ANATOMIE PATHOLOGIQUE 13 PARTIE II
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14/12/2011 Revêtement cutané n°13 Groupe n°1 – Estelle & Anissa 13 ANATOMIE PATHOLOGIQUE PARTIE II I. INTRODUCTION II. HISTORIQUE MICROSCOPIE MULTIPHOTONIQUE III. FLUORESCENCE IV. MICROSCOPIE CONFOCALE V. MICROSCOPIE BIPHOTONIQUE 1. COMPARAISON FLUORESCENCE MICROSCOPIE CONFOCALE ET BIPHOTONIQUE 2. DÉVELOPPEMENT MÉTHODOLOGIQUES ET DOMAINES D'APPLICATION 3. RAPPEL : MICROSCOPE CONFOCAL (1-PHOTON) 4. MICROSCOPIE 3D DANS UN TISSU BIOLOGIQUE ? 5. ORGANISATION D'UN MICROSCOPE MULTI-PHOTONIQUE 6. RÉSOLUTION TRIDIMENSIONNELLE DU MICROSCOPE 2PEF 7. FENÊTRE OPTIQUE DANS L'IR 8. MOLÉCULES FLUORESCENTES ENDOGÈNES DANS LA PEAU 9. APPLICATIONS MICROSCOPIE MULTI-PHOTONIQUE Chu de Caen 1/19 14/12/2011 Revêtement cutané n°13 Groupe n°1 – Estelle & Anissa I. INTRODUCTION Premier microscope confocal en 1995 – Marvin MINSKY – Sans laser, sans mémoire électroniques, ni beaucoup d’électronique ni dispositifs piézoélectriques performants Microscopie multiphoton 1989 – WEBB W.W à la Cornell university – DENK Wilfrid Max Planck institue – STRICKLER Cette microscopie met à profit la fluorescence naturelle, l'autofluorescence. On utilise des rayonnements peu destructeurs, possibilité de biopsies optiques par endoscopie et laparoscopie. Mme Goeppert-Mayer. Américaine.Théoricienne physicienne Elle a envisagé l'existence de l'absorption biphotonique dès 1929. Prix Nobel de physique en 1963 Chu de Caen 2/19 14/12/2011 Revêtement cutané n°13 Groupe n°1 – Estelle & Anissa II. MICROSCOPIE MULTIPHOTON : Historique Thèse STRUPLER La microscopie multiphoton utilise les interactions non linéaires entre la lumière et la matière (« Vous pouvez retenir ça… ») comme source de contraste. Le processus non-linéaire à l’origine du développement de la microscopie multiphoton est l’absorption à 2 photons et la fluorecence qui en découle. (2PEF) démontré théoriquement par Maria Goeppert-Mayer en 1929 dans sa thèse. Il a fallu ensuite 30 années et le développement des lasers pour le mettre en évidence expérimentalement puis attendre 1990 pour que Winfried Denk, Jim Strickler et Watt W.Webb l'appliquent à la microscopie. Par la suite, la microscopie multiphotonique s'est enrichie en utilisant de nouveaux modes de contraste. Tout d'abord, la génération de second harmonique (SHG) mise en évidence par P.A Franken et appliquée à la microscopie par Samuel Roth et Isaac Freud. Ce n'est qu'une dizaine d'années plus tard que le groupe de Yaron Silberberg a mis en œuvre la génération de troisième harmonique (THG). III. FLUORESCENCE FORMULE GENERALE Propriété de quelques atomes et molécules d’absorber une lumière (des photons) de longueur d’onde donnée pour peu après émettre une lumière (des photons) de moindre énergie (λ >) 1. Absorption monophotonique – Un photon pousse un électron vers une orbitale supérieure – Quand il revient au repos : Emission d'un photon qui ne récupère pas toute l'énergie du photon incident (donc de plus faible et énergie et de plus grande longueur d'onde). 2. Absorption biphotonique « Comme au volleyball un joueur ne passe pas la balle directement de l'autre côté tout seul, 2 joueurs donnent des impulions coordonnées à une balle pour qu'elle passe le filet ». – Ici c'est le même phénomène, il y a besoin de 2 photons rouges pour pousser l'électron sur une orbitale – Cet électron va émettre en émission de fluorecence, par exemple un photon vert. Chu de Caen 3/19 14/12/2011 Revêtement cutané n°13 Groupe n°1 – Estelle & Anissa Il y a donc besoin de la coopération de 2 photons qui agissent,dans un espace temporel et tridimensionnel extrêmement réduit. Provoquer une absorption biphotonique suppose donc de mettre en jeu des intensités lumineuses considérables pour que l'évènement est lieu. Schéma Absorption et émission Il existe aussi une courbe pour l'absorption biphotonique. Ce n'est pas parce qu'il y a 2 photons qui doivent agir de concert qu'il n'y a pas la plage des énergies nécessaires pour que ces photons soientefficaces. Ici : Coopération de 2 photons rouges ou infrarouges. Rappel de la construction de ces microscopes modernes = Microscope biphotonique (Microscope à fluorecence et épillumination) Trajet des rayons lumineux incidents par