ou
infectés par une forte charge bactérienne et traités de façon plus tardive.
3.2.1.1. Animaux
La cinétique de la marbofloxacine dans les fèces a été réalisée en même temps que
la cinétique plasmatique, sur les mêmes animaux (paragraphe 2.5.) Pour le groupe
d’animaux infectés par le petit inoculum et traités précocement (Groupe C) ainsi que pour le
groupe d’animaux infectés par le grand inoculum et traités plus tardivement (Groupe D), en
plus des prélèvements sanguins, la totalité des fèces des animaux a été recueillie au cours
des 48 h qui ont suivi l’administration de 4, 16 ou 100 mg/kg de marbofloxacine par voie
sous cutanée puis conservée à -20°C jusqu’au dosage.
123
Chapitre 3 – Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la flore du tube digestif
3.2.1.2. Dosage de la marbofloxacine
La méthode de dosage est celle précédemment décrite pour le plasma paragraphe
2.5.2.2. Les fèces obtenues pour chaque intervalle de temps ont été homogénéisées avant
de réaliser le dosage. Les échantillons dont les concentrations étaient supérieures à la
gamme de concentrations de la courbe de calibration ont été dilués avant le dosage.
L’exactitude a varié de 94.8 à 113.87% et la variation de la précision intra-jour et inter jour
était en dessous de 7.7% et 10.51% respectivement. La limite de quantification était de
550 ng/mL.
3.2.1.3. Analyse pharmacocinétique
 Pourcentage de marbofloxacine excrétée dans les fèces
La biodisponibilité de la marbofloxacine en administration sous cutanée étant proche
de 100%, le pourcentage de marbofloxacine excrétée dans les fèces a été calculé selon
l’équation 3.
% excrétion 
X f
Equation 3
X marbo
Où X f représente la quantité totale de marbofloxacine éliminée dans les fèces et X marbo
représente la quantité totale de marbofloxacine administrée.
 Clairance fécale
L’expression de la clairance (Cl) de façon générale est :
Cl 
taux d ' é lim ination d ' un analyte
Concentration de référence
La clairance fécale pour chaque animal a donc été calculée selon l’équation 4.
Cl f 
X f
AUC 0
Equation 4
Où Cl f représente la clairance fécale, X f représente la quantité totale de marbofloxacine
éliminée dans les fèces et l’ AUC0 représente l’aire sous la courbe des concentrations
plasmatiques de marbofloxacine, qui ont été calculées, pour chaque animal, par la méthode
des trapèzes.
124
Chapitre 3 – Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la flore du tube digestif
3.2.2. Résultats
Les quantités de marbofloxacine excrétées dans les fèces en fonction de la dose
pour les animaux infectés par le petit (Groupe C) ou le grand inoculum (Groupe D) sont
représentées dans la Figure 21.
La quantité de fèces excrétées sur 48 h a été en moyenne de 11.80  1.65 g pour les
animaux du groupe C et de 5.65  2.57 g pour les animaux du groupe D.
Nous avons observé une relation de proportionnalité entre la quantité de
marbofloxacine excrétée sur 48 h et la dose administrée dans chaque groupe d’animaux
(Tableau 7). Le pourcentage de marbofloxacine qui a été excrétée dans les fèces sur 48 h a
été moins important pour les animaux infectés par le grand inoculum de KP (5%) que pour
ceux infectés par le petit inoculum (23%). La clairance fécale moyenne calculée était de
36.7  16.7 mL.h.kg-1 pour les animaux infectés par le grand inoculum de KP et de
Quantité de marbofloxacine
excrétée (µg)
145.3  33.9 mL.h.kg-1 pour ceux infectés par le petit inoculum.
2000
1600
1200
800
400
0
0
20
40
60
80
100
120
dose (mg/kg)
petit inoculum
grand inoculum
Figure 21 : Quantité de marbofloxacine excrétée dans les fèces en fonction des doses
administrées.
Quantité cumulée sur 48 h de marbofloxacine excrétée dans les fèces après une administration
sous cutanée chez des animaux infectés par un petit (Groupe C)
ou un grand (Groupe D)
inoculum de K. pneumoniae.
Tableau 7: Quantité moyenne de marbofloxacine excrétée dans les fèces des animaux
infectés par un petit ou un grand inoculum.
Dose de
marbofloxacine
(mg/kg)
Quantité moyenne
de marbofloxacine
administrée (µg)
Quantité moyenne de marbofloxacine
excrétée dans les fèces (µg)  écart type
Petit inoculum
Grand inoculum
4
835  58
192  24
42  23
16
3605  232
896  116
168  126
100
22650  636
-
1340  547
125
Chapitre 3 – Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la flore du tube digestif
3.2.3. Conclusion
Dans notre modèle d’infection pulmonaire on observe une diminution du pourcentage
de marbofloxacine excrétée dans les fèces pour les animaux infectés par un grand inoculum
par rapport à ceux infectés par un petit. La quantité de marbofloxacine totale excrétée dans
les fèces est divisée par 4 pour les animaux infectés par le grand inoculum de KP par rapport
à ceux infectés par le petit inoculum.
126
Chapitre 3 – Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la flore du tube digestif
3.3. Etude des microorganismes implantés
3.3.1. Problématique et objectifs
La sensibilité aux fluoroquinolones des souches bactériennes du tube digestif
conditionne la possibilité d’émergence de bactéries résistantes c’est pourquoi il est important
de connaître leurs caractéristiques vis-à-vis de cette substance ainsi que leurs paramètres
de croissance.
L’objectif de cette étude était de déterminer pour les deux souches qui vont être
implantées dans les animaux axéniques : une souche E. coli et une souche E. faecium,
leurs paramètres de croissance in vitro ainsi que leurs concentrations minimales
inhibitrices (CMI) et leurs concentrations prévenant l’apparition de premier mutant
(MPC) pour la marbofloxacine.
3.3.2. Matériels et méthodes
3.3.2.1. Souche bactérienne et antibiotique
La souche E. coli (T199) et la souche d’E. faecium (T196EF2) utilisées sont d’origine
porcine. Elles proviennent du plan de surveillance des abattoirs effectués par l’AFSSA de
Fougères en 2006.
La marbofloxacine sous forme de poudre a été aimablement fournie par le laboratoire
Vetoquinol (Lure, France).
3.3.2.2. Croissance in vitro
Pour chaque souche, quelques colonies ont été mises en suspension dans 10 mL de
MH et placées à l’étuve à 37°C pour une nuit. Les dénombrements bactériens ont été
effectués après 18 h d’incubation, sur gélose Mac Conkey, pour E. coli et sur gélose Slanetz
et Bartley pour E. faecium.
3.3.2.3. Test de susceptibilité in vitro
La détermination de la CMI de marbofloxacine pour les deux souches a été réalisée
selon les méthodes précédemment décrites dans le paragraphe 2.3.2.2.
127
Chapitre 3 – Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la flore du tube digestif
La détermination de la MPC de marbofloxacine pour les des deux souches a été
réalisée selon les méthodes précédemment décrites paragraphe 2.3.2.2. sur des géloses
Mac Conkey pour E. coli et sur du milieu Slanetz et Bartley pour E. faecium.
3.3.3. Résultats
3.3.3.1. Croissance in vitro
Après 18 h d’incubation nous avons retrouvé environ 3  108 CFU/mL d’E. faecium et
2  109 CFU/mL d’E. coli.
3.3.3.2. Etude de sensibilité
Les valeurs des CMI qui ont été observées étaient de 0.032 µg/mL pour E. coli et de
2 µg/mL pour E. faecium. La MPC observée pour E. coli était de 0.512 µg/mL. La MPC pour
E. faecium n’a pas pu être obtenue, peut être à cause d’une interaction entre le milieu
Slanetz et Bartley et la marbofloxacine.
3.3.4. Conclusion
La CMI ainsi que la MPC de la souche d’E. coli sont semblables à celle de KP
implantée dans les poumons, soit, respectivement, 0.032 µg/mL et 0.512 µg/mL.
La CMI de la souche d’E. faecium est de 2 µg/mL, mais il ne sera pas possible de
rechercher les E. faecium résistantes à la marbofloxacine dans la suite de cette étude étant
donné qu’il semble y avoir une interaction entre le milieu de culture sélectif et l’antibiotique.
128
Chapitre 3 – Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la flore du tube digestif
3.4. Impact de différents schémas posologiques de
marbofloxacine sur la flore commensale
3.4.1. Problématique et objectifs
De nombreuses études ont démontré que des bacilles à Gram négatif résistants aux
fluoroquinolones peuvent apparaître durant un traitement par cette famille d’antibiotique (95,
108, 159, 170, 189, 214). Cependant ces études sont très souvent de type épidémiologique.
