Rôle des bactéries dans la rétention et le transfert accéléré

Rôle des bactéries dans la rétention et le
transfert accéléré de multipollutions
métalliques dans les sols
DESAUNAY Aurélien
Sous la direction de
Jean MARTINS
Financement: bourse CNRS-BDI
Contexte d’étude
•
•
•
•
•
Ruissellement de surface
Transport fluvial
Transport dynamique
Bio transformations
Volatilisation
?
ÎNécessité d’identifier ces mécanismes pour mieux prédire le
devenir des polluants et leur impact sanitaire et environnemental
ÎRôle de la fraction colloïdale dans le
transport des métaux ?
1
Impact du transport colloïdal
Æ Les colloïdes abiotiques du sol (argiles, MO…) :
- Taille < 1µm
- Faible solubilité
- Réactivité importante
Æ Colloïdes abiotiques sont connus pour la mobilisation
et l’accélération du transport de contaminants (ETM et
Radioéléments)
Æ Encore peu de connaissances sur:
- La présence de plusieurs polluants dans le milieu
- Le rôle joué par les biocolloïdes (bactéries)
2
Les bactéries
• Êtres vivants unicellulaires, procaryotes (pas de
noyau) micrométriques Î comportement colloïdal
• Mobiles, fixées ou formant des biofilms
Îprésentes dans tous types d’environnement
ÎNombreuses (106 à 1010 cellules/g sol sec) et actives
ÎParticipation aux cycles biogéochimiques
ÎRéactivité importante
COMPARTIMENT REACTIF DU SOL
3
Spécificité des bactéries vis-à-vis
des métaux
Sorption aux
polymères de
surface
Ln cristals sorption
on P. aeruginosa
(Fortin et al. 1997)
Adsorption sur
la membrane
Copper encrustations
on P. aeruginosa cells
(Little et al. 1997)
Accumulation
intracellulaire
Se accumulation in
R. metallidurans CH34
(Roux et al. 2001)
Æ Comprendre les mécanismes d’interactions métaux
bactéries et leur prépondérance
Æ Contribution au transfert accéléré des polluants ?
4
Démarche expérimentale couplée
Statique
Dynamique
Prise en charge des
Étude du transfert
métaux par les bactéries? accéléré des polluants
- A l’échelle subcellulaire
- Bactéries seules
- Métaux seuls
Photo MEB, Muris
- A l’échelle Biofilm
- Mélanges
1
Bio-transported metal (C. metallidurans CH34)
Cadmium
Bio-transported metal (E. coli DH5α)
pH ≈ 6
C/C0
0.75
0.5
0.25
Impact d’une Multipollution
0
0
1
2
3
4
V/V0
5
6
7
8
5
D’après Véronique Guiné
Plan
• Introduction
• Axe 1 : interactions bactéries/métaux
– Étude de la distribution subcellulaire des métaux
– Visualisation en microscopie électronique
• Axe 2 : Étude du transfert accéléré des
métaux
6
Réactivité Bactérie/Métaux
Adsorption
(Propriétés de surface)
Cytoplasme
Membrane
Polymères de
surface
Fixation aux polymères
de surface
Accumulation
intracellulaire
7
D’après Ledin, 2000
Approche classique interactions
bactéries/métaux
OCOOH ' OCOO- + H+
Acides carboxyliques
OPOH ' OPO- + H+
Neutres phosphatés
OH OROH ' ORO- + H+
Basiques hydroxiles (amines)
Conceptualisation simpliste
ÆNe décrit qu’une partie des mécanismes
ÆSouvent mis en défaut
8
Adsorption de Zn/Cd sur 3 bactéries
(Guiné et al., 2006)
Calcul théorique de densité de sites membranaires:
2 atomes de Zn/Cd par nm-2
Capacité de sorption mesurée:
Ratio:
15 à 30 X
30 à 60 atomes Zn/Cd par nm-2
Approche insuffisante
AUTRES MECANISMES?
9
Objectif de l’Axe 1
1. Mieux comprendre les mécanismes de prise
en charge des métaux par les bactéries
-
Étude de la distribution subcellulaire des métaux
- Microscopie électronique
2. Ces mécanismes sont-ils conservés en
présence de plusieurs métaux (2) ?