l'objectif (comme système par réflexion). Excitation → La lumière passe au travers de l'objectif → Vient sur la substance fluorescente → La lumière fluoresente ici en vert restraverse un miroir dichroïque. Filtre d'excitation : Traversé par la lumière blanche de 450 <λ < 490 nm Miroir dichroïque : Réfléchit les λ < 510 nm et transmet les λ > 510 nm 2ème filtre d'arrêt : Ne laisse passer que les λ de 520 à 560 nm Chu de Caen 4/19 14/12/2011 Revêtement cutané n°13 Groupe n°1 – Estelle & Anissa IV. MICROSCOPIE CONFOCALE La source et le détecteur sont focalisés simultanément sur le même point par un jeu adapté de trous d’épingles. → Le point focal d'illumination est le même que le point focal de détection. 1. EXCITATION – Un laser continu envoie un jet continu de lumière en 1 point (très bien focalisé) – Mais si on agrandit le point éclairé et excité on s'aperçoit que au foyer, dans le plan z adéquat, on voit que l'intensité de l'excitation est considérable et que en avant et en arrière de ce foyer, dans la direction de ce point, une lumière d'excitation apparaît. Ici : Absoption monophotonique : Un photon bleu pousse un photon sur une orbitale S1 et au retour de l'électron à sont orbitale de repos S0 il y a émission d'un photon de moindre énergie et de plus grande longueur d'onde. Chu de Caen 5/19 14/12/2011 Revêtement cutané n°13 Groupe n°1 – Estelle & Anissa 2. EMISSION – La lumière de fluorescence qui jaillit du foyer où l'intensité était considérable, est une intensité qui se fait dans toutes les directions – Une partie de ce rayonnement se dirige au travers de l'objectif (ayant une focale donnée) – Il se focalise dans ce point, appartenant à ce plan focal , plan focal conjugué au plan où se trouve l'objet – La lumière focalisée dans le point de ce plan là va passer par le trou d'aiguille (En rouge : diaphragme à trou d'aiguille) – Sur le détecteur en bas : Lumière en provenance principalement de ce point là dans ce plan là Microscope confocal à balayage laser (CLSM) Le point focal d'illumination est le même que le point focal d'émission Ce schéma représente à peu près les mêmes éléments. Souvent utilisé avec épi-illumination en fluorecence (épi-fluorescence) – Excitation : bleu – Emission : vert Si on excite fort au foyer, on a une émission forte en provenance du foyer qui va traverser en direction du détecteur. Les émissions parasites résultant d'une excitation parasite (en dessus ou dessous) vont exsister à des intensités plus faibles et vont aller s'écraser sur le pin hole. Chu de Caen 6/19 14/12/2011 Revêtement cutané n°13 Groupe n°1 – Estelle & Anissa Dans ces conditions, on réalise une section, une tomographie cellulaire. Exemple Classique Confocale à balayage laser On utilisait ce matériel des années 1990/2000. Chu de Caen 7/19 14/12/2011 Revêtement cutané n°13 Groupe n°1 – Estelle & Anissa V.MICROSCOPIE BIPHOTONIQUE 1. Comparaison fluorescence excitée à 2 photons (2 PEF) & microscopie confocale Cuve remplie de fluroscéine A gauche Orifice par lequel le laser d’argon jaillit. Cette lumière, quand elle arrive dans la cuve suscite une fluorescence. → Trainée de fluorescence sur toute l’épaisseur avec une tâche au centre fortement fluorescente A droite La source de droite envoie des pulses, des impulsions extrêmement courtes de lumière dont l'intensité n'arrive à générer un événement biphotonique que dans le point central. Point central : Point lumineux d’où émerge la lumière de fluorecence résultant d'une absorption biphotonique. On considère qu'il n'y a pas besoin de système comme le pin hole et de système comme dans les microscopes confocaux. On considère qu'il y a un confinement au plan focal et dans le point focal de l'excitation (et de l'émission bien sûr ...!). Laser titane safir : Coopération de 2 photons rouges pour arriver à déplacer l'électron, lequel, quand il va revenir au repos, va émettre un photon vert. Chu de Caen 8/19 14/12/2011 Revêtement cutané n°13 Groupe n°1 – Estelle & Anissa Pourquoi fait-on ça ? (Bonne question -_-) Si on compare les 2 – Gauche : Monophotonique – Droite : Biphotonique – Avec la lumière du soleil, un événement monophotonique intervient toutes les secondes (schéma en bas à droite). – Probabilité biphotonique : Toutes les 10 millions d'années – Probabilité