Par ailleurs, les études expérimentales de l’impact des antibiotiques sur la flore commensale
in vivo sont le plus souvent réalisées sur des animaux sains. Or, comme nous l’avons vu
précédemment, le statut infectieux de l’animal peut influencer de nombreux paramètres dont
la pharmacocinétique ou la sélection de bactéries résistantes. Il apparaît donc indispensable
d’évaluer l’impact d’un traitement antibiotique sur la flore intestinale d’animaux atteints d’une
infection.
Dans le chapitre 2, nous avons montré qu’un traitement de type métaphylactique
avec une dose de marbofloxacine de 16 mg/kg permettait la guérison des animaux sans
émergence de bactéries résistantes au niveau des poumons. En revanche, pour une charge
bactérienne de plus grande taille à l’initiation du traitement antibiotique, représentant un
traitement de type curatif, nous avons montré qu’une dose de marbofloxacine de 64 mg/kg
entraînait l’émergence de bactéries résistantes au niveau du site infectieux. Nous nous
sommes donc intéressés à l’impact de ces différentes modalités de traitement afin d’évaluer
i) si un traitement métaphylactique qui permettait la guérison clinique entraînait l’émergence
de résistance dans la flore présente au niveau du tube digestif, ii) si un traitement curatif qui
pouvait entraîner l’émergence de résistance au niveau du site infectieux entraînait également
l’émergence de résistance dans la flore digestive.
Les objectifs de cette étude étaient donc d’évaluer l’impact de différents schémas
posologiques de marbofloxacine sur l’émergence de bactéries commensales ou
pathogènes résistantes, à la fois au niveau du site infectieux et au niveau du tube
digestif, chez des animaux infectés par un petit ou un grand inoculum de KP dans les
poumons.
3.4.2. Matériels et méthodes
3.4.2.1. Bactéries et antibiotique
La souche Klebsiella pneumoniae ATCC 43816 a été utilisée pour réaliser les
infections pulmonaires.
129
Chapitre 3 – Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la flore du tube digestif
La souche E. coli (T199) et la souche d’E. faecium (T196EF2) utilisées sont d’origine
porcine. Elles proviennent du plan de surveillance des abattoirs effectués par l’AFSSA de
Fougères en 2006.
L’antibiotique utilisé a été la marbofloxacine sous forme de poudre, aimablement
fournie par le laboratoire Vetoquinol (Lure, France) pour la phase in vitro et le MarbocylND
10% (Vetoquinol, Lure, France) pour le traitement des animaux.
3.4.2.2. Préparation de l’inoculum bactérien
Pour l’implantation de la flore, quelques colonies de E. coli (T199) et de d’E. faecium
(T196EF2) ont chacune été ensemencées dans 50 mL de bouillon MH. La suspension
obtenue a été placée à l’étuve pour 18 h.
Pour l’infection pulmonaire, une étude préliminaire ayant montré une plus grande
mortalité des animaux dixéniques suite à l’infection des poumons par un inoculum de
109 CFU nous avons décidé de diminuer la charge bactérienne pour le « grand » inoculum et
de prendre un inoculum de 108 CFU.
Quelques KP on été ensemencées dans 50 mL de bouillon MH. La suspension
obtenue a été placée à l’étuve pour la nuit puis centrifugée à 3000 g pendant 10 min. Les
bactéries ont ensuite été remises en suspension dans du NaCl 0.9% afin d’obtenir une
suspension finale contentant 2109 CFU/mL KP. Cette suspension correspondant au grand
inoculum a ensuite été diluée au 1000ème afin d’obtenir la suspension correspondant au petit
inoculum de 2106 CFU/mL KP.
La taille de chaque inoculum ainsi que sa composition en bactéries résistantes a été
vérifiée comme cela a été décrit dans le paragraphe 2.3.2.6.
3.4.2.3. Animaux
Pour cette étude, des rats mâles OFA axéniques (Charles River, L’arbresle, France),
pesant entre 170 et 200 g ont été utilisés. Ils ont été hébergés dans des cages individuelles
placées dans 4 isolateurs souples différents avec un cycle jour/nuit de 12h (un isolateur par
groupe de traitement). La température ainsi que le degré d’humidité ont été enregistrés de
façon continue dans les isolateurs. Les animaux ont eu un accès libre à la nourriture stérile
(R03 40, UAR, Villemoisson, France) et à l’eau distillée stérilisée (120°C, 20 min).
Le statut axénique des animaux a été vérifié immédiatement après la réception et
l’introduction dans les isolateurs et durant toute la période d’acclimatation (Voir le
paragraphe 3.4.2.7.).
130
Chapitre 3 – Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la flore du tube digestif
3.4.2.4. Implantation de la flore
Après une semaine d’acclimatation, les animaux reçoivent via une sonde intragastrique 1 mL de la suspension bactérienne d’E. coli contenant environ 109 CFU/mL et
1 mL de la suspension bactérienne d’E. faecium contenant environ 109 CFU/mL.
3.4.2.5. Infection pulmonaire par KP
L’inoculation des poumons par KP a été effectuée de la même manière que pour les
animaux conventionnels (paragraphe 2.3.2.4.) avec un inoculum de 2  106 CFU/mL soit
105 CFU de KP in toto ou 2  109 CFU/mL soit 108 CFU de KP in toto.
3.4.2.6. Traitement antibiotique
Le traitement à la marbofloxacine (MarbocylND, Vetoquinol, Lure, France) a débuté
4 h (Groupe A, infectés par le petit inoculum) ou 24 h (Groupe B, infectés par le grand
inoculum) après l’inoculation des poumons par KP. La marbofloxacine a été administrée par
voie sous cutanée dans un volume de 0.3 mL.
Les animaux ont été traités suivant deux modalités : la dose de marbofloxacine a été
administrée en une seule prise ou divisée en 4 administrations sur 4 jours. Pour le groupe A
la dose de marbofloxacine était de 16 mg/kg et pour le groupe B de 64 mg/kg.
Sept jours après le début du traitement à la marbofloxacine, les animaux ont été
euthanasiés par une injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (DolethalND,
Vetoquinol, France). Les poumons ont alors été prélevés de manière stérile et
homogénéisés dans 10 mL de NaCl 0.9%. Les homogénats obtenus ont été centrifugés
10 min à 3000g puis lavés deux fois dans du NaCl 0.9% afin d’éliminer les traces éventuelles
d’antibiotique. Chaque groupe de traitement comprenait de 7 à 10 rats.
Un échantillon de fèces de chaque animal a été prélevé à t = 0, 4 et 7 jours après
l’initiation du traitement à la marbofloxacine.
3.4.2.7. Etude bactériologique
 Vérification du statut axénique
Les échantillons de fèces ont été dilués au 10ème dans de l’eau distillée et
homogénéisés. Cent microlitres de chaque homogénat ont été ensemencés sur des milieux
sélectifs et non sélectifs incluant du milieu Schaedler (Difco, France) supplémenté de sang
131
Chapitre 3 – Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la flore du tube digestif
de mouton pour les bactéries anaérobies, du milieu Brain Hearth Infusion (BHI, AES, France)
supplémenté de sang de mouton pour les bactéries aérobies, du milieu Malt Extract Agar
(MEA, AES, France) pour les levures ainsi que dans du bouillon Trypticase Glucose Yeast
extract (TGY). Chaque homogénat a été ensemencé 2 fois sur chaque milieu.
Les géloses BHI ainsi que les bouillons TGY ont été placés à l’étude à 37°C pendant
4 jours. Les géloses Shaedler ont été placées en milieu anaérobie à 37°C pendant 4 jours.
Les géloses MAE ont été placées à l’étuve à 30°C pendant 4 jours.
 Etude bactériologique des fèces
Les échantillons de fèces ont été dilués au 10ème dans de l’eau distillée et
homogénéisés, puis des dilutions successives au 10ème ont été réalisées. Pour chaque
échantillon, 100 µL de 3 des dilutions au 10ème ont été ensemencés sur des géloses Slanetz
et Bartley (AES, France) pour le dénombrement d’E. faecium, sur des géloses Mac Conkey
(AES, France) pour le dénombrement d’E. coli et sur des géloses Mac Conkey
supplémentées par 0.3 µg/mL de marbofloxacine pour les E. coli résistantes. Pour chaque
milieu, 2 géloses ont été ensemencées. Les géloses ont ensuite été placées à l’étuve à
37°C.
