T H È S

THÈSE
En vue de l'obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE
Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier
Discipline ou spécialité : Immunologie
Présentée et soutenue par Ludovic MARTINET
Le 18/12/2008
Titre : Régulation des réponses effectrices des lymphocytes T
par les cellules du stroma tumoral
JURY
Pr. Roland LIBLAU Président du jury
Dr. Nathalie ROUAS-FREISS Rapporteur
Pr. Jean-François MOREAU Rapporteur
Dr. Karin TARTE Examinateur
Dr. Philippe BOURIN Examinateur
Dr. Remy POUPOT Directeur de thèse
Ecole doctorale : Biologie Santé
Unité de recherche : INSERM U563
Directeur(s) de Thèse : Dr. Remy POUPOT
Rapporteurs : Dr. Nathalie ROUAS-FREISS
Pr. Jean-François MOREAU
Je dédie ce travail
à Emilie, la femme de ma vie
à mes parents Christian et Danie
à ma sœur Laure
Remerciements
Même si en règle générale je préfère témoigner ma reconnaissance oralement aux personnes
qui me soutiennent ou qui m’apportent joie et bonne humeur je vais tout de même essayer de
remercier dans les quelques lignes qui vont suivre toutes les personnes qui ont compté pour
moi durant ces 3 années de doctorat.
Je tiens à remercier le Professeur Roland Liblau qui m’a fait l’honneur de présider le jury de
cette thèse.
Je remercie également le docteur Nathalie Rouas-Freiss ainsi que le Professeur Jean-françois
Moreau d’avoir accepté d’être les rapporteurs de cette thèse.
Je remercie également le docteur Karin Tarte et le docteur Philippe Bourin d’avoir accepté
d’être examinateur de cette thèse.
Mes remerciements s’adressent également au Professeur Joost Van Meerwijk pour m’avoir
permis d’intégrer le M2R d’immunologie de Toulouse et pour m’avoir transmis la passion de
l’immunologie au travers des enseignements de qualité qui m’ont été offerts durant cette
formation.
Je tiens à exprimer toute ma reconnaissance à mon directeur de thèse Remy Poupot qui a su
me faire confiance et me conforter dans l’ensemble de mes choix scientifiques depuis le M2R.
Je le remercie également pour sa franchise, son ouverture d’esprit et pour la liberté
intellectuelle qu’il m’a laissé durant mon doctorat.
Je remercie mon directeur de thèse le docteur Jean-jacques Fournié pour m’avoir accueilli
depuis le M2R dans son équipe. Je suis également reconnaissant de sa disponibilité, de sa
gentillesse quotidienne et de son humour.
Je remercie l’ensemble des membres de l’équipe Immunité et Hémopathies malignes :
Mary et Séverine pour les nombreuses discussions que nous avons pu avoir sur divers sujets
durant les 4 années où nous avons partagé le même bureau.
Delphine et les ex-JJF Julie, Damien et Baptiste pour tous les bons moments passés en leur
compagnie dans le labo.
La nouvelle génération de doctorant Charlotte, Aude-Hélène et Nico pour leur bonne humeur
quotidienne. Je vous souhaite plein de manip réussies pour les 2 ans à venir.
Chris J pour sa gentillesse dans toutes les situations et Chris B pour son humour et son
énergie.
Anne pour son soutien et pour l’aide qu’elle apporte à toute l’équipe.
Tous les autres membres de l’ex-équipe Guy Laurent, Loïc, les Emilie, Emilie-Fleur et Samar.
Je remercie mon ami Gilles Dietrich pour m’avoir initié aux Emit, pour avoir su m’écouter,
me conseiller et me motiver quand il le fallait ainsi que pour sa franchise scientifique.
Je remercie mon ami Alan Benard, le célèbre nageur breton, pour nous avoir fait découvrir,
Emilie et moi, le Badminton qui occupe maintenant une bonne partie de notre temps libre. Je
lui dédicacerai ma médaille aux J.O vétérans de 2040.
Je remercie toutes les personnes des équipes Delsol et Payrastre qui se reconnaitront pour tous
les bons moments passés à l’heure du déjeuné dans la salle repas.
Je tiens également à remercier le Dr Abdel Saoudi et le professeur Roland Liblau pour toutes
les excellentes sessions d’immunologie auxquelles ils m’ont permis d’assister et de participer
tous les matins.
Je remercie les membres de l’EFS, le docteur Philippe Bourin, Sandrine Capellesso et
Mélanie Gadelorge pour leur aide précieuse concernant l’isolation et la culture des MSC sans
laquelle je n’aurais pu réaliser mes recherches.
Je remercie également le nouveau directeur du Stem cell laboratory du Weill Cornell Medical
College de Doha, le Dr Arash Rafii pour son implication dans le projet Hospicell, pour sa
motivation, pour sa sympathie et la confiance qu’il témoigne aux personnes qui travaillent
avec lui. Je remercie également son fidèle collaborateur dans cette aventure qatari, Raphaël lis
pour sa grande qualité scientifique et son humour décalé. J’ai beaucoup apprécié les
discussions scientifiques que nous avons partagées l’année passée.
Je remercie également le Dr Massoud Mirshahi pour avoir collaboré avec notre équipe sur le
projet Hospicell ainsi que Pejman Mirshahi pour le travail qu’il réalise sur l’isolation des
Hospicell.
Enfin, je remercie tous les gensériens, Théo, Alex, Dams, Nico, Dimi, Thomas, Louan …..
pour m’avoir permis de décompresser en répondant présent à chacun de mes retours en
Charente Maritime.
ABREVATIONS ET ANGLICISMES………………….…...………5
LISTE DES FIGURES………………………………………………7
INTRODUCTION…………………………………………………....9
I. Immunosurveillance et immunité antitumorale…………………..11
I.1 Preuves de l’immunosurveillance antitumorale……………………………...………..11
I.2 L’Immunité adaptative antitumorale………………………………………...……..….13
I.2.1 Immunité antitumorale assurée par cellules T αβ………………..……….....14
αβ
2.1.1 Génération des lymphocytes T effecteurs…………………………...……………………….14
2.1.2 Les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques………………………………..……….. ...…….17
2.1.3 Les Lymphocytes T CD4+ ………………………………………………………..…..….……20
I.3 Immunité innée et immunité antitumorale……………………………...………..……24
I.3.1 Cellules dendritiques……………………………………………………..…....24
3.1.1 Biologie des DC………………………………………………………………………..……..….24
3.1.2 Signaux à l’origine de l’activation des DC………………………………………………..…25
I.3.2 Cellules NK…………………………………………………………...……...…27
3.2.1 Cellules NK et immunité antitumorale………………………………………………….….…27
3.2.2 Contrôle de l’activation des cellules NK ……………………………………………….……28
I.3.3 Les lymphocytes T γδ.…………………………………………………..……..35
γδ.
3.3.1 Developpement des lymphocytes T γδ……………………………………………………… 35
3.3.2 Réactivité des lymphocytes T Vγ9Vδ2………………………………………….…………….36
3.3.3 Mécanismes de reconnaissance des PAg par les lymphocytes T Vγ9Vδ2……………..…39
3.3.4 Sous populations de lymphocytes T Vγ9Vδ2……………………………………………....…41
3.3.5 Les lymphocytes T Vγ9Vδ2 et l’immunosurveillance anti-tumorale……………………...43
II. Echappement des cancers aux réponses immunitaires……...……46
II.1 Concept d’ « immunoediting »…………………………………………………………46
II.2 Altération de l’expression des molécules de CMH……………………………………49
II.3 Modulation de l’expression de l’antigène. ……………………………………..…..…50
II.4 Résistance à l’apoptose. ………………………………………………..………………50
II.4.1 Résistance à l’apoptose initiée par les recepteurs à domaine de mort….....50
II.4.2 Résistance à la mort induite par perforine/granzyme……………………...51
1
II.5 Production de facteurs immunosuppresseurs. ……………………………………….52
II.5.1 Le TGF-β
β ………………………...……………………………..….………….52
II.5.2 L’Interleukine 10…………………………………………...…………...……54
II.5.3 L’Indoléamine 2,3-dioxygénase…………………………………..….....……54
II.5.4 Expression des molécules de CMH I non classiques HLA-G………...…….55
II.5.5 Interaction entre PD-1 et PD-L1/ PD-L2………………………………....…58
II.5.6 Rôle des galectines…………………………………………………….…..….59
II.5.7 Expression de FasL et TRAIL……………………………………...…..……61
II.5.8 La Prostaglandine E2……………………………………………………..…..62
5.8.1 Synthèse de la PGE2……………………………………………………………………………..62
5.8.2 Récepteurs à la PGE2……..……………………………………………………………….……63
5.8.3 PGE2 et immunité….…………………………………………………………….….………..….64
5.8.4 PGE2 et tumeurs…………………………………………………………………………..……..66
III. Cellules du microenvironnement Tumoral et Immunité………..68
III.1 Les Fibroblastes associés aux cancers (CAF).……………………………..……..…68
III.2 Les Macrophages associés aux tumeurs (TAM)….………………………………….70
III.2.1 Recrutement des TAM………………………………………………………70
III.2.2 Phénotype des TAM durant la progression tumorale………………...…...71
III.2.32 Rôle des TAM dans la progression tumorale………………………..……72
III.3 DC associées aux tumeurs………………………………………...……………...……74
III.4 Les cellules suppressives myéloïdes (MDSC)..……………………..……………...…76
III.4.1 Accumulation de cellules myéloïdes immature dans les cancers…………76
III.4.2 Mécanismes d’immunosuppression par les MDSC…………………......…77
III.5 Les lymphocytes T CD4+CD25+ régulateurs. …………………………………..……78
III.5.1 Treg et tumeurs. …………………………………………………….....……78
III.5.2 Mécanismes d’accumulation des Treg dans les tumeurs. ……………..…79
III.5.3 Signaux inhibiteurs délivrés par les Treg. ………………………….……...81
III.6 Les Cellules souches mésenchymateuses (MSC)..……………………………....……83
III.6.1 Découverte et caractéristiques des MSC…………………………... ….…..83
III.6.2 Propriétés immunomodulatrices des MSC ………………………….…….85
III.6.3 Mécanisme d’immunosuppression médié par les MSC………………...…86
III.6.4 MSC et tumeurs……………………………………………………...…...….87
2
MATERIEL ET METHODES.……………………………………..89
RESULTATS………………………………………………..……..101
I. Régulation des réponses effectrices des lymphocytes T Vγγ9Vδ
δ2
par les cellules souches mésenchymateuses…………………………….......103
II. Régulation des réponses immunitaires T par un nouveau type
cellulaire isolé à partir du stroma de cancers ovariens : les HOSPICEL..117
DISCUSSION……………………………………………….......…125
I. La PGE2 dans la régulation des réponses T Vγγ9Vδ
δ2……...…...…127
I.1 La PGE2 dans la régulation des réponses antitumorale des cellules T Vγγ9Vδ
δ2…....127
I.2 La PGE2, un régulateur des réponses anti-infectieuses des cellules T Vγγ9Vδ
δ2. ...…128
I. 3 Signalisation de la PGE2 dans les lymphocytes T Vγ9
γ9Vδ2.
γ9 δ2.……….………...……….129
δ2.
II. Les MSC dans la régulation des réponses immunitaires…….….130
II.1 Mécanisme d’inhibition des réponses T Vγγ9Vδ
δ2 par les MSC………………...…...130
II.2 Régulation des réponses T Vγγ9Vδ
δ2 par les MSC in vivo………………………....…132
III. Rôle des MSC dans les cancers…………………………………..132
III.1 Les MSC dans le microenvironnement tumoral……………………………….…...132
III.2 Rôle du VEGF et de l’IL-6 produits par les MSC dans le développement
tumoral……………………………………………………………………………………...134
III.3 Rôle du VEGF et de l’IL-6 dans l’inhibition des réponses antitumorales……......135
III.4 Cellules souches et immunosuppression……………………………..…………...…136
IV. Hospicell et réponses immunitaires antitumorales…………......137
IV.1 Régulation des réponses immunitaires antitumorales par les Hospicell………….137
IV.2 Mécanisme d’inhibition des réponses lymphocytaires T par les Hospicell…….....138
IV.3 Rôle des Hospicell dans la dissémination péritonéale des cancers de l’ovaire...….140
3
IV.4 Origine des Hospicell………………………………………………………...……….141
CONCLUSION GENERALE.…………………………………….143
BIBLIOGRAPHIE………………………………………...………147
4
ABREVIATIONS ET ANGLISCISMES
ABP, aminobiphosphonate
ADCC, cytotoxicité cellulaire dépendante de l'anticorps
Ac, anticorps
Ag, antigen
AML, Acute Myeloid Lymphoma
ApoA1, apolipoprotein A1
AS, ATP synthase
BrHPP, pyrophosphate de bromohydrine
CFU-F, Colony Forming Units-Fibroblast
CMH, complexe majeur d’histocompatibilité
CPA, cellules présentatrices d’antigène
CTL, lymphocytes T cytotoxiques
DAMP, Damage Asociated Molecular Pattern
DC, dendritic cell
DMAPP, dimethylallyl pyrophosphate
DOXP, 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate
FGF, Fibrobast growth factor
Fc, Fragment constant
GVHD, Graft Versus Host Desease
HDMAPP, 4-hydroxy-3-dimethylallyl pyrophosphate
HEV, High Endothelial Veinule
HGF, Hepatocyte Growth Factor
HSP, Heat Shock Protein
IDO, Indeolamine 2,3 Dioxygenase
IFN, Interféron
IL, Interleukine
iMC, Cellules Myéloïdes immatures
IPP, isopentenyl pyrophosphate
ITAM, Immunoreceptor Tyrosine-based Activatory Motif
ITIM, Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibitory Motif
KIR, Killer Immunoglobulin like Receptor
LT, Lymphocyte T
5
mAb, monoclonal antibody
MCA, Methylcholanthrene
MDSC, Meloid Derived Suppressor Cell
MIC, MHC class I chain related protein
MSC, Mesenchymal Stem Cell
MVA, mevalonate
NCR, Natural Cytotoxicity Receptor
NK, Natural Killer
NO, oxyde nitrique
PAg, phosphoantigène
PAMP, Pathogen associated Molecular Pattern
PBMC, Periferal Blood Mononuclear Cells
pDC, DC plasmacytoïde
PDGF, Platelet Derived Growth Factor
PG, Prostaglandine
PKA, Protéine Kinase A
ROS, espèces réactives de l’oxygène
SDF-1, Stroma Derived Factor-1
TCR, T Cell Receptor;
TIL Tumor Infiltrating Lymphocytes
TGF, Tumor Growth Factor
TLR, Toll Like Receptor
TNF, Tumor Necrosis Factor
TRAIL, Tumor necrosis factor Apoptosis Inducing Ligand
ULBP, UL16-Binding Protein
VEGF, Vascular Endothelial Growth Factor
6
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Libération des médiateurs cytotoxiques au niveau du domaine de sécrétion de la
synapse immunologique.
Figure 2 : Rôle central des lymphocytes T CD4+ dans la mise en place des réponses
immunitaires antitumorales.
Figure 3 : Modèle d’activation des DC basé sur la reconnaissance de signaux étrangers ou de
danger dans le microenvironnement.
Figure 4 : La balance entre les signaux activateurs et inhibiteurs reçus par les NK détermine
l’issu de leur rencontre avec les cellules cibles.
Figure 5 : Voies de signalisation initiées par les principaux récepteurs activateurs et
inhibiteurs NK humains.
Figure 6 : Régulation des réponses immunitaires adaptatives et innées par les NK.
Figure 7 : Biosynthèse des PAg.
Figure 8 : Les sous populations de lymphocytes T Vγ9Vδ2.
Figure 9 : Potentiel antitumoral des lymphocytes T Vγ9Vδ2 humains.
Figure 10 : Les trois phases du processus d’immonediting des cancers.
Figure 11 : L’altération de l’expression des molécules de CMH I permet aux cellules
tumorales d’échapper à la destruction par les CTL.
Figure 12 : Effets pleiotropes exercés par le TGF-β1 sur les différentes cellules de
l’immunité.
Figure 13 : Mécanismes d’inhibition de l’immunité antitumorale par HLA-G.
Figure 14 : Mécanismes d’inhibition de l’immunité antitumorale par PD-L1.
Figure 15 : Mécanismes d’inhibition de l’immunité antitumorale par les galectines.
Figure 16 : Voies de signalisation initiées par les recepteurs à la PGE2 EP1-4.
Figure 17 : Modulation des réponses immunitaires par la PGE2.
Figure 18 : Rôle des TAM dans le developpement tumoral.
Figure 19 : Mécanismes d’immunosuppression induits par l’accumulation de cellules
dendritiques immatures et de cellules myeloides suppressives chez les patients atteints de
cancers.
7
Figure 20 : Mécanismes d’accumulation des Treg dans les tumeurs.
Figure 21 : Mécanismes d’action des Treg.
Figure 22 : Capacité des MSC à se différencier en diverses cellules des lignages
mesodermique, ectodermique et endodermique.
Figure 23 : Mécanismes permettant aux MSC d’exercer leurs fonctions immunosuppressives.
Figure 24 : Les MSC favorisent le développement de tumeurs dans les souris SCID/beige.
Figure 25 : Les cellules T Vγ9Vδ2 augmentent la sécrétion d’IL-6 et de VEGF par les MSC.
Figure 26 : Réponses effectrices des lymphocytes T Vγ9Vδ2 en présence de PGE2.
Figure 27 : La PGE2 inhibe l’activation du potentiel cytolytique des cellules NK médiée par
les récepteurs NCR, CD16 et NKG2D.
Figure 28 : La fixation de la PGE2 sur les récepteurs EP2 et EP4 inhibe l’activation des NK.
Figure 29 : L’activation de la Proteine Kinase A de type I inhibe l’activation des NK induite
par les récepteurs NCR, CD16 et NKG2D.
Figure 30 : L’inhibition de la PKA I réverse les effets de la PGE2.
Figure 31 : Isolation of Hospicell.
Figure 32 : Electronic microscopy analysis of ovarian cancer aggregates and primocultures of
Hospicell and OVCAR3.
Figure 33 : Specific interaction between OVCAR3 cells and Hospicell.
Figure 34 : Chemoresistance induced by Hospicell.
Figure 35 : Clinical relevance of the presence of Hospicell among ovarian primary tumors.
Figure 36 : Rôle des MSC dans le microenvironnement tumoral.
Table I : Les souris immunodéficientes ont une suceptibilité accrue à devevelopper des
tumeurs.
Table II : Amélioration des réponses T antitumorales par le ciblage des molécules de costimulation de la famille du TNFR.
Table III : Molecular characterization of Hospicell.
8
INTRODUCTION
9
10
I. Immunosurveillance et immunité antitumorale
I.1 Preuves de l’immunosurveillance antitumorale
L’idée du rôle du système immunitaire dans la reconnaissance et dans la destruction
des tumeurs fut émise pour la première fois au 19éme siècle par William Coley, un chirurgien
du Mémorial Sloan-Kettering Cancer Center à New York qui s’était aperçu que les rares cas
de régressions spontanées de tumeurs étaient souvent précédés d’épisodes infectieux 1.
Toutefois, les essais réalisés par Coley et ses collègues pour stimuler le système immunitaire
contre les tumeurs à l’aide d’extraits bactériens restèrent infructueux.
Ce n’est qu’en 1909, que le concept d’immunosurveillance des cancers fut envisagé
par Paul Ehrlich. A l’époque, il émit l’hypothèse que des tumeurs pouvaient apparaître de
manière continuelle dans le corps humain et que le système immunitaire devait reconnaître et
détruire ces tumeurs avant que celles-ci soient cliniquement observables 2. L’idée d’un
contrôle par le système immunitaire de maladies néoplasiques donna naissance à d’intenses
débats et l’hypothèse d’Erlich dut attendre un demi-siècle et l’apparition des souris
congéniques pour être prise en considération. La démonstration que des souris pouvaient être
immunisées contre des tumeurs syngéniques induites par des agents carcinogènes permit
d’établir de manière irréfutable l’existence d’antigènes spécifiques de tumeurs et donna une
raison de croire en l’hypothèse d’Erlich 1. En effet, l’immunosurveillance antitumorale ne
peut exister sans la présence de structures permettant la reconnaissance spécifique des cellules
tumorales par le système immunitaire. Ces observations furent reprisent par Burnet et
Thomas, et formèrent les bases de leur théorie d’immunosurveillance antitumorale
3, 4
.
Selon cette théorie le développement de carcinomes spontanés est continuellement réprimé
par le système immunitaire en raison de la présence d’antigènes spécifiques sur ces tumeurs.
Pour Thomas, la présence d’un système de reconnaissance des tumeurs serait une nécessité au
moins aussi importante que le système de défenses anti pathogènes pour la survie
d’organismes complexes à durée de vie longue comme les vertébrés à sang chaud.
De nombreuses expériences furent ensuite réalisées afin de confirmer cette théorie et
sa conséquence logique à savoir qu’en l’absence de système immunitaire, une augmentation
de fréquence d’apparition de tumeurs spontanées ou induites devrait être observée. Les
travaux conduits dans ce sens par différents groupes sur les souris « nude » démontrèrent qu’il
n’y avait pas d’augmentation statistiquement significative du nombre de cancers spontanés
non induits par des agents viraux 5. A l’époque le manque de connaissances précises sur les
11
anomalies immunitaires dont souffrent les souris nude et les résultats très convaincants
obtenus sur ces souris firent abandonner l’idée de l’immunosurveillance antitumorale. Avec
du recul on sait maintenant que ces expériences comportaient d’importantes lacunes. Tout
d’abord, s’il est vrai que ces souris ont moins de cellules T que les souris sauvages, il subsiste
néanmoins une population détectable de lymphocytes T αβ fonctionnels 6. Il est donc
impossible de prédire le rôle de ces cellules dans l’élimination de tumeurs en comparaison
aux souris sauvages. Enfin et surtout, ces études furent conduites avant la découverte d’autres
populations lymphocytaires comme les cellules NK et γδ dont le développement peut se faire
en l’absence de thymus 7.
Table I : Les souris immunodéficientes ont une suceptibilité accrue à devevelopper des tumeurs. Tiré de Dunn et
al, Nature Rev Immunol, 2006 8.
L’idée du rôle du système immunitaire dans la surveillance et la destruction de tumeur
resurgit au début des années 90 avec la génération de souris transgéniques permettant
12
l’inactivation de compartiments immunitaires de manière spécifique. Ainsi de nombreuses
études ont pu démontrer que de nombreuses souches de souris Knock Out (KO) pour divers
composants de l’immunité innée ou adaptative ont un risque accru de développer des tumeurs
spontanées ou induites par des agents carcinogènes 8 (voir table I).
Chez l’humain, l’existence d’une immunosurveillance antitumorale, est appuyée par
plusieurs études rétrospectives démontrant une fréquence d’apparition de tumeurs accrue chez
les individus immunodéprimés ou immunodéficients 9, 10.
Pour faciliter la compréhension des différents mécanismes mis en place par
l’organisme pour reconnaître et combattre les tumeurs les différents acteurs de l’immunité
sont classés en 2 catégories : l’immunité adaptative et l’immunité innée. Pour autant
l’ensemble des connaissances actuelles dans ce domaine suggère que l’immunosurveillance
antitumorale est un processus complexe impliquant l’action concertée des différents effecteurs
immunitaires en fonction de la localisation, du type de transformation et du type de tumeur.
I.2 L’Immunité adaptative antitumorale
La première démonstration formelle du rôle de l’immunité adaptative dans les
défenses immunitaires antitumorales provient d’expériences réalisées par l’équipe de
Schreiber en 2001 sur des souris mutées sur le géne « recombination–activating gene 2 »
(RAG2). L’inactivation de ce gène qui est exprimé uniquement dans les lymphocytes et qui
est nécessaire au réarrangement V(D)J des chaînes du récepteur des lymphocytes T (TCR)
et du récepteur des lymphocytes B (BCR) empêche la génération de lymphocytes B, T αβ ,
NKT et T γδ matures dans ces souris 11. Les auteurs ont pu démontrer que ces souris RAG2
KO développaient plus rapidement et plus fréquemment des tumeurs induites par le
méthylcholanthrène que les souris sauvages. Ainsi, après 160 jours 30/52 souris RAG2-/développaient des tumeurs contre 11/57 pour les souris sauvages. Par ailleurs, ces souris
immunodéficientes pour les compartiments lymphocytaires T et B développaient des tumeurs
spontanées avec une fréquence accrue. En effet 26/26 de ces souris RAG2-/- âgées de 13 à 24
mois contractaient des cancers spontanés contre seulement 5/20 pour les souris de type
sauvage 12. Ces expériences, certes réalisées sur la souris, mettent en évidence le rôle crucial
que joue le compartiment immunitaire adaptatif dans les défenses contre des tumeurs qui se
développent de manière spontanée ou qui sont induites par des agents chimiques 13.
Par la suite, de nombreuses études ont étendu ces observations en identifiant quels
lymphocytes RAG2-dépendants pouvaient contribuer aux défenses antitumorales. Ces travaux
13
ont mis en avant un rôle important des populations T αβ, T γδ et NKT dans le processus
d’immunosurveillance antitumorale. Les lymphocytes T γδ de par leurs caractéristiques
fonctionnelles et phénotypiques sont considérées comme étant à la frontière de l’immunité
innée et adaptative et pour des raisons didactiques seront décrites dans le paragraphe consacré
à l’immunité innée.
Même si la présence d’anticorps dirigés contre les cellules tumorales est fréquemment
retrouvée dans le sérum de patients atteints de cancers, ces anticorps sont souvent dirigés
contre des composants intracellulaires relargués par les cellules mourantes et sont rarement
associés à une activité tumoricide ou à un pronostic favorable chez ces patients 14. Par ailleurs,
plusieurs modèles de tumeurs chez la souris suggèrent que les lymphocytes B et molécules
qu’ils sécrètent pourraient inhiber le rejet de tumeurs et favoriser le développement de cancers
15, 16
. Globalement, ces données indiquent que même si une réponse humorale médiée par les
lymphocytes B contre les tumeurs peut être observée, à l’heure actuelle peu de données
indiquent qu’elle soit impliquée dans l’immunosurveillance antitumorale. Pour ces raisons je
ne détaillerai pas par la suite la population lymphocytaire B.
I.2.1 Immunité antitumorale assurée par les cellules T αβ
2.1
2.1.1 Génération des lymphocytes T effecteurs
La majorité des lymphocytes T (LT) circulant (95%) expriment un TCR formé par
l’association de deux chaines proteiques, α et β, leur permettant de reconnaître des antigènes
peptidiques présentés par des molécules du CMH de classe I pour les LT CD8+ ou de classe
II pour les LT CD4+. On estime à 108 le nombre de lymphocytes T naïfs portant un TCR
avec une spécificité différente à un temps donné dans le corps humain. Ainsi, afin de générer
un nombre suffisant de lymphocytes T spécifiques d’un antigène lors d’une infection ou du
développement d’une tumeur, les clones T naïfs spécifiques de l’antigène en question doivent
dans un premier temps être activés et proliférer ; processus appelé expansion clonale. De plus,
les cellules T αβ naïves sont dépourvues de fonctions effectrices immédiates qui seront
acquises suite à leur différenciation en effecteurs lors de l’étape de prolifération clonale 17.
Les lieux privilégiés de rencontre entre un lymphocyte T αβ naïf et son antigène sont
les organes lymphoïdes secondaires (les ganglions lymphatiques, les plaques de Peyer et la
rate). Les lymphocytes T αβ naïfs circulent continuellement du sang périphérique vers les
ganglions lymphatiques à la recherche de leurs antigènes spécifiques. En effet, ils expriment à
14
leur surface un ensemble de récepteurs qui les attirent vers ces organes et qui leurs permettent
de pénétrer dans ceux-ci. Le principal récepteur impliqué dans le chimiotactisme des
lymphocytes T naïfs vers les ganglions lymphatiques est CCR7 18. Il permet aux lymphocytes
de répondre aux chimiokines CCL21 et CCL19 respectivement produites par les cellules
endothéliales des vaisseaux sanguins lymphatiques appelées HEV (High Endothelium
Veinule) et par les cellules stromales entourant ces structures. Par la suite le récepteur CD62L
(L-selectine) va permettre le ralentissement et le roulement des lymphocytes le long de la
paroi des HEV et permettre l’entrée de ceux-ci dans les ganglions lymphatiques
18
. Les
lymphocytes T naïfs entrant dans les ganglions lymphatiques vont se localiser dans les zones
T et entrer en contact avec les nombreuses DC présentes dans ces zones. Ces cellules
présentatrices d’antigène professionnelles qui jouent le rôle de sentinelle du système
immunitaire, migrent continuellement vers les ganglions lymphatiques pour présenter aux
lymphocytes T αβ les antigènes captés dans les tissus périphériques et initier la réponse T
adaptative 19. Dans le chapitre qui sera consacré aux DC je développerai plus précisément les
processus de maturation à l’origine de la migration de ces cellules vers les organes
lymphoïdes secondaires et la capacité de ces cellules à reconnaître et capter des antigènes
tumoraux pour activer les lymphocytes T αβ.
La reconnaissance des complexes CMH-peptides par le TCR délivre le premier
signal nécessaire à l’activation des lymphocytes T αβ naïfs. Les résidus tyrosines des motifs
ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activatory Motif) des chaînes non polymorphes
CD3 associées au TCR sont rapidement phosphorylées suite à l’engagement de celui-ci. Cette
phosphorylation est réalisée majoritairement par la protéine tyrosine kinase lck de la famille
des Src qui est associée au domaine intracellulaire des corécepteurs CD4 et CD8. Il est à
noter que les corécepteurs CD4 et CD8, grâce à leurs interactions respectives avec les
molécules de CMH II et I, jouent également un rôle important dans l’activation des
lymphocytes T αβ en augmentant la stabilité de l’interaction peptide-CMH-TCR 17.
La seule activation par le TCR n’est pas suffisante pour initier le processus
d’expansion clonale des lymphocytes T naïfs et permettre leur différenciation en effecteur 17.
En effet, les capacités prolifératives des lymphocytes T sont principalement contrôlées par
leur capacité à produire et à répondre à l’IL-2, principale cytokine impliquée dans la
prolifération des lymphocytes T activés. Si l’expression de la chaîne de haute affinité du
récepteur à l’IL-2 (CD25) peut être induite sur les lymphocytes T naïfs par l’engagement du
TCR seul, la production d’IL-2 est contrôlée de manière très stringente et nécessite donc la
présence d’un second signal, dit de costimulation
20
. En l’absence de signal de costimulation
le lymphocyte T entre dans un état appelé état d’anergie durant lequel il ne peut être réactivé
15
ni même sécréter de l’IL-2 20. La molécule de surface CD28 a été identifiée comme étant le
principal récepteur de costimulation des lymphocytes T
21
. L’engagement de CD28 par ses
ligands CD80 et CD86 sur la cellule présentatrice de l’antigène conduit à l’amplification du
signal TCR via le recrutement et la phosphorylation de tyrosines kinases de la famille des Src
21
. Ainsi CD28 régule le seuil d’activation des lymphocytes T permettant d’abaisser
considérablement le nombre de TCR engagés nécessaires pour induire celle-ci. CD28 permet
également le recrutement de la sous unité catalytique P85 de la PI3K qui par la suite conduit à
l’activation de la serine/threonine kinase Akt et du facteur de transcription NFκB nécessaire à
la production optimale d’IL-2 par le lymphocyte T 21. Par ailleurs CD28 permet la dégradation
des inhibiteurs de cycle cellulaire INK4 et Kip1 et l’augmentation de l’expression de la
protéine anti apoptotique BclxL nécessaire à la survie et à la prolifération des lymphocytes T
naifs 21.
Plus récemment d’autres molécules exprimées plus tardivement par les lymphocytes T
CD4+ et CD8+ activés, appartenant aux membres de la superfamille du TNF-TNFR, ont été
impliqué dans la survie, la prolifération des lymphocytes T ainsi que dans la génération des
cellules mémoires. Ces molécules, dont les principaux représentants sont CD27, OX40, 41BB, CD30 et HVEM (Herpus-virus entry mediator), font actuellement l’objet d’intenses
recherches de par leurs capacités à améliorer les réponses T antitumorales dans divers
modèles (voir table II) 22.
Table II : Amélioration des réponses T antitumorales par le ciblage des molécules de co-stimulation de la
famille du TNFR. Tiré de Croft et al, Nature Rev Immunol, 200322.
16
2.1.2 Les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques
a. Lymphocytes T CD8+ cytotoxiques et immunosurveillance antitumorale
De nombreuses études réalisées ces 20 dernières années démontrent que les
lymphocytes T CD8+, aussi appelés lymphocytes T cytotoxiques (CTL), jouent un rôle
prépondérant dans les défenses immunitaires antitumorales.
Dès le début des années 80, l’étude des populations cellulaires impliquées dans le rejet
de tumeurs implantées dans des souris syngéniques immunisées contre ces mêmes tumeurs a
permis de mettre en évidence l’importance des CTL dans le processus d’élimination de
tumeurs
23, 24
. Une preuve irréfutable du rôle de ces lymphocytes dans les défenses
antitumorales fut apportée quelques années plus tard par l’identification d’antigènes
tumoraux reconnus chez la souris puis chez l’homme par les CTL grâce à l’obtention de
clones lysant spécifiquement certaines tumeurs
25
. Plus récemment, de nombreuses études
cliniques sur différents types de cancers ont démontré que la présence de CTL infiltrant les
tumeurs constituait un facteur pronostic indépendant de survie à long terme des patients 26-31.
b- Fonctions effectrices des lymphocytes T CD8+
La principale propriété des lymphocytes T CD8+ est leur capacité à reconnaître et à
détruire les cellules qui expriment à leur surface leur antigène spécifique présenté par les
molécules de CMH I. Les lymphocytes T cytotoxiques utilisent deux mécanismes pour
induire la mort des cellules tumorales : l’exocytose de granules cytotoxiques et l’apoptose
induite par des récepteurs de mort 32.
La voie de mort par exocytose est médiée par un ensemble de molécules
cytotoxiques stockées dans des granules sécrétoires cytoplasmiques. Les protéines les plus
abondamment retrouvées dans ces granules cytotoxiques sont les granzymes et la perforine
mais ils contiennent également un ensemble d’enzymes lysosomiales 33.
Les granzymes correspondent à une famille de sérine protéases synthétisées sous
forme de pro-enzymes activées par protéolyse. Les CTL issues de souris déficientes en
granzyme ont des capacités cytotoxiques sévèrement réduites ce qui démontre le rôle clef de
cette famille de protéines dans l’induction de mort par les lymphocytes T CD8+
34
. Les
granzymes A, B, H et K sont exprimés par les CTL humains mais les formes A et B sont
largement majoritaires dans les granules cytolytiques 33. Granzyme B est le seul membre de la
famille des granzymes à avoir un clivage protéolytique préférentiel lui permettant l’activation
17
directe de protéines de la famille des caspases 33, protéines connues pour jouer un rôle crucial
dans les processus d’induction d’apoptose. Il a notamment été démontré in vitro et in vivo que
le Granzyme B pouvait initier l’apoptose des cellules cibles suite au clivage de la caspase 3 et
de la caspase 8 35. Cependant, le granzyme B peut agir de manière indépendante des caspases
par l’activation de BID, une protéine pro-apoptotique de la famille Bcl2, conduisant au
relargage de cytochrome c par les mitochondries 32.
Même si les CTL issus de souris déficientes en granzyme B présentent des capacités
cytotoxiques réduites in vitro, en comparaison aux CTL issus de souris sauvages 36, les souris
déficientes en granzyme B n’ont pourtant pas de susceptibilité accrue aux infections virales et
ne développent pas plus de tumeurs que les souris sauvage, contrairement aux souris
déficientes en granzyme A qui sont hautement susceptibles aux infections par les poxvirus 37.
Ces données indiquent que le granzyme A participe également à l’induction d’apoptose par
les CTL. L’étude des mécanismes de mort induit par le Granzyme A a par ailleurs permis de
démontrer que le Granzyme A agit indépendamment des caspases pour induire une nouvelle
forme d’apoptose 32.
Si les granzymes A et B sont des effecteurs indispensables à l’induction de mort par le
relargage de granules cytotoxiques, leur action semble dépendre exclusivement d’une autre
protéine présente en importante quantité dans ces granules : la perforine. En effet, les souris
génétiquement déficientes en perforine sont caractérisées par une immunodéficience sévère et
une incapacité à se défendre contre des infections virales
38
ou des tumeurs chimioinduites 39.
L’hypothèse qui prédomine jusqu’à présent concernant le mode d’action de la perforine
repose sur sa capacité à induire la formation de pores membranaires sur la cellule cible par
une homo-polymérisation dépendante de la présence de calcium. Ces pores formés par la
perforine ne semblent pas pouvoir induire une lyse directe de la cellule cible mais pourraient
plutôt permettre la pénétration des granzymes dans le cytosol
40
. Toutefois ce modèle est
remis en question car la taille des pores formés par la perforine aux concentrations retrouvées
dans le milieu extracellulaire après exocytose semble trop petite pour permettre l’entrée des
granzymes dans la cellule cible 41. Par ailleurs, plusieurs études démontrent que les granzymes
peuvent pénétrer dans la cellule en l’absence de perforine
42, 43
. Ainsi, le rôle de la perforine
ne serait pas de permettre l’entrée de granzyme dans la cellule cible mais plutôt de le libérer
de compartiments d’endocytose vers le cytosol afin que celui-ci puisse exercer son activité
protéolytique 33. Des expériences démontrant que la perforine peut agir plusieurs heures après
le traitement des cellules cibles avec le granzyme B et que certains adénovirus et bactéries
connus pour faciliter la libération du contenu endosomal peuvent se substituer à l’action de la
perforine confortent cette hypothèse 41, 44.
18
Les granules lytiques des lymphocytes cytotoxiques humains contiennent également
de la granulysine, un autre type de protéine pouvant à forte concentration altérer la
membrane plasmique et induire l’apoptose des cellules cibles
45
. La granulysine serait
toutefois plutôt impliquée dans les défenses anti infectieuses car c’est un puissant anti
microbien qui agit en augmentant la perméabilité membranaire de nombreux type de bactéries
46
.
Figure 1 : Libération des médiateurs cytotoxiques au niveau du domaine de sécrétion de la synapse
immunologique. Tiré de Lieberman et al, Nature Rev Immunol, 2003 33.
La sécrétion des granules cytotoxiques par les CTL est une étape clef dans le
processus de destruction de la cellule cible. Etant donné le caractère hautement cytolytique de
ces granules, cette sécrétion n’est pas faite au hasard dans le milieu extracellulaire afin de
préserver au maximum les cellules saines environnantes. Plusieurs études ont ainsi pu mettre
en évidence que l’exocytose des granules lytiques était concentrée dans une zone privilégiée
de la membrane plasmique au contact direct avec la cellule cible appelée domaine de
sécrétion
47
. Suite à la reconnaissance sur la cellule cible de complexe peptide-CMH I par le
TCR, le CTL réorganise rapidement son cytosquelette et ses protéines membranaires afin de
former un domaine d’interaction privilégié appelé synapse immunologique 48. Les molécules
19
d’adhésion comme LFA-1 et CD2 sont concentrées en périphérie de cette zone formant un
anneau entourant une région centrale divisée en deux domaines aux fonctions distinctes. Un
premier domaine occupé par les TCR et CD8 ainsi que les molécules de signalisation qui y
sont associées va permettre de réguler l’activation de CTL alors que le deuxième domaine
correspondant au domaine de sécrétion va permettre de focaliser les granules cytolytique sur
la cellule cible 48.
Les lymphocytes T CD8+ peuvent également induire l’apoptose de cellules tumorales
par l’engagement de récepteurs de mort sur la cellule cible. Le mécanisme le mieux décrit
dans la littérature est la voie cytotoxique Fas/FasL. L’activation par le TCR du CTL conduit
à l’expression du recepteur trimérique FasL à sa surface qui en se liant au récepteur Fas sur la
cellule cible conduit à l’activation des caspases intracellulaire par le recrutement de la
molécule adaptatrice FADD
49
. D’autres couples de recepteurs comme TRAIL/TRAIL
ligand ou TNFRI/TNF peuvent également induire l’activation de la cascade des caspases
conduisant à l’apoptose de la cellule cible
50
. On observe une différence importante entre la
voie perforine/granzyme et celle des récepteurs de morts en terme de cinétique d’induction
d’apoptose. En effet, les granules cytolytiques sont déjà exprimés dans les lymphocytes T
CD8+ activés et peuvent ainsi être réorientées et libérées en quelques minutes suite à la
reconnaissance sur la cible de complexe peptide-CMH I par le TCR
47
. A l’inverse, le stock
intracellulaire de récepteurs de la superfamille du TNF comme FasL ou TRAIL est très limité
dans les CTL mêmes activés. Ainsi, une période de 1 à 2 heures suivant l’activation par le
TCR est nécessaire pour permettre l’expression maximale de ces récepteurs et ainsi délivrer
un signal suffisant pour induire la mort de la cellule cible 51.
2.1.3 Les Lymphocytes T CD4+
Les lymphocytes T αβ CD4+ helper (Th) jouent un rôle central dans la mise en place
des réponses immunitaires anti-infectieuses. Ils reconnaissent des épitopes peptidiques
d’environ 20 acides aminés présentés par le CMH de classe II principalement retrouvés sur les
DC, les lymphocytes B et les macrophages. L’origine du concept de lymphocyte « helper »
provient d’expériences réalisées dans les années 70 démontrant le caractère indispensable des
lymphocytes T CD4+ pour permettre la production d’anticorps de haute affinité par les
lymphocytes B en réponse à certains types d’antigènes 52.
20
a- Sous populations de lymphocytes Th.
Suite à leur activation, les Th naïfs vont se différencier en Th effecteurs qui peuvent
être séparés en diverses sous populations ayant des fonctions et des profils de sécrétion
cytokiniques différents. Le microenvironnement présent au moment de l’activation du
lymphocyte Th naïf incluant la dose antigénique, le type de cellule présentatrice d’antigène, le
milieu cytokinique et les signaux de costimulation, jouent un rôle crucial dans le devenir de
celui-ci et dans le type de réponse immunitaire que celui-ci va engendrer 53.
Les lymphocytes Th sont classés en lymphocytes effecteurs T helper de type 1
(Th1) et de type 2 (Th2)
54
. Les Th1 produisent d’importantes quantités d’IFNγ et de
TNFα en réponse à leur antigène et sont impliqués dans l’immunité à composante cellulaire
contre des pathogènes intracellulaires et les tumeurs. Le développement des Th1 est initié lors
de l’activation des CD4+ naïfs par la signalisation de l’IL-12 / STAT4 et par la signalisation
de l’IFNγ / STAT1 conduisant à l’activation du facteur de transcription T-bet
55
. A l’inverse
les Th2 sont caractérisés par la production d’IL-4, d’IL-5 et d’IL-13 et jouent un rôle clef dans
la coordination des réponses humorales contre des infections bactériennes extracellulaires et
parasitaires. L’IL-4 est majoritairement à l’origine de la différenciation des Th naifs en Th2
par l’activation de STAT6 et du facteur de transcription GATA3
53, 56
. Les développements
Th1 et Th2 sont mutuellement exclusifs car l’IFNγ inhibe la différenciation Th2 et l’IL-4 la
différenciation Th1 53.
Un autre sous type de T CD4+, qui se développe indépendamment des Th1 et Th2, a
récemment été décrit, les lymphocytes Th17. Ces cellules sont caractérisées principalement
par la production d’IL-17A, d’IL-17F, de TNFα et d’IL-6 et semblent jouer un rôle
prépondérant dans de nombreuses pathologies auto-immunes. La différenciation Th17
nécessite la présence de TGF-β et d’IL-6 et l’expression du facteur de transcription RORγt 57.
Plusieurs études indiquent que les Th17 sont retrouvés en quantité importante parmi les
lymphocytes T infiltrant les tumeurs dans plusieurs types de cancers
58
. Toutefois, le rôle de
ces cellules dans l’immunité antitumorale reste encore mal défini. En effet, il a récemment été
démontré dans un modèle murin que les Th17 pouvaient induire le rejet de tumeurs par un
mécanisme dépendant de l’IFNγ 59. A l’inverse, la présence de Th17 a été associée au
developpement de la maladie chez les patients atteints de cancers gastriques
60
et plusieurs
études démontrent que l’IL-17A stimule la croissance tumorale 61.
Un autre sous-type de lymphocytes T CD4+ qui trouve son origine dans le thymus et
qui représente 5-6% des lymphocytes T CD4+ circulants fait également l’objet d’intenses
21
recherches ces dernières années. Il s’agit des lymphocytes T CD4+CD25+ régulateurs
(Treg) dont le rôle sera détaillé de manière plus précise par la suite dans le chapitre III.
b- Fonctions anti tumorales exercées par les lymphocytes T CD4+ .
Si le rôle des lymphocytes T CD4+ dans l’immunité antitumorale était déjà évoqué
dans les années 80, l’absence de CMH II sur la plupart des tumeurs ainsi que la difficulté à
identifier des antigènes tumoraux restreints au CMH II ont conduit les recherches à se
focaliser sur les CTL dans un premier temps. Néanmoins, ces dernières années plusieurs
études ont pu mettre en évidence le rôle joué par les lymphocytes T CD4+ dans le
développement de réponses immunitaires efficaces contre les tumeurs 62, 63.
La contribution principale fournie par les lymphocytes T CD4+ dans les défenses
antitumorales provient de l’aide qu’apportent ces cellules à la mise en place de réponses T
CD8 cytotoxiques optimales 64. Les lymphocytes T CD4+ ne sont pas strictement nécessaires
à la mise en place de réponses CD8 mais le nombre de lymphocytes T CD8+ obtenu après
expansion primaire est bien inférieur en l’absence d’aide CD4. Par contre les Th sont
indispensables pour la génération et le maintien de réponses CD8 mémoires. En effet, les T
CD8+ activés en l’absence de CD4+ n’acquièrent pas de phénotype mémoire, prolifèrent très
peu et produisent de faibles quantités de cytokines lors de réponses secondaires
65, 66
.
Plusieurs travaux, réalisés sur des modèles murins de tumeurs, ont pu démontrer que les Th1
et Th2 avaient des capacités relativement comparables à initier des réponses CTL
antitumorales 67.
Plusieurs mécanismes moléculaires ont été identifiés comme pouvant être à l’origine
de l’aide des CD4+ aux réponses T CD8+. L’interaction entre CD40L à la surface des Th
activés et CD40 sur les APC semble jouer un rôle crucial car il conduit à augmenter le niveau
d’expression de molécules de CMH, de molécules de costimulation et à stimuler la production
de cytokines par les APC permettant ainsi l’activation de réponses CTL efficaces
68
. Les
lymphocytes T CD4+ peuvent également apporter une aide plus directe à la mise en place des
réponses T cytotoxiques mémoires par l’interaction entre CD40L et CD40 exprimés
transitoirement par les LT CD8+ suite à leur activation
69
. L’IL-2, dont les lymphocytes T
CD4+ sont la principale source, participe également à la mise en place en place des réponses
CD8+ mémoires 70. La production d’IFNγγ par les lymphocytes effecteurs Th1 semble aussi
jouer un rôle important dans l’induction de réponses CTL antitumorales. En effet l’IFNγ agit
directement sur les APC en induisant une augmentation de l’expression de molécules de
CMH de classe I et de protéines impliquées dans l’apprêtement d’antigènes sur le CMH I
22
conduisant ainsi à une meilleure présentation d’antigènes tumoraux sur les APC. Lors de la
phase effectrice l’IFNγ augmente également la présentation d’antigènes par les cellules
tumorales permettant ainsi une meilleure reconnaissance de ces cellules par les CTL 71.
Les T CD4+ Th1 et Th2 peuvent également induire une régression tumorale en
l’absence de T CD8+ comme cela a pu être démontré dans un modèle d’immunisation
antitumorale de souris CD8 KO
62
. En effet, l’IFNγ produit par les Th1 active les
macrophages à produire de l’oxide nitrique (NO) et des ions super-oxides (O2-) qui jouent un
rôle important dans la destruction de cellules tumorales. Les cellules Th2 peuvent recruter et
activer les éosinophiles qui produisent divers facteurs antitumoraux 72.
Plusieurs études semblent indiquer que les T CD4+ pourraient également avoir une
activité antitumorale directe, au travers de l’IFNγ qui présente des effets antiangionéniques et
cytostatiques sur de nombreux types de cancers
tumorales par des interactions Fas/FasL
75
73, 74
ou en induisant l’apoptose de cellules
et Trail /Trail L 76.
IFNγ,TNFα
Direct or indirect killing
IFNγ,TNFα
IFNγ, IL-2
Direct killing
Clonal expansion
Figure 2 : Rôle central des lymphocytes T CD4+ dans la mise en place des réponses immunitaires antitumorales.
23
I.3 Immunité innée et immunité antitumorale.
I.3.1 Cellules dendritiques.
3.1.1 Biologie des DC.
Les cellules tumorales en elles-mêmes ont de faibles capacités de présentation
d’antigènes et les études menées sur des modèles murins démontrent que la mise en place des
réponses immunitaires adaptatives antitumorales dépend de la présentation d’antigènes
tumoraux par les DC 77. En effet, ces cellules, qui décodent et intègrent les différents signaux
au niveau des tissus périphériques puis transmettent ces informations aux cellules de
l’immunité adaptative au niveau des organes lymphoïdes secondaires sont connues pour jouer
un rôle clef dans l’initiation, l’amplitude et la qualité des réponses immunitaires mises en
place lors d’infections 78.
Les DC à l’état « immature» sont localisées dans l’ensemble des tissus périphériques
où elles servent de détecteurs immunologiques recherchant continuellement la présence
signaux étrangers. Ces cellules ont d’importantes capacités de phagocytose et expriment de
nombreux récepteurs spécialisés qui leur permettent de capter un grand nombre d’antigènes
présents dans le milieu extracellulaire
79
. Les DC ont un compartiment d’endocytose
spécialisé, caractérisé par une acidification et une dégradation réduite en comparaison avec
celui des macrophages et des neutrophiles, qui leur permet une meilleure conservation des
peptides antigéniques et une présentation accrue de ces peptides sur les molécules de CMH I
et II 79. Cette capacité à présenter à la fois des antigènes captés dans le milieu extracellulaire
sur le CMH de classe II et sur le CMH I, processus appelé cross-présentation, joue un rôle
critique dans l’activation des CTL antitumoraux in vivo 80.
La reconnaissance de signaux étrangers ou de danger par les DC « immatures » en
périphérie initie ensuite un processus de maturation complexe caractérisé par des
changements morphologiques, phénotypiques et fonctionnels qui confèrent à ces cellules des
capacités uniques de stimulation des lymphocytes T 81. Ils incluent :
•
La perte d’expression des récepteurs d’endocytose/phagocytose.
•
La migration vers les organes lymphoïdes secondaires induit par la perte
d’expression des récepteurs aux chimiokines périphériques CCR1, CCR2 et CCR5 et
l’acquisition du récepteur CCR7.
24
•
La production de nombreuses chimiokines et l’acquisition de dendrites qui facilitent
les interactions entre les DC et les lymphocytes T.
•
La relocalisation à la membrane cellulaire des complexes CMH de classe I et de
classe II associés aux peptides antigéniques captés précédemment et la surexpression de
nombreuses molécules de co-stimulation dont CD40, CD80 et CD86 qui permettent
d’induire la pleine activation des lymphocytes T CD4+ et CD8+ naïfs.
•
La sécrétion de cytokines comme l’IL-12 qui vont jouer un rôle indispensable dans
la polarisation et dans l’induction des fonctions effectrices des lymphocytes T.
3.1.2 Signaux à l’origine de l’activation des DC.
La nécessité d’activation préalable des DC pour permettre la mise en place de
réponses immunitaires adaptatives efficaces, pose la question des mécanismes qui permettent
à ces cellules de détecter la présence de pathogènes étrangers ou dans le cas qui nous intéresse
de détecter la présence de cellules tumorales.
Selon la théorie émise par Janeway en 1989, il existe à la surface des pathogènes un
nombre limité de motifs conservés entre les espèces qu’il appela PAMP (« Pathogen
Associated Molecular Patterns »), permettant au système immunitaire de détecter la
présence de microbes
82
. Cette théorie « du corps étranger » a permis la découverte d’un
nombre important de récepteurs spécialisés dans la reconnaissance de microbes appelés PRR
pour « Pattern Recognition Receptor » comme les « Toll-like receptor » (TLR), les récepteurs
lectine de type C et les recepteurs intracytoplasmiques de type NOD
79
.
Ce modèle de reconnaissance basée sur la reconnaissance de structures étrangères à la
surface des pathogènes, s’il est en grande partie vrai, ne s’applique toutefois pas à l’ensemble
des réponses immunitaires. Par exemple, on peut observer une importante immunité T lors de
maladies autoimmunes sans pour autant détecter la présence de pathogènes. De plus, le rôle
crucial de l’immunité adaptative T CD4+ et CD8+ dans l’immunosurveillance antitumorale
implique nécessairement une activation et la présentation d’antigènes tumoraux par des DC
sur le site de la tumeur. Ces limites avec le modèle de Janeway a conduit Matzinger à
proposer la théorie du « signal de danger », en 1994 postulant que le système immunitaire
avait évolué pour répondre non pas aux infections mais plutôt aux signaux de dangers,
produits par les cellules en conditions non physiologiques
83
. Selon cette théorie les cellules
endommagées, stressées ou nécrotiques libèrent des signaux de dangers, aussi appelés DAMP
pour « damage associated molecular pattern » qui peuvent activer les DC et autres cellules
de l’immunité innée afin de permettre l’activation de l’immunité adaptative. Au moment de sa
25
formulation, cette hypothèse était purement théorique et les évidences expérimentales de son
fondement étaient très limitées.
Figure 3 : Modèle d’activation des DC basé sur la reconnaissance de signaux étrangers ou de dangers
dans le microenvironnement. D’après Kono et al, Nat rev immunol , 2008 85.
Plus récemment, il a été démontré que les cellules peuvent contenir des adjuvants
endogènes permettant la maturation et la migration de DC vers les ganglions lymphatiques et
ainsi stimuler la mise en place d’une immunité T 84. Ces signaux de dangers sont séquestrés à
l’intérieur de la cellule en conditions physiologiques et peuvent être libérés dans le milieu
extracellulaire lors du processus de nécrose ou dans certains processus apoptotiques en
conditions non-physiologiques
85
. Parmi ces signaux de dangers endogènes, plusieurs ont été
identifiés comme pouvant jouer un rôle dans l’activation des réponses immunitaires
antitumorales. Par exemple, l’acide
urique libéré par les cellules tumorales mourantes,
transformé en urate monosodé (MSU) dans le milieu extracellulaire riche en sodium peut
26
stimuler la maturation de DC et induire le rejet de tumeurs via l’expansion de CTL
spécifiques d’antigènes tumoraux 86, 87. Le constituant nucléaire HMGB1 est également connu
comme pouvant être un adjuvant endogène puissant in vivo
88
. Ainsi, il a récemment été
démontré dans un modèle murin que HMGB1 libéré dans le milieu extracellulaire par les
cellules tumorales endommagées lors de chimiothérapies ou de radiothérapies peut induire la
maturation des DC via la reconnaissance par TLR4 et permettre ainsi la mise en place de
réponses immunitaires T antitumorales efficaces
89
. D’autres constituants cellulaires comme
les protéines de choc thermique (HSP) ou l’ADN génomique sont connus pour activer les DC
et pourraient donc participer à l’induction de réponses immunitaires antitumorales 85.
I.3.2 Cellules NK
3.2.1 Cellules NK et immunité antitumorale.
La découverte des cellules Natural Killer remonte au début des années 70 lorsque les
auteurs d’une étude sur la répartition lymphocytaire de patients atteints de maladies
inflammatoires et de sujets sains, observèrent dans le sang périphérique un type cellulaire, ni
T, ni B, qui fut appelé « cellules nulles »
90
. C’est en 1975 que ces cellules furent
définitivement identifiées par deux équipes indépendantes qui observèrent dans des souris non
immunisés une réactivité naturelle d’un type de lymphocytes larges et granuleux contre des
cellules tumorales 91, 92. Cette propension à reconnaître et détruire un grand nombre de cibles
tumorales humaines in vitro sans sensibilisation préalable leur valu le nom de cellules
« Natural Killer» 93.
L’importance des NK dans l’immunosurveillance antitumorale a été suggérée par
plusieurs études indiquant que l’infiltration de cellules NK était associée à un bon pronostic
dans divers types cancers
94
et que l’activité des cellules NK dans le sang circulant est
directement corrélée au risque de développement de cancers
95
. Plusieurs modèles
expérimentaux de tumeurs chez la souris ont également démontré que la déplétion du
compartiment NK, in vivo chez la souris, par des anticorps anti-NK1.1 ou anti-asialo-GM1
favorisait le développement de tumeurs dans des modèles de cancers spontanés, induits par
des agents chimiques ou greffés dans des souris syngéniques
96 , 97, 98
. Toutefois, la capacité
de ces anticorps à éliminer d’autres types cellulaires que les NK limite quelque peu
l’interprétation de ces résultats.
Les Cellules NK, comme les CTL, peuvent induire la mort des cellules tumorales par
la libération de médiateurs contenus dans les granules cytotoxiques. Parmi ceux-ci, la
perforine semble jouer un rôle indispensable dans le contrôle de tumeurs expérimentales par
27
les NK in vivo
99, 100
alors que les granzymes A et B semblent moins nécessaires
101
. Le
récepteur de mort TRAIL, exprimé de manière constitutive sur une proportion des NK
hépatiques, et dont l’expression peut être induite par IL-15 ou l’IFNγ sur les NK circulantes,
contribue également aux réponses antitumorales des NK in vivo et notamment à la destruction
des métastases hépatiques
102
. TRAIL a également été impliqué dans l’immunosurveillance
par les NK de fibrosarcome induits par le MCA
103
. Ces données suggèrent que TRAIL est
une molécule effectrice importante dans le contrôle de l’initiation et du développement de
tumeurs par les NK.
La destruction de cellules tumorales par les NK dans les phases précoces du
développement tumoral pourrait jouer un rôle important dans la mise en place des réponses
adaptatives antitumorales en permettant la libération de débris cellulaires et d’antigènes
tumoraux qui seront ensuite captés par les DC résidentes puis présentés aux lymphocytes T
104
. Par ailleurs, plusieurs études indiquent que les NK activés peuvent stimuler la maturation
et augmenter les capacités activatrices des DC notamment via la production d’IFNγ, de TNFα
105
mais également dans certaines circonstances lyser les DC les plus immatures. Ce processus
de sélection par les NK des DC les plus aptes à stimuler l’immunité adaptative pourrait
participer à la mise en place de réponses T antitumorales efficaces 105.
3.2.2 Contrôle de l’activation des cellules NK
L’activation des cellules NK n’est pas le fait de l’engagement spécifique d’un
récepteur par son ligand, comme pour les lymphocytes T ou B, mais le résultat de
l’intégration de tous les signaux provenant de divers récepteurs présents sur les cellules NK
106
. La caractérisation de ces récepteurs NK (NKR), qui existent aussi bien sous des formes
activatrices qu’inhibitrices, a permis de définir les bases moléculaires de la reconnaissance
des cellules transformées par les cellules NK.
28
Figure 4 : La balance entre les signaux activateurs et inhibiteurs reçus par les NK détermine l’issue de
leur rencontre avec les cellules cibles. Tiré de Raulet et al, Nat rev immunol, 2006 107.
a. NKR inhibiteurs et hypothèse du « missing self »
Très rapidement après leur découverte les premières études concernant la réactivité des
NK ont pu démontrer que ces cellules avaient une spécificité particulière pour les cellules
déficientes en CMH de classe I
108
. Suite à ces constatations, Klas Karre suggéra qu’à la
différence des lymphocytes T, qui reconnaissent des peptides étrangers présentés par le CMH,
les NK réagissent à l’absence de déterminant du soi sur les cellules cibles 109. Cette hypothèse
du « missing self » qui suggérait l’existence de récepteurs aux molécules de CMH I exerçant
des effets inhibiteurs sur les fonctions des NK a permis la découverte de nombreux récepteurs
inhibiteurs pour des molécules de CMH I conventionnelles et non-conventionnelles. Les
principaux récepteurs inhibiteurs des NK sont les récepteurs de la famille des KIR (Killer
immunoglobulin like receptors, CD158), les récepteurs de type lectine CD94/NKG2A et le
récepteur ILT2 (Leucocytes Ig-like Receptor 1, LIR1) :
•
Les récepteurs KIR inhibiteurs : ces récepteurs contiennent 2 ou 3 domaines
extracellulaires de type Ig. Les KIR reconnaissent les molécules de CMH I classiques
présentes à la surface des cellules cibles à l’exception de KIR2DL4 qui reconnaît la
molécule de classe I non classique HLA-G. La reconnaissance par les KIR est dégénérée
et ainsi un même KIR reconnaît différents haplotypes d’une même molécule de CMH I.
29
Par exemple, KIR2DL1 reconnaît les allèles d’HLA-C ayant un résidu lysine en position
80 (HLA-Cw2, -Cw4, -Cw5, -Cw6) alors que KIR2DL2 et KIR2DL3 reconnaissent les
allèles d’HLA-C ayant un résidu asparagine en position 80 (HLA-Cw1, -Cw3, -Cw7, Cw8) 110.
•
Le récepteur ILT2 : il appartient comme les KIR à la superfamille des Ig et se lie à
plusieurs types de molécules de CMH I classiques (HLA-A, -B) et non classiques HLA-G
111
•
.
Le récepteur hétérodimérique CD94/NKG2A : il reconnaît la molécule de CMH I
non classique HLA-E. L’expression de HLA-E dans une cellule est dépendante des
peptides dérivés des séquences signals des molécules de classe I classique HLA-A,-B et C et non classiques HLA-G. Ainsi, les NK grâce au récepteur CD94/NKG2A vont
pouvoir évaluer le taux d’expression global des molécules de CMH I 112 .
Bien qu’ils aient tous des structures extracellulaires et des ligands différents, ces trois
classes de récepteurs NK inhibiteurs ont tous dans leur partie intracellulaire un motif ITIM
(Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibitory Motif). L’engagement de ces récepteurs par
leur ligand induit la phosphorylation des résidus tyrosines des ITIM ce qui permet le
recrutement des phosphatases SHP1, SHP2 et SHIP1 au niveau du point de contact entre le
NK et sa cible. Ces phosphatases vont alors déphosphoryler les protéines cibles des protéines
tyrosine kinases associées aux récepteurs activateurs NK et pouvoir ainsi limiter voir même
supprimer le flux calcique, la dégranulation et la production de cytokine induite par ces
récepteurs. Ces événements sont toutefois très transitoires et ne vont pas empêcher
l’activation des NK au contact d’une autre cible dépourvue de ligands pour les récepteurs
inhibiteurs 106.
b. NKR activateurs
S’il est vrai que les NK réagissent à l’absence signaux inhibiteurs initiés par les
molécules de CMH I, il reste néanmoins nécessaire pour ces cellules de reconnaître sur leurs
cibles des signaux activateurs transmis par un vaste ensemble de récepteurs exprimés à la
surface des cellules NK. Comme Long et ses collaborateurs ont pu le démontrer, l’activation
de chaque récepteur activateur séparément par des anticorps agonistes ne permet pas de
stimuler les fonctions cytotoxiques de cellules NK fraîchement isolées, à l’exception du
récepteur CD16
113
. A l’inverse, l’activation de plusieurs combinaisons de récepteurs stimule
l’activité cytolytique des NK suggérant ainsi que le terme de récepteurs « co-activateurs » est
30
plus approprié pour décrire ces récepteurs qui agissent en synergie pour induire la destruction
des cellules cibles. Bien que ces récepteurs activateurs ou co-activateurs exprimés par les NK
soient nombreux, la plupart d’entre eux utilisent des voies de signalisation communes. Ainsi,
on distingue essentiellement les récepteurs associés à des protéines d’adaptatrices portant des
motifs ITAM et le récepteur NKG2D 106.
Les principaux récepteurs associés à des protéines d’adaptatrices portant des motifs
ITAM sont :
•
Les « Natural Cytotoxicity Receptor » (NCR) : Ils forment une famille composée
essentiellement des récepteurs NKp30, NKp44, NKp46. Ces récepteurs associés aux
protéines d’adaptatrices portant des motifs ITAM CD3ζ, DAP12, FcεRI-γ- ont été
impliqués dans la reconnaissance de tumeurs d’origines variées. Toutefois, l’identification
des ligands de ces récepteurs sur ces cellules reste infructueuse jusqu’à présent 114.
•
Le récepteur CD16 (FcγγRIIIA) : ce récepteur de faible affinité au fragment constant
des Ig, associé à CD3ζ, est exprimé par une grande majorité des NK circulant. Il permet à
ces cellules de reconnaître et lyser spécifiquement les cellules préalablement recouvertes
par des Ig, processus nommé « antibody dependent cell-mediated cytotoxicity » (ADCC)
115
•
.