triphotonique (Tant qu'on y est!) : Il faudrait attendre l'âge de l'univers pour qu'un seul événement triphotonique puisse se produire. → Avec le laser gaz Argon : Jet continu, flux continu de lumière → Avec le laser solide Titane safir : Pulses Il faudrait des usines d'énergie considérable pour alimenter en continu de tels lasers. Chu de Caen 9/19 14/12/2011 Revêtement cutané n°13 Groupe n°1 – Estelle & Anissa On peut soutenir une émission aussi intense si et seulement si elle est ponctuelle, hachée dans le temps par petits pulse. → Cela consomme moins → Abime moins les tissus Avantage de l'utilisation de l'infrarouge : Moins dangereux, inoffensif 2. Développement méthodologiques et domaines d'application Courbe : Exponentielle (1990 → 2004) de l'augmentation du nombre d’application en microscopie photonique Développement méthodologiques importants – Nouveaux contrastes – Miniaturisation, endoscopie – Systèmes fibrés – acquisition rapide (multipoint, scan rapide) – Pulse shaping, optique adaptative Quelques domaines d'application – Neurosciences – Biologie du développement – Physiologie – Dermatologie Chu de Caen 10/19 14/12/2011 Revêtement cutané n°13 Groupe n°1 – Estelle & Anissa 3. Rappel : Microscope confocal (1-photon) Résolution en rapport – En latéral, en xy, avec λ/NA – En z, en profondeur avec λ/NA² • En microscopie confocale classique on utilise plutôt des rayonnements visibles et énergétiques donc de forte énergie et de courte longueur d'onde : Bonne résolution. • En infrarouge, de longueur d'onde plus grande, on pert de la résolution. La microscopie multi-photonique ne va donc pas nous donner de grandes performances en termes de résolution. Par ailleurs, elle a des qualités d'aptitude, de par l'utilisation des infrarouges, à être assez pénétrante. 4. Microscopie 3D dans un tissu biologique ? Haute résolution → Repose sur la lumière non diffusée. Mais la lumière visible est fortement diffusée dans les tissus. Emission de la lumière dans un tissu biologique Des photons balistiques traversent, d’autres diffusent. Passée une certaine épaisseur, on a plus assez de lumière pour faire une image Chu de Caen 11/19 14/12/2011 Revêtement cutané n°13 Groupe n°1 – Estelle & Anissa a) Microscopie (confocale) en milieu diffusant On a un fort signal mais c'est un bruit de fond : Très brouillé. – Diffusion de la fluorescence → Bruit de fond – Diffusion de la lumière excitatrice → Signal atténué Pénétration limitée par la diffusion. b) Microscopie 2PEF en milieu diffusant : Infrarouge – Meilleure pénétration – L'infrarouge diffusé ne produit pas de fluorecence → Bruit de fond réduit c) Conclusion La lumière bleue qui se diffuse dans un tissu qu'on excite, va aller exciter des molécules à côté (Microscopie confocale). Alors que la lumière infrarouge n'est, elle, pas en quantité suffisante pour exciter. – Notion de seuil Toute la lumière infrarouge qui diffuse est sans conséquence. Seul l'infrarouge qui pénètre et se focalise dans la zone focale est susceptible d'avoir des conséquences et générer un signal de fluorecence. Chu de Caen 12/19 14/12/2011 Revêtement cutané n°13 Groupe n°1 – Estelle & Anissa Mise en évidence de la différence entre un flux continu et un flux de pulse → Dépense d'énergie moindre → Pas d'effet chauffant permanent sur les tissus Chu de Caen 13/19 14/12/2011 Revêtement cutané n°13 Groupe n°1 – Estelle & Anissa 5. Organisation d'un microscope multi-photonique – Source avec un laser pulsé – Scanner pour diriger le faisceau point par point (microscope à balayage) – On envoie la lumière au travers d'un miroir dichroïque, au travers d'un objectif – Arrive sur une préparation – La fluorecence qui en émane part dans toutes les directions – Elle est collectée – Elle est renvoyée vers des détecteurs Chu de Caen 14/19 14/12/2011 Revêtement cutané n°13 Groupe n°1 – Estelle & Anissa 6. Résolution tridimensionnelle du microscope 2PEF – En latéral : λ/2NA → Pas extraordinaire – En axial, en z : 1,3 nλ/NA² → Pas extraordinaire Car λ est assez grand comme on prend de l'infrarouge (Plus du double du violet). On peut dire que c'est une résolution comparable à celle du microscope confocal. Typiquement 2µm * 0,4µm (ouverture numérique NA = 0,9) Quand on travaille en mode fluorecence biphotonique