Laboratoire #3

101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies - ESP Hiver 2014
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E. coli
E. coli
Phages
ADN
Bactériologie
L3. CAPTURE DE PHAGES
1. OBJECTIFS
- Isoler des phages d’E. coli de l’environnement.
- Effectuer un dénombrement par dilutions en série.
- Utiliser une technique de filtration avec filtres millipores.
2. INTRODUCTION
2.1. Contexte théorique
- Les bactériophages (ou “phages”) sont des virus s’attaquant aux bactéries.
- Sept des premiers phages étudiés infectaient la bactérie E. coli, une bactérie qui vit dans l’intestin des
mammifères. Ils ont été nommés type 1 (T1), type 2 (T2), etc., dans l’ordre de leur découverte.
- Dès 1952, on a découvert que l’ADN constituait le matériel génétique du phage T2.
- Les phages sont reproduits par les bactéries selon deux
mécanismes principaux : [1; p.446-7]
o Cycle lytique : multiplication immédiate du virus et
éclatement de la cellule hôte. Ex : phages T d’E. coli.
o Cycle lysogénique : intégration de l’ADN viral au
chromosome bactérien sous forme de “pro-phage”
pour un certain temps avant la multiplication virale.
Ex : phages λ d’E. coli.
- Les phages dépendent d’hôtes spécifiques pour leur
“survie” et on les trouve dans le même environnement.
- Les bactériophages font l’objet de recherches intensives :
o Ils sont faciles à cultiver en labo sur des cultures
bactériennes et permettent de mieux comprendre les
mécanismes d’infection virale.
o Certaines compagnies se spécialisent dans l’isolation de phages pour constituer les plus grandes
banques de phages possible et découvrir de nouveaux médicaments.
o Les phages pourraient possiblement être utilisés en complément aux antibiotiques.
o Les phages sont utilisés en biotechnologie comme vecteurs pour introduire des gènes.
Sécurité au laboratoire
Sarrau
Port du sarrau obligatoire.
Contamination
Bactéries : éviter de se contaminer ou de contaminer des objets ou le labo.
En cas de doute, nettoyer soigneusement.
Asepsie
Nettoyer le plan de travail et les mains avant et après le labo.
Brûleur
Surveiller les becs de gaz. Ajuster le brûleur avec soin. Attacher les cheveux.
Rappel
Comme toujours, il est interdit de manger ou de boire au labo.

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2.2. Principe de la méthode employée (Voir la schématisation du protocole)
- Amplification. Des phages de bactéries intestinales sont isolés d’un échantillon d’eau d’égout qu’on
incube avec une culture bactérienne connue pour amplifier leur nombre.
- Purification. On élimine d’abord par centrifugation les divers débris, les bactéries et leurs fragments. On
obtient ensuite une solution de phages plus pure en filtrant avec un filtre muni de pores très fins (0,20 à
0,45µ) qui bloquent le passage des plus petites bactéries, mais non des phages.
- Dilutions. Le filtrat est dilué en série avec de la saline pour obtenir plusieurs concentrations différentes.
- Culture. Les dilutions du filtrat sont ensemencées sur gélose en présence de bactéries. Après incubation,
si le virus est présent, on devrait observer sur les géloses des zones claires appelées “plages de lyse”,
correspondant à des endroits où le virus s’est multiplié et a inhibé la croissance bactérienne.
- Dénombrement. Le nombre de plages observées sert à évaluer la concentration de phages dans le filtrat.
3. MANIPULATIONS
PARTIE 1 : Amplification
On peut préparer un kit par table.
1. De manière aseptique, transférer un échantillon d’eau d’égout dans un erlenmeyer et y ajouter une
culture en bouillon d’E. coli et du bouillon nutritif concentré 10X dans les proportions suivantes :
Eau d’égout : milieu de culture 10X : culture bactérienne (45:5:5)
2. Incuber à 37oC pendant 24 heures. Conserver au réfrigérateur.
PARTIE 2 : Isolation
• Préparation (par équipe): Placer un bécher avec un fond d’eau (2 cm) et 6 tubes de gélose LB «molle» sur
une plaque chauffante et porter à ébullition pour faire fondre la gélose; puis les maintenir autour de 55oC.
• Élimination des résidus par centrifugation (un kit par table) :
3. Avec une pipette stérile, prélever 10 ml de la solution de phages (préparée à la partie 1) et transférer
dans un tube stérile à centrifugation avec bouchon. Identifier.
4. Équilibrer dans la centrifugeuse avec un tube d’eau ou le tube d’une autre équipe.
5. Centrifuger à 2500 rpm pendant 10 minutes.
• Filtration des phages (un kit par table) :
6. Préparer un appareil à filtration stérile utilisant (démo en classe)
 Un système de pompe à vide.
 Une pince stérilisée (flambée à l’alcool) pour manipuler le filtre.
 Un filtre «millipore» de 0,20 à 0,45µ.
7. Une fois la centrifugation terminée, vérifier la présence d’un culot et verser le surnageant dans la partie
supérieure de l’appareil à filtration. Filtrer sous vide en ayant pris soin de dévisser légèrement le
couvercle supérieur pour faciliter l’écoulement du liquide à travers le filtre.
• Dilution du filtrat de phages (par équipe) : Effectuer une dilution en série du filtrat allant de 10-2 à 10-7.
8. Identifier 6 tubes stériles selon les dilutions visées (10-2, 10-3... 10-7)
9. Pipeter 9,9 ml de saline dans le 1er tube (10-2).
10. Pipeter 9,0 ml de saline dans chacun des autres tubes (10-3... 10-7)

