Danio rerio - Master Pathologie Humaine
publicité
Apport des modèles animaux pour l’étude des infections mycobactériennes Ex. du Danio rerio Audrey BERNUT [email protected] Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques - Pathogénie Tuberculeuse et Nouvelles Cibles Thérapeutiques Montpellier Apport des modèles animaux pour l’étude des infections mycobactériennes Ex. du Danio rerio Plan 1) Intérêt des modèles animaux pour l’étude des maladies infectieuses - Généralités sur les modèles expérimentaux - Focus sur le Danio rerio 2) L’embryon de Danio rerio comme modèle d’étude des infections mycobactériennes - Mycobacterium marinum / Danio rerio comme modèle d’étude de la tuberculose - L’embryon de Danio rerio comme nouveau modèle d’infection pour l’étude de Mycobacterium abscessus Apport des modèles animaux pour l’étude des infections mycobactériennes Ex. du Danio rerio Plan 1) Intérêt des modèles animaux pour l’étude des maladies infectieuses - Généralités sur les modèles expérimentaux - Focus sur le Danio rerio 2) L’embryon de Danio rerio comme modèle d’étude des infections mycobactériennes - Mycobacterium marinum / Danio rerio comme modèle d’étude de la tuberculose - L’embryon de Danio rerio comme nouveau modèle d’infection pour l’étude de Mycobacterium abscessus La problématique Les maladies infectieuses : enjeux majeur en santé publique Début des années 80 - Emergence et réémergence de maladies infectieuses - Maladies nosocomiales …. Et toutes les autres (Données WHO, 2008) - Emergence mondiale de la résistance aux ATB Manque/absence de vaccins/traitements Physiopathologie des maladies mal/non connue La problématique Urgent Prévenir les maladies infectieuses • Nouveaux vaccins : Recherche et identification de nouveaux constituants spécifiques • Nouvelles thérapies anti‐infectieuses actives contre de nouvelles cibles bactériennes Une solution? Mieux comprendre la physiopathologie des maladies infectieuses Louis Pasteur (1822‐1895) Importance de connaître le « mode de vie » des microorganismes afin de les domestiquer et de contrer leurs éventuels effets néfastes Couple hôte ‐ pathogène Facteurs de virulence Mécanismes de résistance Problème dans le cas des maladies humaines Mécanismes de défense Expérimentation sur l’homme? Utilisation de modèles animaux Modèle animal « En recherche biomédicale, un modèle animal est un modèle permettant l'étude de données de référence sur la biologie ou le comportement, ou chez lequel on peut étudier un processus pathologique spontané ou induit, celui-ci ayant un ou plusieurs aspects communs avec un phénomène équivalent chez l'humain ou d'autres espèces animales. » L'American National Research Council Committee on Animal Models for Research and Aging Expérimentation animale en infectiologie Utilisation des animaux comme modèles pour : - Comprendre les mécanismes physiopathologiques de la maladie - Elaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques Utilisation de modèles animaux Choix du modèle Le choix du modèle animal le plus approprié selon la condition à étudier est délicat et fondamental afin de pouvoir valider l’extrapolation qui sera faite à l’homme. Etudes physiologiques développées Faible coût d’élevage Facilité d’élevage Vitesse de reproduction Qualités d’un modèle Simplicité d’analyse génétique Simplicité d’analyse génétique Reproductibilité des résultats Biochimie facile Meilleure analogie possible / cas humain Le modèle parfait n’existe pas Utilisation de modèles animaux Limites des modèles animaux Aspects techniques de l’élevage Physiologie Anatomie Suivre des procédures validées Ethique