Le récepteur hétérodimérique CD94/NKG2C : comme son homologue inhibiteur
CD94/NKG2A, il reconnaît les molécules de CMH I non classiques HLA-E mais avec une
affinité 10 fois inférieure. De plus, à la différence de ce dernier CD94/NKG2C ne présente
pas de motif ITIM dans sa partie intra cytoplasmique et s’associe à la protéine adaptatrice
DAP12. Le rôle de ce récepteur dans l’activation des NK reste mal défini 115.
•
Les récepteurs KIR activateurs KIR2DS1ou 2, KIR3DS1 et KIR2DS4 : ils
reconnaissent comme les KIR inhibiteurs des allèles de CMH I mais avec une affinité 10
fois inférieure à ces derniers 115.
L’engagement de ces récepteurs induit la phosphorylation des motifs ITAM des
protéines adaptatrices CD3-ζ-, DAP12, FcεRI-γ- par les protéines kinases de la famille des
Src. Plusieurs membres de cette famille comme Lck, Fyn, Src, Yes et Lyn sont exprimés par
les NK et semblent avoir des activités redondantes comme le suggère les études réalisées dans
des souris déficientes pour ces différentes protéines
106
. Les ITAM phosphorylés permettent
ensuite le recrutement des tyrosines kinases Syk et ZAP70 qui vont initier plusieurs voies de
signalisation conduisant la réorganisation du cytosquelette d’actine, à la libération de granules
31
cytotoxiques ainsi qu’à la transcription de gènes codant pour de nombreuses cytokines et
chimiokines. Il est à noter que les différentes protéines adaptatrices CD3-ζ-, DAP12, FcεRI-γpeuvent ne pas utiliser les mêmes voies de signalisation en fonction du stade de maturation et
d’activation des NK pouvant ainsi conduire à des réponses effectrices différentes 106.
Figure 5 : Voies de signalisation initiées par les principaux récepteurs activateurs et inhibiteurs NK humains.
Tiré de Vivier et al, Science, 2004 120.
Le récepteur homodimérique de type lectine NKG2D est associé chez l’homme à
DAP10, une petite protéine transmembranaire de 10 kD
116
. DAP10 ne porte pas dans sa
partie intra-cytoplasmique de motif ITAM mais présente un seul motif YINM qui permet le
recrutement de la sous unité p85 de la PI3K ou de l’adaptateur Grb2. Leibson et ses
collaborateurs ont pu démontrer, en mutant spécifiquement les sites de fixation de la PI3K
(YXXM) ou de Grb2 (YXNX), que les voies de signalisations initiées par ces deux protéines
étaient indispensables à l’activité cytotoxique des NK induite par l’engagement de NKG2D
117
. Contrairement aux complexes de récepteurs portant des motifs ITAM, les complexes
NKG2D-DAP10 ne nécessitent pas la présence des protéines kinases Syk ou ZAP70 pour
activer la cytotoxicité des cellules NK
118
. Par contre, le recrutement de Grb2 et de p85
requiert la phosphorylation en tyrosine du motif YINM probablement par les membres de la
famille des Src kinases. En effet, l’utilisation d’inhibiteurs chimiques de ces protéines inhibe
totalement la signalisation initiée par le complexe NKG2D-DAP10
106
. Une étude récente
32
indique que la signalisation de l’IL-15 pourrait également induire via Jak3 la phosphorylation
de DAP10 dans les NK et ainsi sensibiliser ces derniers à des cibles exprimant des ligands de
NKG2D (NKG2DL) 119.
Les ligands de NKG2D sont des protéines transmembranaires endogènes qui
présentent une structure proche de celle du CMH I. Ils incluent chez l’homme, les « MHC
class I chain related protein » A (MICA) et B (MICB) et les « UL16-binding protein 14 » (ULBP1-4). En général, ces ligands sont faiblement exprimés à la surface des cellules
normales mais sont souvent up-régulés en condition de stress comme lors d’infection ou lors
du processus de transformation oncogénique
121
. En effet, de forts niveaux d’expression des
ligands de NKG2D ont été détectés dans plusieurs types de tumeurs incluant les mélanomes,
les carcinomes et les leucémies
121
.
L’expression de ces signaux de dangers endogènes par les cellules tumorales augmente
fortement leur rejet in vivo par le système immunitaire 122. En effet, si NKG2D est présent sur
quasiment l’ensemble des cellules NK, il est également exprimé par les cellules T γδ, les NKT
et sur une proportion de lymphocytes T CD8+
121
. L’importance de NKG2D dans
l’immunosurveillance antitumorale est supportée par une récente étude démontrant que le
blocage de l’interaction NKG2D/NKG2DL permet de favoriser l’apparition de fibrosarcomes
dans les souris traitées avec le MCA 98.
c. « Licensing » des NK.
De récentes expériences visant à analyser la dégranulation et la production d’IFNγ de
NK fraîchement isolés du sang périphérique de donneurs sains ou de la rate de souris contre
des cibles typiques de ces cellules, semblent indiquer qu’une proportion importante des NK
circulantes sont dépourvues de fonctions effectrices immédiates malgré la présence d’un
phénotype mature
123
. Les auteurs de cette étude ont remarqué que ces cellules NK
hyporépondeuses sont dépourvues de récepteurs inhibiteurs KIR ou CD94/NKG2A pour le
CMH I et suggèrent qu’une étape d’éducation en périphérie existe pour habiliter ces cellules à
exercer leurs fonctions effectrices. Cette hypothèse s’appuie sur d’autres études réalisées dans
des souris déficientes en CMH I dans lesquelles les NK sont dépourvues de fonctions
effectrices directes
124, 125
. Cette nécessité de reconnaissance de molécules de CMH I du soi
pour permettre la maturation des NK vers un statut de Natural Killer, qui constitue par
analogie avec les lymphocytes T une sorte de sélection positive, permettrait d’éviter
l’activation de NK potentiellement auto-réactives car dépourvus de récepteurs inhibiteurs au
CMH I.
33
Par ailleurs, il apparaît clairement que le statut de « natural killer » est partiellement
vrai pour les NK car ces cellules nécessitent une étape d’activation pour exercer leurs
fonctions de façon optimale
126
. Par exemple, l’IL-2 produite par les lymphocytes T activés
est un inducteur puissant du potentiel cytotoxique des cellules NK et augmente la sécrétion
d’IFNγ par ces cellules
127
. Certaines cytokines produites par les DC matures et les
macrophages activés incluant l’IL-1β, l’IL-12, l’IL-15, l’IL-18 et les interférons de type I
(IFN α et β) jouent aussi un rôle crucial dans l’activation des fonctions des NK en stimulant
l’activité cytotoxique et la sécrétion de cytokines de ces cellules 128. IL semblerait en effet que
les DC jouent un rôle important dans l’activation des fonctions effectrices des NK
105
comme
le suggère une récente étude qui indique que l’ablation des DC in vivo entraine un défaut
d’activation des NK en réponse à des produits microbiens
129
. Dans cette étude, les auteurs
démontrent que les DC activées expriment d’importantes quantités d’IL-15 membranaire à
l’origine de l’activation des NK.
Figure 6 : Régulation des réponses immunitaires adaptatives et innées par les NK. Tiré de Vivier et al, Nat
immunol, 2008 93.
34
I.3.3 Les lymphocytes T γδ
γδ
3.3.1 Developpement des lymphocytes T γδ
Les lymphocytes T γδ ont été identifiés en 1986 comme étant une nouvelle population
de lymphocytes T périphériques et de thymocytes caractérisés par un TCR formé de
l’association d’une chaîne gamma (γ) et d’une chaîne delta (δ)130 ,
131
. Contrairement aux
lymphocytes T αβ, les lymphocytes T γδ ne représentent qu’une faible proportion (< 6%) des
lymphocytes circulants dans le sang périphérique mais sont beaucoup plus répandus dans les
tissus épithéliaux et tous les organes lymphoïdes où ils peuvent représenter jusqu’à 50% des
lymphocytes T.
Comme pour les TCR αβ, les TCR γδ sont générés par les recombinaisons somatiques
qui ont lieu au niveau des segments VDJ de l’ADN (V, J et C pour les chaînes γ ou V, D, J et
C pour les chaînes δ) durant l’ontogenèse. Toutefois, à la différence des T αβ, le répertoire
des TCR γδ présente une diversité combinatoire limitée en raison du faible nombre de
segments génomiques Vγ et Vδ et en raison d'associations privilégiées entre les chaines γ et δ.
Cette limitation dans la diversité des TCR confère aux lymphocytes T γδ une reconnaissance
antigénique plus restreinte. Pour cette raison, on considère que les lymphocytes T γδ se situent
à la frontière entre l’immunité innée et l’immunité adaptative car ils expriment un récepteur
réarrangé de type TCR caractéristique de l’immunité adaptative mais dont la faible variabilité
le rapproche plus des récepteurs non réarrangés caractéristiques de l’immunité innée de type
NKR que des TCR αβ dont les séquences sont uniques chez un individu 132.
L’étude de l’ontogénie des lymphocytes T γδ chez la souris indique que ces cellules
apparaissent par vagues successives dans le thymus au cours du développement fœtal à partir
duquel ils vont coloniser un organe particulier dans lequel ils resteront tout au long de la vie
133
. Cette distribution anatomique s’accompagne de l’expression de récepteurs T γδ très
homogènes. Ainsi, au sein d’une même sous-population tissulaire, les mêmes segments Vγ et
Vδ seront exprimés suggérant que les lymphocytes γδ reconnaissent un même ligand exprimé
par les cellules du tissu correspondant.
Chez l’Homme, le foie et l’intestin fœtal sont les premiers sites de l’ontogenèse des
lymphocytes T γδ
134
. Ils y apparaissent entre les 7 et 11èmes semaines puis migrent ensuite
vers le thymus par vagues successives dès la 10ème semaine. Des études génétiques ont montré
que chez l’Homme toutes les familles Vδ et Vγ sont exprimées et réarrangées dans le thymus
35
dès la 11ème semaine de la vie fœtale
135
. Ce réarrangement va générer majoritairement deux
sous populations distinctes caractérisées par un récepteur T et une localisation anatomique
spécifique:
- Une population résidente majoritairement représentée dans les muqueuses de
l’intestin est caractérisée par une chaine δ, issue de la recombinaison du segment Vδ1 avec
Dδ1 et Dδ2 et par la chaine γ, composée des segments Vγ2, 3, 5, 8 (famille VγI) au cluster
Jγ2. Les cellules qui expriment ces TCR sont les lymphocytes T Vδ
δ1 136.
- Une population périphérique présentant un récepteur TCR codé par les segments Vγ9
et Vδ2 dont la diversité combinatoire est quasi nulle qui représente 1 à 10% des lymphocytes
δ2 représente 70 à
circulants 137, 138. Cette sous population de γδ appelée lymphocytes T Vγγ9Vδ
90% des lymphocytes T γδ circulant et n’est retrouvée que chez les primates humains et non
humains.
L’établissement des répertoires γδ chez la plupart des individus est effectif dès la
première année, mais la proportion des différentes populations γδ évolue au cours de la vie.
Ainsi, la population Vγ9Vδ2 n’est pas prédominante à la naissance mais s’accroit
considérablement jusqu’à l’âge de 7 ans sans qu’aucune colonisation du thymus soit observée,
suggérant une amplification extra thymique guidée par des antigènes environnementaux
139
. Il
a notamment été démontré que 2 ans après la naissance, une large majorité des LT Vγ9Vδ2
ont un phénotype mémoire
140
. Par la suite leur nombre décroit progressivement d’environ
0,1% par ans à partir de l’âge de 30 ans
141
pour aboutir, chez les individus âgés, à une
population ayant un faible potentiel prolifératif et des fonctions altérées 142.
Dans les paragraphes qui suivent, je détaillerai plus précisément les caractéristiques
phénotypiques et fonctionnelles et l’implication dans l’immunité anti tumorale de la sous
population de lymphocytes T γδ exprimant un TCR Vγ9Vδ2.
3.3.2 Réactivité des lymphocytes T Vγγ9Vδ
δ2.
Les lymphocytes T Vγ9Vδ2 reconnaissent des antigènes non peptidiques de faible
masse moléculaire
143
. Cette reconnaissance ne requiert ni apprêtement d’antigène par des
cellules présentatrices professionnelles, ni présentation par des molécules de CMH
conventionnelles ou non conventionnelles 144.
L’origine de la découverte des antigènes spécifiques des lymphocytes T Vγ9Vδ2
provient d’observations faites chez les patients atteints d’infections mycobactériennes et plus
36
particulièrement de tuberculose, chez qui une augmentation du nombre des lymphocytes T
Vγ9Vδ2 humains est fréquemment observée dans le sang circulant et dans les zones de lésions
145
. A partir d’extraits mycobactériens (Mycobacterium tuberculosis), quatre composés de
structures proches (appelés TUBag 1-4) par la présence d’une partie pyrophosphosphate ont
été isolés pour leur capacité à activer les lymphocytes T Vγ9Vδ2
146
. Par la suite, plusieurs
études ont pu démontrer qu’un large éventail de composés pyrophosphatés naturels tels que
l'isopentenyl pyrophosphate (IPP)
147
, le diméthylallyl pyrophosphate (DMAPP)
également le 3 formyl-butyl-pyrophosphate
dimethylallyl (HDMAPP)
149
148
147
, ou
et le pyrophosphate de 4 hydroxy-3-
produits par de nombreux micro-organismes
146, 148, 150
et
plantes151 stimulent sélectivement les cellules T γδ humaines exprimant le TCR Vγ9Vδ2. Ces
antigènes non peptidiques, spécifiquement reconnus par les LT Vγ9Vδ2, ont été nommés
phosphoantigènes (PAg). Plusieurs PAg ont également été produits par synthèse chimique
totale, parmi lesquels le plus puissant à l’heure actuelle est le pyrophosphate de
bromohydrine (BrHPP)
152
. La large distribution des PAg parmi les micro-organismes
eucaryotes et procaryotes explique probablement l'activation des cellules T Vγ9Vδ2 dans des
contextes infectieux divers comme la tuberculose 153, la méningite 154 ou encore la malaria 155,
la toxoplasmose
156
ou la leishmaniose
157
. En outre, l'expression de ces métabolites par une
variété d'agents environnementaux et de plantes pourrait expliquer l'expansion sélective des
cellules Vγ9Vδ2 périphériques qui se produit après la naissance et la prédominance manifeste
de cellules Vγ9Vδ2 parmi les T γδ circulants de l’adulte 140.
Très tôt après leur découverte, plusieurs études indiquaient également que les
lymphocytes T γ9δ2 reconnaissent et s’activent au contact de différents types de cellules
tumorales humaines comme les lymphomes de Burkitt suggérant que ces cellules contiennent
des antigènes reconnus par les lymphocytes T Vγ9Vδ2
158, 159
. Les composés isolés à partir
des cellules cancéreuses humaines qui stimulent les cellules T Vγ9Vδ2 ont été identifiés
comme étant l’IPP et le DMAPP issus de la voie de biosynthèse du cholestérol chez les
mammifères ou voie du mévalonate (MVA). Ainsi, les aminobisphosphonates (ABP)
thérapeutiques comme le pamidronate ou le zolédronate qui bloquent la voie du MVA après la
biosynthèse de l’IPP et du DMAPP et qui induisent une bio accumulation de ces composés
dans les cellules traitées, ont la capacité d’activer les cellules T Vγ9Vδ2 humaines in vitro et
in vivo
160 , 161
. A l’inverse, les inhibiteurs en amont du MVA tels que les statines peuvent
abroger l'activation de cellules T Vγ9Vδ2 par le blocage de la production des métabolites en
aval tels que l’IPP 162 , 163.
37
Les phosphoantigénes naturels possédant la bio activité la plus importante et qui
permettent de faire un lien entre la reconnaissance d’agents infectieux et les cellules
transformées par les lymphocytes T Vγ9Vδ2 sont les métabolites issus de la voie de synthèse
des isoprénoides comme l’IPP et le DMAPP. En effet, tous les organismes vivants produisent
des isoprénoides, métabolites essentiels à leur biologie cellulaire, et partagent une étape clef
dans la synthèse de ces composés, l'isomérisation des deux isomères en C5 : l'IPP et le
DMAPP. Les archaebactéries et la plupart des eucaryotes synthétisent de l’IPP à partir
d'acétyl-CoA par la voie du MVA alors que les cyanobactéries et la plupart des eubactéries,
les algues et les plastides font de l’IPP par la « voie de Rohmer », à partir d'hydrates de
carbone désignés sous le nom de 1 déoxy-D-xylulose-5-phosphate (DOXP), pour produire de
l’HDMAPP puis et de l’IPP 143.
Figure 7 : Biosynthèse des PAg. Les voies métaboliques DOXP et MVA de la biosynthèse de cholestérol
impliquent des intermédiaires PAg. Panneau supérieur, distribution phylogénétique des voies DOXP (boîtes
vertes) et MVA (boîtes jaunes) dans un arbre simplifié de la vie. Panneaux inférieurs, voies DOXP et MVA.
D’après Bonneville et al, Microbes and infection, 2005 165.
38
Il a récemment été démontré par De Libero et ses collaborateurs que l’infection par
des bactéries comme Escherichia coli ou Staphilococcus aureus induisait une augmentation
rapide de l’activité de l’HMG-coA reductase conduisant à une accumulation de métabolites
intermédiaires de la voie du MVA comme l’IPP dans les monocytes ou les DC. Selon cette
étude l’augmentation de ces métabolites endogènes serait responsable de l’activation des
lymphocytes T Vγ9Vδ2 dans les phases précoces de l’infection
164
. Ainsi, la capacité des T
Vγ9Vδ2 à détecter des signaux de dangers endogènes caractérisés par des variations
métabolique dans la voie du MVA permettrait donc aux primates de réagir rapidement en
réponse à des infections ou à des processus de transformation cellulaire.
3.3.3 Mécanismes de reconnaissance des PAg par les lymphocytes T Vγγ9Vδ
δ2.
Les caractéristiques structurales et chimiques des PAg contribuant à l'activation des
cellules γ9δ2 ont été bien documentées par plusieurs études mais les mécanismes précis
conduisant à l'activation de ces cellules par les PAg demeurent, à ce jour, encore mal définis.
Toutefois, plusieurs évidences suggèrent l’implication du TCR Vγ9Vδ2 dans la
reconnaissance spécifique des PAg :
•
Le traitement avec des anticorps anti-TCR empêche l’activation des cellules T
Vγ9Vδ2 induite par les PAg TUBag 1-4 146.
•
La transfection de cellules Jurkat avec les cDNA codant pour les chaines du TCR
Vγ9Vδ2 leur confère une réactivité vis-à-vis des PAg 166.
•
La mutation des résidus lysines dans la région CDR3 de la chaine TCRγ abroge
complètement la réponse des cellules T Vγ9Vδ2 à tous les PAg sans toutefois altérer
la réponse aux Ac anti-CD3 167.
•
La cristallographie aux rayons X a permis de révéler la structure tridimensionnelle du
TCR Vγ9Vδ2 avec une résolution de 3,8 Å
168
. Celle-ci suggére que le TCR Vγ9Vδ2
serait apte à fixer directement les PAg.
•
La modélisation moléculaire et l’analyse QSAR (quantitative Structure-Activity
Relationship) réalisée en collaboration avec l’équipe de Olfied suggère l’existence
d’une conformation tridimensionnelle commune à tous les PAg, qui permet leur
reconnaissance directe sans présentation 169.
39
Toutefois, l’interaction directe TCR Vγ9Vδ2 et les PAg n’a pas encore été
formellement démontrée par la technique de Résonance Plasmonique de Surface ou par
cristallographie aux rayons X. De plus, même si l'activation des cellules T Vγ9Vδ2 se produit
dans les secondes qui suivent l’exposition aux PAg, plusieurs études démontrent la nécessité
d’un contact cellulaire 144, 170. Plusieurs hypothèses peuvent expliquer ces résultats :
•
L’engagement du TCR par les PAg solubles pourrait nécessiter des signaux
additionnels de co-stimulation fournis par des ligands liés à la membrane des cellules
cibles pour permettre la pleine activation des cellules T γ9δ2.
•
Les PAg pourraient être présentés par une molécule encore non identifiée, distincte
des molécules classiques ou non-classiques connues de CMH 144.
•
L’induction d’une modification conformationnelle d'une molécule ou la surexpression
d'un ligand reconnu par le TCR Vγ9Vδ2 est également une hypothèse qui a été émise.
Dans ce dernier cas, les changements conformationels et les surexpressions de
récepteurs devraient être très rapides et transitoires pour expliquer la cinétique
extrêmement rapide de l'activation par les PAg des cellules T Vγ9Vδ2.
Récemment, il a été démontré que l’utilisation d’anticorps monoclonaux dirigés contre
un complexe de récepteurs membranaires permettait d’empêcher la reconnaissance de cellules
tumorales par les lymphocytes Vγ9Vδ2 in vitro. Ce complexe a été identifié, il est constitué
par l'apolipoprotein A1 (ApoA1), une lipoprotéine à haute densité abondante dans le sérum,
et les sous unités de l’ATPase synthase (AS), un récepteur hétéromérique majoritairement
trouvé au niveau des mitochondries
171
. L’implication de ce complexe dans l'activation
sélective des cellules Vγ9Vδ2 a été plus directement documentée dans des systèmes
acellulaires, en utilisant des billes recouvertes d’AS purifiée et d’ApoA1. La reconnaissance
du complexe AS/APOA1 par les cellules Vγ9Vδ2 pourrait expliquer leur large activité antitumorale, puisque certaines sous-unités de l’AS sont surexprimées dans de nombreuses
tumeurs hématopoïétiques et solides. Cependant, plusieurs questions importantes subsistent
concernant la nature exacte du complexe AS/APOA1 reconnu ainsi que sa contribution dans
la reconnaissance des PAg par le TCR Vγ9Vδ2.
40
3.3.4 Sous populations de lymphocytes T Vγγ9Vδ
δ2.
Comme les lymphocytes T αβ CD4+ et CD8+, les lymphocytes T Vγ9Vδ2
comprennent différentes sous-populations cellulaires distinctes qui peuvent être distinguées
sur la base de l’expression de marqueurs de surface et de leurs fonctions effectrices comme la
production de cytokines et la cytotoxicité. L’expression des marqueurs CD45RA, CD27 et
CD16 permet notamment de définir plusieurs sous populations de lymphocytes T Vγ9Vδ2
avec des stades de maturation distinct ainsi que des distributions anatomiques spécifiques à
chacune d’elle 172, 173.
Les cellules Vγγ9Vδ
δ2 naïves (TN) de phénotype CD27+, CD45RA+, CD16-, constituent
20% des cellules T Vγ9Vδ2 dans le sang des donneurs sains. Ces cellules qui expriment les
récepteurs CCR7 et CD62L se logent majoritairement dans les ganglions lymphatiques où
elles représentent 80% des cellules T Vγ9Vδ2
172
. Ces cellules sont dépourvues de fonctions
effectrices immédiates mais peuvent proliférer vigoureusement en réponse au PAg et à l’IL-2
et se différencier en T γδ centrales mémoires (TCM) et effecteurs mémoires (TEM) 174. Il est à
noter que les cellules T Vγ9Vδ2 activés produisent très peu d’IL-2
175
. In vivo, leur
prolifération est donc dépendante de la production d’IL-2 par d’autres cellules comme les
lymphocytes T CD4+ activées
176
. On peut également penser que l’IL-15 produits par les DC
activées pourrait contribuer à l’expansion des T Vγ9Vδ2 lors d’infections, comme cela a été
récemment démontré pour les cellules NK 129.
Les cellules Vγγ9Vδ
δ2 centrales mémoires (TCM) de phénotype CD27+, CD45RA-,
CD16- constituent 60% des cellules T Vγ9Vδ2 dans le sang et 20% des cellules T Vγ9Vδ2
des ganglions lymphatiques des donneurs sains
172
. Une proportion de ces cellules expriment
les récepteurs aux chimiokines pro inflammatoires CCR5 et CXCR3 ce qui leur permet de
migrer au site de lésion. Toutefois, ces cellules présentent de très faibles capacités de lyse et
de production de cytokines immédiates
172
. Elles sont essentiellement capables de proliférer
en réponse au PAg en présenced’IL-2 ou d’IL-15 conduisant à leur différencieatio en T
effecteurs mémoires 174.
Il a récemment été démontré que l’expression du récepteur CXCR5 permettait d’identifier une
sous population de TCM présente principalement dans les zones B des ganglions lymphatiques.
Ces cellules qui expriment ICOS et CD40L et sécrètent des cytokines de type Th2 comme
l’IL-4 et l’IL-10 semblent spécialisées dans l’aide aux Lymphocytes B 177.
Les cellules Vγγ9Vδ
δ2 effectrices mémoires TEMh et TEMRA ont des phénotypes, des
modes d’activation et des rôles complémentaires, et représenteraient peut-être une voie
41
alternative de maturation terminale pour les cellules T Vγ9Vδ2 circulantes
172, 178
. Les
cellules Vγ9Vδ2 TEMh de phénotype CD27-, CD45RA- expriment un fort niveau de récepteurs
aux chimiokines pro inflammatoires CXCR3, CCR5 et CCR6, mais peu de NKR tels que
CD16, KIR et NKG2A. Ces cellules produisent des taux élevés d’IFNγ et de TNFα en
réponse à la stimulation par le PAg mais expriment peu de perforine intracellulaire. A
l’inverse, les cellules Vγ9Vδ2 TEMRA de phénotype CD27-, CD45RA+ expriment
constitutivement plusieurs NKR, dont le récepteur activateur CD16, et les récepteurs
inhibiteurs CD94/NKG2A et KIR, contiennent des taux élevés de perforine mais ne
produisent pas d’IFNγ et de TNFα en réponse aux PAg, suggérant leur implication
préférentielle dans des processus lytiques et notamment dans l’ADCC. En effet, ces cellules T
Vγ9Vδ2 « NK-like » sont particulièrement cytotoxiques contre les cellules tumorales
humaines
173
. Alors que les Ag solubles spécifiques des cellules T Vγ9Vδ2 permettent de
générer in vitro des lignées cellulaires en induisant la prolifération et la maturation de ces
cellules en TEMh1, la génération des cellules TEMRA semble indépendante du PAg et demeure
énigmatique 172 , 173.
Figure 8: Les sous populations de lymphocytes T Vγ9Vδ2. D’après Poupot et al, Immunol Letters, 2005 143.
42
3.3.5 Les lymphocytes T Vγγ9Vδ
δ2 et l’immunosurveillance anti-tumorale.
Les premières études suggérant l’implication des lymphocytes T γδ dans
l’immunosurveillance antitumorale proviennent d’expériences réalisées au début des années
90 indiquant que les lymphocytes T γδ d’individus sains présentent in vitro une activité
cytotoxique plus importante contre les cellules transformées que leurs homologues αβ sans
exposition préalable à cette tumeur
159, 179
. Par la suite, la preuve de l’implication des
lymphocytes T γδ dans l’immunosurveillance des tumeurs a été apportée par des études
qui démontraient la forte susceptibilité à la carcinogenèse cutanée des souris déficientes en
cellules T γδ
180 , 181
. Plusieurs études ont également montré la présence, in vivo, de
lymphocytes T γδ au niveau du site tumoral, dans certains modèles tumoraux tels que le
cancer du poumon 182, le cancer du rein 183, le cancer de la thyroïde 184, le carcinome rénal 185,
le carcinome des ovaires 186 et dans les lymphomes B
187
.
Le potentiel cytolytique des lymphocytes T Vγ9Vδ2 activés a été démontré vis-à-vis
de très nombreux types de cellules cancéreuses, à la fois in vitro
cellules de patients atteints de carcinome rénal
multiple
193
183 , 191
188-190
et ex vivo à partir de
, de la prostate
192
ou de myélome
. De plus, la découverte que bon nombre de cellules tumorales ont une voie du
mévalonate dérégulée et bio accumulent des PAg
161
permettant ainsi aux lymphocytes T
Vγ9Vδ2 de reconnaitre un large spectre de cellules tumorales in vitro suggère que ces cellules
participent activement aux défenses antitumorales chez l’homme. L’étude du potentiel
antitumoral de ces cellules in vivo, dans des souris immunodéficientes xénogréffés avec des
tumeurs humaines du nasopharynx
194
de mélanome et d’adénocarcinome pancréatique
195
appuient cette hypothèse. La démonstration des capacités des lymphocytes T Vγ9Vδ2 à
contrôler le développement tumoral in vivo provient également d’essais cliniques réalisés avec
les aminobisphosphonates (Acide Zoledronique, Pamidronate, Clodronate) qui peuvent être
utilisés pour amplifier les T Vγ9Vδ2 de patients atteint de cancer in vivo
193
. Dans une étude
réalisée par Wilhelm et ses collaborateurs, trois patients sur cinq atteint de myélome multiple
ou de lymphomes non-Hodgkinien de bas grade ont montré une réduction tumorale
significative sous traitement par le Pamidronate et l’IL2, associée à une augmentation du
nombre de cellules T Vγ9Vδ2 circulantes 196.
Comme les lymphocytes T CD8+, les lymphocytes T Vγ9Vδ2 activées expriment des
niveaux élevés de perforine, de granzymes A, B et M et la granulysine qui leur permettent
de détruire les cellules tumorales par dégranulation de leurs composants lytiques
197
. Comme
43
nous l’avons vu précédemment, l’expression de ces molécules est corrélée avec le stade de
différenciation des T Vγ9Vδ2
172, 173
. D’autre part, après activation, les lymphocytes T
Vγ9Vδ2, de la même façon que les lymphocytes T conventionnels αβ, expriment la molécule
FasL qui leur permet d’induire l’apoptose de cibles exprimant le récepteur Fas 198.
En plus du récepteur TCR Vγ9Vδ2, les cellules T Vγ9Vδ2 expriment une large
sélection de récepteurs inhibiteurs et activateurs qu'ils partagent avec des cellules NK, qui
permettent de moduler l’activation de ces cellules. Parmi les récepteurs inhibiteurs
fréquemment exprimés par les cellules T Vγ9Vδ2 on trouve les récepteurs aux molécules de
CMH I classiques ou non classiques KIR, ILT2 et NKG2A/CD94
199
. Ainsi, l’absence de
CMH I ou le masquage de ces molécules par des anticorps permet d’augmenter la cytotoxicité
des T Vγ9Vδ2 vis-à-vis de cibles tumorales mais également de cibles autologues saines
indiquant vraisemblablement que ces récepteurs assurent comme pour les NK, une
discrimination efficace entre les cellules normales et les cellules transformées
200
. La faible
expression des molécules de CMH I dans les cancers pourrait expliquer la réactivité des
cellules T Vγ9Vδ2 contre de nombreux types de tumeurs in vitro.
La grande majorité des cellules T Vγ9Vδ2 expriment également le récepteur de type
lectine NKG2D. Ce récepteur qui est considéré comme un corécepteur dans les lymphocytes
T αβ CD8+ semble comme chez les NK induire l’activation des lymphocytes T Vγ9Vδ2 en
l'absence de l'engagement du TCR
201
. Toutefois, il a également été démontré que le co-
engagement de ce récepteur avec le TCR Vγ9Vδ2 permettait de potentialiser la lyse de
cellules tumorales par les lymphocytes T Vγ9Vδ2 202. L’expression de NKG2D permet ainsi à
ces cellules de détecter et de détruire les cellules exprimant les ligands de stress MICA/B et
les ULBP1-4 fréquemment up régulés à la surface des cellules néoplasiques. Ainsi, TCR
Vγ9Vδ2 et NKR agissent de manière coordonnée pour diriger les réponses des cellules T
Vγ9Vδ2 qui résultent en fait de l'intégration des signaux inhibiteurs et activateurs délivrés par
ces différents récepteurs.
Il a été montré que des souris qui possèdent des lymphocytes T γδ déficients dans leur
capacité à produire de l’IFNγ sont beaucoup plus sensibles au développement tumoral induit
par des carcinogènes ou par l'inoculation de cellules de mélanome B16 que les souris
sauvages 203. La
libération de cytokines pro inflammatoire comme l’IFNγγ et le TNFα
α
produits rapidement par les cellules T Vγ9Vδ2 de type TEMH1 au contact de tumeurs
190
pourrait donc activement participer aux réponses immunitaires antitumorales. En effet, la
sécrétion d’IFNγ et de TNFα par les cellules T Vγ9Vδ2 contribue à la maturation des cellules
44
dendritiques immatures (iDC) et favorise la mise en place de réponses T αβ efficaces en
augmentant l’expression des molécules de costimulation, des molécules de CMH et la
production d’IL12 204 , 205 , 206, 207. Les lymphocytes T Vγ9Vδ2 activés au contact de la tumeur
pourraient donc fournir des signaux essentiels à la maturation des DC en l’absence de signaux
de dangers importants.
Immature DC
Mature DC
CD8 T cell
Figure 9 : Potentiel antitumoral des lymphocytes T Vγ9Vδ2 humains. Modifié d’après Zitvogel et al, Nat rev
immunol, 2006 208.
45
II.Echappement aux réponses immunitaires
II.1 Concept d’ « immunoediting ».
A son fondement, l’immunosurveillance antitumorale était considéré comme un
processus simple durant lequel le système immunitaire protégeait l’hôte du développement
d’une tumeur ou ne le protégeait pas 3. On pensait par ailleurs, que l’action protectrice du
système immunitaire avait lieu seulement aux stades les plus précoces de la tumorigénèse.
Cependant, les récentes études sur le développement de tumeurs dans des hôtes
immunocompétents indiquent que même si le système immunitaire ne contrôle plus la
croissance tumorale son influence sur l’évolution de la tumeur n’est pas terminée car il exerce
sans cesse une pression de sélection contre celle-ci 209.
Les expériences visant à étudier l’immunogénicité de tumeurs issues d’hôtes
immunocompétents ou immunodéficients démontrent bien la complexicité de l’interaction
entre les cellules cancéreuses et le système immunitaire. Par exemple, il est connu que
l’ensemble des tumeurs dérivées de souris sauvages ou de souris RAG2-/- se développent
progressivement lorsqu’elles sont transplantées dans des souris RAG2-/-. À l’inverse,
seulement une faible proportion des tumeurs issues de souris RAG2-/- se développent dans des
souris sauvages alors que toutes les tumeurs issues de souris sauvages poussent
progressivement lorsqu’elles sont transplantées dans des souris sauvages
similaire, les sarcomes induits par le MCA dans des souris nude ou SCID
12
210
. De manière
sont rejetés de
manière beaucoup plus fréquente que les sarcomes issus de souris sauvages lorsqu’ils sont
transplantés dans des souris immunocompétentes. Ces expériences nous démontrent que les
tumeurs ayant poussé dans des souris immunocompétentes sont beaucoup moins
immunogènes que les tumeurs ayant poussé dans des souris immunodéficientes. En effet, en
éliminant les cellules tumorales très immunogènes, le système immunitaire sélectionne les
variants tumoraux avec une immunogénicité réduite et favorise donc le développement de
tumeurs faiblement reconnues par le système immunitaire ou ayant acquis des mécanismes
pour bloquer son action.
46
Figure 10. Les trois phases du processus d’immonediting des cancers. Tiré de Dunn et al, Nat rev immunol,
2006 8.
Cette démonstration fonctionnelle du fait que les tumeurs portent l’empreinte de
l’environnement immunitaire dans lequel elles se sont développées amena l’équipe de Robert
Schreiber à inventer le concept d’immunoediting 1. Ce concept, qui englobe la notion
d’immunosurveillance, possède trois phases ; l’élimination, l’équilibre et l’échappement
(Figure 10).
La phase d’élimination correspond à la phase de reconnaissance et de destruction par
le système immunitaire de la tumeur. Elle peut aboutir à l’éradication totale de la tumeur ou à
l’établissement d’une phase d’équilibre dynamique entre le système immunitaire et la fraction
de cellules cancéreuse ayant échappé à la phase d’élimination. L’équilibre correspond à une
phase durant laquelle le système immunitaire continue à exercer une importante pression de
47
sélection sur les cellules tumorales permettant de contenir la tumeur mais qui est insuffisante
pour totalement l’éteindre en raison du grand nombre de cellules et de l’instabilité génétique
de celles ci. De nombreuses observations cliniques tendent à démontrer l’existence de cette
phase. Il a été rapporté plusieurs cas de cancers secondaires chez des personnes transplantés
avec des organes prélevés sur des donneurs ayant été atteints de cancer de nombreuses années
auparavant
211
. L’un des cas les plus célèbres correspond à un donneur qui avait été opéré en
1982 d’un mélanome invasif et pour qui aucune tumeur n’était détectable depuis plus de 15
ans au moment du don de ses deux reins. Malheureusement, des cellules tumorales
persistaient sous le contrôle du système immunitaire chez cet individu car les deux receveurs
de ses reins développèrent, en raison du traitement immunodépresseur, un mélanome
secondaire d’origine du donneur, qui fut fatal pour l’un d’eux 212. De nombreux cas de cancers
latents sont également découverts lors d’autopsies en l’absence de tout signe clinique ayant pu
faire penser à la présence d’un cancer chez ces individus 213, 214.
Une étude récente, réalisée par l’équipe de Schreiber sur un modèle murin de sarcome
induit, démontre de manière formelle l’existence de cette phase d’équilibre
215
. Dans cette
étude, les auteurs se sont intéressés aux souris qui ne développaient pas de tumeurs apparentes
200 jours après le traitement au MCA imaginant que dans ces souris des petites tumeurs
pouvaient exister dans une phase d’équilibre avec le système immunitaire. Après déplétion du
compartiment lymphocytaire T CD4 ou CD8 de ces souris, les auteurs ont ainsi pu
s’apercevoir qu’en l’absence d’immunité adaptative, la proportion de souris qui développait
des tumeurs tardives était bien plus importante. Par ailleurs, en transplantant dans d’autres
souris sauvages les tumeurs prélevées aux différents stades, les auteurs de cette étude ont pu
démontrer que les tumeurs qui sont maintenues à l’état d’équilibre par le système immunitaire
sont plus immunogènes que celles qui échappent naturellement à celui-ci.
On peut donc penser qu’une sélection de type darwinienne s’opère lors de la phase
d’équilibre où de nombreux variants tumoraux sont éliminés mais où les variants qui portent
des mutations leur conférant un avantage en terme résistance vis à vis du système immunitaire
sont sélectionnés. La phase d’équilibre peut donc durer de nombreuses années durant
lesquelles le système immunitaire et la tumeur sont en perpétuelle interaction. Pour entrer
dans la phase d’échappement et devenir cliniquement détectable, la tumeur doit accumuler un
certain nombre de changements génétiques et épigénétiques lui permettant de résister aux
différents effecteurs immunitaires ou d’induire un état de tolérance. Ainsi, afin d’échapper au
système immunitaire, les cellules tumorales peuvent employer de multiples stratégies qui ont
fait l’objet de nombreuses recherches ces dix dernières années. Quelques unes des stratégies
48
les plus communément retrouvées dans les tumeurs humaines seront développées dans les
paragraphes suivant.
II.2 Altération de l’expression des molécules de CMH.
Une diminution ou une perte de l’expression des molécules de CMH de classe I a été
décrite dans de nombreux types de tumeurs chez l’homme
216
. Plusieurs mécanismes ont été
décrits pour expliquer la diminution d’expression du CMH I dans ces différents types de
cancers. La perte d’hétérozygotie au niveau des gènes codant le CMH I est un phénomène
fréquent, observé par exemple dans approximativement 40% des cancers colorectaux
217
. Une
diminution d’expression de CMH I peut également être la conséquence de délétions ou de
mutations dans le gène codant la β 2-microglobuline. Par exemple, la perte d’hétérozygotie
du locus codant la β2-microglobuline et la présence de mutations sur l’allèle restant est un
scénario couramment observé dans les mélanomes
réponses aux traitements vaccinaux
219
218
qui explique souvent l’absence de
. La diminution de l’expression des gènes impliqués
dans l’apprêtement des antigènes comme TAP1 et TAP2 ou dans l’immunoprotéasome
comme LMP2 et LMP7 a également été observée dans plusieurs cas de cancers 220. Enfin, de
nombreuses tumeurs perdent la capacité d’augmenter l’expression du CMH I en réponse à
l’IFNγ 221.
La diminution ou la perte de CMH I ne permettant plus la reconnaissance des cellules
tumorales par les CTL, elle est généralement associée au caractère agressif de la tumeur 222 et
à un mauvais pronostic pour le patient
223
. Toutefois dans certains types de cancers une perte
totale de CMH I est associée à un bon pronostic comme dans les cancers du sein
224
. Cette
observation quelque peu paradoxale peut s’expliquer par une sensibilité accrue des cellules
tumorales à la lyse par les cellules NK en l’absence de CMH I 109.
Figure 11. L’altération de l’expression des molécules de CMH I permet aux cellules tumorales d’échapper à la
destruction par les CTL. Tiré de Zitvogel et al, Nat Rev Immunol, 2006 208.
49
II.3 Modulation de l’expression de l’antigène.
Durant ces 20 dernières années, de nombreux laboratoires se sont attachés à
caractériser la structure et la nature des différents antigènes tumoraux reconnus par les
lymphocytes T. Malheureusement, la perte ou la diminution d’expression d’antigènes
tumoraux correspond à un phénomène fréquent dans divers types de cancers 225. Par exemple,
dans les cellules de mélanomes l’expression de l’antigène Melan-A/MART-1 peut être
inhibée via son promoteur par l’action autocrine de facteurs solubles, permettant ainsi à ces
cellules d’échapper à la destruction par les clones de CTL spécifiques de cet antigène 226.
Par ailleurs, la génération continue de variant tumoraux, conséquence de la fréquence
importante de mutations dans ces cellules, peut conduire à l’émergence de cellules qui
n’expriment plus les mêmes antigènes tumoraux que ceux qui étaient reconnus initialement
par les lymphocytes T CD8+ et CD4+. Ce phénomène de dérive antigènique bien caractérisé
dans les infections virales a été décrit dans certains modèles de tumeurs 227.
II.4 Résistance à l’apoptose.
Comme nous l’avons vu dans le chapitre précédent les effecteurs immunitaires
peuvent utiliser 2 voies majeures pour induire la mort des cellules Tumorales : la voie de
cytotoxicité classique médiée par l’exocytose de granules lytiques et la voie des récepteurs à
domaine de mort comme Fas et TRAIL récepteur. Plusieurs études ont pu démontrer que
certaines cellules tumorales peuvent acquérir des mécanismes de résistance leur permettant
d’échapper à ces deux types de mort.
II.4.1 Résistance à l’apoptose initiée par les recepteurs à domaine de mort.
L’activation des récepteurs à domaine de mort comme Fas, TRAIL-R et TNF-R1 par
leur ligand initie la formation d’un complexe qui porte le nom de death inducing signaling
complex (DISC) constitué de la protéine adaptatrice FADD et des caspases 8 (FLICE) et 10.
Le recrutement de la caspase 8 au DISC entraine son proteoclivage et permet d’initier la voie
d’apoptose dépendante des caspases.
50
La proteine anti-apoptotique FLICE-inhibitory protein (FLIP) correspond à un
homologue inactif de la caspase 8 pouvant se fixer sur les domaines effecteurs de mort de
FADD et de caspase 8. De cette manière, FLIP empêche l’association de la caspase 8 à FADD
et inhibe ainsi l’apoptose induite par les récepteurs de mort 228. Cette protéine est couramment
up régulée dans certains types de cancers comme les mélanomes 229 dans lesquels elle pourrait
participer à la résistance des cellules tumorales au système immunitaire. Une étude réalisée
sur deux types de tumeurs murines a pu ainsi démontrer que la surexpression de FLIP permet
aux cellules tumorales d’échapper à la destruction par les lymphocytes T cytotoxiques in vivo
malgré une voie d’apoptose perforine/granzyme intacte 230.
Les tumeurs peuvent également résister à l’apoptose induite par FasL ou TRAIL suite
à la diminution de l’expression des récepteurs à domaine de mort comme cela a été observée
dans certains types de cancers comme les carcinomes hépatocellulaires
231
. Des mutations
dans les gènes codant les récepteurs Fas, TRAIL-R1 et TRAIL-R2 sont également
fréquemment observées dans divers types de cancers conduisant à l’expression de formes
tronquées pouvant jouer le rôle de dominant négatifs 232, 233.
Enfin, la présence de récepteurs solubles qui servent de leurres pour les ligands de
mort et empêchent leur fixation sur leurs récepteurs sont sécrétés par divers types de tumeurs.
Parmi ceux-ci on retrouve le CD95 soluble (sCD95) et le decoy receptor 3 (DcR3) qui
empêchent tous deux la fixation de CD95L (FASL) sur son récepteur CD95 (Fas)
234
. sCD95
est retrouvé à des niveaux élevés dans le sérum de patients atteint de divers cancers dans
lesquels il est associé au développement de la maladie 235. DcR3 est fréquemment surexprimé
dans les glioblastomes. Dans un modèle de gliosarcome chez le rat la surexpression de DcR3
se traduisait par une diminution de l’infiltrat lymphocytaire suggérant un rôle de ce récepteur
soluble dans l’échappement de certaines tumeurs au système immunitaire 236.
II.4.2 Résistance à la mort induite par perforine/granzyme :
Même si le sujet reste controversé, certaines cellules tumorales semblent pouvoir
exprimer des protéines capables d’interférer avec l’action cytolytique de la perforine et des
granzymes et ainsi échapper à la destruction par les effecteurs cytotoxiques. L’expression de
l’inhibiteur de granzyme B PI-9 et son homologue murin SPI-6 a été détectée dans plusieurs
types de tumeurs humaines et murines incluant les mélanomes, les carcinomes du colon et du
sein
237
. Selon les auteurs de cette étude, l’expression de SPI-6 dans les tumeurs murines est
corrélée à la résistance des ces cellules à la lyse par les CTL et l’expression forcée de cette
serpine dans une cellule tumorale est suffisante pour lui conférer une résistance in vitro et in
51
vivo. Toutefois, une récente étude a pu démontrer que les cellules de lymphomes sont
sensibles à la lyse dépendante de la perforine malgré un fort niveau d’expression de PI-9
suggérant que l’expression de cette inhibiteur de protéase pourrait ne pas être suffisant pour
protéger totalement les cellules tumorales de la destruction par les cellules cytotoxiques
238
.
En effet, comme nous avons pu le voir au chapitre précédent les granules cytolytiques
contiennent d’autres molécules effectrices comme le granzyme A ou la granulysine qui
peuvent agir en l’absence de granzyme B.
Par ailleurs, un autre mécanisme de résistance touchant l’action de la perforine a été
découvert dans les leucémies aigues myéloïdes. Les auteurs de cette étude ont pu observer un
défaut de fixation de la perforine sur la membrane plasmique des cellules leucémiques de
plusieurs patients et de certaines lignées cellulaires se traduisant par une absence de lyse par
les cellules NK 239.
II.5 Production de facteurs immunosuppresseurs.
De nombreux agents exerçant des effets immunosuppresseurs peuvent être produits
par les cellules tumorales elles mêmes ou par d’autres cellules au contact de la tumeur. Je
détaillerai dans ce chapitre quelques un des principaux facteurs retrouvés dans le
microenvironnement tumoral qui pourraient participer à la résistance des cellules tumorales au
système immunitaire.
II.5.1 Le TGF-β
β
Le TGF-β
β est une cytokine qui joue un rôle majeur dans la régulation de l’activation
de nombreux types de cellules immunitaires et dans le maintien de la tolérance périphérique
240
comme en témoigne les maladies inflammatoires généralisées dont souffrent les souris
TGF-β KO 241. De nombreuses lignées cellulaires de carcinomes humains secrètent du TGF-β
bioactif in vitro et on peut détecter, par immunohistochimie, du TGF-β sur des échantillons de
tissus issus de carcinomes d’origines variées
242
. Par ailleurs, la détection du TGF-β dans ces
divers types de cancers semble être corrélée à la progression de la maladie et au caractère
invasif de la tumeur notamment dans les cancers du sein où l’expression du TGF-β1 est
significativement supérieure dans les carcinomes invasifs avec atteinte ganglionnaire que dans
les carcinomes in situ 243. De même, des niveaux élevés de TGF-β dans le sérum des patients
sont associés à un mauvais pronostic dans de nombreux cancers 242.
52
La démonstration du rôle néfaste du TGF-β sur l’immunité anti tumorale provient
d’une étude du début des années 90 montrant que la transfection de cDNA codant le TGF-β
dans des tumeurs hautement immunogènes permettant à ces cellules d’échapper à la
destruction par le système immunitaire in vivo
244
. L’inhibition de l’immunité antitumorale
par le TGF-β s’explique en grande partie par la capacité de cette cytokine à inhiber
l’activation et la différenciation des lymphocytes T CD8+
240
. Ainsi, le blocage de la voie de
signalisation du TGF-β dans les lymphocytes T CD8+ par l’utilisation de LT CD8+
génétiquement insensibles au TGF-β permet de restaurer une immunité antitumorale efficace
in vivo malgré la présence de TGF-β 245. En effet, le TGF-β agit sur les CTL en réprimant
spécifiquement l’expression de gènes codant pour plusieurs molécules effectrices essentielles
à l’activité antitumorale de ces cellules dont granzyme A, granzyme B, Fas ligand et l’IFNγ
246
. Le TGF-β agit également sur les propriétés effectrices des cellules NK en diminuant leur
activité cytotoxique et leur capacité à produire de l’IFNγ
247
. Une étude réalisée sur des
patients atteints de cancer du poumon et colorectaux démontre que le taux élevé de TGF-β
retrouvé dans le plasma de ces patients est à l’origine d’une diminution d’expression du
récepteur NKG2D sur les cellules NK et de la faible capacité cytolytique de ces cellules 248.
Figure 12. Effets pleiotropes exercés par le TGF-β sur les différentes cellules de l’immunité. D’après Li et al,
Annu Rev Immunol, 2006 240.
53
II.5.2 L’Interleukine 10.
Plusieurs études ont pu décrire la présence de taux élevés d’IL-10 dans les biopsies et
dans le sérum de patients atteints de différents types de cancers
249
. Cette cytokine, connue
pour être un régulateur clef lors d’infections virales, bactériennes et parasitaires
250
, pourrait
de par ses propriétés anti-inflammatoires participer à l’inhibition des réponses immunitaires
anti-tumorales.
La présence d’IL-10 dans le sérum de patients est de mauvais pronostic dans les
carcinomes hepatocellulaires, pulmonaires, rénaux et colorectaux
249
. En effet, L’IL-10 limite
l’expression des molécules de classe II et de costimulation sur les macrophages et les DC et
inhibe la production de cytokines et de chimiokines proinflammatoires par ces cellules
250
diminuant ainsi fortement leurs capacités présentatrices d’antigènes tumoraux 251. Par ailleurs,
l’IL-10 peut agir directement sur les lymphocytes T CD4+ en inhibant leur prolifération et leur
capacité à produire de l’IL-2, de l’IFN-γ et du TNF-α 249. l’IL-10 agit également directement
sur les cellules tumorales en diminuant leur expression de CMH de classe I et de molécules
d’adhésion comme ICAM-I rendant ces cellules moins sensibles à la lyse par les CTL 252, 253.
II.5.3 L’Indoléamine 2,3-dioxygénase.
L’Indoléamine 2,3 dioxygènase (IDO) est une enzyme cytosolique impliquée dans
les premières étapes du catabolisme du tryptophane par la voie métabolique de la kynurénine
254
. Le rôle clef de cette enzyme dans la tolérance périphérique fut initialement découvert par
Munn et collaborateurs qui s’étaient aperçus que le traitement de souris gestantes avec un
inhibiteur de IDO provoquait le rejet de fœtus allogéniques par le système immunitaire de la
mère 255. Par la suite, plusieurs études réalisées sur des modèles murins ont pu démontrer que
l’inhibition de IDO pouvait exacerber l’inflammation et les symptômes de diverses
pathologies auto-immunes 256
, 257
.
Plusieurs mécanismes peuvent expliquer l’action immunosuppressive d’IDO.
L’accumulation dans le milieu extracellulaire de métabolites, comme la L-kynurénine,
générés par la dégradation du tryptophane via IDO peut conduire à l’inhibition de la
prolifération des lymphocytes T et induire leur apoptose
258
. Ces métabolites peuvent
également altérer la fonctionnalité des cellules NK en diminuant l’expression de récepteurs
activateurs comme NKp46 et NKG2D 259. Le stress cellulaire causé par la déplétion locale en
tryptophane par les cellules exprimant IDO pourrait également expliquer plusieurs des effets
immunomodulateurs de cette enzyme car les lymphocytes T sont très sensibles à la
54
concentration de certains acides aminés et notamment du L-tryptophane dans leur
environnement local
260
. Ainsi, Plusieurs études ont ainsi pu démontrer que l’arrêt de
prolifération des cellules T induit par IDO pouvait être réversé in vitro par l’addition de Ltryptophane dans le milieu 261, 262.
L’expression d’IDO a été détectée dans des cellules cancéreuses d’origines diverses
aussi bien que dans certains autres types cellulaires présents dans le microenvironnement
tumoral
261
. Par ailleurs, l’expression d’IDO dans le tissu tumoral est considérée par
différentes équipes comme un marqueur clinicopathologique de mauvais pronostic
263, 264
.
L’expression d’IDO dans le stroma tumoral pourrait donc participer à l’établissement d’un
microenvironnement immunosuppresseur qui favoriserait le développement de tumeurs dans
des individus immunocompétents comme le démontre la capacité d’IDO à prévenir le rejet de
tumeurs greffées dans des souris préalablement immunisées 261.
L’expression d’IDO par différentes tumeur peut être la conséquence des changements
génétiques qui ont lieu lors de la transformation oncogénique
265
. L’expression d’IDO est
également inductible dans certaines lignées tumorales sous l’effet de médiateurs
inflammatoires comme l’IFNγ 266. L’expression d’IDO observée dans les biopsies de patients
pourrait dans ce cas être la conséquence de l’action de cytokines pro-inflammatoires produites
lors de réponses immunitaires initiales de l’hôte contre la tumeur.
II.5.4 Expression des molécules de CMH I non classiques HLA-G.
Il existe Sept isoformes de la molécule de CMH I non classique HLA-G
correspondant à des formes membranaires (HLA-G1, G2, G3 et G4) et à des formes solubles
(HLA-G5, G6 et G7), toutes générés par épissage alternatif du transcript primaire d’HLA-G
267
. Des formes solubles peuvent également exister par clivage protéolytique de formes
membranaire comme c’est le cas pour HLA-G1 soluble.
HLA-G fut initialement décrit pour sa contribution à la tolérance fœto-maternelle de
par sa capacité à inhiber la cytotoxicité des NK de la cavité utérine
268
. Par la suite, plusieurs
groupes ont pu établir que HLA-G pouvait se fixer sur les récepteurs ILT2, ILT4
(LILRB2/CD85d) et KIR2DL4 et exercer des fonctions immunosuppressives sur d’autres
cellules que les NK
269
. En effet, l’expression d’HLA-G1 à la surface des cellules cibles peut
bloquer la cytotoxicité des lymphocytes T CD8+
270
. HLA-G1 soluble peut également, en se
fixant sur le corécepteur CD8, entrainer l’apoptose dépendante de Fas/Fas ligand des
lymphocytes T CD8+ et des NK
271, 272
. La présence d’HLA-G5 soluble dans le milieu
extracellulaire ou l’expression de HLA-G1 à la surface d’APC peut bloquer la prolifération et
55
la sécrétion de cytokines des lymphocytes T CD4+ en se fixant sur le récepteur ILT2 exprimé
sur une proportion considérable de ces cellules
273, 274
. Il semblerait également que HLA–G
puisse induire la conversion de lymphocytes T CD4+ et CD8+ en un nouveau type de
lymphocytes T aux propriétés immunorégulatrices caractérisé par une faible expression de
CD4 et de CD8 à leur surface
275
. Enfin, l’interaction de HLA-G avec ILT4 à la surface des
DC inhibe leur maturation, conduisant ainsi à la génération de DC immatures aux propriétés
tolérogènes 276.
Les propriétés immunosuppressive de HLA-G ont logiquement amené la communauté
scientifique à s’intéresser au rôle de HLA-G dans la progression tumorale et dans
l’échappement immunitaire des cancers. Ainsi, l’étude de plus 1000 lésions malignes par
différents groupes ces 5 dernières années a permis de démontrer que l’expression de HLA-G
est un événement fréquent dans de nombreux types de cancers incluant notamment les cancers
de l’ovaire, du sein, du colon, du poumon et les mélanomes cutanés
267
. L’expression de
HLA-G est clairement associée au processus de transformation oncogénique car l’expression
de ces protéines n’est pas détectée dans les tissus sains adjacents. De plus, l’expression
d’HLA-G a été associée à l’avancée clinique de la maladie dans de nombreux types de
cancers. Par exemple, dans les cancers colorectaux, l’expression d’HLA-G est un facteur
indépendant de mauvais pronostic de survie à long terme car il est corrélé à un haut grade
histologique, à une diminution des réponses immunes et à une atteinte ganglionnaire plus
fréquente
277
. De même, dans les cancers gastriques, il a été observé une corrélation inverse
entre le nombre de NK infiltrant la tumeur et l’expression d’HLA-G 278. Toutefois, le nombre
de cellules exprimant HLA-G dans les lésions cancéreuses étudiées ainsi que la nature des
cellules l’exprimant varie entre les patients atteints d’une même maladie. De plus,
l’expression de HLA-G ne semble pas être répartie de façon homogène sur l’ensemble de la
tumeur mais plutôt focalisée sur certaines zones 267.
On retrouve également des taux anormalement élevés de HLA-G soluble dans le
sérum et les ascites de patients soufrant de divers cancers : leucémie, mélanome, gliome,
carcinome ovarien et carcinome du sein
267
. HLA-G circulant dans le sérum des patients
pourrait affecter les réponses immunitaires de manière systémique et favoriser le
développement de la tumeur ou de métastases. Ainsi, les patients atteints de glioblastomes qui
présentent des taux élevés de HLA-G dans le sang ont une médiane de survie
significativement plus faible que ceux qui ont des taux normaux
279
. Dans le cas du
mélanome, la présence d’HLA-G soluble dans le sérum est corrélée à la taille et au stade de la
tumeur et à l’absence de réponse aux traitements à base de haute dose d’IFNα 280.
56
Plusieurs mécanismes peuvent expliquer l’expression de HLA-G dans les différentes
lésions tumorales étudiées. Certains facteurs présents dans le microenvironnement tumoral
comme l’IFNγ, la kynurénine, l’IL-10 ou la protéine HIF-1α exprimée en réponse au stress
hypoxique, peuvent stimuler dans certains types cellulaires l’expression de HLA-G
281
. La
sélection de variant tumoraux exprimant HLA-G sous la pression du système immunitaire
endogène pourrait également expliquer l’expression de HLA-G détectée dans un grand
nombre de pathologies malignes
281
. Le fait que HLA-G soit en règle générale associée à
l’avancée de la maladie appuie cette hypothèse.
Figure 13. Mécanismes d’inhibition de l’immunité antitumorale par HLA-G. D’après Rouas-Freiss et al, sem
cancer biol, 2007
281
.
57
II.5.5 Interaction entre PD-1 et PD-L1/ PD-L2.
Programmed death 1 (PD-1) est un récepteur exprimé par de nombreux types
cellulaires incluant les lymphocytes T, B, les monocytes et les DC activées. PD-1 n’est pas
exprimé sur les lymphocytes T au repos mais en revanche il est rapidement up régulé sur ces
derniers suite à l’activation par le TCR 282. Si son rôle reste relativement méconnu sur les DC
et sur les macrophages, PD-1 est considéré comme un corécepteur inhibiteur pour les
lymphocytes T activés. L’engagement de PD-1 avec ses ligands PD-L1 (B7-H1) et PD-L2
(B7-DC) conduit, via la phosphorylation des motifs (ITIM) et (ITSM) présents dans sa partie
intracellulaire, au recrutement et à l’activation de phosphatases SHP1 et SHP2
283
. Ces
phosphatases recrutées par PD-1 à la synapse immunologique lors de l’activation T vont avoir
pour conséquence de diminuer l’intensité des signaux transmis par l’engagement du TCR
284
.
L’activation de PD-1 conduit notamment à réduire l’activité de la PI3K ainsi qu’à diminuer la
phosphorylation de CD3zeta, ZAP 70 et PKCθ induite par le TCR285. De cette manière PD-1
peut influer sur la prolifération, la survie ainsi que sur les réponses effectrices des
lymphocytes T 282.
Par ses capacités à réguler les fonctions des cellules T, PD-1 joue un rôle important
dans les mécanismes de tolérance centrale et périphérique. Ainsi, les souris Pdcd 1-/déficientes en PD-1 développent un nombre accru de maladies auto-immunes spontanées
287
286,
. PD-1 joue également un rôle déterminant dans la régulation de l’inflammation lors
d’infections bactériennes ou virales chroniques. Ce récepteur a ainsi été récemment impliqué
dans l’épuisement progressif des réponses T cytotoxiques observées dans les souris infectées
avec le LCMV ou chez les patients atteints d’infections virales chroniques comme le HIV,
HBV ou HCV
humaines
288
282
. Les défauts de fonctionnalité des lymphocytes T infiltrant les tumeurs
et la surexpression fréquente de PD-1 sur ces mêmes cellules
289
a conduit
plusieurs équipes à s’intéresser au rôle du récepteur PD-1 et de ses ligands PD-L1 et PD-L2
dans la régulation des réponses immunitaires antitumorales.
L’expression de PD-L1 a été détectée dans de nombreuses tumeurs d’origines diverses
290
dans lesquelles elle est associée à un pronostic défavorable pour les patients
291, 292
.
L’expression de PD-L1 par les tumeurs pourrait donc diminuer les réponses immunitaires de
l’hôte comme le suggère une étude dans les cancers ovariens indiquant que l’expression de
PD-L1 est inversement corrélée à la présence de lymphocytes T CD8+ infiltrant la masse
tumorale 293. En effet, plusieurs études réalisées ces dernières années sur des modèles murins
ont pu démontrer que l’expression de PD-L1 sur les cellules tumorales favorisait le
développement de tumeurs dans souris immunocompétentes en empêchant l’activation et les
58
fonctions cytotoxiques de lymphocytes T CD8+ spécifiques d’antigènes tumoraux
290, 294, 295
.
De plus, sur des prélèvements de patients atteints de mélanomes le blocage de PD-1 par un
anticorps totalement humanisé augmentait fortement les réponses prolifératives et
fonctionnelles de lymphocytes T CD8+ spécifiques d’antigènes tumoraux in vitro 290.
Figure 14. Mécanismes d’inhibition de l’immunité antitumorale par PD-L1. D’après Zou et al, Nat Rev
Immunol, 2008 296.
II.5.6 Rôle des galectines
Les galectines forment une famille de lectines solubles très conservées au cour de
l’évolution qui partagent des séquences d’acides aminés consensus leur permettant de
reconnaître des glycoconjugués riches en N-acetyl-lactosamine. 15 galectines ont pu être
identifiées chez les mammifères jusqu’à présent, lesquelles participent à divers processus
biologiques et notamment à la régulation des réponses immunitaires innées et adaptatives
297
.
De manière intéressante, plusieurs études démontrent que l’expression des galectines est
fréquemment dérégulée dans divers cancers 298. L’altération de l’expression des galectines est
59
le plus souvent corrélée au potentiel agressif des tumeurs et à l’acquisition de phénotype
métastatique suggérant que les galectines peuvent moduler la progression tumorale et influer
sur l’issu clinique de la maladie. En effet, plusieurs études démontrent que les galectines sont
impliquées dans divers aspects de la biologie des cancers incluant les processus de
transformation, de prolifération et d’apoptose 298.
De par leurs propriétés immunomodulatrices certaines galectines surexprimées par
divers types de cancers pourraient également participer à inhiber les réponses immunitaires.
Plusieurs études se sont ainsi intéressées à la galectine-1 connue pour être impliquée de
manière critique dans la modulation des réponses T 297. En effet, la galectine-1 peut inhiber la
prolifération et la sécrétion de cytokines par les cellules T en interférant avec la signalisation
proximale du TCR
299
et en sensibilisant ces cellules à la mort induite par FasL
300
. Des
expériences utilisant des tumeurs génétiquement modifiées pour exprimer des taux variables
de galectine-1 ont ainsi permis de démontrer que l’expression de la galectine 1 permettait aux
cellules tumorales d’échapper à la destruction par le système immunitaire en induisant une
apoptose massive des effecteurs T antitumoraux
301
. Le rôle néfaste de la galectine-1 sur les
réponses antitumorale est également appuyé par le fait que l’expression de la galectine 1 est
inversement corrélée à la présence de CD3+ infiltrant la tumeur dans certains types de cancers
302
.
Figure 15. Mécanismes d’inhibition de l’immunité antitumorale par les galectines. D’après Liu et al, Nat rev
cancer, 2005
298
.