Le dénombrement des bactéries, a été effectué après 24 h d’incubation à 37°C pour
E. coli et 48 h pour E. faecium et E. coli résistantes Si les colonies étaient trop petites,
l’incubation était poursuivie pendant 24 heures. La moyenne du nombre de colonies des 2
boîtes issues du même homogénat a été calculée pour obtenir le nombre de bactéries par
gramme de fèces. La limite inférieure de détection était de 100 CFU/g de fèces, les bactéries
ont été considérées comme étant éradiquées en dessous de ce seuil.
 Etude bactériologique des poumons
L’étude bactériologique des poumons a été réalisée selon la méthode décrite dans le
paragraphe 2.3.2.6. (page 79) pour les animaux conventionnels.
132
Chapitre 3 – Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la flore du tube digestif
3.4.3. Résultats
3.4.3.1. Impact des différents schémas posologiques de marbofloxacine
sur la flore pathogène dans les poumons
La quantité de KP retrouvée dans les poumons des animaux ainsi que les
pourcentages d’animaux porteurs de KP résistantes dans les poumons pour chaque groupe
de traitement sont rapportés dans le Tableau 8.
Tableau 8 : Population bactérienne totale et pourcentage d’animaux porteurs de KP
résistantes dans les poumons 7 jours après l’initiation du traitement à la marbofloxacine.
Petit Inoculum
Grand inoculum
16 mg/kg
64 mg/kg
Dose totale de marbofloxacine
Modalité d’administration
Groupe
unique
A1
fractionnée
A2
unique
B1
fractionnée
B2
n
10
8
7
7
Animaux morts
0/10
0/10
3/7
Nombres de bactéries totales log10
CFU/poumons (Moyenne  écart type)
Pourcentage d’animaux porteur de KP
résistantes dans les poumons
0.1  0.2
0.13 0.8†
5.1  1.9
5.9  1.8
0%
0%
43%
14%
†
a
1/7
a
†
Pour le calcul de ces moyennes, la valeur 0 log10 CFU a été assignée aux poumons pour lesquels les bactéries
étaient indétectables.
a
Les animaux sont morts dans les 48-72 heures suivant l’inoculation de KP et sont inclus dans le calcul des
pourcentages d’animaux porteurs de KP résistantes dans les poumons.
Les animaux morts ne pas sont pris en considération pour le calcul de la population moyenne de bactérie dans
les poumons.
Pour les animaux infectés par le petit inoculum de KP (Groupe A), 7 jours après
l’initiation du traitement antibiotique nous avons observé une diminution de la charge
bactérienne en dessous de la limite de détection et ce, quelle que soit la modalité
d’administration (unique ou fractionnée) de la dose de marbofloxacine de 16 mg/kg.
En revanche, pour les animaux infectés par le grand inoculum de KP et traités par
64 mg/kg de marbofloxacine (Groupe B), nous avons observé une certaine mortalité, plus
importante pour les animaux recevant l’administration unique (3 rats sur 7) que pour ceux
recevant l’administration fractionnée (1 rat sur 7). Chez les animaux ayant survécu, la charge
bactérienne retrouvée 7 jours après l’initiation du traitement avait diminué d’environ 2 à 3 log
quelle que soit la modalité d’administration de la dose de marbofloxacine (unique ou
fractionnée).
Chez les animaux qui ont survécu jusqu’à la fin de l’expérience, nous n’avons pas
retrouvé de KP résistantes à la marbofloxacine dans les poumons. Cependant, la mortalité
observée dans le groupe B survenant entre 48 et 72 h après le début du traitement à la
marbofloxacine peut être attribuée à l’infection bactérienne au vu des signes cliniques
133
Chapitre 3 – Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la flore du tube digestif
observés. Nous avons fait l’hypothèse que ces animaux étaient porteurs de bactéries
résistantes et nous les avons inclus comme tel pour le calcul du pourcentage d’animaux
porteur de KP résistantes dans les poumons.
3.4.3.2. Impact des différents schémas posologiques de marbofloxacine
sur la flore du tube digestif
 Impact sur la population d’E. faecium
Pour les deux groupes d’animaux (A et B), quelles que soient la dose et la modalité
d’administration de la marbofloxacine nous n’avons pas observé d’impact du traitement sur
la population d’E. faecium comme cela est visible sur la Figure 22.
A
Marbofloxacine – 16mg/kg
Marbofloxacine – 4  4 mg/kg
12
12
10
10
8
6
4
2
LOQ
Infection pulmonaire
109 CFU
Inoculation
de la flore
Log CFU/g de fèces
Log CFU/g de fèces
B
Infection pulmonaire
105 CFU
Inoculation
de la flore
Marbofloxacine – 64 mg/kg
Marbofloxacine – 4  16 mg/kg
8
6
4
2
LOQ
0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Temps post implantation (jour)
Temps post implantation (jour)
Petit Inoculum - Administration unique
Grand Inoculum - Administration unique
Petit Inoculum - Administration fractionnée
Grand Inoculum - Administration fractionnée
Figure 22 : Evolution de la population fécale d’E. faecium au cours du temps
Evolution de la population d’E. faecium (moyenne  écart type) durant la période d’implantation, le
traitement à la marbofloxacine et à l’arrêt du traitement, pour les animaux infectés par le petit
inoculum (A) ou le grand inoculum (B).
(A) les animaux reçoivent 16 mg/kg de marbofloxacine en administration unique (rouge) ou
fractionnée en 4 administrations de 4 mg/kg (bleu), le traitement débute 4 h après l’inoculation de
KP dans les poumons.
(B) les animaux reçoivent 64 mg/kg de marbofloxacine en administration unique (rouge) ou
fractionnée en 4 administrations de 16 mg/kg (bleu), le traitement débute 24 h après l’inoculation de
KP dans les poumons.
 Impact sur la population d’E. coli
Contrairement à ce qui s’est produit pour la population d’E. faecium, le traitement
antibiotique a modifié la population d’E. coli présente dans le tube digestif des animaux.
134
Chapitre 3 – Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la flore du tube digestif
Au cours des différents traitements, pour les animaux infectés par le petit et par le
grand inoculum de KP et quelle que soit la modalité de traitement (fractionnée ou unique),
nous avons observé une diminution transitoire de la population d’E. coli (Figure 23). Cette
diminution de la population d’E. coli a été associée dans tous les cas à un retour à un niveau
de colonisation 7 jours après l’initiation du traitement à peu près équivalent à celui observé
avant le traitement antibiotique.
A
B
Inoculation
de la flore
Infection pulmonaire
105 CFU
Marbofloxacine – 16mg/kg
Marbofloxacine – 4  4 mg/kg
12
10
8
6
4
2
LOQ
0
Infection pulmonaire
109 CFU
Marbofloxacine – 64 mg/kg
Marbofloxacine – 4  16 mg/kg
12
Log CFU/g de fèces
Log CFU /g de fèces
Inoculation
de la flore
10
8
6
4
2
LOQ
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Temps post implantation (jour)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Temps post implantation (jour)
Petit Inoculum - Administration unique
Grand Inoculum - Administration unique
Petit Inoculum - Administration fractionnée
Grand Inoculum - Administration fractionnée
Figure 23 : Evolution de la population fécale d’E. coli au cours du temps
Evolution de la population d’E. coli (moyenne  écart type) durant la période d’implantation, le
traitement à la marbofloxacine et à l’arrêt du traitement, pour les animaux infectés par le petit
inoculum (A) ou le grand inoculum (B).
(A) les animaux reçoivent 16 mg/kg de marbofloxacine en administration unique (rouge) ou
fractionnée en 4 administrations de 4 mg/kg (bleu), le traitement débute 4 h après l’inoculation de
KP dans les poumons.
(B) les animaux reçoivent 64 mg/kg de marbofloxacine en administration unique (rouge) ou
fractionnée en 4 administrations de 16 mg/kg (bleu), le traitement débute 24 h après l’inoculation de
KP dans les poumons.
Nous avons également observé l’émergence d’E. coli résistantes à la marbofloxacine
dans tous les groupes d’animaux, alors qu’aucun animal ne présentaient d’E. coli résistantes
dans les fèces à J0. Les pourcentages d’animaux porteurs d’E. coli résistantes dans les
fèces ainsi que les quantités moyennes d’E. coli résistantes retrouvées dans les fèces sont
rapportés dans le Tableau 9 pour les animaux infectés par le petit inoculum et dans le
Tableau 10 pour ceux infectés par le grand inoculum. Pour les groupes A1, A2 et B2 ces
pourcentages d’animaux porteurs d’E. coli résistantes observés ont été de 10 à 17%. Seul le
groupe B1 (grand inoculum, 64 mg/kg en administration unique) a montré un pourcentage
d’animaux porteurs d’E. coli résistantes important, i.e. 50% des animaux à la fin de
l’expérimentation.