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11. Ajouter 100 µl le filtrat au 1er tube (10-2). Rincer l’embout dans le tube.
12. Boucher le tube et agiter au Vortex.
13. Transférer 1000µl du 1er au 2e tube de la série; rincer l’embout dans le 2e tube.
14. Boucher. Agiter au Vortex.
15. Répéter ces 2 dernières étapes en complétant la dilution en série jusqu’au dernier tube.
• Ensemencement sur géloses des bactéries et des dilutions de phages (par équipe) :
16. Identifier 6 géloses nutritives en vase de Pétri selon les dilutions effectuées (10-2, 10-3... 10-7)
Les 3 étapes suivantes devraient être effectuées rapidement, après avoir retiré du bain chauffant un seul
tube de gélose molle à la fois. Si on les retire trop vite, les géloses refroidiront et se solidifieront trop tôt.
17. Retirer un tube de gélose molle du bain chauffant et y ajouter aseptiquement 0,1 ml de culture
bactérienne (pipette stérile de 1,0ml). Sans attendre :
18. Ajouter 25µl de la solution la plus diluée de phages (10-7); agiter par rotation. Sans attendre :
19. Verser toute la gélose molle sur la gélose en vase de Pétri correspondante tout en la dispersant
immédiatement sur toute la surface.
Répéter les 3 dernières étapes pour chacune des autres dilutions (à partir de la solution la plus diluée)
20. Bien laisser durcir les géloses avant de porter à incuber à 37oC pendant 24 heures.
_______________________________

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4. RÉSULTATS NOMS : _________________________ _________________________
4.1. Plages de lyse
Noter le nombre de plages de lyse obtenues sur les géloses ensemencées.
Tableau 1. Nb de plages de lyse selon les dilutions du filtrat
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
4.2. Concentration de phages dans le filtrat.
Calculer la concentration de phages dans le filtrat d’égout (nb/ml), en tenant compte que le nombre
de plages de lyse a été obtenu à partir d’un volume de 25µl d’une des dilutions du tableau 1.
5. QUESTIONS.
5.1. Compte tenu du filtre utilisé dans cette expérience, le filtrat de phages obtenu aurait-il pu contenir
A) Un coque bactérien provenant de l’eau d’égout?
B) Une spore bactérienne provenant de l’eau d’égout ?
C) Une molécule d’ADN ou une protéine libre dans l’eau d’égout ?
5.2. Si on voulait réaliser un protocole pour évaluer la concentration de phages dans un échantillon d’eau
d’égout, quelle partie de notre expérimentation devrait être éliminée?
5.3. Les plages de lyse obtenues sont-elles toutes causées nécessairement par un seul type de phage?
5.4. Pendant l’amplification des phages, quel organisme s’est reproduit le plus rapidement ? Les phages
présents de l’eau d’égout ou les bactéries ajoutées? Répondre en comparant leur cycle de
multiplication et en assumant un cycle «lytique» pour les phages.
6. MÉDIAGRAPHIE
1. Reece, J.B. et coll. (2012). Campbell Biologie. 4e éd., ERPI, 1458 p.

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1000µl
15
9
25µl 25µl 25µl 25µl25µl
filtrat
surnageant
PARTIE 2
Égout :milieu :E.coli (45 :5 :5)
Incubation 24hres X 37oC
10-2
10 ml
Tube à
centrifugation 2500 rpm X 10 min
centrifugeuse Filtration
Saline
9,9 ml
25µl
Gélose molle 3ml
Bactérie
0,1ml
Gélose dure 25 ml
Incubation 24 hres X 37oC
11
17
18
19
20
1
2
3 4 7
10
5
18 18 18 18 18
Bactérie
0,1ml
17
Bactérie
0,1ml
17
Bactérie
0,1ml
17
Bactérie
0,1ml
17
Bactérie
0,1ml
17
19 19 19 19 19
10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
Saline
9,0 ml
Filtrat
100 µl
10 Saline
9,0 ml 10 Saline 9,0 ml 10 Saline 9,0 ml 10 Saline 9,0 ml
15 15 15 15
1000µl 1000µl 1000µl 1000µl
PARTIE 1
SCHÉMATISATION DU PROTOCOLE 1= Étape du texte de lab