60
D’autres galectines, comme la galectine-3, produites par les tumeurs ou dans le
microenvironnement tumoral pourraient également participer à l’inhibition des réponses
antitumorales. En effet, la galectine-3 extracellulaire peut se fixer sur les TCR portant des
résidus N-acetyl-lactosamine et former des complexes à la surface des lymphocytes T ayant
pour conséquence de prévenir l’association entre les TCR et les corecepteurs CD4 ou CD8,
nécessaires à la transmission du signal
303 , 304
. Ainsi, une étude a récemment démontré un
défaut de fonctionnalité des lymphocytes T CD8+ issus d’ascites de patients atteints de
carcinomes gastriques, ovariens ou de l’endomètre qui pouvait être restauré en dissociant les
complexes TCR-galectine-3 304.
II.5.7 Expression de FasL et TRAIL
L’expression de FasL a été détectée dans de nombreux tissus tumoraux et il a été
démontré in vitro que les tumeurs exprimant FasL peuvent induire la mort de cibles sensibles
à l’apoptose induite par Fas, démontrant ainsi que ces récepteurs sont fonctionnels
305, 306
. Par
ailleurs, dans plusieurs types de cancers, on observe une apoptose accrue parmi les
lymphocytes infiltrant les tumeurs exprimant FasL
306, 307
. Ces évidences ajoutées aux études
suggérant que l’expression de FasL peut conférer un privilège immunologique à certains
tissus
308
ont amené la communauté scientifique à envisager l’expression de FasL sur les
tumeurs comme un possible mécanisme d’échappement à l’immunité tumorale. Ainsi, de
nombreuses études réalisées sur des modèles animaux ont pu démontrer la capacité de FasL
exprimé sur les tumeurs à diminuer les réponses immunitaires antitumorales. Par exemple,
l’inhibition de l’expression de FasL au moyen de siRNA dans des tumeurs du colon greffées
dans des souris syngéniques immunocompétentes diminue la croissance tumorale et facilite le
rejet de ces tumeurs
309
. De même, la croissance de mélanomes exprimant FasL est ralentie
dans les souris exprimant un récepteur Fas muté comparé aux souris sauvages 310.
Malgré ces nombreuses évidences, ce mécanisme de contre attaque des tumeurs contre
le système immunitaire est très controversé. Plusieurs études ont pu démontrer que la
surexpression de FasL dans les cellules tumorales n’augmentait pas la croissance tumorale
mais au contraire pouvait faciliter le rejet de ces tumeurs dans des souris immunocompétentes
en entrainant le rejet aigu des cellules cancéreuses par les neutrophiles
311, 312
. Des facteurs
supplémentaires in vivo pourraient conditionner le devenir de tumeurs exprimant FasL et ainsi
expliquer les résultats divergeant obtenus entre les différentes études menées sur le sujet. Le
niveau d’expression de FasL pourrait jouer un rôle important car la plupart des études
démontrant un effet antitumoral de cette molécule utilisaient des modèles murins de tumeurs
61
transfectées avec FasL exprimant des taux de FasL bien supérieurs à ceux retrouvés dans les
cellules tumorales humaines. Les facteurs présents dans le microenvironnement tumoral
pourraient également influer sur les conséquences de l’expression de FasL sur les cellules
tumorales. Par exemple, la présence de TGF-β permet de prévenir le rejet de tumeurs
exprimant FasL par les neutrophiles 313.
Une autre molécule pourrait également être impliquée dans l’apoptose des effecteurs T
par les cellules tumorales. Il s’agit du récepteur TRAIL (Tumor necrosis factor-related
apoptosis inducing ligand) qui lorsqu’il est surexprimé sur certaines cellules tumorales peut
induire la mort des effecteurs immunitaires exprimant les recepteurs TRAIL-R1 ou TRAILR2 314.
II.5.8 La Prostaglandine E2
Les prostaglandines (PG) sont de petits médiateurs lipidiques impliqués dans la
régulation de nombreux processus biologiques incluant notamment les fonctions rénales,
l’agrégation plaquettaire et la libération de neurotransmetteurs. La PGE2, une des plus
étudiées de ces molécules, est également connue pour réguler certains aspects critiques de la
réponse immunitaire.
5.8.1 Synthèse de la PGE2
La production de PGE2 est initiée par la libération d’acide arachidonique (AA) à partir
de phospholipides membranaires par l’action de la phospholipase A2 (PLA2)315. L’acide
arachidonique ainsi libéré est ensuite converti en PGH2 par les cyclooxygénases (COX) aussi
connues sous le nom de prostaglandin endopéroxyde H synthases. Les COX sont des enzymes
ayant 2 fonctions leur permettant de transformer l’AA en PGG2 via leur fonction
cyclooxygénase, et de réduire la PGG2 en PGH2 via leur fonction endopéroxidase.
La synthèse de PGE2 est déterminée en grande partie par l’activité des enzymes COX.
Il existe 2 isoformes majeures de ces enzymes (COX1 et 2). COX1 est exprimée dans la
majorité des tissus où elle permet une production basale de PG nécessaire aux fonctions
physiologiques de l’organisme. A l’inverse, COX2 n’est pas détectable dans les tissus
normaux mais l’expression de cette enzyme est induite par de nombreux stimuli
inflammatoires ou mitogènes. Ainsi, les cytokines comme le TNFα 316, l’IFNγ
endotoxines bactériennes comme le LPS
318
317
ou les
peuvent induire l’expression de COX2 et
augmenter la synthèse de PGE2 dans les macrophages. De même, plusieurs oncogènes et
62
facteurs de croissances surexprimés par de nombreuses tumeurs peuvent augmenter la
transcription de COX2 319. Par exemple, d’importantes quantités de COX2 sont détectées dans
les tumeurs du sein sur-exprimant HER-2/neu en raison d’une sur-activation de Ras dans ces
cellules. 320.
La PGH2 synthétisée par les enzymes COX est ensuite convertie en PGE2 par l’action
de la PGE2 synthase (PGES). Cette enzyme est présente sous deux formes, la forme
cytosolique cPGES et membranaire mPGES ayant des fonctions et des modes d’expression
différentes. La cPGES est exprimée constitutivement dans de nombreux types cellulaires et
des expériences de cotransfection ont démontré que cette enzyme est couplée
fonctionnellement à COX1 dans la régulation de l’homéostasie cellulaire
321
cPGES, l’expression de mPGES semble synchronisee avec celle de COX2
322
. A l’inverse de
et comme cette
dernière elle peut être induite par plusieurs stimuli pro-inflammatoires incluant notamment
l’IL-1β, le TNFα et le LPS
323
. De plus, l’enzyme mPGES est fonctionnellement couplée à
COX2 avec laquelle elle colocalise au niveau de la membrane perinucléaire pour permettre un
transfert plus efficace du substrat PGH2 entre ces deux enzymes 321.
5.8.2 Récepteurs de la PGE2
Figure 16 . Voies de signalisation initiées par les recepteurs à la PGE2 EP1-4. D’après harris et al, trends
immunol, 2002 325.
La PGE2 peut se fixer sur quatre récepteurs à sept domaines transmembranaires
différents appelés EP1, EP2, EP3 et EP4. Ces récepteurs sont couplés à différents types de
protéines G et utilisent des voies de signalisation différentes. EP1 est couplé à des protéines
63
Gq/p et permet d’induire une augmentation de calcium intracellulaire alors qu’EP2 et EP4
sont couplés à des protéines Gs et augmentent l’AMPc intracellulaire en activant l’adénylate
cyclase. A l’inverse EP3 qui est couplé à des protéines Gi inhibe l’adénylate cyclase et ainsi
diminue la concentration en AMPc intracellulaire. Toutefois, la présence de transcrits
alternatifs de EP3 capables comme EP2 et EP4 de se lier avec des protéines Gs, a également
été observé chez la souris 324.
5.8.3 PGE2 et immunité
De nombreux groupes de recherches se sont intéressés à l’influence de la PGE2 sur le
système immunitaire ces vingt dernières années. Ces études ont démontré que ce facteur peut
avoir des effets anti et pro-inflammatoires selon le type cellulaire ciblé et selon la dose
produite et les facteurs qui y sont associés.
Par exemple, la PGE2 peut accentuer l’inflammation en facilitant le recrutement des
cellules immunitaires au site d’infection par ses effets vasodilatateurs sur les cellules
endothéliales 326. Dans les tissus périphériques, la PGE2 produite en quantité importante lors
d’infections
327
lymphatiques
semble également jouer un rôle dans la migration des DC vers les ganglions
328-330
. En effet, la PGE2, augmente l’expression du récepteur CCR7 et ainsi,
sensibilise les DC aux chimiokines CCL19 et CCL21 produites au niveau des ganglions
lymphatiques
331
. Ces effets sont médiés via une augmentation de l’AMPc induit par la
fixation de la PGE2 sur les récepteurs EP2 et EP4 à la surface des DC 329 , 330.
Si la PGE2 semble nécessaire à la bonne migration des DC, elle pourrait à l’inverse
jouer un rôle néfaste sur les fonctions de ces cellules. En effet, la PGE2 inhibe dans certains
cas la maturation des DC en diminuant leur expression de CMH II et de molécules de
costimulation affectant ainsi leur capacité de présentation d’antigènes aux cellules T
332
. La
présence de PGE2 lors de l’activation des DC modifie également le profil des cytokines
produites par ces cellules et influe sur le type de réponse T qu’elles induisent. Ainsi, la PGE2
en augmentant la production d’IL-10 des DC activées au LPS inhibe leur production d’IL-12
332, 333
et favorise donc la différenciation des cellules T naïves en cellules Th2 334. Par ailleurs,
la présence de PGE2 lors du processus de maturation des DC semble également pouvoir
induire leur différenciation en DC tolérogénes caractérisées par l’expression d’IDO 335.
La PGE2 régule également la production de cytokines des macrophages activés via les
récepteurs EP2 et EP4 en inhibant leur production d’IL-1β, d’IL-8, d’IL-12 et de TNFα, et en
favorisant leur production d’IL10
336
. La PGE2 en se fixant sur le récepteur EP2 diminue
également les capacités phagocytiques des macrophages 337.
64
En plus d’agir sur les CPA, la PGE2 peut également exercer divers effets inhibiteurs
directement sur les cellules T. La plupart des études se sont focalisées sur l’action de la PGE2
sur les lymphocytes T CD4+ et ont permis de démontrer la capacité de la PGE2 à inhiber la
prolifération de ces cellules induite par divers mitogènes ou leur antigène spécifique
338, 339
.
Cette inhibition dépend de l’augmentation d’AMPc intracellulaire induit par la fixation de la
PGE2 sur les récepteurs EP2 et EP4
339, 340
. En effet, l’AMPc intracellulaire est le principal
substrat de la protéine kinase A (PKA) de type I qui en inhibant lck permet de diminuer la
phosphorylation des motifs ITAM du complexe TCR/CD3 341 , 342.
Si la PGE2 inhibe les réponses prolifératives des lymphocytes T CD4+ elle permet par
contre de les protéger de l’apoptose induite par AICD en inhibant l’expression de FasL à leur
surface 343 et en activant la voie de signalisation de la PI3 kinase 344. La PGE2 agit également
sur la production de cytokines des T CD4+. Elle inhibe spécifiquement la production de
cytokines de type 1 comme l’IFNγ et l’IL-2 mais n’influe pas sur la production de cytokines
de type 2 comme l’IL-4 et l’IL-5
345
. La PGE2, lorsqu’elle est présente durant le priming des
lymphocytes T interfère également directement avec la différenciation des cellules T naïves
en Th1 en favorisant plutôt leur différenciation en lymphocytes Th2 346.
La PGE2 augmente également la fonctionnalité des Treg in vitro et stimule la
différenciation des cellules T CD4+ effectrices en cellules T CD4+CD25+ régulatrices
347, 348
.
En effet, la PGE2 présente lors de l’activation de cellules T effectrices CD4+CD25- permet
d’augmenter l’expression du facteur de transcription spécifique des T régulateurs Foxp3 et
confère un caractère immunomodulateur à ces cellules.
Peu d’études se sont intéressées aux effets de la PGE2 sur l’activité des lymphocytes T
CD8+. Néanmoins, il semblerait que cette molécule influe de manière comparable sur les
cellules T CD8+ que sur les cellules T CD4+ en inhibant la prolifération et la production
d’IFNγ de ces dernières 349, 350. La PGE2 peut également inhiber les capacités cytotoxiques des
T CD8+ in vitro et in vivo
351
et augmenter l’expression des récepteurs inhibiteurs
CD94/NKG2A sur ces dernières, les rendant plus sensibles à l’inhibition par HLA-E
352
.
Même si aucune étude ne le démontre formellement, il y a fort à penser que l’activité
inhibitrice de la PGE2 sur les lymphocytes T CD8+ ait pour origine une atténuation de la
signalisation TCR induite par l’activation de la PKA I comme cela a pu être démontré avec
les lymphocytes T CD4+. De plus, il a été démontré récemment qu’une augmentation de
l’AMPc intracellulaire permettait d’inhiber les fonctions cytolytiques de lymphocytes T CD8+
spécifiques d’antigènes de mélanomes via l’action de la PKA I 353.
La PGE2 agit de différentes manières sur l’activité des cellules NK. Elle limite la
production d’IFNγ des NK induite par la combinaison d’IL-12 et d’IL-18 en se fixant sur le
65
récepteur EP2. La PGE2 peut aussi interférer avec les réponses cytotoxiques et prolifératives
de ces cellules en diminuant l’expression de la chaine commune γc du récepteur à l’IL-2 et à
l’IL-15
354, 355
. Enfin, la PGE2 inhibe directement la lyse de cellules cibles par les NK via
l’activation de la PKA I par l’AMPc 356.
5.8.4 PGE2 et tumeurs
La surexpression de COX2 est un phénomène fréquent dans le processus de
cancérogénèse
357
. L’up-régulation de COX2 est particulièrement frappante dans les cancers
du colon où l’expression de cette enzyme est présente dans plus de 85% des adénocarcinomes
colorectaux alors qu’elle est indétectable dans les muqueuses de colons sains
358
. De manière
similaire, l’enzyme COX2 est retrouvée à des niveaux élevés dans 40% des tissus tumoraux
issus de patientes atteintes de cancers du sein alors qu’elle est indétectable dans les tissus
sains adjacents des mêmes patientes 359. Dans de nombreux types de cancers la surexpression
de COX2 est accompagnée par une surproduction de PGE2. Celle-ci est associée à une
augmentation de la prolifération
360
, du pouvoir invasif
361, 362
et de l’angiogénèse
363
des
cellules tumorales. Ainsi par exemple, dans les cancers du sein l’expression de COX2 et la
production de PGE2 sont des facteurs de mauvais pronostic de survie à long terme car ils sont
associés à un grade élevé et à la dissémination de la tumeur 364, 365.
De par ses capacités immunosuppressives importantes, décrites dans le paragraphe
précédent, la PGE2 produite par les cellules tumorales a également été impliquée dans
l’inhibition des réponses immunitaires antitumorales dans de nombreux types de cancers. Il a
notamment été démontré que la PGE2 produite par différentes lignées de tumeur du poumon,
peut inhiber les capacités des DC à activer des cellules T in vitro et in vivo en induisant une
surproduction d’IL-10
366, 367
. Ainsi, dans un modèle de carcinome pulmonaire chez le rat
l’inhibition de la production de PGE2 par des inhibiteurs de COX2 ou avec des anticorps
bloquant anti-PGE2 était accompagné d’une diminution de la production d’IL-10 au site de la
tumeur et conduisait à une réduction de la croissance tumorale
368
. La production de PGE2
détectée dans les cancers pourrait également être à l’origine de l’accumulation de T régulateur
fréquemment observée dans ce type de pathologies
369
. En effet, la PGE2 présente dans le
surnageant de tumeurs du poumon augmente l’expression de FOXP3 dans les lymphocytes T
CD4+ et dans un modèle murin de cancer du poumon, il a été démontré que l’inhibition de
COX2 permettait de réduire le nombre de Treg infiltrant la tumeur
348
. Enfin, le rôle de la
PGE2 et de l’enzyme COX2 dans l’inhibition des réponses immunitaires antitumorales est
66
appuyé par une série d’études sur des tumeurs murines où l’inhibition de COX2 permet
d’améliorer de manière significative l’effet de vaccins antitumoraux 370, 371, 372 .
Figure 17. Modulation des réponses immunitaires antitumorales par la PGE2.
67
III. Cellules du microenvironnement Tumoral et Immunité
Durant les 30 dernières années la majorité des études sur le cancer se sont focalisées
sur les cellules tumorales afin de déterminer les fonctions des oncogènes et des gènes
suppresseurs de tumeur ainsi que les différentes voies de signalisation qui régulent la
prolifération, la survie ou la mort cellulaire. Ces études ont apporté beaucoup à la
compréhension des mécanismes de transformation cellulaire mais elles ont largement ignoré
le fait que les cancers sont des entités cellulaires hétérogènes dont le développement et la
survie dépend des interactions réciproques entre les cellules initiatrices génétiquement
altérées et le microenvironnement cellulaire dans lequel elles vivent. Ainsi, ces dernières
années
d’intenses
recherches
ont
été
réalisées
afin
de
mieux
caractériser
ce
microenvironnement cellulaire composé en majorité de fibroblastes, de cellules immunitaires,
de cellules endothéliales, de cellules épithéliales et de cellules graisseuses
373
et de
comprendre comment celui-ci favorise la croissance tumorale. Les études qui se sont
intéressées au rôle de ces différentes cellules dans le contexte de l’immunité antitumorale
indiquent que de nombreux types cellulaires modifiés ou recrutés par les tumeurs peuvent
altérer les réponses immunitaires antitumorales pour participer à l’établissement de l’état de
tolérance fréquemment observé dans les cancers 374.
III.1 Fibroblastes associés aux cancers (CAF)
Les fibroblastes sont des cellules non épithéliales, non vasculaires et non
hématopoïétiques enfouies au milieu de la matrice du tissu conjonctif dont ils représentent le
principal composant cellulaire. Ces cellules sont facilement reconnaissables in vitro par leur
morphologie très allongée et leur capacité à adhérer au plastique en culture
375
mais l’absence
de marqueurs spécifiques sur ces cellules reste un frein à l’étude de ces cellules in vivo. En
effet, s’il existe plusieurs marqueurs caractéristiques de ces cellules, aucuns d’entre eux n’est
réellement exclusif, ni même présent sur l’ensemble des fibroblastes du corps humain. Parmi
ceux-ci, les marqueurs qui semblent être les plus spécifiques sont le « fibroblast-specific
protein 1 » (FSP-1), la vimentine, l’α-smooth muscle actine (α-SMA) et la desmine 376.
Les fibroblastes participent activement à la synthèse des fibres de la matrice
extracellulaire (ECM) notamment via la production de collagène de type I, de type III, de type
V et de fibronectine. Ils contribuent à la formation de la membrane basale par la sécrétion de
collagène de type IV et de laminine et sont également d’importants producteurs de protéases à
68
l’origine de la dégradation de l’ECM comme les MMP ce qui souligne leur rôle crucial dans
l’homéostasie des tissus conjonctifs
376
. Les fibroblastes sont essentiels lors du processus de
cicatrisation, car ils envahissent les zones de lésion et synthétisent les principaux constituants
de l’ECM servant de structure pour l’arrivée d’autres types cellulaires
375
. Les fibroblastes
isolés des sites de cicatrisation présentent un phénotype dit « activé » caractérisé par la
sécrétion de quantités plus importantes de constituant de l’ECM et une prolifération accrue en
comparaison avec leurs homologues des tissus sains 377.
Les fibroblastes représentent le constituant cellulaire majoritaire dans le stroma
tumoral et dans certains types de cancers ces cellules sont mêmes en nombre plus important
que les cellules tumorales elles mêmes
376
. Les fibroblastes retrouvés dans le stroma tumoral,
identifiés par l’expression de l’α-SMA et par leur forme fuselée, sont fonctionnellement
distinct des fibroblastes issus des tissus environnants
378
. Ces fibroblastes du stroma tumoral
communément appelés « cancer associated fibroblast » (CAF), ou myofibroblastes
présentent un phénotype activé comme celui des fibroblastes retrouvés dans les sites de
cicatrisation
376
. Toutefois, à la différence des fibroblastes physiologiquement activés dont le
nombre diminue très vite suite à la réparation tissulaire, les CAF semblent être dans un état de
perpétuelle activation et leur nombre ne décroit pas dans le temps 376.
Des études récentes indiquent que les CAF pourraient jouer un rôle important dans
l’initiation, le développement et la migration des tumeurs 379 , 380. Il a notamment été démontré
que l’injection de CAF, isolés à partir de cancer du sein, dans des souris nude permettait de
stimuler la croissance de xénogréffes de tumeurs mammaires de façon bien plus efficace que
l’injection de fibroblastes normaux
381
. En effet, à la différence des fibroblastes normaux, les
CAF produisent d’importantes quantités de « Stroma derived factor 1 » (SDF-1) qui peut
directement promouvoir la croissance tumorale via CXCR4 et également stimuler
l’angiogénèse via le recrutement de cellules progénitrices endothéliales issues de la moelle
osseuse
381
. Enfin, les CAF sécrètent de nombreux facteurs connus pour être de puissants
inducteurs du potentiel migratoire et invasif des tumeurs comme le Fibrobast growth
factor (FGF), l’hépatocyte growth factor (HGF) et plusieurs membres de la famille du TGF-β
376
.
Jusqu’à présent aucune étude ne s’est intéressée à la question du potentiel
immunorégulateurs des CAF. Pourtant, les fibroblastes ne sont pas des cellules
immunologiquement inertes. En effet, plusieurs études réalisées sur les fibroblastes issus de
localisations anatomiques différentes indiquent qu’une fois activées par l’IFNγ, ces
cellules peuvent exercer des fonctions inhibitrices sur les lymphocytes T
382-384
. Une étude
69
récente a notamment démontré la capacité de fibroblastes du derme à exprimer l’enzyme IDO
et à inhiber la prolifération et la production de cytokines de lymphocytes T activés 385.
III.2 Macrophages associés aux tumeurs (TAM)
III.2.1 Recrutement des TAM
Il est actuellement bien établi que les macrophages représentent une proportion
importante des cellules infiltrant les tumeurs et constituent une population majeure du
microenvironnement tumoral
386
. Ces macrophages, communément nommés « Tumor
Associated Macrophages » (TAM) sont recrutés à partir de monocytes circulants,
continuellement générés dans la moelle osseuse, qui migrent dans les différents tissus
périphériques pour subir une ultime étape de différenciation en macrophages résidents.
De nombreuses chimiokines sont exprimées dans les tissus périphériques lors
d’intrusions microbiennes ou de blessures pour stimuler le recrutement et la différenciation
des monocytes en macrophages. Bon nombre d’entre elles sont également produites par
différents types de tumeurs et sont responsables de l’accumulation des TAM 387. Par exemple,
la chimiokine CCL2/MCP-1 (monocyte chemoattractant protein 1) est produite par de
nombreux types de cancers 386. Dans les cancers du sein, la production de CCL2 est corrélée à
la densité de macrophages associés à la tumeur 388 et il a été démontré que le recrutement des
macrophages est inhibé dans les tumeurs implantées dans les souris CCL2 KO 389.
Le facteur de croissance M-CSF/CSF-1 (colony stimulating factor) responsable de la
survie, de la prolifération, de la migration et de la différenciation des macrophages est lui
aussi impliqué dans le recrutement des macrophages associés aux tumeurs. Ce facteur qui est
surexprimé dans de nombreuses tumeurs incluant celles de la prostate, du sein ou de l’ovaire
est corrélé à l’accumulation de TAM dans plus de 90% des lésions analysées 390. Par exemple,
dans un modèle de tumeur mammaire spontanée la densité de TAM était sévèrement réduite
dans les souris déficientes en CSF-1 en comparaison avec les souris sauvages
391
. Plusieurs
études démontrent également que les TAM s’accumulent de manière préférentielle dans les
zones hypoxiques
392
et nécrotiques
processus d’angiogénèse
394
393
des tumeurs où ils jouent un rôle important dans le
. En effet, il a été démontré que le VEGF (Vascular Endothelial
Growth Factor) produit pour stimuler la néovascularisation de ces zones hypoxiques est un
chemoattractant puissant des macrophages 395.
70
III.2.2 Phénotype des TAM durant la progression tumorale
Les macrophages sont des cellules versatiles et très plastiques qui peuvent répondre à
divers stimuli environnementaux par différents programmes fonctionnels leur permettant de
participer aussi bien aux défenses immunitaires qu’au remodelage tissulaire ou à
l’angiogénèse. L’activation « classique » des macrophages, en réponse à l’IFNγ ou à des
produits microbiens comme le LPS, est connue depuis longtemps pour conduire à la
production d’oxyde nitrique (NO), de cytokines pro-inflammatoire et d’espèces réactives de
l’oxygène (ROS). Ces macrophages que l’on appelle macrophages M1 sont spécialisés dans
les défenses antimicrobiennes et dans la mise en place des réponses immunitaires adaptatives
396
. A l’inverse les molécules anti-inflammatoires comme les hormones glucocorticoïdes, l’IL-
4, l’IL-13 ou l’IL-10 induisent une activation dite « alternative » des macrophages. Ces
macrophages également appelés macrophages M2 sont spécialisés dans la production de
médiateurs anti-inflammatoires comme l’IL-10 ou le TGF-β, ont une activité phagocytaire
accrue et sont spécialisés dans le remodelage tissulaire et la cicatrisation 397.
Un certain nombre d’évidences semblent indiquer que le phénotype des TAM pourrait
dépendre du stade de la tumeur et de leur localisation. En effet, plusieurs études
épidémiologiques et cliniques ont démontré qu’il existe un lien entre les maladies
inflammatoires chroniques et le risque d’apparition de cancer
398
. Les macrophages M1
connus pour jouer un rôle clef dans ce type de pathologies inflammatoires chroniques
pourraient activement participer au processus de tumorigénèse notamment par la libération de
médiateurs cytotoxiques comme les ROS ou le NO et de cytokines comme le TNFα, l’IL-1β
ou l’IL-6 399.
Si les macrophages M1 peuvent être à l’origine du développement de cancer, il
semblerait toutefois que les macrophages retrouvés dans les différents types de tumeurs soient
majoritairement de type M2
400
. En effet, il a été démontré dans divers modèles de tumeurs
d’origine humaine ou murine que les TAM produisent peu d’IL-12 et d’importantes quantités
d’IL-10
401
, expriment faiblement l’enzyme iNOS
présentation d’antigène réduites
403
402
et présentent des capacités de
. Les TAM présentent également un défaut de production
de cytokines pro-inflammatoires comme l’IL-1β, l’IL-6 et le TNFα en réponse au LPS 404.
Le milieu immunosuppressif qui se met en place lors du développement tumoral
pourrait être à l’origine de la transition des TAM du phénotype M1 à M2. Par exemple, l’IL10 et le TGF-β1 peuvent induire la différenciation des monocytes en macrophages de type M2
397
. Une étude récente met également en avant l’importance de la protéine IKKβ, connue pour
71
son rôle d’activateur de NFκB, dans le phénotype alternatif et les capacités
immunosuppressives des TAM. En effet, en inhibant l’activation de STAT1, elle empêche
l’up régulation d’iNOS et de l’IL-12 induite par l’IFNγ et favorise le phénotype alternatif des
macrophages. Il a notamment été démontré que l’inhibition sélective de IKKβ dans les TAM
en utilisant un dominant négatif de IKKβ permet de renverser le profil de ces cellules de M2
vers M1 et ainsi de limiter la croissance tumorale 405.
III.2.3Rôle des TAM dans la progression tumorale
Plusieurs études cliniques indiquent que la présence de TAM est le plus souvent
néfaste au devenir clinique des patients dans de nombreux types de cancers. Ces données sont
particulièrement convaincantes dans les cancers du sein, de la prostate et de l’ovaire
386
. Les
chimiokines et facteurs de croissances responsables de l’accumulation des TAM sont
également facteurs de mauvais pronostic dans plusieurs types de cancers
386
. Ces données
cliniques qui suggèrent que les TAM sont impliqués dans la progression tumorale sont
appuyées par plusieurs études de tumorigénèse murine. Par exemple, dans un modèle murin
de mélanome non tumorigène, l’accumulation de TAM, induit par la sécrétion de faible
quantité de CCL2 était nécessaire pour permettre le développement de la tumeur
406
. Dans un
modèle de tumeur mammaire spontanée, la mutation du gène codant pour CSF-1 n’influait
pas sur la cinétique d’apparition de la tumeur, mais permettait de diminuer sa progression et
son pouvoir métastatique, en diminuant la densité de TAM 391.
Le Rôle néfaste des TAM sur la progression tumorale peut avoir plusieurs origines.
Tout d’abord, la production d’Il-10, de TGF-β ou de PGE2 par les TAM qui s’accumulent au
site de la tumeur pourrait participer à l’établissement d’un microenvironnement
immunosuppresseur néfaste à l’activité antitumorale des NK et des lymphocytes T CD8+
cytotoxiques
401, 407
. Par ailleurs, les macrophages de type 2 peuvent favoriser la conversion
de lymphocytes T effecteurs en T régulateurs 408 et dans les cancers ovariens il a été démontré
que la production de CCL22 par les TAM était en partie responsable de l’accumulation des
lymphocytes T régulateurs dans le stroma peritumoral 409.
Les TAM produisent également un certain nombre de facteurs proangiogéniques
comme CXCL8, VEGF, FGF-2 et Platelet derived growth factor B (PDGF-B) qui, en activant
le développement vasculaire de la tumeur, peuvent stimuler la croissance tumorale
410
. Ainsi,
des niveaux élevés de TAM sont corrélés à l’augmentation de l’angiogénèse dans de
nombreux cancers
386
. Par exemple, dans un modèle de tumeur mammaire spontanée, il a été
72
démontré que la mutation du gène codant pour CSF-1, en diminuant la densité et la
maturation des TAM, inhibe la vascularisation et la progression de la tumeur
394
. Par ailleurs,
de nombreux facteurs impliqués dans l’angiogénèse sont produits par les macrophages en état
d’hypoxie via l’induction du facteur Hypoxia induced factor 2α (HIF-2α) dans ces cellules
410
.
Les TAM sont également producteurs d’un certain nombre de facteurs de croissances
qui peuvent stimuler la croissance et la mobilité des cellules tumorales comme le FGF,
l’HGF, les ligands de la famille des récepteurs à l’epidermal growth factor (EGF) et le TGF-β.
Ainsi, le pourcentage de TAM dans la masse tumorale est corrélé au potentiel métastatique de
la tumeur dans divers types de cancers, ce qui suggère que les TAM jouent un rôle dans la
dissémination des cellules cancéreuses.
Figure 18. Rôle des TAM dans le developpement tumoral. D’après Mantovani et al, trends immunol, 2002 411.
73
III.3 DC associées aux tumeurs
Les DC jouent un rôle crucial dans la tolérance périphérique
78
. En effet, ces cellules
captent de manière continuelle des antigènes du soi dans les tissus périphériques. En l’absence
de signaux de dangers, ces DC migrent dans les ganglions lymphatiques avec un phénotype
immature ou semi mature et ainsi, au lieu de stimuler la prolifération et la différenciation des
lymphocytes T effecteurs, ces cellules vont induire l’anergie des lymphocytes T
potentiellement auto-réactifs
412
. Les DC représentent donc un type cellulaire important dans
le stroma tumoral capable de faire pencher les réponses immunitaire soit du coté de
l’activation soit du coté de la tolérance.
De nombreuses études se sont donc intéressées à ces cellules dans divers types de
cancers et semblent indiquer que les DC infiltrant les tumeurs sont caractérisées par une faible
expression des molécules de costimulation CD80, CD86 et de faibles capacités d’activation
lymphocytaire
413
. Ces DC immatures (iDC) sont capables d’induire une anergie des
lymphocytes T avec lesquels elles interagissent et pourraient donc favoriser le développement
tumoral en instaurant une tolérance vis-à-vis des antigènes tumoraux présentés 414.
Le caractère immature des DC infiltrant les tumeurs ne semble pas être la conséquence
d’une absence de signaux activateurs au site de la tumeur car les fonctions de ces cellules ne
peuvent être augmentées par le traitement ex vivo avec des agents stimulant la maturation des
DC comme CD40L ou la combinaison GM-CSF/ TNFα
415
. Par ailleurs, le nombre et les
fonctions des DC retrouvées dans la peau, le sang circulant et les ganglions et la rate est lui
aussi réduit chez les individus atteints de cancers en comparaison avec les individus sains
417
416,
. Le défaut de maturation des DC des patients atteints de cancer n’est donc pas restreint au
site de la tumeur mais plutôt d’ordre systémique suggérant l’hypothèse d’une différenciation
anormale de ces cellules en présence de la tumeur. Cette hypothèse est appuyée par des études
indiquant que le nombre, le phénotype et les capacités activatrices des DC dans le sang
circulant des patients sont directement corrélés au stade de la maladie et que l’ablation
chirurgicale de la tumeur permet de reverser ces effets 418.
Plusieurs facteurs solubles produits par des tumeurs ont été impliqués dans la
différenciation anormale des DC
413
. Le VEGF retrouvé en concentration important dans le
sérum des patients, semble jouer un rôle central comme cela a pu être démontré dans des
modèles murins où l’injection d’anticorps neutralisant anti-VEGF permettait de restaurer les
fonctions des DC altérées par la présence de tumeurs
419
. CSF-1 et l’IL-6 ont également été
impliqués dans la capacité de lignées tumorales à inhiber la différenciation des DC à partir de
précurseur hematopoiétique CD34+
420
. Enfin, l’Il-10 présent dans le microenvironnement
74
tumoral, pourrait également participer au blocage de la maturation et des fonctions des DC
comme cela a pu être démontré par des modéles de tumeurs implantées dans des souris IL-10
KO 421.
En plus de l’accumulation de cellules dendritiques immatures, plusieurs études ont
rapporté la présence de sous types de DC aux propriétés régulatrices dans les tissus tumoraux.
Par exemple, dans les ascites de cancers ovariens des DC plasmacytoides (pDC) immatures,
recrutées par la sécrétion de SDF-1 au site de la tumeur, induisent la génération de
lymphocytes T régulateurs producteurs d’IL-10
422
. Ces pDC immatures sont également
retrouvées dans d’autres types de cancers où elles sont associées à un pronostic défavorable
pour les patients
423
. Il a également été démontré dans un modèle murin que les ganglions
drainant la tumeur contiennent des pDC exprimant IDO capables d’inhiber la prolifération des
lymphocytes T et d’induire une profonde anergie dans ces cellules
262
. L’expression d’IDO
fréquemment observée dans les ganglions drainant les tumeurs humaines laisse penser que ce
type de DC pourrait jouer un rôle important dans l’induction de tolérance vis-à-vis des
antigènes tumoraux 424.
ONOO-
ARG1
iNOS
VEGF, IL-6,
CSF1, IL-10
Figure 19. Mécanismes d’immunosuppression induits par l’accumulation de cellules dendritiques immatures et
de cellules myeloides suppréssives chez les patients atteints de cancer. D’après gabrilovich et al, Nat rev
immunol, 2004 413.
75
III.4 Les cellules suppressives myéloïdes (MDSC)
III.4.1 Accumulation de cellules myéloïdes immature dans les cancers
Les cellules suppressives myéloïdes (MDSC) également appelées cellules myéloïdes
immatures (iMC) représentent un groupe hétérogène de précurseurs myéloïdes, caractérisés
par l’expression de Gr-1 et de l’intégrine αm CD11b chez la souris, qui peuvent se différencier
in vitro ou in vivo en granulocytes, macrophages ou en DC matures. Ces cellules représentent
20 à 30% des cellules de la moelle osseuse, environ 3% des cellules de la rate mais sont
virtuellement absente des organes lymphoïdes secondaires des souris saines 425.
Plusieurs groupes ont observé une accumulation de ces cellules dans la rate, dans les
organes lymphoïdes secondaires ainsi que dans le foyer primaire de souris porteuses de
tumeurs d’origines diverses
426
. Dans ces souris, l’accumulation des MDSC semble provenir
d’un défaut de différenciation en cellules matures des précurseurs myéloïdes occasionné par
une accumulation de ROS et notamment de peroxyde d’hydrogène (H2O2) dans le
cytoplasme de ces cellules 427.
La présence des MDSC est corrélée au développement des tumeurs
428
et à une
diminution des réponses immunitaires antitumorales dans les différents modèles de souris
étudiés suggérant un rôle de ces cellules dans l’altération des réponses immunitaires
425
.
L’équipe de Bronte a notamment pu démontrer que la déplétion des MDSC dans les souris
porteuses de tumeurs permettait de restaurer les réponses effectrices de lymphocytes T CD8+
antitumoraux
426
. Plusieurs études ont par la suite confirmé la capacité des MDSC issues de
souris porteuses de tumeur à inhiber la prolifération et la production d’IFNγ des lymphocytes
T CD8+ activés par leur antigène spécifique in vitro et in vivo
425
. Par ailleurs, ces propriétés
semblent spécifiques des MDSC issues de souris porteuses de tumeur comme l’indique
l’absence de propriétés régulatrices des MDSC issues de souris saines 429.
Une expansion similaire de cellules myéloïdes immatures définies chez l’homme
comme des cellules CD33+CD11b+CD14- est également retrouvé dans les patients atteints de
divers cancers
430
. Comme chez la souris le nombre de MDSC retrouvé en périphérie est
corrélé au grade de la tumeur
418
et des études ex vivo indiquent que ces cellules présentent
des activés suppressives contre les lymphocytes T similaires à leurs homologues murines
432
431 ,
.
76
III.4.2 Mécanismes d’immunosuppression par les MDSC
L’étude du mécanisme d’immunorégulation des lymphocytes T par les MDSC indique
qu’un contact cellulaire et une reconnaissance par le CMH I entre les 2 types cellulaires sont
nécessaires 433. Les MDSC, qui n’expriment pas de molécules de costimulation ni de CMH II,
sont en effet capables de capter et d’apprêter des antigènes sur le CMH I pour induire une
anergie des lymphocytes T CD8+ avec lesquels elles interagissent 429. La production accrue de
ROS dans les MDSC semble être à l’origine des fonctions immunosuppressives de ces
cellules chez les patients ou les souris atteints de tumeur comme le démontre l’absence de
propriétés inhibitrices des MDSC issues de souris gp91
-/-
incapables de générer des ROS
434
ou des MDSC traitées avec des agents qui neutralisent le peroxyde d’hydrogène 435. Plusieurs
études semblent indiquer que l’arginase I (ARG1) qui est fortement surexprimé dans les
MDSC de souris porteuses de tumeurs et chez les patients atteints de cancers
425
, pourrait
également participer aux fonctions immmunosuppressives des MDSC. En effet, Il a été
démontré que cette enzyme, qui catabolise la L-arginine en L-ornithine, appauvrie le milieu
extracellulaire en cet acide aminé essentiel à la prolifération et aux fonctions des lymphocytes
T
436
. Ce mécanisme d’appauvrissement en L-arginine par les MDSC, qui a récemment été
démontré comme étant à l’origine d’une diminution de l’expression de la chaine ζ du TCR
dans un modèle murin de cancer du poumon, pourrait donc représenter un mécanisme majeur
de tolérance chez les patients atteint de cancer 437.
L’expression de l’ARG1 dans les MDSC pourrait également être à l’origine de
l’accumulation des ROS dans ces cellules comme le démontre l’absence de ROS dans les
MDSC traités avec des inhibiteurs de cette enzyme. Le lien entre l’accumulation de ROS et
l’ARG1 implique l’enzyme iNOS également exprimée dans les MDSC 438. iNOS utilise la Larginine pour générer du NO mais en présence de faibles taux de cet acide aminé, le domaine
réductase de iNOS synthètise des ions superoxide O2-, qui peuvent se combiner avec le NO
pour former du peroxyde nitrique (ONO2-)
439
. Le peroxyde nitrique, déjà connu pour sa
capacité à induire une inhibition de prolifération des lymphocytes T en interférant avec la
phosphorylation des protéines tyrosine kinase associées au TCR 440, a récemment été impliqué
dans la capacité des MDSC à induire une tolérance des lymphocytes T CD8+ dans un modèle
de tumeur murine. Les auteurs de cette étude ont pu démontrer que la nitration des résidus
tyrosines des complexes TCR/CD8 par ONO2- affecte la conformation de ces protéines et
altère la reconnaissance des complexes peptide-CMH par le TCR
434
. Il semblerait donc que
les ions superoxides et ses produits comme le peroxynitrite et le peroxyde d’hydrogène soient
à l’origine des fonctions des MDSC puisque les inhibiteurs d’ARG1 et d’iNOS ainsi que les
77
agents qui neutralisent l’H2O2 ou le ONO2- sont tous capables d’abroger les propriétés
immunosuppressives des MDSC 434, 435, 438.
III.5 Les lymphocytes T CD4+CD25+ régulateurs
III.5.1 Treg et tumeurs.
L’idée que des lymphocytes T suppresseurs pouvaient être générés par la présence
d’une tumeur et favoriser son développement remonte au début des années 80 441. A l’époque,
North et ses collaborateurs, dans une série d’expériences réalisées sur des modèles murins de
fibrosarcomes induits au MCA avaient pu démontrer que le développement de tumeurs était
accompagné par l’apparition de cellules T CD4+ aux propriétés immunosuppressives qui
pouvaient être transférées et favoriser le développement de tumeurs dans d’autres animaux 442.
Malheureusement, en raison du manque d’outils de recherches pour isoler et caractériser ces
cellules, ce champs d’investigation se heurta au scepticisme de la communauté scientifique et
fut abandonné. Ce n’est qu’au milieu des années 1990 que le concept de suppression médiée
par les cellules T fut approuvé lorsqu’une étude conduite par l’équipe de Sakaguchi permis de
mettre en évidence le rôle crucial que jouait une population mineure de cellules T CD4+, coexprimant la chaine α du récepteur à l’IL-2, dans le contrôle des cellules auto-réactives in
vivo
443
. Depuis, de nombreuses études réalisées par différents groupes, ont pu montrer que
ces cellules T CD4+CD25+ régulatrices, initialement décrites chez la souris, existent aussi
chez l’homme où elles participent activement à la tolérance périphérique aux antigènes du soi
et à la régulation des réponses immunitaires lors d’infections bactériennes ou virales
444
. Les
Treg représentent jusqu’à 3% des lymphocytes T CD4+ périphériques chez l’homme et
expriment au repos un certain nombre de marqueurs spécifiques des cellules T activées ou
mémoires comme CD5hi, CD45RBlo, CD25hi, CTLA-4 (cytotoxic-T-lymphocytes-associatedprotein 4), et GITR (glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor)
444
. A ce jour, le
marqueur le plus caractéristique des Treg est le facteur de transcription Foxp3 qui contrôle
le développement et les fonctions de ces cellules 445.
L’identification des lymphocytes T régulateurs et l’amélioration des marqueurs
permettant de les discriminer, a conduit de nombreux groupes à s’intéresser au rôle de ces
cellules dans les cancers. Ils ont permis de démontrer la présence d’un nombre accru de Treg
dans le sang circulant ainsi que dans le microenvironnement tumoral de patients atteints de
cancers d’origines diverses chez lesquels ces cellules peuvent représenter une fraction
importante des TIL
446
. L’isolation de ces cellules a permis de confirmer que ces cellules
78
présentent des propriétés immunosuppressives
369, 409
. Par exemple, dans le cas des cancers
ovariens, les Treg exprimant Foxp3 isolés d’ascites péritonéales sont capables d’inhiber la
destruction, par des lymphocytes T CD8+ autologues, de tumeurs ovariennes xénogréffées
dans des souris NOD/SCID
409
. Par ailleurs, il a été démontré que l’accumulation de Treg
dans les cancers de l’ovaire était corrélée à un stade élevé de la tumeur et à un mauvais
pronostic de survie à long terme pour les patientes. Cette accumulation qui est d’autant plus
importante dans les stades cancers avancés suggère que la présence de Treg pourrait participer
au développement de la maladie.
En effet, plusieurs études réalisées sur des modèles murins de tumeurs indiquent que
l’inhibition des réponses immunitaires médiée par les Treg est un mécanisme majeur qui
contribue au développement des tumeurs. Les premières d’études réalisées à l’aide
d’anticorps déplétant anti-CD25 ont permis de démontrer que l’ablation des Treg in vivo
permettait de réduire la croissance et même d’induire le rejet de tumeurs déjà établies
447, 448
.
Dans ces études, la réduction du nombre de Treg était corrélée à une réduction de la
croissance tumorale et à l’augmentation des réponses immunitaires. Par la suite, de nombreux
groupes ont pu confirmer que l’ablation des Treg in vivo par le biais d’anticorps anti-CD25
permettait d’améliorer l’efficacité de divers protocoles vaccinaux visant à stimuler l’immunité
antitumorale 446. D’autres preuves de la capacité des Treg à inhiber la destruction de tumeurs
par les effecteurs de l’immunité sont apportées par des expériences de transfert adoptif de
lymphocytes T CD8+ spécifiques de mélanomes B16 en présence de lymphocytes T effecteurs
CD4+CD25- ou régulateurs CD4+CD25+
449
. Le transfert de cellules CD4+CD25- permettait
d’améliorer le rejet de tumeurs induit par le transfert de lymphocytes T CD8+ alors que le
transfert de CD4+CD25+ l’inhibait.
III.5.2 Mécanismes d’accumulation des Treg dans les tumeurs.
Les Treg se développent dans le thymus et apparaissent en périphérie dans les 2
premières semaines de la vie comme le démontre l’absence de Treg dans les souris ayant subi
une thymectomie 3 jours après la naissance 450. A l’âge adulte, les Treg sont retrouvés dans le
sang et les différents organes lymphoïdes du corps humain comme les ganglions
lymphatiques, la rate et la moelle osseuse. Les Treg expriment un répertoire de TCR orienté
vers la reconnaissance des antigènes du soi, présentent un seuil d’activation inférieur aux
lymphocytes T conventionnels et s’expandent rapidement in vivo en réponse à leur antigène
spécifique 444.
79
Ces propriétés, qui participent au maintien de ces cellules en périphérie et leurs
permettent d’empêcher l’expansion des lymphocytes T auto-réactifs en conditions
homéostatiques
451
, pourraient également expliquer l’accumulation des Treg fréquemment
détectée dans les ganglions drainant les tumeurs. En effet, de nombreux antigènes tumoraux
présentés par les DC sont des antigènes du soi, qui peuvent potentiellement stimuler la
prolifération et les fonctions des Treg comme cela a déjà été démontré dans des expériences
de transfert adoptifs de DC pulsées avec des autoantigènes
452
. Par ailleurs, dans des modèles
de tumeurs implantées chez la souris ou le rat, il a été démontré que les DC au phénotype
immatures ou semi-mature qui migrent dans les ganglions induisent l’expansion des
lymphocytes CD4+CD25+ régulateurs via la production de TGF-β 453. Le défaut de maturation
des DC décrit chez les patients atteints de cancer pourrait donc favoriser l’expansion des Treg.
Les Treg activés, tout comme les lymphocytes T conventionnels, acquièrent un certain
nombre de récepteurs aux chimiokines (CCR4, CXCR3) et molécules d’adhésion (CD103,
LFA-1) qui leur permettent de quitter les ganglions lymphatiques et migrer dans les tissus
enflammés
454
. Certains facteurs connus pour induire la migration des Treg in vitro
455
sont
retrouvés dans le microenvironnement tumoral comme CCL22 et pourraient donc stimuler la
migration des Treg du sang circulant vers la tumeur, comme cela a pu être démontré dans les
carcinomes ovariens 409. La présentation d’antigènes tumoraux et d’autoantigènes directement
au site de la tumeur par les DC résidentes, au phénotype immature, pourrait également
stimuler l’expansion des Treg infiltrant les tumeurs.
Ces dernières années plusieurs études ont pu démontrer que des lymphocytes T
effecteurs CD4+CD25- pouvaient se différencier en T CD4+CD25+ régulateurs via l’induction
du facteur de transcription Foxp3 en réponse à divers facteurs produits dans le
microenvironnement tumoral comme le TGF-β 456, la PGE2 348 et IDO 457. La conversion de T
effecteurs infiltrant la tumeur en T régulateurs sous l’action de ces facteurs pourrait donc
expliquer le nombre important de cellules exprimant Foxp3 dans divers cancers.
80
Figure 20. Mécanismes d’accumulation des Treg dans les tumeurs. D’après Zou et al, Nat rev immunol, 2006 446.
III.5.3 Signaux inhibiteurs délivrés par les Treg.
Pour exercer leurs fonctions suppressives, les Treg nécessitent d’être activés via la
reconnaissance par leur TCR de leur antigène spécifique présenté sur le CMH II mais par la
suite, ces cellules inhibent les réponses effectrices de nombreux types cellulaires incluant les
lymphocytes T CD4+ et CD8+ et les cellules NK indépendamment de la présence de leur
antigène
458
. De nombreux mécanismes ont été suggéré comme étant à l’origine de l’activité
immunosuppressive de ces cellules.
Les cytokines telles que l’Il-10 et le TGF-β
β semblent impliquées dans l’inhibition des
réponses immunitaires antitumorales par les Treg comme le soulignent plusieurs études qui
décrivent la production d’IL-10 et de TGF-β par les Treg issus différents types de tumeurs
humaines
459, 460
. De plus, Plusieurs modèles de tumeurs murines démontrent le caractère
indispensable de ces cytokines dans l’inhibition des réponses immunitaires antitumorales par
les Tregs 461 , 462.
L’IL-35, une nouvelle cytokine composée de la chaine Ebi de l’IL-27 et de la chaine
p35 (Il12a) de l’IL-12, a récemment été impliqué dans l’action immunosuppressive des Treg
463
. En effet, l’IL-35 est préférentiellement exprimée par les Treg 464 et les Treg issus de souris
Ebi KO ou Il12a KO ont des capacités inhibitrices réduites in vitro et in vivo
463
. De plus,
81
l’expression ectopique de l’IL-35 dans des cellules T naïves leurs confère des propriétés
régulatrices
463
. Toutefois, cette cytokine n’a pas été encore impliquée dans la capacité des
Treg associés à la tumeur à moduler les réponses immunitaires antitumorales.
Les Treg pourraient également exercer leurs fonctions suppressives en induisant
l’apoptose des cellules effectrices. En effet, l’expression de granzyme A et B a été détectée
dans les Treg humains et il a été démontré que ces cellules peuvent lyser un certain nombre de
cibles autologues incluant notamment des cellules T CD4+, CD8+ et des DC
465
. De même,
plusieurs études sur les Treg murins indiquent que ces cellules peuvent inhiber les réponses
effectrices des lymphocytes T et des lymphocytes B en induisant l’apoptose de ces cellules
via l’action de granzyme B 466. Le rôle de granzyme B dans l’activité suppressive des Treg est
conforté par des expériences qui démontrent que les Treg issus de souris granzyme B KO ont
des fonctions immunosuppressives réduites in vitro
466
. Ce mécanisme d’immunosuppression
semble relevant dans le contexte de la régulation des réponses antitumorales car dans une
récente étude basée sur des modèles de tumeurs murines Cao et ses collaborateurs ont pu
démontrer que granzyme B est fortement exprimé dans les Treg présents dans le
microenvironnement tumoral. En utilisant des Treg issus de souris perforine KO ou granzyme
B KO, les auteurs de cette études ont par la suite démontré que les Treg associés à la tumeur
peuvent induire la mort des cellules T CD8+ et NK via l’action de la perforine et de granzyme
B et ainsi inhiber le rejet de tumeurs syngéniques ou allogéniques 467.
Récemment, plusieurs mécanismes d’altération du métabolisme des cellules cibles par
les Treg ont été décrits dans la littérature. Il semblerait que les Treg puissent induire
l’apoptose des cellules T effectrices en déprivant ces cellules en cytokines et notamment en
IL-2 468. Il a également été démontré que les Treg expriment les ectoenzymes CD39 et CD73
qui permettent de générer de l’adénosine dans le milieu extracellulaire. L’adénosine en se
fixant sur le récepteur 2a à l’adénosine (A2AR) inhibe les fonctions effectrices T en induisant
une augmentation d’AMP cyclique intracellulaire 469. Même si ces derniers mécanismes n’ont
pas encore été décrits dans les Treg retrouvés dans le microenvironnement tumoral, on peut
néanmoins penser qu’ils peuvent participer aux effets néfastes que médient ces cellules vis-àvis de l’immunité antitumorale.
La modulation des fonctions des DC est également un mécanisme clef permettant aux
Treg d’inhiber les réponses antitumorales. En effet, les Treg peuvent influer sur les capacités
activatrices des DC en diminuant l’expression des molécules de costimulation CD80 et CD86
et stimuler leur différenciation en DC tolérogènes
470
. Ainsi, il a été démontré que les Treg
peuvent induire l’expression d’IDO dans les DC par des interactions entre CTLA-4 et CD80
82
ou CD86 471 suggèrant un possible rôle de ces cellules dans l’accumulation des DC IDO+ dans
les ganglions drainant les tumeurs 472.
Membrane
CD39
CD73
Figure 21. Mécanismes d’action des Treg. D’après vignali et al, Nat rev immunol, 2008 458.
III.6 Les cellules souches mésenchymateuses (MSC)
III.6.1 Découverte et caractéristiques des cellules souches mésenchymateuses
Les cellules stromales issues de la moelle osseuses furent découvertes par Friedenstein
en 1976 qui observa in vitro, à partir d’extraits de moelle osseuse, une population adhérente à
l’aspect fibroblastique capable de se différencier après plusieurs passages en ostéoblastes
473
.
Par la suite, de nombreuses études démontrèrent que ces cellules peuvent également se
différencier dans certaines conditions en divers types cellulaires d’origine mésodermique,
incluant les chondrocytes, les adipocytes et les myocytes
474
, et d’origine non mésodermique
comme les cardiomyocytes, les neurones, les astrocytes 475. C’est en raison de ces capacités de
différenciation que Caplan donna à ces cellules le nom de cellules souches
mésenchymateuses (MSC) 476 bien que de nombreux autres noms aient également été donnés
pour décrire cette population hétérogène de cellules multipotentes comme notamment
83
« colony forming units-fibroblast » (CFU-F) ou « multipotent progenitor cell » (MPC) ou
encore « mesenchymal stromal cell »
475
. Des cellules présentant des caractéristiques
comparables aux MSC ont également été isolées à partir de nombreuses autres espèces
comme la souris, le rat et le babouin 477.
Les aspirats de moelle osseuse sont considérés comme la source la plus riche en MSC
qui peuvent représenter jusqu’ à 0.01% des cellules de la moelle. Les MSC ont aussi été
isolées à partir de nombreux autres tissus incluant les tendons
les ganglions lymphatiques
source de MSC
482
481
478
, les muscles
479
, le sang 480,
et le tissu adipeux qui représente également une importante
. Ainsi, on considère que ces cellules sont présentes dans l’ensemble des
tissus du corps humain où elles représentent un pool de cellules souches dormantes nécessaire
à la régénération des tissus 477.
Figure 22. Capacité des MSC à se différencier en divers cellules des lignages mesodermiques, ectodermiques et
endodermiques. D’après Uccelli et al, Nat rev immunol, 2008484.
Les MSC expriment un grand nombre de marqueurs phénotypiques, malheureusement
aucun de ces marqueurs n’est spécifique à ces cellules. Ainsi, la principale propriété
permettant l’identification des MSC est leur capacité de différenciation en cellules de
84
différents lignages. On considère néanmoins, que les MSC adultes humaines n’expriment pas
les marqueurs hématopoïétiques CD45, CD34 et CD14. Elles n’expriment pas non plus les
molécules de costimulation CD80, CD86, CD40 ni les molécules d’adhésion CD31 (platelet
endothelial cell adhesion molecule [PECAM]-1, CD18 (leukocyte function associated
molecule [LFA]-1) et CD56. Par contre, elles expriment les marqueurs CD105 (SH2), CD73,
CD44, CD90 (thy-1), stro-1 ainsi que les molécules d’adhésion CD106 (vascular cell
adhesion molecule [VCAM]-1), CD166 (activated leukocyte cell adhesion molecule
[ALCAM]), CD54 (intercellular cell adhesion molecule [ICAM]-1) et CD29
477
. Il est
important de noter que l’expression de nombreux marqueurs peut varier en fonction des
cellules et des facteurs de croissance présents lors des différents passages de ces cellules en
culture. Ainsi, l’expression de certains marqueurs détectée in vitro ne reflète pas toujours le
phénotype des MSC in vivo 483.
III.6.2 Propriétés immunomodulatrices des MSC.
Plusieurs études réalisées ces dernières années avec des MSC d’origine humaine ou
animale ont pu démontrer que ces cellules présentent d’importantes propriétés
immunosuppressives in vitro. En effet, les MSC inhibent la prolifération et la production de
cytokines des lymphocytes T αβ CD4+ et CD8+ naïfs ou mémoire induites par des
alloantigénes, par des mitogénes, par leur antigène spécifique ou par des anticorps anti-CD3/
anti-CD28 485-488.
Les MSC exercent également des fonctions inhibitrices sur les cellules dendritiques.
Les MSC empêchent la différenciation des DC à partir de monocytes ou de précurseurs issus
de la moelle osseuse 489 ainsi que la maturation de ces cellules induite par le LPS. En effet, les
DC activées en présence de MSC produisent moins d’IL-12 ou de TNFα, expriment de faibles
niveaux de molécules de costimulation et produisent d’importantes quantités d’IL-10,
diminuant ainsi leur capacité à activer les lymphocytes T 485, 490.
Les MSC sont également capables d’interférer avec la prolifération des NK induite par
l’IL-2 ou l’IL-15 et de diminuer leur production d’IFNγ 485, 491-493. Une étude récente indique
également que les MSC diminuent l’expression des récepteurs activateurs de lyse NKG2D,
NKp30 et NKp44 et ainsi inhibent les capacités cytolytiques des NK contre différentes cibles
tumorales 494 même s’il a également été démontré que les NK activés peuvent également lyser
les MSC autologues in vitro 493.
Les propriétés immunomodulatrices des MSC ont également été évaluées in vivo.
Bartholomew et ses collaborateurs ont démontré que l’injection intraveineuse de MSC issues
85
de la moelle osseuse de babouins permettait de prolonger la survie de greffes de peaux
allogéniques de manière comparable à ce que l’on obtient avec les traitements
immunosuppresseurs couramment utilisés
495
. Plusieurs études réalisées dans des modèles
murins de sclérose en plaque, de polyarthrite rhumatoïde ou de lupus érythémateux ont
démontré la capacité des MSC à inhiber le développement de maladies auto-immunes
496-498
.
Enfin, des essais cliniques chez l’homme ont pu démontrer l’effet bénéfique de l’injection de
MSC lors de greffes de moelle semi-allogénique, où la présence de lymphocytes T matures
dans le greffon peut entrainer une attaque des tissus du receveur que l’on appelle réaction du
greffon contre l’hôte (GVHD) 499.
III.6.3 Mécanisme d’immunosuppression médié par les MSC.
Les mécanismes moléculaires à l’origine des effets immunomodulateurs des MSC
différent en fonction des études. En effet, si la plupart d’entre elles indiquent que
l’immunosuppression induite par les MSC est médiée par des facteurs solubles, certaines
expériences démontrent également une nécessité de contact entre les MSC et les cellules
cibles 484.
Plusieurs cytokines comme le TGF-β
β1, l'HGF et l’IL-10 ont été impliquées dans
l’immunomodulation des MSC
484
. Plusieurs études ont également détecté l’enzyme IDO
dans les MSC et ont démontré que la dégradation du tryptophane par cette enzyme est
impliquée dans l’inhibition des fonctions des NK et des lymphocytes T 491, 494, 500.
Les MSC peuvent également exprimer l’enzyme iNOS et produire d’importantes
quantité de NO, métabolite connu pour induire un arrêt de prolifération des lymphocytes T 501.
Dans une étude récente, Ren et ses collaborateurs ont ainsi démontré que les MSC issues de
souris iNOS KO ne possèdent pas de fonctions immunosuppressives in vitro et ne permettent
pas de prévenir le développement de GVHD lors de greffes semi-allogéniques de moelle
osseuse suggérant ainsi que l’enzyme iNOS joue un rôle crucial dans les fonctions inhibitrices
des MSCs in vivo502.
Les MSCs produisent des niveaux important de prostaglandine E2 et des expériences
réalisées avec des inhibiteurs de COX ont pu démontrer que ce facteur joue un rôle important
dans la capacité des MSC à réguler les réponses immunitaires
485
. La PGE2 a ainsi été
impliquée dans l’inhibition des fonctions des cellules NK, en association avec le TGF-β1492
ou IDO 494, et dans la suppression des réponses T CD4+ et CD8+ en synergie avec iNOS 501.
Enfin, une étude récente indique que les MSC peuvent inhiber les fonctions des NK et
la prolifération des lymphocytes T via la sécrétion d’HLA-G5 dans le surnageant
503
. Dans
86
cette étude, les auteurs indiquent également que les MSC exprimant HLA-G peuvent stimuler
la génération de lymphocytes T régulateurs Foxp3+ qui pourraient également participer à
l’immunosuppresssion induite par les MSC.
Figure 23. Mécanismes permettant aux MSC d’exercer leurs fonctions immunosuppressives. D’après Uccelli et
al, Nat rev immunol, 2008 484.
III.6.4 MSC et tumeurs
Ces dernières années plusieurs études ont pu démontrer la capacité des MSC à migrer
vers les sites de lésions ou d’inflammation afin de participer à la réparation des tissus
477
. Par
exemple, il a été démontré que les MSC injectées par voie systémique chez le rat après
ischémie cérébrale, migrent préférentiellement aux sites de lésion du cerveau
504, 505
. De
même, les MSC injectées chez le rat pour traiter le rejet de greffe de cœur allogénique sont
massivement recrutées dans la zone de rejet où elles se différencient en fibroblastes et en
myocytes
506
. Le foyer primaire d’une tumeur est souvent comparé au tissu cicatriciel
373
et
pourrait donc, par analogie avec celui-ci, stimuler le recrutement de MSC comme le suggère
plusieurs observations réalisées ces dernières années.
Plusieurs études se sont en effet intéressées à la migration des MSC vers différents
types de tumeurs in vivo, à l’aide de modèles de xénogreffes dans des souris imunodéficientes
et ont pu démontrer que les MSC sont spécifiquement recrutées au niveau de gliomes
507, 508
,
87
de carcinomes du colon
mélanomes
512
509
, de carcinomes ovariens
510
, de carcinomes du sein
511
et de
. De plus, il a été observé au niveau du site de xénogreffes de lignées de
tumeurs du sein MCF7/Ras et MDA-MB-231 dans des souris immunodéficientes une
accumulation de cellules ayant la capacité de former des CFU-F in vitro, une caractéristique
importante des MSC. L’absence de telles cellules dans les tissus voisins suggère que des MSC
endogènes pourraient migrer spécifiquement au niveau du site du développement d’une
tumeur
511
. Plus récemment, une étude conduite par Cao et al a permis l’isolation de cellule
présentant toutes les caractéristiques des MSC (phénotype et différenciation) à partir de
prélèvements de carcinomes gastriques
513
. Malheureusement, Il n’existe actuellement aucun
moyen de déterminer avec précision le nombre de MSC présentes dans le stroma des tumeurs
humaines en raison de l’absence de marqueurs spécifiques sur ces cellules.
Jusqu’à présent peu d’études se sont intéressées à l’impact du recrutement des MSC
sur les réponses immunitaires antitumorales. Il a toutefois été démontré dans un modèle murin
de souris immunocompétente que l’injection de MSC permettait d’inhiber le rejet de tumeurs
allogéniques
514
. Etant donné les importantes propriétés immunosuppressives de ces cellules
et la capacité de celles-ci à inhiber des pathologies inflammatoires sévères in vivo, on peut
penser que la présence de ces cellules au niveau de la tumeur pourrait empêcher la destruction
des cellules tumorales par des effecteurs cytotoxiques.