135
Chapitre 3 – Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la flore du tube digestif
Tableau 9 : Quantité d’E. coli résistantes, de KP et de KP résistantes dans les fèces des
animaux infectés par le petit inoculum de KP, 4 et 7 jours après l’initiation du traitement à la
marbofloxacine.
E. coli résistantes
moyenne
nbre
dose totale de
log10
marbofloxacine animaux
%
CFU/g
porteur/
et modalité
animaux
d'administration nombre porteur de fèces
total
 écart
animaux
type
K. pneumoniae
K. pneumoniae résistantes
moyenne
nbre
log10
animaux
%
CFU/g
porteur/
animaux
de fèces
nombre
porteur
total
 écart
animaux
type
moyenne
nbre
log10
animaux
%
CFU/g
porteur/
animaux
de fèces
nombre
porteur
total
 écart
animaux
type
4 jours après l'initiation du traitement
16 mg/kg Unique
0/10
0%
-
16 mg/kg 0/8
0%
Fractionnée
7 jours après l'initiation du traitement
16 mg/kg 1/10
10%
3.8*
Unique
16 mg/kg Fractionnée
1/8
13%
3.9*
2/10
20%
5.0  3.2
0/10
0%
-
0/8
0%
-
0/8
0%
-
6/10
60%
8.1  1.1
4/10
40%
3.8  1.5
1/8
13%
5.7*
0/8
0%
0
* Un seul animal de ce groupe était porteur de la bactérie
Tableau 10 : Quantité d’E. coli résistantes, de KP et de KP résistantes dans les fèces des
animaux infectés par le grand inoculum de KP, 4 et 7 jours après l’initiation du traitement à
la marbofloxacine.
E. coli résistantes
moyenne
nbre
dose totale de
log10
animaux
marbofloxacine
%
CFU/g
porteur/
et modalité
animaux
d'administration nombre porteur de fèces
total
 écart
animaux
type
4 jours après l'initiation du traitement
64 mg/kg 0/6
0%
Unique
-
64 mg/kg 0/6
0%
Fractionnée
7 jours après l'initiation du traitement
64 mg/kg 2/4
50%
2.0  0
Unique
64 mg/kg Fractionnée
1/6
17%
6.0*
K. pneumoniae
K. pneumoniae résistantes
moyenne
nbre
log10
animaux
%
CFU/g
porteur/
animaux
de fèces
nombre
porteur
total
 écart
animaux
type
moyenne
nbre
log10
animaux
%
CFU/g
porteur/
animaux
de fèces
nombre
porteur
total
 écart
animaux
type
5/6
83%
3.1  2.4
3/6
50%
1.4  1.9
1/6
17%
1.7*
0/6
0%
-
4/4
100%
7.3  1.3
4/4
100%
5.4  0.1
4/6
67%
5.9  0.6
1/6
17%
1.7*
* Un seul animal de ce groupe était porteur de la bactérie
 Colonisation du tractus digestif par K. pneumoniae
Au cours de notre étude, nous avons observé la colonisation du tube digestif de
certains animaux par KP. Les pourcentages d’animaux porteurs de KP dans les fèces ainsi
que les quantités moyennes de KP retrouvées dans les fèces sont rapportés dans le Tableau
136
Chapitre 3 – Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la flore du tube digestif
9 pour les animaux infectés par le petit inoculum et dans le Tableau 10 pour ceux infectés
par le grand inoculum.
La colonisation du tube digestif par KP a été observée 4 jours après l’initiation du
traitement antibiotique des animaux des groupes A1 (petit inoculum, 16 mg/kg administration
unique), B1 et B2 (grand inoculum, 64 mg/kg). Sept jours après l’initiation du traitement à la
marbofloxacine cette colonisation a été observée chez tous les groupes d’animaux de façon
plus importante pour les groupes traités par administration unique que pour les groupes
recevant une administration fractionnée de marbofloxacine (60% versus 13% respectivement
pour l’administration unique et fractionnée pour le petit inoculum et 100% versus 67%
respectivement pour l’administration unique et fractionnée pour le grand inoculum).
De plus, nous avons observé chez certains animaux la colonisation du tube digestif
par une sous-population de KP résistantes à 0.3 µg/mL de marbofloxacine. Les
pourcentages d’animaux porteurs de KP résistantes dans les fèces ainsi que les quantités
moyennes de KP résistantes retrouvées dans les fèces sont rapportés dans le Tableau 9
pour les animaux infectés par le petit inoculum et dans le Tableau 10 pour ceux infectés par
le grand inoculum. Quatre jours après l’initiation du traitement à la marbofloxacine ces KP
résistantes n’ont été retrouvées que dans les fèces du groupe B2 (64 mg/kg, administration
unique) chez 57% des animaux. Sept jours après l’initiation du traitement, ces bactéries
résistantes ont été retrouvées chez les animaux infectés par le petit ou le grand inoculum de
KP ayant été traités par une dose unique (A1 et B1) ainsi que chez les animaux infectés par
le grand inoculum de KP (groupe B2) ayant reçu 64 mg/kg de marbofloxacine en
administration fractionnée. Les pourcentages d’animaux porteurs de KP résistantes dans les
fèces sont rapportés dans le Tableau 9 et les quantités moyennes de KP résistantes
retrouvées dans les fèces pour chaque groupe d’animaux sont rapportées dans le Tableau
10.
Sept jours après l’initiation du traitement à la marbofloxacine nous n’avons retrouvé
aucune KP résistante dans les poumons des animaux porteurs de KP résistantes dans les
fèces.
3.4.4. Conclusion
Au cours de cette étude nous avons pu mettre en évidence un impact négatif et
transitoire du traitement antibiotique, quelles que soient la dose et la modalité
d’administration, sur la population d’E. coli pouvant conduire à l’émergence d’E. coli
résistantes dans le tube digestif des animaux traités. En revanche, nous n’avons pas
137
Chapitre 3 – Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la flore du tube digestif
observé d’impact négatif du traitement à la marbofloxacine sur la population totale d’E.
faecium.
Parallèlement, nous avons mis en évidence une colonisation du tube digestif par la
bactérie pathogène présente au niveau des poumons au cours du traitement. Cette
colonisation apparaît plus importante lorsque la dose de marbofloxacine est administrée en
une seule fois plutôt que fractionnée. L’émergence de résistance a été constatée au sein de
cette population exogène implantée dans le tube digestif, là encore de façon plus importante
lorsque l’antibiotique est administré en dose unique.
L’émergence de résistance dans le tube digestif des animaux, quelles que soient la
modalité de traitement et le schéma posologique, est observée chez des animaux qui ne
présentent pas de résistance au niveau des poumons à la fin de l’étude.
138
Chapitre 3 – Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la flore du tube digestif
3.5. Discussion
L’antibiothérapie
vétérinaire,
particulièrement
les
traitements
préventifs
et
métaphylactiques, est accusée d’être l’une des causes responsables de l’augmentation des
résistances bactériennes chez l’Homme. Nous avons vu dans le chapitre 2 qu’un traitement
de type métaphylactique permettait de prévenir l’émergence de résistance au niveau du site
infectieux avec des doses plus faibles d’antibiotique qu’un traitement de type curatif. Nous
avons vu dans le chapitre 1 (paragraphe 1.5.3., page 56) qu’un traitement antibiotique
pouvait également avoir un impact sur l’émergence de résistance dans la flore commensale
du tube digestif. Dans la continuation des résultats du chapitre 2, l’objectif de cette étude
était donc de déterminer l’impact d’un traitement de type métaphylactique sur la flore du tube
digestif.
3.5.1. Impact de la charge bactérienne sur l’élimination de la
marbofloxacine dans les fèces
Dans le chapitre 2, nous avons observé des cinétiques plasmatiques de
marbofloxacine similaires entre les animaux infectés par un petit ou un grand inoculum. En
revanche, l’étude de l’élimination fécale de la marbofloxacine a montré que la fraction de la
dose administrée qui était excrétée dans les fèces était 4 fois moins importante chez les
animaux infectés par le grand inoculum par rapport à ceux infectés par le petit. Ces résultats
indiquent que dans notre étude l’exposition du tube digestif des animaux infectés par le petit
inoculum et traités avec 16 mg/kg de marbofloxacine était à peu près équivalente à celle des
animaux infectés par un grand inoculum et traités par 64 mg/kg de marbofloxacine.