on est un peu mieux qu'en mode réflexion – Un peu mieux que RCLSM : 0,5 et 1,2µm en latéral et axial 7. Fenêtre optique dans l'IR IMPORTANT ♥ Il y a une fenêtre optique dans l’infrarouge – Mis en évidence par Anderson et Parish en 1981 – « On le devine. Quand on éclaire notre main avec une lumière blanche, de l'autre côté on voit ressortir du rouge, si on avait des yeux qui voyait l'infrarouge, on verrait encore mieux l'infrarouge qui ressort. » – L'infrarouge traverse nos tissus – La peau humaine est trouble, diffusante et absorbante pour la lumière visible : finesse du specimen requise Cette fenêtre optique de l'infrarouge a permis 2 modalités : – Reflectance mode cofocal laser scanning microscopy RCLSM – Multiphoton laser scaning microscopy MPLSM Profondeur de pénétration : 200µm (« C’est ce qui nous intéresse ce soir… ») Chu de Caen 15/19 14/12/2011 Revêtement cutané n°13 Groupe n°1 – Estelle & Anissa 8. Molécules fluorescentes endogènes dans la peau – NAD nicotanamide adénine dinucléotide réduit – NADPH – Collagène – Kératine – Elastine – Flavine – Lipofuscine Gros avantage de microscopie multi-photonique à fluorecence : Elle excite des molécules qui sont déjà présentes dans notre corps cad qu'on a pas besoin d'apporter de produits (souvent toxiques). On a simplement à illuminer des molécules qui sont présentes dans notre peau. Ces molécules sont généralement excitables avec un photon énergétique, elles le sont aussi avec 2 photons IR moins destructeurs pour la peau. Chu de Caen 16/19 14/12/2011 Revêtement cutané n°13 Groupe n°1 – Estelle & Anissa 9. APPLICATIONS microscopie multi-photonique – Cellule mitrale – Imagerie calcique – Dermatologie a) Application à la dermatologie Ces images résultent de l'imagerie avec absorption biphotonique de fluorescence sur des prélèvements nouveaux à côté de lésions plus ou moins cancéreuses. – Exérèse – Mise à plat des morceaux – On met le microscope de telle sorte à ce qu'on puisse acquérir l'image sur la surface, puis un peu sous la surface, et de plus en plus en profondeur – Plage de réglage à 2ooµm – Obtention de ces images à différentes profondeurs, sans même à avoir à couper la peau ! Chu de Caen 17/19 14/12/2011 Revêtement cutané n°13 Groupe n°1 – Estelle & Anissa Par la suite, des Allemands ont proposé une machine, un microscope, que l'on met dans la salle de dermatologie. → « Le patient met son bras, son nez, enfin met ce qu'il veut … sous le microscope ». Microscopie multi-photonique : En face MPLSM (Multi photon laser scanning microscope) “En face” : On a une pile de sections possibles à acquérir dans le plan même de la peau quand elle est présentée face à nous : Tranches virtuelles. – Marche avec un microscope 40 * Na (grossit 40 fois) = 0.8 Immersion à l'eau (Donc pas toxique) → « Il suffit de mettre de l'eau sur la peau du 'client' pardon 'patient' et de poser l'objectif dessus » ^^ – Profondeur de 135 µm : Accès à l'épiderme et derme supérieur – Emission à 450 530 : Fluorescence du NADPH, nicotonamide dinucléotide (NAD) kératine élastine collagène et mélanine Photos (page 17) – Ligne supérieure (A): Normal périlésionnel – Ligne intermédiaire (B): Cellules squameuses d'un carcinome in situ – En bas (C): Carcinome à cellules superficielles On observe donc la peau à différentes profondeurs. Travail des nouveaux dermatologues : Bien interpréter ces images, cela va être un nouveau métier. Jusqu'à présent pour avoir ce type d'images on faisait unebiopsie qu'on envoyait chez les anapath'. Alors que là tout se fait dans le cabinet du dermatologie, on peut avoir les résultats plus rapidement. Pour les curieux et motivés : www.jenlab.de/fileadmin/user/DermaInspect.pdf Machines très couteuses Chu de Caen 18/19 14/12/2011 Revêtement cutané n°13 Groupe n°1 – Estelle & Anissa b) Autres applications en dermato – Vieillissement de la peau – Contrôle de la cicatrisation – Contrôle du pH cutané – Contrôle de la pénétration ou de la délivrance de médicaments Au delà de la possibilité de mettre en avant des fluorescences endogène, on peut aussi faire des études complémentaires avec : – Ac marqués – Polarisation – Secondes harmoniques : Le collagène est générateur de secondes harmoniques Image : Neurone avec émission de secondes harmoniques Chu de Caen 19/19