88
MATERIEL ET METHODES
89
90
1. Réactifs.
Le CFSE, la Brefeldin A, l’Indométacine, le 7-AminoActinomycin D (7-AAD), le 1-MethylDL-Tryptophan (1-MT), le N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), le PKH67, la PGE2,
la forskoline et les anticorps monoclonaux dirigés contre l’IFNγ (clone 25718.11) et le TNFα
(clone 28401.111) ont été achetés chez Sigma-Aldrich (Saint-Louis, MO). Les anticorps
polyclonaux dirigés contre EP2-4 et les agonistes des recepteurs EP 1-4 butaprost (EP2),
sulprostone (EP1, 3) et PGE1-alcohol (EP 2, 4) ainsi que les analogues de l’AMPc RP-8BrcAMP, 8-HA-cAMP, 6-Benz-cAMP ont été achetés chez Cayman Chemical (Ann Arbor,
MI). L'Indo-1 AM provient de chez Molecular Probes (San Diego, CA). Les cytokines
recombinantes humaines IFNγ, TNFα, IL-4 et GM-CSF ont été obtenues chez Peprotech
(Rocky Hill, NJ). Les billes recouvertes d’anticorps anti-CD3/anti-CD28 « DynabeadsTM
CD3/CD28 T cell expander kit » ont été achetées chez Invitrogen (San Diego, CA). Les
anticorps monoclonaux dirigés contre le TGF-β1 (clone AF-101), l’HGF (clone 24612), l’IL10 (clone 25209), NKp30 (clone 210845), NKp44 (clone 253415), NKp46 (clone 195314) et
NKG2D (clone 149810) ont été achetés chez R&D Systems (Minneapolis, MN). Les
anticorps purifiés anti-CD3 (clone OKT3), anti-TCRVδ2 (clone B6) et les anticorps
conjugués anti-COX1-FITC, anti-COX2-PE, anti-TCRVγ9-PE, anti-IFNγ-PE, anti-IL-6-PE,
anti-TNFα-PE, anti-HLA-DR-FITC, anti-HLA-ABC-PE-Cy5, anti-CD1a-PE, anti-CD11cPE, anti-CD14-PE-Cy7, anti-CD25-PE-Cy7, anti-CD73-PE, anti-CD86-PE, anti-CD107a-PECy5 et l’iodure de propidium (IP) ont été achetés chez BD Bioscience (San Jose, CA). Les
anticorps anti-TCRVγ9-FITC, anti-CD3-FITC, anti-CD3-PE-Cy7, anti-CD4-PE-Cy5, antiCD8-PE-Cy7, anti-CD34-FITC, anti-CD45-PE-Cy7, anti-CD56-PE-Cy5, anti-CD69-PE-Cy5,
anti-CD80-PE-Cy5 et goat F(ab’)2 anti-Rabbit IgG-FITC ont été achetés chez BeckmanCoulter (Fullerton, CA). Les anticorps anti-CD3-Pacific Blue, anti-CD90-PE-Cy5, antiCD105-FITC, anti-CD106-PE, anti-CD146-PE-Cy5 et anti-CD166-PE ont été achetés chez
Biolegend (San Diego, CA).
2. Isolement et culture des MSC.
Les MSC Humaines ont été isolées à partir de filtres utilisés lors du prélèvement de moelle
osseuse pour les greffes de moelle allogéniques. Les cellules récupérées par lavage de ces
filtres au PBS ont été cultivées à une densité de 5x104 cellules/cm² dans du
MEM-α
(Invitrogen, San Diego, CA) supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (SVF) (Hyclone,
Logan, UT) et de la Ciprofloxacine (10 µg/ml; Bayer Schering Pharma, Germany). Après 72
h de culture à 37°C dans une atmosphère 5% CO2, les cellules non-adhérentes ont été
91
enlevées. Le milieu de culture a ensuite été régulièrement changé tous les 3-4 jours pendant
une période de 21 jours jusqu’à ce que les cellules soient confluentes. Les cellules adhérentes
ont été décollées avec de la trypsine, et cultivées à une densité de 103 cellules/cm² pendant 1-3
semaines. Les MSC ont ensuite été cryo-préservées ou non avant leur utilisation. Les MSC
utilisées étaient toutes CD34–, CD45–, CD73+, CD90+, CD105+ et CD106+. La capacité des
MSC à se différencier en ostéoblastes, en chondroblastes et en adipocytes a été confirmée en
cultivant ces cellules dans les milieux de culture appropriées.
3. Isolement et culture des cellules T Vγγ9Vδ
δ2.
Les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) humaines ont été isolées à partir de
sang frais de donneurs sains en utilisant des tubes Leucosep™ (Greiner Bio-one,
Frickenhausen, Germany) selon les instructions données par le fabricant et conservées dans du
milieu complet (RPMI 1640 supplémenté avec 10% de SVF (Invitrogen), 1mM de pyruvate
de sodium (Life Technologies, Paisley, UK), 2mM de L-glutamine, 100 U/ml de pénicilline et
100 µg/ml streptomycine (Cambrex Bioscience, Verviers, Belgique).
Les lignées primaires de cellules T Vγ9Vδ2 ont été générées à partir de PBMC stimulées par
du PAg (BrHPP, 200nM; Innate-Pharma, Marseilles, France) et cultivées à une densité de 106
cellules/ml dans du milieu complet en présence d’IL-2 (300 U/ml; Sanofi-Synthelabo,
Labège, France). Le milieu a été changé tous les 2-3 jours pendant une période de 2 semaines
jusqu’à ce que les lignées cellulaires comprennent plus de 95% de cellules exprimant le TCR
Vγ9Vδ2 vérifié par cytométrie de flux.
Les cellules T Vγ9Vδ2 ont été purifiées à partir de PBMC par tri magnétique positif sur des
colonnes LS à l’aide du kit « γδ T cell isolation kit » (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) selon les
instructions données par le fabricant. Brièvement, les PBMC ont été marquées avec des
anticorps anti-TCRγδ (dirigés contre les sous populations Vδ1, Vδ2 et Vδ3) couplés à des
haptènes puis avec des microbilles couplées à des anticorps anti-haptène. La pureté des
cellules T γδ, évaluée par cytométrie de flux était toujours ≥ 90%.
4. Isolement et culture des cellules NK.
Les cellules NK CD3+CD56- ont été purifiées à partir de PBMC par tri magnétique négatif en
utilisant le Kit de déplétion « NK cell isolation kit II » (Miltenyi Biotec). Brièvement, les
PBMC ont été marquées avec un cocktail d’anticorps couplés à la biotine puis avec des
microbilles recouvertes d’anticorps anti-biotine. La pureté des cellules NK, évaluée par
cytométrie de flux à l’aide d’anticorps anti-CD3-FITC et anti-CD56-PE-Cy5, était toujours ≥
92
90%. Les cellules NK ont ensuite été activées 3 jours dans du RPMI complet en présence
d’IL-2 (100 U/ml) à la densité 2x106 cellules/ml avant d’être utilisées dans les différents tests.
5. Isolement et culture des lymphocytes T CD4+ et CD8+.
+
+
Les lymphocytes T CD4 et CD8 ont été purifiés à partir de PBMC de donneurs sains par tri
magnétique positif en utilisant les kits « CD4 Macrobeads » et « CD8 Macrobeads » (Miltenyi
+
+
Biotec). La pureté des lymphocytes T CD4 et CD8 évaluée par cytométrie de flux à l’aide
des anticorps anti-CD3-pacific blue, anti-CD4-PE-Cy5 et anti-CD8-PE-Cy7 est toujours ≥
90%.
Les cultures primaires de lymphocytes T CD4
+
+
et CD8+ ont été générées à partir de
+
lymphocytes T CD4 et CD8 fraichement purifiés activés avec des billes recouvertes
d’anticorps anti-CD3/anti-CD28 (1 bille pour 2 cellules T) à une densité de 106 cellules/ml
dans du milieu complet en présence d’IL-2 (100 U/ml). Le milieu a été changé tous les 2-3
jours pendant une période de 2-3 semaines avant d’utiliser ces cellules.
6. Isolement et culture des Hospicell humaines.
Les Hospicell ont été isolées à partir de prélèvement d’ascites à l’hôpital Hôtel-Dieu (Paris)
sur 5 patientes atteintes de cancer de l’ovaire de stade III non-traitées précédemment. Les
ascites ont été centrifugées à 800 rpm pendant 1 minute puis les lymphocytes et les
érythrocytes ont été séparés des agrégats tumoraux sur gradient de densité Ficoll-hypaque.
Les cellules mésothèliales (Hospicell) qui interagissent spécifiquement avec les cellules
tumorales ovariennes au sein de ces agrégats cellulaires ont été séparées en utilisant de la
trypsine (Mediatech, Inc). Une méthode de dilution limite a ensuite été mise en œuvre pour
sélectionner et enrichir les Hospicell.
La caractérisation des Hospicell a été réalisée par immunohistochimie dans l’équipe du Dr
Mirshahi à l’aide des anticorps suivant : Cytokeratine (KL1, Beckman Coulter), vimentin
(V9, Beckman Coulter), CD45 (2b11 et PD7/26, Dako), CD20 (L26, Dako), CD3 (SP7,
Neomarkers), CD68 (KP1 et PG-M1, Dako), CD34 (Obend10, Dako), CD10 (clone 56C6,
Novocastra, Newcastle, UK), Proteine S100 (polyclonal, Dako), myélopéroxidase
(polyclonal, Dako), CD166 (polyclonal, Dako), CD146 (polyclonal, Dako).
93
7. Immortalisation des Hospicell.
Cette étape a été effectuée dans le laboratoire Inserm U649 - Laboratoire de Thérapie Génique
et d'Amplification de Vecteurs- Hôtel Dieu, Nantes.
Le gène T du rétrovirus SV40 a été utilisé pour obtenir les lignées cellulaires d’Hospicell
immortalisées à partir des Hospicell isolés précedement. Ce gène a été associé lors de la
transfection à un gène de sélection (résistance à le néomycine). Cette immortalisation a été
réalisée en plusieurs étapes :
1°) La transfection des Hospicell a été effectuée par des rétrovirus provenant du surnageant
filtré (filtre : 0,45µm) de cellules infectées en présence de polybrène.
2°) La sélection des cellules ayant intégré le gène T a été réalisée en cultivant les cellules à
33°C en milieu sélectif contenant de la néomycine (concentration finale 0,5ug/µl).
3°) Le contrôle des cellules a été réalisé en analysant, par cytométrie en flux, l’expression de
l'antigène T de SV40 dans les cellules sélectionnées.
Les clones immortalisés ont été ensuite caractérisés. Nous avons pu montrer que ces cellules
gardent leur affinité pour les cellules tumorales ovariennes OVCAR3. Par ailleurs, bien que
proliférant plus rapidement, elles gardent toutes les caractéristiques phénotypiques des
Hospicell. Des injections sous-cutanées et intra-péritonéales dans des souris SCID/beige ont
montré l’incapacité de ces cellules à former des tumeurs spontanément confirmant leur
caractère immortalisée et éliminant une éventuelle transformation de ces cellules suite à la
transfection rétrovirale.
8. Génération des cellules dendritiques.
Les cellules dendritiques ont été générées à partir de PBMC dans des plaques 6 puits. La
fraction adhérente des PBMC a été cultivée à 3x106 cellules/ml pendant 7 jours dans du
milieu complet supplémenté en GM-CSF (100ng/ml) et en IL-4 (50ng/ml). La maturation des
DC a été induite avec du LPS (2µg/ml) 24 h avant leur utilisation. La pureté et le phénotype
des DC matures ont été évalués par cytométrie de flux à l’aide des anticorps suivant : CD1aPE, CD11c-PE, CD14-PE-Cy7, CD80-PE-Cy5, CD86-PE et HLA-DR-FITC.
9. Test de prolifération des lymphocytes T Vγγ9Vδ
δ2.
Les PBMC ou les cellules T γδ purifiées ont été marquées avec 1 µM de CFSE dans du PBS
pendant 10 min à 37°C. Après 2 lavages, 3x105 cellules ont été cultivées dans des plaques 96
puits dans du milieu complet avec des quantités croissantes de MSC irradiées ou de PGE2 (110000 ng/ml). Pour les cultures en TranswellTM, 2x105 MSC ont été déposées dans le
94
compartiment inférieur et 106 PBMC marquées au CFSE ont été ajoutées dans le
compartiment supérieur du TranswellTM constitué d’une membrane avec une porosité de 0.4
µm (BD Bioscience).
Après 6 jours de culture en présence de 300 U/ml d’IL-2 et 200nM de BrHPP, les cellules ont
été récupérées et marquées 15 min à 4°C avec un anticorps anti-TCRVγ9-PE puis 30 min à
température ambiante avec 1µM de 7-AAD. La dilution du CFSE et le marquage 7-AAD des
cellules T Vγ9Vδ2 a été analysée par cytomètrie de flux afin de mesurer la prolifération et
l’apoptose de ces cellules.
10. Test de prolifération des lymphocytes T CD4+ et CD8+.
Les cellules T CD4+ et CD8+ ont été marquées avec 1,5 µM de CFSE dans du PBS pendant 10
min à 37°C. Après 2 lavages, 3x105 cellules ont été cultivées dans des plaques 96 puits dans
du milieu complet avec des quantités croissantes d’Hospicell immortalisées irradiées ou non.
Pour les cultures en TranswellTM, 2x105 Hospicell immortalisées ont été déposées dans le
compartiment inférieur et 106 lymphocytes T CD4+ fraichement purifiés marqués au CFSE
ont été ajoutés dans le compartiment supérieur du TranswellTM.
Après 6 jours de culture en présence de billes anti-CD3/anti-CD28 (1 bille pour 5 cellules T)
ou de DC allogéniques (1 DC pour 5 cellules T), les cellules ont été récupérées et marquées
15 min à 4°C avec un anticorps anti-CD3-Pacific Blue puis 15 min à température ambiante
avec de l’IP. La dilution du CFSE et le taux d’apoptose des cellules T CD4+ ou CD8+ a été
analysée par cytomètrie de flux. Dans certaines conditions de l’indométacine (1-5 µM), du 1MT (0,5-1mM), du L-NAME (0,5-1mM), de l’anti-TGF-β1 (10 µg/ml), de l’anti-IL-10 (10
µg/ml) ou de l’IL-2 exogène (100 U/ml) ont été ajoutés au début de la culture.
11. Production de cytokines des cellules T Vγγ9Vδ
δ2.
5x105 lymphocytes T Vγ9Vδ2 issus de lignées primaires ou fraichement purifiés ont été
stimulés par 20nM de BrHPP avec des quantités croissantes de MSC allogéniques dans des
plaques 48 puits pendant 24 heures. 10 µM de Brefeldine A a été ajoutée pendant les 5
dernières heures de culture afin d’inhiber la sécrétion de cytokines par ces cellules. Les
cellules ont ensuite été récupérées puis incubées 15 min à 4°C avec des anticorps anti-TCRγ9FITC dans du PBS 5% SVF. Les cellules ont été lavées, puis fixées dans du PBS 2% para
formaldéhyde, et perméabilisées avec du PBS 1% saponine. Le marquage intracellulaire a été
réalisé avec des anticorps anti-IFNγ ou anti-TNFα conjugués à la PE pendant 30 min à 4°C
dans du PBS 1% saponine. La production de TNFα et d’IFNγ des lymphocytes T Vγ9Vδ2 a
95
été analysée par cytomètrie de flux. Dans les expériences réalisées avec la PGE2 soluble, le
butaprost, la sulprostone, la PGE1-alcohol ou la forskoline, les cellules T Vγ9Vδ2 issues de
lignées primaires ont été restimulées par 20nM de BrHPP pendant 5 heures en présence de 10
µM de Brefeldine A.
12. Production de cytokines par les cellules T CD4+ et CD8+.
5x105 lymphocytes T CD4+ issus de cultures primaires ou fraichement purifiés ont été
restimulées par des billes anti-CD3/anti-CD28 (1 bille pour 5 cellules T) avec des nombres
croissants d’Hospicell immortalisées en plaque 48 puits. Après 3 jours de culture les
surnageants ont été prélevés, filtrés sur des membranes de 0,25 µm puis les concentrations en
IL-2, IL-4, IL6, IL-10, IFNγ et en TNFα ont été analysés dans les surnageant par cytométrie
de flux à l’aide du kit “CBA beads Th1/ Th2” (BD Bioscience) selon les instructions fournies
par le fabricant.
La production intracellulaire d’IFNγ des lymphocytes T CD4+ a été analysée au bout de 24 h
de restimulation par cytomètrie de flux après ajout de 10 µM de Brefeldine A pendant les 5
dernières heures des cultures. La production d’IFNγ intracellulaire des cellules T CD8+
marquées au CFSE cultivées 6 jours en présence ou non d’Hospicell immortalisées et de billes
anti-CD3/anti-CD28 a été analysée après 5 h de restimulation avec de la PHA (10µg/ml) et de
la Brefeldin A (10 µM). Les cellules ont ensuite été récupérées puis marquées 15 min à 4°C
avec des anticorps anti-CD3-Pacific Blue avant d’effectuer le marquage intracellulaire réalisé
comme décrit précédemment avec des anticorps anti-IFNγ-PE.
13. Surnageants de culture de MSC et/ou de lymphocytes T Vγγ9Vδ
δ2.
106 MSC ont été cultivées avec ou sans 5x106 cellules T Vγ9Vδ2 dans des plaques 6 puits
dans 6 ml de milieu complet. Le surnageant a été prélevé après 3 jours de culture. Le
surnageant de culture des cellules T Vγ9Vδ2 a été obtenu en cultivant 30x106 cellules T
Vγ9Vδ2 issus de lignées primaires dans 30 ml de milieu complet avec ou sans 200 nM de
BrHPP pendant 24 heures. Tous les surnageant ont été filtrés sur des membranes de 0.25 µm
puis congelés à -20°C jusqu’à leur utilisation.
La déplétion des surnageant de culture de cellules T Vγ9Vδ2 en IFNγ et/ou en TNFα a été
réalisée en incubant le surnageant de lymphocytes T Vγ9Vδ2 avec 20 µg/ml d’anticorps antiIFNγ, anti-TNFα ou d’IgG1 non relevant pendant la nuit à 4°C. 100µg/ml de billes d’agarose
recouvertes de ProteinA ont ensuite été ajoutées pendant 1h à 4°C et le surnageant a été
96
prélevé après centrifugation. La quantité d’IFNγ et de TNFα présente dans le surnageant des
cultures de lymphocytes T Vγ9Vδ2 avant et après déplétion a été analysée par cytométrie de
flux en utilisant le kit “CBA beads Th1/ Th2” kit (BD Bioscience).
14. Expression de COX2 et production de PGE2, d’IL-6 et de VEGF dans
les surnageants de culture de MSC et de cellules T Vγγ9Vδ
δ2.
2x105 MSC ont été déposées dans des plaques 12 puits avec ou sans 106 cellules T Vγ9Vδ2
issues de lignées primaires en présence ou en l’absence de 200 nM de BrHPP dans 2 ml de
milieu complet. Dans certaines expériences les cellules T Vγ9Vδ2 ont été remplacées par des
surnageants de culture de cellules T Vγ9Vδ2 (voir paragraphe précédent) ou par des cytokines
humaines recombinantes IFNγ et/ou TNFα. Après 24 h de culture, les surnageants ont été
prélevés, filtrés sur des membranes de 0,25 µm puis congelés à -20°C jusqu’à leur utilisation.
Les MSC ont été récupérées après traitement avec de la Trypsine-EDTA (Invitrogen) et le
marquage intracellulaire avec des anticorps anti-COX1-FITC, anti-COX2-PE ou anti-IL-6-PE
a été réalisé comme décrit précédemment.
Les niveaux de PGE2 dans le surnageant des cultures correspondantes ont été mesurés par
ELISA (“Prostaglandin E2 EIA Kit-monoclonal”, Cayman Chemical) conformément aux
instructions fournies par le fabricant. Les niveaux d’IL-6 et de VEGF dans les différentes
cultures ont été analysés par cytomètrie de flux en utilisant le kit “CBA beads soluble
protein” (BD Bioscience) selon les instructions fournies par le fabricant.
15. Test standard de cytotoxicité par relargage de 51Cr.
La cytotoxicité des cellules de lignées T Vγ9Vδ2 contre la cible Daudi en présence de MSC a
été analysée dans un test de cytotoxicité standard de 4 h aux ratios effecteurs/cibles de 30:1,
10:1 et 5:1. Les cellules T Vγ9Vδ2 avaient été préalablement cultivées avec des quantités
croissantes de MSC pendant 24 heures dans des plaques 96 puits avant l’ajout des cibles
Daudi chargées au
51
Cr. Dans certaines expériences, les MSC ont été remplacées par du
surnageant de culture ou des concentrations croissantes de PGE2 soluble ajoutées directement
au début du test de lyse.
Les cellules P815 chargées au 51Cr ont été incubées 30 min à température ambiante avec des
anticorps non relevant ou dirigés contre NKp30 (5 µg/ml), NKp44 (5 µg/ml), NKp46
(5 µg/ml), NKG2D (15 µg/ml), CD16 (5 µg/ml) ou TCRVδ2 (5µg/ml). La cytotoxicité des
97
cellules T Vγ9Vδ2 ou des NK a été analysé contre les cellules P815 en présence de
concentrations croissantes de PGE2 (1 à 10000 ng/ml) dans un test standard de 4 h aux ratios
effecteurs/cibles de 20:1 et 10:1 pour les T Vγ9Vδ2 ou 5:1 et 2:1 pour les NK.
16. Analyse de la dégranulation des cellules cytotoxiques.
La dégranulation des lymphocytes T Vγ9Vδ2 ou des NK activés à l’IL-2 a été analysée par
cytométrie de flux grâce à l’expression du marqueur CD107a. Les cellules P815 ont été
incubées 30 min à température ambiante avec des anticorps non relevant ou dirigés contre
NKp30 (5 µg/ml), NKp44 (5 µg/ml), NKp46 (5 µg/ml), NKG2D (15 µg/ml), CD16 (5 µg/ml)
ou TCRVδ2 (0,5-50 µg/ml). 2x105 lymphocytes T Vγ9Vδ2 ou NK ont été incubés avec 105
cibles P815 dans du milieu complet en présence d’anticorps anti-CD107a-PE-Cy5 ou
d’anticorps contrôle IgG1-PE-Cy5 à 5 µg/mL. La PGE2 soluble, les agonistes des recepteurs
EP 1-4 butaprost, sulprostone et PGE1-alcohol ainsi que les analogues de l’AMPc 8-HAcAMP, 6-Benz-cAMP ont été ajoutés au début du test aux concentrations indiquées. Dans
certaines expériences les NK ont été préincubées 1h avec du RP-8Br-cAMP (inhibiteur de la
PKA I ) avant l’ajout de PGE2 pendant le test.
Après 5h d’incubation les cellules ont été lavées avec du PBS / EDTA 0.5 mM puis marquées
15 min à 4°C avec des anticorps anti-CD3-PE et anti-CD56-PE-Cy7 pour les NK ou des
anticorps anti-TCRγ9-FITC / anti-CD3-PE pour les cellules T Vγ9Vδ2. La proportion de
cellules NK ou T Vγ9Vδ2 exprimant le marqueur CD107a a été déterminé par cytométrie de
flux.
17. Transfert synaptique (trogocytose).
2x105 cellules Daudi marquées avec la sonde fluorescente lipophile PKH67 selon les
instructions données par le fabriquant ont été co-cultivées avec 105 lymphocytes T Vγ9Vδ2 en
présence de concentrations croissantes de PGE2. Les deux types cellulaires ont ensuite été mis
en contact par une centrifugation douce de 1 min à 800 rpm. Après 3 (contrôle) ou 60
minutes d’incubation les cellules ont été lavées avec une solution de PBS / EDTA 0.5 mM
puis marquées 15 min à 4°C avec des anticorps anti-TCRγ9-PE. Le transfert synaptique a été
mesuré par cytométrie de flux en analysant l’intensité moyenne de fluorescence (mfi) du
PKH67 sur les cellules T Vγ9Vδ2.
98
18. Mesure du flux calcique.
Les cellules de lignées Vγ9Vδ2 (5x106 cellules/ml) ont été chargées avec 5 µM d’Indo-1 AM
(Molecular Probes) pendant 45 min à 37°C. Après 2 lavages, 106 cellules T Vγ9Vδ2 ont été
marquées avec 5 µg/ml d’anticorps anti-CD3 pendant 30 min à 4°C. Le ratio moyen de
fluorescence de l’Indo-1 AM à 480 (Indo-1 libre) et 410 nm (Indo-1 lié au Ca2+) a été analysé
dans les lymphocytes T Vγ9Vδ2 par cytométrie de flux pendant 5 minutes après l’ajout
d’anticorps secondaires anti-IgG1 (Goat anti-mouse ; 15µg/ml) en présence ou non de 1000
ng/ml PGE2.
19. Extraction des ARNm et expression des récepteurs à la PGE2.
L’ARN total des cellules T Vγ9Vδ2 issues de lignées primaires ou des NK fraichement
purifiés ont été extraits avec du TRIzolTM (Invitrogen). L’ARN a ensuite été rétro transcrit en
cDNA avec la transcriptase inverse « Moloney murine leukemia virus» (M-MLV-RT)
(Invitrogen). Le cDNA codant pour les récepteurs humains à la PGE2 EP1, EP2, EP3, EP4 et
pour l’HPRT (gène contrôle) ont été amplifiés par PCR en utilisant les primers suivants : 5'GGCCGCTATGAGCTGCAGT-3' and 5'-GAGGTAGAGCTCCAGCCGC-3' (EP1); 5'GACCGCTTACCTGCAGCTGTA-3' and 5'-GACTGAACGCATTAGTCTCAGAACA-3'
(EP2) ;
5'-AACGGGACTAGCTCTTCGCAT-3'
and
5'-
AGTTGTTTGTGTGGTACCTGATCTG-3' (EP3) ; 5'-GGTCATCTTACTCATTGCCACCT3'
and
5'-GGAGGGTCTGAGATGTACTGCTG-3'
ACTGAACGTCTTGCTCGAGATGT-3'
and
(EP4) ;
5'-
5'-GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT-3'
(HPRT). La taille des fragments pour EP1, EP2, EP3, EP4 et HPRT étaient respectivement
de 455 paires de bases (pb), 409 pb, 451 pb, 377 pb et 369 pb, conformément aux tailles
attendues. Par ailleurs, les produits de PCR ont été séquencés et ont permis de confirmer
l’amplification des ARNm codant pour EP1, EP2, EP3, EP4 et HPRT.
Les protéines EP2, EP3 and EP4 ont été détectées par cytométrie de flux sur les cellules NK
fraichement purifiées et sur les cellules T Vγ9Vδ2 fraichement purifiés ou issues de lignées
primaires. Ces cellules ont été incubées 30 minutes à 4°C avec les anticorps polyclonaux de
lapin dirigés contre EP2, EP3 et EP4 ou leur contrôle isotypique. Après un lavage au PBS, des
anticorps dirigés contre les IgG de lapins conjugués à la FITC (FITC-F(ab’)2 Goat AntiRabbit IgG) ont été ajoutés pendant 30 min à 4°C.
99
20. Développement de tumeurs dans les souris SCID/beige.
5x106 cellules de la lignée de Myélome Multiple RPMI 8226 ont été injectées en sous-cutané
dans le flanc de souris SCID/beige âgées de 9 à 10 semaines en présence ou en l’absence de
106 MSC. La taille des tumeurs des animaux de chaque groupe a été régulièrement mesurée à
l’aide d’un pied à coulisse. Le diamètre moyen des tumeurs a été évalué de la manière
suivante : [largeur + longueur des tumeurs mesurées]/2.
100
RESULTATS
101
102
PARTIE I
Régulation des réponses effectrices des
lymphocytes T Vγγ9Vδ
δ2 par les cellules
souches mésenchymateuses.
103
De par leur large réactivité contre des tumeurs d’origines diverses, les lymphocytes T
Vγ9Vδ2, capables à la fois d’exercer des fonctions cytotoxiques et de sécréter des cytokines
pro-inflammatoires, participent activement aux défenses immunitaires antitumorales
165
. La
disponibilité de phosphoantigènes de synthèse comme le BrhPP 515 et d’agents thérapeutiques
comme les ABP
196
capables d’amplifier spécifiquement les lymphocytes T Vγ9Vδ2 in vivo
ou ex vivo permet d’envisager l’utilisation thérapeutique de ces cellules 516. En effet, plusieurs
essais cliniques réalisés ces dernières années ont permis de démontrer le potentiel
thérapeutique des lymphocytes T Vγ9Vδ2 pour le traitement de différents types de cancers
196 ,
517
.
Malheureusement,
de
nombreux
facteurs
et
cellules
présents
dans
le
microenvironnement tumoral sont susceptibles de bloquer ou de diminuer l’impact des
immunothérapies visant à stimuler les lymphocytes T Vγ9Vδ2 in vivo ou ex vivo.
Il a été démontré récemment que les cellules souches mésenchymateuses sont
recrutées dans le stroma de différents types de tumeurs
511, 518
. Outre leur capacité à se
différencier en types cellulaires de différents lignages, les MSC présentent d’importantes
propriétés immunosuppressives qui leur permettent d’inhiber les fonctions de nombreux types
de cellules immunitaires comme les lymphocytes T αβ, les NK et les DC
484
. Ces propriétés
pourraient être néfastes à l’immunité antitumorale comme le démontre la capacité des MSC à
empêcher le rejet de tumeurs allogéniques greffées dans des souris immunocompétentes 514.
Jusqu’à présent, peu d’études se sont intéressées aux facteurs impliqués dans la
régulation négative des lymphocytes T Vγ9Vδ2. L’objet de ce projet était donc d’étudier
l’influence des cellules souches mésenchymateuses sur les réponses effectrices des
lymphocytes T Vγ9Vδ2 afin de déterminer si la présence de ces cellules dans le stroma
péritumoral est susceptible de diminuer l’efficacité des immunothérapies cellulaires basées
sur l’utilisation des lymphocytes T Vγ9Vδ2 .
104
A Regulatory cross-talk between Vγ9Vδ2 T lymphocytes and Mesenchymal
Stem Cells
Running title: γδ and MSC cross-talk
Ludovic Martinet*, Sandrine Fleury-Cappellesso†, Mélanie Gadelorge†, Gilles
Dietrich*, Philippe Bourin†, Jean-Jacques Fournié* and Rémy Poupot*1
From *INSERM, U.563, Centre de Physiopathologie de Toulouse-Purpan, Toulouse, F-31300
France and Université Paul-Sabatier, Toulouse, F-31400 France; †Etablissement Français du
Sang – Pyrénées Méditerranée and GECSOM, 75 rue de Lisieux, 31300 Toulouse, France.
Key Words: γδ T Cells ● Mesenchymal Stem Cells ● Immune regulation ● Prostaglandin E2
Correspondence : Dr. Rémy Poupot, INSERM 563 Centre de Physiopathologie de ToulousePurpan, CHU Purpan, BP3048, 31024 Toulouse Cedex, France. Telephone: +33-562-748368;
Fax: +33-562-744558; e-mail: [email protected]
Abbreviations used in this paper: MSC, mesenchymal stem cells; PGE2, prostaglandin E2;
cAMP, cyclic adenosine monophosphate.
Accepted For Publication in the European Journal of Immunology
Abstract
The physiological functions of human TCRVγ9Vδ2+ γδ lymphocytes reactive to non-peptide
phosphoantigens contribute to cancer immunosurveillance and immunotherapy. However,
their regulation by Mesenchymal Stem Cells (MSC), multipotent and immunomodulatory
progenitor cells able to infiltrate tumors, has not been investigated so far. By analysing freshly
isolated TCRVγ9Vδ2+ lymphocytes and primary cell lines stimulated with synthetic
phosphoantigen or B-cell lymphoma cell lines in the presence of MSC, we demonstrated that
MSC were potent suppressors of γδcell proliferation, cytokine production and cytolytic
responses in vitro. This inhibition was mediated by the COX2 dependent production of PGE2
and by MSC through EP2 and EP4 inhibitory receptors expressed by Vγ9Vδ2 T lymphocytes.
COX2 expression and PGE2 production by MSC were not constitutive, but were induced by
IFN-γ and TNF-α secreted by activated Vγ9Vδ2 T cells. This regulatory cross-talk between
MSC and Vγ9Vδ2 T lymphocytes involving PGE2, could be of importance for the antitumor
and antimicrobial activities of γδ T cells.
Introduction
Most circulating γδ T lymphocytes (1-5 % of PBMC) from humans or primates
express Vγ9Vδ2+ T cell receptor, have an unconventional pattern of reactivity and
physiological functions that link innate and adaptive immunity to infections and cancer.
Vγ9Vδ2 T lymphocytes are specific for HLA-unrestricted, non-peptide antigens referred to as
phosphoantigens, small phosphorylated metabolites from microbial pathogens, human tumor
cells or phosphorylated analogues produced by chemical synthesis (reviewed in [1, 2]).
Activated Vγ9Vδ2 T lymphocytes participate to the early phase of immune responses through
the release of pro-inflammatory chemokines and cytokines, a cross-talk with DC [3-5] and
their cytotoxic activity [6, 7]. They also provide help to drive adaptive immunity, by favoring
Ig production [8], immunological memory [9, 10] and protection against viral infections [11].
In monkeys and humans treated with the synthetic phosphoantigen bromohydrin
pyrophosphate (BrHPP) [12], the strong amplification of blood Vγ9Vδ2 T lymphocytes [13,
14] together with their promising anti-tumor activity [15-18] make Vγ9Vδ2 cells highly
attractive to develop innovative immunotherapy against solid and lymphoid malignancies.
However, Human tumors develop in a favourable microenvironment, which may
comprise various cell types with immunomodulatory properties [19]. Likewise, the stroma of
mammary and glioma tumors may recruit large numbers of bone marrow-derived
mesenchymal stem cells (MSC) [20, 21]. MSC are multipotent and uncommitted cells able to
differentiate into a wide variety of cell types: osteoblasts, adipocytes, chondrocytes, tenocytes,
or skeletal myocytes [22]. Their ability to migrate to injured tissues after systemic injection
[23] makes MSC attractive for tissue engineering and regenerative cell therapies [24]. MSC
escape immune recognition and inhibit αβ T cell proliferation induced by mitogens or
cognate peptides [25-27]. MSC also inhibit proliferation of NK cells [28, 29] and the
differentiation and maturation of DC [30, 31]. The underlying immunosuppressive bioactivity
of MSC involves multiple mechanisms mediated by soluble factors and cell contact [32].
These encompass release of prostaglandin E2 (PGE2), IDO, NO, HGF as well as TGF-β1 and
IL-10 cytokines [32].
Along this line, the suppressive properties of MSC could possibly be deleterious to
anti-tumor immunity. Accordingly, MSC were able to promote the growth of an allogeneic
tumor in immunocompetent mice [33]. Despite this piece of evidence, it remains unclear
whether MSC regulate the function of unconventional HLA-unrestricted T cells such as
TCRVγ9Vδ2+ lymphocytes. In addition, quite a few compounds with negative regulatory
activity for TCRVγ9Vδ2+ cells have already been described [34, 35]. In this study, we
demonstrate that MSC exert a strong regulation of Vγ9Vδ2 T cell responses, mediated by
secretion of inhibitory PGE2. The MSC up-regulated PGE2 production in response to the γδ
cytokines uncovers a regulatory cross-talk between MSC and γδ lymphocytes.
Results
MSC inhibit the antigen-induced Vγ9Vδ2 T cell responses
PBMC or freshly purified γδ T cells were cultured with BrHPP, IL2 and with or without
allogeneic irradiated MSC at cell ratios of 0.2:10, 1:10 and 2:10 for MSC: PBMC or MSC: γδ.
CFSE dilution assay showed that MSC inhibition of Vγ9Vδ2 T cells proliferation was dose
dependent (Fig. 1A). The rate of dividing Vγ9Vδ2 T cells among PBMC or among purified γδ
T cells was significantly lower at the 1:10 and 2:10 ratios (p < 0.01) (Fig. 1B). Accordingly,
the [3H]-thymidine incorporation by phosphoantigen-stimulated Vγ9Vδ2 T cells was reduced
when MSC were added to the culture (data not shown). Moreover, after 6 days of co-culture,
the presence of MSC resulted in less Vγ9Vδ2 T cells in PBMC cultures (Fig.1C). CFSE and
7-AAD staining showed that the percentage of apoptotic divided and undivided Vγ9Vδ2 T
lymphocytes was not increased when irradiated MSC were added to the culture (Fig.1D-E).
Altogether, these data indicate that MSC inhibit the phosphoantigen-induced Vγ9Vδ2 T cell
proliferation without increasing cell death.
Because BrHPP-activated Vγ9Vδ2 T cells produce the pro-inflammatory cytokines
IFN-γ and TNF-α, we analyzed the effect of MSC on this production. When added to
purified γδ Τ cell cultures at 0.2:10, 1:10 and 2:10 cell ratios, MSC strongly inhibited the
production of IFN-γ and TNF-α as shown by intracellular staining of Vγ9Vδ2 T cells (Fig.
1F). The percentage of both IFN-γ−producing and TNF-α-producing Vγ9Vδ2 T cells were
significantly decreased (p < 0.01, n = 3 donors) at 1:10 and 2:10 MSC/ γδ T cell ratios (Fig.
1G). This effect was not confined to freshly isolated γδ T cells, since the production of IFN-γ
and TNF-α by PBMC-derived Vγ9Vδ2 T cell lines in response to BrHPP was also severely
decreased by MSC (data not shown).
Upon recognition of endogenous phosphoantigen metabolites, Vγ9Vδ2 T cells show
spontaneous lytic activity towards tumoral cell lines such as the Daudi Burkitt’s lymphoma
[36]. Therefore, we tested whether the MSC affected this function. When added to standard (4
h)
51
Cr-release assays, MSC induced a dose-dependent reduction of the Vγ9Vδ2 T cell line
cytotoxicity, total abrogation being seen at 5 MSC: 10 Vγ9Vδ2 T cell ratio (Fig. 1H).
Although activated NK cells are able to lyse autologous and allogeneic MSC [28, 29], neither
freshly purified γδ T cells nor activated Vγ9Vδ2 T cell lines killed allogeneic MSC (data not
shown).
COX activity is necessary for Vγ9Vδ2 T cell inhibition by MSC
To determine how MSC inhibited Vγ9Vδ2 T cell biological responses, the above experiments
were repeated using TranswellTM settings. When MSC were plated in the lower compartment
of the TranswellTM device, freshly purified γδ T cells did not proliferate in response to BrHPP
(Fig.2A). In these conditions, MSC also inhibited the Vγ9Vδ2 T cell production of IFN-γ
(Fig. 2B) and TNF-α (Fig. 2C).
The TranswellTM co-culture settings were not appropriate to assay cytotoxicity. Thus,
we performed standard (4 h)
51
Cr-release assays in medium supplemented with the
supernatants from MSC cultivated for 3 days, either alone or with Vγ9Vδ2 T cell lines. Only
the supernatant of MSC co-cultured with Vγ9Vδ2 T cell lines, decreased the Daudi lysis by
γδ lymphocytes (Fig. 2D). Thus, MSC produce a soluble mediator able to inhibit the Vγ9Vδ2
T cell lytic activity. Interestingly, this mediator was not produced by MSC cultured alone but
only when MSC were co-cultured with Vγ9Vδ2 T cells.
To identify the soluble mediator responsible for MSC suppression of Vγ9Vδ2 T cell
responses, we tested the following specific inhibitors: antibodies against soluble or
membrane-bound TGF-β, IL-10 and HGF, and chemical inhibitors of either COX
(indomethacin), iNO-synthase (L-NAME) or IDO (1-MT) enzyme activities. This screening
was applied to a BrHPP-induced Vγ9Vδ2 T cell proliferation assay from PBMC co-cultured
with MSC at different cell ratios, in presence of the inhibitors. Only the COX1 and 2 inhibitor
indomethacin significantly blocked the suppressive activity of MSC (p < 0.01) (Fig. 2E).
Soluble PGE2 inhibits Vγ9Vδ2 T cell activation and biological responses
The above data suggested that PGE2, the final metabolite of the COX pathway could play a
role in the suppressive activity of MSC. Therefore, we tested the effect of exogenous PGE2
addition in Vγ9Vδ2 cell activation experiments devoided of MSC. Fig. 3A shows that soluble
PGE2 inhibited the calcium flux induced in Vγ9Vδ2 T cells lines by TCRVγ9Vδ2 crosslinking with anti-CD3 mAb. Cytokine production and cytotoxicity from either freshly purified
γδ T cells or Vγ9Vδ2 T cell lines were strongly inhibited by soluble PGE2 (Figs. 3B-C).
Moreover, the exogenous PGE2 concentration able to abrogate both target cell lysis (Fig. 3C)
and IFN-γ/ TNF-α secretion (Fig. 3 C) by Vγ9Vδ2 T cell lines (100 ng/ml) corresponded to
the PGE2 concentration secreted by MSC co-cultured with activated Vγ9Vδ2 T cells (see
below). Exogenous PGE2, added from the beginning of the culture or 24hr after activation,
significantly inhibited Vγ9Vδ2 T cell proliferation in PBMC (data not shown) or in purified
γδ T cells culture (Fig. 3E) only at 1000 ng/ml (p < 0.01 Student Test). This discrepancy can
be due to the length of the proliferation assay (6 days). When the inhibition of proliferation
was achieved with MSC, they produced PGE2 throughout the assay. Conversely, the
exogenous PGE2 was added once at day 0 and might undergo degradation by serum enzymes
[37]. CFSE and 7-AAD staining indicate that the percentage of apoptotic divided and
undivided Vγ9Vδ2 T lymphocytes were not statistically increased even when 10000 ng/ml of
PGE2 was added to the culture (Fig.3 D, F). Altogether, these results indicate that like MSC,
PGE2 inhibits phosphoantigen-induced Vγ9Vδ2 T cell responses without increasing cell
death.
Expression of PGE2 receptors by Vγ9Vδ2 T lymphocytes
PGE2 is a ligand for the G-protein-coupled receptors EP1-4, which expression level in γδ cells
was unknown. Using RT-PCR, we then evaluated the level of mRNA encoding the four PGE2
receptor subtypes. Only EP2, 3 and 4 were expressed by Vγ9Vδ2 T cell lines (Fig. 4A). A
strong cell surface expression of the EP2, EP3 and EP4 receptor proteins was next confirmed
by flow cytometry analysis on Vγ9Vδ2 T cell lines and on resting purified Vγ9Vδ2 T cells
either unstimulated or 2 days following activation with BrHPP+IL-2 (Fig. 4B). EP2 and 4 are
coupled to Gs, activate adenylate cyclase and increase cyclic adenosine monophosphate
(cAMP), whereas the major signalling pathway of EP3 inhibits adenylate cyclise via Gi and
decreases cAMP [38]. Using forskolin, the chemical activator of adenylate cyclase that
mimics the EP2 and EP4 signalling pathways, we reproduced the inhibitory effect of soluble
PGE2 on IFN-γ production by Vγ9Vδ2 T cell lines (Fig. 4C).
In addition, EP-specific agonists reproduced the effect of soluble PGE2 on IFN-γ production
by Vγ9Vδ2 T cell lines (Fig. 4D). Butaprost, a structural analog of PGE2 with good selectivity
for the EP2 receptor was the most effective inhibitor among these agonists: its activity was
virtually the same as that of PGE2. The EP3 and EP4 agonist 1-Hydroxy PGE1 was also
inhibitory of Vγ9Vδ2 T cells although at much higher concentrations. In this case however, 1Hydroxy PGE1 inhibition was not mediated through EP3 since sulprostone, an agonist of EP1
and EP3 receptors was inactive. Together, these results demonstrate that PGE2 inhibits
Vγ9Vδ2 T cells through their EP2 and EP4 receptor-dependent activation of adenylate
cyclase.
Activated Vγ9Vδ2 T cells induce COX2 expression and PGE2 production by MSC
Since MSC inhibition of Vγ9Vδ2 T cell responses depends on COX activity and PGE2, we
checked the expression of this enzyme and the production of its PGE2 metabolite by MSC.
We analysed COX1 and COX2, the two major isoforms of the COX enzyme by flow
cytometry in MSC either cultured alone or co-cultured with resting and phosphoantigenactivated Vγ9Vδ2 T cell lines (cell ratio of 2:10). We observed a low level of COX1 in MSC
cultured in all conditions (data not shown). COX2 expression was also low in MSC cultured
alone, but it was greatly increased in MSC co-cultured with activated Vγ9Vδ2 T cell lines
(Fig. 5A). A dose-dependent up-regulation of COX2 could also be achieved with supernatants
of the co-cultures, suggesting that COX2 expression by MSC is enhanced by soluble factors
released by activated Vγ9Vδ2 T cell lines (Fig. 5B). The presence of PGE2 was titrated by
ELISA in the supernatant of MSC and Vγ9Vδ2 T cells co-cultures. Although MSC secreted
only low levels of PGE2 when cultured alone or co-cultured with resting Vγ9Vδ2 T cell lines
(cell ratio 2:10), MSC co-cultured with activated Vγ9Vδ2 T cell lines produced up to 100
ng/ml of PGE2 (Fig. 5C). The effect of Vγ9Vδ2 T cell lines (activated or not) was totally
mimicked by their culture supernatants. It is noteworthy that PGE2 production by MSC was
significantly inhibited by adding indomethacin at the beginning of the co-cultures or in the
supernatant tests (data not shown).
IFN-γ and TNF-α from activated Vγ9Vδ2 T cells induce PGE2 production by MSC
Soluble IFN-γ and TNF-α are able to induce COX2 expression [39, 40] and PGE2 production
by MSC [30]. Since Vγ9Vδ2 T cells are potent producers of IFN-γ and TNF-α, we wondered
whether these cytokines were inducing COX2 expression in MSC. IFN-γ and TNF-α were
depleted from the Vγ9Vδ2 T cell lines supernatants by immunoprecipitation with specific
antibodies (average depletion: 90%, not shown) and led to supernatants totally unable to
induce COX2 expression (Fig. 6A) and PGE2 production (Fig. 6B). We found that 100 ng/ml
of soluble IFN-γ or TNF-α alone could induce only low level of intracellular COX2 in MSC
as checked by flow cytometry. However, when both cytokines were added together at 100
ng/ml each in MSC cultures over 40% of MSC were COX2+, indicating a cumulative effect
on COX2 induction (Fig. 6C). Altogether, these results demonstrate that both IFNγ and TNFα
produced by activated Vγ9Vδ2 T cell are necessary to induce COX2 expression and PGE2
synthesis in MSC. Interestingly, an average of 10 ng/ml of IFN-γ and TNF-α were detected in
the supernatants of BrHPP activated Vγ9Vδ2 T cell lines whereas 100 ng/ml of commercial
recombinant cytokines were necessary to induce COX2 expression by MSC. The obvious
explanation is that IFN-γ and TNF-α produced by Vγ9Vδ2 T cell might be more bioactive
than commercial recombinant cytokines used in our experiments. However, we can not
exclude that other cytokines produced by activated Vγ9Vδ2 T cell might also potentiate IFN-γ
and TNF-α ability to stimulate COX2 expression by MSC.
Discussion
This study uncovered a regulatory cross-talk between the unconventional human γδ T
lymphocytes and MSC, in which IFN-γ and TNF-α from activated Vγ9Vδ2 T cells induce
PGE2 production by MSC. The cell-surface expression of PGE2 receptors EP2 and EP4 by γδ
T lymphocytes reported here enables soluble PGE2 to transduce a strong cAMP-mediated
inhibitory signalling which efficiently blocks the physiological functions of Vγ9Vδ2 T
lymphocytes.
Vγ9Vδ2 T cells actively participate in anti-infectious immunity though the recognition
of bacteria derived phophoantigens [2]. PGE2 release triggered by microbial products or
inflammatory mediators secreted by macrophages [39, 41], could represent an important
regulatory pathway to prevent deleterious excessive Vγ9Vδ2 T cells activation and to turn off
their responses at the end of infection. This observation is also of importance with regard to
the prospect of developing γδ T cell-based cancer immunotherapy in humans, in which either
treatment with BrHPP /IL2 or autologous Vγ9Vδ2 T cell therapy are expected to restore
strong antitumor immunity [2, 17]. Most- if not all- tumoral cells produce phosphoantigens
triggering Vγ9Vδ2 T cell proliferation, cytokines production and cytotoxicity [36]. In
addition, tumors frequently show progressive loss of cell surface expression of HLA class I
molecules [19], which thereby facilitates recognition by cytolytic NK cells and Vγ9Vδ2 T
lymphocytes. Unfortunately, many tumors, especially solid ones, secrete high amounts of
PGE2 in their micro-environment [41], and might therefore escape Vγ9Vδ2 T cell
cytotoxicity. Neutralizing the PGE2 pathway with COX2 inhibitors is already aimed at
improving αβ T cell–based cancer immunotherapy [42]. Thus, this report suggests such
approaches could also benefit to Vγ9Vδ2 T cell activity. However, other cAMP-triggering
soluble factors from the tumor microenvironment such as adenosine [43], might also be
detrimental to the Vγ9Vδ2 T cell functions as demonstrated in experiments conducted with
forskolin.
Recent studies indicated that MSC are recruited to the stroma of developing tumor [20,
21]. The inhibitory effects of MSC on phosphoantigen-activated Vγ9Vδ2 T cells described in
vitro, where the two cell types are in close vicinity, raise the question of MSC being able to
temper their antitumor effect in vivo as well. Ren et al demonstrated that pro-inflammatory
cytokine activated mouse MSC attract αβ T cells and inhibit their responses, both in vitro and
in vivo, though the production of a wide array of chemokines including CXCL9, CXCL10 and
CXCL11 [44]. Thus, activated Vγ9Vδ2 T cells, that express CXCR3 receptor for these
chemokines [6], might also migrate toward activated MSC present within the tumor stroma
and be targeted by the multiple inhibitory factors produced by these cells.
Based on the therapeutic benefit of MSC to control acute graft-versus-host diseases
[45], MSC immunosuppressive properties are of substantial interest for several chronic
inflammatory pathologies [23, 32]. Indeed, in experimental models of rheumatoid arthritis
(RA) and multiple sclerosis (MS), MSC infusion reduced the extent of autoimmune disorders
[46, 47]. γδ T cells have been implicated in the pathogenesis of these autoimmune diseases in
which TH1 cytokines and cytotoxic factors are thought to play a critical role [48, 49]. For
example in MS, γδ are present in the inflammatory lesions, and show evidence of clonal
expansion [50-52]. The regulatory cross-talk between MSC and γδ T cells described in this
report could contribute to the bioactivity of MSC in ongoing MS clinical trials.
MSC, as part of the bone marrow stromal microenvironment, secrete a number of
cytokines, growth factors, and extracellular matrix molecules that play a pivotal role in the
proliferation, migration and differentiation of HSC [53, 54]. Assuming that MSC in vitro
reflect their physiological function, their suppressive activity in response to pro-inflammatory
cytokines suggests that within the bone marrow, MSC could also protect normal
haematopoiesis from harmful inflammation triggered by activated γδ lymphocytes [55].
Materials and Methods
Reagents
CFSE, Indomethacin, 7-aminoactinomycin D (7-AAD), 1-methyl-DL-tryptophan (1-MT), Nnitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), PGE2, purified mouse mAbs against IFN-γ (clone
25718.11) and TNF-α (clone 28401.111) and forskolin were obtained from Sigma-Aldrich
(Saint-Louis, MO). Butaprost, sulprostone and PGE1-alcohol, purified rabbit Polyclonal
Antibodies directed against EP2, EP3 and EP4 were from Cayman Chemical (Ann Arbor,
MI). Indo-1 AM was from Molecular Probes (San Diego, CA). Purified mAbs against TGFβ (clone AF-101), HGF (clone 24612) and IL-10 (clone 25209) were obtained from R&D
Systems (Minneapolis, MN). FITC-conjugated anti-COX1, PE-conjugated mAbs against
TCRVγ9, IFN-γ, TNF-α, and COX2 were purchased from BD Bioscience (San Jose, CA).
FITC-conjugated mAb anti-TCRVγ9 and FITC conjugated goat F(ab’)2 anti-Rabbit IgG were
from Beckman-Coulter (Fullerton, CA). Purified mouse anti-CD3 mAb was purchased from
eBioscience (San Diego, CA). Recombinant human-IFN-γ and TNF-α were obtained from
Peprotech (Rocky Hill, NJ).
Isolation and culture of human MSC
Human MSC were isolated from PBS-washed filters used during bone marrow graft
processing for allogeneic bone marrow transplantation. Cells were cultured at a density of
5x104 cells/cm² in MEM-α medium (Invitrogen, San Diego, CA) supplemented with 10% of
FCS (Hyclone, Logan, UT) and ciprofloxacin (10 µg/ml; Bayer Schering Pharma, Germany).
After 72 h at 37°C in 5% CO2, non-adherent cells were removed and the medium was
changed. Cultures were fed every 3-4 days for 21 days or until confluency. Adherent cells
were then trypsinized, harvested and cultured at a density of 103/cm² for 1-3 weeks. MSC able
to differentiate into osteoblasts, chondroblasts and adipocytes were CD34–, CD45– and
CD73+, CD90+, CD105+. (data not shown).
TCR Vγ9Vδ2 cells
Primary Vγ9Vδ2 T cell lines were generated from PBMC as described [56], these comprised
more than 95% TCRVγ9Vδ2+ cells. γδ T cells were purified ( ≥ 90%) from freshly isolated
PBMC using magnetically activated cell sorting (Miltenyi Biotec, Auburn, CA).
Proliferation assays
The specified cells were labelled with 1 µM CFSE for 10 min at 37°C. 3x105 CFSE labelled
cells were cultured in 96-well plates with or without irradiated MSC or increasing doses of
soluble PGE2. For TranswellTM cultures, 2x105 allogeneic MSC were seeded in the lower
chamber of a 0.4 µm pore size membrane TranswellTM plate (BD Bioscience) and 1x106
CFSE-labelled PBMC were added in the upper chamber of the TranswellTM. After 6 days of
culture in the presence of 300 U/ml IL-2 and 200nM BrHPP, CFSE dilution and 7-AAD
staining were evaluated by flow cytometry analysis. When specified, indomethacin (5 µM), 1MT (1mM), L-NAME (1mM), anti-TGF-β, anti-IL-10 or anti-HGF mAbs (all at 5 µg/ml)
were added at the beginning of the culture.
Cytokine-production
5x105 Vγ9Vδ2 T cells or purified γδ T cells were stimulated by BrHPP 20 nM with allogeneic
MSC in 48-well plates for 24 h, with adding 10 µM Brefeldin A (Sigma-Aldrich) for the last 5
h of culture. Cells were stained with anti-TCRγ9-FITC, fixed with PBS 2%
paraformaldehyde, stained for 30 min in PBS 1% saponin with the specified PE-conjugated
mAbs and analyzed by flow cytometry. In experiments using soluble PGE2, butaprost,
sulprostone, 1-Hydroxy-PGE1 or forskolin, Vγ9Vδ2 T cell lines were restimulated by 20 nM
BrHPP for 5 h in the presence of 10 µM Brefeldin A.
MSC and Vγ9Vδ2 T cell supernatant collection
MSC culture supernatants were obtained from a 3-day culture of 1x106 MSC plated alone or
with 5x106 allogeneic Vγ9Vδ2 T cells in 6-well plates. Vγ9Vδ2 T cell line culture
supernatants were obtained with 30x106 Vγ9Vδ2 T cells cultured in 30 ml of complete
medium with or without restimulation of 200 nM BrHPP. All supernatants were filtered with
a 0.25 µm pore size filter and frozen at -20°C before use. IFN-γ and TNF-α depletions of
Vγ9Vδ2 T cell line culture supernatants were conducted by overnight incubation at 4°C with
20 µg/ml of either anti-IFN-γ, anti-TNF-α or IgG1-control mAbs. 100 µg/ml of ProteinAagarose were then added for 1 h and supernatants were recovered after centrifugation. IFN-γ
and TNF-α levels, before and after depletion, were analyzed by flow cytometry using the
“CBA beads Th1/ Th2” kit (BD Bioscience).
COX2 expression and PGE2 titration
2x105 MSC seeded alone or in the presence of 1x106 allogeneic Vγ9Vδ2 T cells with or
without 200 nM BrHPP. After 24 h, intracellular staining using FITC-anti-COX1 and PE-antiCOX2 mAbs were done as described above, while PGE2 levels were measured by ELISA
(“Prostaglandin E2 EIA Kit-monoclonal”, Cayman Chemical).
Cytotoxic assays
Standard 4 h
51
Cr-release assays with
51
Cr-labelled Daudi target cells were modified by
adding either MSC culture supernatants or soluble PGE2 into the co-incubation, or by co-
incubating Vγ9Vδ2 T cells with MSC for 24 h at the specified cell ratios before the
experiment.
Calcium flux assessment
Vγ9Vδ2 T cells were loaded with 5 µM Indo-1 AM (Molecular Probes) for 45 min at 37°C
and coated with 5 µg/ml anti-CD3 mAb for 30 min at 4°C in the presence or not of 1000
ng/ml PGE2, and cross-linked with 15µg/ml of goat anti-mouse mAb. Ca++ flux was based on
Indo-1 AM 410/480 nm fluorescence analyzed by flow cytometry.
PGE2 receptor expression
Total RNA was isolated from Vγ9Vδ2 T cell lines by TRIzolTM reagent (Invitrogen). RNA
was reverse transcribed with Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase
(Invitrogen) and cDNA encoding human EP1, EP2, EP3, EP4 and HPRT were amplified by
PCR using the following forward and reverse primers respectively:
5'-GGCCGCTATGAGCTGCAGT-3' and 5'-GAGGTAGAGCTCCAGCCGC-3' (EP1);
5'-GACCGCTTACCTGCAGCTGTA-3' and 5'-GACTGAACGCATTAGTCTCAGAACA-3'
(EP2) ;
5'-AACGGGACTAGCTCTTCGCAT-3'
and
5'-
AGTTGTTTGTGTGGTACCTGATCTG-3' (EP3) ; 5'-GGTCATCTTACTCATTGCCACCT3'
and
5'-GGAGGGTCTGAGATGTACTGCTG-3'
ACTGAACGTCTTGCTCGAGATGT-3'
and
(EP4);
5'-
5'-GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT-3'
(HPRT). The fragment sizes for EP1, EP2, EP3, EP4 and HPRT were 455 bp, 409 bp, 451 bp,
377 bp and 369 bp respectively. The corresponding receptor proteins were detected by flow
cytometry using polyclonal rabbit primary antibodies directed against EP2, EP3 and EP4
(Cayman chemical) and FITC conjugated Goat Fab’2 Anti-Rabbit IgG secondary antibody.
Statistical analysis
Significant differences were assessed by Student’s t (for normal distributions) or MannWhitney’s rank sum (for other distributions) two-tailed tests with a = 0.01 with the SigmaStat
software (Systat Software Inc., San Jose, CA).
Acknowledgements
This work is supported by institutional grants from the « Institut National de la Santé Et de la
Recherche Médicale » (INSERM), the « Etablissement Français du Sang » (EFS) and grants
from the « Association pour la Recherche sur le Cancer » (ARC contract # 3757, Mevalonate
pathway and tumor immunity) and the « Institut National du Cancer » (INCa, contract #
07/3D1616/IABC-23-8/NC-NG).
Conflict of interest
The authors do not report any conflict of interest.
References:
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Poupot, M. and Fournie, J. J., Non-peptide antigens activating human
Vgamma9/Vdelta2 T lymphocytes. Immunol Lett 2004. 95: 129-138.
Bonneville, M. and Scotet, E., Human Vgamma9Vdelta2 T cells: promising new
leads for immunotherapy of infections and tumors. Curr Opin Immunol 2006. 18: 539546.
Ismaili, J., Olislagers, V., Poupot, R., Fournie, J. J. and Goldman, M., Human
gamma delta T cells induce dendritic cell maturation. Clin Immunol 2002. 103: 296302.
Dieli, F., Caccamo, N., Meraviglia, S., Ivanyi, J., Sireci, G., Bonanno, C. T.,
Ferlazzo, V., La Mendola, C. and Salerno, A., Reciprocal stimulation of
gammadelta T cells and dendritic cells during the anti-mycobacterial immune
response. Eur J Immunol 2004. 34: 3227-3235.
Devilder, M. C., Maillet, S., Bouyge-Moreau, I., Donnadieu, E., Bonneville, M.
and Scotet, E., Potentiation of antigen-stimulated V gamma 9V delta 2 T cell
cytokine production by immature dendritic cells (DC) and reciprocal effect on DC
maturation. J Immunol 2006. 176: 1386-1393.
Dieli, F., Poccia, F., Lipp, M., Sireci, G., Caccamo, N., Di Sano, C. and Salerno,
A., Differentiation of effector/memory Vdelta2 T cells and migratory routes in lymph
nodes or inflammatory sites. J Exp Med 2003. 198: 391-397.
Angelini, D. F., Borsellino, G., Poupot, M., Diamantini, A., Poupot, R., Bernardi,
G., Poccia, F., Fournie, J. J. and Battistini, L., FcgammaRIII discriminates between
2 subsets of Vgamma9Vdelta2 effector cells with different responses and activation
pathways. Blood 2004. 104: 1801-1807.
Caccamo, N., Battistini, L., Bonneville, M., Poccia, F., Fournie, J. J., Meraviglia,
S., Borsellino, G., Kroczek, R. A., La Mendola, C., Scotet, E., Dieli, F. and
Salerno, A., CXCR5 identifies a subset of Vgamma9Vdelta2 T cells which secrete IL4 and IL-10 and help B cells for antibody production. J Immunol 2006. 177: 52905295.
Shen, Y., Zhou, D., Qiu, L., Lai, X., Simon, M., Shen, L., Kou, Z., Wang, Q.,
Jiang, L., Estep, J., Hunt, R., Clagett, M., Sehgal, P. K., Li, Y., Zeng, X., Morita,
C. T., Brenner, M. B., Letvin, N. L. and Chen, Z. W., Adaptive immune response
of Vgamma2Vdelta2+ T cells during mycobacterial infections. Science 2002. 295:
2255-2258.
Worku, S., Gorse, G. J., Belshe, R. B. and Hoft, D. F., Canarypox vaccines induce
antigen-specific human gammadelta T cells capable of interferon-gamma production.
J Infect Dis 2001. 184: 525-532.
Agrati, C., Castilletti, C., De Santis, R., Cimini, E., Bordi, L., Malkovsky, M.,
Poccia, F. and Capobianchi, M. R., Interferon-gamma-mediated antiviral immunity
against orthopoxvirus infection is provided by gamma delta T cells. J Infect Dis 2006.
193: 1606-1607; author reply 1607-1608.
Espinosa, E., Belmant, C., Pont, F., Luciani, B., Poupot, R., Romagne, F., Brailly,
H., Bonneville, M. and Fournie, J. J., Chemical synthesis and biological activity of
bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human gamma delta T cells. J Biol
Chem 2001. 276: 18337-18344.
Cendron, D., Ingoure, S., Martino, A., Casetti, R., Horand, F., Romagne, F.,
Sicard, H., Fournie, J. J. and Poccia, F., A tuberculosis vaccine based on
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
phosphoantigens and fusion proteins induces distinct gammadelta and alphabeta T cell
responses in primates. Eur J Immunol 2007. 37: 549-565.
Sicard, H., Ingoure, S., Luciani, B., Serraz, C., Fournie, J. J., Bonneville, M.,
Tiollier, J. and Romagne, F., In vivo immunomanipulation of V gamma 9V delta 2 T
cells with a synthetic phosphoantigen in a preclinical nonhuman primate model. J
Immunol 2005. 175: 5471-5480.
Kobayashi, H., Tanaka, Y., Yagi, J., Toma, H. and Uchiyama, T., Gamma/delta T
cells provide innate immunity against renal cell carcinoma. Cancer Immunol
Immunother 2001. 50: 115-124.
Kunzmann, V. and Wilhelm, M., Anti-lymphoma effect of gammadelta T cells. Leuk
Lymphoma 2005. 46: 671-680.
Lamb, L. S., Jr. and Lopez, R. D., gammadelta T cells: a new frontier for
immunotherapy? Biol Blood Marrow Transplant 2005. 11: 161-168.
Viey, E., Fromont, G., Escudier, B., Morel, Y., Da Rocha, S., Chouaib, S. and
Caignard, A., Phosphostim-activated gamma delta T cells kill autologous metastatic
renal cell carcinoma. J Immunol 2005. 174: 1338-1347.
Rabinovich, G. A., Gabrilovich, D. and Sotomayor, E. M., Immunosuppressive
strategies that are mediated by tumor cells. Annu Rev Immunol 2007. 25: 267-296.
Hall, B., Andreeff, M. and Marini, F., The participation of mesenchymal stem cells
in tumor stroma formation and their application as targeted-gene delivery vehicles.
Handb Exp Pharmacol 2007: 263-283.
Karnoub, A. E., Dash, A. B., Vo, A. P., Sullivan, A., Brooks, M. W., Bell, G. W.,
Richardson, A. L., Polyak, K., Tubo, R. and Weinberg, R. A., Mesenchymal stem
cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature 2007. 449: 557563.
Pittenger, M. F., Mackay, A. M., Beck, S. C., Jaiswal, R. K., Douglas, R., Mosca,
J. D., Moorman, M. A., Simonetti, D. W., Craig, S. and Marshak, D. R.,
Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999. 284:
143-147.
Barry, F. P., Biology and clinical applications of mesenchymal stem cells. Birth
Defects Res C Embryo Today 2003. 69: 250-256.
Jorgensen, C., Djouad, F., Apparailly, F. and Noel, D., Engineering mesenchymal
stem cells for immunotherapy. Gene Ther 2003. 10: 928-931.
Di Nicola, M., Carlo-Stella, C., Magni, M., Milanesi, M., Longoni, P. D.,
Matteucci, P., Grisanti, S. and Gianni, A. M., Human bone marrow stromal cells
suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic
stimuli. Blood 2002. 99: 3838-3843.
Glennie, S., Soeiro, I., Dyson, P. J., Lam, E. W. and Dazzi, F., Bone marrow
mesenchymal stem cells induce division arrest anergy of activated T cells. Blood
2005. 105: 2821-2827.