Ces résultats confirment ceux obtenus par Lindecrona et al. (133) pour la
danofloxacine chez des porcs infectés par Salmonella typhimurium. Les fluoroquinolones
peuvent atteindre le tube digestif via la sécrétion biliaire ou être excrétées directement au
niveau intestinal ; cependant, la sécrétion biliaire de certaines fluoroquinolones est limitée
(208, 209). Ce serait donc la sécrétion intestinale qui jouerait un rôle prépondérant dans
l’excrétion des fluoroquinolones dans le tube digestif. Chez les animaux infectés par le grand
inoculum, nous avons observé une réduction de la prise alimentaire qui s’est traduite par une
diminution de la quantité de fèces excrétées pour ce groupe, i.e. deux fois moins que pour
celui infecté par le petit inoculum (paragraphe 3.2.2.). Cette réduction de la prise alimentaire
a pu entraîner une diminution de la perfusion sanguine du tube digestif qui pourrait expliquer
la diminution de l’excrétion de la marbofloxacine chez ces animaux. De plus, Blatteis et al.
(20) ont montré qu’une l’inflammation diminuait le flux sanguin splanchnique. La sécrétion
gastro-intestinale des fluoroquinolones passe par plusieurs systèmes de transports
139
Chapitre 3 – Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la flore du tube digestif
spécifiques et notamment via les P-gp et les MRP2 (201, 239). Or, l’expression des P-gp
hépatiques ainsi que l’expression des cytochromes P450, qui sont impliqués dans le
métabolisme des fluoroquinolones, est nettement réduite chez le rat lors d’une inflammation
aiguë via des médiateurs de l’inflammation tel que IL-6 notamment (74, 96, 179). Il est donc
possible que le statut inflammatoire des animaux infectés par le grand inoculum entraîne une
diminution de l’expression des P-gp intestinales chez ces animaux expliquant une partie de
la diminution d’excrétion de la marbofloxacine dans le tube digestif. Des études
complémentaires seraient nécessaires afin de confirmer ces hypothèses.
3.5.2. Impact des différentes modalités de traitement
antibiotique sur la flore pathogène au niveau du site
infectieux
Pour les animaux infectés par le petit inoculum, nous n’avons pas retrouvé de flore
pathogène au niveau du site infectieux, comme cela avait déjà été le cas pour l’étude sur les
animaux conventionnels (chapitre 2). Pour les animaux dixéniques infectés par le grand
inoculum, la charge bactérienne retrouvée dans les poumons 7 jours après l’initiation du
traitement a été légèrement inférieure à celle retrouvée 4 jours après l’initiation du traitement
chez les animaux conventionnels. Cette différence peut avoir deux explications. D’une part,
pour les animaux dixéniques, le prélèvement des poumons a été effectué plus tard que pour
les animaux conventionnels et le système immunitaire des animaux a pu prendre le relais du
traitement antibiotique et entraîner une diminution de la charge bactérienne durant cette
période. D’autre part, le grand inoculum était plus petit pour les animaux dixéniques que pour
les animaux conventionnels (108 CFU versus 10 9CFU) et la diminution de la charge
bactérienne observée dans les deux cas était d’environ 2 log, donc similaire.
Pour les animaux infectés par le grand inoculum, nous n’avons pas retrouvé de KP
résistantes à la marbofloxacine dans les poumons des animaux survivants contrairement à
ce qui a été observé chez les animaux conventionnels. Cependant, si l’on considère que les
animaux morts au cours du traitement sont morts à cause de l’infection car ils étaient
porteurs de KP résistantes dans les poumons nous retrouvons des pourcentages d’animaux
porteurs de bactéries résistantes dans les poumons assez similaires à ceux observés chez
les animaux conventionnels, i.e. respectivement 14% et 27% pour l’administration
fractionnée et 43% et 50% pour l’administration unique (Tableau 3 page 49 et Tableau 8
page 133). La sensibilité plus importante des animaux dixéniques vis-à-vis de l’infection
bactérienne (3 rats dixéniques sur 5 infectés par un inoculum de 109 CFU et traités par
16 mg/kg de marbofloxacine en administration fractionnée sont morts dans les 48 h suivant
l’initiation du traitement alors que le même traitement sur des animaux conventionnels n’a
140
Chapitre 3 – Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la flore du tube digestif
pas entrainé de mortalité) est probablement la cause de la mortalité plus précoce par rapport
aux animaux conventionnels. Afin de confirmer la présence de bactéries résistantes au
niveau des poumons chez les animaux dixéniques infectés par le grand inoculum et traités
par 64 mg/kg de marbofloxacine, il aurait été nécessaire de prélever les poumons des
animaux plus tôt que pour les animaux conventionnels.
3.5.3. Impact des différentes modalités de traitement sur la flore
commensale du tube digestif
Dans notre modèle, que ce soit dans le cadre d’une antibiothérapie métaphylactique
ou curative, tous les schémas posologiques utilisés ont entraîné une diminution transitoire de
la population d’E. coli mais n’ont eu aucun impact sur la population d’E. faecium. Ces
résultats confirment ceux obtenus lors de précédentes études, comme nous l’avons vu dans
l’étude bibliographique, qui ont montré qu’un traitement aux fluoroquinolones inhibait
transitoirement les populations à Gram négatif et n’avait que peu d’impact sur les
populations à Gram positif.
Parallèlement à cette diminution de la population d’E. coli, nous avons observé
l’émergence d’E. coli résistantes à la marbofloxacine dans tous les groupes de traitement ce
qui confirme les données de la littérature qui indiquent que des bacilles à Gram négatif
résistants aux fluoroquinolones peuvent apparaître au cours d’un traitement par cette famille
d’antibiotique (95, 108, 159, 170, 189, 214). Cette émergence de résistance est restée
limitée dans la plupart des groupes expérimentaux (entre 10 et 17% des animaux), mais elle
est devenue importante pour les animaux infectés par le grand inoculum et traités par
64 mg/kg de marbofloxacine en administration unique (50%). L’étude de l’excrétion de la
marbofloxacine dans les fèces ayant montré que la quantité de marbofloxacine excrétée était
équivalente pour les deux groupes d’animaux (infectés par le petit ou le grand inoculum), il
n’est pas surprenant d’obtenir des pourcentages d’animaux porteurs d’E. coli résistantes
assez similaires entre les groupes A1, A2 et B2. Bien que le groupe B1 ait présenté un
pourcentage d’animaux porteurs d’E. coli résistantes beaucoup plus important que les
autres, il faut rappeler que ce pourcentage n’a été calculé que sur 4 animaux étant donné
que 3 animaux de ce groupe sont morts au cours du traitement. De plus, les 2 animaux
porteurs d’E. coli résistantes ne l’ont été qu’à un faible niveau (2 log10 CFU/mL) équivalent à
celui des autres groupes d’animaux (Tableau 9 et Tableau 10, page 136) ce qui tend à
suggérer que l’administration unique de 64 mg/kg de marbofloxacine chez les animaux
infectés par le grand inoculum n’a pas augmenté l’émergence d’E. coli résistantes par
rapport aux autres groupes (A1, A2 et B2).
141
Chapitre 3 – Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la flore du tube digestif
3.5.4. Colonisation du tractus digestif par la bactérie pathogène
et émergence de résistance
En revanche, le fait marquant de notre étude est la colonisation du tube digestif des
animaux par la bactérie pathogène présente au niveau du site infectieux. Cette colonisation
du tube digestif par des KP pulmonaires a pu se produire suite à une bactériémie ou via
l’ingestion de mucus remontant les voies respiratoires. Il semble que cette seconde
hypothèse soit la plus probable étant donné qu’aucune bactériémie n’a été observée chez
les animaux infectés par un petit inoculum traités à la marbofloxacine alors que ces animaux
présentaient des KP dans les fèces. Plusieurs études ont suggéré que l’inhibition de la flore
commensale pourrait conduire à la colonisation du tube digestif par des organismes qui sont
ingérés (55, 56, 196). Dans notre modèle, l’absence de flore anaérobie, qui est connue pour
participer activement au rôle de barrière (voir paragraphe 1.5.2., page 55), pourrait expliquer
la colonisation du tube digestif par KP. En effet, différentes études ont montré qu’un
traitement antibiotique associé à un traitement inhibiteur de la flore anaérobie, la
clindamycine, facilitait la colonisation du tube digestif par un organisme exogène administré
par gavage (182, 183, 213).