Reproductible Techniques expérimentales Influence des facteurs non expérimentaux sur la réponse du modèle Une analogie jamais parfaite Intérêt de croiser les résultats obtenus à partir de plusieurs modèles ? Utilisation de modèles animaux Modèles mammifères traditionnels utilisés Utilisation de modèles animaux L'expérimentation animale : une pratique controversée Problèmes éthiques Analogie avec l’homme? Méthodes alternatives à l’expérimentation animale ? Les méthodes alternatives - Modèles cellulaires ou tissus/organes isolés Méthodes physico-chimiques Modèles mathématiques et informatiques Utilisation des animaux à des fins scientifiques reste à l’heure actuelle incontournable Méthodes alternatives à l’expérimentation animale ? L'expérimentation animale d’aujourdhui, un nouveau leitmotiv : le bien-être animal Remplacement Réduction de l’animal par des méthodes alternatives du nombre d’animaux utilisés dans les études « Principe des 3 R » Raffinement des procédures d’expérience dans le but d’éviter ou de diminuer la souffrance animale Mais aussi….Utilisation d’espèces animales pour lesquelles les connaissances scientifiques établissent qu’elles sont moins sensibles aux contraintes établies Modèles non mammifères Dictyostelium discoideum Arabidopsis thaliana Caenorhabditis elegans Acanthamoeba sp. Drosophila melanogaster Danio rerio Apport des modèles animaux pour l’étude des infections mycobactériennes Ex. du Danio rerio Plan 1) Intérêt des modèles animaux pour l’étude des maladies infectieuses - Généralités sur les modèles expérimentaux - Focus sur le Danio rerio 2) L’embryon de Danio rerio comme modèle d’étude des infections mycobactériennes - Mycobacterium marinum / Danio rerio comme modèle d’étude de la tuberculose - L’embryon de Danio rerio comme nouveau modèle d’infection pour l’étude de Mycobacterium abscessus Le Danio (Danio rerio ou Zebrafish) Généralités • Poisson tropical d'eau douce • Téléostéen, famille des Cyprinidés • Originaire des régions nord-est de l’Inde • Initialement : utilisé comme modèle en biologie du développement • Aujourd’hui : - Ecotoxicologie / toxicologie Génétique Biologie cellulaire Neurobiologie Cancérologie Pharmacologie Et INFECTIOLOGIE Le Danio (Danio rerio ou Zebrafish) Staphylococcus aureus (lin et al. 2007) Streptococcus sp. Burkholderia cenocepacia (Vergunst et al. 2010) (Neely et al. 2002; Miller et Nelly, 2004; Bates et al. 2005) Organisme modèle pour l'étude de diverses maladies infectieuses Listeria sp. Pseudomonas aeruginosa (Menudier et al. 1996) (Brannon et al. 2009; Clatworthy et al. 2009) Mycobacterium marinum Pathogène le mieux étudié et caractérisé chez le danio Avantages du danio comme modèle d'infection Élevage en laboratoire aisé et peu onéreux • Petite taille • Conditions d’élevage peu stringentes • Excellentes capacité reproductives • Temps de génération court Avantages du danio comme modèle d'infection Nombreux outils / bases de données disponibles • Génome entièrement séquencé http://www.sanger.ac.uk/Projects/D_rerio/ - 85% d’identité avec l’homme • Annotation en cours http://www.genetics.wustl.edu/fish_lab/frank/cgi-bin/fish/ - Nombreux gènes orthologues avec les mammifères • Nombreuses bases de données disponibles sur internet - ZFIN : http://www.shigen.nig.ac.jp:6070/ • Large gamme d’outils cellulaires, moléculaires et génétiques - Technologie antisens : Oligonucléotides morpholinos Puces à ADN Avantages du danio comme modèle d'infection Système immunitaire (SI) homologue à celui des mammifères SI inné - Leucocytes, macrophages, granulocytes - Système complément actif avec 3 voies différentes - Voie classique Voie des lectines Voie alternative - Nombreux récepteurs - TLR - Cytokines proinflammatoires (TNFa IL1B INF1, INF2, IL10, 11, 15, 22 et 26) - Chimiokines SI adaptatif - Lymphocytes T CD4 et CD8 - Lymphocyte B - Ig et TCR avec diverses recombinaison et réarrangement durant le développement Avantages du danio comme modèle d'infection Elaboration progressive du SI SI innée puis SI adaptatif Avantages du danio comme modèle d'infection Suivi spatiotemporel non invasif du processus infectieux in vivo • Fécondation et développement ex utéro • Transparence des embryons 0dpi Utilisation bactéries fluo 1dpi 2dpi 3dpi 4dpi 5dpi 6dpi Suivi du même embryon sur 6dpi Avantages du danio comme modèle d'infection Suivi spatiotemporel non invasif du processus infectieux in vivo MPEG::DsRed IL1b::eGFP Sécrétion IL1b Macrophages mpx::eGFP Neutrophiles © G. Lutfalla Utilisation de lignées transgéniques Avantages du danio comme modèle d'infection Suivi spatiotemporel non invasif du processus infectieux in vivo © M. Nguyen Chi Utilisation de lignées transgéniques + bactéries fluo mpx::eGFP La transparence un potentiel extraordinaire pour l’étude des interactions hôte-pathogène Le danio comme modèle d'infection Limites du modèle • Manque d’Ac monoclonaux • Site ZFIN : plus de 400 Ac répertoriés (en développement) • Manque de lignées cellulaires • Alternative : la carpe commune • Transparence : limitée à 3 semaines • Lignée transparente : Casper • Modèle medaka • Température • Maintenance du danio entre 26 et 29°C / pathogènes mammifères adaptés à la T°C de leur hôte Interactions dans ce modèle affectées? • Pas de méthode globale pour une suppression de gène ciblé • Oligonucléotides morpholinos • Mutation d’insertion • SI • Identification de cellules dendritiques non établie • Différences anatomiques évidentes Pourquoi le danio comme modèle d’infection Qu‘est ce que le modèle danio nous apprend de plus que les autres Invertébrés Vertébrés Un « hybride invertébré / murin» Pourquoi le danio comme modèle d’infection Qu‘est ce que le modèle danio nous apprend de plus que les autres Invertébrés Vertébrés • Proche de l’homme évolutivement • SI : branche innée et adaptative • Etude non invasive • Maintenance • Ethique • Etude non invasive et moins laborieuse • Données fondamentales • Ethique • Suppression sélective de gène • Suppression sélective de gène • Proche de l’homme évolutivement • Données fondamentales Stratégie d’infection Déchorionage mécanique Stratégie d’infection Stratégie d’infection Voie d’infection naturelle : Tractus gastro intestinal, branchies, lésions… Infection expérimentale • Co incubation : inoculation dans un milieu contenant des bactéries • Injection intrapéritonéale ou intramusculaire sur embryons anesthésiés (microinjection entre 28hpf et 30 hpf voir jusqu’à 48hpf) Stratégie d’infection Injection dans différents compartiments Spinal chord Yolk Subcutenous Notochord Caudal vein (CHT) Heart Hindbrain ventricle Otic vesicle 200μm Stratégie d’infection Apport des modèles animaux pour l’étude des infections mycobactériennes Ex. du Danio rerio Plan 1) Intérêt des modèles animaux pour l’étude des maladies infectieuses - Généralités sur les modèles expérimentaux - Focus sur le Danio rerio 2) L’embryon de Danio rerio comme modèle d’étude des infections mycobactériennes - Mycobacterium marinum / Danio rerio comme modèle d’étude de la tuberculose - L’embryon de Danio rerio comme nouveau modèle d’infection pour l’étude de Mycobacterium abscessus La tuberculose Contexte actuel • M. Tuberculosis agent étiologique de la tuberculose • 1/3 de la planète