Krampera, M., Glennie, S., Dyson, J., Scott, D., Laylor, R., Simpson, E. and
Dazzi, F., Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and
memory antigen-specific T cells to their cognate peptide. Blood 2003. 101: 37223729.
Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Gritzapis, A. D., Baxevanis, C. N. and
Papamichail, M., Interactions between human mesenchymal stem cells and natural
killer cells. Stem Cells 2006. 24: 74-85.
Spaggiari, G. M., Capobianco, A., Becchetti, S., Mingari, M. C. and Moretta, L.,
Mesenchymal stem cell-natural killer cell interactions: evidence that activated NK
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
cells are capable of killing MSCs, whereas MSCs can inhibit IL-2-induced NK-cell
proliferation. Blood 2006. 107: 1484-1490.
Aggarwal, S. and Pittenger, M. F., Human mesenchymal stem cells modulate
allogeneic immune cell responses. Blood 2005. 105: 1815-1822.
Nauta, A. J., Kruisselbrink, A. B., Lurvink, E., Willemze, R. and Fibbe, W. E.,
Mesenchymal stem cells inhibit generation and function of both CD34+-derived and
monocyte-derived dendritic cells. J Immunol 2006. 177: 2080-2087.
Uccelli, A., Moretta, L. and Pistoia, V., Immunoregulatory function of mesenchymal
stem cells. Eur J Immunol 2006. 36: 2566-2573.
Djouad, F., Plence, P., Bony, C., Tropel, P., Apparailly, F., Sany, J., Noel, D. and
Jorgensen, C., Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor
growth in allogeneic animals. Blood 2003. 102: 3837-3844.
Chen, L., Cencioni, M. T., Angelini, D. F., Borsellino, G., Battistini, L. and
Brosnan, C. F., Transcriptional profiling of gamma delta T cells identifies a role for
vitamin D in the immunoregulation of the V gamma 9V delta 2 response to phosphatecontaining ligands. J Immunol 2005. 174: 6144-6152.
Rojas, R. E., Balaji, K. N., Subramanian, A. and Boom, W. H., Regulation of
human CD4(+) alphabeta T-cell-receptor-positive (TCR(+)) and gammadelta TCR(+)
T-cell responses to Mycobacterium tuberculosis by interleukin-10 and transforming
growth factor beta. Infect Immun 1999. 67: 6461-6472.
Gober, H. J., Kistowska, M., Angman, L., Jeno, P., Mori, L. and De Libero, G.,
Human T cell receptor gammadelta cells recognize endogenous mevalonate
metabolites in tumor cells. J Exp Med 2003. 197: 163-168.
Bygdeman, M., Pharmacokinetics of prostaglandins. Best Pract Res Clin Obstet
Gynaecol 2003. 17: 707-716.
Sugimoto, Y. and Narumiya, S., Prostaglandin E receptors. J Biol Chem 2007. 282:
11613-11617.
Blanco, J. C., Contursi, C., Salkowski, C. A., DeWitt, D. L., Ozato, K. and Vogel,
S. N., Interferon regulatory factor (IRF)-1 and IRF-2 regulate interferon gammadependent cyclooxygenase 2 expression. J Exp Med 2000. 191: 2131-2144.
Chen, C. C., Sun, Y. T., Chen, J. J. and Chiu, K. T., TNF-alpha-induced
cyclooxygenase-2 expression in human lung epithelial cells: involvement of the
phospholipase C-gamma 2, protein kinase C-alpha, tyrosine kinase, NF-kappa Binducing kinase, and I-kappa B kinase 1/2 pathway. J Immunol 2000. 165: 2719-2728.
Harris, S. G., Padilla, J., Koumas, L., Ray, D. and Phipps, R. P., Prostaglandins as
modulators of immunity. Trends Immunol 2002. 23: 144-150.
DeLong, P., Tanaka, T., Kruklitis, R., Henry, A. C., Kapoor, V., Kaiser, L. R.,
Sterman, D. H. and Albelda, S. M., Use of cyclooxygenase-2 inhibition to enhance
the efficacy of immunotherapy. Cancer Res 2003. 63: 7845-7852.
Blay, J., White, T. D. and Hoskin, D. W., The extracellular fluid of solid carcinomas
contains immunosuppressive concentrations of adenosine. Cancer Res 1997. 57: 26022605.
Ren, G., Zhang, L., Zhao, X., Xu, G., Zhang, Y., Roberts, A. I., Zhao, R. C. and
Shi, Y., Mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression occurs via concerted
action of chemokines and nitric oxide. Cell Stem Cell 2008. 2: 141-150.
Le Blanc, K. and Ringden, O., Mesenchymal stem cells: properties and role in
clinical bone marrow transplantation. Curr Opin Immunol 2006. 18: 586-591.
Djouad, F., Fritz, V., Apparailly, F., Louis-Plence, P., Bony, C., Sany, J.,
Jorgensen, C. and Noel, D., Reversal of the immunosuppressive properties of
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
mesenchymal stem cells by tumor necrosis factor alpha in collagen-induced arthritis.
Arthritis Rheum 2005. 52: 1595-1603.
Zappia, E., Casazza, S., Pedemonte, E., Benvenuto, F., Bonanni, I., Gerdoni, E.,
Giunti, D., Ceravolo, A., Cazzanti, F., Frassoni, F., Mancardi, G. and Uccelli, A.,
Mesenchymal stem cells ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis
inducing T-cell anergy. Blood 2005. 106: 1755-1761.
Rajan, A. J., Gao, Y. L., Raine, C. S. and Brosnan, C. F., A pathogenic role for
gamma delta T cells in relapsing-remitting experimental allergic encephalomyelitis in
the SJL mouse. J Immunol 1996. 157: 941-949.
Spahn, T. W., Issazadah, S., Salvin, A. J. and Weiner, H. L., Decreased severity of
myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 33 - 35-induced experimental
autoimmune encephalomyelitis in mice with a disrupted TCR delta chain gene. Eur J
Immunol 1999. 29: 4060-4071.
Battistini, L., Selmaj, K., Kowal, C., Ohmen, J., Modlin, R. L., Raine, C. S. and
Brosnan, C. F., Multiple sclerosis: limited diversity of the V delta 2-J delta 3 T-cell
receptor in chronic active lesions. Ann Neurol 1995. 37: 198-203.
Shimonkevitz, R., Colburn, C., Burnham, J. A., Murray, R. S. and Kotzin, B. L.,
Clonal expansions of activated gamma/delta T cells in recent-onset multiple sclerosis.
Proc Natl Acad Sci U S A 1993. 90: 923-927.
Stinissen, P., Vandevyver, C., Medaer, R., Vandegaer, L., Nies, J., Tuyls, L.,
Hafler, D. A., Raus, J. and Zhang, J., Increased frequency of gamma delta T cells in
cerebrospinal fluid and peripheral blood of patients with multiple sclerosis. Reactivity,
cytotoxicity, and T cell receptor V gene rearrangements. J Immunol 1995. 154: 48834894.
Dazzi, F., Ramasamy, R., Glennie, S., Jones, S. P. and Roberts, I., The role of
mesenchymal stem cells in haemopoiesis. Blood Rev 2006. 20: 161-171.
Krampera, M., Cosmi, L., Angeli, R., Pasini, A., Liotta, F., Andreini, A.,
Santarlasci, V., Mazzinghi, B., Pizzolo, G., Vinante, F., Romagnani, P., Maggi, E.,
Romagnani, S. and Annunziato, F., Role for interferon-gamma in the
immunomodulatory activity of human bone marrow mesenchymal stem cells. Stem
Cells 2006. 24: 386-398.
Fisch, P., Handgretinger, R. and Schaefer, H. E., Pure red cell aplasia. Br J
Haematol 2000. 111: 1010-1022.
Espinosa, E., Tabiasco, J., Hudrisier, D. and Fournie, J. J., Synaptic transfer by
human gamma delta T cells stimulated with soluble or cellular antigens. J Immunol
2002. 168: 6336-6343.
Legend to Figures
Fig.1: MSC inhibit antigen-induced Vγγ9Vδ
δ2 T cell responses
(A-E) CFSE-labelled PBMC or purified γδ T cells stimulated with BrHPP+IL-2 were cocultured for 6 days with irradiated allogeneic MSC. (A) Representative CFSE dilution by
dividing Vγ9+ cells from PBMC (upper panel) or purified γδ T cells (lower panel). (B) Rates
of dividing Vγ9+ cells from the above experiments (Mean +/- SD from n = 5 indep. expts;
p < 0.01 (Mann-Whitney test)). (C) Absolute Vγ9+ cell counts recovered from
PBMC+MSC co-cultures (Means +/- SD from n = 4 ind. expts, p < 0.01 (Mann-Whitney
test)). (D) Dividing and dying Vγ9+ cells from purified γδ T cells co-cultured with MSC
(representative experiment out of 4). (E) Rates of apoptotic Vγ9+ cells among divided (black
bars) or undivided (white bars) Vγ9+ cells in the above experiments (Means +/- SD, n=4 ind.
expts N.S p > 0.05 (Student test)). (F,G) BrHPP-stimulated γδ T cells producing IFN-γ and
TNF-α in the presence of MSC. (F: representative experiment; G: Means +/- SD from n = 3
ind. expts, p < 0.001 (Student test)). (H) Inhibition of Daudi target cell lysis by
Vγ9Vδ2 T cells in presence of MSC as follows: □: no MSC added, : 0.2 MSC per 10 γδ, ▲:
1 MSC per 10 γδ, ●: 2 MSC per 10 γδ, ■: 5 MSC per 10 γδ. (representative from n = 3 ind.
expts).
Fig. 2: COX activity from MSC inhibits Vγγ9Vδ
δ2 T cell responses.
(A-C, E) Purified γδ T cells co-cultured with BrHPP+IL2 and allogeneic MSC in conditions
allowing (black) or not (white) cell contact. (A) Rates of dividing Vγ9+ cells after 6 days in
the co-cultures (Means +/- SD from 5 indep. expts). (B,C) Rates of IFN-γ+ and TNF-α+ Vγ9+
cells 24 h after stimulation by BrHPP (Means +/- SD from 3 indep. expts). (D) Standard 51Cr
release assay from Daudi target cells lysed by Vγ9Vδ2 T cells in complete medium alone (□),
in medium with MSC culture supernatant () or in medium with MSC and Vγ9Vδ2 T cell
line co-culture supernatant (▲) (representative of 3 indep. expts). (E) Rates of dividing Vγ9+
PBMC after 6 days in co-cultures with MSC supplemented with the specified drugs (Means
+/- SD from 5 indep. expts). N.S p > 0.05 ; p < 0.001 (Student test).
δ2 T cell activation and responses. (A) Ca++ flux
Fig 3: Soluble PGE2 inhibits Vγγ9Vδ
induced by anti-CD3 stimulation of Vγ9Vδ2 T cell lines preincubated (grey line) or not (black
line) with 1µg/ml of PGE2; GAM : goat anti-mouse cross linking (representative of 3 indep.
expts). (B) IFN-γ+ and TNF-α+ Vγ9+ cells 5 h after stimulation of Vγ9Vδ2 T cell lines by
BrHPP in presence of PGE2 (representative of 5 ind. expts). (C) PGE2 inhibits the specific
lysis of 51Cr-pulsed Daudi target cells by Vγ9Vδ2 T cell lines □: no PGE2 added, : 10 ng/ml
PGE2, ▲: 100 ng/ml PGE2, ●: 1000 ng/ml PGE2, ■: 10 000 ng/ml PGE2. (representative of 5
ind. expts). (D) Representative CFSE dilution and 7AAD staining of purified γδ T cells
stimulated by BrHPP/IL2 in the presence of PGE2 (representative of 4 ind. expts). (E) Rates
of dividing Vγ9+ cells from purified γδ T cells cultures stimulated by BrHPP/IL2 in the
presence of PGE2 added from the beginning of the culture (black bars) or 24 h after
BrHPP/IL2 stimulation (white bars) (Mean +/- SD from n = 4 indep. expts). (F) Rates of
apoptotic Vγ9+ cells among divided (black bars) or undivided (white bars) purified γδ T cells
stimulated by BrHPP/IL2 in the presence of PGE2 (Means +/- SD, n=4 ind. expts). N.S p >
0.05 , p < 0.01 , p < 0.001 (Student test). N.D, non detectable.
Fig 4: Expression of PGE2 receptors by Vγγ9Vδ
δ2 T cells. (A) RT-PCR for EP1, EP2, EP3
and EP4-mRNA from Vγ9Vδ2 T cell lines; HPRT: mRNA for hypoxantine phosphoribosyl
transferase (representative from 4 ind. cell lines). (B) Cell surface expression of EP2, EP3 and
EP4 receptor on purified Vγ9Vδ2 T cells stimulated or not by BrHPP/IL2 or on Vγ9Vδ2 T
cell lines ; grey line, isotype control; black line, EP2 receptor; dotted line, EP3 receptor ;
dashed line, EP4 receptor. (C,D) Rates of IFN-γ+ Vγ9+ cells 5 h after stimulation of Vγ9Vδ2 T
cell lines by BrHPP and increasing doses of (C) forskolin (■) or control medium alone (□); or
of (D) increasing doses of PGE2 (□), EP1-3 agonist sulprostone (), EP2 agonist butaprost
(▲) or EP 3-4 agonist Prostaglandin E1 Alcohol (●) (Means +/- SD from of 4 ind. expts).
Fig 5: Activated Vγγ9Vδ
δ2 T cells induce COX2 expression and PGE2 production by MSC
(A) Intracellular COX2 expression in MSC cultured for 24 h either alone (medium) or with
Vγ9Vδ2 cells activated or not by BrHPP. (B) Rates of COX2+ MSC after 24 h of culture
alone, or with Vγ9Vδ2 T cells, or with Vγ9Vδ2 T cell line supernatant (SN) (Means +/- SD
from 5 indep. expts, p < 0.001 (Student test)). (C) PGE2 concentrations in the specified
culture supernatants (representative of 4 ind. expts).
Fig 6: IFN-γγ and TNF-α
α from activated Vγγ9Vδ
δ2 T cells induce PGE2 production by
MSC (A,B) Depletion of both IFN-γ and TNF-α from supernatants of activated Vγ9Vδ2 cell
cultures reduces (A) COX2 induction in MSC (Means +/- SD from 4 ind. Expts ; N.S p >
0.05, p < 0.01 (Student test) versus activated γ9δ2 cells SN treated MSC) and (B) PGE2
secretion (representative of 4 ind. expts). (C) Rates of COX2+ MSC after 24 h of culture in
medium alone, or supplemented with recombinant IFN-γ and/or recombinant TNF-α (10 or
100 ng/ml) (Means +/- SD from 3 ind. Expts ; N.S p > 0.05 , p < 0.01 (Student test)
versus medium treated MSC).
γδ and MSC cross-talk
L. Martinet et al.
FIGURE 1
B
MSC / responder cell ratio
1:10
2:10
Divided γ9δ2 Tcells (%)
0.2:10
TCR vγ9
0:10
100
75
75
50
50
25
25
0
0
0:10
1:10
2:10
0:10
0:10
0.2:10
1:10
2:10
30
20
10
0
0:10
0.2:10
1:10
2:10
CFSE
MSC / PBMC cell ratio
36%
2:10
10%
18%
α
TNFα
36%
TCR vγ9
5%
N.S
30
20
10
0
H
60
40
0.2:10
1:10
2:10
MSC / γδ T cell ratio
80
40
20
Specific lysis (%)
44%
1:10
IFNγ producing
γ9δ2 T cells (%)
0.2:10
γ
IFNγ
0:10
TNFα producing
γ9δ2 T cells (%)
MSC / γδ T cell ratio
2:10
50
0:10
G
F
1:10
E
MSC / γδ T cell ratio
40
0.2:10
MSC / γδ T cell ratio
7 AAD
γ9δ2 Tcells number (x1000)
D
50
0.2:10
MSC / PBMC cell ratio
CFSE
C
100
7AAD+ γ9δ2 Tcells (%)
A
0
0
60
40
60
40
20
20
0
0
0:10
0.2:10
1:10
MSC / γδ T cell ratio
2:10
30:1
10:1
γ9δ2 / Target cell ratio
5:1
γδ and MSC cross-talk
L. Martinet et al.
B
100
75
N.S
50
25
C
TNFα producing γ9δ2 T cells (%)
0
MSC
-
-
D
N.S
60
40
N.S
20
0
MSC
E
-
Dividedγ9δ2
γδ Tcells
(%)
Divided
Tcells (%)
100
-
N.S
60
40
N.S
20
0
MSC
+
+
-
-
+
60
40
20
0
+
+
30:1
10:1
γδ / Target cell ratio
75
50
25
0
No
MSCs
+
80
Specific Lysis (%)
Divided γ9δ2 Tcells (%)
N.S
A
IFNγ producing γ9δ2 T cells (%)
FIGURE 2
With MSCs +
medium INDO αTGF-β αIL-10 αHGF
1-MT L-NAME
γδ and MSC cross-talk
L. Martinet et al.
FIGURE 3
PGE2 (ng/ml)
B
100
1000
10000
43%
43%
31%
31%
16%
16%
6%
6%
3%
49%
49%
40%
40%
17%
17%
3%
1%
1000
10000
IFNγ
150
10
100
TNFα
GAM
50
0
C
0
20
40 60
Time (s)
80
100
D
Specific Lysis (%)
40
TCRvγ9
120
30
No BrHPP
0
10
PGE2 (ng/ml)
100
7AAD
Mean Indo-1 Ratio (X100)
A
0
20
10
0
CFSE
10:1
5:1
γδ: Target cell ratio
Divided γ9δ2 Tcells (%)
E
F
100
75
50
25
0
0
10
100
1000 10000
PGE2 (ng/ml)
7AAD+ γ9δ2 Tcells (%)
30:1
80
60
N.S
40
20
0
N.D
N.D
No BrHPP
0
10
100
1000
PGE2 (ng/ml)
10000
γδ and MSC cross-talk
L. Martinet et al.
FIGURE 4
B
A
A
B
C
Purified Vγ9Vδ2 T cells
Vγ9Vδ2 T cell line
D
EP 1
EP 2
EP 3
EP 4
HPRT
Day 0
D
80
IFNγ producing γ9δ2 T cells (%)
IFNγ producing γ9δ2 T cells (%)
C
Day 2
60
40
20
0
80
60
40
20
0
0
10-7
10-6
10-5
concentration (M)
10-4
0
0.01
0.1
1
concentration (µg/ml)
10
γδ and MSC cross-talk
L. Martinet et al.
FIGURE 5
A
medium
Activated Vγ9Vδ2
Vγ9Vδ2
Intracellular COX2
B
COX2 expressing MSC (%)
60
40
20
0
medium Vγ9Vδ2 Activated Vγ9Vδ2
SN
Vγ9Vδ2
C
1
1:2
1:4
1:8
dilution of activated Vγ9Vδ2
SN
PGE2 (ng/ml)
150
100
50
0
Vγ9Vδ2
activated
Vγ9Vδ2
MSC
MSC +
Vγ9Vδ2
MSC +
activated
Vγ9Vδ2
MSC +
Vγ9Vδ2
SN
MSC +
activated
Vγ9Vδ2 SN
γδ and MSC cross-talk
L. Martinet et al.
FIGURE 6
COX2 expressing MSC (%)
A
60
N.S
40
N.S
20
0
medium
αIgG1
Ctrl
αIFNγ αTNFα αIFNγ/TNFα
activated γ9δ2 cells SN
B
PGE2 (ng/ml)
150
100
50
0
medium
αIgG1
Ctrl
C
αIFNγ αTNFα αIFNγ/TNFα
activated γ9δ2 cells SN
60
COX2 expressing MSC (%)
40
N.S
N.S
20
0
10
100
10
100
10
100
medium
IFNγ
TNFα
IFNγ + TNFα
Résultats supplémentaires
I. Interaction entre les MSC et les cellules T Vγγ9Vδ
δ2.
I. 1 Les MSC favorisent le développement de tumeurs dans les souris SCID/beige.
Les résultats précédents démontrent que les MSC inhibent les réponses biologiques
fonctionnelles des lymphocytes T Vγ9Vδ2 in vitro. Afin de déterminer si les MSC peuvent
inhiber la destruction de tumeurs par les lymphocytes T Vγ9Vδ2 in vivo, j’ai cherché dans un
premier à analyser l’influence des MSC sur la croissance de tumeurs humaines xenogréffées
dans des souris immunodéficientes SCID/beige. Pour ce faire, 5 millions de cellules de la
lignée de Myélome Multiple RPMI 8226 ont été injectées en sous-cutané en présence ou en
l’absence de 1 million de MSC. Malgré un nombre sub-optimal de cellules tumorales
injectées, la présence de MSC a permis le développement de tumeurs dans 90% des souris coinjectées avec RPMI 8226 et les MSC alors que seulement 4 souris sur 10 ont développé des
tumeurs visibles dans les 55 jours après l’injection de RPMI 8226 seul (Fig. 24 .A,B). Ces
résultats indiquent que les MSC améliorent la prise de greffe de la tumeur RPMI 8226 dans
les souris SCID/beige. Les MSC ont également accéléré le développement des tumeurs dans
ces animaux. En présence de MSC, 9 souris sur 10 ont développé des tumeurs dans les 20
jours suivant l’injection des RPMI 8226 alors qu’aucun des animaux contrôles ne présentaient
de tumeurs visibles jusqu’à 30 jours après injection (Fig. 24. A,B). Comme les souris
SCID/beige sont caractérisées par une absence de cellules T, B et présentent des NK, des
neutrophiles et des macrophages non fonctionnels on peut penser que la capacité des MSC à
promouvoir la croissance des cellules tumorales est indépendante de leur action
immunosuppressive. Etant donné l’importante différence observée entre les lots de souris
injectés avec RPMI 8226 seul et les lots co-injectés avec les MSC, il était difficilement
envisageable de pouvoir étudier le rôle des MSC dans l’inhibition de la destruction de RPMI
8226 par les lymphocytes T Vγ9Vδ2 dans les souris SCID/beige. En effet, l’absence d’effet
antitumoral des Vγ9Vδ2 en présence de MSC dans un tel modèle pourrait être aussi bien due
à l’inhibition des fonctions des T Vγ9Vδ2 par les MSC qu’à une croissance accrue des
cellules tumorales en présence de MSC.
105
B
100
3
90
Tumor free mice (%)
Mean Tumor diameter (cm)
A
2.5
2
1.5
1
0.5
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
Days after tumor inoculation
0
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Days after tumor inoculation
Figure 24 : Les MSC favorisent le développement de tumeurs dans les souris SCID/beige.
5 millions de cellules de la lignée de Myélome Multiple RPMI 8226 ont été injectées en sous-cutané dans des
souris SCID/beige en présence (symbole noir) ou en l’absence (symbole blanc) de 1 million de MSC (n =10
animaux par groupe). (A) Diamètre moyen des tumeurs des animaux de chaque groupe. (B) Pourcentage de
souris ne développant pas de tumeurs dans la même expérience.
I.2 Les cellules T Vγγ9Vδ
δ2 induisent la sécrétion d’IL-6 et de VEGF par les MSC.
Un certain nombre de facteurs comme l’IL-6 et le VEGF, impliqués dans les fonctions
de remodelage tissulaire et dans la régénération des tissus par les MSC
connus pour influer sur le développement et la croissance tumorale
520
519
sont également
. Les résultats publiés
dans l’article (Martinet et al, Eur JI, accepted) indiquent que cytokines pro-inflammatoires
sécrétées par les lymphocytes T Vγ9Vδ2 activés stimulent l’expression de COX2 et la
production de PGE2 par les MSC. La sécrétion d’IL-6 et de VEGF des MSC a donc également
été analysée en présence des lymphocytes T Vγ9Vδ2.
L’analyse de la sécrétion d’IL-6 dans le surnageant des MSC cultivées seules ou en
présence de lignées de lymphocytes T Vγ9Vδ2 restimulés ou non par du BrHPP indique que
les MSC cultivées seules produisent de faibles quantités d’IL-6 alors que la présence de
lymphocyte T Vγ9Vδ2 dans la culture induit une augmentation de cette production qui est
encore plus importante lorsque les cellules T Vγ9Vδ2 sont activées (Fig. 25.A).
L’augmentation de l’IL-6 dans le surnageant des co-cultures de MSC et de Vγ9Vδ2 activés
n’est pas due à la production d’IL-6 par les lymphocytes T Vγ9Vδ2 restimulés comme le
démontre l’absence d’IL-6 dans le surnageant des T Vγ9Vδ2 cultivés seuls (Fig. 25.A). De
plus, la production d’IL-6 intracellulaire dans les MSC, détectée par cytométrie de flux, est
106
augmentée en présence de lymphocytes T Vγ9Vδ2 activés (Fig. 25.B). Cette augmentation de
la production d’IL-6 est médié par des facteurs solubles comme le démontre la capacité du
surnageant de culture de lymphocytes T Vγ9Vδ2 activés avec des doses croissantes de BrHPP
à stimuler la production d’IL-6 par les MSC (Fig. 25.C). L’IFNγ et le TNFα ajoutés de
manière exogène dans les cultures de MSC sont tous deux capables d’induire une
augmentation de la sécrétion d’IL-6 par ces dernières suggérant que ces cytokines produites
par les lymphocytes T Vγ9Vδ2 activés sont à l’origine de l’augmentation de la production
d’IL-6 comme c’est le cas pour la PGE2. (Fig. 25.D).
B
E
250
10
200
7.5
VEGF (ng/ml)
IL-6 (ng/ml)
A
150
100
50
0
N.D
N.D
N.D
D
0
MSC +
Activated
Vγ9Vδ2
D
150
150
IL-6 (ng/ml)
200
IL-6 (ng/ml)
200
100
Vγ9Vδ2
Activated MSC MSC
MSC
Vγ9Vδ2
Vγ9Vδ2 Activated
Vγ9Vδ2
100
50
50
0
2.5
IL-6-PE
Vγ9Vδ2 Activated MSC MSC +
Vγ9Vδ2
Vγ9Vδ2
C
5
MSC MSC + Vγ9Vδ2
Vγ9Vδ2 supernatant
100
10
1
0
BrHPP (nM)
0
Medium 10
100
IFNγ (ng/ml)
10
100
TNFα (ng/ml)
Figure 25 : Les cellules T Vγγ9Vδ
δ2 augmentent la sécrétion d’IL-6 et de VEGF par les MSC. (A)
Concentrations en IL-6 détectées dans le surnageant des cultures de MSC et/ou de lignées de lymphocytes T
Vγ9Vδ2 activés ou non par du BrHPP (représentatif de 5 expériences indépendantes). (B) IL-6 intracellulaire
détectée par cytométrie de flux dans les MSC cultivées seules (histogramme gris) ou en présence de surnageant
de lignées de lymphocyte T Vγ9Vδ2 au repos (histogramme pointillé) ou activés par du BrHPP (histogramme
noir) (représentatif de 3 expériences indépendantes). (C) concentrations en IL-6 détectées dans le surnageant des
cultures de MSC en présence de surnageant de lignées de lymphocytes T Vγ9Vδ2 activés par des doses
croissantes de BrHPP (représentatif de 3 expériences indépendantes). (D) concentrations en IL-6 détectées dans
le surnageant des cultures de MSC en présence de d’IFNγ ou de TNFα exogène (représentatif de 3 expériences
indépendantes). (E) Concentrations en VEGF détectées dans le surnageant des cultures ou co-cultures spécifiées
(représentatif de 3 expériences indépendantes). N.D, non détectable.
107
La production de VEGF par les MSC en présence de lymphocytes T Vγ9Vδ2 a également été
analysée. L’ajout de lymphocytes T Vγ9Vδ2 activés ou non par du BrHPP induit une
augmentation de la sécrétion de VEGF dans le surnageant de culture des MSC (Fig. 25.E).
Comme le surnageant de culture des lymphocytes T Vγ9Vδ2 activés ou non ne contient pas
de VEGF, le VEGF détecté dans le surnageant est produit par les MSC. Toutefois, à la
différence de l’IL-6 ou de la PGE2, l’augmentation du VEGF dans le surnageant des cultures
de MSC en présence de cellules T Vγ9Vδ2 ne semble pas dépendre de l’activation de ces
dernières par le BrHPP.
I.3 Réponses effectrices des lymphocytes T Vγγ9Vδ
δ2 en présence de PGE2.
Parallèlement au processus de lyse, les lymphocytes effecteurs cytotoxiques, et
particulièrement les cellules T Vγ9Vδ2, sont capables de capturer des morceaux de
membranes de leurs cellules cibles par un processus appelé trogocytose. Il a été démontré
récemment dans l’équipe que les cellules T Vγ9Vδ2 cytolytiques capturent des fragments de
membrane et sécrètent des granules lytiques de manière simultanée
521
suggérant que la
trogocytose ne serait pas requise à l’activation des lymphocytes T Vγ9Vδ2, mais plutôt une
conséquence de cette dernière. Comme la PGE2 bloque la capacité des lymphocytes T
Vγ9Vδ2 à lyser la lignée de lymphome de Burkitt Daudi, la capacité de la PGE2 à moduler la
trogocytose de lignées de lymphocytes T Vγ9Vδ2 a été analysée. La figure 26.A démontre que
la PGE2 diminue de manière dose dépendante la quantité de matériel membranaire capté par
les lymphocytes T Vγ9Vδ2 en présence de la cible Daudi marquée au PKH67. En
conséquence, il semblerait donc que la PGE2 inhibe le processus de trogocytose et de lyse
suggérant que la PGE2 bloque l’activation des lymphocytes T Vγ9Vδ2 induite par la
reconnaissance de ligands activateurs sur la cible Daudi.
Le processus d’activation des lymphocytes T Vγ9Vδ2 qui conduit à la destruction des
cellules cibles est la conséquence de l’intégration des différents signaux activateurs fournis
par le TCR Vγ9Vδ2 et par les autres récepteurs ou co-recepteurs exprimés par ces cellules
comme NKG2D, CD16 ou NKp44. Afin de déterminer les effets de la PGE2 sur l’activation
de la lyse induite spécifiquement par le récepteur TCR Vγ9Vδ2, un test classique de lyse
redirigée au 51Cr de la cible de mastocytome murin FCγR III+ P815 a été réalisé en présence
d’anticorps agonistes anti-TCRVδ2 et de concentrations croissantes de PGE2. La figure 26.B
démontre que la PGE2 inhibe de manière statistiquement significative la lyse des cellules
108
P815 induite par l’activation du TCR Vγ9Vδ2. L’étude de la lyse des cellules P815 en
présence de dose croissantes de TCR Vγ9Vδ2 m’a permis par la suite de chercher déterminer
si la capacité de la PGE2 à inhiber la lyse de cellules cibles induite par le TCR Vγ9Vδ2
dépendait de la dose antigénique détectée sur la cellule cible. Ainsi, la proportion de
lymphocytes T Vγ9Vδ2 qui exprimait le marqueur CD107a (LAMP1) en présence de cibles
P815 et de concentrations croissantes d’anticorps anti-TCRVδ2 a été analysée par cytométrie
de flux. CD107a est un marqueur présent dans les granules cytotoxiques qui est exprimé à la
membrane extracellulaire uniquement lorsque la cellule effectrice libère son contenu lytique
et qui est décrit comme un marqueur très fiable pour évaluer l’activité cytolytique
522
. La
figure 26.C indique que même aux doses d’anticorps les plus élevées la PGE2 inhibe toujours
les capacités cytolytiques des lymphocytes T Vγ9Vδ2. Afin de confirmer ces résultats, la
production d’IFNγ et de TNFα intracellulaire induite dans les lymphocytes T Vγ9Vδ2 en
réponse à des doses croissantes de BrHPP a été analysée. La PGE2 inhibait la production
d’IFNγ et de TNFα intracellulaire des lymphocytes T Vγ9Vδ2 pour toutes les doses de
BrHPP testées (fig 26.D). Ces données indiquent que la PGE2 inhibe l’activation des cellules
T Vγ9Vδ2 induite par le TCR Vγ9Vδ2 indépendamment de la dose antigénique qui sert à
activer ces cellules.
109
T 3 min
T 60 min
B
TCR Vγ9
A
P815 Specific lysis (%)
Vγ9Vδ2 PKH67 MFI
5000
4000
3000
2000
PGE2 1000 ng/ml
30
PGE2 10000 ng/ml
20
10
1000
0
0
IgG1
T60 min
30
20
10
0
0,5
1
5
Anti δ2 (µg/ml)
anti TCRδ2
D
10
50
Cytokine producing γ9δ2 T cells (%)
T3 min
C
CD107+ Vγ9Vδ2 Tcells (%)
PGE2 10 ng/ml
PGE2 100ng/ml
PKH67
0
Sans PGE2
40
50
40
30
20
10
0
10
100
1000
BrHPP (nM)
10000
Figure 26 : Réponses effectrices des lymphocytes T Vγγ9Vδ
δ2 en présence de PGE2. (A) Intensité moyenne de
fluorescence des lymphocytes T Vγ9Vδ2 incubés 3 (contrôle) ou 60 min en présence de la lignée cellulaire
Daudi marquée au PKH67 et de concentrations croissantes en PGE2 (représentatif de 3 expériences
indépendantes). (B) Lyse redirigée de cibles P815 marquées au 51Cr par une lignée de lymphocyte T Vγ9Vδ2 en
présence de concentrations croissantes de PGE2 et d’anticorps anti-IgG1 contrôle ou anti-TCRVδ2 (Moyenne et
déviation standard calculées à partir de 3 expériences indépendantes). (C) Pourcentage de lymphocytes T
Vγ9Vδ2 CD107a+ en présence de cibles P815 pré-incubées avec des concentrations croissantes en anticorps antiTCRVδ2 avec (noir) ou sans (blanc) PGE2 (1000 ng/ml) (Moyenne et déviation standard calculées à partir de 3
expériences indépendantes). (D) Pourcentage de lymphocytes T Vγ9Vδ2 IFNγ+ (■) ou TNFa+ (▲) en présence
de concentrations croissantes en BrHPP avec (gris) ou sans (noir) 1000 ng/ml de PGE2 (Représentatif de 3
expériences indépendantes).
110
II. Effet de la PGE2 sur la cytotoxicité des NK.
II. 1 La PGE2 inhibe l’activation des NK induite par les récepteurs NCR, CD16 et
NKG2D.
L’activation des cellules NK est le résultat de l’intégration de divers signaux transmis
par les différents récepteurs inhibiteurs et activateurs exprimés par ces cellules. Il existe 3
types de récepteurs activateurs qui jouent un rôle majeur dans l’activation du potentiel
cytolytique des cellules NK contre les cellules cibles : les Natural Cytotoxicity Receptor
(NCR) NKp30, NKp44, NKp46, le récepteur de type lectine NKG2D et le récepteur de basse
affinité au fragment constant des IgG, CD16
106
. La PGE2 est connue depuis de nombreuses
années pour ses capacités à moduler les réponses effectrices des cellules NK
356
mais jusqu’à
présent, aucune étude n’a permis de déterminer si la PGE2 peut moduler l’activation des
cellules NK induite par ces différents types de récepteurs. J’ai donc cherché à étudier l’action
de la PGE2 sur l’activité cytotoxique des cellules NK induite par l’activation des différents
récepteurs cités précédemment en utilisant comme modèle la lyse redirigée de la lignée de
mastocytome murin P815 en présence d’anticorps agonistes des récepteurs NKp30, NKp44,
NKp46, CD16 et NKG2D. Les résultats présentés figure 27A démontrent que la présence de
1000 ng/ml de PGE2 permet d’inhiber presque totalement la lyse de P815 induite par les
récepteurs NCR, CD16 et NKG2D. L’utilisation de doses croissantes de PGE2 démontre que
l’inhibition des réponses cytotoxiques induites par ces trois classes de récepteurs dépend de la
dose de PGE2 présente lors du test (Fig.27.B). L’étude du marqueur CD107a sur les cellules
NK en présence de cibles P815 et d’anticorps agonistes des NCR, de CD16 et de NKG2D
confirme la capacité de la PGE2 à inhiber la dégranulation des NK induite par ces 3 types de
récepteurs (Fig. 27.C,D).
111
B
P815 spécific lysis (%)
P815 specific lysis (%)
60
40
20
0
80
80
60
60
40
40
20
20
P815 specific lysis (%)
A
0
0
0
αIgG1 αNKp30 αNKp44 αNKp46 αCD16 αNKG2D
00.1
0.1
1
1
10
10
PGE2 (ng/ml)
PGE2 (µg/ml)
C
αIgG1
α
IgG1
11%
αNCR
αNCR
α NKG2D
49%
37%
D
αCD16
αCD16
80
51%
3%
22%
12%
29%
1 µg/ml
µg/ml
PGE2
2%
15%
3%
21%
CD107 + NK cells (%)
CD107 a
medium
PGE2 0,1
PGE2 1
60
medium
PGE2 10
40
20
10 µg/ml
µg/ml
PGE2
0
CD56
αNCR
αNKG2D
αCD16
Figure 27 : La PGE2 inhibe l’activation du potentiel cytolytique des cellules NK médiée par les récepteurs
NCR, CD16 et NKG2D. (A-D) Des cellules NK isolés à partir de donneurs sains ont été incubées en présence
ou en l’absence de PGE2 avec la cible P815 préalablement marquée avec les anticorps spécifiés. (A) Test de lyse
au 51Cr en présence (histogramme noir) ou en l’absence (histogramme blanc) de PGE2 (1000ng/ml) (Moyenne et
déviation standard calculées à partir de triplicats, donnée représentative de 4 expériences indépendantes). (B)
Test de lyse de cibles P815 marquées au 51Cr et pré-incubées avec des anticorps anti-IgG1 (), anti-NCR (▲),
anti-CD16 () ou anti-NKG2D () en présence de concentrations croissantes en PGE2 (donnée représentative
de 4 expériences indépendantes). (C-D) Pourcentage de cellules NK CD107a+ en présence de concentrations
croissantes en PGE2 (0-10 µg/ml), (C) donnée représentative, (D) Moyenne et déviation standard calculées à
partir de 5 expériences indépendante. p< 0.001 Student T test.
II. 2 La fixation de la PGE2 sur les récepteurs EP2 et EP4 inhibe l’activation des NK
induite par les récepteurs NCR, CD16 et NKG2D.
Même si la PGE2 est connue pour inhiber les cellules NK, jusqu’à présent, aucune
étude ne s’est intéressée à l’expression des récepteurs EP1-4 sur ces cellules. L’expression des
récepteurs à la PGE2 EP1-4 a donc été analysée par RT-PCR sur les NK fraichement purifiés
à partir de donneurs sains. L’ARNm pour EP1 n’était exprimé dans aucun des donneurs
(données non montrées) mais les ARNm codant pour EP2, EP3 et EP4 étaient détectables
112
dans les NK des trois donneurs testés suggérant que ces récepteurs sont exprimés dans les
cellules NK (Fig 28.A).
A
Purified NK
B
A
C
EP 2
EP 3
EP 4
HPRT
Inhibition of CD107a expression (%)
B
60
anti-NCR
anti-CD16
anti-NKG2D
40
20
0
10-8
10-7
10-6
10-5
10-8
10-7
10-6
10-5
10-8
10-7
10-6
10-5
EP receptor agonist concentration (g/ml)
Figure 28 : La fixation de la PGE2 sur les récepteurs EP2 et EP4 inhibe l’activation des NK. (A) Expression
des mRNA codant pour les récepteurs à la PGE2 EP2, EP3 et EP4 détectée par RT-PCR dans des NK
fraichement purifiés à partir de 3 donneurs sains. (B) Les cellules NK ont été mis en présence de cibles P815 préincubées avec les anticorps spécifiés et des doses croissantes de PGE2 (○), de l’agoniste de EP 1 et 3 sulprostone
(▲), de l’agoniste de EP2 butaprost () ou de l’agoniste de EP 3 et 4 Prostaglandin E1 Alcohol (●). Le
pourcentage d’inhibition de l’expression de CD107a+ sur les cellules NK a été calculé pour les différents
traitements en comparaison avec le témoin non traité.
Afin de déterminer l’implication respective des récepteurs EP 2-4 dans l’inhibition des
réponses cytotoxiques des NK induites par les récepteurs CD16, NCR et NKG2D,
l’expression du marqueur CD107a a été analysée sur des NK activés en présence de cibles
P815 et des différents agonistes pour les récepteurs EP1-4. L’agoniste du récepteur EP2
Butaprost était le plus efficace des inhibiteurs testés même si son activité inhibitrice était plus
faible que celle de la PGE2 (Fig 28. B). L’agoniste des récepteurs EP3 et EP4, 1-Hydroxy
113
PGE1 permettait également de diminuer la dégranulation des cellules NK induite par les NCR,
CD16 et NKG2D mais à plus forte concentration que le Butaprost. Etant donné que l’agoniste
des récepteurs EP1 et EP3 Sulprostone n’avait aucun effet sur l’activation des cellules NK
induite par les 3 types de récepteurs activateurs, les effets inhibiteurs de l’1-Hydroxy PGE1
sont dus à l’activation du récepteur EP4. Globalement ces résultats démontrent que, comme
pour les lymphocytes T Vγ9Vδ2 l’inhibition de la cytotoxicité des NK est médiée
principalement par les récepteurs EP2 et EP4.
II. 3 L’activation de la PKA I inhibe l’activation des NK induite par les récepteurs NCR,
CD16 et NKG2D.
La capacité des agonistes des récepteurs EP2 et EP4 à moduler la lyse des cellules NK
induite par les NCR, CD16 et NKG2D suggère que la PGE2 exerce ses effets inhibiteurs en se
fixant sur ces deux types de récepteurs. Comme EP2 et EP4 activent l’adénylate cyclase et
induisent une augmentation de l’AMPc intracellulaire 324, ces données suggèrent que la PGE2
permet de moduler la lyse des cellules NK via l’AMPc.
L’augmentation de l’AMPc intracellulaire conduit à l’activation de la protéine kinase
A de type I (PKA I) et de type II (PKA II), toutes deux constituées de deux sous unités
régulatrices et deux sous unités catalytiques. Chaque sous unité régulatrice comporte deux
sites de fixation pour l’AMPc (RI A et B ou RII A et B). La fixation des molécules d’AMPc
sur les sites de fixation A et B des deux sous-unités régulatrices induit la dissociation de
l’enzyme et la libération des deux sous-unités catalytiques qui vont alors pouvoir
phosphoryler les résidus thréonine ou sérine de leurs substrats protéiques
523
. De nombreux
analogues de l’AMPc qui peuvent se fixer sélectivement sur les sites A et B des sous unités
RI et RII ont été synthétisés. En combinant les différents analogues d’AMPc il est ainsi
possible d’activer sélectivement la PKA de type I ou de type II. Afin de déterminer
l’implication de la PKA I dans l’action de la PGE2 sur les NK, j’ai cherché à déterminer si
l’activation de la PKA I pouvait bloquer la dégranulation des cellules NK induite par les
différents types de récepteurs activateurs. Ainsi, l’expression du marqueur CD107a sur les
cellules NK a été analysée en présence de cibles P815 et d’anticorps anti-NCR, anti-CD16 et
anti-NKG2D et des différents analogues d’AMPc pour les sous unités régulatrices de la PKA
I. L’activation des sous unités RIA et RIIA par la présence de doses saturantes de 6-BenzcAMP (0,5 mM) permettait d’inhiber faiblement la dégranulation des NK induite par les 3
types de récepteurs (Fig. 29). La présence de 8-HA-cAMP (0,5 mM) qui permet d’activer la
sous-unité RI B induisait une diminution de l’activité cytotoxique des NK similaire au
114
composé précédent. Par contre l’activation des sous-unités RIA et RIB par l’utilisation
combinée de ces 2 molécules (0,25 mM 6-Benz-cAMP+ 0,25 mM 8-HA-cAMP) induisait une
forte inhibition de la dégranulation des NK en réponse aux 3 types de récepteurs suggérant
que l’activation spécifique de la PKA I permet de réguler négativement l’activation des
cellules NK indépendamment du type de récepteur activateur.
CD107 + NK cells (%)
80
60
40
20
0
αIgG1
αNCR
αNKG2D
αCD16
Figure 29 : L’activation de la Proteine Kinase A de type I inhibe l’activation des NK induite par les
récepteurs NCR, CD16 et NKG2D. Pourcentage de cellules NK CD107a+ en présence de cibles P815 préincubées avec les anticorps spécifiés et 0,5 mM de 6-Benz-cAMP (noir), 0,5 mM 8-HA-cAMP (gris), 0,25 mM
de 6-Benz-cAMP et 0,25 mM 8-HA-cAMP (hachuré), 0,5 mM de 6-Benz-cAMP et 0,5 mM 8-HA-cAMP (barre
horizontale) (Moyenne et déviation standard calculées à partir 3 expériences indépendantes).
Les données présentées ci-dessus indiquent que l’activation de la PKA I mime les
effets de la PGE2. Récemment plusieurs analogues d’AMPc qui inhibent l’activation des sousunités RI de la PKA I ont été synthétisés. Parmi ceux-ci le RP-8-Br-cAMP permet d’inhiber
les fonctions de la PKA I en empêchant la dissociation des sous unités catalytiques et des sous
unités régulatrices de cette enzyme
524
. Afin de confirmer l’implication la PKA I dans la
modulation de l’activation des NK induite par les récepteurs NCR, CD16 et NKG2D en
présence de PGE2, les cellules NK ont été pré-incubées avec le RP-8-Br-cAMP. Par la suite,
l’expression du marqueur CD107a a été analysé sur les cellules NK en présence des cibles
P815 marqués avec les différents anticorps agonistes avec ou sans PGE2 (100 ng/ml). La
présence de RP-8Br-cAMP (1 mM) permettait de réverser en grande partie l’inhibition de
l’activation des NK médié par la PGE2 pour les trois types de récepteurs testés confirmant que
la PKA I est fortement impliquée dans l’inhibition de l’activation des NK par la PGE2 (Fig
30).
115
Globalement les résultats obtenus démontrent que la PGE2 peut inhiber l’activation des
cellules NK induite par les récepteurs de type NCR, CD16 et NKG2D en induisant
l’activation de la PKA de type I suite à l’augmentation de l’AMPc induit par la fixation de la
PGE2 sur les récepteurs EP2 et EP4.
80
CD107 + NK cells (%)
60
40
20
0
αIgG1
αNCR
αNKG2D αCD16
Figure 30 : L’inhibition de la PKA I réverse les effets de la PGE2. Les cellules NK de donneurs sains ont été
pré-incubées avec 1mM de RP-8Br-cAMP (histogramme blanc et histogramme hachuré) puis la dégranulation de
ces cellules induite par la fixation des anticorps spécifiés sur les cibles P815 a été analysée en présence
(histogramme noir et hachuré) ou en l’absence (histogramme blanc) de 100 ng/ml de PGE2. Les données
présentées sur ce graphique indiquent le pourcentage de cellules NK CD107a+ (Moyenne et déviation standard
calculées à partir de 3 expériences indépendantes). p< 0. 01, p< 0.005 Student T test.
116
PARTIE II
Régulation des réponses immunitaires T
par un nouveau type cellulaire isolé à
partir du stroma de cancers ovariens :
les HOSPICELL
117
Le carcinome épithélial ovarien est le sixième cancer le plus diagnostiqué chez les
femmes et la première cause de décès parmi les cancers d’origine gynécologique dans le
monde 525. Les cancers ovariens ont une importante prédisposition à métastaser dans la cavité
péritonéale et les stades avancés de la maladie sont souvent caractérisés par une dissémination
péritonéale importante, la formation d’ascites et un taux de mortalité élevé à 5 ans
526
. Le
microenvironnement cellulaire joue un rôle important dans l’établissement et le
développement de métastases
527
. Plusieurs études indiquent notamment que les cellules
mésothéliales qui constituent la paroi péritonéale peuvent interagir avec les cellules tumorales
et favoriser la dissémination des carcinomes ovariens dans la cavité péritonéale
528, 529
. Il a
notamment été observé que les cellules mésothéliales isolées de patientes atteintes de
carcinomes ovariens ont un degré de prolifération et une morphologie différente de celles des
sujets non atteints de cancers 530.
Afin d’étudier plus précisément les cellules mésothéliales qui interagissent avec les
cellules tumorales et de comprendre comment celles-ci peuvent favoriser le développement de
métastases, l’équipe du Dr Mirshahi (Institut des Cordeliers, Paris VI) a récemment isolé les
agrégats de cellules cancéreuses ovariennes à partir de ponctions d’ascites de 5 patientes
atteintes de cancer ovarien de stade avancé non traitées précédemment (Fig. 31. A, B). Après
la dissociation de ces agrégats, l’équipe du Dr Mirshahi a isolé par dilution limite les cellules
mésothéliales présentes dans ces agrégats qui interagissaient spécifiquement avec les cellules
tumorales ovariennes (Fig. 31. C et fig. 32). Les cellules mésothéliales ainsi clonées
présentaient une morphologie unique caractérisée par de longs et fins pseudopodes et un
cytosquelette très actif (Fig. 31. D, E, F).
118
Figure 31. Isolation of Hospicell. Tiré de Rafii et al, Plos one, en révision.
A. Cellular aggregates from ascitic fluid of patients with ovarian carcinosis in suspension (x40). B. Cellular
aggregates on culture plates (x40). C. Gradual disaggregation of strongly interacting stromal cells (« Hospicell »)
and cancer cells at 10 days of culture (x20). D. Fluorescence microscopy (actin immunostaining) showing the
“hammock-like” actin cytoskeleton of freshly isolated Hospicell (x60). E.
Lamellipodal formation at the
extremity of the Hospicell containing active actin fibers. F. Details of an hospicell’s fillopode demonstrating
numerous “comb-like” filaments.
Figure 32. Electronic microscopy analysis of ovarian cancer aggregates and primocultures of Hospicell
and OVCAR3. Tiré de Rafii et al, Plos one, en révision.
A. Electron microscopy sections showing EOC cell and Hospicell aggregates displaying numerous interactions
between cancer cells and Hospicell (thick arrow). B. C and D. Details of different interactions : through thin
pseudopods (B and C) or through large membranous contact (D). E. Co-cultures of freshly isolated Hospicell (*)
and ovarian cancer cell line OVCAR3 displaying the network of Hospicell pseudopods enhancing contact with
EOC. F. Cell membrane fusion (arrows) between Hospicell (*) and cancer cells in co-cultures.
L’analyse phénotypique de ces cellules par immunohistochimie indique qu’elles
n’appartiennent à aucun lignage connu (voir Table III). En effet, ces cellules n’expriment pas
les marqueurs spécifiques suivant : la cytokeratine et l’EMA (cellules épithéliales), la
vimentine (cellules mésenchymateuses), CD45 (cellules hématopoïétiques), l’α−smooth
muscle actine (αSMA) (Fibroblastes associés aux tumeurs) et CD31 (cellules endothéliales).
Ces cellules caractérisées par l’expression de CD9, CD10, CD29, CD146 et CD166
119
représentent donc un type cellulaire original, non décrit précédemment. Elles ont été appelées
« Hospicell » 531.
Table III. Molecular characterization of Hospicell. Tiré de Rafii et al, Plos one, en révision.
L’équipe du Dr Mirshahi et plus particulièrement le Dr Rafii ont par la suite pu
confirmer que les cellules tumorales ovariennes interagissaient préférentiellement avec les
Hospicell in vitro et se développaient majoritairement sur le réseau formé par les Hospicell
(Fig. 33. A, B, C).
120
Figure 33. Specific interaction between OVCAR3 cells and Hospicell, Tiré de Rafii et al, Plos one, en
révision.
A. Adhesion of eGFP-OVCAR3 to Hospicell compared to that of fibroblast and HBMEC (Human Bone Marrow
Endothelial Cells). B and C. Hospicell were seeded on matrigel coated culture plates allowing them to form a
network. eGFP-OVCAR3 cells were then added. eGFP-OVCAR3 developped on the Hospicell network.
L’analyse fonctionnelle de l’interaction entre les Hospicell et les cellules tumorales
ovariennes a permis de révéler que les Hospicell confèrent une chimiorésistance aux cellules
cancéreuses ovariennes contre différents agents chimiothérapeutiques couramment utilisés
dans le traitement des cancers de l’ovaire (Fig. 34).
Figure 34. Chemoresistance induced by Hospicell. Tiré de Rafii et al, Plos one, en révision.
Induced chemoresistance when Hospicell co-cultured with OVCAR3 cells overexpressing e-GFP are treated
with 22.2 µM carboplatin and/or 1,4 µM paclitaxel ( *p<0,05). Fibroblasts, HBMEC and OVCAR3 cells were
used as controls.
121
Rafii et ses collaborateurs ont notamment pu démontrer que le transfert des proteines
« Multi Drug Resistance » (MDR) exprimées par les Hospicell vers les cellules tumorales
ovariennes par trogocytose était à l’origine de cette chimioresistance. Par la suite, l’analyse
histopathologique de « Tissu Micro-Array » issus de 29 patientes atteintes de carcinomes
ovariens sur des critères morphologiques et sur la base de l’expression du marqueur CD10 a
démontré la présence de cellules qui présentent des caractéristiques proches des Hospicell
dans les tumeurs ovariennes primaires indiquant que ces cellules ne sont pas seulement
confinées à la cavité péritonéale (Fig. 35. A). De plus, L’étude de la réponse aux traitements
chimiothérapeutiques des patientes analysées indique que la présence d’une densité
importante d’Hospicell dans la tumeur primaire est corrélée à la chimioresistance des
patientes traitées (Fig. 35. B).
Figure 35. Clinical relevance of the presence of Hospicell among ovarian primary tumors. Tiré de Rafii et
al, Plos one, en révision.
Tissue Micro-array were prepared from tumors originating from 29 patients who underwent a neo-adjuvant
chemotherapy. A. Different densities of Hospicell as represented by CD10 staining. Morphological control was
used to rule out the staining of endothelial cells. B. Samples from chemoresistant patients had significantly
higher density of Hospicell compared to chemosensitive patients (*p<0,05). Three different spots were used to
characterize the Hospicell density for each patient.
122
Les résultats obtenus par l’équipe du Dr Mirshahi indiquent donc que les Hospicell
sont en étroite interaction avec les cellules tumorales ovariennes à la fois dans la cavité
péritonéale mais également dans la tumeur primaire où ces cellules participent à la
chimioresistance des cellules tumorales. Il a récemment été démontré que le système
immunitaire, et notamment les lymphocytes T CD4+ et CD8+, contribuent de manière
importante à la destruction des tumeurs par divers agents chimiothérapeutiques
89
.
Malheureusement, de nombreuses études suggèrent également que les tumeurs échappent à la
destruction par les cellules immunitaires en favorisant le recrutement dans leur
microenvironnement de nombreux types cellulaires aux propriétés immunosuppressives
comme les cellules T régulatrices, les cellules myéloïdes suppressives, les cellules
dendritiques tolérogènes et les macrophages alternatifs
532
. Zhang et al, ont récemment
démontré que le ciblage de cellules du microenvironnement tumoral qui bloquent les réponses
immunitaires permettait de restaurer les réponses immunitaires contre les tumeurs. Ces
résultats démontrent la nécessité d’identifier les cellules du stroma tumoral qui peuvent
bloquer les réponses immunitaires antitumorales 533.
Ainsi, j’ai cherché à analyser les propriétés immunomodulatrices des Hospicell
précédemment isolées par l’équipe du Dr Mirshahi afin de déterminer si ces cellules qui
interagissent directement avec les cellules tumorales ovariennes pouvaient aider les cancers
ovariens à échapper aux réponses immunitaires.
123
124
Hospicells derived from ovarian cancer stroma inhibit T cell immune
responses
Running title: T cell inhibition by Hospicells
Ludovic Martinet*1, Peshman Mirshahi†, Rémy Poupot*, Arash Rafii†, Jean-Jacques
Fournié*, Masoud Mirshahi† and Mary Poupot*
From *INSERM, U.563, Centre de Physiopathologie de Toulouse-Purpan, Toulouse, F-31300
France and Université Paul-Sabatier, Toulouse, F-31400 France; †UMRS 872 INSERM,
Université Pierre et Marie Curie-Paris 6 and Université Paris Descartes, Equipe 18, Centre de
recherche des cordeliers, 15 rue de l’école de médecine, 75270 Paris cedex 06, France.
Key Words: T Cells ● Ovarian carcinoma ● Immune regulation ● Tumor microenvironment
1
Address correspondence to Ludovic.Martinet, INSERM 563 Centre de Physiopathologie de
+
Toulouse-Purpan, CHU Purpan, BP3048, 31024 Toulouse Cedex, France. Telephone: 33+
562-748368; Fax: 33-562-744558; e-mail: [email protected]
2
Abbreviations used in this paper:
Abstract
Ovarian cancer is the fifth leading cause of women cancer death and the most lethal
gynecological malignancy in the world. The lethality of ovarian cancer is primarily
attributable to the advanced stage of the disease at the time of initial diagnosis.
Approximately 70% of patients present disease that has spread beyond the ovaries. Several
studies suggest that ovarian carcinomas can be recognized and attacked by the immune
system. Therefore, malignant ovarian cells must evade the immune system in order to develop
metastasis in distant locations. Recently, we described an original type of stromal cells
isolated from ascitis of patients with ovarian carcinosis that strongly interacts with epithelial
ovarian cancer cell. These cells, characterized by positive immuno-staining for CD9, CD10,
CD29, CD146 and CD166, were referred to as “Hospicells”. In this study, we describe the
ability of Hospicells to inhibit in vitro CD4+, CD8+ and Vγ9Vδ2 T cell immune responses
including proliferation and cytokine production through a mechanism independent of a cellto-cell contact involving IDO by-products and a yet unknown supplemental soluble mediator.
We suggest that the immunosuppressive properties of Hospicells could provide a favorable
microenvironment to the ovarian cancer cells emigrating in the peritoneal cavity allowing the
re-establishment of malignant growth.
2
Introduction
Since the introduction of the cancer immunosurveillance hypothesis by Thomas and
Burnett, many experiments illustrated the ability of the immune system to protect the host
from cancer development (reviewed in (1)). The discovery of a wide array of tumor associated
antigen (TAA) specific for T cells (2, 3), together with experiments of tumorigenesis
conducted in mouse defective for different immune components, demonstrated that adaptive
+
+
immunity based on CD4 and CD8 T cells plays a critical role in cancer eradication (4, 5).
+
Indeed, CD8 T lymphocytes specific for TAA are frequently found in the blood and in the
lesions of cancer patients and recognize and kill TAA expressing cancer cells both in vitro
and in vivo (3, 6-8).
Despite the ability of the immune system to infiltrate and kill tumor cells, the
spontaneous clearance of established tumors by endogenous immune mechanisms is rare. In
addition, even if vaccines induce an increase of the number of T cells specific for TAA, this
does not always result in tumor regression (8). Indeed, tumors have the ability to escape
immune destruction by the activation of a plethora of immunosuppressive mechanisms
including impairment in antigen presentation, activation of negative co-stimulatory signals
and synthesis of immunosuppressive factors (9). Tumors also foster a tolerant
microenvironment through the specific recruitment of cells with immunoregulatory properties
(10). Regulatory T cells (11), myeloid derived suppressor cells (12), tolerogenic dendritic
cells (13) and alternative macrophages (14) have all been found to accumulate in the stroma
of human tumors and to counteract effective antitumor immune responses. Zhang et al,
recently demonstrated that targeting the tumor microenvironment can restore host immune
responses against cancer cells (15). This highlights the importance of identifying cells within
the tumor stroma which interfere with the immune responses against cancer.
3
Recently, we described an original type of stromal cells isolated from ascitis of
patients with ovarian carcinosis. These cells, referred to as “Hospicells”, strongly interact
with epithelial ovarian cancer cells; they are from mesothelial origin, they display a
fibroblastic like morphology and are characterized by positive immuno-staining for CD9,
CD10, CD29, CD146, and CD166 (16). Moreover, they don’t express cell surface markers for
specific lineages such as cytokeratin and EMA (epithelial cell marker), vimentin
(mesenchymal cell marker), CD45 (hematopoietic cell marker) or α−smooth muscle actin
(αSMA) (cell marker of tumor associated fibroblasts). Functional analysis of Hospicells
revealed that these cells can confer chemoresistance to ovarian cancer cells thanks to the
transfer of Multi Drug Resistance (MDR) protein by trogocytosis. Presence of Hospicells on
ovarian cancer tissue microarray from patients with neoadjuvant chemotherapy was
significantly associated to chemoresistance, suggesting that Hospicells represent an important
cell type of the ovarian carcinoma microenvironment and may favor tumor development. The
strong association between Hospicells and cancer cells in the ovarian tumor stroma raises the
question whether Hospicells interfere with the responses of T lymphocytes and contribute to
immune escape of ovarian cancer cells.
In this study, we describe the ability of Hospicells to inhibit in vitro CD4+, CD8+ and
Vγ9Vδ2 T cell immune responses including proliferation and cytokine production through a
mechanism independent of a cell-to-cell contact.
4
Results
Hospicells inhibit CD4+ T cell proliferation.
We first examined the direct effect of Hospicell isolated from ascitis of patients with ovarian
carcinosis on CD4+ T cell proliferation. CD4+ T cells freshly purified from healthy donors
were co-cultured with immortalized Hospicells at cell ratios Hospicell/CD4+ T cells ranging
from 1/50 to 1/2. During these co-cultures, CD4+ T cells were kept unstimulated or were
activated by anti-CD3/anti-CD28 mAbs coated on macrobeads. The proliferation of activated
CD4+ T cells was measured by CFSE dilution. Hospicells inhibited the proliferation of
+
+
activated CD4 T cells in a dose-dependent manner (Fig. 1A). Division of CD4 T cells was
+
significantly inhibited by the presence of only 1 Hospicell for 10 CD4 T cells in the culture
(p < 0.01) (Fig. 1B). Immortalized Hospicells also decreased significantly the proliferation of
+
CD4 T cells induced by allogeneic DC activated by LPS (Fig. 1C). It is noteworthy that
Hospicells could not directly generate allogeneic reaction by CD4+ T cells (Fig. 1A, C) since
they do not express MHC class II molecules (supplementary figure 1). We verified that the
inhibition of TCR-induced proliferation of CD4+ T cells was not the consequence of an
excessive proliferation of immortalized Hospicells since it also occurred with irradiated
Hospicells (supplementary figure 2). Moreover, analysis of the kinetic of proliferation of
CD4+ T cells induced by TCR activation indicates that inhibition by Hospicells occurs very
early in the proliferation process, as soon as the first division (supplementary figure 3).
+
Finally, double staining of CD4 T cells with CFSE and IP revealed that the percentage of
+
apoptotic CD4 T lymphocytes in co-cultures with immortalized Hospicells (either with or
without stimulation of CD4+ T cells) was not increased even with high numbers of
immortalized Hospicells (Fig.1D-F). Thus, Hospicells inhibited the TCR-induced
+
proliferation of CD4 T cells without increasing cell death.
5
Hospicells inhibit TCR-induced production of cytokines by CD4+ T cells.
+
Many reports indicate that secretion of IFNγ by activated Th1 polarized CD4 T cell is crucial
for tumor rejection in vivo (17). Thus, we wondered whether Hospicells interfere with the
+
production of IFNγ induced by TCR re-stimulation of CD4 T cell blasts. Blasts were
generated from freshly purified CD4+ T cells stimulated with anti-CD3/anti-CD28 mAbs for
several days in presence of exogenous IL-2. These cells do not produce cytokines unless they
are re-stimulated through TCR activation. When added to the culture, immortalized
+
Hospicells strongly inhibited intracellular production of IFN-γ by CD4 T cell blasts induced
+
by TCR re-stimulation (Fig. 2A). The levels of IFNγ detected in the supernatants of CD4 T
cell blast cultures were also significantly decreased in the presence of immortalized
Hospicells (Fig. 2B). After re-stimulation, CD4+ T cell blasts also produce Th2 cytokines such
as IL-4 and IL-10. The production of these cytokines detected in the supernatants of CD4+ T
cell blasts cultures was also significantly reduced in presence of immortalized Hospicells
(Fig. 2C). Thus, Hospicells interfere with the production of both Th1 and Th2 cytokines
induced by TCR activation.
Inhibition of CD4+ T cell proliferation by Hospicells is cell-to-cell contact independent and
reversible.
+
+
To determine how Hospicells inhibited CD4 T cell responses, CD4 T cell/ immortalized
Hospicells co-cultures were repeated using the TranswellTM technology. Immortalized
Hospicells were plated in the lower compartment of the TranswellTM device, and in this
+
setting they still inhibited significantly the TCR-induced proliferation of CD4 T cells (Fig.
6
3A,B). This indicates that the inhibition of proliferation of CD4+ T cells by Hospicells is not
dependent on a cell-to-cell contact but is rather mediated by soluble factors.
It is known that insufficient level of costimulation or presence of inhibitory factors during
+
activation of the TCR can lead to a state of profound anergy in CD4 T cell characterised by
the inability of these cells to proliferate after TCR re-stimulation (18, 19). The physical
+
separation between CD4 T cells and Hospicells in the TranswellTM system allowed us to
remove Hospicells from the experiments after 6 days of co-culture and to investigate the
+
ability of CD4 T cells to proliferate when they were restimulated by anti-CD3/anti-CD28
beads. Our results indicate that after inhibition by Hospicells, CD4
+
T cells can still
proliferate after TCR restimulation once Hospicells have been removed (Fig.4). Thus,
inhibition of CD4+ T cells by Hospicells does not induce anergy of the former and is
reversible.