10
Les modèles : les bactéries (Gram-)
Cupriavidus
metallidurans CH34
Sensibilité aux
métaux
Très résistante à de
nombreux métaux
Escherichia coli
K12DH5α
Plus sensible aux métaux à
forte concentration
Cellules en forme de bâtonnets
Morphologie et
taille
1.2 x 0.4 µm
2.1 x 0.6 µm
Bactéries maintenant bien connues au laboratoire:
Capacités d’échange et groupes réactifs sont
identifiés et caractérisés
11
Guiné , 2006
Les modèles : Métaux (ETM)
• ZINC (Zn):
Æ Oligo-élément essentiel à la vie (métalloenzymes)
Æ Toxique à fortes concentrations
Æ Principale utilisation : industrielle (galvanisation)
• CADMIUM (Cd):
Æ Aucune fonction biologique connue
Æ Métal très toxique
Æ Principales utilisations: cadmiage, accumulateurs
électriques, pigments colorés…
12
Démarche expérimentale
« Contact passif »
« Contact actif »
Culture en
absence de
métal
Culture en
présence de
métal
(48h à 30°C)
Centrifugation et rinçage du
milieu de culture (3X)
48h à 30°C
Resuspension
dans H2O
Mise en contact
avec le métal
2h à 4°C
Distribution
subcellulaire
13
Distribution subcellulaire des métaux
Bactérie + Métal
X2
Centrifugation 5000g / 10 min
Culot
surnageant
Resuspension dans H2O
Casse cellulaire par une presse de French
à 1500kgf/cm2
Ultracentrifugation 20000g / 20 min
Compartiment
extracellulaire
surnageant
Culot
Compartiment
Compartiment
membranaire
intracellulaire
Analyse des métaux par ICP-MS
Sarah Bureau
14
Interactions bactéries/Cd
Contact passif (2h à 4°C)
C. metallidurans CH34
E. coli K12DH5α
65%
46%
4%
11%
43%
10-5M
31%
10-5M
Æ Comportement dépendant de la bactérie
ÆForte accumulation dans les compartiments intracellulaire
et extracellulaire
ÆAccumulation faible dans les membranes
15
Interactions bactéries/Zn
Contact passif (2h à 4°C)
C. metallidurans CH34
55%
E. coli K12DH5α
89%
2%
6%
9%
39%
10-5M
10-5M
ÆComportement dépendant de la bactérie
ÆForte accumulation dans les compartiments extracellulaire
et intracellulaire ( surtout C. metallidurans CH34)
ÆAccumulation faible dans les membranes
16
Interactions bactéries/Zn
Contact actif (48h à 30°C)
C. metallidurans CH34
E. coli K12DH5α
Cadmium
87%
88%
3%
5%
7%
10%
Zinc
81%
80%
3%
3%
17%
16%
• Prise en charge « similaire » pour les 2 bactéries
• 80 à 90 % du métal dans le fluide extracellulaire
17
Interactions bactéries/Cd
C. metallidurans CH34
Contact passif
Contact actif
46%
88%
5%
11%
7%
43%
• Distribution très différente selon la mise en
contact
• Mise en évidence de mécanismes de résistance
• Contact actif = comportement en milieu naturel
18
Microscopie électronique
MET/EDX
Control
Zn 1000ppm
Confirmation
d’ accumulation
intracellulaire
Présence de nanogranules
extracellulaire contenant du
métal
19
Collaboration avec Roland Hellmann (LGIT)
Travaux en cours
• Poursuivre la microscopie pour confirmer ces résultats
• Mise au point d’un protocole d’ultrafiltration pour isoler les
polymères extracellulaires (manip en cours)
Bactéries
Exopolymères:
- ADN
- Polysaccharides
- Protéines
• Effet d’un mélange (Zn/Cd) sur la distribution de
ces métaux chez les bactéries
20
Conclusions
• Mise au point du protocole:
– Manip. Reproductibles
• Étude de distribution des métaux
– Faible importance de la membrane
– Forte accumulation intracellulaire et extracellulaire
• Microscopie électronique
– Mise en évidence de l’accumulation intracellulaire
– Présence de nanogranules extracellulaires
21
Plan
• Introduction
• Axe 1 : interactions bactéries/métaux
(seuls et en mélange)
• Axe 2 : Étude du transfert accéléré
des métaux
- Comprendre ce que deviennent les métaux dans
le sol après prise en charge