actuellement infecté • Plus de 2 millions morts/an • Traitements inadaptés : apparition de souches multirésistantes et ultrarésistantes (Données WHO, 2011) La tuberculose Le granulome tuberculoïde Forme latente (90%) Asymptomatique Forme réactivée (10%) Symptomatique Importance de la compréhension des mécanismes de formation des granulomes pour expliquer la physiopathologie de la tuberculose et développer des traitements efficaces (Russell, 2007) La tuberculose Modèle murin non adapté pour décripter la formation du granulome La tuberculose Un couple pathogène-hôte comme modèle de la tuberculose Mycobacterium marinum Danio rerio Observation et analyse in vivo de la formation de granulomes Couple M. marinum / danio Pourquoi utiliser M. marinum ? M. abscessus M. smegmatis Mycobactéries à croissance rapide M. marinum Mycobactéries à croissance lente M. marinum M. ulcerans • Induit la tuberculose du poisson • Proximité phylogénique avec M. tuberculosis M. tuberculosis complex M. tuberculosis M. bovis M. microti • Génome séquencé M. africanum • Restrictions en biosécurité plus faibles • Température optimale de croissance de 25-30°C M. canetti M. leprae M. paratuberculosis M. avium Un bon modèle pour comprendre le granulome tuberculeux dans le modèle danio Couple M. marinum / danio Que peut nous apprendre le couple M. marinum / danio ? Mycobacterium marinum Danio rerio Apport du couple M. marinum / danio Des résultats inattendus Infections Lignée transgénique avec MmaM © G. Lutfalla • SI inné + adaptatif longtemps considérés comme nécessaire à la formation du granulome MPEG::DsRed Injection dans la veine caudale MPEG::DsRed Overlay © L. Alibaud M. ma::eGPF Pré-granulome Formation du granulome est en premier lieu le fait du SI inné Apport du couple M. marinum / danio Identification et caractérisation de nouveaux facteurs de virulence mycobactériens • Banque de mutants transpositonnels M. marinum (JD Cirillo, Texas, USA) Dictyostelium discoideum Screening de la banque dans Dictyostelium disciodeum Apport du modèle dictyostelium Pourquoi utiliser Dictyostelium discoideum ? • Amibe sociale, vivant sur des tapis de feuilles mortes Régime principal composé de bactéries • Utilisée initialement en biologie cellulaire • Culture et maintenance facilitées • Hôte modèle pour différentes bactéries pathogènes …et aussi pour M. marinum (Solomon et al, 2003) Apport du modèle dictyostelium Phagocytosis plaque Klebsiella aerogenes Dictyostelium Bactérie non pathogène Bactérie pathogène M.marinum 4-8 days at 25°C Bacterial layer Un moyen facile d’identifier des mutants MmaM Avant le screening ... MmaM_RD1 Mise au point des conditions permettant la discrimination des souches virulentes/avirulentes MmaM_L1D Msm (Alibaud L. et al, 2011) Apport du modèle dictyostelium Screening de la banque transpositionnelle de M. marinum dans Dictyostelium Identification d’un mutant attenué : MmaM_47 MmaM MmaM_RD1 MmaM_47 MmaM _87 (Alibaud L. et al, 2011) Apport du modèle dictyostelium Screening de la banque transpositionnelle de M. marinum dans Dictyostelium Identification d’une insertion dans MmaM_47 Tn5370 hyg probe MmaM_47 PCR1 (~370pb) PCR2 (~850pb) PCR3 MMAR_1778 (tesA) MmaM PCR3 (735bp) Insertion dans tesA, présent dans le cluster de DIM ppsA ppsB ppsC ppsD ppsE mas pks1 M. tuberculosis ppsA ppsB ppsC ppsD ppsE mas pks1 M. marinum (Alibaud L. et al, 2011) Apport du modèle dictyostelium Biosynthèse des DIMs et des PGLs chez M. tuberculosis 18-20 O FadD26, PpsA-D OH Fattyacid 18-20 OH OH O PpsE KS AT ACP S C O 18-20 OH O H R 18-20 TesA O PapA5 OH O FadD28, Mas FadD22, Pks15/1, FadD29, PpsA-D