A mechanism for inhibition of the proliferation of CD4+ T cells by Hospicells.
+
Since the proliferation of TCR-activated CD4 T cells relies mainly on the ability of these
cells to produce and respond to IL-2, we analyzed the expression of the high affinity receptor
for IL-2 (CD25) on CD4+ T cells after activation by anti-CD3/anti-CD28 beads, in the
absence or in the presence of immortalized Hospicells. We observed no significant difference
in the expression of CD25 (Fig. 5A) indicating that the inhibition of CD4+ T cell proliferation
is not the consequence of a reduced ability to bind IL-2. We then compared the secretion of
IL-2 by freshly purified CD4+ T cells after activation of the TCR, in the absence or in the
presence of immortalized Hospicells. Fig. 5B shows that the production of secreted IL-2 is
significantly decreased in the presence of Hospicells. Nevertheless, the reduction of IL-2
secretion does not seem to account for the inhibition of CD4+ T cell proliferation mediated by
Hospicells since high doses of exogenous IL-2 did not reverse the inhibition (Fig. 5C).
7
Moreover, it is noteworthy that the reduction of IL-2 secretion mediated by Hospicells was
statistically effective at a cell ratio of 1 Hospicell for 5 CD4+ T cells whereas the inhibition of
proliferation occurred at a lower cell ratio of 1 Hospicell for 10 CD4+ T cells (Fig. 1B).
Several immunosuppressive factors (such as TGF-β, IL-10, PGE2, nitric oxide (NO),
tryptophan catabolism by IDO) produced by tumors or cells from their microenvironment
have been described for their potential to inhibit antitumor responses of CD4+ T cells (9). In a
trial designed to identify the soluble mediator responsible for immunosuppression mediated
by Hospicells, we analyzed the inhibitory effects of immortalized Hospicells towards the
+
proliferation of TCR-activated CD4 T cells in the presence of different specific inhibitors.
We used mAbs against TGF-β or IL-10, and chemical inhibitors of either COX
(indomethacin), iNO-synthase (L-NAME) and IDO (1-MT) enzyme activities. Only 1-MT at
the concentration of 1mM can partially reverse the inhibitory effect of Hospicells (Fig. 5D).
This indicates that by-products of tryptophan catabolism by IDO may be responsible for the
immunosuppressive properties of Hospicells, together with a yet unknown supplemental
mediator.
Hospicells inhibit immune responses of cytotoxic effectors.
+
CD8 T cells are cytotoxic effectors which frequently infiltrate ovary carcinoma tumors and
this infiltration is associated with a favourable prognostic (20). Immortalized Hospicells
express MHC class I molecules (supplementary figure 1) and may be identified as allogeneic
+
targets by purified CD8 T cells from healthy donors. First, we sought after a cytotoxic
+
potential of polyclonal CD8 T cell blasts against Hospicells.
We used the CD107a
degranulation assay (21) which revealed that allogeneic immortalized Hospicells are not
recognized by activated CD8+ T cells (Data not shown). We neither detected over-expression
of activation markers such as CD69 and CD25 on resting CD8+ T cells in the presence of
8
immortalized Hospicells (supplementary figure 4). Thus, we didn’t observe any allogeneic
+
recognition of Hospicells by CD8 T cells in vitro.
We chose the same experimental setting which we used for CD4+ T cells to detect the direct
effect of Hospicells on CD8+ T cell proliferation. Analysis of the CFSE dilution as a measure
+
of the proliferation of freshly purified CD8 T cells activated by anti-CD3/anti-CD8 in the
presence of increasing numbers of immortalized Hospicells by CFSE dilution assay indicates
+
that Hospicells are potent inhibitors of the proliferation of TCR-activated CD8 T cells (Fig.
6A). In order to determine if Hospicells could also interfere with the acquisition of effector
+
functions by CD8 T cells, we analyzed intracellular production of IFNγ induced by PHA re+
stimulation in CD8 T cells co-cultured for 1 week with anti-CD3/anti-CD8 mAbs and
increasing numbers of immortalized Hospicells. We observed a dose dependant decrease of
+
the rate of CD8 T cells which produce intracellular IFNγ in the presence of Hospicells. Thus,
Hospicells not only suppress CD8+ T cell proliferation but also inhibit the ability of the latter
to differentiate into effector cells (Fig. 6B).
T lymphocytes of the unconventional T γδ subset are also cytotoxic effectors against tumors
that contribute to immune surveillance of cancer (22). In this context, Vγ9Vδ2 T lymphocytes
are of particular interest since they can be activated by small non-peptide ligands produced by
tumor cells (23, 24). We thus examined the effect of Hospicells towards Vγ9Vδ2 T cells.
Figure 6 C indicates that proliferation of freshly purified Vγ9Vδ2 T cells activated by BrHPP
and IL-2 are severely decreased by the presence of increasing numbers of immortalized
Hospicells. Because BrHPP-activated Vγ9Vδ2 T cells produce the pro-inflammatory
cytokines IFN-γ, we analyzed the effect of Hospicell on this production. When added to
Vγ9Vδ2 T cell lines at 1/10 and 1/5 cell ratios, immortalized Hospicells strongly inhibited the
production of IFN-γ as shown by intracellular staining of Vγ9Vδ2 T cells (Fig. 6. D).
9
Altogether, these data indicate that Hospicells inhibit the phosphoantigen-induced Vγ9Vδ2 T
cell biological responses.
Discussion
Recently, we described the isolation of an original type of stromal cells from ascitis of
patients with ovarian carcinosis that strongly interacts with epithelial ovarian cancer cells
(16). These mesothelial cells referred to as “Hospicells” are able to confer chemoresistance to
ovarian cancer cells through the transfer of Multi Drug Resistance (MDR) protein by
trogocytosis. In the current study, we demonstrate using immortalized Hospicells that these
cells also display strong immunosuppressive properties against CD4+, CD8+ and Vγ9Vδ2 T
cells independently of a cell-to-cell contact.
Activated CD4+ T cells, through their ability to drive CTL expansion and to produce
Th1 and Th2 cytokines that activate eosinophils as well as macrophages, play a central role in
the antitumor immune response (25). Due to their ability to prevent proliferation and
production of Th1 and Th2 cytokines by CD4+ T lymphocytes, Hospicells might block
antitumor functions of these cells and favour tumor immune escape. We show that Hospicells
can also interfere with TCR-induced effector functions of CD8+ and Vγ9Vδ2 T cells in vitro.
Future experiments will have to address if Hospicells that reside in close proximity to cancer
cells in the peritoneal cavity can prevent killing of TAA or phosphoantigen expressing cancer
cells by these cytotoxic T lymphocytes in vivo.
We afford data indicating that IDO may be responsible for a part of the
immunosuppressive properties of Hospicells, together with a yet unknown supplemental
soluble mediator. Several mechanisms can account for IDO-mediated immunosuppression of
T cell responses. Among them, cellular stress imposed by local depletion of tryptophan by
10
IDO and accumulation of tryptophan-derived catabolites such as L-kynurénine have been
shown to alter the proliferation of T lymphocytes (26). Further experiments have to be
conducted in order to determine which of these mechanisms are involved in the inhibition of
T cell responses by Hospicells. IDO expression has been detected in various human tumors by
immunohistochemistry (27) and has been shown to correlate with a poor clinical prognosis in
ovarian carcinoma (28). Moreover, Uyttenhove et al. have demonstrated that mouse tumor
cells transfected with IDO became resistant to rejection by the immune system, even in mice
pre-immunized against the tumor (27). On the basis of mouse models, it is reasonable to
speculate that IDO expression by host stromal cells such as Hospicells could create an
immunosuppressive microenvironment in the tumor.
+
In our experiments, CD4 T cells could still proliferate after TCR restimulation once
Hospicells had been removed, demonstrating that inhibition of CD4+ T cells by Hospicells
does not induce anergy and is reversible. Several reports indicate that immunosuppressive
factors derived from tumor stroma such as PGE2, TGF-β or by-products of IDO promote the
conversion of effector CD4+ T cells into FOXP3+ regulatory T cells (29-31). Since
CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells have been found to accumulate in the ascites of
ovarian carcinoma, it should be interesting to analyse the phenotype and the functions of
CD4+ T cells after co-culture with Hospicells.
Ovarian cancer is the fifth leading cause of women cancer death and the most lethal
gynecological malignancy in the world (32). The lethality of ovarian cancer is primarily
attributable to the advanced stage of the disease at the time of initial diagnosis.
Approximately 70% of patients present disease that has spread beyond the ovaries. Tumor
metastasis is a complex biological process at the cellular level, involving regulation of cell
motility, invasion, survival, and proliferation. Several studies suggest that ovarian carcinomas
can be recognized and attacked by the immune system. Indeed, tumor-specific T cells were
11
recently detected in peripheral blood of 50% of patients with advanced ovarian carcinoma and
tumor infiltrating lymphocytes are associated with favorable prognosis in ovarian cancer (20,
33). Therefore, malignant ovarian cells must evade the immune system in order to develop
metastasis in distant locations. The ability of Hospicells to inhibit expansion and effector
functions of T lymphocytes could provide a favorable microenvironment to the ovarian cancer
cells emigrating in the peritoneal cavity allowing thereby the re-establishment of malignant
growth. In the late nineteenth century, the observation of 735 breast cancers by Paget et al.
led to the “seed and soil” hypothesis stating that tumor cells (seeds) preferentially metastasize
to discrete locations (soils) where organ specific microenvironment provides optimal growth
conditions for specific circulating cell types (34). There are many evidences indicating that
preferential invasion of the peritoneum by ovarian caner is not only due to anatomic
proximity but also to an array of molecular signals secreted by cancer cells and stromal cells
predisposing the peritoneum to invasion (35 , 36). Since the most important partners of cancer
cells in the peritoneum are mesothelial cells of the peritoneal surface, immunosuppressive
properties of Hospicells might also contribute to the preferential invasion of the peritoneum.
Despite advances in the cytotoxic therapies, only 30% of patients with advanced-stage
ovarian cancer survive 5 years after initial diagnosis (37). Recently, we demonstrated that the
density of Hospicells infiltrating the primary tumor of ovarian carcinoma detected by CD10
immuno-staining on tissue microarray was correlated with the chemoresistance of patients in
response to neo-adjuvant chemotherapy (16). Indeed, Hospicells were shown to induce
chemoresistance of ovarian tumor cells in vitro through the transfer of MDR proteins by
trogocytosis. It was recently demonstrated that the adaptive immune system and particularly
CD4+ and CD8+ T cells account for a part of the chemotherapeutic response (38). Given the
strong immunosuppressive properties of Hospicells towards T lymphocytes in vitro, the
12
inhibition of immune response by Hospicells infiltrating ovarian tumors and tumor ascites
could also contribute to the chemo-resistance of these patients to neo-adjuvant chemotherapy.
Hospicells represent a new subset of stromal cells that does not express any of the common
markers for other cell types. The cell surface markers CD9, CD10, CD29, CD105, CD146 and
CD166 expressed by Hospicells have already been described as part of the complex
phenotype of the mesenchymal stem cells and particularly of the adipose tissue derived
stromal cells (ADSC) (39). The ability of Hospicells to exert immunosuppressive properties
like MSC and ADSC raises the question whether these cell types are closely related.
Nevertheless, Hospicells do not express other markers classically expressed by MSC and
ADSC like vimentin, CD73, CD90 and CD106, suggesting that these cells represent a distinct
cell type. Several reports indicate that MSC can be actively recruited to the stroma of
developing tumors of several types including glioma (40), breast carcinoma (41) and ovarian
carcinoma (42). A recent study indicates that MSC can differentiate into carcinoma associated
fibroblasts under the influence of tumor derived factors (43). Future experiments will have to
determine if Hospicells may originate from mesenchymal stem cells of the tumor stroma.
In conclusion, due to their ability to confer both chemo-resistance through trogocytosis and to
prevent T cell activation, Hospicells may represent an interesting target in order to improve
chemotherapy or immunotherapeutic protocols.
13
Materials and Methods
Reagents.
CFSE, PHA, Indomethacin, 1-methyl-DL-tryptophan (1-MT), N-nitro-L-arginine methyl ester
(L-NAME) were obtained from Sigma-Aldrich (Saint-Louis, MO). Purified mAbs against
TGF-β (clone AF-101) and IL-10 (clone 25209) were obtained from R&D Systems
(Minneapolis, MN). Iodide propidium (IP) and fluorochrome-conjugated mAbs: antiTCRVγ9−PE, anti-IFN-γ−PE, anti-HLA-DR−FITC, anti-HLA-ABC−PE-Cy5, anti-CD1a−PE,
anti-CD11b−PE-Cy7,
anti-CD11c−PE,
anti-CD14−PE-Cy7,
anti-CD25−PE-Cy7,
anti-
CD73−PE, anti-CD86−PE and anti-CD107a−PE-Cy5 were purchased from BD Bioscience
(San Jose, CA). Fluorochrome-conjugated mAbs: anti-TCRVγ9−FITC, anti-CD3−FITC, antiCD3−PE-Cy7, anti-CD4−PE-Cy5, anti-CD8−PE-Cy7, anti-CD34−FITC, anti-CD45−PE-Cy7,
anti-CD69−PE-Cy5 and anti-CD80−PE-Cy5 were purchased from Beckman-Coulter
(Fullerton, CA). Fluorochrome-conjugated mAbs: anti-CD3−Pacific Blue, anti-CD29−AF647,
anti-CD31−AF647,
anti-CD90−PE-Cy5,
anti-CD105−FITC,
anti-CD106−PE,
anti-
CD146−PE-Cy5 and anti-CD166−PE were purchased from Biolegend (San Diego, CA).
Recombinant human GM-CSF and IL-4 were purchased from Peprotech (Rocky Hill, NJ). IL2 was kindly provided by Sanofi-Aventis (Labège, France). Synthetic phosphoantigen
bromohydrin pyrophosphate (BrHPP) was kindly provided by Innate-Pharma (Marseilles,
France).
Isolation and culture of human Hospicells.
Hospicells were isolated as previously described (16) from 5 ascitis of non-previously treated
patients with stage III ovarian cancer undergoing ascitis evacuation for clinical discomfort
following routine protocols approved by the IRB of the hospital Hôtel-Dieu, Paris. As ascitis
evacuation is part of the routine management of patients in the medical oncology department
14
of Hôtel-Dieu only oral consent was obtained from the patients. Demographic characteristics
of these patients are described in supplementary Table I. Briefly, ascitis were centrifuged at
800 rpm for 1 minute. Lymphocytes and erythrocytes were separated from cancer cell
aggregates using density gradient procedure (Ficoll-Hypaque, Amersham, upsalla, Sweden).
The aggregates were separated using trypsin. Using serial dilution and enrichment, Hospicells
interacting specifically with the ovarian cancer cells were isolated and grown at 37°C in 5%
CO2 in RPMI medium supplemented with 10% FCS (Invitrogen, San Diego, CA) and 2mM
L-glutamine (Cambrex Bioscience, Verviers, Belgium).
Hospicell characterisation, performed by immunohistochemistry using the following
antibodies directed against cytokeratine (clone KL1) and vimentin (clone V9) from BeckmanCoulter (Marseilles, France); CD45 (clones 2b11 or PD7/26), CD20 (clone L26), CD68
(clones KP1 or PG-M1), CD34 (clone Obend10), Protein S100 (polyclonal antibody),
myeloperoxidase (polyclonal antibody), CD166 (polyclonal antibody) and CD146 (polyclonal
antibody) from Dako (Glostrup, Denmark), CD10 (clone 56C6) from Novocastra (Newcastle,
UK) and CD3 (clone SP7) from Neomarkers (Lab Vision, Fremont, CA), has been described
previously (16).
Immortalization of Hospicells.
Immortalization of ovarian carcinoma derived Hospicells with SV40 large T antigen has been
performed in the laboratory « Thérapie Génique et d'Amplification de Vecteurs, Inserm U649,
Hôtel Dieu, Nantes ». Briefly, Hospicells primary cultures isolated from five different ovarian
carcinoma patients were infected with LT-expressing retroviral vector containing supernatants
in the presence of polybrene. Then SV40 large T antigen expressing Hospicells were selected
in medium containing 500 µg/ml neomycin. Immortalized Hospicell line were grown at 37°C
in 5% CO2 in RPMI medium supplemented with 5 % FCS (Invitrogen, San Diego, CA), 2mM
15
L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin (Cambrex Bioscience,
Verviers, Belgium) until they were used. Intra-peritoneal and subcutaneous injection of
immortalized Hospicells in SCID/beige mice did not generate tumors demonstrating that these
cells have not been transformed by retroviral transfection. Immortalized Hospicells kept their
ability to interact specifically with ovarian tumor cells. Phenotype of Immortalized Hospicell
was analysed by flow cytometry. Consistent with primary Hospicells phenotype(16), they
were all CD11b+, CD29+, CD105+, CD146+, CD166+, HLA-I+, CD14-, CD31-, CD34-, CD45-,
CD73-, CD80-, CD86-, CD90- and CD106- (supplementary figure 1).
T cell isolation and culture.
PBMCs were isolated from fresh blood samples using Leucosep™ tubes (Greiner Bio-one,
Frickenhausen, Germany). Then, they were cultured in complete RPMI 1640 medium, i.e.
supplemented with 10% FCS (Invitrogen), 1mM sodium pyruvate (Life Technologies,
Paisley, UK), 2mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin (Cambrex
Bioscience) until they were used.
+
+
Purified CD4 T cells or CD8 T cells (purity > 95 %) were isolated from freshly isolated
PBMCs by magnetically activated cell sorting using “CD4 Macrobeads” or “CD8
Macrobeads” kits (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) accordingly to the manufacturer’s
+
instructions. Polyclonal expanded CD4 and CD8+ T cell blasts were generated using “antiCD3/anti-CD28 T cell expander kit” DynabeadsTM (Invitrogen) accordingly to the
+
+
manufacturer’s instructions. Briefly, purified CD4 T cells or CD8 T cells were cultured in
complete RPMI 1640 medium supplemented with 100 U/ml of IL-2 and anti-CD3/anti-CD28
beads for 2 weeks.
Purified γδ T cells were obtained from freshly isolated PBMCs using magnetically activated
cell sorting (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Briefly, PBMCs were stained with haptened anti-
16
TCRγδ mAb (against the Vδ1, Vδ2 and Vδ3 subsets), followed by anti-hapten FITCconjugated micro-beads. The purity of the selected γδ T cells was always ≥ 90% (with more
than 80% Vγ9Vδ2 T cells), as checked by flow cytometry. Primary Vγ9Vδ2 T cell lines were
generated by stimulating PBMCs once with phosphoantigen (200 nM of BrHPP, InnatePharma, Marseilles, France) in the continuous presence of 300 U/ml of IL-2 (Sanofi-Aventis,
Labège, France) as previously described (44). After 2 weeks of culture, Vγ9Vδ2 T cell lines
comprised more than 95% TCR Vγ9Vδ2 T cells.
Dendritic cells generation.
Dendritic cells (DC) were obtained from adherent PBMCs cultured in 6-well plates at 3x106
cells/ml for 7 days in fresh complete RPMI 1640 medium supplemented with GM-CSF (100
ng/ml) and IL-4 (50 ng/ml). Then, maturation of DC was induced with LPS (2 µg/ml, Sigma)
for one day before they were used. Phenotype and purity of mature DC was evaluated by flow
cytometry. They were for 90% of them CD1a+, CD11c+, CD14-, CD86high and MHC-II+.
Proliferation assays.
+
Freshly purified CD4 or CD8+ T cells were labelled with 1.5 µM CFSE for 10 min at 37°C.
Freshly purified γδ T cells were labelled with 1 µM CFSE in serum free PBS for 10 min at
37°C. After 2 washes, 3x105 CFSE-labelled cells were cultured in 96-well plates with or
without increasing numbers of immortalized Hospicells. For TranswellTM cultures, 3x105
immortalized Hospicells were seeded in the lower chamber of a 0.4 µm pore-sized membrane
+
TranswellTM plate (BD Bioscience) and 1x106 CFSE-labelled CD4 T cells were added in the
upper chamber of the TranswellTM. After 6 days of culture in the presence of anti-CD3/antiCD28 beads (1 bead for 5 T cells) or allogeneic DC (1 DC for 5 T cells), CFSE dilution and
IP staining in CD4+ T cells were evaluated by flow cytometry analysis. Proliferation of CD8+
17
or γδ T cells was evaluated after 6 days of culture in the presence of anti-CD3/anti-CD28
beads (1 bead for 5 T cells) and 300 U/ml of IL-2 with 200nM BrHPP respectively. When
specified, indomethacin (1 and 5 µM), 1-MT (1mM), L-NAME (0.5 and 1mM), anti-TGF-β
or anti-IL-10 mAbs (all at 10 µg/ml), or exogenous IL-2 (1000 U/ml) were added at the
beginning of the culture.
Cytokine production.
+
5x105 CD4 T cell blasts or Vγ9Vδ2 T cells were stimulated by anti-CD3/anti-CD28 beads (1
bead for 5 T cells) and 200nM BrHPP respectively with increasing numbers of immortalized
Hospicells in 48-well plates for 24 hr. Intracellular IFNγ labelling was performed by adding
10 µM Brefeldin A (Sigma-Aldrich) for the last 5 h of the culture. Briefly, cells fixed with
PBS 2% paraformaldehyde and stained for 30 min in PBS 1% saponin with PE-conjugated
anti IFN-γ mAb were analyzed by flow cytometry. Intracellular IFNγ production in CFSE+
labelled CD8 T cells cultured for 6 days with immortalized Hospicells in the presence of
anti-CD3/anti-CD28 beads was measured as described above following re-stimulation with
PHA (10µg/ml) in the presence of Brefeldin A (10 µM) for 5 hrs.
+
+
5x105 freshly purified CD4 T cells or CD4 T cell blasts were stimulated by anti-CD3/antiCD28 beads (1 bead for 5 T cells) with increasing numbers of immortalized Hospicells in 48well plates for 72 hr. Culture supernatants were harvested and filtered with a 0.25 µm poresized filter and IL-2, IL-4, IL-10 and IFNγ levels were assessed by flow cytometry using
“CBA beads Th1/ Th2” kit (BD Bioscience) accordingly to the manufacturer’s instructions.
18
Statistical analysis.
Significant differences were assessed by Student’s t-test with the SigmaStat software (Systat
Software Inc., San Jose, CA).
Acknowledgements
This work is supported by institutional grants from the “Institut National de la Santé et de la
Recherche Médicale” (INSERM) and “université Paul Sabatier”. Specific fundings were
obtained from the “Association pour la Recherche sur le Cancer” (ARC) and the “Institut
National du Cancer” (INCa), contract # 07/3D1616/IABC-23-8/NC-NG.
Conflict of interest
The authors do not report any conflict of interest.
19
References:
1.
Dunn GP, Old LJ, Schreiber RD. The immunobiology of cancer immunosurveillance
and immunoediting. Immunity 2004;21(2):137-48.
2.
van der Bruggen P, Traversari C, Chomez P, et al. A gene encoding an antigen
recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Science (New York, NY
1991;254(5038):1643-7.
3.
Traversari C, van der Bruggen P, Luescher IF, et al. A nonapeptide encoded by human
gene MAGE-1 is recognized on HLA-A1 by cytolytic T lymphocytes directed against tumor
antigen MZ2-E. The Journal of experimental medicine 1992;176(5):1453-7.
4.
Koebel CM, Vermi W, Swann JB, et al. Adaptive immunity maintains occult cancer in
an equilibrium state. Nature 2007;450(7171):903-7.
5.
Smyth MJ, Dunn GP, Schreiber RD. Cancer immunosurveillance and immunoediting:
the roles of immunity in suppressing tumor development and shaping tumor immunogenicity.
Advances in immunology 2006;90:1-50.
6.
Sharma P, Shen Y, Wen S, et al. CD8 tumor-infiltrating lymphocytes are predictive of
survival in muscle-invasive urothelial carcinoma. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America 2007;104(10):3967-72.
7.
Wang RF, Robbins PF, Kawakami Y, Kang XQ, Rosenberg SA. Identification of a
gene encoding a melanoma tumor antigen recognized by HLA-A31-restricted tumorinfiltrating lymphocytes. The Journal of experimental medicine 1995;181(2):799-804.
8.
Nestle FO, Alijagic S, Gilliet M, et al. Vaccination of melanoma patients with peptideor tumor lysate-pulsed dendritic cells. Nature medicine 1998;4(3):328-32.
9.
Rabinovich GA, Gabrilovich D, Sotomayor EM. Immunosuppressive strategies that
are mediated by tumor cells. Annual review of immunology 2007;25:267-96.
10.
Zou W. Immunosuppressive networks in the tumour environment and their therapeutic
relevance. Nature reviews 2005;5(4):263-74.
11.
Zou W. Regulatory T cells, tumour immunity and immunotherapy. Nat Rev Immunol
2006;6(4):295-307.
12.
Serafini P, Borrello I, Bronte V. Myeloid suppressor cells in cancer: recruitment,
phenotype, properties, and mechanisms of immune suppression. Seminars in cancer biology
2006;16(1):53-65.
13.
Gabrilovich D. Mechanisms and functional significance of tumour-induced dendriticcell defects. Nat Rev Immunol 2004;4(12):941-52.
14.
Pollard JW. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and
metastasis. Nature reviews 2004;4(1):71-8.
15.
Zhang B, Zhang Y, Bowerman NA, et al. Equilibrium between host and cancer caused
by effector T cells killing tumor stroma. Cancer research 2008;68(5):1563-71.
16.
Rafii. AJ, Mirshahi P, Poupot M, et al. Oncologic Trogocytosis of an Original Stromal
Cells Induces Chemoresistance of Ovarian Tumours. PLoS ONE 2008;under Review.
17.
Blankenstein T, Qin Z. The role of IFN-gamma in tumor transplantation immunity and
inhibition of chemical carcinogenesis. Current opinion in immunology 2003;15(2):148-54.
18.
Linsley PS, Ledbetter JA. The role of the CD28 receptor during T cell responses to
antigen. Annual review of immunology 1993;11:191-212.
19.
Groux H, Bigler M, de Vries JE, Roncarolo MG. Interleukin-10 induces a long-term
antigen-specific anergic state in human CD4+ T cells. The Journal of experimental medicine
1996;184(1):19-29.
20.
Sato E, Olson SH, Ahn J, et al. Intraepithelial CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes
and a high CD8+/regulatory T cell ratio are associated with favorable prognosis in ovarian
20
cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
2005;102(51):18538-43.
21.
Alter G, Malenfant JM, Altfeld M. CD107a as a functional marker for the
identification of natural killer cell activity. Journal of immunological methods 2004;294(12):15-22.
22.
Girardi M, Oppenheim DE, Steele CR, et al. Regulation of cutaneous malignancy by
gammadelta T cells. Science (New York, NY 2001;294(5542):605-9.
23.
Gober HJ, Kistowska M, Angman L, Jeno P, Mori L, De Libero G. Human T cell
receptor gammadelta cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells. The
Journal of experimental medicine 2003;197(2):163-8.
24.
Bonneville M, Fournie JJ. Sensing cell stress and transformation through
Vgamma9Vdelta2 T cell-mediated recognition of the isoprenoid pathway metabolites.
Microbes and infection / Institut Pasteur 2005;7(3):503-9.
25.
Hung K, Hayashi R, Lafond-Walker A, Lowenstein C, Pardoll D, Levitsky H. The
central role of CD4(+) T cells in the antitumor immune response. The Journal of experimental
medicine 1998;188(12):2357-68.
26.
Mellor AL, Munn DH. IDO expression by dendritic cells: tolerance and tryptophan
catabolism. Nat Rev Immunol 2004;4(10):762-74.
27.
Uyttenhove C, Pilotte L, Theate I, et al. Evidence for a tumoral immune resistance
mechanism based on tryptophan degradation by indoleamine 2,3-dioxygenase. Nature
medicine 2003;9(10):1269-74.
28.
Okamoto A, Nikaido T, Ochiai K, et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase serves as a
marker of poor prognosis in gene expression profiles of serous ovarian cancer cells. Clin
Cancer Res 2005;11(16):6030-9.
29.
Sharma S, Yang SC, Zhu L, et al. Tumor cyclooxygenase-2/prostaglandin E2dependent promotion of FOXP3 expression and CD4+ CD25+ T regulatory cell activities in
lung cancer. Cancer research 2005;65(12):5211-20.
30.
Ghiringhelli F, Puig PE, Roux S, et al. Tumor cells convert immature myeloid
dendritic cells into TGF-beta-secreting cells inducing CD4+CD25+ regulatory T cell
proliferation. The Journal of experimental medicine 2005;202(7):919-29.
31.
Curti A, Pandolfi S, Valzasina B, et al. Modulation of tryptophan catabolism by
human leukemic cells results in the conversion of CD25- into CD25+ T regulatory cells.
Blood 2007;109(7):2871-7.
32.
Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics, 2008. CA: a cancer journal for
clinicians 2008;58(2):71-96.
33.
Zhang L, Conejo-Garcia JR, Katsaros D, et al. Intratumoral T cells, recurrence, and
survival in epithelial ovarian cancer. The New England journal of medicine 2003;348(3):20313.
34.
Paget S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. 1889. Cancer
metastasis reviews 1989;8(2):98-101.
35.
Sako A, Kitayama J, Shida D, et al. Lysophosphatidic acid (LPA)-induced vascular
endothelial growth factor (VEGF) by mesothelial cells and quantification of host-derived
VEGF in malignant ascites. The Journal of surgical research 2006;130(1):94-101.
36.
Jayne DG, Perry SL, Morrison E, Farmery SM, Guillou PJ. Activated mesothelial cells
produce heparin-binding growth factors: implications for tumour metastases. British journal
of cancer 2000;82(6):1233-8.
37.
Bhoola S, Hoskins WJ. Diagnosis and management of epithelial ovarian cancer.
Obstetrics and gynecology 2006;107(6):1399-410.
21
38.
Apetoh L, Ghiringhelli F, Tesniere A, et al. Toll-like receptor 4-dependent
contribution of the immune system to anticancer chemotherapy and radiotherapy. Nature
medicine 2007;13(9):1050-9.
39.
Schaffler A, Buchler C. Concise review: adipose tissue-derived stromal cells--basic
and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem cells (Dayton, Ohio)
2007;25(4):818-27.
40.
Nakamizo A, Marini F, Amano T, et al. Human bone marrow-derived mesenchymal
stem cells in the treatment of gliomas. Cancer research 2005;65(8):3307-18.
41.
Karnoub AE, Dash AB, Vo AP, et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma
promote breast cancer metastasis. Nature 2007;449(7162):557-63.
42.
Komarova S, Kawakami Y, Stoff-Khalili MA, Curiel DT, Pereboeva L. Mesenchymal
progenitor cells as cellular vehicles for delivery of oncolytic adenoviruses. Molecular cancer
therapeutics 2006;5(3):755-66.
43.
Mishra PJ, Mishra PJ, Humeniuk R, et al. Carcinoma-associated fibroblast-like
differentiation of human mesenchymal stem cells. Cancer research 2008;68(11):4331-9.
44.
Espinosa E, Tabiasco J, Hudrisier D, Fournie JJ. Synaptic transfer by human gamma
delta T cells stimulated with soluble or cellular antigens. J Immunol 2002;168(12):6336-43.
22
Legend to Figures
Fig.1: Hospicells inhibit TCR-induced proliferation of CD4+ T cells.
+
(A) A representative assay of CFSE dilution to measure the proliferation of purified CD4 T
cells stimulated (lower panels) or not (upper panels) by anti-CD3/ CD28 beads co-cultured for
+
6 days with immortalized Hospicells. (B) Rates of dividing CD4 T cells from precedent
experiments: open symbol for unstimulated CD4+ T cells, full symbol for stimulated ones
+
(means and s.d., n = 5 independent experiments). (C) Rates of dividing purified CD4 T cells
co-cultured for 6 days with (open symbol) or without (full symbol) allogeneic DC and
inceasing numbers of immortalized Hospicells (means and s.d., n = 3 independent
+
experiments). (D) Dividing and dying CD4 T cells co-cultured for 6 days with immortalized
Hospicells in the presence (lower panel) or absence (upper panel) of anti-CD3/antiCD28
+
beads (representative experiment out of 4). (E) Rates of apoptotic CD4 T cells among
+
unstimulated (open bars) or anti-CD3/anti-CD28 stimulated (black bars) CD4 T cells in the
+
above experiments (means and s.d., n = 4). (F) Rates of apoptotic CD4 T cells among
+
divided (black bars) or undivided (white bars) CD4 T cells in the above experiments (means
and s.d., n=4). p < 0.01 ; p < 0.001 Student T test.
23
+
Fig. 2: Hospicells inhibit TCR-induced production of cytokines by CD4 T cells.
+
(A,B,C) Polyclonal CD4 T cells from healthy donors were restimulated or not with antiCD3/anti-CD28 beads in the presence immortalized Hospicells (A) Representative experiment
+
out of 3 showing intracellular IFN-γ staining in anti-CD3/anti-CD28 stimulated CD4 T cells.
(B) Rates of intracellular IFN-γ
+
+
cells among CD4 T cells stimulated (close symbol) or not
(open symbol) (means and s.d. from n = 3 ind. Expts). (C) Levels of IL-4, IL-10 and IFNγ in
the supernatants of the specified culture (means and s.d. from n = 3 ind. Expts). p < 0.05 ;
p < 0.01 ; p < 0.005 (Student).
Fig 3: Hospicells inhibition is cell contact independent.
+
(A) Representative CFSE dilution of anti-CD3/anti-CD28 beads stimulated CD4 T cells cocultured for 6 days with or without immortalized Hospicells in conditions allowing (upper
+
panel) or not (lower panel) cell contact. (B) Rates of dividing CD4 T cells in the above
experiment; cell contact (white bars) or no cell contact (black bars) (means and s.d., n = 5
indep. Expts). N.S p > 0.05 (Student T test).
Fig 4: Hospicells inhibition is of CD4 T cell proliferation is reversible.
+
CFSE labeled purified CD4 T cells were seeded in the top of a TranswellTM chamber with or
without anti-CD3/anti-CD28 beads for 6 days. Where indicated, immortalized Hospicells
were plated in the bottom of the TranswellTM chamber. Representative CFSE dilution of
+
+
CD4 T cells after 6 days (upper panel). Then, Hospicells were removed and CD4 T cells
were allowed to proliferate 4 additional days in the presence or absence of anti-CD3/anti+
CD28 beads. Representative CFSE dilution of CD4 T cells after 10 days (lower panel) (n=3
indep. expts).
24
Fig 5: Mechanism of Hospicells mediated inhibition of CD4 T cell proliferation.
+
+
(A) Rates of CD25 purified CD4 T cells stimulated (black bars) or not (white bars) by antiCD3/anti-CD28 beads for 3 days with or without immortalized Hospicells. (means and s.d., n
= 3 indep. Expts) (B) Levels of IL-2 in the supernatants of the same cultures (means and s.d.,
+
n = 3 indep. Expts). (C) Rates of dividing purified CD4 T cells stimulated (black bars) or not
(white bars) by anti-CD3/anti-CD28 beads for 6 days in co-cultures with immortalized
Hospicells supplemented or with recombinant IL-2 (100 U/ml) (means and s.d. from 3 indep.
+
expts). (D) Rates of dividing purified CD4 T cells stimulated (black bars) or not (white bars)
by anti-CD3/anti-CD28 beads for 6 days in co-cultures with immortalized Hospicells
supplemented with the specified molecules (means and s.d. from 3 indep. expts). p < 0.05,
p < 0.01 (Student T test).
Fig 6: Ovarian carcinoma derived Hospicells inhibits CD8 T cell and Vγγ9Vδ
δ2 responses.
+
(A-B) CFSE labeled purified CD8 T cells stimulated by anti-CD3/anti-CD28 beads were cocultured for 6 days with immortalized Hospicells. (A) Representative CFSE dilution from 5
independent experiments. (B) CFSE dilution and intracellular IFNγ staining of CD8+ T cells
restimulated with PHA for 5 hrs (representative of 3 ind. expts). (C) CFSE-labelled purified
γδ T cells stimulated with BrHPP+IL-2 were co-cultured for 6 days with immortalized
Hospicells (representative of 3 ind. expts). (D) Vγ9Vδ2 T cell producing IFN-γ in the
presence of immortalized Hospicells and BrHPP (representative experiment from n = 3 ind.
expts).
25
Supplementary fig.1: Phenotype of immortalized Hospicells.
Flow cytometry analysis of immortalized Hospicell phenotype in culture using the specified
antibodies (Black histogram) and their isotype match control (grey histogram).
Supplementary fig.2: Irradiated Hospicells inhibit proliferation of CD4+ T cells.
+
Rates of dividing CD4 T cells stimulated (black bars) or not (white bars) by anti-CD3/ antiCD28 beads and co-cultured for 6 days with irradiated immortalized Hospicells (means and
s.d. from 3 indep. expts). p < 0.001 Student T test.
Supplementary fig.3: Kinetic of CD4+ T cells inhibition of proliferation by Hospicells.
+
A representative assay of CFSE dilution from 3 independent experiments of purified CD4 T
cells stimulated by anti-CD3/anti-CD28 beads for 6 days with increasing numbers of
immortalized Hospicells.
Supplementary fig.4: CD69 and CD25 expression of CD8 T cells co-cultured with
Hospicells.
+
Percentage of CD69 (black bars) and CD25 (white bars) expressing CD8 T cells co-cultured
with increasing numbers of Immortalized Hospicells for 3 days (means and s.d. from 3 indep.
expts).
26
L. Martinet et al.
T cell inhibition by Hospicells
FIGURE 1
B
0
1/50
1/20
1/10
1/5
100
Divided CD4 T cell (%)
Hospi / CD4 T cell Ratio
1/2
C
50
Divided CD4 T cell (%)
A
80
60
40
20
40
30
20
10
0
0
CFSE
0
1/50
1/10
0
1/50 1/10
1/5
Hospi/ CD4 T cell Ratio
1/2
1/5
Hospi / CD4 T cell Ratio
D
P= 0.001
E
F
Hospi / CD4 T cell Ratio
1/2
100
% 7AAD+ CD4+ T cells
1/5
% 7AAD+ CD4+ T cells
1/10
IP
0
75
50
25
0
0
1/10
1/5
MSC / CD4 T cell Ratio
CFSE
1/2
100
75
50
25
0
0
1/10
1/5
MSC / CD4 T cell Ratio
1/2
L. Martinet et al.
T cell inhibition by Hospicells
FIGURE 2
IL-10 (ng/ml)
P=0.005
1/10
1/5
1/2
30
4
2
0
20
9
P=0.015
15
IL-4
6
3
10
0
P=0.001
5
0
0
IFNγ
6
25
IL-4 (ng/ml)
IFNγ producing CD4 T cell (%)
Hospi/ CD4 T cell Ratio
0
8
C
B
1/10
1/5
1/2
IFNγ (ng/ml)
A
150
100
50
Hospi / CD4 T cell Ratio
0
0
1/5 1/2
0
1/5 1/2
Hospi/ CD4 T cell Ratio
No stimulation
αCD3CD28
L. Martinet et al.
T cell inhibition by Hospicells
FIGURE 3
A
B
Divided CD4 T cell (%)
N.S
100
75
50
N.S
25
0
0
0
1/5
Hospi /CD4 T cell Ratio
1/5
Hospi /CD4 T cell Ratio
L. Martinet et al.
T cell inhibition by Hospicells
FIGURE 4
Hospi cell
-
+
-
+
αCD3/CD28 Day 0
-
-
+
+
+
+
αCD3/CD28 Day 6
-
-
+
+
0
N.D
N.D
0
N.D
N.D
1/50
1/10
1/5
Hospi/ CD4 T cell Ratio
20
0
1
5
0.5
1
1-MT (mM)
10
40
L-NAME (mM)
20
Indo (µM)
P=0.01
60
Anti TGF-β
80
Divided CD4 T cell (%)
C
Anti IL-10
30
IgG1
1/50
1/10
1/5
Hospi/ CD4 T cell Ratio
0
Exogenous IL-2
25
Medium
B
0
Divided CD4 T cell (%)
% CD25 + CD4 T cell
A
IL-2 (ng/ml)
FIGURE 5
100
75
D
50
100
75
50
25
0
0.5
1
L. Martinet et al.
T cell inhibition by Hospicells
FIGURE 6
A
Hospi/ CD8+ T cell Ratio
unstimulated
0
1/50
B
1/10
1/5
Hospi/ CD8+ T cell Ratio
0
1/50
12%
1/10
7%
1%
1/10
1/5
IFNγ
10%
1/2
1/5
4%
CFSE
C
Hospi/ γδ T cell Ratio
unstimulated
0
1/50
D
Hospi/ Vγ9Vδ2 T cell Ratio
0
1/10
IFNγ
31%
1/5
19%
TCR Vγ9
1/2
6%
3%
L. Martinet et al.
T cell inhibition by Hospicells
Supplementary FIGURE 1
HLA-ABC
CD14
CD146
HLA-DR
CD86
CD166
CD73
CD31
CD45
CD80
CD105
CD90
CD34
CD11b
CD29
CD106
L. Martinet et al.
T cell inhibition by Hospicells
Divided CD4 T cell (%)
Supplementary FIGURE 2
P= 0.001
80
60
40
20
0
0
1/50
1/20
1/10
Hospi/ CD4 T cell Ratio
1/5
L. Martinet et al.
T cell inhibition by Hospicells
Supplementary FIGURE 3
Hospi/ CD4 T cell Ratio
0
1/50
1/10
1/5
Day 3
Day 4
Day 5
Day 6
L. Martinet et al.
T cell inhibition by Hospicells
Supplementary FIGURE 4
% of CD8 T cells
50
40
30
20
10
0
0
0
1/50
1/20
1/10
Hospi/ CD8 T cell Ratio
1/5
DISCUSSION
125
126
I. La PGE2 dans la régulation des réponses T Vγγ9Vδ
δ2.
δ2.
I.1 La PGE2 dans la régulation des réponses antitumorale des cellules T Vγγ9Vδ
Le potentiel cytolytique des lymphocytes T Vγ9Vδ2 activés a été démontré vis-à-vis
de très nombreux types de cellules cancéreuses, à la fois in vitro
cellules de patients atteints de carcinome rénal
183 , 191
188-190
et ex vivo à partir de
, de la prostate
192
ou de myélome
multiple 193. Plusieurs essais cliniques réalisés ces dernières années à l’aide d’agents capables
d’activer l’expansion et les fonctions effectrices de ces cellules in vivo comme les
aminobisphosphonates
196
et les phosphoantigènes de synthèse
515
démontrent le potentiel
thérapeutique des lymphocytes T Vγ9Vδ2 pour le traitement de cancers d’origines diverses.
Par exemple, dans une étude réalisée sur des patients atteints de Myélome Multiple ou de
lymphomes non-Hodgkinien de bas grade, Wilhelm et ses collaborateurs ont démontré que le
traitement par le Pamidronate et l’IL-2 permettait de réduire la masse tumorale
196
. Plus
récemment, une étude réalisée sur des patients atteints de cancer de la prostate indique que le
traitement avec de faibles doses d’IL-2 et de l’acide Zolédronique permet d’améliorer la
survie des patients 517.
La surexpression de COX2 est un phénomène fréquent dans le processus de
cancérogénèse 357 et dans de nombreux types de cancers cette surexpression est accompagnée
par une surproduction de PGE2. Celle-ci est souvent corrélée à un mauvais pronostic de survie
à long terme pour les patients car elle est associée à un grade élevé et à la dissémination de la
tumeur
364, 365
. Les résultats obtenus au cours de mon doctorat mettent en évidence le rôle
crucial de la PGE2 dans la régulation négative des réponses effectrices des lymphocytes T
Vγ9Vδ2. La présence de PGE2 dans le sérum et dans le microenvironnement tumoral des
patients atteints de cancer pourrait donc constituer un obstacle majeur à l’efficacité
d’immunothérapies antitumorales Vγ9Vδ2. En effet, la PGE2 peut non seulement bloquer
l’expansion des lymphocytes T Vγ9Vδ2 mais également sévèrement diminuer la lyse des
cellules cibles induite par la reconnaissance de phosphoantigènes à leur surface et ceci
indépendamment de la dose antigénique. Les lymphocytes T Vγ9Vδ2 expriment également
d’autres récepteurs qui vont pouvoir moduler leur activation comme NKG2D, NKp44 ou
encore CD16 qui permet aux cellules T Vγ9Vδ2 de participer activement aux processus
d’ADCC
534
. Les signaux activateurs transmis par ces récepteurs pourraient éventuellement
127
compenser l’inhibition du TCR Vγ9Vδ2 induite par la PGE2. Malheureusement, mes
expériences démontrent que la PGE2 inhibe l’activation de la cytotoxicité des NK induite par
les récepteurs NKG2D, NKp44 et CD16 via l’activation de la PKA I. Ces résultats indiquent
que la PGE2 bloque la signalisation de ces 3 types de récepteurs dans les cellules NK. Même
s’il est possible que la signalisation de NKG2D, NKp44 et CD16 diffère entre les NK et les
lymphocytes T Vγ9Vδ2, il semble néanmoins plus probable que la PGE2 bloque également
l’activation des lymphocytes T Vγ9Vδ2 induit par ces trois types de récepteurs. Il est toutefois
difficile de valider cette hypothèse par des tests fonctionnels étant donné que ces récepteurs
sont tous des co-récepteurs pour les lymphocytes T Vγ9Vδ2 qui nécessitent donc également
l’engagement du TCR pour conduire à l’activation de ces cellules.
La production de PGE2 par les cellules tumorales et leur microenvironnement pourrait
expliquer l’absence de réponse de certains patients aux traitements visant à amplifier les
lymphocytes T Vγ9Vδ2 in vivo. Par exemple, les études de Wilhelm et Dieli indiquent que le
traitement combiné d’ABP et d’IL-2 permet d’induire une amplification des cellules T
Vγ9Vδ2 in vivo que pour une partie des patients traités
196
. Par ailleurs, une étude menée par
l’équipe de Provinciali a démontré que le nombre absolu et les fonctions des cellules T
Vγ9Vδ2 circulants sont significativement réduits chez les patients atteints de mélanome
cutané primaire en comparaison avec les sujets sains
535
. Les taux élevés de PGE2
fréquemment produits par les cellules de mélanomes pourraient être à l’origine de ces
résultats
536
. Il serait donc intéressant dans l’avenir de chercher une éventuelle corrélation
entre le niveau de PGE2 dans le sérum des patients ou le niveau d’expression de COX2 sur les
biopsies de tumeurs et les réponses effectrices des lymphocytes T Vγ9Vδ2 induites par
les différents traitements. Plusieurs études réalisées sur des modèles murins de tumeurs ont
démontré que l’inhibition de la PGE2 grâce à l’utilisation d’agents qui inhibent l’activité des
COX permettait d’améliorer l’efficacité de vaccins visant à stimuler les réponses T αβ
372
370, 371,
. L’utilisation de tels agents pourrait donc également améliorer l’efficacité des
immunothérapies antitumorales Vγ9Vδ2.
I.2 La PGE2, un régulateur des réponses anti-infectieuses des cellules T Vγγ9Vδ
δ2.
La large distribution des PAg parmi les micro-organismes eucaryotes et procaryotes
permet aux cellules T Vγ9Vδ2 de s’activer dans des contextes infectieux divers comme la
tuberculose
153
, la méningite
154
ou encore la malaria
155
et de participer activement à
128
l’éradication de ces pathogènes via la lyse des cellules infectées et via la libération de
cytokines pro-inflammatoires comme le TNFα ou l’IFNγ. Ces cytokines ainsi que les
endotoxines bactériennes comme le LPS peuvent induire l’expression de COX2 dans les
macrophages 316-318 et conduire à la sécrétion de quantités importantes de PGE2 dans les tissus
périphériques en conditions infectieuses
327
. La PGE2 pourrait donc jouer un rôle important
dans la régulation négative des fonctions des lymphocytes T Vγ9Vδ2 lors d’infections afin
d’éviter la surproduction de médiateurs inflammatoires néfastes au bon fonctionnement de
l’organisme ou pour terminer la phase inflammatoire et permettre la cicatrisation. Dans
certaines pathologies la production de PGE2 pourrait également permettre aux pathogènes
d’échapper à la destruction par les lymphocytes T Vγ9Vδ2.  Mycobacterium tuberculosis est
l’agent responsable de la tuberculose, maladie qui touche un tiers de la population mondiale et
qui est responsable de la mort de 2 à 3 millions de personnes chaque année
537
. La
pathogénicité de cette mycobactérie dépend en grande partie de sa survie et de sa réplication
dans les macrophages. Il a été démontré que les cellules T Vγ9Vδ2 participent activement au
contrôle de l’infection par mycobacterium tuberculosis
infectés
46
153
par la lyse des macrophages
et via la sécrétion d’IFNγ et de TNFα qui permettent la mise en place de réponses
immunitaires adaptatives Th1
206
. On peut penser que les taux élevés de PGE2 qui sont
produits par les macrophages infectés par mycobacterium tuberculosis
538
pourraient
contribuer à la persistance de ce pathogène dans l’organisme en inhibant les réponses
biologiques des cellules T Vγ9Vδ2.
γ9Vδ2.
I. 3 Voie de signalisation de la PGE2 dans les lymphocytes T Vγ9
γ9 δ2.
Mes résultats démontrent que l’inhibition des réponses des lymphocytes T
Vγ9Vδ2 dépend de l’augmentation d’AMPc intracellulaire induit par la fixation de la PGE2
sur les récepteurs EP2 et EP4. L’AMPc intracellulaire est le principal substrat de la PKA I 341
qui permet de stabiliser dans les rafts lipidiques et d’augmenter de 2 à 4 fois l’activité de la
protéine COOH-terminal src kinase (Csk) 342, dont le principal rôle est de maintenir la kinase
lck à l’état inactif 539. Il a ainsi été démontré dans les lymphocytes T CD4+ que l’activation de
la PKA type I par la PGE2 permettait de diminuer la phosphorylation des ITAM du complexe
CD3 par lck
540
et ainsi d’inhiber la transmission du signal induit par le TCR
541
. La capacité
de la PGE2 à bloquer le flux calcique induit par des anticorps anti-CD3 dans les T
Vγ9Vδ2 laisse penser que comme pour les lymphocytes T CD4+, l’inhibition de la PGE2 a
lieu très tôt dans la signalisation TCR, certainement via l’inactivation de lck par la PKA I.
129
Toutefois, comme l’activation des lymphocytes T Vγ9Vδ2 par le PAg ne nécessite que
quelques secondes
144
, l’inhibition de la signalisation TCR par la PGE2 ne peut expliquer la
capacité de cette molécule à inhiber les réponses prolifératives des lymphocytes T
Vγ9Vδ2 lorsqu’elle est ajoutée dans la culture 24 heures après la stimulation par le PAg. Il a
été démontré que la PKA I peut inhiber l’expression de la cycline D3 et augmenter celle de
l’inhibiteur de Cdk (cycline dépendent kinase) p27kip1
542
. L’altération de l’expression du
complexe cycline/Cdk impliqué dans l’entrée en phase S du cycle cellulaire par la PGE2
pourrait donc permettre de réguler la prolifération cellulaire des lymphocytes T Vγ9Vδ2.
Mes travaux démontrent que la forskoline inhibe les réponses effectrices des cellules
T Vγ9Vδ2 suggérant que les facteurs qui augmentent l’AMPc intracellulaire sont susceptibles
de réguler négativement les fonctions de ces cellules. L’adénosine en se fixant aux récepteurs
A2A couplés à l’adénylate cyclase, joue un rôle important dans la régulation des dommages
liés à l’inflammation aigue. Ce composé est également produit en concentration importante
dans les zones d’hypoxie et on retrouve des niveaux élevés d’adénosine dans de nombreuses
tumeurs
T αβ
543
544
. L’adénosine qui a déjà été impliqué dans l’inhibition des réponses immunitaires
et NK
545
par les tumeurs pourrait donc participer à l’inhibition des réponses
antitumorales des lymphocytes T Vγ9Vδ2. Il serait donc intéressant d’étudier l’expression du
récepteur A2A et la capacité de l’adénosine à moduler les réponses effectrices des différentes
sous populations de lymphocytes T Vγ9Vδ2 afin d’optimiser la réussite des futures
immunothérapies d’autant plus que ce facteur a été récemment été impliqué dans les fonctions
immunorégulatrices des T reg 469.
II. Les MSC dans la régulation des réponses immunitaires.
II.1 Mécanisme d’inhibition des réponses T Vγγ9Vδ
δ2 par les MSC.
La PGE2 joue un rôle crucial dans l’inhibition des lymphocytes T Vγ9Vδ2 par les
MSC comme le démontre l’incapacité des MSC traitées avec l’indométacine à inhiber la
prolifération des lymphocytes T Vγ9Vδ2. Ces données sont en accord avec plusieurs études
qui avaient démontré que la PGE2 contribuait à l’inhibition des fonctions des cellules NK et
lymphocytes T CD4+ et CD8+ par les MSC
484
. Ces dernières années plusieurs autres
mécanismes ont été impliqués dans les propriétés immunomodulatrices des MSC incluant des
cytokines comme le TGF-β, l’HGF et l’IL-10 484, la dégradation du tryptophane par l’enzyme
130
IDO
491, 494, 500
et la production de NO par l’enzyme iNOS
501 , 502
. L’utilisation d’anticorps
bloquant ou d’inhibiteurs chimiques seuls ou en combinaison semble démontrer que ces
facteurs ne sont pas impliqués dans l’inhibition des réponses T Vγ9Vδ2 par les MSC.
Toutefois, ces résultats ne signifient pas que ces facteurs ne sont pas susceptibles d’interférer
avec les fonctions des lymphocytes T Vγ9Vδ2 mais plutôt qu’ils ne sont pas produits par les
MSC en présence de lymphocytes T Vγ9Vδ2.
Une étude récente a démontré que les MSC peuvent inhiber les fonctions des NK et la
prolifération des lymphocytes T via la sécrétion de molécules de CMH I non conventionnelle
HLA-G5
503
. Nous n’avons pas testé l’implication de ce facteur dans nos expériences, même
si une proportion des lymphocytes T Vγ9Vδ2 exprime le récepteur inhibiteur ILT2 et pourrait
être sensibles à la sécrétion d’HLA-G par les MSC.
Mes résultats ont révélé que la PGE2 à l’origine de l’inhibition des réponses effectrices
des lymphocytes T Vγ9Vδ2 n’est pas produite de manière constitutive par les MSC. En effet,
l’expression de l’enzyme COX2 et la sécrétion de PGE2 par ces cellules sont induites en
réponse à l’IFNγ et au TNFα sécrétés par les lymphocytes T Vγ9Vδ2 activés. Le rôle clef de
l’IFNγ dans l'induction du potentiel immunosuppresseur des MSC est en accord avec deux
études récentes qui démontrent l’absence de propriétés régulatrices des MSC issues de souris
IFNγR KO 502 ou traitées avec des anticorps bloquant anti-IFNγR 491. Toutefois, dans ces deux
études les fonctions immunosuppressives des MSC dépendaient des enzymes iNOS et IDO
respectivement. Même si je n’ai pas analysé l’expression de ces enzymes dans les MSC en
réponse au surnageant de lymphocytes T Vγ9Vδ2 activés, l’absence d’effet des inhibiteurs de
ces enzymes dans mes expériences semble indiquer que celles-ci ne sont pas surexprimées par
les MSC en présence de lymphocytes T Vγ9Vδ2. Ren et ses collaborateurs ont démontré que
d’autres cytokines comme le TNFα ou l’IL-1β contribuent également à l’activation du
potentiel immunorégulateur des MSC
502
. Mes expériences qui démontrent que le TNFα et
l’IFNγ agissent en synergie sur les MSC pour stimuler leur production de PGE2 sont en accord
avec ces résultats. Par ailleurs, on peut noter que la quantité d’IFNγ et de TNFα exogène
nécessaire pour stimuler la production de PGE2 par les MSC était supérieure à celle retrouvée
dans le surnageant des cellules T Vγ9Vδ2 activés. Si la bio-activité de ces cytokines
recombinantes est identique à celle du TNFα et de l’IFNγ produits par les cellules T
Vγ9Vδ2, ces résultats pourraient suggérer que d'autres cytokines ou chimiokines sécrétées par
ces cellules contribuent également à l'activation du potentiel immunorégulateur des MSC.
131
II.2 Régulation des réponses T Vγγ9Vδ
δ2 par les MSC in vivo.
Mes résultats démontrent que les MSC inhibent la prolifération, la production de
cytokines pro-inflammatoires et la cytotoxicité des lymphocytes T Vγ9Vδ2 fraichement isolés
ou issus de lignées générées en réponse au BrHPP et à l’IL-2. Ces résultats obtenus in vitro où
les deux types cellulaires sont très proches soulève la question de la relevance des ces
observations in vivo. Une récente étude publiée par Ren et ses collaborateurs démontre que les
MSC activées produisent de nombreuses chimiokines incluant notamment CCL5 et CXCL911
502
. Cette production de chimiokines qui est à l’origine du recrutement des lymphocytes T
permet aux MSC d’exercer leurs fonctions immunosuppressives en très faible nombre in vivo.
Une importante proportion des cellules Vγ9Vδ2 effectrices mémoires TEMh et TEMRA
expriment les récepteurs CCR5 et CXCR3 pour les chimiokines CCL5 et CXCL9-11. Ainsi,
même si nous n’avons pas analysé la migration des lymphocytes T Vγ9Vδ2 vers les MSC, on
peut raisonnablement penser que ces cellules peuvent être attirées par les MSC in vivo.
III. Rôle des MSC dans les cancers.
III.1 Les MSC dans le microenvironnement tumoral.
Plusieurs études basées sur des modèles in vitro ou murins ont démontré que les MSC
migrent spécifiquement vers différents types de tumeurs, incluant les gliomes
carcinomes du colon
509
, les carcinomes ovariens
510
, et les mélanomes
512
507, 508
, les
. Par exemple,
Weinberg et ses collaborateurs ont observé l’accumulation de MSC exprimant la GFP
injectées par voie intraveineuse dans des souris immunodéficientes au niveau de xénogreffes
de tumeurs du sein MCF7/Ras et MDA-MB-231, suggérant que les MSC sont activement
recrutées par les tumeurs
511
. Des cellules fibroblastiques présentant des caractéristiques
phénotypiques proches des MSC avec notamment l’expression des marqueurs CD105,
CD106, CD10 et CD44 ont également été isolées à partir du stroma de carcinomes
mammaires invasifs 511. Plus récemment, une étude conduite par Cao et al a permis l’isolation
de cellule présentant toutes les caractéristiques des MSC (phénotype et différenciation) à
partir de prélèvements de carcinomes gastriques
513
. Ainsi, de plus en plus de données
suggèrent que les MSC sont recrutées au niveau des tumeurs. La présence des MSC dans le
stroma tumoral pourrait donc jouer un rôle néfaste sur les réponses effectrices des
132
lymphocytes T Vγ9Vδ2 et pourrait constituer un obstacle à la réussite des futures
immunothérapies Vγ9Vδ2.
De par leurs capacités de différenciation en divers types cellulaires d’origine
mésodermique
474
et d’origine non mésodermique
475
, les MSC participent activement à la
régénération des tissus. Ces dernières années plusieurs études ont pu démontrer la capacité
des MSC à migrer vers les sites de lésions ou d’inflammation où, de par leurs capacités à se
différencier en divers types cellulaires, elles participent à la réparation des tissus
477
. Il a par
ailleurs été démontré que les MSC expriment plusieurs récepteurs de la famille des TLR (TLR
2-4, 7, 8) leur permettant de migrer en réponse à la reconnaissance de structures microbiennes
546
. Ces données suggèrent que les MSC pourraient jouer un rôle physiologique important lors
d’infections ou de lésions afin de réduire l’inflammation indispensable pour permettre le
processus de cicatrisation. Le développement de tumeurs solides est toujours accompagné
d’un remodelage des tissus environnants caractérisé par une dégradation de la matrice
extracellulaire, la formation de nouveau tissu conjonctif et l’infiltration de nombreux types de
cellules immunitaires
373
. De par ces caractéristiques, le foyer primaire d’une tumeur est
souvent comparé au tissu cicatriciel et pourrait donc expliquer le recrutement de MSC au
niveau des tumeurs. Par ailleurs, plusieurs facteurs produits par les cellules tumorales elles
mêmes ou les cellules environnantes sont de puissants chémoattractants pour les MSC comme
le MCP-1 produit par les tumeurs mammaires
les fibroblastes associés aux tumeurs
MSC dans le stroma tumoral
548
373
547
. SDF-1, produit en importante quantité par
, semble également contribuer au recrutement des
. Récemment, il a été démontré que les facteurs de croissance
produits par les tumeurs pancréatiques comme le PDGF et le l’EGF pouvaient induire le
recrutement des MSC
549
. Enfin, les cytokines angiogéniques comme l’IL-8, le TGF-β, la
neurotrophine-3 et le VEGF semblent impliquées dans le recrutement des MSC au niveau des
gliomes 550.
La capacité des MSC à se différencier en divers types cellulaires soulève la question
du devenir des MSC dans le microenvironnement tumoral. Cette question est d’autant plus
importante que plusieurs études ont pu démontrer que les cellules qui se différencient à partir
des MSC conservent des propriétés immunomodulatrices
551, 552
. Les « cancers associated
fibroblast » qui représentent le constituant cellulaire majoritaire du stroma tumoral
376
sont
fonctionnellement distincts des fibroblastes issus des tissus environnants 378 et semblent jouer
un rôle important dans l’initiation, le développement et la migration des tumeurs
379 , 380
.
L’origine des CAF reste relativement controversée et il a été récemment suggéré que
l’accumulation et le phénotype anormal de ces cellules seraient la conséquence d’une
différenciation des MSC en fibroblastes au site de la tumeur
553, 554
. Jusqu’à présent aucune
133
étude ne s’est intéressée à la question du potentiel immunorégulateurs des CAF. Pourtant,
plusieurs études réalisées sur les fibroblastes issus de localisations anatomiques différentes
indiquent qu’une fois activées par l’IFNγ, ces cellules peuvent exercer des fonctions
inhibitrices sur les lymphocytes T 382, 383, 384 , 385. Dans l’avenir, il serait intéressant d’identifier
les signaux à l’origine de la différenciation des MSC en CAF et de déterminer si ces cellules
conservent les propriétés suppressives des MSC. Si tel est le cas, étant donné l’importante
concentration de ces cellules dans le stroma tumoral, les CAF pourraient contribuer et même
être à l’origine du microenvironnement immunosuppressif des cancers.
III.2 Rôle du VEGF et de l’IL-6 produits par les MSC dans le développement tumoral.
Mes résultats démontrent la capacité des MSC à stimuler le développement des
tumeurs RPMI 8226 dans les souris immunodéficientes SCID/beige. Plusieurs autres équipes
ont également pu démontrer avec d’autres modèles de tumeurs que les MSC favorisent la
croissance tumorale in vitro
481
et in vivo
555, 556
. Le VEGF est le principal facteur impliqué
dans le développement vasculaire des tumeurs nécessaire à leur approvisionnement en
nutriments et à leur dissémination
557
. Ce facteur pourrait être à l’origine de l’effet pro-
tumoral des MSC comme le suggère une étude récente qui démontre que le VEGF produit par
les MSC qui migrent au niveau de carcinomes pancréatiques stimule l’angiogénèse de ces
tumeurs
549
. Les MSC pourraient donc constituer un type cellulaire clef dans le
développement de l’angiogénèse tumorale d’autant plus que la production de VEGF par les
MSC est augmentée in vitro par la présence de cellules inflammatoires comme les
lymphocytes T Vγ9Vδ2 ou les lymphocytes T allogéniques 558. Par ailleurs, comme le VEGF
est également un chemoattactant puissant qui contribue à la migration des MSC vers les
tumeurs
549
, l’augmentation de la production de VEGF par les MSC en présence de stimuli
inflammatoires pourrait participer à la mise en place d’une boucle de régulation positive
favorisant l’augmentation du nombre de MSC présentes dans le stroma tumoral.
