ANATOMIE PATHOLOGIQUE 13 PARTIE II

14/12/2011
Revêtement cutané n°13
Groupe n°1 – Estelle & Anissa
13
ANATOMIE
PATHOLOGIQUE
PARTIE II
I. INTRODUCTION
II. HISTORIQUE MICROSCOPIE MULTIPHOTONIQUE
III. FLUORESCENCE
IV. MICROSCOPIE CONFOCALE
V. MICROSCOPIE BIPHOTONIQUE
1. COMPARAISON FLUORESCENCE MICROSCOPIE CONFOCALE ET BIPHOTONIQUE
2. DÉVELOPPEMENT MÉTHODOLOGIQUES ET DOMAINES D'APPLICATION
3. RAPPEL : MICROSCOPE CONFOCAL (1-PHOTON)
4. MICROSCOPIE 3D DANS UN TISSU BIOLOGIQUE ?
5. ORGANISATION D'UN MICROSCOPE MULTI-PHOTONIQUE
6. RÉSOLUTION TRIDIMENSIONNELLE DU MICROSCOPE 2PEF
7. FENÊTRE OPTIQUE DANS L'IR
8. MOLÉCULES FLUORESCENTES ENDOGÈNES DANS LA PEAU
9. APPLICATIONS MICROSCOPIE MULTI-PHOTONIQUE
Chu de Caen 1/19

14/12/2011
Revêtement cutané n°13
Groupe n°1 – Estelle & Anissa
I. INTRODUCTION
Premier microscope confocal en 1995
–Marvin MINSKY
–Sans laser, sans mémoire électroniques, ni beaucoup d’électronique ni dispositifs
piézoélectriques performants
Microscopie multiphoton 1989
–WEBB W.W à la Cornell university
–DENK Wilfrid Max Planck institue
–STRICKLER
Cette microscopie met à profit la fluorescence naturelle, l'autofluorescence.
On utilise des rayonnements peu destructeurs, possibilité de biopsies optiques par
endoscopie et laparoscopie.
Mme Goeppert-Mayer. Américaine.Théoricienne physicienne
Elle a envisagé l'existence de l'absorption biphotonique dès 1929.
Prix Nobel de physique en 1963
Chu de Caen 2/19

14/12/2011
Revêtement cutané n°13
Groupe n°1 – Estelle & Anissa
II. MICROSCOPIE MULTIPHOTON : Historique
Thèse STRUPLER
La microscopie multiphoton utilise les interactions non linéaires entre la lumière et la matière
(« Vous pouvez retenir ça… ») comme source de contraste.
Le processus non-linéaire à l’origine du développement de la microscopie multiphoton est
l’absorption à 2 photons et la fluorecence qui en découle.
(2PEF) démontré théoriquement par Maria Goeppert-Mayer en 1929 dans sa thèse.
Il a fallu ensuite 30 années et le développement des lasers pour le mettre en évidence
expérimentalement puis attendre 1990 pour que Winfried Denk, Jim Strickler et Watt W.Webb
l'appliquent à la microscopie. Par la suite, la microscopie multiphotonique s'est enrichie en utilisant
de nouveaux modes de contraste. Tout d'abord, la génération de second harmonique (SHG) mise
en évidence par P.A Franken et appliquée à la microscopie par Samuel Roth et Isaac Freud. Ce
n'est qu'une dizaine d'années plus tard que le groupe de Yaron Silberberg a mis en œuvre la
génération de troisième harmonique (THG).
III. FLUORESCENCE
FORMULE GENERALE
Propriété de quelques atomes et molécules d’absorber une lumière (des photons) de longueur
d’onde donnée pour peu après émettre une lumière (des photons) de moindre énergie (λ >)
1. Absorption monophotonique
–Un photon pousse un électron vers une orbitale supérieure
–Quand il revient au repos : Emission d'un photon qui ne récupère pas toute l'énergie du
photon incident (donc de plus faible et énergie et de plus grande longueur d'onde).
2. Absorption biphotonique
« Comme au volleyball un joueur ne passe pas la balle directement de l'autre côté tout seul, 2
joueurs donnent des impulions coordonnées à une balle pour qu'elle passe le filet ».
–Ici c'est le même phénomène, il y a besoin de 2 photons rouges pour pousser l'électron sur
une orbitale
–Cet électron va émettre en émission de fluorecence, par exemple un photon vert.
Chu de Caen 3/19

14/12/2011
Revêtement cutané n°13
Groupe n°1 – Estelle & Anissa
Schéma Absorption et émission
Il existe aussi une courbe pour l'absorption biphotonique.
Ce n'est pas parce qu'il y a 2 photons qui doivent agir de
concert qu'il n'y a pas la plage des énergies nécessaires
pour que ces photons soientefficaces.
Ici : Coopération de 2 photons rouges ou infrarouges.
Rappel de la construction de ces
microscopes modernes = Microscope
biphotonique (Microscope à fluorecence et
épillumination)
Trajet des rayons lumineux incidents par l'objectif
(comme système par réflexion).
Excitation → La lumière passe au travers de l'objectif
→ Vient sur la substance fluorescente → La lumière
fluoresente ici en vert restraverse un miroir dichroïque.
Filtre d'excitation : Traversé par la lumière blanche de 450 <λ < 490 nm
Miroir dichroïque : Réfléchit les λ < 510 nm et transmet les λ > 510 nm
2ème filtre d'arrêt : Ne laisse passer que les λ de 520 à 560 nm
Chu de Caen 4/19
Il y a donc besoin de la coopération de 2 photons qui agissent,dans un espace temporel et
tridimensionnel extrêmement réduit.
Provoquer une absorption biphotonique suppose donc de mettre en jeu des intensités
lumineuses considérables pour que l'évènement est lieu.

14/12/2011
Revêtement cutané n°13
Groupe n°1 – Estelle & Anissa
IV. MICROSCOPIE CONFOCALE
La source et le détecteur sont focalisés simultanément sur le même point par un jeu adapté de
trous d’épingles.
→ Le point focal d'illumination est le même que le point focal de détection.
1. EXCITATION
–Un laser continu envoie un jet continu de lumière en 1 point (très bien focalisé)
–Mais si on agrandit le point éclairé et excité on s'aperçoit que au foyer, dans le plan z
adéquat, on voit que l'intensité de l'excitation est considérable et que en avant et en arrière
de ce foyer, dans la direction de ce point, une lumière d'excitation apparaît.
Ici : Absoption monophotonique : Un photon bleu pousse un photon sur une orbitale S1 et au
retour de l'électron à sont orbitale de repos S0 il y a émission d'un photon de moindre énergie et
de plus grande longueur d'onde.
Chu de Caen 5/19