Cette colonisation du tube digestif par KP a été observée chez les animaux dans tous
les groupes, mais elle est apparue plus fréquemment chez les animaux infectés par le grand
inoculum (groupes B1 et B2). Quelle que soit la taille de l’inoculum de départ, cette
colonisation a été plus fréquente chez les animaux recevant leur traitement de
marbofloxacine en administration unique en comparaison de ceux qui l’ont reçu en
administration fractionnée. (Tableau 9 et Tableau 10, page 135). Néanmoins la quantité
moyenne de KP retrouvée dans les fèces des animaux du groupe A1 traités par
l’administration unique de marbofloxacine a été sensiblement équivalente à celle du groupe
B1 traité par l’administration unique ; il en est de même pour l’administration fractionnée
entre les groupes A2 et B2 (Tableau 9 et Tableau 10, page 136).
Dans cette population de KP intestinales, nous avons également observé
l’émergence de KP résistantes à 0.3 µg/mL de marbofloxacine. De la même façon que pour
KP, le pourcentage d’animaux porteurs de ces KP résistantes a été plus important pour les
animaux recevant la marbofloxacine en administration unique par rapport à l’administration
fractionnée. Le pourcentage d’animaux porteurs de KP résistantes a également été plus
important chez les animaux infectés par le grand inoculum par rapport à ceux infectés par le
petit inoculum (Tableau 9 et Tableau 10, page 135).
Quels que soient les modalités d’administration et les schémas posologiques
l’émergence de KP résistantes au niveau du tube digestif des animaux n’a jamais été
associée à la présence de KP résistantes dans les poumons. Ceci suggère qu’un traitement
142
Chapitre 3 – Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la flore du tube digestif
antibiotique qui permet de limiter l’émergence de bactéries résistantes au niveau du site
infectieux peut simultanément être à l’origine de la création d’un réservoir de résistance pour
les bactéries présentes initialement au niveau du site infectieux.
Comme nous l’avons vu précédemment, malgré une dose de marbofloxacine plus
importante, la quantité de marbofloxacine excrétée dans les fèces pour les animaux infectés
par le grand inoculum (Groupes B1 et B2) est sensiblement identique à celle des animaux
infectés par le petit inoculum (Groupe A1 et A2). Une exposition plus importante du tube
digestif à la marbofloxacine pour les animaux des groupes B traités par 64 mg/kg de
marbofloxacine ne peut donc pas expliquer les pourcentages plus élevés d’animaux porteurs
de KP et de KP résistantes dans les fèces dans les groupes B1 et B2 par rapport aux
groupes infectés par le petit inoculum et traités par 16 mg/kg de marbofloxacine (A1 et A2).
Deux hypothèses peuvent expliquer cette différence. D’une part, la quantité de KP dans les
poumons des rats infectés par le grand inoculum est plus importante donc la probabilité pour
cette bactérie de coloniser le tube digestif augmente. D’autre part, le traitement antibiotique
commence plus tard pour les animaux infectés par le grand inoculum (24 h après
l’inoculation de KP) que pour le groupe infecté par le petit inoculum (4 h). KP peut donc
coloniser le tube digestif des animaux infectés par le grand inoculum durant les 24 h
précédant l’initiation du traitement antibiotique, quand le tube digestif n’a pas encore été
exposé à la marbofloxacine. Ces hypothèses sont confirmées par les résultats obtenus après
4 jours de traitement pour lesquels on observe que le pourcentage d’animaux porteurs de KP
dans les fèces est plus important pour les groupes infectés par le grand inoculum que pour
ceux infectés par le petit inoculum (Tableau 9 et Tableau 10, page 135). Néanmoins une
étude complémentaire, avec des effectifs plus importants et un suivi quotidien des
populations bactériennes dans les fèces serait nécessaire afin de confirmer cette hypothèse.
Bien qu’aucune étude ne l’ait confirmé, il est possible que les indices PK/PD
plasmatiques soient transposables au niveau des concentrations observées dans le tube
digestif. Dans ce cas, l’effet négatif de l’administration en dose unique sur la colonisation du
tube digestif par KP et KP résistantes pourrait être imputé à un rapport T>MPC/TMSW au niveau
du tube digestif plus faible que pour l’administration fractionnée. En effet, comme nous
l’avons vu dans le chapitre 2 au niveau des poumons, le traitement par administration unique
de la dose a produit un T>MPC court et un TMSW important ce qui a pu favoriser la sélection de
bactéries résistantes pour les doses testées. Cependant les données obtenues lors de
l’étude pharmacocinétique de l’excrétion de la marbofloxacine dans les fèces ne nous
permettent pas de calculer ce rapport au niveau du tube digestif. De plus il est possible que
les paramètres pharmacocinétiques des animaux dixéniques diffèrent de ceux des animaux
143
Chapitre 3 – Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la flore du tube digestif
conventionnels. Des études complémentaires plus complètes, de la cinétique de la
marbofloxacine notamment, seront donc nécessaires afin de confirmer cette hypothèse au
niveau du tube digestif.
3.5.5. Conclusion
Dans cette étude nous avons montré que lors d’une infection, d’une part la bactérie
pathogène présente au niveau du site infectieux pouvait coloniser le tube digestif et d’autre
part, que le traitement antibiotique de cette infection pouvait conduire à l’émergence de
résistance aussi au sein de cette flore pathogène implantée dans le tube digestif. Si la
colonisation du tube digestif par une bactérie pathogène exogène suite à l’absence de flore
de barrière avait déjà été observée (182, 183, 213), cette étude est à notre connaissance la
seule pour laquelle la colonisation s’est faite de façon naturelle suite à l’infection et la seule à
montrer l’émergence de résistance au sein de cette flore pathogène digestive.
Nos résultats montrent également qu’un traitement par une fluoroquinolone qui
permet la guérison et prévient l’émergence de bactéries résistantes au niveau du site
infectieux peut, dans le même temps, permettre l’émergence de ces même bactéries
pathogènes au niveau du tube digestif ce qui peut entraîner la mise en place d’un
réservoir de bactéries résistantes.
De plus, les études sur rats conventionnels consacrées uniquement à la flore
pathogène présente au niveau du site infectieux (chapitre 2) ont montré que l’administration
de type « one shot » pourrait favoriser l’émergence de résistance si la dose d’antibiotique
n’était pas adaptée chez des animaux ayant reçu un traitement curatif. Cependant, nous
n’avons pas vu d’effet négatif de l’administration « one shot » lors d’un traitement
métaphylactique. Les résultats présentés dans cette deuxième étude expérimentale ont mis
en évidence que l’administration de type « one shot » pouvait avoir un impact négatif sur la
flore digestive, plus particulièrement sur la colonisation du tube digestif par une bactérie
exogène y compris chez des animaux ayant reçu un traitement de type métaphylactique.
L’ensemble de nos études semble donc montrer que pour un traitement de type préventif tel
que la prophylaxie ou la métaphylaxie, fractionner la dose pourrait être bénéfique en termes
de colonisation du tube digestif par la bactérie pathogène et éviter ainsi la mise en place d’un
réservoir de cette bactérie ainsi que l’émergence de résistance pour cette même bactérie.
Cependant, il est important de noter que cette étude a été réalisée chez le rat et dans
un écosystème intestinal artificiel. Ce modèle diffère de la flore « normale » des animaux
notamment par son manque de bactéries anaérobies qui participent au rôle de flore de
barrière. De plus, les paramètres pharmacocinétiques des rats ne sont pas les mêmes que
144
Chapitre 3 – Impact d’un traitement à la marbofloxacine sur la flore du tube digestif
ceux des humains ou des espèces animales cibles de l’antibiothérapie. Nous ne pouvons
donc pas exclure la possibilité que l’exposition digestive à la marbofloxacine chez le rat
diffère de celle des autres espèces, notamment des espèces pour lesquelles le temps de
demi-vie de la marbofloxacine est nettement plus long. D’autres études dans d’autres
modèles animaux et avec une microflore complète, ainsi que des études plus complètes de
cinétique de l’antibiotique sont donc nécessaires afin de confirmer ces résultats.
145
.
146
Article 2
3.6. Article 2
Emergence of resistant Klebsiella pneumoniae in the intestinal tract during a
successful treatment of Klebsiella pneumoniae lung infection in rats.
Anne-Sylvie Kesteman, Agnès Perrin-Guyomard, Michel Laurentie, Pascal Sanders,
Pierre-Louis Toutain and Alain Bousquet-Mélou
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010 Jul; 54(7):2960-64
147
Article 2
149
Article 2
150
Article 2
151
Article 2
152
Article 2
153
154
DISCUSSION GENERALE
155
156
Discussion générale
DISCUSSION GENERALE
Les traitements antibiotiques en médecine vétérinaire, notamment les traitements de
type métaphylactique ou prophylactique, administrés à un grand nombre d’animaux font
l’objet de controverse quant à leur contribution à l’émergence de bactéries résistantes et à la
transmission de cette résistance à l’Homme (2, 24, 176, 217). L’objectif de ce travail de
thèse était d’évaluer l’impact d’un traitement métaphylactique par rapport à un traitement
curatif sur l’émergence de bactéries résistantes à la fois au niveau du site infectieux et de la
flore commensale du tube digestif des animaux traités.