Des niveaux élevés d’IL-6 sont corrélés dans de nombreux types de cancers à un
mauvais pronostic et au développement de la maladie
520
. En effet, l’IL-6 peut agir
directement en stimulant la croissance, la survie et la chimiorésistance de certains cancers
comme le Myélome Multiple 520 et indirectement en stimulant la production de VEGF 520. La
production d’IL-6 par les MSC pourrait donc contribuer à la capacité de ces cellules à
favoriser le développement des tumeurs et notamment des RPMI 8266 dans notre modèle. Par
ailleurs, mes résultats démontrent que la sécrétion de cette cytokine est augmentée dans les
MSC par la présence de stimuli inflammatoires comme l’IFNγ et le TNFα produits par les
134
lymphocytes T Vγ9Vδ2 activés. L’inflammation générée dans le stroma péritumoral par la
présence de cellules immunitaires comme les lymphocytes T Vγ9Vδ2 ou les lymphocytes T
CD4+ et CD8+ pourrait donc en présence de MSC plutôt favoriser la croissance tumorale que
l’inhiber. En effet, les MSC en présence de médiateurs inflammatoires comme l’IFNγ, le
TNFα et l’IL-1β vont produire un certain nombre de facteurs immunosuppresseurs comme la
PGE2, le NO, le TGFβ ou HLA-G qui vont bloquer la destruction des cellules cancéreuses par
les effecteurs immunitaires mais également entrainer la production d’un certain nombre de
facteurs pro-tumoraux comme le VEGF et l’IL-6. La capacité des MSC à réagir aux stimuli
inflammatoires par la production de nombreux facteurs capables à la fois d’inhiber les
réponses immunitaires antitumorales et de stimuler la croissance, la survie et dissémination
des tumeurs pourrait permettre d’expliquer pourquoi les réponses inflammatoires dans les
tumeurs, au lieu de conduire à l’activation de réponses immunitaires antitumorales, favorisent
plutôt le développement des cancers 559.
III.3 Rôle du VEGF et de l’IL-6 dans l’inhibition des réponses antitumorales.
Le VEGF et l’IL-6 conduisent à l’activation du facteur de transcription STAT3.
Plusieurs études suggèrent que STAT3, qui est fréquemment activé dans divers cancers
d’origine hématopoïétique et épithéliale, permet de limiter la sécrétion de facteurs
inflammatoires et de signaux de dangers par les cellules cancéreuses
560
. Il a notamment été
démontré que le blocage de la signalisation de STAT3 dans les cellules tumorales conduisait à
une augmentation de la sécrétion de cytokines et chimiokines pro-inflammatoires et permettait
d’induire la mise en place de réponses immunitaires antitumorales adaptatives via l’activation
des DC
561
. En effet, l’activation de la signalisation STAT3 par l’IL-6 et le VEGF est
fortement impliquée dans l’inhibition de la maturation des cellules dendritiques et dans
l’accumulation des DC immatures et des cellules myéloïdes suppressives chez les patients
atteints de cancers
413
. Dans une étude récente, il a été démontré que l’IL-6 produite par les
MSC diminuait la maturation des cellules dendritiques in vitro
558
. L’IL-6 et le VEGF
produits par les MSC en grande quantité dans le microenvironnement tumoral sous l’effet de
cytokines inflammatoires pourraient donc également contribuer à inhiber les réponses
antitumorales adaptatives.
135
Immune escape
NK cells
Tumor Growth
CTL
IFNγγ
TNFα
α
PGE2, HLA-G, NO,
L-kynurénine
Immature DC
IL-6, VEGF
PGE2, IL-6, VEGF
VEGF, SDF-1,
MCP1, EGF, FGF
PGE2
IFNγγ
TNFα
α
MSC recruitment
Bone Marrow,
Adipose Tissu
mature DC
VEGF
Tumor Angiogenesis
Vγγ9Vδ
δ2 T cells
Figure 36. Rôle des MSC dans le microenvironnement tumoral.
III.4 Immunogénicité des cellules souches et des cellules souches tumorales.
Récemment, il a été démontré que les cellules souches embryonnaires (ESC), comme
les MSC, inhibent la maturation des DC ainsi que les réponses prolifératives des cellules T
induites par divers stimuli. Ce type cellulaire partage également avec les MSC la capacité
d’échapper à la reconnaissance par le système immunitaires
562
. Des cellules souches existent
dans chaque tissu qu’elles permettent de générer puis de régénérer tout au long de la vie. La
capacité des cellules souches embryonnaires et des cellules souches mésenchymateuses à
échapper au système immunitaire pourrait donc révéler une propriété générale des cellules
souches acquise au cour de l’évolution pour éviter tout risque de destruction par le système
immunitaire en conditions pathologiques. On peut donc imaginer que cette sauvegarde des
cellules souches serait essentielle au maintien de l’intégrité de l’organisme.
Il existe une grande hétérogénéité fonctionnelle et phénotypique entre les différentes
cellules cancéreuses qui composent une même tumeur. Ces dernières années plusieurs études
ont pu démontrer que seulement une faible proportion des cellules tumorales permet de
générer une tumeur dans une localisation anatomique différente, par exemple dans des souris
immunodéficientes
563
. Ces cellules partagent d’importantes propriétés avec les cellules
136
souches normales présentes dans les différents tissus comme les capacités d’autorenouvellement et de différenciation en différents types cellulaires qui leur ont valu
l’appellation de cellule souche cancéreuse (« cancer stem cell », CSC )
563
. Jusqu’à présent la
plupart des études qui traitent de l’immonogénicité des tumeurs et des défenses antitumorales
se sont intéressées aux cellules tumorales dans leur globalité. La question de
l’immunogénicité des CSC est particulièrement importante si l’on considère que ces cellules
sont à l’origine de la croissance, du renouvellement et de la dissémination des cancers. Même
s’il a déjà été démontré que des cellules progénitrices différenciées peuvent se transformer en
CSC en acquérant des capacités d’auto-renouvellement sous l’effet de certains oncogènes
564
,
plusieurs études suggèrent que les CSC pourraient être issues de la transformation de cellules
souches normales sous l’effet de l’inflammation chronique ou de l’exposition répétée à des
produits cancérigènes
565
. En effet, le phénotype des CSC est souvent proche des cellules
souches normales des tissus à partir duquel elles dérivent. Par ailleurs, on peut penser que les
cellules souches normales qui ont durée de vie longue ont une probabilité accrue de subir les
différentes mutations nécessaires au processus de transformation oncogénique
565
. Compte
tenu des propriétés immunomodulatrices de certaines cellules souches normales comme les
MSC et les ESC, il est alors envisageable que les nombreux facteurs immunosuppressifs
détectés dans les cellules tumorales aient été hérités des cellules souches saines desquelles
elles dérivent.
IV. Hospicell et réponses immunitaires antitumorales.
IV.1 Régulation des réponses immunitaires antitumorales par les Hospicell.
Afin d’étudier plus précisément les cellules mésothéliales qui interagissent avec les
cellules tumorales et de comprendre comment celles-ci peuvent favoriser le développement de
métastases, l’équipe du Dr Mirshahi (Institut des Cordeliers, Paris VI) a récemment isolé à
partir des agrégats tumoraux d’ascites de 5 patientes atteintes de cancer ovarien de stade
avancé des cellules mésothéliales qui interagissent spécifiquement avec les cellules tumorales
ovariennes. Ces cellules caractérisées par l’expression de CD9, CD10, CD29, CD146 et
CD166 ont été appelées « Hospicell »
531
. L’analyse de Tissu Micro-Array sur des critères
morphologiques et sur la base de l’expression du marqueur CD10 a également révélé la
présence de ces cellules au niveau des tumeurs primaires de patientes atteintes de cancers de
l’ovaire 531.
137
La capacité des Hospicell à empêcher la prolifération et la production de cytokines des
cellules T CD4+ et à interférer directement avec les fonctions des effecteurs cytotoxiques T
CD8+ et T Vγ9Vδ2 in vitro suggère que ces cellules pourraient participer à l’échappement des
cellules tumorales ovariennes aux réponses immunitaires. Il serait donc utile d’étudier
l’impact des Hospicell sur le développement de tumeurs ovariennes humaines xénogréffées
dans des souris immunodéficientes (NOD-SCID ou SCID/beige) en présence d’effecteurs
immunitaires spécifiques de ces tumeurs (CTL spécifiques d’Ag tumoraux, lymphocytes T
Vγ9Vδ2) afin de déterminer si les Hospicell peuvent empêcher la destruction des tumeurs
ovariennes par les cellules T in vivo. Toutefois, la capacité des Hospicells à stimuler la survie
et la prolifération des cellules tumorales ovariennes independament des cellules immunitaires
in vitro 531, pourrait limiter ce type d’approche.
Les résultats obtenus par l’équipe du Dr Mirshahi indiquent que les Hospicell
participent à la résistance des patientes atteintes de cancers de l’ovaire aux traitements
chimiothérapeutiques. Il a récemment été démontré que le système immunitaire, et notamment
les lymphocytes T CD4+ et CD8+, contribue de manière importante à la destruction des
tumeurs par divers agents chimiothérapeutiques
89, 566
. Même si Rafii et al ont pu démontrer
que le transfert de protéines MDR entre les Hospicell et les cellules tumorales ovariennes était
à l’origine de la chimiorésistance de ces cellules in vitro 531, on peut également penser que les
propriétés immunosuppressives des Hospicell pourraient contribuer au phénomène de
chimiorésistance in vivo.
IV.2 Mécanisme d’inhibition des réponses lymphocytaires T par les Hospicell.
Les expériences réalisées avec l’inhibiteur d’IDO suggèrent que cette enzyme pourrait
contribuer aux fonctions immunosuppressives des Hospicell. L’accumulation dans le milieu
extracellulaire de métabolites, comme la L-kynurénine, générés par la dégradation du
tryptophane via IDO
258
et le stress cellulaire causé par la déplétion locale en tryptophane
260
pourrait en effet expliquer plusieurs des effets immunomodulateurs des Hospicell. Afin de
valider l’implication de cette enzyme dans le potentiel immunorégulateur des Hospicell, il
serait nécessaire d’étudier l’expression d’IDO dans les Hospicell et d’analyser les
concentrations en L- kynurénine et en trypthophane dans les co-cultures de lymphocytes T et
d’Hospicell. Plusieurs études ont pu démontrer que l’arrêt de prolifération des cellules T
induit par IDO pouvait être réversé in vitro par l’addition de L-tryptophane dans le milieu 261,
262
. Il serait intéressant de déterminer si l’inhibition de la prolifération des lymphocytes T
CD4+ en présence d’Hospicell peut être réversé de manière similaire. Enfin, l’étude de Rafii
138
et al démontre la présence d’Hospicell sur les Tissu Micro-Array de tumeurs primaires de
patientes atteintes de cancer de l’ovaire
531
. L’expression de l’enzyme IDO par les Hospicell
pourrait donc être évaluée par immunohistochimie directement sur ces prélèvements de
tumeurs et être éventuellement corrélé au devenir clinique des patientes. En effet, l’expression
d’IDO dans le tissu tumoral est considérée par différentes équipes comme un marqueur
clinicopathologique de mauvais pronostic 263, 264.
Le traitement des Hospicell avec l’inhibiteur d’IDO ne réversait que faiblement
l’inhibition de prolifération des lymphocytes T CD4+ induite par ces cellules, suggérant que
d’autres facteurs immunosuppressifs sont produits par les Hospicell. L’analyse de
l’expression de COX2 et de iNOS dans ces cellules et le traitement des co-cultures de T CD4+
et d’Hospicell avec des inhibiteurs de ces enzymes indiquent que la production de PGE2 et de
NO ne sont pas à l’origine de cette inhibition. De même, l’IL-10 n’était pas détectable dans le
surnageant des cultures Hospicell et le traitement des co-cultures avec des anticorps anti-IL10 et anti-TGF-β n’avait aucun effet suggérant que ces facteurs ne sont pas à l’origine de
l’inhibition des réponses T par les Hospicell.
La galectine-3 extracellulaire peut se fixer sur les TCR portant des résidus N-acetyllactosamine et former des complexes à la surface des lymphocytes T ayant pour conséquence
de prévenir l’association entre les TCR et les corecepteurs CD4 ou CD8, nécessaire à la
transmission du signal
303 , 304
. Une étude a récemment démontré un défaut de fonctionnalité
des lymphocytes T CD8+ issus d’ascites de patients atteints de carcinomes gastriques,
ovariens ou de l’endomètre qui pouvait être restaurée en dissociant les complexes TCRgalectine-3
304
. L’analyse de la sécrétion de galectine-3 par les Hospicell et le traitement des
co-cultures T CD4+ et d’Hospicell avec la N-acetyl-lactosamine qui induit la dissociation des
complexes TCR-galectine-3 pourrait permettre de déterminer si la galectine-3 participe à
l’inhibition des réponses T par les Hospicell.
La
présence d’HLA-G soluble dans le milieu extracellulaire peut bloquer la
prolifération et la sécrétion de cytokines des lymphocytes T CD4+
273, 274
. Par ailleurs, la
présence de niveaux élevés d’HLA-G soluble sont retrouvés dans les ascites de cancers de
l’ovaire 567. Nous avons détecté une faible expression de HLA-G intracellulaire par cytométrie
de flux (Ac anti HLA-G1 et G5, clone MEM/G9) dans les Hospicell. L’analyse des
concentrations en HLA-G soluble dans le surnageant des cultures d’Hospicell par ELISA
pourrait permettre de déterminer si les Hospicell peuvent sécréter ce médiateur dans le milieu
extracellulaire. Si tel est le cas, l’implication de HLA-G dans les propriétés
immunosuppressives des Hospicell devrait être analysée dans les co-cultures de lymphocytes
T CD4+ et d’Hospicell en présence d’anticoprs neutralisant anti-HLA-G.
139
Les Hospicell bloquent la prolifération des lymphocytes T CD4+sans induire une
anergie de ces cellules comme le démontre la capacité des cellules T CD4+ à reproliférer en
réponse à des anticorps anti-CD3/anti-CD28 lorsque les Hospicell sont enlevés des cocultures. Plusieurs études indiquent que certains facteurs immunosuppressifs du stroma
tumoral comme la PGE2, le TGF-β ou HLA-G peuvent convertir les lymphocytes T CD4+ en
lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+Foxp3+ 348, 453 , 503. Il serait donc intéressant d’analyser
la fonctionnalité et l’expression de Foxp3 des cellules T CD4+ qui ont été co-cultivées avec
les Hospicell d’autant plus qu’il a été démontré que les ascites des cancers de l’ovaire sont
fréquemment infiltrés par les Treg 409.
IV.3 Rôle des Hospicell dans la dissémination péritonéale des cancers de l’ovaire.
Le carcinome épithélial ovarien est le sixième cancer le plus diagnostiqué chez les
femmes et la première cause décès parmi les cancers d’origine gynécologique dans le monde
525
. La mortalité des cancers ovariens est due au stade avancé de la maladie au moment du
diagnostique souvent caractérisée par la présence de métastastases dans la cavité péritonéale
526
.
A la fin du 19éme siècle, l’observation de 735 cas de cancers du sein amena Paget et
ses collaborateurs à proposer l’hypothèse du “seed and soil” qui suggérait que les cellules
tumorales (seeds) métastasent préférentiellement au niveau de sites anatomiques (soils) qui
fournissent à ces cellules un environnement optimal pour leur développement
568
. En accord
avec l’hypothèse de Paget, plusieurs études démontrent que l’invasion du péritoine par les
cellules tumorales ovariennes n’est pas simplement due à une proximité anatomique et que les
cellules mésothéliales de la paroi péritonéale peuvent interagir avec les cellules tumorales
ovariennes et favoriser leur dissémination dans la cavité péritonéale
528, 529
. Des lymphocytes
T spécifiques d’antigènes tumoraux ont été détecté dans 50% des patientes atteintes de
carcinome ovarien avancé indiquant que les cancers ovariens sont reconnus par le système
immunitaire 26, 569. Ces données suggèrent donc que les cellules tumorales ovariennes doivent
échapper au système immunitaire pour induire le développement de métastases dans des sites
anatomiques distants. La capacité des Hospicell, qui interagissent spécifiquement avec les
cellules tumorales ovariennes, à bloquer la prolifération et les fonctions effectrices des
lymphocytes T pourrait donc fournir un microenvironnement favorable aux cellules
ovariennes qui migrent dans la cavité péritonéale pour permettre l’établissement de
métastases.
140
IV.4 Origine des Hospicell.
Les Hospicell expriment les marqueurs de CD9, CD10, CD29, CD105, CD146 et
CD166. Ces marqueurs font partie des marqueurs communément retrouvés sur les MSC et
plus particulièrement sur les MSC issues du tissue adipeux (“adipose tissue derived stromal
cells” (ADSC)) 570. Les importantes fonctions immunosuppressives des Hospicell tout comme
les ADSC et les MSC laissent penser que les Hospicell pourraient s’apparenter à ces
dernières. Afin de clairement exclure cette possibilité, il serait nécessaire d’effectuer des tests
de différenciation classique en ostéoblastes, adipocytes et chondrocytes à partir d’Hospicell
fraichement isolées. Néanmoins, les Hospicell n’expriment pas les autres marqueurs
spécifiques des MSC et des ADSC comme la vimentine, CD73, CD90 et CD106 suggérant
que les Hospicell représentent un type cellulaire distinct.
L’équipe du Dr Mirshahi a pu démontrer qu’il était possible d’obtenir des cellules au
phénotype et à la morphologie comparable aux Hospicell issues de patientes atteintes de
l’ovaire en cultivant la fraction adhérente de cellules CD34+ purifiées à partir de prélèvements
de moelle osseuse de donneurs sains pendant 2 à 3 semaines dans du milieu pour cellules
endothéliales MV2 en présence de cellules de la lignée leucémique HL-60 (Dr Mihrshahi,
données non publiées). Etant donné la capacité des MSC à migrer au niveau de différents
types de tumeurs
511, 513
, on peut envisager que les Hospicell pourraient provenir de la
différenciation anormale de MSC ou d’ADSC sous l’influence de facteurs produits par les
tumeurs ovariennes comme cela a été démontré pour la différenciation des MSC en CAF
553
.
Il serait donc intéressant de tester cette hypothèse en analysant la différenciation des MSC en
présence de cellules tumorales ovariennes in vitro ou in vivo dans des modèles de xénogreffes
de tumeurs ovariennes en présence de MSC dans des souris immunodéficientes.
141
142
CONCLUSION GENERALE
143
144
De nombreuses études réalisées ces vingt dernières années ont pu valider le concept
d’immunosurveillance des cancers envisagé par Paul Ehrlich au début du 19éme siècle.
L’ensemble des connaissances actuelles dans ce domaine suggère que l’immunosurveillance
antitumorale est un processus complexe impliquant l’action concertée des différents effecteurs
de l’immunité innée comme les DC et les NK et de l’immunité adaptative comme les
lymphocytes T αβ CD4+ et CD8+
208
. De par leur large réactivité contre des tumeurs
d’origines diverses, les lymphocytes T Vγ9Vδ2, capables à la fois d’exercer des fonctions
cytotoxiques et de sécréter des cytokines pro-inflammatoires, participent également
activement aux défenses immunitaires antitumorales
165
. Malgré la présence de réponses
immunitaires antitumorales endogènes détectables chez de nombreux patients atteints de
cancers les résultats cliniques obtenus par les différents protocoles d’immunothérapie testés
jusqu’à présent sont assez décevant. En effet, les cellules tumorales peuvent employer de
multiples stratégies pour échapper au système immunitaire
208
. Par ailleurs, il est
communément admis que les cancers sont des entités cellulaires hétérogènes dont le
développement et la survie dépendent des interactions réciproques entre les cellules
initiatrices génétiquement altérées et le microenvironnement cellulaire dans lequel elles
vivent. Les études qui se sont intéressées au rôle des différentes cellules qui composent le
stroma tumoral dans le contexte de l’immunité antitumorale indiquent que de nombreux types
cellulaires modifiés ou recrutés par les tumeurs peuvent altérer les réponses immunitaires
antitumorales 374.
Il a récemment été démontré que les cellules souches mésenchymateuses sont
recrutées dans le stroma de différents types de tumeurs
511, 518
. Outre leur capacité à se
différencier en types cellulaires de différents lignages, les MSC présentent d’importantes
propriétés immunosuppressives qui leur permettent d’inhiber les fonctions de nombreux types
de cellules immunitaires
484
. Les travaux réalisés au cours de mon doctorat ont permis de
déterminer que les MSC, via leur sécrétion de PGE2, peuvent interférer avec les réponses
effectrices des lymphocytes T Vγ9Vδ2 in vitro suggérant que la présence des MSC ou de
PGE2 dans le microenvironnement tumoral pourrait constituer un obstacle aux futures
immunothérapies basées sur l’utilisation des lymphocytes T Vγ9Vδ2. Mes résultats indiquent
également que les MSC peuvent, en présence de cytokines pro-inflammatoires comme
l’IFNγ et le TNFα, sécréter un certains nombre de facteurs pro-tumoraux comme l’IL-6 et le
VEGF in vitro et stimuler la croissance des cellules tumorales in vivo indépendamment des
cellules immunitaires. Il a récemment été démontré que la destruction de constituants
cellulaires du microenvironnement tumoral comme les TAM ou les MDSC permettait de
145
restaurer les réponses immunitaires endogènes contre les cellules cancéreuses et ainsi de
bloquer la croissance tumorale
533, 571
. Etant donné la capacité des MSC à diminuer les
réponses immunitaires et à promouvoir la croissance tumorale le ciblage thérapeutique de ces
cellules ou des facteurs qu’elles produisent pourrait représenter une stratégie intéressante afin
d’améliorer les traitements antitumoraux actuels.
L’équipe du Dr Mirshahi a récemment isolé des cellules mésothéliales appelées
Hospicell qui sont en étroite interaction avec les cellules tumorales ovariennes dans la cavité
péritonéale où elles participent à la chimiorésistance des cellules tumorales
531
. Mes travaux
de thèse, qui démontrent que ces cellules peuvent empêcher la prolifération et la production
de cytokines des cellules T CD4+ et interférer directement avec les fonctions des effecteurs
cytotoxiques T CD8+ et T Vγ9Vδ2 in vitro, suggèrent que ces cellules pourraient participer à
l’échappement des cellules tumorales ovariennes aux réponses immunitaires et favoriser la
dissémination péritonéale des cancers ovariens. L’analyse phénotypique des Hospicell a
révélé que ces cellules expriment certains des marqueurs communément retrouvés sur les
MSC et plus particulièrement sur les MSC issues du tissue adipeux comme CD9, CD10,
CD29, CD105, CD146 et CD166
570
. Des futures études devront déterminer si les Hospicell
sont issues de la différenciation de MSC ou d’ADSC sous l’influence de facteurs produits par
les tumeurs ovariennes comme cela a deja été démontré pour la différenciation des MSC en
CAF
553
. Par ailleurs, une meilleure caractérisation phénotypique de ces cellules devrait
permettre à l’avenir de rechercher la présence d’Hospicell dans d’autres types de cancers afin
de déterminer si ces cellules constituent un type cellulaire communément impliqué dans
l’inhibition des réponses immunitaires antitumorales.
146
BIBLIOGRAPHIE
147
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
Dunn, G.P., Bruce, A.T., Ikeda, H., Old, L.J. & Schreiber, R.D. Cancer immunoediting: from
immunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol 3, 991-8 (2002).
Kristiansen, J.E., Hendricks, O. & Permin, H. [Letters from the Nobellaureter Paul Ehrlich to the
Director for the State Serum Institute in Copenhagen, Thorvald Madsen]. Dan Medicinhist Arbog, 17391 (2004).
Burnet, F.M. The concept of immunological surveillance. Prog Exp Tumor Res 13, 1-27 (1970).
Thomas, L. On immunosurveillance in human cancer. Yale J Biol Med 55, 329-33 (1982).
Rygaard, J. & Povlsen, C.O. The mouse mutant nude does not develop spontaneous tumours. An
argument against immunological surveillance. Acta Pathol Microbiol Scand [B] Microbiol Immunol 82,
99-106 (1974).
Maleckar, J.R. & Sherman, L.A. The composition of the T cell receptor repertoire in nude mice. J
Immunol 138, 3873-6 (1987).
Hayday, A.C. [gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of
protection. Annu Rev Immunol 18, 975-1026 (2000).
Dunn, G.P., Koebel, C.M. & Schreiber, R.D. Interferons, immunity and cancer immunoediting. Nat Rev
Immunol 6, 836-48 (2006).
Sheil, A.G. Cancer after transplantation. World J Surg 10, 389-96 (1986).
Boshoff, C. & Weiss, R. AIDS-related malignancies. Nat Rev Cancer 2, 373-82 (2002).
Shinkai, Y. et al. RAG-2-deficient mice lack mature lymphocytes owing to inability to initiate V(D)J
rearrangement. Cell 68, 855-67 (1992).
Shankaran, V. et al. IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape
tumour immunogenicity. Nature 410, 1107-11 (2001).
Smyth, M.J., Dunn, G.P. & Schreiber, R.D. Cancer immunosurveillance and immunoediting: the roles
of immunity in suppressing tumor development and shaping tumor immunogenicity. Adv Immunol 90,
1-50 (2006).
Willimsky, G. & Blankenstein, T. The adaptive immune response to sporadic cancer. Immunol Rev 220,
102-12 (2007).
Qin, Z. et al. B cells inhibit induction of T cell-dependent tumor immunity. Nat Med 4, 627-30 (1998).
de Visser, K.E., Korets, L.V. & Coussens, L.M. De novo carcinogenesis promoted by chronic
inflammation is B lymphocyte dependent. Cancer Cell 7, 411-23 (2005).
Cronin, S.J. & Penninger, J.M. From T-cell activation signals to signaling control of anti-cancer
immunity. Immunol Rev 220, 151-68 (2007).
Miyasaka, M. & Tanaka, T. Lymphocyte trafficking across high endothelial venules: dogmas and
enigmas. Nat Rev Immunol 4, 360-70 (2004).
Shortman, K. & Liu, Y.J. Mouse and human dendritic cell subtypes. Nat Rev Immunol 2, 151-61
(2002).
Linsley, P.S. & Ledbetter, J.A. The role of the CD28 receptor during T cell responses to antigen. Annu
Rev Immunol 11, 191-212 (1993).
Acuto, O. & Michel, F. CD28-mediated co-stimulation: a quantitative support for TCR signalling. Nat
Rev Immunol 3, 939-51 (2003).
Croft, M. Co-stimulatory members of the TNFR family: keys to effective T-cell immunity? Nat Rev
Immunol 3, 609-20 (2003).
Chauvenet, P.H., McArthur, C.P. & Smith, R.T. Demonstration in vitro of cytotoxic T cells with
apparent specificity toward tumor-specific transplantation antigens on chemically induced tumors. J
Immunol 123, 2575-81 (1979).
Burton, R.C., Chism, S.E. & Warner, N.L. In vitro induction of tumor specific immunity. VII. Does
autosensitization occur with in vitro culture of T lymphocytes? J Immunol 119, 1329-39 (1977).
van der Bruggen, P. et al. A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a
human melanoma. Science 254, 1643-7 (1991).
Sato, E. et al. Intraepithelial CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes and a high CD8+/regulatory T cell
ratio are associated with favorable prognosis in ovarian cancer. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 1853843 (2005).
Sharma, P. et al. CD8 tumor-infiltrating lymphocytes are predictive of survival in muscle-invasive
urothelial carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 3967-72 (2007).
Kondratiev, S., Sabo, E., Yakirevich, E., Lavie, O. & Resnick, M.B. Intratumoral CD8+ T lymphocytes
as a prognostic factor of survival in endometrial carcinoma. Clin Cancer Res 10, 4450-6 (2004).
Marrogi, A.J. et al. Study of tumor infiltrating lymphocytes and transforming growth factor-beta as
prognostic factors in breast carcinoma. Int J Cancer 74, 492-501 (1997).
Nakano, O. et al. Proliferative activity of intratumoral CD8(+) T-lymphocytes as a prognostic factor in
human renal cell carcinoma: clinicopathologic demonstration of antitumor immunity. Cancer Res 61,
5132-6 (2001).
148
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
Schumacher, K., Haensch, W., Roefzaad, C. & Schlag, P.M. Prognostic significance of activated
CD8(+) T cell infiltrations within esophageal carcinomas. Cancer Res 61, 3932-6 (2001).
Barry, M. & Bleackley, R.C. Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death. Nat Rev Immunol 2,
401-9 (2002).
Lieberman, J. The ABCs of granule-mediated cytotoxicity: new weapons in the arsenal. Nat Rev
Immunol 3, 361-70 (2003).
Shresta, S., Graubert, T.A., Thomas, D.A., Raptis, S.Z. & Ley, T.J. Granzyme A initiates an alternative
pathway for granule-mediated apoptosis. Immunity 10, 595-605 (1999).
Darmon, A.J., Nicholson, D.W. & Bleackley, R.C. Activation of the apoptotic protease CPP32 by
cytotoxic T-cell-derived granzyme B. Nature 377, 446-8 (1995).
Heusel, J.W., Wesselschmidt, R.L., Shresta, S., Russell, J.H. & Ley, T.J. Cytotoxic lymphocytes require
granzyme B for the rapid induction of DNA fragmentation and apoptosis in allogeneic target cells. Cell
76, 977-87 (1994).
Mullbacher, A. et al. Granzyme A is critical for recovery of mice from infection with the natural
cytopathic viral pathogen, ectromelia. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 5783-7 (1996).
Kagi, D., Ledermann, B., Burki, K., Zinkernagel, R.M. & Hengartner, H. Molecular mechanisms of
lymphocyte-mediated cytotoxicity and their role in immunological protection and pathogenesis in vivo.
Annu Rev Immunol 14, 207-32 (1996).
Smyth, M.J. et al. Perforin-mediated cytotoxicity is critical for surveillance of spontaneous lymphoma.
J Exp Med 192, 755-60 (2000).
Shresta, S., Pham, C.T., Thomas, D.A., Graubert, T.A. & Ley, T.J. How do cytotoxic lymphocytes kill
their targets? Curr Opin Immunol 10, 581-7 (1998).
Froelich, C.J. et al. New paradigm for lymphocyte granule-mediated cytotoxicity. Target cells bind and
internalize granzyme B, but an endosomolytic agent is necessary for cytosolic delivery and subsequent
apoptosis. J Biol Chem 271, 29073-9 (1996).
Motyka, B. et al. Mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor is a death receptor for
granzyme B during cytotoxic T cell-induced apoptosis. Cell 103, 491-500 (2000).
Trapani, J.A. et al. A clathrin/dynamin- and mannose-6-phosphate receptor-independent pathway for
granzyme B-induced cell death. J Cell Biol 160, 223-33 (2003).
Browne, K.A. et al. Cytosolic delivery of granzyme B by bacterial toxins: evidence that endosomal
disruption, in addition to transmembrane pore formation, is an important function of perforin. Mol Cell
Biol 19, 8604-15 (1999).
Gamen, S. et al. Granulysin-induced apoptosis. I. Involvement of at least two distinct pathways. J
Immunol 161, 1758-64 (1998).
Stenger, S. et al. An antimicrobial activity of cytolytic T cells mediated by granulysin. Science 282,
121-5 (1998).
Bossi, G. et al. The secretory synapse: the secrets of a serial killer. Immunol Rev 189, 152-60 (2002).
Stinchcombe, J.C., Bossi, G., Booth, S. & Griffiths, G.M. The immunological synapse of CTL contains
a secretory domain and membrane bridges. Immunity 15, 751-61 (2001).
Peter, M.E. & Krammer, P.H. Mechanisms of CD95 (APO-1/Fas)-mediated apoptosis. Curr Opin
Immunol 10, 545-51 (1998).
Wallach, D. et al. Tumor necrosis factor receptor and Fas signaling mechanisms. Annu Rev Immunol 17,
331-67 (1999).
Russell, J.H. & Ley, T.J. Lymphocyte-mediated cytotoxicity. Annu Rev Immunol 20, 323-70 (2002).
Mitchison, N.A. The carrier effect in the secondary response to hapten-protein conjugates. I.
Measurement of the effect with transferred cells and objections to the local environment hypothesis.
Eur J Immunol 1, 10-7 (1971).
Murphy, K.M. & Reiner, S.L. The lineage decisions of helper T cells. Nat Rev Immunol 2, 933-44
(2002).
Mosmann, T.R., Cherwinski, H., Bond, M.W., Giedlin, M.A. & Coffman, R.L. Two types of murine
helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J
Immunol 136, 2348-57 (1986).
Szabo, S.J. et al. A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell 100, 655-69
(2000).
Zheng, W. & Flavell, R.A. The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2
cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell 89, 587-96 (1997).
Stockinger, B. & Veldhoen, M. Differentiation and function of Th17 T cells. Curr Opin Immunol 19,
281-6 (2007).
Kryczek, I. et al. Cutting edge: Th17 and regulatory T cell dynamics and the regulation by IL-2 in the
tumor microenvironment. J Immunol 178, 6730-3 (2007).
Muranski, P. et al. Tumor-specific Th17-polarized cells eradicate large established melanoma. Blood
112, 362-73 (2008).
149
60.
61.
62.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
82.
83.
84.
85.
86.
87.
88.
89.
Zhang, B. et al. The prevalence of Th17 cells in patients with gastric cancer. Biochem Biophys Res
Commun 374, 533-7 (2008).
Lin, W.W. & Karin, M. A cytokine-mediated link between innate immunity, inflammation, and cancer.
J Clin Invest 117, 1175-83 (2007).
Hung, K. et al. The central role of CD4(+) T cells in the antitumor immune response. J Exp Med 188,
2357-68 (1998).
Ossendorp, F., Mengede, E., Camps, M., Filius, R. & Melief, C.J. Specific T helper cell requirement for
optimal induction of cytotoxic T lymphocytes against major histocompatibility complex class II
negative tumors. J Exp Med 187, 693-702 (1998).
Kennedy, R. & Celis, E. Multiple roles for CD4+ T cells in anti-tumor immune responses. Immunol Rev
222, 129-44 (2008).
Janssen, E.M. et al. CD4+ T cells are required for secondary expansion and memory in CD8+ T
lymphocytes. Nature 421, 852-6 (2003).
Shedlock, D.J. & Shen, H. Requirement for CD4 T cell help in generating functional CD8 T cell
memory. Science 300, 337-9 (2003).
Fallarino, F. et al. Th1 and Th2 cell clones to a poorly immunogenic tumor antigen initiate CD8+ T
cell-dependent tumor eradication in vivo. J Immunol 165, 5495-501 (2000).
Schoenberger, S.P., Toes, R.E., van der Voort, E.I., Offringa, R. & Melief, C.J. T-cell help for cytotoxic
T lymphocytes is mediated by CD40-CD40L interactions. Nature 393, 480-3 (1998).
Bourgeois, C., Rocha, B. & Tanchot, C. A role for CD40 expression on CD8+ T cells in the generation
of CD8+ T cell memory. Science 297, 2060-3 (2002).
Williams, M.A., Tyznik, A.J. & Bevan, M.J. Interleukin-2 signals during priming are required for
secondary expansion of CD8+ memory T cells. Nature 441, 890-3 (2006).
Wang, R.F. The role of MHC class II-restricted tumor antigens and CD4+ T cells in antitumor
immunity. Trends Immunol 22, 269-76 (2001).
Kataoka, S., Konishi, Y., Nishio, Y., Fujikawa-Adachi, K. & Tominaga, A. Antitumor activity of
eosinophils activated by IL-5 and eotaxin against hepatocellular carcinoma. DNA Cell Biol 23, 549-60
(2004).
Mumberg, D. et al. CD4(+) T cells eliminate MHC class II-negative cancer cells in vivo by indirect
effects of IFN-gamma. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 8633-8 (1999).
Qin, Z. & Blankenstein, T. CD4+ T cell--mediated tumor rejection involves inhibition of angiogenesis
that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells. Immunity 12, 677-86
(2000).
Schattner, E.J. et al. CD4+ T-cell induction of Fas-mediated apoptosis in Burkitt's lymphoma B cells.
Blood 88, 1375-82 (1996).
Thomas, W.D. & Hersey, P. TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) induces apoptosis in Fas
ligand-resistant melanoma cells and mediates CD4 T cell killing of target cells. J Immunol 161, 2195200 (1998).
Huang, A.Y. et al. Role of bone marrow-derived cells in presenting MHC class I-restricted tumor
antigens. Science 264, 961-5 (1994).
Pulendran, B., Palucka, K. & Banchereau, J. Sensing pathogens and tuning immune responses. Science
293, 253-6 (2001).
Savina, A. & Amigorena, S. Phagocytosis and antigen presentation in dendritic cells. Immunol Rev 219,
143-56 (2007).
Albert, M.L., Sauter, B. & Bhardwaj, N. Dendritic cells acquire antigen from apoptotic cells and induce
class I-restricted CTLs. Nature 392, 86-9 (1998).
Steinman, R.M. & Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature 449, 419-26 (2007).
Janeway, C.A., Jr. Approaching the asymptote? Evolution and revolution in immunology. Cold Spring
Harb Symp Quant Biol 54 Pt 1, 1-13 (1989).
Matzinger, P. Tolerance, danger, and the extended family. Annu Rev Immunol 12, 991-1045 (1994).
Gallucci, S., Lolkema, M. & Matzinger, P. Natural adjuvants: endogenous activators of dendritic cells.
Nat Med 5, 1249-55 (1999).
Kono, H. & Rock, K.L. How dying cells alert the immune system to danger. Nat Rev Immunol 8, 27989 (2008).
Shi, Y., Evans, J.E. & Rock, K.L. Molecular identification of a danger signal that alerts the immune
system to dying cells. Nature 425, 516-21 (2003).
Hu, D.E., Moore, A.M., Thomsen, L.L. & Brindle, K.M. Uric acid promotes tumor immune rejection.
Cancer Res 64, 5059-62 (2004).
Scaffidi, P., Misteli, T. & Bianchi, M.E. Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers
inflammation. Nature 418, 191-5 (2002).
Apetoh, L. et al. Toll-like receptor 4-dependent contribution of the immune system to anticancer
chemotherapy and radiotherapy. Nat Med 13, 1050-9 (2007).
150
90.
91.
92.
93.
94.
95.
96.
97.
98.
99.
100.
101.
102.
103.
104.
105.
106.
107.
108.
109.
110.
111.
112.
113.
114.
115.
116.
117.
118.
Williams, R.C., Jr., DeBoard, J.R., Mellbye, O.J., Messner, R.P. & Lindstrom, F.D. Studies of T- and
B-lymphocytes in patients with connective tissue diseases. J Clin Invest 52, 283-95 (1973).
Herberman, R.B., Nunn, M.E. & Lavrin, D.H. Natural cytotoxic reactivity of mouse lymphoid cells
against syngeneic acid allogeneic tumors. I. Distribution of reactivity and specificity. Int J Cancer 16,
216-29 (1975).
Kiessling, R., Klein, E. & Wigzell, H. "Natural" killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with
specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype. Eur J
Immunol 5, 112-7 (1975).
Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T. & Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nat
Immunol 9, 503-10 (2008).
Terme, M., Ullrich, E., Delahaye, N.F., Chaput, N. & Zitvogel, L. Natural killer cell-directed therapies:
moving from unexpected results to successful strategies. Nat Immunol 9, 486-94 (2008).
Imai, K., Matsuyama, S., Miyake, S., Suga, K. & Nakachi, K. Natural cytotoxic activity of peripheralblood lymphocytes and cancer incidence: an 11-year follow-up study of a general population. Lancet
356, 1795-9 (2000).
Smyth, M.J. et al. Differential tumor surveillance by natural killer (NK) and NKT cells. J Exp Med 191,
661-8 (2000).
Smyth, M.J., Crowe, N.Y. & Godfrey, D.I. NK cells and NKT cells collaborate in host protection from
methylcholanthrene-induced fibrosarcoma. Int Immunol 13, 459-63 (2001).
Smyth, M.J. et al. NKG2D function protects the host from tumor initiation. J Exp Med 202, 583-8
(2005).
van den Broek, M.F., Kagi, D., Zinkernagel, R.M. & Hengartner, H. Perforin dependence of natural
killer cell-mediated tumor control in vivo. Eur J Immunol 25, 3514-6 (1995).
Smyth, M.J. et al. Perforin is a major contributor to NK cell control of tumor metastasis. J Immunol
162, 6658-62 (1999).
Smyth, M.J., Street, S.E. & Trapani, J.A. Cutting edge: granzymes A and B are not essential for
perforin-mediated tumor rejection. J Immunol 171, 515-8 (2003).
Takeda, K. et al. Involvement of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in surveillance
of tumor metastasis by liver natural killer cells. Nat Med 7, 94-100 (2001).
Takeda, K. et al. Critical role for tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in immune
surveillance against tumor development. J Exp Med 195, 161-9 (2002).
Liu, C. et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell
cross-priming and tumor regression in mice. J Clin Invest 118, 1165-75 (2008).
Walzer, T., Dalod, M., Robbins, S.H., Zitvogel, L. & Vivier, E. Natural-killer cells and dendritic cells:
"l'union fait la force". Blood 106, 2252-8 (2005).
Lanier, L.L. Up on the tightrope: natural killer cell activation and inhibition. Nat Immunol 9, 495-502
(2008).
Raulet, D.H. & Vance, R.E. Self-tolerance of natural killer cells. Nat Rev Immunol 6, 520-31 (2006).
Ljunggren, H.G. & Karre, K. Host resistance directed selectively against H-2-deficient lymphoma
variants. Analysis of the mechanism. J Exp Med 162, 1745-59 (1985).
Karre, K., Ljunggren, H.G., Piontek, G. & Kiessling, R. Selective rejection of H-2-deficient lymphoma
variants suggests alternative immune defence strategy. Nature 319, 675-8 (1986).
Moretta, L. & Moretta, A. Killer immunoglobulin-like receptors. Curr Opin Immunol 16, 626-33
(2004).
Shiroishi, M. et al. Human inhibitory receptors Ig-like transcript 2 (ILT2) and ILT4 compete with CD8
for MHC class I binding and bind preferentially to HLA-G. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 8856-61
(2003).
Braud, V.M. et al. HLA-E binds to natural killer cell receptors CD94/NKG2A, B and C. Nature 391,
795-9 (1998).
Bryceson, Y.T., March, M.E., Ljunggren, H.G. & Long, E.O. Synergy among receptors on resting NK
cells for the activation of natural cytotoxicity and cytokine secretion. Blood 107, 159-66 (2006).
Bottino, C., Castriconi, R., Moretta, L. & Moretta, A. Cellular ligands of activating NK receptors.
Trends Immunol 26, 221-6 (2005).
Moretta, A. et al. Activating receptors and coreceptors involved in human natural killer cell-mediated
cytolysis. Annu Rev Immunol 19, 197-223 (2001).
Wu, J. et al. An activating immunoreceptor complex formed by NKG2D and DAP10. Science 285, 7302 (1999).
Upshaw, J.L. et al. NKG2D-mediated signaling requires a DAP10-bound Grb2-Vav1 intermediate and
phosphatidylinositol-3-kinase in human natural killer cells. Nat Immunol 7, 524-32 (2006).
Billadeau, D.D., Upshaw, J.L., Schoon, R.A., Dick, C.J. & Leibson, P.J. NKG2D-DAP10 triggers
human NK cell-mediated killing via a Syk-independent regulatory pathway. Nat Immunol 4, 557-64
(2003).
151
119.
120.
121.
122.
123.
124.
125.
126.
127.
128.
129.
130.
131.
132.
133.
134.
135.
136.
137.
138.
139.
140.
141.
142.
143.
144.
145.
146.
147.
148.
149.
150.
Horng, T., Bezbradica, J.S. & Medzhitov, R. NKG2D signaling is coupled to the interleukin 15 receptor
signaling pathway. Nat Immunol 8, 1345-52 (2007).
Vivier, E., Nunes, J.A. & Vely, F. Natural killer cell signaling pathways. Science 306, 1517-9 (2004).
Raulet, D.H. Roles of the NKG2D immunoreceptor and its ligands. Nat Rev Immunol 3, 781-90 (2003).
Diefenbach, A., Jensen, E.R., Jamieson, A.M. & Raulet, D.H. Rae1 and H60 ligands of the NKG2D
receptor stimulate tumour immunity. Nature 413, 165-71 (2001).
Anfossi, N. et al. Human NK cell education by inhibitory receptors for MHC class I. Immunity 25, 33142 (2006).
Kim, S. et al. Licensing of natural killer cells by host major histocompatibility complex class I
molecules. Nature 436, 709-13 (2005).
Fernandez, N.C. et al. A subset of natural killer cells achieves self-tolerance without expressing
inhibitory receptors specific for self-MHC molecules. Blood 105, 4416-23 (2005).
Walzer, T., Jaeger, S., Chaix, J. & Vivier, E. Natural killer cells: from CD3(-)NKp46(+) to postgenomics meta-analyses. Curr Opin Immunol 19, 365-72 (2007).
Fehniger, T.A. et al. CD56bright natural killer cells are present in human lymph nodes and are activated
by T cell-derived IL-2: a potential new link between adaptive and innate immunity. Blood 101, 3052-7
(2003).
Cooper, M.A., Fehniger, T.A. & Caligiuri, M.A. The biology of human natural killer-cell subsets.
Trends Immunol 22, 633-40 (2001).
Lucas, M., Schachterle, W., Oberle, K., Aichele, P. & Diefenbach, A. Dendritic cells prime natural
killer cells by trans-presenting interleukin 15. Immunity 26, 503-17 (2007).
Bank, I. et al. A functional T3 molecule associated with a novel heterodimer on the surface of immature
human thymocytes. Nature 322, 179-81 (1986).
Brenner, M.B. et al. Identification of a putative second T-cell receptor. Nature 322, 145-9 (1986).
McVay, L.D. & Carding, S.R. Generation of human gammadelta T-cell repertoires. Crit Rev Immunol
19, 431-60 (1999).
Carding, S.R. & Egan, P.J. Gammadelta T cells: functional plasticity and heterogeneity. Nat Rev
Immunol 2, 336-45 (2002).
McVay, L.D. & Carding, S.R. Extrathymic origin of human gamma delta T cells during fetal
development. J Immunol 157, 2873-82 (1996).
Hayday, A.C. & Pennington, D.J. Key factors in the organized chaos of early T cell development. Nat
Immunol 8, 137-44 (2007).
Deusch, K. et al. A major fraction of human intraepithelial lymphocytes simultaneously expresses the
gamma/delta T cell receptor, the CD8 accessory molecule and preferentially uses the V delta 1 gene
segment. Eur J Immunol 21, 1053-9 (1991).
Triebel, F. et al. A unique V-J-C-rearranged gene encodes a gamma protein expressed on the majority
of CD3+ T cell receptor-alpha/beta- circulating lymphocytes. J Exp Med 167, 694-9 (1988).
Davodeau, F. et al. Peripheral selection of antigen receptor junctional features in a major human gamma
delta subset. Eur J Immunol 23, 804-8 (1993).
Parker, C.M. et al. Evidence for extrathymic changes in the T cell receptor gamma/delta repertoire. J
Exp Med 171, 1597-612 (1990).
De Rosa, S.C. et al. Ontogeny of gamma delta T cells in humans. J Immunol 172, 1637-45 (2004).
Caccamo, N., Dieli, F., Wesch, D., Jomaa, H. & Eberl, M. Sex-specific phenotypical and functional
differences in peripheral human Vgamma9/Vdelta2 T cells. J Leukoc Biol 79, 663-6 (2006).
Argentati, K. et al. Numerical and functional alterations of circulating gammadelta T lymphocytes in
aged people and centenarians. J Leukoc Biol 72, 65-71 (2002).
Poupot, M. & Fournie, J.J. Non-peptide antigens activating human Vgamma9/Vdelta2 T lymphocytes.
Immunol Lett 95, 129-38 (2004).
Morita, C.T. et al. Direct presentation of nonpeptide prenyl pyrophosphate antigens to human gamma
delta T cells. Immunity 3, 495-507 (1995).
Ito, M. et al. Increased proportions of peripheral blood gamma delta T cells in patients with pulmonary
tuberculosis. Chest 102, 195-7 (1992).
Constant, P. et al. Stimulation of human gamma delta T cells by nonpeptidic mycobacterial ligands.
Science 264, 267-70 (1994).
Tanaka, Y. et al. Natural and synthetic non-peptide antigens recognized by human gamma delta T cells.
Nature 375, 155-8 (1995).
Belmant, C. et al. 3-Formyl-1-butyl pyrophosphate A novel mycobacterial metabolite-activating human
gammadelta T cells. J Biol Chem 274, 32079-84 (1999).
Hintz, M. et al. Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator
for human gammadelta T cells in Escherichia coli. FEBS Lett 509, 317-22 (2001).
Feurle, J. et al. Escherichia coli produces phosphoantigens activating human gamma delta T cells. J Biol
Chem 277, 148-54 (2002).
152
151.
152.
153.
154.
155.
156.
157.
158.
159.
160.
161.
162.
163.
164.
165.
166.
167.
168.
169.
170.
171.
172.
173.
174.
175.
176.
177.
178.
179.
Fischer, S., Scheffler, A. & Kabelitz, D. Activation of human gamma delta T-cells by heat-treated
mistletoe plant extracts. Immunol Lett 52, 69-72 (1996).
Espinosa, E. et al. Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent
stimulator of human gamma delta T cells. J Biol Chem 276, 18337-44 (2001).
Shen, Y. et al. Adaptive immune response of Vgamma2Vdelta2+ T cells during mycobacterial
infections. Science 295, 2255-8 (2002).
Raziuddin, S., Mir, N.A., el-Awad, M.e.-H., Telmesani, A.W. & al-Janadi, M. Gamma delta T
lymphocytes and proinflammatory cytokines in bacterial meningitis. J Allergy Clin Immunol 93, 793-8
(1994).
Ho, M., Webster, H.K., Tongtawe, P., Pattanapanyasat, K. & Weidanz, W.P. Increased gamma delta T
cells in acute Plasmodium falciparum malaria. Immunol Lett 25, 139-41 (1990).
Scalise, F. et al. Lymphocytes bearing the gamma delta T-cell receptor in acute toxoplasmosis.
Immunology 76, 668-70 (1992).
Raziuddin, S., Telmasani, A.W., el-Hag el-Awad, M., al-Amari, O. & al-Janadi, M. Gamma delta T
cells and the immune response in visceral leishmaniasis. Eur J Immunol 22, 1143-8 (1992).
Fisch, P. et al. Recognition by human V gamma 9/V delta 2 T cells of a GroEL homolog on Daudi
Burkitt's lymphoma cells. Science 250, 1269-73 (1990).
Ensslin, A.S. & Formby, B. Comparison of cytolytic and proliferative activities of human gamma delta
and alpha beta T cells from peripheral blood against various human tumor cell lines. J Natl Cancer Inst
83, 1564-9 (1991).
Kunzmann, V., Bauer, E. & Wilhelm, M. Gamma/delta T-cell stimulation by pamidronate. N Engl J
Med 340, 737-8 (1999).
Gober, H.J. et al. Human T cell receptor gammadelta cells recognize endogenous mevalonate
metabolites in tumor cells. J Exp Med 197, 163-8 (2003).
Thompson, K. & Rogers, M.J. Statins prevent bisphosphonate-induced gamma,delta-T-cell proliferation
and activation in vitro. J Bone Miner Res 19, 278-88 (2004).
Uchida, R. et al. Gamma delta T cells kill myeloma cells by sensing mevalonate metabolites and
ICAM-1 molecules on cell surface. Biochem Biophys Res Commun 354, 613-8 (2007).
Kistowska, M. et al. Dysregulation of the host mevalonate pathway during early bacterial infection
activates human TCR gamma delta cells. Eur J Immunol 38, 2200-9 (2008).
Bonneville, M. & Fournie, J.J. Sensing cell stress and transformation through Vgamma9Vdelta2 T cellmediated recognition of the isoprenoid pathway metabolites. Microbes Infect 7, 503-9 (2005).
Bukowski, J.F. et al. V gamma 2V delta 2 TCR-dependent recognition of non-peptide antigens and
Daudi cells analyzed by TCR gene transfer. J Immunol 154, 998-1006 (1995).
Miyagawa, F. et al. Essential contribution of germline-encoded lysine residues in Jgamma1.2 segment
to the recognition of nonpeptide antigens by human gammadelta T cells. J Immunol 167, 6773-9 (2001).
Allison, T.J., Winter, C.C., Fournie, J.J., Bonneville, M. & Garboczi, D.N. Structure of a human
gammadelta T-cell antigen receptor. Nature 411, 820-4 (2001).
Gossman, W. & Oldfield, E. Quantitative structure--activity relations for gammadelta T cell activation
by phosphoantigens. J Med Chem 45, 4868-74 (2002).
Lang, F. et al. Early activation of human V gamma 9V delta 2 T cell broad cytotoxicity and TNF
production by nonpeptidic mycobacterial ligands. J Immunol 154, 5986-94 (1995).
Champagne, E., Martinez, L.O., Vantourout, P., Collet, X. & Barbaras, R. Role of apolipoproteins in
gammadelta and NKT cell-mediated innate immunity. Immunol Res 33, 241-55 (2005).
Dieli, F. et al. Differentiation of effector/memory Vdelta2 T cells and migratory routes in lymph nodes
or inflammatory sites. J Exp Med 198, 391-7 (2003).
Angelini, D.F. et al. FcgammaRIII discriminates between 2 subsets of Vgamma9Vdelta2 effector cells
with different responses and activation pathways. Blood 104, 1801-7 (2004).
Caccamo, N. et al. Differential requirements for antigen or homeostatic cytokines for proliferation and
differentiation of human Vgamma9Vdelta2 naive, memory and effector T cell subsets. Eur J Immunol
35, 1764-72 (2005).
Morita, C.T. et al. Functionally distinct subsets of human gamma/delta T cells. Eur J Immunol 21,
2999-3007 (1991).
Elloso, M.M., van der Heyde, H.C., Troutt, A., Manning, D.D. & Weidanz, W.P. Human gamma delta
T cell subset-proliferative response to malarial antigen in vitro depends on CD4+ T cells or cytokines
that signal through components of the IL-2R. J Immunol 157, 2096-102 (1996).
Caccamo, N. et al. CXCR5 identifies a subset of Vgamma9Vdelta2 T cells which secrete IL-4 and IL10 and help B cells for antibody production. J Immunol 177, 5290-5 (2006).
Gioia, C. et al. Lack of CD27-CD45RA-V gamma 9V delta 2+ T cell effectors in immunocompromised
hosts and during active pulmonary tuberculosis. J Immunol 168, 1484-9 (2002).
Boismenu, R. & Havran, W.L. Gammadelta T cells in host defense and epithelial cell biology. Clin
Immunol Immunopathol 86, 121-33 (1998).
153
180.
181.
182.
183.
184.
185.
186.
187.
188.
189.
190.
191.
192.
193.
194.
195.
196.
197.
198.
199.
200.
201.
202.
203.
204.
205.
206.
Girardi, M. et al. Regulation of cutaneous malignancy by gammadelta T cells. Science 294, 605-9
(2001).
Girardi, M. et al. The distinct contributions of murine T cell receptor (TCR)gammadelta+ and
TCRalphabeta+ T cells to different stages of chemically induced skin cancer. J Exp Med 198, 747-55
(2003).
Zocchi, M.R., Ferrarini, M. & Rugarli, C. Selective lysis of the autologous tumor by delta TCS1+
gamma/delta+ tumor-infiltrating lymphocytes from human lung carcinomas. Eur J Immunol 20, 2685-9
(1990).
Choudhary, A. et al. Selective lysis of autologous tumor cells by recurrent gamma delta tumorinfiltrating lymphocytes from renal carcinoma. J Immunol 154, 3932-40 (1995).
Paolieri, F. et al. Infiltrating gamma/delta T-cell receptor-positive lymphocytes in Hashimoto's
thyroiditis, Graves' disease and papillary thyroid cancer. J Endocrinol Invest 18, 295-8 (1995).
Kowalczyk, D., Skorupski, W., Kwias, Z. & Nowak, J. Activated gamma/delta T lymphocytes
infiltrating renal cell carcinoma. Immunol Lett 53, 15-8 (1996).
Raspollini, M.R. et al. Tumour-infiltrating gamma/delta T-lymphocytes are correlated with a brief
disease-free interval in advanced ovarian serous carcinoma. Ann Oncol 16, 590-6 (2005).
Kuriyama, Y., Kawanishi, Y., Otawa, M., Utsumi, K. & Ohyashiki, K. Circulating and tumorinfiltrating gamma delta T Cells in patients with B-cell lymphomas. Leuk Lymphoma 39, 321-7 (2000).
Bank, I. et al. V delta 2+ gamma delta T lymphocytes are cytotoxic to the MCF 7 breast carcinoma cell
line and can be detected among the T cells that infiltrate breast tumors. Clin Immunol Immunopathol 67,
17-24 (1993).
Fisch, P. et al. Control of B cell lymphoma recognition via natural killer inhibitory receptors implies a
role for human Vgamma9/Vdelta2 T cells in tumor immunity. Eur J Immunol 27, 3368-79 (1997).
Corvaisier, M. et al. V gamma 9V delta 2 T cell response to colon carcinoma cells. J Immunol 175,
5481-8 (2005).
Viey, E. et al. Phosphostim-activated gamma delta T cells kill autologous metastatic renal cell
carcinoma. J Immunol 174, 1338-47 (2005).
Liu, Z., Guo, B.L., Gehrs, B.C., Nan, L. & Lopez, R.D. Ex vivo expanded human Vgamma9Vdelta2+
gammadelta-T cells mediate innate antitumor activity against human prostate cancer cells in vitro. J
Urol 173, 1552-6 (2005).
Kunzmann, V. et al. Stimulation of gammadelta T cells by aminobisphosphonates and induction of
antiplasma cell activity in multiple myeloma. Blood 96, 384-92 (2000).
Schilbach, K.E., Geiselhart, A., Wessels, J.T., Niethammer, D. & Handgretinger, R. Human
gammadelta T lymphocytes exert natural and IL-2-induced cytotoxicity to neuroblastoma cells. J
Immunother (1997) 23, 536-48 (2000).
Kabelitz, D., Wesch, D., Pitters, E. & Zoller, M. Characterization of tumor reactivity of human V
gamma 9V delta 2 gamma delta T cells in vitro and in SCID mice in vivo. J Immunol 173, 6767-76
(2004).
Wilhelm, M. et al. Gammadelta T cells for immune therapy of patients with lymphoid malignancies.
Blood 102, 200-6 (2003).
Sayers, T.J. et al. The restricted expression of granzyme M in human lymphocytes. J Immunol 166,
765-71 (2001).
Li, B. et al. Involvement of the Fas/Fas ligand pathway in activation-induced cell death of
mycobacteria-reactive human gamma delta T cells: a mechanism for the loss of gamma delta T cells in
patients with pulmonary tuberculosis. J Immunol 161, 1558-67 (1998).
Halary, F. et al. Control of self-reactive cytotoxic T lymphocytes expressing gamma delta T cell
receptors by natural killer inhibitory receptors. Eur J Immunol 27, 2812-21 (1997).
Fisch, P., Moris, A., Rammensee, H.G. & Handgretinger, R. Inhibitory MHC class I receptors on
gammadelta T cells in tumour immunity and autoimmunity. Immunol Today 21, 187-91 (2000).
Rincon-Orozco, B. et al. Activation of V gamma 9V delta 2 T cells by NKG2D. J Immunol 175, 214451 (2005).
Das, H. et al. MICA engagement by human Vgamma2Vdelta2 T cells enhances their antigen-dependent
effector function. Immunity 15, 83-93 (2001).
Gao, Y. et al. Gamma delta T cells provide an early source of interferon gamma in tumor immunity. J
Exp Med 198, 433-42 (2003).
Ismaili, J., Olislagers, V., Poupot, R., Fournie, J.J. & Goldman, M. Human gamma delta T cells induce
dendritic cell maturation. Clin Immunol 103, 296-302 (2002).
Conti, L. et al. Reciprocal activating interaction between dendritic cells and pamidronate-stimulated
gammadelta T cells: role of CD86 and inflammatory cytokines. J Immunol 174, 252-60 (2005).
Dieli, F. et al. Reciprocal stimulation of gammadelta T cells and dendritic cells during the antimycobacterial immune response. Eur J Immunol 34, 3227-35 (2004).
154
207.
208.
209.
210.
211.
212.
213.
214.
215.
216.
217.
218.
219.
220.
221.
222.
223.
224.
225.
226.
227.
228.
229.
230.
231.
232.
233.
Devilder, M.C. et al. Potentiation of antigen-stimulated V gamma 9V delta 2 T cell cytokine production
by immature dendritic cells (DC) and reciprocal effect on DC maturation. J Immunol 176, 1386-93
(2006).
Zitvogel, L., Tesniere, A. & Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and
immunosubversion. Nat Rev Immunol 6, 715-27 (2006).
Dunn, G.P., Old, L.J. & Schreiber, R.D. The immunobiology of cancer immunosurveillance and
immunoediting. Immunity 21, 137-48 (2004).
Svane, I.M. et al. Chemically induced sarcomas from nude mice are more immunogenic than similar
sarcomas from congenic normal mice. Eur J Immunol 26, 1844-50 (1996).
Penn, I. Malignant melanoma in organ allograft recipients. Transplantation 61, 274-8 (1996).
MacKie, R.M., Reid, R. & Junor, B. Fatal melanoma transferred in a donated kidney 16 years after
melanoma surgery. N Engl J Med 348, 567-8 (2003).
Sakr, W.A. & Partin, A.W. Histological markers of risk and the role of high-grade prostatic
intraepithelial neoplasia. Urology 57, 115-20 (2001).
Welch, H.G. & Black, W.C. Using autopsy series to estimate the disease "reservoir" for ductal
carcinoma in situ of the breast: how much more breast cancer can we find? Ann Intern Med 127, 1023-8
(1997).
Koebel, C.M. et al. Adaptive immunity maintains occult cancer in an equilibrium state. Nature 450,
903-7 (2007).
Reiman, J.M., Kmieciak, M., Manjili, M.H. & Knutson, K.L. Tumor immunoediting and
immunosculpting pathways to cancer progression. Semin Cancer Biol 17, 275-87 (2007).
Maleno, I. et al. Distribution of HLA class I altered phenotypes in colorectal carcinomas: high
frequency of HLA haplotype loss associated with loss of heterozygosity in chromosome region 6p21.
Immunogenetics 56, 244-53 (2004).
D'Urso, C.M. et al. Lack of HLA class I antigen expression by cultured melanoma cells FO-1 due to a
defect in B2m gene expression. J Clin Invest 87, 284-92 (1991).
Restifo, N.P. et al. Loss of functional beta 2-microglobulin in metastatic melanomas from five patients
receiving immunotherapy. J Natl Cancer Inst 88, 100-8 (1996).
Garcia-Lora, A., Martinez, M., Algarra, I., Gaforio, J.J. & Garrido, F. MHC class I-deficient metastatic
tumor variants immunoselected by T lymphocytes originate from the coordinated downregulation of
APM components. Int J Cancer 106, 521-7 (2003).
Dovhey, S.E., Ghosh, N.S. & Wright, K.L. Loss of interferon-gamma inducibility of TAP1 and LMP2
in a renal cell carcinoma cell line. Cancer Res 60, 5789-96 (2000).
Cabrera, T. et al. High frequency of altered HLA class I phenotypes in invasive colorectal carcinomas.
Tissue Antigens 52, 114-23 (1998).
Kageshita, T., Hirai, S., Ono, T., Hicklin, D.J. & Ferrone, S. Down-regulation of HLA class I antigenprocessing molecules in malignant melanoma: association with disease progression. Am J Pathol 154,
745-54 (1999).
Madjd, Z., Spendlove, I., Pinder, S.E., Ellis, I.O. & Durrant, L.G. Total loss of MHC class I is an
independent indicator of good prognosis in breast cancer. Int J Cancer 117, 248-55 (2005).
Maeurer, M.J. et al. Tumor escape from immune recognition: lethal recurrent melanoma in a patient
associated with downregulation of the peptide transporter protein TAP-1 and loss of expression of the
immunodominant MART-1/Melan-A antigen. J Clin Invest 98, 1633-41 (1996).
Kurnick, J.T. et al. A novel autocrine pathway of tumor escape from immune recognition: melanoma
cell lines produce a soluble protein that diminishes expression of the gene encoding the melanocyte
lineage melan-A/MART-1 antigen through down-modulation of its promoter. J Immunol 167, 1204-11
(2001).
Bai, X.F., Liu, J., Li, O., Zheng, P. & Liu, Y. Antigenic drift as a mechanism for tumor evasion of
destruction by cytolytic T lymphocytes. J Clin Invest 111, 1487-96 (2003).
Irmler, M. et al. Inhibition of death receptor signals by cellular FLIP. Nature 388, 190-5 (1997).
Griffith, T.S., Chin, W.A., Jackson, G.C., Lynch, D.H. & Kubin, M.Z. Intracellular regulation of
TRAIL-induced apoptosis in human melanoma cells. J Immunol 161, 2833-40 (1998).
Medema, J.P., de Jong, J., van Hall, T., Melief, C.J. & Offringa, R. Immune escape of tumors in vivo by
expression of cellular FLICE-inhibitory protein. J Exp Med 190, 1033-8 (1999).
Higaki, K., Yano, H. & Kojiro, M. Fas antigen expression and its relationship with apoptosis in human
hepatocellular carcinoma and noncancerous tissues. Am J Pathol 149, 429-37 (1996).
Shin, M.S. et al. Mutations of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor 1
(TRAIL-R1) and receptor 2 (TRAIL-R2) genes in metastatic breast cancers. Cancer Res 61, 4942-6
(2001).