C OOH p-HBA pyruvate 16-22 HO O H OH HO C OOH O - OO C O 2-5 2-5 DIM O sugar O 15-17 Mycocerosic acid HO R O 16-22 2-5 Fattyacid O O 15-17 15-17 HO 14-16 O Phthiocerol A Phthiodiolone A R: =O --OCH3 PpsE KS AT ACP S C O PapA5 O R O O 2-5 2-5 PGL 15-17 15-17 16-22 HO O H OH TesA R: =O --OCH3 R Phenolphthiocerol A Phenolphthiodiolone A C H2 Chorismate DIM phthiocerol dimycocerosate PGL glycolipides phénoliques (Alibaud L. et al, 2011) Apport du modèle dictyostelium Profil des DIMs et PGLs dans le mutant tesA::Tn 2 2 1 1 MmaM 2 2 1 1 MmaM_87 Purified spots tesA::Tn tesA::Tn + pMV261_tesA PGL I PGL II DIM A DIM B 2 2 1 1 Mutant tesA::Tn incapable de synthétiser les PDIMs et les PGLs (Alibaud L. et al, 2011) Apport du modèle dictyostelium Screening de la banque transpositionnelle de M. marinum dans Dictyostelium La complémentation avec tesA restore la virulence Validation du phénotype du mutant tesA::Tn dans un organisme plus complexe et plus spécifique ? (Alibaud L. et al, 2011) Apport du couple M. marinum / danio Infection du mutant tesA::Tn dans différents compartiments Spinal chord Yolk Notochord Subcutenous Caudal vein Heart Otic vesicle Hindbrain ventricle pre-granuloma aggregates no granuloma formation very few infected macrophages (Alibaud L. et al, 2011) Apport du couple M. marinum / danio Infection du mutant tesA::Tn dans différents compartiments Macrophage infecté MmaM RD1 tesA::Tn Mutant tesA::Tn incapable de se multiplier dans les macrophages (Alibaud L. et al, 2011) Apport du couple M. marinum / danio Spinal chord Infection du mutant tesA::Tn dans différents compartiments Yolk Notochord Subcutenous Caudal vein (CHT) Heart Otic vesicle Hindbrain ventricle Cerveau Vésicule otique (Alibaud L. et al, 2011) Le mutant tesA::Tn présente une réduction de virulence lorsqu’il est injecté dans tous les compartiments excepté… Apport du couple M. marinum / danio Notochorde : seul compartiment permettant La prolifération de tesA::Tn Co-Infection avec tesA::Tn Spinal chord tesA::Tn_GFP blood flow 1hpi Yolk Notochord tesA::Tn_mC Notochord Subcutenous Caudal vein (CHT) Heart Otic vesicle Hindbrain ventricle 2dpi 5dpi 7dpi infection controlée par les macrophages infection et mort rapide de l’embryon (Alibaud L. et al, 2011) Apport du couple M. marinum / danio Infections Lignée transgénique MPEG / MmaM © G. Lutfalla Notochorde MPEG::DsRed Injection dans la notochorde MPEG::DsRed Overlay © L. Alibaud M. ma::eGPF La notochorde est inaccessible aux macrophages Apport du trio M. marinum / dictyo/ danio Identification et caractérisation de nouveaux facteurs de virulence mycobactériens • Identification d’un mutant de virulence dans dictyostelium • Le mutant tesA incapable de synthétiser les DIMs et GPLs • Le mutant tesA attenué dans le poisson Rôle clé des ces glycolipides de paroi pour la virulence de M. marinum gène tesA : Bon candidat en temps que cible thérapeutique • Découverte d’un nouveau compartiment qui permet la prolifération du mutant tesA la notochorde (absence de macrophages) Apport du trio M. marinum / dictyo/ danio Modèle d’étude pour la tuberculose osseuse ● 1-2% des cas de tuberculose ● Destruction des disques intervertébraux et progressive affaissement vertébral Apport des modèles animaux pour l’étude des infections mycobactériennes Ex. du Danio rerio Plan 1) Intérêt des modèles animaux pour l’étude des maladies infectieuses - Généralités sur les modèles expérimentaux - Focus sur le Danio rerio 2) L’embryon de Danio rerio comme modèle d’étude des infections mycobactériennes - Mycobacterium marinum / Danio rerio comme modèle d’étude de la tuberculose - L’embryon de Danio rerio comme nouveau modèle d’infection pour l’étude de Mycobacterium abscessus Mycobacterium abscessus Généralités • Mycobactérie à croissance rapide (MCR) • Pathogène émergeant • Large spectre d’infections Problème majeur Infections à M. abscessus associées au développement de lésions granulomateuses pseudo-tuberculeuses (Song et al. 2010) Atteintes pulmonaires chez les patients mucoviscidosiques Mycobacterium abscessus Glycopeptidolipides (GPLs) GPLs (Medjahed et al. 2009) Mycobacterium abscessus Glycopeptidolipides (GPLs) • Colonies rugueuses • Persistence et mutiplication • Hypervirulent • Réponse pro-inflammatoire intense / TNF-α Modèle ex vivo Morphotype S • Colonies muqueuses • Incapable de se multiplier et de persister • Atténué Modèle in vivo (Catherinot et al, 2007; Byrd et Lyons, 1999) Morphotype R Mycobacterium abscessus Contexte actuel • Aucun vaccin disponible • Résistance naturelle + apparition de souches multirésistantes • Mécanismes moléculaires / déterminants de virulence requis pour le développement de la maladie inconnus Peu de modèles d’étude disponibles ex vivo Macrophages Lignées cellulaires in vivo Souris Nécessité de développer de nouveaux modèles d’étude pertinents Mycobacterium abscessus Que peut nous apprendre le modèle d’infection danio ? Injection dans la veine caudale Étude de la virulence de M. abs dans les embryons de danio Analyse de la survie Évaluation de la charge bactérienne au cours de l'infection 0 à 3dpi Log CFU / embryo Multiplication des 2 variants A partir de 3dpi Charge bactérienne plus importante chez les embryons infectés par le variant R Variant R plus virulent que S Suivi en temps réel de l’infection Formation de foyers infectieux localisés au niveau du SNC exclusivement avec la souche R (60% des embryons) Tropisme préférentiel pour le cerveau (40% des embryons) Étude de la virulence de M. abs dans les embryons de danio Exploration ultrastructurale des foyers infectieux Cerveau Moelle épinière 3 dpi 7 dpi 2μm 3 dpi 1μm 10μm 5μm 1μm 1μm 5μm • Bactéries internalisées • Pas de pré-granulome • Siège de divisions bactériennes intenses 2μm SI inné de l'hôte dans le contrôle de l'infection Recrutement des neutrophiles Controle Variant R dans La lignée transgénique mpx:GFP Cerveau Moelle épinière 1 dpi 6 dpi 6 dpi SI inné de l'hôte dans le contrôle de l'infection Profil de cytokines au cours de l'infection IL1b IFNγ2 TNFα Variant_R_avec_foyers_5dpi Variant_R_sans foyer_5dpi Variant_S_5dpi Témoins_5dpi Variant_R_48hpi Variant_S_48hpi Témoins_48hpi Variant_R_24hpi Variant_S_24hpi Témoins_24hpi 1,E-05 Production précoce de IL1b et de TNFa suite à l’infection par les 2 variants puis de IFNG2 1,E-04 1,E-03 1,E-02 1,00E-06 1,E-06 1,E-05 1,E-04 1,00E-05 1,00E-04 1,E-03 La production de ces cytokines pro-inflammatoires est significativement plus importante lors des infections à R Variant R dans La lignée transgénique IL1b:GFP IL1b::eGFP Overlay © G. Lutfalla MabsR::mCherry L’embryon de danio comme nouveau modèle d’infection pour l’étude de M. abscessus Le danio : un bon potentiel pour étudier la virulence de M. abs ► Étude de la virulence des morphotypes R et S dans l’embryo de danio • Les 2 morphotypes sont capables de se multiplier dans le poisson • La souche R établi une infection létale plus rapide que la souche S • Développement de foyer infectieux au niveau du SNC→ Cerveau ► Contribution du SI inné de l’hôte dans le contrôle de l'infection • Recrutement actif des neutrophiles aux foyers infectieux • Production précoce de IL1b et de TNFa suite à l’infection par les 2 souches puis de IFNG2.