Dans la première partie de ce travail, en mettant au point une infection pulmonaire
chez le rat obtenue par deux charges bactériennes de tailles différentes, nous avons
reproduit des traitements de type métaphylactique et curatif. L’administration de différentes
doses de marbofloxacine, selon deux schémas d’administration, unique ou fractionné sur 4
jours, a mis en évidence d’une part l’influence de la charge bactérienne présente à l’initiation
de l’antibiothérapie et d’autre part, le rôle du schéma d’administration sur l’émergence de
bactéries résistantes au cours du traitement antibiotique. Nous n’avons pas observé de
relation entre les indices PK/PD habituels pour les fluoroquinolones (AUC/CMI, Cmax/CMI) et
l’émergence de résistance chez les animaux traités lorsque nous avons considéré
simultanément les deux schémas d’administration (fractionné et unique). La construction
d’un nouvel indice PK/PD, le rapport du temps durant lequel les concentrations plasmatiques
d’antibiotique se trouvent au-dessus de la MPC sur le temps durant lequel elles sont dans la
fenêtre de sélection (T>MPC/TMSW), nous a permis de montrer qu’il existait une relation entre
ce rapport et l’émergence de bactéries résistantes chez les animaux traités et ce, quel que
soit le schéma d’administration utilisé.
Dans la seconde partie de ce travail, l’utilisation de notre modèle d’infection
pulmonaire par KP chez des animaux gnotoxéniques a montré un impact limité du traitement
antibiotique sur la flore intestinale implantée chez ces animaux, avec peu d’émergence de
résistance quel que soit le schéma posologique utilisé. En revanche, nous avons observé, de
façon inattendue, la colonisation du tube digestif des animaux par la bactérie pathogène
présente au niveau du site infectieux pulmonaire, ainsi que l’émergence de résistance pour
cette bactérie. Cette colonisation s’est révélée plus importante dans le contexte d’un
traitement tardif sur une forte charge bactérienne (curatif) que pour un traitement précoce sur
une faible charge bactérienne (métaphylactique). De plus, pour chaque modalité de
traitement, curatif ou métaphylactique, le schéma d’administration unique a plus
fréquemment conduit à l’émergence de bactéries résistantes que l’administration fractionnée
157
Discussion générale
de la même dose totale. Au cours de cette étude, nous avons donc mis en évidence, qu’une
antibiothérapie associée à la guérison et à une absence de sélection de bactéries résistantes
au niveau du site infectieux pulmonaire pouvait, dans le même temps, entraîner la mise en
place d’un réservoir de la même bactérie, résistante ou non, au niveau du tube digestif de
l’individu traité.
L’ensemble de ces résultats s’ils permettent d’apporter des éléments de réponse à un
certain nombre de questions relatives à l’antibiothérapie vétérinaire, requiert néanmoins des
confirmations ou des approfondissements.
Influence
du
statut
physiopathologique
sur
les
paramètres
pharmacocinétiques
L’étude de la cinétique de la marbofloxacine chez des rats infectés par un petit
inoculum et traités précocement ou chez des animaux infectés par un grand inoculum et
traités tardivement n’a pas montré de différences significatives au niveau des paramètres
pharmacocinétiques plasmatiques entre les différents groupes d’animaux. En revanche,
nous avons observé une diminution de 400% de la clairance fécale de la marbofloxacine
chez les animaux infectés par un grand inoculum. Ces résultats montrent que le statut
physiopathologique de l’animal peut faire varier les paramètres pharmacocinétiques locaux,
et qu’à ce titre, la pharmacocinétique est un élément important à prendre en considération
lors de l’étude d’efficacité d’un antibiotique mais également, lors de l’étude de l’impact d’un
antibiotique sur la flore commensale du tube digestif. Afin de caractériser de façon plus
complète l’impact du statut physiopathologique des animaux traités, il serait pertinent de faire
des cinétiques comparatives entre des animaux sains, des animaux infectés par un petit
inoculum ou par un grand inoculum. De plus il serait nécessaire de réaliser ces études sur la
période complète du traitement.
Influence de la taille de l’inoculum à l’initiation du traitement sur la sélection de
bactéries résistantes
Nous avons montré qu’un traitement précoce sur un petit inoculum représentant un
traitement de type métaphylactique limitait l’émergence de bactéries résistantes au niveau
du site infectieux comparé à un traitement tardif sur un grand inoculum représentant un
traitement de type curatif. Cela confirme l’hypothèse émise par d’Agata et al. (48) qui ont
158
Discussion générale
montré à l’aide d’un modèle mathématique qu’un traitement précoce limitait le risque
d’émergence de résistance (48). Ces résultats soulignent l’importance de prendre en compte
la taille de la charge bactérienne présente lors de l’initiation d’une antibiothérapie. Or, les
indices PK/PD utilisés pour déterminer les schémas posologiques des antibiotiques afin
d’obtenir la guérison de l’individu traité se basent sur la CMI des bactéries et cette CMI est
évaluée, selon les méthodes standards du CLSI, à partir d’une population bactérienne fixe
de 105 CFU/mL, c'est-à-dire un faible inoculum dans lequel il n’y a pas de sous-population
résistante. En revanche, évaluer la CMI sur une population de 109 CFU/mL (ce qui
correspond approximativement à la charge bactérienne présente au niveau d’un site
infectieux (118)) permettrait de prendre en considération la CMI des bactéries les moins
sensibles dans la population, ce qui revient à déterminer la MPC. Ainsi, la construction des
indices PK/PD à partir des valeurs de MPC serait plus pertinente en termes d’émergence de
résistance.
Au final, nos résultats montrent qu’un traitement de type métaphylactique est plus
favorable qu’un traitement curatif pour la prévention de l’émergence de bactéries résistantes
au niveau du site infectieux.
Peut-on diminuer les doses de fluoroquinolone en métaphylaxie ?
Lors de notre étude nous avons observé que pour les animaux infectés par un petit
inoculum et traités précocement, l’absence d’émergence de résistance était obtenue avec
une dose de marbofloxacine de 16 mg/kg alors que pour les animaux infectés par le grand
inoculum et traités tardivement, la dose de 64 mg/kg n’était pas suffisante pour éviter
l’émergence de bactéries résistantes. Nos résultats suggèrent qu’il serait possible de
diminuer les doses d’antibiotique lors d’un traitement métaphylactique par rapport à un
traitement curatif, sans pour autant diminuer son efficacité. Cette possibilité serait à évaluer
notamment en termes d’effet sur la flore commensale. Cela dit il convient de rester prudent
dans la mesure où l’on ignore s’il est possible de discriminer les animaux ayant une charge
bactérienne forte ou faible. Des études cliniques en élevage bovin ou porcin sont donc
nécessaires pour établir les relations entre la charge bactérienne et les signes cliniques
avant de pouvoir conclure quant à la diminution des doses en métaphylaxie.
Peut-on remplacer les traitements usuels fractionnés par des administrations uniques
dites « one shot » ?
En médecine vétérinaire les traitements antibiotiques en administration dite « one
shot » sont de plus en plus utilisés. Cependant, nos résultats semblent montrer que
159
Discussion générale
fractionner la dose sur quelques jours limite l’émergence de bactéries résistantes issues des
poumons ainsi que la probabilité de colonisation du tube digestif par la bactérie pathogène.
Cependant, il faut garder à l’esprit que nos études ont été réalisées chez le rat et que les
paramètres pharmacocinétiques de la marbofloxacine chez ces animaux sont différents de
ceux que l’on peut observer chez les espèces cibles notamment du point de vue du temps
de demi-vie d’élimination. Il est possible qu’un traitement « one shot » sur une espèce cible
assure des expositions des flores commensales qui seraient similaires à celles que nous
avons réalisées avec des traitements répétés. Là encore des études cliniques
complémentaires sont nécessaires afin de confirmer nos résultats.
L’influence d’un traitement antibiotique sur la flore du tube digestif
Au cours de notre étude nous avons observé que les différents schémas
posologiques de marbofloxacine administrés n’avaient qu’un impact limité sur la flore
implantée dans le tube digestif des animaux dixéniques avec peu d’émergence de résistance
au niveau de cette flore, confirmant ainsi les résultats obtenus in vitro et in vivo par d’autres
équipes (28, 62, 65, 214). En revanche, nous avons observé la colonisation du tube digestif
des animaux traités par la bactérie présente au niveau du site infectieux pulmonaire, KP,
avec sélection de KP résistantes. Cette colonisation par KP soulève plusieurs questions.