Æ Étude du transfert en milieu poreux
22
Colonne de laboratoire
C/C0
Collecteur de
fractions
V/V0
Analyses:
Sable
-
Dosage des métaux
Énumération cellulaire
pH
conductivité…
Pompe
péristaltique
C
Balance
T
2 sols modèles:
Métaux et/ou
bactéries
-
Sable de Fontainebleau
-
Sable d’Hostun
23
Démarche expérimentale pour
l’étude du transfert:
– Bactéries seules et en mélange
– Métaux seuls et en mélange
– Bactéries et métaux
Et Modélisation…
24
Transfert des bactéries
Sable de Fontainebleau (Guiné 2006)
1
C. metallidurans CH34
E. coli DH5α
E. coli HMS174
0.75
A. tumefaciens C58
C/C0
KBr 1g L-1
0.5
0.25
0
0
0.5
1
1.5
V/V0
2
2.5
3
3.5
Importance de la souche bactérienne et des conditions
physico-chimique (FI, pH, q, Conc…)
Pour le transport de mélanges de bactéries :
Î nécessité d’outils plus puissants et nouveaux
25
Énumération cellulaire
• Méthodes classiques:
Dénombrement / DAPI / Densité Optique (600nm)
Æ Inutilisable pour l’étude du mélange de bactéries
• Utilisation de la cytométrie en flux (Sylvie)
La cytométrie renseigne sur:
• Taille relative (Forward scatter - FSC)
• Granularité relative (Side scatter - SSC)
• Intensité de fluorescence (Fluorochrome)
26
Résultats préliminaires
Densité optique
Cytométrie
Dilution x 1000
1.00
1.00
0.80
0.80
0.60
C/C0
C/C0
H2O non filtré
0.70
0.70
0.50
0.40
0.60
0.40
0.30
0.20
0.20
0.10
0.10
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
H2O filtré 0.1µm
0.50
0.30
0.00
DO
0.90
0.90
0.00
0.00
0.50
1.00
1.50
V/V0
3.00
3.50
Cytométrie
Dilution x 10000
1.00
DO
DO
1.00
0.90
0.90
0.80
H2O non filtré
H2O non filtré
0.80
0.70
0.70
0.60
C/C0
C/C0
2.50
V/V0
Cytométrie
Dilution x 5000
H2O filtré 0.1µm
0.50
0.40
0.60
H2O filtré 0.1µm
0.50
0.40
0.30
0.30
0.20
0.20
0.10
0.10
0.00
0.00
2.00
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
V/V0
2.50
3.00
3.50
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
V/V0
Æ Outil « puissant et rapide »
Æ Mise au point à compléter
27
Transfert des bactéries
Sable de Fontainebleau
Sable d’Hostun
1.00
1
C. metallidurans CH34
E. coli DH5α
0.80
0.75
C. metallidruans
CH34
KBr 1g L-1
0.60
C/C0
C/C 0
E.coli K12DH5
0.5
0.40
0.20
0.25
0.00
0.0
0
0
0.5
1
1.5
V/V0
2
Faible rétention
des 2 bactéries
2.5
3
3.5
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
V/V0
Rétentions réversible
et irréversible plus
importantes
28
3.5
Transfert des métaux
Sable d’Hostun
Sable Fontainebleau
Transport en présence
des bactéries:
-E. coli DH5a
-R. metallidurans CH34
C/C0
1
0,75
Transport en l'absence
des bactéries
1
0.9
0.8
Cd
0.7
Cadmium
67%
0.6
0.5
0,5
Zn
0.4
0.3
0.2
0,25
14%
13%
0.1
0
0
0
0
2
4
6
V/V0
2
8
4
6
8
10
Rétention totale
des métaux
C/C0
1
% de metal total
0
0,75
% de metal total
100
0
Retard important
Accélération par les bactéries
8
V/V0
4
6
8
10
12
Cd
Prof. de colonne (en cm)
6
Prof. de colonne (en cm)
0
4
80
20
40
60
80
100
2
17%
2
60
0
53%
0
40
2
20%
0,25
20
0
Zinc
0,5
12
4
6
8
10
12
14
14
16
16
Zn
29
Travaux en cours
-Terminer la mise au point du cytométre pour
l’étude des mélanges de bactéries
- Étude du transport des bactéries et des
métaux seuls ou en mélange dans une colonne de
sable
- Modélisation du transfert
30
Conclusions
• Mise au point de la cytométrie en flux:
– Résultats préliminaires prometteurs (forme de la
courbe de percée,mise au point à affiner)
• Étude du transfert accéléré des métaux
– 1 sable peu réactif Æ accélération du transfert
– 1 sable trop réactif Æ remobilisation des polluants
31
MERCI DE VOTRE
ATTENTION
Remerciements:
Erwann, Aline, Jean, Sylvie, Lorenzo, Véronique Æ LTHE
Sarah Bureau Æ LGCA
Géraldine Sarret, Roland Hellmann Æ
32