Maeda, T. et al. Fas gene mutation in the progression of adult T cell leukemia. J Exp Med 189, 1063-71
(1999).
155
234.
235.
236.
237.
238.
239.
240.
241.
242.
243.
244.
245.
246.
247.
248.
249.
250.
251.
252.
253.
254.
255.
256.
257.
258.
259.
260.
261.
262.
263.
Cheng, J. et al. Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of the Fas molecule. Science
263, 1759-62 (1994).
Midis, G.P., Shen, Y. & Owen-Schaub, L.B. Elevated soluble Fas (sFas) levels in nonhematopoietic
human malignancy. Cancer Res 56, 3870-4 (1996).
Roth, W. et al. Soluble decoy receptor 3 is expressed by malignant gliomas and suppresses CD95
ligand-induced apoptosis and chemotaxis. Cancer Res 61, 2759-65 (2001).
Medema, J.P. et al. Blockade of the granzyme B/perforin pathway through overexpression of the serine
protease inhibitor PI-9/SPI-6 constitutes a mechanism for immune escape by tumors. Proc Natl Acad
Sci U S A 98, 11515-20 (2001).
Godal, R. et al. Lymphomas are sensitive to perforin-dependent cytotoxic pathways despite expression
of PI-9 and overexpression of bcl-2. Blood 107, 3205-11 (2006).
Lehmann, C., Zeis, M., Schmitz, N. & Uharek, L. Impaired binding of perforin on the surface of tumor
cells is a cause of target cell resistance against cytotoxic effector cells. Blood 96, 594-600 (2000).
Li, M.O., Wan, Y.Y., Sanjabi, S., Robertson, A.K. & Flavell, R.A. Transforming growth factor-beta
regulation of immune responses. Annu Rev Immunol 24, 99-146 (2006).
Shull, M.M. et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-beta 1 gene results in
multifocal inflammatory disease. Nature 359, 693-9 (1992).
Reiss, M. TGF-beta and cancer. Microbes Infect 1, 1327-47 (1999).
Gorsch, S.M., Memoli, V.A., Stukel, T.A., Gold, L.I. & Arrick, B.A. Immunohistochemical staining for
transforming growth factor beta 1 associates with disease progression in human breast cancer. Cancer
Res 52, 6949-52 (1992).
Torre-Amione, G. et al. A highly immunogenic tumor transfected with a murine transforming growth
factor type beta 1 cDNA escapes immune surveillance. Proc Natl Acad Sci U S A 87, 1486-90 (1990).
Gorelik, L. & Flavell, R.A. Immune-mediated eradication of tumors through the blockade of
transforming growth factor-beta signaling in T cells. Nat Med 7, 1118-22 (2001).
Thomas, D.A. & Massague, J. TGF-beta directly targets cytotoxic T cell functions during tumor evasion
of immune surveillance. Cancer Cell 8, 369-80 (2005).
Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G. & Rodeck, U. Regulation of NK cell functions by TGFbeta 1. J Immunol 155, 1066-73 (1995).
Lee, J.C., Lee, K.M., Kim, D.W. & Heo, D.S. Elevated TGF-beta1 secretion and down-modulation of
NKG2D underlies impaired NK cytotoxicity in cancer patients. J Immunol 172, 7335-40 (2004).
Moore, K.W., de Waal Malefyt, R., Coffman, R.L. & O'Garra, A. Interleukin-10 and the interleukin-10
receptor. Annu Rev Immunol 19, 683-765 (2001).
Couper, K.N., Blount, D.G. & Riley, E.M. IL-10: the master regulator of immunity to infection. J
Immunol 180, 5771-7 (2008).
Steinbrink, K. et al. Interleukin-10-treated human dendritic cells induce a melanoma-antigen-specific
anergy in CD8(+) T cells resulting in a failure to lyse tumor cells. Blood 93, 1634-42 (1999).
Matsuda, M. et al. Interleukin 10 pretreatment protects target cells from tumor- and allo-specific
cytotoxic T cells and downregulates HLA class I expression. J Exp Med 180, 2371-6 (1994).
Yue, F.Y. et al. Interleukin-10 is a growth factor for human melanoma cells and down-regulates HLA
class-I, HLA class-II and ICAM-1 molecules. Int J Cancer 71, 630-7 (1997).
Terentis, A.C. et al. The heme environment of recombinant human indoleamine 2,3-dioxygenase.
Structural properties and substrate-ligand interactions. J Biol Chem 277, 15788-94 (2002).
Munn, D.H. et al. Prevention of allogeneic fetal rejection by tryptophan catabolism. Science 281, 11913 (1998).
Gurtner, G.J., Newberry, R.D., Schloemann, S.R., McDonald, K.G. & Stenson, W.F. Inhibition of
indoleamine 2,3-dioxygenase augments trinitrobenzene sulfonic acid colitis in mice. Gastroenterology
125, 1762-73 (2003).
Kwidzinski, E. et al. Indolamine 2,3-dioxygenase is expressed in the CNS and down-regulates
autoimmune inflammation. Faseb J 19, 1347-9 (2005).
Frumento, G. et al. Tryptophan-derived catabolites are responsible for inhibition of T and natural killer
cell proliferation induced by indoleamine 2,3-dioxygenase. J Exp Med 196, 459-68 (2002).
Della Chiesa, M. et al. The tryptophan catabolite L-kynurenine inhibits the surface expression of
NKp46- and NKG2D-activating receptors and regulates NK-cell function. Blood 108, 4118-25 (2006).
Edinger, A.L. & Thompson, C.B. Antigen-presenting cells control T cell proliferation by regulating
amino acid availability. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 1107-9 (2002).
Uyttenhove, C. et al. Evidence for a tumoral immune resistance mechanism based on tryptophan
degradation by indoleamine 2,3-dioxygenase. Nat Med 9, 1269-74 (2003).
Munn, D.H. et al. Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase by plasmacytoid dendritic cells in tumordraining lymph nodes. J Clin Invest 114, 280-90 (2004).
Brandacher, G. et al. Prognostic value of indoleamine 2,3-dioxygenase expression in colorectal cancer:
effect on tumor-infiltrating T cells. Clin Cancer Res 12, 1144-51 (2006).
156
264.
265.
266.
267.
268.
269.
270.
271.
272.
273.
274.
275.
276.
277.
278.
279.
280.
281.
282.
283.
284.
285.
286.
287.
288.
289.
290.
291.
292.
Okamoto, A. et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase serves as a marker of poor prognosis in gene
expression profiles of serous ovarian cancer cells. Clin Cancer Res 11, 6030-9 (2005).
Muller, A.J., DuHadaway, J.B., Donover, P.S., Sutanto-Ward, E. & Prendergast, G.C. Inhibition of
indoleamine 2,3-dioxygenase, an immunoregulatory target of the cancer suppression gene Bin1,
potentiates cancer chemotherapy. Nat Med 11, 312-9 (2005).
Taylor, M.W. & Feng, G.S. Relationship between interferon-gamma, indoleamine 2,3-dioxygenase, and
tryptophan catabolism. Faseb J 5, 2516-22 (1991).
Rouas-Freiss, N., Moreau, P., Ferrone, S. & Carosella, E.D. HLA-G proteins in cancer: do they provide
tumor cells with an escape mechanism? Cancer Res 65, 10139-44 (2005).
Rouas-Freiss, N., Goncalves, R.M., Menier, C., Dausset, J. & Carosella, E.D. Direct evidence to
support the role of HLA-G in protecting the fetus from maternal uterine natural killer cytolysis. Proc
Natl Acad Sci U S A 94, 11520-5 (1997).
Carosella, E.D., Moreau, P., Lemaoult, J. & Rouas-Freiss, N. HLA-G: from biology to clinical benefits.
Trends Immunol 29, 125-32 (2008).
Le Gal, F.A. et al. HLA-G-mediated inhibition of antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. Int
Immunol 11, 1351-6 (1999).
Contini, P. et al. Soluble HLA-A,-B,-C and -G molecules induce apoptosis in T and NK CD8+ cells and
inhibit cytotoxic T cell activity through CD8 ligation. Eur J Immunol 33, 125-34 (2003).
Fournel, S. et al. Cutting edge: soluble HLA-G1 triggers CD95/CD95 ligand-mediated apoptosis in
activated CD8+ cells by interacting with CD8. J Immunol 164, 6100-4 (2000).
Bahri, R. et al. Soluble HLA-G inhibits cell cycle progression in human alloreactive T lymphocytes. J
Immunol 176, 1331-9 (2006).
Bainbridge, D.R., Ellis, S.A. & Sargent, I.L. HLA-G suppresses proliferation of CD4(+) Tlymphocytes. J Reprod Immunol 48, 17-26 (2000).
Naji, A. et al. CD3+CD4low and CD3+CD8low are induced by HLA-G: novel human peripheral blood
suppressor T-cell subsets involved in transplant acceptance. Blood 110, 3936-48 (2007).
Ristich, V., Liang, S., Zhang, W., Wu, J. & Horuzsko, A. Tolerization of dendritic cells by HLA-G. Eur
J Immunol 35, 1133-42 (2005).
Ye, S.R. et al. Human leukocyte antigen G expression: as a significant prognostic indicator for patients
with colorectal cancer. Mod Pathol 20, 375-83 (2007).
Ishigami, S. et al. HLA-G expression in gastric cancer. Anticancer Res 26, 2467-72 (2006).
Wiendl, H. et al. A functional role of HLA-G expression in human gliomas: an alternative strategy of
immune escape. J Immunol 168, 4772-80 (2002).
Ugurel, S. et al. Soluble human leukocyte antigen--G serum level is elevated in melanoma patients and
is further increased by interferon-alpha immunotherapy. Cancer 92, 369-76 (2001).
Rouas-Freiss, N., Moreau, P., Menier, C., LeMaoult, J. & Carosella, E.D. Expression of tolerogenic
HLA-G molecules in cancer prevents antitumor responses. Semin Cancer Biol 17, 413-21 (2007).
Keir, M.E., Butte, M.J., Freeman, G.J. & Sharpe, A.H. PD-1 and its ligands in tolerance and immunity.
Annu Rev Immunol 26, 677-704 (2008).
Chemnitz, J.M., Parry, R.V., Nichols, K.E., June, C.H. & Riley, J.L. SHP-1 and SHP-2 associate with
immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell
stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation. J Immunol 173, 945-54 (2004).
Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D.M. & Allison, J.P. Programmed death-1 concentration at the
immunological synapse is determined by ligand affinity and availability. Proc Natl Acad Sci U S A 104,
17765-70 (2007).
Sheppard, K.A. et al. PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta
signalosome and downstream signaling to PKCtheta. FEBS Lett 574, 37-41 (2004).
Nishimura, H., Nose, M., Hiai, H., Minato, N. & Honjo, T. Development of lupus-like autoimmune
diseases by disruption of the PD-1 gene encoding an ITIM motif-carrying immunoreceptor. Immunity
11, 141-51 (1999).
Nishimura, H. et al. Autoimmune dilated cardiomyopathy in PD-1 receptor-deficient mice. Science 291,
319-22 (2001).
Blohm, U. et al. Lack of effector cell function and altered tetramer binding of tumor-infiltrating
lymphocytes. J Immunol 169, 5522-30 (2002).
Wong, R.M. et al. Programmed death-1 blockade enhances expansion and functional capacity of human
melanoma antigen-specific CTLs. Int Immunol 19, 1223-34 (2007).
Dong, H. et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune
evasion. Nat Med 8, 793-800 (2002).
Nakanishi, J. et al. Overexpression of B7-H1 (PD-L1) significantly associates with tumor grade and
postoperative prognosis in human urothelial cancers. Cancer Immunol Immunother 56, 1173-82 (2007).
Nomi, T. et al. Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1
ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer. Clin Cancer Res 13, 2151-7 (2007).
157
293.
294.
295.
296.
297.
298.
299.
300.
301.
302.
303.
304.
305.
306.
307.
308.
309.
310.
311.
312.
313.
314.
315.
316.
317.
318.
319.
320.
Hamanishi, J. et al. Programmed cell death 1 ligand 1 and tumor-infiltrating CD8+ T lymphocytes are
prognostic factors of human ovarian cancer. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 3360-5 (2007).
Hirano, F. et al. Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic
immunity. Cancer Res 65, 1089-96 (2005).
Iwai, Y. et al. Involvement of PD-L1 on tumor cells in the escape from host immune system and tumor
immunotherapy by PD-L1 blockade. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 12293-7 (2002).
Zou, W. & Chen, L. Inhibitory B7-family molecules in the tumour microenvironment. Nat Rev Immunol
8, 467-77 (2008).
van Kooyk, Y. & Rabinovich, G.A. Protein-glycan interactions in the control of innate and adaptive
immune responses. Nat Immunol 9, 593-601 (2008).
Liu, F.T. & Rabinovich, G.A. Galectins as modulators of tumour progression. Nat Rev Cancer 5, 29-41
(2005).
Chung, C.D., Patel, V.P., Moran, M., Lewis, L.A. & Miceli, M.C. Galectin-1 induces partial TCR zetachain phosphorylation and antagonizes processive TCR signal transduction. J Immunol 165, 3722-9
(2000).
Matarrese, P. et al. Galectin-1 sensitizes resting human T lymphocytes to Fas (CD95)-mediated cell
death via mitochondrial hyperpolarization, budding, and fission. J Biol Chem 280, 6969-85 (2005).
Rubinstein, N. et al. Targeted inhibition of galectin-1 gene expression in tumor cells results in
heightened T cell-mediated rejection; A potential mechanism of tumor-immune privilege. Cancer Cell
5, 241-51 (2004).
Le, Q.T. et al. Galectin-1: a link between tumor hypoxia and tumor immune privilege. J Clin Oncol 23,
8932-41 (2005).
Demetriou, M., Granovsky, M., Quaggin, S. & Dennis, J.W. Negative regulation of T-cell activation
and autoimmunity by Mgat5 N-glycosylation. Nature 409, 733-9 (2001).
Demotte, N. et al. Restoring the association of the T cell receptor with CD8 reverses anergy in human
tumor-infiltrating lymphocytes. Immunity 28, 414-24 (2008).
Hahne, M. et al. Melanoma cell expression of Fas(Apo-1/CD95) ligand: implications for tumor immune
escape. Science 274, 1363-6 (1996).
Strand, S. et al. Lymphocyte apoptosis induced by CD95 (APO-1/Fas) ligand-expressing tumor cells--a
mechanism of immune evasion? Nat Med 2, 1361-6 (1996).
Nagashima, H. et al. Expression of Fas ligand in gastric carcinoma relates to lymph node metastasis. Int
J Oncol 18, 1157-62 (2001).
Krammer, P.H. CD95's deadly mission in the immune system. Nature 407, 789-95 (2000).
Bennett, M.W. et al. The Fas counterattack in vivo: apoptotic depletion of tumor-infiltrating
lymphocytes associated with Fas ligand expression by human esophageal carcinoma. J Immunol 160,
5669-75 (1998).
Ryan, A.E., Shanahan, F., O'Connell, J. & Houston, A.M. Addressing the "Fas counterattack"
controversy: blocking fas ligand expression suppresses tumor immune evasion of colon cancer in vivo.
Cancer Res 65, 9817-23 (2005).
Arai, H., Gordon, D., Nabel, E.G. & Nabel, G.J. Gene transfer of Fas ligand induces tumor regression in
vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 13862-7 (1997).
Seino, K., Kayagaki, N., Okumura, K. & Yagita, H. Antitumor effect of locally produced CD95 ligand.
Nat Med 3, 165-70 (1997).
Chen, J.J., Sun, Y. & Nabel, G.J. Regulation of the proinflammatory effects of Fas ligand (CD95L).
Science 282, 1714-7 (1998).
Giovarelli, M. et al. A "stealth effect": adenocarcinoma cells engineered to express TRAIL elude tumorspecific and allogeneic T cell reactions. J Immunol 163, 4886-93 (1999).
Patel, M.I., Kurek, C. & Dong, Q. The arachidonic acid pathway and its role in prostate cancer
development and progression. J Urol 179, 1668-75 (2008).
Chen, C.C., Sun, Y.T., Chen, J.J. & Chiu, K.T. TNF-alpha-induced cyclooxygenase-2 expression in
human lung epithelial cells: involvement of the phospholipase C-gamma 2, protein kinase C-alpha,
tyrosine kinase, NF-kappa B-inducing kinase, and I-kappa B kinase 1/2 pathway. J Immunol 165, 271928 (2000).
Blanco, J.C. et al. Interferon regulatory factor (IRF)-1 and IRF-2 regulate interferon gamma-dependent
cyclooxygenase 2 expression. J Exp Med 191, 2131-44 (2000).
Arias-Negrete, S., Keller, K. & Chadee, K. Proinflammatory cytokines regulate cyclooxygenase-2
mRNA expression in human macrophages. Biochem Biophys Res Commun 208, 582-9 (1995).
Smith, W.L., DeWitt, D.L. & Garavito, R.M. Cyclooxygenases: structural, cellular, and molecular
biology. Annu Rev Biochem 69, 145-82 (2000).
Subbaramaiah, K., Norton, L., Gerald, W. & Dannenberg, A.J. Cyclooxygenase-2 is overexpressed in
HER-2/neu-positive breast cancer: evidence for involvement of AP-1 and PEA3. J Biol Chem 277,
18649-57 (2002).
158
321.
322.
323.
324.
325.
326.
327.
328.
329.
330.
331.
332.
333.
334.
335.
336.
337.
338.
339.
340.
341.
342.
343.
344.
345.
Murakami, M. et al. Regulation of prostaglandin E2 biosynthesis by inducible membrane-associated
prostaglandin E2 synthase that acts in concert with cyclooxygenase-2. J Biol Chem 275, 32783-92
(2000).
Thoren, S. & Jakobsson, P.J. Coordinate up- and down-regulation of glutathione-dependent
prostaglandin E synthase and cyclooxygenase-2 in A549 cells. Inhibition by NS-398 and leukotriene
C4. Eur J Biochem 267, 6428-34 (2000).
Stichtenoth, D.O. et al. Microsomal prostaglandin E synthase is regulated by proinflammatory
cytokines and glucocorticoids in primary rheumatoid synovial cells. J Immunol 167, 469-74 (2001).
Sugimoto, Y. & Narumiya, S. Prostaglandin E receptors. J Biol Chem 282, 11613-7 (2007).
Harris, S.G., Padilla, J., Koumas, L., Ray, D. & Phipps, R.P. Prostaglandins as modulators of immunity.
Trends Immunol 23, 144-50 (2002).
Downey, G.P. et al. Enhancement of pulmonary inflammation by PGE2: evidence for a vasodilator
effect. J Appl Physiol 64, 728-41 (1988).
Eberhard, J., Jepsen, S., Pohl, L., Albers, H.K. & Acil, Y. Bacterial challenge stimulates formation of
arachidonic acid metabolites by human keratinocytes and neutrophils in vitro. Clin Diagn Lab Immunol
9, 132-7 (2002).
Rubio, M.T. et al. Maturation of human monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) in the presence of
prostaglandin E2 optimizes CD4 and CD8 T cell-mediated responses to protein antigens: role of PGE2
in chemokine and cytokine expression by MoDCs. Int Immunol 17, 1561-72 (2005).
Kabashima, K. et al. Prostaglandin E2-EP4 signaling initiates skin immune responses by promoting
migration and maturation of Langerhans cells. Nat Med 9, 744-9 (2003).
Legler, D.F., Krause, P., Scandella, E., Singer, E. & Groettrup, M. Prostaglandin E2 is generally
required for human dendritic cell migration and exerts its effect via EP2 and EP4 receptors. J Immunol
176, 966-73 (2006).
Scandella, E., Men, Y., Gillessen, S., Forster, R. & Groettrup, M. Prostaglandin E2 is a key factor for
CCR7 surface expression and migration of monocyte-derived dendritic cells. Blood 100, 1354-61
(2002).
Harizi, H., Juzan, M., Pitard, V., Moreau, J.F. & Gualde, N. Cyclooxygenase-2-issued prostaglandin
e(2) enhances the production of endogenous IL-10, which down-regulates dendritic cell functions. J
Immunol 168, 2255-63 (2002).
van der Pouw Kraan, T.C., Boeije, L.C., Smeenk, R.J., Wijdenes, J. & Aarden, L.A. Prostaglandin-E2 is
a potent inhibitor of human interleukin 12 production. J Exp Med 181, 775-9 (1995).
Kalinski, P., Hilkens, C.M., Snijders, A., Snijdewint, F.G. & Kapsenberg, M.L. Dendritic cells,
obtained from peripheral blood precursors in the presence of PGE2, promote Th2 responses. Adv Exp
Med Biol 417, 363-7 (1997).
von Bergwelt-Baildon, M.S. et al. CD25 and indoleamine 2,3-dioxygenase are up-regulated by
prostaglandin E2 and expressed by tumor-associated dendritic cells in vivo: additional mechanisms of
T-cell inhibition. Blood 108, 228-37 (2006).
Shinomiya, S. et al. Regulation of TNFalpha and interleukin-10 production by prostaglandins I(2) and
E(2): studies with prostaglandin receptor-deficient mice and prostaglandin E-receptor subtype-selective
synthetic agonists. Biochem Pharmacol 61, 1153-60 (2001).
Aronoff, D.M., Canetti, C. & Peters-Golden, M. Prostaglandin E2 inhibits alveolar macrophage
phagocytosis through an E-prostanoid 2 receptor-mediated increase in intracellular cyclic AMP. J
Immunol 173, 559-65 (2004).
Gerlo, S., Verdood, P., Gellersen, B., Hooghe-Peters, E.L. & Kooijman, R. Mechanism of prostaglandin
(PG)E2-induced prolactin expression in human T cells: cooperation of two PGE2 receptor subtypes, Eprostanoid (EP) 3 and EP4, via calcium- and cyclic adenosine 5'-monophosphate-mediated signaling
pathways. J Immunol 173, 5952-62 (2004).
Okano, M. et al. E prostanoid 2 (EP2)/EP4-mediated suppression of antigen-specific human T-cell
responses by prostaglandin E2. Immunology 118, 343-52 (2006).
Nataraj, C. et al. Receptors for prostaglandin E(2) that regulate cellular immune responses in the mouse.
J Clin Invest 108, 1229-35 (2001).
Aandahl, E.M. et al. Inhibition of antigen-specific T cell proliferation and cytokine production by
protein kinase A type I. J Immunol 169, 802-8 (2002).
Vang, T. et al. Activation of the COOH-terminal Src kinase (Csk) by cAMP-dependent protein kinase
inhibits signaling through the T cell receptor. J Exp Med 193, 497-507 (2001).
Porter, B.O. & Malek, T.R. Prostaglandin E2 inhibits T cell activation-induced apoptosis and Fasmediated cellular cytotoxicity by blockade of Fas-ligand induction. Eur J Immunol 29, 2360-5 (1999).
George, R.J., Sturmoski, M.A., Anant, S. & Houchen, C.W. EP4 mediates PGE2 dependent cell
survival through the PI3 kinase/AKT pathway. Prostaglandins Other Lipid Mediat 83, 112-20 (2007).
Betz, M. & Fox, B.S. Prostaglandin E2 inhibits production of Th1 lymphokines but not of Th2
lymphokines. J Immunol 146, 108-13 (1991).
159
346.
347.
348.
349.
350.
351.
352.
353.
354.
355.
356.
357.
358.
359.
360.
361.
362.
363.
364.
365.
366.
367.
368.
369.
370.
371.
Katamura, K. et al. Prostaglandin E2 at priming of naive CD4+ T cells inhibits acquisition of ability to
produce IFN-gamma and IL-2, but not IL-4 and IL-5. J Immunol 155, 4604-12 (1995).
Baratelli, F. et al. Prostaglandin E2 induces FOXP3 gene expression and T regulatory cell function in
human CD4+ T cells. J Immunol 175, 1483-90 (2005).
Sharma, S. et al. Tumor cyclooxygenase-2/prostaglandin E2-dependent promotion of FOXP3
expression and CD4+ CD25+ T regulatory cell activities in lung cancer. Cancer Res 65, 5211-20
(2005).
Ganapathy, V., Gurlo, T., Jarstadmarken, H.O. & von Grafenstein, H. Regulation of TCR-induced IFNgamma release from islet-reactive non-obese diabetic CD8(+) T cells by prostaglandin E(2) receptor
signaling. Int Immunol 12, 851-60 (2000).
Hendricks, A., Leibold, W., Kaever, V. & Schuberth, H.J. Prostaglandin E2 is variably induced by
bacterial superantigens in bovine mononuclear cells and has a regulatory role for the T cell proliferative
response. Immunobiology 201, 493-505 (2000).
Specht, C., Bexten, S., Kolsch, E. & Pauels, H.G. Prostaglandins, but not tumor-derived IL-10, shut
down concomitant tumor-specific CTL responses during murine plasmacytoma progression. Int J
Cancer 91, 705-12 (2001).
Zeddou, M. et al. Prostaglandin E2 induces the expression of functional inhibitory CD94/NKG2A
receptors in human CD8+ T lymphocytes by a cAMP-dependent protein kinase A type I pathway.
Biochem Pharmacol 70, 714-24 (2005).
Raskovalova, T. et al. Inhibition of cytokine production and cytotoxic activity of human antimelanoma
specific CD8+ and CD4+ T lymphocytes by adenosine-protein kinase A type I signaling. Cancer Res
67, 5949-56 (2007).
Joshi, P.C., Zhou, X., Cuchens, M. & Jones, Q. Prostaglandin E2 suppressed IL-15-mediated human
NK cell function through down-regulation of common gamma-chain. J Immunol 166, 885-91 (2001).
Linnemeyer, P.A. & Pollack, S.B. Prostaglandin E2-induced changes in the phenotype, morphology,
and lytic activity of IL-2-activated natural killer cells. J Immunol 150, 3747-54 (1993).
Torgersen, K.M. et al. Selective activation of cAMP-dependent protein kinase type I inhibits rat natural
killer cell cytotoxicity. J Biol Chem 272, 5495-500 (1997).
Soslow, R.A. et al. COX-2 is expressed in human pulmonary, colonic, and mammary tumors. Cancer
89, 2637-45 (2000).
Williams, C.S., Mann, M. & DuBois, R.N. The role of cyclooxygenases in inflammation, cancer, and
development. Oncogene 18, 7908-16 (1999).
Howe, L.R. Inflammation and breast cancer. Cyclooxygenase/prostaglandin signaling and breast cancer.
Breast Cancer Res 9, 210 (2007).
Sumitani, K. et al. Specific inhibition of cyclooxygenase-2 results in inhibition of proliferation of oral
cancer cell lines via suppression of prostaglandin E2 production. J Oral Pathol Med 30, 41-7 (2001).
Tsujii, M., Kawano, S. & DuBois, R.N. Cyclooxygenase-2 expression in human colon cancer cells
increases metastatic potential. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 3336-40 (1997).
Dohadwala, M. et al. Autocrine/paracrine prostaglandin E2 production by non-small cell lung cancer
cells regulates matrix metalloproteinase-2 and CD44 in cyclooxygenase-2-dependent invasion. J Biol
Chem 277, 50828-33 (2002).
Gately, S. The contributions of cyclooxygenase-2 to tumor angiogenesis. Cancer Metastasis Rev 19, 1927 (2000).
Rolland, P.H., Martin, P.M., Jacquemier, J., Rolland, A.M. & Toga, M. Prostaglandin in human breast
cancer: Evidence suggesting that an elevated prostaglandin production is a marker of high metastatic
potential for neoplastic cells. J Natl Cancer Inst 64, 1061-70 (1980).
Ristimaki, A. et al. Prognostic significance of elevated cyclooxygenase-2 expression in breast cancer.
Cancer Res 62, 632-5 (2002).
Huang, M., Sharma, S., Mao, J.T. & Dubinett, S.M. Non-small cell lung cancer-derived soluble
mediators and prostaglandin E2 enhance peripheral blood lymphocyte IL-10 transcription and protein
production. J Immunol 157, 5512-20 (1996).
Sharma, S. et al. Tumor cyclooxygenase 2-dependent suppression of dendritic cell function. Clin
Cancer Res 9, 961-8 (2003).
Stolina, M. et al. Specific inhibition of cyclooxygenase 2 restores antitumor reactivity by altering the
balance of IL-10 and IL-12 synthesis. J Immunol 164, 361-70 (2000).
Woo, E.Y. et al. Cutting edge: Regulatory T cells from lung cancer patients directly inhibit autologous
T cell proliferation. J Immunol 168, 4272-6 (2002).
DeLong, P. et al. Use of cyclooxygenase-2 inhibition to enhance the efficacy of immunotherapy.
Cancer Res 63, 7845-52 (2003).
Sharma, S. et al. Cyclooxygenase 2 inhibition promotes IFN-gamma-dependent enhancement of
antitumor responses. J Immunol 175, 813-9 (2005).
160
372.
373.
374.
375.
376.
377.
378.
379.
380.
381.
382.
383.
384.
385.
386.
387.
388.
389.
390.
391.
392.
393.
394.
395.
396.
397.
398.
399.
400.
401.
402.
Haas, A.R. et al. Cycloxygenase-2 inhibition augments the efficacy of a cancer vaccine. Clin Cancer
Res 12, 214-22 (2006).
Tlsty, T.D. & Coussens, L.M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu Rev Pathol 1,
119-50 (2006).
Zou, W. Immunosuppressive networks in the tumour environment and their therapeutic relevance. Nat
Rev Cancer 5, 263-74 (2005).
Tarin, D. & Croft, C.B. Ultrastructural features of wound healing in mouse skin. J Anat 105, 189-90
(1969).
Kalluri, R. & Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer 6, 392-401 (2006).
Tomasek, J.J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C. & Brown, R.A. Myofibroblasts and mechanoregulation of connective tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol 3, 349-63 (2002).
Durning, P., Schor, S.L. & Sellwood, R.A. Fibroblasts from patients with breast cancer show abnormal
migratory behaviour in vitro. Lancet 2, 890-2 (1984).
Orimo, A. et al. Cancer-associated myofibroblasts possess various factors to promote endometrial tumor
progression. Clin Cancer Res 7, 3097-105 (2001).
Olumi, A.F. et al. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human
prostatic epithelium. Cancer Res 59, 5002-11 (1999).
Orimo, A. et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth
and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell 121, 335-48 (2005).
Sarkhosh, K. et al. Immune cell proliferation is suppressed by the interferon-gamma-induced
indoleamine 2,3-dioxygenase expression of fibroblasts populated in collagen gel (FPCG). J Cell
Biochem 90, 206-17 (2003).
Donnelly, J.J., Xi, M.S. & Rockey, J.H. A soluble product of human corneal fibroblasts inhibits
lymphocyte activation. Enhancement by interferon-gamma. Exp Eye Res 56, 157-65 (1993).
Korn, J.H. Modulation of lymphocyte mitogen responses by cocultured fibroblasts. Cell Immunol 63,
374-84 (1981).
Haniffa, M.A. et al. Adult human fibroblasts are potent immunoregulatory cells and functionally
equivalent to mesenchymal stem cells. J Immunol 179, 1595-604 (2007).
Pollard, J.W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nat Rev
Cancer 4, 71-8 (2004).
Bottazzi, B. et al. Regulation of the macrophage content of neoplasms by chemoattractants. Science
220, 210-2 (1983).
Ueno, T. et al. Significance of macrophage chemoattractant protein-1 in macrophage recruitment,
angiogenesis, and survival in human breast cancer. Clin Cancer Res 6, 3282-9 (2000).
Nakao, S. et al. Infiltration of COX-2-expressing macrophages is a prerequisite for IL-1 beta-induced
neovascularization and tumor growth. J Clin Invest 115, 2979-91 (2005).
Scholl, S.M. et al. Anti-colony-stimulating factor-1 antibody staining in primary breast
adenocarcinomas correlates with marked inflammatory cell infiltrates and prognosis. J Natl Cancer Inst
86, 120-6 (1994).
Lin, E.Y., Nguyen, A.V., Russell, R.G. & Pollard, J.W. Colony-stimulating factor 1 promotes
progression of mammary tumors to malignancy. J Exp Med 193, 727-40 (2001).
Onita, T. et al. Hypoxia-induced, perinecrotic expression of endothelial Per-ARNT-Sim domain
protein-1/hypoxia-inducible factor-2alpha correlates with tumor progression, vascularization, and focal
macrophage infiltration in bladder cancer. Clin Cancer Res 8, 471-80 (2002).
Leek, R.D., Landers, R.J., Harris, A.L. & Lewis, C.E. Necrosis correlates with high vascular density
and focal macrophage infiltration in invasive carcinoma of the breast. Br J Cancer 79, 991-5 (1999).
Lin, E.Y. et al. Macrophages regulate the angiogenic switch in a mouse model of breast cancer. Cancer
Res 66, 11238-46 (2006).
Barleon, B. et al. Migration of human monocytes in response to vascular endothelial growth factor
(VEGF) is mediated via the VEGF receptor flt-1. Blood 87, 3336-43 (1996).
Mosser, D.M. The many faces of macrophage activation. J Leukoc Biol 73, 209-12 (2003).
Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol 3, 23-35 (2003).
Coussens, L.M. & Werb, Z. Inflammation and cancer. Nature 420, 860-7 (2002).
Karin, M. & Greten, F.R. NF-kappaB: linking inflammation and immunity to cancer development and
progression. Nat Rev Immunol 5, 749-59 (2005).
Mantovani, A., Allavena, P. & Sica, A. Tumour-associated macrophages as a prototypic type II
polarised phagocyte population: role in tumour progression. Eur J Cancer 40, 1660-7 (2004).
Sica, A. et al. Autocrine production of IL-10 mediates defective IL-12 production and NF-kappa B
activation in tumor-associated macrophages. J Immunol 164, 762-7 (2000).
Dinapoli, M.R., Calderon, C.L. & Lopez, D.M. The altered tumoricidal capacity of macrophages
isolated from tumor-bearing mice is related to reduce expression of the inducible nitric oxide synthase
gene. J Exp Med 183, 1323-9 (1996).
161
403.
404.
405.
406.
407.
408.
409.
410.
411.
412.
413.
414.
415.
416.
417.
418.
419.
420.
421.
422.
423.
424.
425.
426.
427.
428.
429.
Mantovani, A., Bottazzi, B., Colotta, F., Sozzani, S. & Ruco, L. The origin and function of tumorassociated macrophages. Immunol Today 13, 265-70 (1992).
Biswas, S.K. et al. A distinct and unique transcriptional program expressed by tumor-associated
macrophages (defective NF-kappaB and enhanced IRF-3/STAT1 activation). Blood 107, 2112-22
(2006).
Fong, C.H. et al. An antiinflammatory role for IKKbeta through the inhibition of "classical"
macrophage activation. J Exp Med 205, 1269-76 (2008).
Nesbit, M., Schaider, H., Miller, T.H. & Herlyn, M. Low-level monocyte chemoattractant protein-1
stimulation of monocytes leads to tumor formation in nontumorigenic melanoma cells. J Immunol 166,
6483-90 (2001).
Baxevanis, C.N. et al. Elevated prostaglandin E2 production by monocytes is responsible for the
depressed levels of natural killer and lymphokine-activated killer cell function in patients with breast
cancer. Cancer 72, 491-501 (1993).
Savage, N.D. et al. Human anti-inflammatory macrophages induce Foxp3+ GITR+ CD25+ regulatory T
cells, which suppress via membrane-bound TGFbeta-1. J Immunol 181, 2220-6 (2008).
Curiel, T.J. et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune
privilege and predicts reduced survival. Nat Med 10, 942-9 (2004).
Lamagna, C., Aurrand-Lions, M. & Imhof, B.A. Dual role of macrophages in tumor growth and
angiogenesis. J Leukoc Biol 80, 705-13 (2006).
Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P. & Sica, A. Macrophage polarization: tumorassociated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends Immunol 23,
549-55 (2002).
Bonifaz, L. et al. Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the
steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and
peripheral CD8+ T cell tolerance. J Exp Med 196, 1627-38 (2002).
Gabrilovich, D. Mechanisms and functional significance of tumour-induced dendritic-cell defects. Nat
Rev Immunol 4, 941-52 (2004).
Enk, A.H., Jonuleit, H., Saloga, J. & Knop, J. Dendritic cells as mediators of tumor-induced tolerance in
metastatic melanoma. Int J Cancer 73, 309-16 (1997).
Chaux, P., Favre, N., Martin, M. & Martin, F. Tumor-infiltrating dendritic cells are defective in their
antigen-presenting function and inducible B7 expression in rats. Int J Cancer 72, 619-24 (1997).
Hoffmann, T.K. et al. Alterations in the frequency of dendritic cell subsets in the peripheral circulation
of patients with squamous cell carcinomas of the head and neck. Clin Cancer Res 8, 1787-93 (2002).
Della Bella, S. et al. Altered maturation of peripheral blood dendritic cells in patients with breast
cancer. Br J Cancer 89, 1463-72 (2003).
Almand, B. et al. Clinical significance of defective dendritic cell differentiation in cancer. Clin Cancer
Res 6, 1755-66 (2000).
Gabrilovich, D.I., Ishida, T., Nadaf, S., Ohm, J.E. & Carbone, D.P. Antibodies to vascular endothelial
growth factor enhance the efficacy of cancer immunotherapy by improving endogenous dendritic cell
function. Clin Cancer Res 5, 2963-70 (1999).
Menetrier-Caux, C. et al. Inhibition of the differentiation of dendritic cells from CD34(+) progenitors
by tumor cells: role of interleukin-6 and macrophage colony-stimulating factor. Blood 92, 4778-91
(1998).
Yang, A.S. & Lattime, E.C. Tumor-induced interleukin 10 suppresses the ability of splenic dendritic
cells to stimulate CD4 and CD8 T-cell responses. Cancer Res 63, 2150-7 (2003).
Zou, W. et al. Stromal-derived factor-1 in human tumors recruits and alters the function of
plasmacytoid precursor dendritic cells. Nat Med 7, 1339-46 (2001).
Hartmann, E. et al. Identification and functional analysis of tumor-infiltrating plasmacytoid dendritic
cells in head and neck cancer. Cancer Res 63, 6478-87 (2003).
Mellor, A.L. & Munn, D.H. IDO expression by dendritic cells: tolerance and tryptophan catabolism.
Nat Rev Immunol 4, 762-74 (2004).
Serafini, P., Borrello, I. & Bronte, V. Myeloid suppressor cells in cancer: recruitment, phenotype,
properties, and mechanisms of immune suppression. Semin Cancer Biol 16, 53-65 (2006).
Bronte, V. et al. Apoptotic death of CD8+ T lymphocytes after immunization: induction of a
suppressive population of Mac-1+/Gr-1+ cells. J Immunol 161, 5313-20 (1998).
Kusmartsev, S. & Gabrilovich, D.I. Inhibition of myeloid cell differentiation in cancer: the role of
reactive oxygen species. J Leukoc Biol 74, 186-96 (2003).
Liu, Y. et al. Nitric oxide-independent CTL suppression during tumor progression: association with
arginase-producing (M2) myeloid cells. J Immunol 170, 5064-74 (2003).
Kusmartsev, S., Nagaraj, S. & Gabrilovich, D.I. Tumor-associated CD8+ T cell tolerance induced by
bone marrow-derived immature myeloid cells. J Immunol 175, 4583-92 (2005).
162
430.
431.
432.
433.
434.
435.
436.
437.
438.
439.
440.
441.
442.
443.
444.
445.
446.
447.
448.
449.
450.
451.
452.
453.
454.
455.
456.
457.
Almand, B. et al. Increased production of immature myeloid cells in cancer patients: a mechanism of
immunosuppression in cancer. J Immunol 166, 678-89 (2001).
Movahedi, K. et al. Identification of discrete tumor-induced myeloid-derived suppressor cell
subpopulations with distinct T cell-suppressive activity. Blood 111, 4233-44 (2008).
Ochoa, A.C., Zea, A.H., Hernandez, C. & Rodriguez, P.C. Arginase, prostaglandins, and myeloidderived suppressor cells in renal cell carcinoma. Clin Cancer Res 13, 721s-726s (2007).
Gabrilovich, D.I., Velders, M.P., Sotomayor, E.M. & Kast, W.M. Mechanism of immune dysfunction in
cancer mediated by immature Gr-1+ myeloid cells. J Immunol 166, 5398-406 (2001).
Nagaraj, S. et al. Altered recognition of antigen is a mechanism of CD8+ T cell tolerance in cancer. Nat
Med 13, 828-35 (2007).
Kusmartsev, S., Nefedova, Y., Yoder, D. & Gabrilovich, D.I. Antigen-specific inhibition of CD8+ T
cell response by immature myeloid cells in cancer is mediated by reactive oxygen species. J Immunol
172, 989-99 (2004).
Bronte, V., Serafini, P., Mazzoni, A., Segal, D.M. & Zanovello, P. L-arginine metabolism in myeloid
cells controls T-lymphocyte functions. Trends Immunol 24, 302-6 (2003).
Rodriguez, P.C. et al. Arginase I in myeloid suppressor cells is induced by COX-2 in lung carcinoma. J
Exp Med 202, 931-9 (2005).
Bronte, V. et al. IL-4-induced arginase 1 suppresses alloreactive T cells in tumor-bearing mice. J
Immunol 170, 270-8 (2003).
Xia, Y. & Zweier, J.L. Superoxide and peroxynitrite generation from inducible nitric oxide synthase in
macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 6954-8 (1997).
Brito, C. et al. Peroxynitrite inhibits T lymphocyte activation and proliferation by promoting
impairment of tyrosine phosphorylation and peroxynitrite-driven apoptotic death. J Immunol 162, 335666 (1999).
Berendt, M.J. & North, R.J. T-cell-mediated suppression of anti-tumor immunity. An explanation for
progressive growth of an immunogenic tumor. J Exp Med 151, 69-80 (1980).
Bursuker, I. & North, R.J. Suppression of generation of concomitant antitumor immunity by passively
transferred suppressor T cells from tumor-bearing donors. Cancer Immunol Immunother 19, 215-8
(1985).
Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M. & Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained
by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism
of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol 155, 1151-64 (1995).
O'Garra, A. & Vieira, P. Regulatory T cells and mechanisms of immune system control. Nat Med 10,
801-5 (2004).
Fontenot, J.D., Gavin, M.A. & Rudensky, A.Y. Foxp3 programs the development and function of
CD4+CD25+ regulatory T cells. Nat Immunol 4, 330-6 (2003).
Zou, W. Regulatory T cells, tumour immunity and immunotherapy. Nat Rev Immunol 6, 295-307
(2006).
Onizuka, S. et al. Tumor rejection by in vivo administration of anti-CD25 (interleukin-2 receptor alpha)
monoclonal antibody. Cancer Res 59, 3128-33 (1999).
Shimizu, J., Yamazaki, S. & Sakaguchi, S. Induction of tumor immunity by removing CD25+CD4+ T
cells: a common basis between tumor immunity and autoimmunity. J Immunol 163, 5211-8 (1999).
Antony, P.A. et al. CD8+ T cell immunity against a tumor/self-antigen is augmented by CD4+ T helper
cells and hindered by naturally occurring T regulatory cells. J Immunol 174, 2591-601 (2005).
Asano, M., Toda, M., Sakaguchi, N. & Sakaguchi, S. Autoimmune disease as a consequence of
developmental abnormality of a T cell subpopulation. J Exp Med 184, 387-96 (1996).
Tang, Q. & Bluestone, J.A. The Foxp3+ regulatory T cell: a jack of all trades, master of regulation. Nat
Immunol 9, 239-44 (2008).
Tarbell, K.V., Yamazaki, S., Olson, K., Toy, P. & Steinman, R.M. CD25+ CD4+ T cells, expanded
with dendritic cells presenting a single autoantigenic peptide, suppress autoimmune diabetes. J Exp Med
199, 1467-77 (2004).
Ghiringhelli, F. et al. Tumor cells convert immature myeloid dendritic cells into TGF-beta-secreting
cells inducing CD4+CD25+ regulatory T cell proliferation. J Exp Med 202, 919-29 (2005).
Huehn, J. et al. Developmental stage, phenotype, and migration distinguish naive- and
effector/memory-like CD4+ regulatory T cells. J Exp Med 199, 303-13 (2004).
Iellem, A. et al. Unique chemotactic response profile and specific expression of chemokine receptors
CCR4 and CCR8 by CD4(+)CD25(+) regulatory T cells. J Exp Med 194, 847-53 (2001).
Chen, W. et al. Conversion of peripheral CD4+CD25- naive T cells to CD4+CD25+ regulatory T cells
by TGF-beta induction of transcription factor Foxp3. J Exp Med 198, 1875-86 (2003).
Fallarino, F. et al. The combined effects of tryptophan starvation and tryptophan catabolites downregulate T cell receptor zeta-chain and induce a regulatory phenotype in naive T cells. J Immunol 176,
6752-61 (2006).
163
458.
459.
460.
461.
462.
463.
464.
465.
466.
467.
468.
469.
470.
471.
472.
473.
474.
475.
476.
477.
478.
479.
480.
481.
482.
483.
484.
485.
Vignali, D.A., Collison, L.W. & Workman, C.J. How regulatory T cells work. Nat Rev Immunol 8, 52332 (2008).
Strauss, L. et al. A unique subset of CD4+CD25highFoxp3+ T cells secreting interleukin-10 and
transforming growth factor-beta1 mediates suppression in the tumor microenvironment. Clin Cancer
Res 13, 4345-54 (2007).
Hilchey, S.P., De, A., Rimsza, L.M., Bankert, R.B. & Bernstein, S.H. Follicular lymphoma intratumoral
CD4+CD25+GITR+ regulatory T cells potently suppress CD3/CD28-costimulated autologous and
allogeneic CD8+CD25- and CD4+CD25- T cells. J Immunol 178, 4051-61 (2007).
Loser, K. et al. IL-10 controls ultraviolet-induced carcinogenesis in mice. J Immunol 179, 365-71
(2007).
Chen, M.L. et al. Regulatory T cells suppress tumor-specific CD8 T cell cytotoxicity through TGF-beta
signals in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 419-24 (2005).
Collison, L.W. et al. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function. Nature
450, 566-9 (2007).
Gavin, M.A. et al. Foxp3-dependent programme of regulatory T-cell differentiation. Nature 445, 771-5
(2007).
Grossman, W.J. et al. Differential expression of granzymes A and B in human cytotoxic lymphocyte
subsets and T regulatory cells. Blood 104, 2840-8 (2004).
Gondek, D.C., Lu, L.F., Quezada, S.A., Sakaguchi, S. & Noelle, R.J. Cutting edge: contact-mediated
suppression by CD4+CD25+ regulatory cells involves a granzyme B-dependent, perforin-independent
mechanism. J Immunol 174, 1783-6 (2005).
Cao, X. et al. Granzyme B and perforin are important for regulatory T cell-mediated suppression of
tumor clearance. Immunity 27, 635-46 (2007).
Pandiyan, P., Zheng, L., Ishihara, S., Reed, J. & Lenardo, M.J. CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells
induce cytokine deprivation-mediated apoptosis of effector CD4+ T cells. Nat Immunol 8, 1353-62
(2007).
Deaglio, S. et al. Adenosine generation catalyzed by CD39 and CD73 expressed on regulatory T cells
mediates immune suppression. J Exp Med 204, 1257-65 (2007).
Hubert, P., Jacobs, N., Caberg, J.H., Boniver, J. & Delvenne, P. The cross-talk between dendritic and
regulatory T cells: good or evil? J Leukoc Biol 82, 781-94 (2007).
Fallarino, F. et al. Modulation of tryptophan catabolism by regulatory T cells. Nat Immunol 4, 1206-12
(2003).
Munn, D.H. Indoleamine 2,3-dioxygenase, tumor-induced tolerance and counter-regulation. Curr Opin
Immunol 18, 220-5 (2006).
Friedenstein, A.J., Gorskaja, J.F. & Kulagina, N.N. Fibroblast precursors in normal and irradiated
mouse hematopoietic organs. Exp Hematol 4, 267-74 (1976).
Pittenger, M.F. et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284, 1437 (1999).
Minguell, J.J., Erices, A. & Conget, P. Mesenchymal stem cells. Exp Biol Med (Maywood) 226, 507-20
(2001).
Caplan, A.I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res 9, 641-50 (1991).
Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B. & Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their
phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells 25,
2739-49 (2007).
Hu, Q., Piao, Y. & Zou, F. Gene expression profiles of human bone marrow derived mesenchymal stem
cells and tendon cells. Chin Med J (Engl) 116, 1270-2 (2003).
Young, H.E. et al. Human reserve pluripotent mesenchymal stem cells are present in the connective
tissues of skeletal muscle and dermis derived from fetal, adult, and geriatric donors. Anat Rec 264, 5162 (2001).
Villaron, E.M. et al. Mesenchymal stem cells are present in peripheral blood and can engraft after
allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Haematologica 89, 1421-7 (2004).
Ame-Thomas, P. et al. Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid
organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis. Blood
109, 693-702 (2007).
Strem, B.M. et al. Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells. Keio J Med 54,
132-41 (2005).
Gronthos, S., Simmons, P.J., Graves, S.E. & Robey, P.G. Integrin-mediated interactions between
human bone marrow stromal precursor cells and the extracellular matrix. Bone 28, 174-81 (2001).
Uccelli, A., Moretta, L. & Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol
(2008).
Aggarwal, S. & Pittenger, M.F. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell
responses. Blood 105, 1815-22 (2005).
164
486.
487.
488.
489.
490.
491.
492.
493.
494.
495.
496.
497.
498.
499.
500.
501.
502.
503.
504.
505.
506.
507.
508.
509.
510.
511.
512.
513.
Di Nicola, M. et al. Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by
cellular or nonspecific mitogenic stimuli. Blood 99, 3838-43 (2002).
Glennie, S., Soeiro, I., Dyson, P.J., Lam, E.W. & Dazzi, F. Bone marrow mesenchymal stem cells
induce division arrest anergy of activated T cells. Blood 105, 2821-7 (2005).
Krampera, M. et al. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory
antigen-specific T cells to their cognate peptide. Blood 101, 3722-9 (2003).
Nauta, A.J., Kruisselbrink, A.B., Lurvink, E., Willemze, R. & Fibbe, W.E. Mesenchymal stem cells
inhibit generation and function of both CD34+-derived and monocyte-derived dendritic cells. J
Immunol 177, 2080-7 (2006).
Beyth, S. et al. Human mesenchymal stem cells alter antigen-presenting cell maturation and induce Tcell unresponsiveness. Blood 105, 2214-9 (2005).
Krampera, M. et al. Role for interferon-gamma in the immunomodulatory activity of human bone
marrow mesenchymal stem cells. Stem Cells 24, 386-98 (2006).
Sotiropoulou, P.A., Perez, S.A., Gritzapis, A.D., Baxevanis, C.N. & Papamichail, M. Interactions
between human mesenchymal stem cells and natural killer cells. Stem Cells 24, 74-85 (2006).
Spaggiari, G.M., Capobianco, A., Becchetti, S., Mingari, M.C. & Moretta, L. Mesenchymal stem cellnatural killer cell interactions: evidence that activated NK cells are capable of killing MSCs, whereas
MSCs can inhibit IL-2-induced NK-cell proliferation. Blood 107, 1484-90 (2006).
Spaggiari, G.M. et al. Mesenchymal stem cells inhibit natural killer-cell proliferation, cytotoxicity, and
cytokine production: role of indoleamine 2,3-dioxygenase and prostaglandin E2. Blood 111, 1327-33
(2008).
Bartholomew, A. et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong
skin graft survival in vivo. Exp Hematol 30, 42-8 (2002).
Deng, W. et al. Effects of allogeneic bone marrow-derived mesenchymal stem cells on T and B
lymphocytes from BXSB mice. DNA Cell Biol 24, 458-63 (2005).
Djouad, F. et al. Reversal of the immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells by tumor
necrosis factor alpha in collagen-induced arthritis. Arthritis Rheum 52, 1595-603 (2005).
Zappia, E. et al. Mesenchymal stem cells ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis
inducing T-cell anergy. Blood 106, 1755-61 (2005).
Le Blanc, K. & Ringden, O. Mesenchymal stem cells: properties and role in clinical bone marrow
transplantation. Curr Opin Immunol 18, 586-91 (2006).
Meisel, R. et al. Human bone marrow stromal cells inhibit allogeneic T-cell responses by indoleamine
2,3-dioxygenase-mediated tryptophan degradation. Blood 103, 4619-21 (2004).
Sato, K. et al. Nitric oxide plays a critical role in suppression of T-cell proliferation by mesenchymal
stem cells. Blood 109, 228-34 (2007).
Ren, G. et al. Mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression occurs via concerted action of
chemokines and nitric oxide. Cell Stem Cell 2, 141-50 (2008).
Selmani, Z. et al. Human leukocyte antigen-G5 secretion by human mesenchymal stem cells is required
to suppress T lymphocyte and natural killer function and to induce CD4+CD25highFOXP3+ regulatory
T cells. Stem Cells 26, 212-22 (2008).
Gao, J., Dennis, J.E., Muzic, R.F., Lundberg, M. & Caplan, A.I. The dynamic in vivo distribution of
bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. Cells Tissues Organs 169, 12-20 (2001).
Mahmood, A. et al. Treatment of traumatic brain injury in female rats with intravenous administration
of bone marrow stromal cells. Neurosurgery 49, 1196-203; discussion 1203-4 (2001).
Wu, G.D. et al. Migration of mesenchymal stem cells to heart allografts during chronic rejection.
Transplantation 75, 679-85 (2003).
Nakamizo, A. et al. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the treatment of gliomas.
Cancer Res 65, 3307-18 (2005).
Sonabend, A.M. et al. Mesenchymal stem cells effectively deliver an oncolytic adenovirus to
intracranial glioma. Stem Cells 26, 831-41 (2008).
Hung, S.C. et al. Mesenchymal stem cell targeting of microscopic tumors and tumor stroma
development monitored by noninvasive in vivo positron emission tomography imaging. Clin Cancer
Res 11, 7749-56 (2005).
Komarova, S., Kawakami, Y., Stoff-Khalili, M.A., Curiel, D.T. & Pereboeva, L. Mesenchymal
progenitor cells as cellular vehicles for delivery of oncolytic adenoviruses. Mol Cancer Ther 5, 755-66
(2006).
Karnoub, A.E. et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis.
Nature 449, 557-63 (2007).
Studeny, M. et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells as vehicles for interferon-beta
delivery into tumors. Cancer Res 62, 3603-8 (2002).
Cao, H. et al. Mesenchymal stem cell-like cells derived from human gastric cancer tissues. Cancer Lett
(2008).
165
514.
515.
516.
517.
518.
519.
520.
521.
522.
523.
524.
525.
526.
527.
528.
529.
530.
531.
532.
533.
534.
535.
536.
537.
538.
539.
540.
541.
542.
Djouad, F. et al. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor growth in
allogeneic animals. Blood 102, 3837-44 (2003).
Sicard, H. et al. In vivo immunomanipulation of V gamma 9V delta 2 T cells with a synthetic
phosphoantigen in a preclinical nonhuman primate model. J Immunol 175, 5471-80 (2005).
Viey, E., Laplace, C. & Escudier, B. Peripheral gammadelta T-lymphocytes as an innovative tool in
immunotherapy for metastatic renal cell carcinoma. Expert Rev Anticancer Ther 5, 973-86 (2005).
Dieli, F. et al. Targeting human {gamma}delta} T cells with zoledronate and interleukin-2 for
immunotherapy of hormone-refractory prostate cancer. Cancer Res 67, 7450-7 (2007).
Hall, B., Andreeff, M. & Marini, F. The participation of mesenchymal stem cells in tumor stroma
formation and their application as targeted-gene delivery vehicles. Handb Exp Pharmacol, 263-83
(2007).
Chen, L., Tredget, E.E., Wu, P.Y. & Wu, Y. Paracrine factors of mesenchymal stem cells recruit
macrophages and endothelial lineage cells and enhance wound healing. PLoS ONE 3, e1886 (2008).
Hong, D.S., Angelo, L.S. & Kurzrock, R. Interleukin-6 and its receptor in cancer: implications for
Translational Therapeutics. Cancer 110, 1911-28 (2007).
Gertner, J., Wiedemann, A., Poupot, M. & Fournie, J.J. Human gammadelta T lymphocytes strip and
kill tumor cells simultaneously. Immunol Lett 110, 42-53 (2007).
Alter, G., Malenfant, J.M. & Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural
killer cell activity. J Immunol Methods 294, 15-22 (2004).
Skalhegg, B.S. & Tasken, K. Specificity in the cAMP/PKA signaling pathway. Differential
expression,regulation, and subcellular localization of subunits of PKA. Front Biosci 5, D678-93 (2000).
Gjertsen, B.T. et al. Novel (Rp)-cAMPS analogs as tools for inhibition of cAMP-kinase in cell culture.
Basal cAMP-kinase activity modulates interleukin-1 beta action. J Biol Chem 270, 20599-607 (1995).
Jemal, A. et al. Cancer statistics, 2008. CA Cancer J Clin 58, 71-96 (2008).
Bhoola, S. & Hoskins, W.J. Diagnosis and management of epithelial ovarian cancer. Obstet Gynecol
107, 1399-410 (2006).
Wels, J., Kaplan, R.N., Rafii, S. & Lyden, D. Migratory neighbors and distant invaders: tumorassociated niche cells. Genes Dev 22, 559-74 (2008).
Sako, A. et al. Vascular endothelial growth factor synthesis by human omental mesothelial cells is
augmented by fibroblast growth factor-2: possible role of mesothelial cell on the development of
peritoneal metastasis. J Surg Res 115, 113-20 (2003).
Wilson, A.P. Mesothelial cells stimulate the anchorage-independent growth of human ovarian tumour
cells. Br J Cancer 59, 876-82 (1989).
Zhang, X.Y. et al. Characteristics and growth patterns of human peritoneal mesothelial cells:
comparison between advanced epithelial ovarian cancer and non-ovarian cancer sources. J Soc Gynecol
Investig 6, 333-40 (1999).
Rafii. AJ et al. Oncologic Trogocytosis of an Original Stromal Cells Induces Chemoresistance of
Ovarian Tumours. PLoS ONE under Review (2008).
Rabinovich, G.A., Gabrilovich, D. & Sotomayor, E.M. Immunosuppressive strategies that are mediated
by tumor cells. Annu Rev Immunol 25, 267-96 (2007).
Zhang, B. et al. Equilibrium between host and cancer caused by effector T cells killing tumor stroma.
Cancer Res 68, 1563-71 (2008).
Tokuyama, H. et al. V gamma 9 V delta 2 T cell cytotoxicity against tumor cells is enhanced by
monoclonal antibody drugs--rituximab and trastuzumab. Int J Cancer 122, 2526-34 (2008).
Argentati, K. et al. Reduced number and impaired function of circulating gamma delta T cells in
patients with cutaneous primary melanoma. J Invest Dermatol 120, 829-34 (2003).
Denkert, C. et al. Expression of cyclooxygenase 2 in human malignant melanoma. Cancer Res 61, 3038 (2001).
Tiruviluamala, P. & Reichman, L.B. Tuberculosis. Annu Rev Public Health 23, 403-26 (2002).
Rangel Moreno, J. et al. The role of prostaglandin E2 in the immunopathogenesis of experimental
pulmonary tuberculosis. Immunology 106, 257-66 (2002).
Kawabuchi, M. et al. Transmembrane phosphoprotein Cbp regulates the activities of Src-family
tyrosine kinases. Nature 404, 999-1003 (2000).
Vang, T., Abrahamsen, H., Myklebust, S., Horejsi, V. & Tasken, K. Combined spatial and enzymatic
regulation of Csk by cAMP and protein kinase a inhibits T cell receptor signaling. J Biol Chem 278,
17597-600 (2003).
Chemnitz, J.M. et al. Prostaglandin E2 impairs CD4+ T cell activation by inhibition of lck: implications
in Hodgkin's lymphoma. Cancer Res 66, 1114-22 (2006).
van Oirschot, B.A., Stahl, M., Lens, S.M. & Medema, R.H. Protein kinase A regulates expression of
p27(kip1) and cyclin D3 to suppress proliferation of leukemic T cell lines. J Biol Chem 276, 33854-60
(2001).
166
543.
544.
545.
546.
547.
548.
549.
550.
551.
552.
553.
554.
555.
556.
557.
558.
559.
560.
561.
562.
563.
564.
565.
566.
567.
568.
569.
570.
571.
Blay, J., White, T.D. & Hoskin, D.W. The extracellular fluid of solid carcinomas contains
immunosuppressive concentrations of adenosine. Cancer Res 57, 2602-5 (1997).
Ohta, A. et al. A2A adenosine receptor protects tumors from antitumor T cells. Proc Natl Acad Sci U S
A 103, 13132-7 (2006).
Raskovalova, T., Lokshin, A., Huang, X., Jackson, E.K. & Gorelik, E. Adenosine-mediated inhibition
of cytotoxic activity and cytokine production by IL-2/NKp46-activated NK cells: involvement of
protein kinase A isozyme I (PKA I). Immunol Res 36, 91-9 (2006).
Tomchuck, S.L. et al. Toll-like receptors on human mesenchymal stem cells drive their migration and
immunomodulating responses. Stem Cells 26, 99-107 (2008).
Dwyer, R.M. et al. Monocyte chemotactic protein-1 secreted by primary breast tumors stimulates
migration of mesenchymal stem cells. Clin Cancer Res 13, 5020-7 (2007).
Menon, L.G. et al. Differential gene expression associated with migration of mesenchymal stem cells to
conditioned medium from tumor cells or bone marrow cells. Stem Cells 25, 520-8 (2007).
Beckermann, B.M. et al. VEGF expression by mesenchymal stem cells contributes to angiogenesis in
pancreatic carcinoma. Br J Cancer 99, 622-31 (2008).
Birnbaum, T. et al. Malignant gliomas actively recruit bone marrow stromal cells by secreting
angiogenic cytokines. J Neurooncol 83, 241-7 (2007).
Bocelli-Tyndall, C. et al. Human articular chondrocytes suppress in vitro proliferation of anti-CD3
activated peripheral blood mononuclear cells. J Cell Physiol 209, 732-4 (2006).
Jones, S., Horwood, N., Cope, A. & Dazzi, F. The antiproliferative effect of mesenchymal stem cells is
a fundamental property shared by all stromal cells. J Immunol 179, 2824-31 (2007).
Mishra, P.J. et al. Carcinoma-associated fibroblast-like differentiation of human mesenchymal stem
cells. Cancer Res 68, 4331-9 (2008).
Jeon, E.S. et al. Cancer-derived lysophosphatidic acid stimulates differentiation of human mesenchymal
stem cells to myofibroblast-like cells. Stem Cells 26, 789-97 (2008).
Galie, M. et al. Mesenchymal stem cells share molecular signature with mesenchymal tumor cells and
favor early tumor growth in syngeneic mice. Oncogene 27, 2542-51 (2008).
Yu, J.M., Jun, E.S., Bae, Y.C. & Jung, J.S. Mesenchymal stem cells derived from human adipose
tissues favor tumor cell growth in vivo. Stem Cells Dev 17, 463-73 (2008).
Li, H., Fan, X. & Houghton, J. Tumor microenvironment: the role of the tumor stroma in cancer. J Cell
Biochem 101, 805-15 (2007).
Djouad, F. et al. Mesenchymal stem cells inhibit the differentiation of dendritic cells through an
interleukin-6-dependent mechanism. Stem Cells 25, 2025-32 (2007).
Balkwill, F. & Mantovani, A. Inflammation and cancer: back to Virchow? Lancet 357, 539-45 (2001).
Drake, C.G., Jaffee, E. & Pardoll, D.M. Mechanisms of immune evasion by tumors. Adv Immunol 90,
51-81 (2006).
Wang, T. et al. Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor
cells. Nat Med 10, 48-54 (2004).
Koch, C.A., Geraldes, P. & Platt, J.L. Immunosuppression by embryonic stem cells. Stem Cells 26, 8998 (2008).
Visvader, J.E. & Lindeman, G.J. Cancer stem cells in solid tumours: accumulating evidence and
unresolved questions. Nat Rev Cancer 8, 755-68 (2008).
Krivtsov, A.V. et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by
MLL-AF9. Nature 442, 818-22 (2006).
Al-Hajj, M. Cancer stem cells and oncology therapeutics. Curr Opin Oncol 19, 61-4 (2007).
Obeid, M. et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nat Med 13,
54-61 (2007).
Singer, G. et al. HLA-G is a potential tumor marker in malignant ascites. Clin Cancer Res 9, 4460-4
(2003).
Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. 1889. Cancer Metastasis Rev 8,
98-101 (1989).
Zhang, L. et al. Intratumoral T cells, recurrence, and survival in epithelial ovarian cancer. N Engl J Med
348, 203-13 (2003).
Schaffler, A. & Buchler, C. Concise review: adipose tissue-derived stromal cells--basic and clinical
implications for novel cell-based therapies. Stem Cells 25, 818-27 (2007).
Luo, Y. et al. Targeting tumor-associated macrophages as a novel strategy against breast cancer. J Clin
Invest 116, 2132-2141 (2006).
167