Quel est le rôle de la flore de barrière ?
Notre modèle de rats dixéniques est une simplification de la flore digestive, il
représente une flore dans un contexte de diminution de la flore de barrière. Une flore plus
complète en particulier au niveau de la population anaérobie aurait pu limiter la colonisation
du tube digestif par la bactérie présente au niveau du site infectieux en jouant son rôle de
barrière. Cependant, si certaines fluoroquinolones, comme la ciprofloxacine, n’ont aucun
effet sur la flore anaérobie d’autres peuvent entraîner une diminution plus ou moins
importante de certaines populations bactériennes anaérobies impliquées dans la résistance
à la colonisation (64, 67, 167). N’ayant que peu d’information sur l’impact de la
marbofloxacine sur les différentes populations anaérobies commensales du tube digestif
nous ne pouvons pas exclure que la marbofloxacine puisse engendrer une diminution de
certaines populations anaérobies et donc une réduction de l’effet de flore de barrière. Afin de
confirmer nos résultats il serait donc nécessaire de réaliser cette étude sur des animaux
porteurs d’une flore complète afin de mieux appréhender le rôle de flore de barrière quant à
la résistance à la colonisation par KP.
160
Discussion générale
Où se produit la sélection de KP résistantes ?
L’émergence de la sous-population de KP résistantes a pu se produire soit dans le
tube digestif soit au niveau des poumons. En effet, si cette sous-population résistante n’a
pas été retrouvée dans les poumons, elle a pu y être sélectionnée avant d’être expectorée et
d’atteindre le tube digestif via l’ingestion de mucus contaminé. Cependant, l’émergence de
KP résistantes dans le tube digestif des animaux infectés par le petit inoculum suggère que
l’émergence de résistance a eu lieu au niveau du tube digestif étant donné que chez ces
animaux, contrairement à ceux infectés par le grand inoculum, nous n’avons jamais retrouvé
de KP résistantes dans les poumons. De plus, pour les animaux infectés par le petit
inoculum chez qui nous retrouvons des KP résistantes, la population de KP est beaucoup
plus importante dans le tube digestif que celle implantée au niveau des poumons, i.e.
8.07  1.14 log10 CFU/g de fèces versus 5 log10 CFU/poumon, (Tableau 9, page 136). Etant
donné que la probabilité de présence de bactéries résistantes aux fluoroquinolones
augmente avec la taille de la population bactérienne, la probabilité que l’émergence de KP
résistantes ait eu lieu dans le tube digestif est donc plus importante. Un traitement
antibiotique limitant l’exposition du tube digestif permettrait de limiter l’émergence de KP
résistantes intestinales, c’est pourquoi il semble important de déterminer où se produit
l’émergence de résistance.
La colonisation du tube digestif par KP et KP résistantes est-elle stable ?
La colonisation du tube digestif par la bactérie pathogène présente au niveau du site
infectieux pulmonaire au cours du traitement conduit à la mise en place d’un réservoir au
niveau du tube digestif. Ce phénomène peut conduire à la contamination de l’environnement,
ou d’autres individus, par cette bactérie pathogène, éventuellement résistante. Cela peut
entraîner des conséquences graves, notamment si on se place dans un contexte clinique de
médecine humaine avec le problème des maladies nosocomiales. En effet une fois dans le
tube digestif, la dissémination de la bactérie est beaucoup plus facile entre individus. Dans
ce contexte, la persistance de la bactérie « colonisatrice » dans le tube digestif est
importante. Notre étude n’a suivi l’évolution de la flore que durant 7 jours après l’initiation du
traitement antibiotique, il serait donc intéressant de suivre la persistance de la colonisation
sur une durée plus longue après l’arrêt du traitement. Il est possible en effet que les KP et
surtout les KP résistantes soient éliminées par un effet de compétition avec la flore
commensale normale étant donné que les bactéries résistantes peuvent présenter des
capacités d’adaptation à l’environnement plus faible que les bactéries sensibles (117).
Cependant, même si elles sont éliminées, les bactéries résistantes peuvent rester à des
161
Discussion générale
niveaux indétectables dans le tube digestif et émerger de nouveau lors d’un traitement
antibiotique ultérieur (199).
Conclusion
En conclusion, cette thèse a permis de mettre en évidence qu’un traitement précoce
sur une faible charge bactérienne représentant un traitement de type métaphylactique
n’entraînait pas l’émergence de bactéries résistantes au niveau du site infectieux. L’impact
négatif d’un traitement métaphylactique sur la flore du tube digestif est plus limité que lors
d’un traitement curatif, mais n’est pas nul. Des études complémentaires seraient nécessaires
afin de confirmer ces résultats sur une flore complexe avant de réaliser des études cliniques
en élevage porcin ou bovin, notamment afin de déterminer les schémas posologiques les
plus bénéfiques en termes de sélection de résistance bactérienne pour une antibiothérapie
de type métaphylactique.
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TITRE ET RESUME EN ANGLAIS
TITLE : Influence of factors associated with the metaphylactic use of antibiotics on PK/PD
relationships. Consequences on dosing regimens and on the emergence of resistance.
SUMMARY : Metaphylaxis is a preventive antibiotic treatment initiated on animals infected
by a small bacterial load. Preventive and curative treatments were compared in term of
resistance emergence at both the infection site and the gut flora. In a rat model of Klebsiella
pneumoniae (KP) lung infection, early (preventive) treatments with a fluoroquinolone
(marbofloxacin) on a small bacterial load prevented resistance emergence contrary to later
(curative) treatments on a large inoculum. An original PK/PD index was built to predict
resistance prevention related to various dosage regimens. Treatments of KP lung infections
in dixenic rats demonstrated that the curative ones favoured the colonization of the gut by
pulmonary KP resistant to marbofloxacin.
KEY-WORDS : Fluoroquinolone, Marbofloxacin, Bacterial load, Metaphylaxis, Bacterial
Resistance, Mutant Selection Window, MPC, PK/PD, Commensal Flora, Collateral Damage.
181
AUTEUR : Anne-Sylvie KESTEMAN
TITRE : Influence des facteurs associés à une antibiothérapie de type métaphylactique sur
les
relations
pharmacocinétiques / pharmacodynamiques
(PK/PD)
des
antibiotiques.
Conséquences sur les schémas posologiques et sur l’émergence de résistance.
DIRECTEUR DE THESE : Monsieur le Professeur Pierre-Louis TOUTAIN
CO-DIRECTEURS DE THESE : Monsieur de Docteur Michel LAURENTIE
Monsieur le Professeur Alain BOUSQUET-MELOU
LIEU ET DATE DE SOUTENANCE : Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse
le 14 décembre 2009
RESUME : La métaphylaxie est une antibiothérapie préventive utilisée en médecine
vétérinaire sur des animaux infectés par une faible charge bactérienne. Nous avons comparé
les effets d’antibiothérapies préventives et curatives sur l’émergence de résistances
bactériennes au niveau du site infectieux et de la flore digestive. Dans un modèle d’infection
pulmonaire à Klebsiella pneumoniae (KP) chez le rat, un traitement précoce avec une
fluoroquinolone (la marbofloxacine) sur une faible charge bactérienne a pu prévenir
l’émergence de résistance contrairement à un traitement tardif sur un inoculum plus
important. Un indice PK/PD original a été proposé pour prédire la capacité des schémas
posologiques testés à prévenir la sélection de résistance dans un contexte curatif. Le
traitement d’infections pulmonaires à KP chez des rats dixéniques a montré que l’usage
curatif favorisait la colonisation du tube digestif par des KP pulmonaires résistantes à la
marbofloxacine.
MOTS-CLES :
Fluoroquinolone,
Marbofloxacine,
Charge
bactérienne,
Métaphylaxie,
Résistance Bactérienne, Fenêtre de Sélection, MPC, PK/PD, Flore Commensale,
Dommages collatéraux.
DISCIPLINE ADMINISTRATIVE : Pharmacologie
INTITULES ET ADRESSE DES LABORATOIRES :
UMR181 Physiopathologie et Toxicologie Expérimentales, ENVT
23 Chemin des Capelles,
BP 87614,
31076 TOULOUSE Cedex 3
Laboratoire d’Etudes et de Recherches des Médicaments Vétérinaires et Désinfectants,
AFSSA Fougères,
La Haute Marche, BP 90203,
35302 Javené, FOUGERES