Août n°231

Août 2005
n°231
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Le signe ### dans cette version papier indique quelques développements supplémentaires ou des commentaires
additionnels consultables dans la version électronique.
André BERKALOFF
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Concepts et Techniques
1.### J Taylor; Trends in Biotechnology 23
(JUN05) 269-271 se penche sur ce que l'on peut
considérer comme des déserts géniques dans le
génome. Ces déserts sont définis par l'absence de
séquences codantes, ce qui ne signifie nullement
qu'ils n'ont aucune fonction. Il revient sur un article de
I Ovcharenko et al.; Genome Research 15 (JAN05)
137-145 qui comparent ceux des oiseaux et de
l'homme, ce qui leur permet de classer ces déserts en
déserts conservés et déserts variables. Ils représentent
environ 25% du génome
Il faut rappeler que chez les Mammifères les
séquences codantes ne représentent que quelques
pourcents du génome (1,5% chez l'homme). Les
régions intergéniques ont une longueur très supérieure
et sont plus fréquentes que ne le permettrait un
processus aléatoire. Les séquences codantes ont, par
ailleurs, une disposition qui n'est également pas
aléatoire. Les déserts dits "stables" pourraient bien
contenir des régulateurs des séquences codantes.
C'est à ces anomalies et à leur explication qu'est
consacré l'article de J Taylor.
La conservation des déserts "stables" montre, en
effet, des caractéristiques évoquant des régions
régulatrices. Ils flanquent des gènes possédant des
régions régulatrices distales et présentent trois fois
plus de séquences faisant penser à des sites régulateurs
que les déserts "variables", en sus d'une synténie entre
homme et poulet. Cette dernière résistance à la
dislocation est quand même remarquable.
I Ovcharenko et al. ont constaté que les gènes
associés aux déserts "stables" sont souvent des gènes
de régulation et de facteurs de transcription, et que
les éléments régulateurs des déserts voisins sont
impliqués dans les régulations complexes lors du
développement, par exemple, comme c'est le cas pour
le gène Dachshund. Les auteurs suggèrent que cette
expansion des déserts est la contrepartie d'une
impossibilité de réarrangements complexes chez les
Vertébrés. Les auteurs attirent l'attention sur les
déserts "conjoints" qui ne sont séparés que par, au
plus, trois gènes et par moins d'un Mb.
La variabilité de certains déserts ne signifie
nullement qu'ils ne possèdent pas de fonctions, mais
elles sont plus difficiles à mettre en évidence. Les
auteurs concluent qu'ils ont également des fonctions
régulatrices, mais probablement différentes des
précédents.
LW Hillier et al. Nature 434 (07APR05) 724-731,
dans une étude des chromosomes humains 2 et 4,
avaient remarqué que le gène de protocadhérine
PCDH7 est flanqué par le plus grand désert
génique humain (plus de 5 Mb) et un autre désert de
3,5 Mb, qui sont tous deux de la catégorie "variable".
Cette synténie désert-gène-désert est conservée entre
poulet et homme
Il est encore difficile de tirer des conclusions mais
c'est clairement une énigme qui mérite une analyse
plus poussée.
2.### D Cowan et al.; Trends in Biotechnology 23
(JUN05) 321-329 s'intéressent aux questions de
métagénomique, ici les inventaires microbiologiques
sans culture d'un milieu donné. Bien entendu le terme
de non cultivable est inapproprié, il suffit de découvrir
le milieu idoine, mais cela prend bien du temps et de
l'obstination.
Ils discutent des nouvelles techniques développées.
L'une des difficultés rencontrées quand on recherche
un gène donné, est la très grande dilution des gènes
dans les populations d'ADNs récoltées. Il faut donc
disposer d'un procédé d'enrichissement du gène que
l'on recherche.
Cela peut passer d'un enrichissement de cellules
entières à celui de génomes ou gènes précis. Ainsi une
filtration adéquate a été utilisée dans le projet "Mer
des Sargasses" de Craig Venter pour éliminer les
eucaryotes. Une centrifugation différentielle a été
utilisée pour séparer des symbiotes d'insectes.
Les auteurs indiquent plusieurs techniques utilisées
avec leurs avantages et inconvénients, depuis le
marquage par isotopes stables permettant de repérer
l'activité du gène jusqu'à l'utilisation des réseaux
ADNs en passant par l'exhibition des produits sur
phages.
D'une façon générale, une extraction globale ne
permet jamais une représentation fidèle, car une
espèce rare est facilement masquée par des
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organismes dominants, ce qui peut aboutir à des
biais, notamment au cours de la PCR. Il existe une
série de parades à ces difficultés.
Mais l'identification suppose que l'on dispose de
cette séquence et c'est un biais limitant la recherche à
des gènes homologues. On ratera des gènes issus
d'une convergence fonctionnelle. Par ailleurs, la PCR
amplifie seulement une partie du gène et la
récupération de la totalité du gène sera nécessaire, ce
qui nécessitera des techniques de PCR particulières.
Une des difficultés rencontrées est que l'extraction
de l'ADN cause une fragmentation excessive (0,5 à 5
kb par fragment) qui empêche une ligation par bouts
cohésifs. Il faut généralement utiliser une ligation par
bout francs ou T-A.Les ARNs sont des marqueurs
intéressants car ils disparaissent rapidement et le
cliché qu'ils donnent est un instantané. Mais les
difficultés rencontrées sont nombreuses.
Les banques d'ADNs métagénomiques ne sont pas
plus compliquées à construire que dans d'autres
systèmes. Les premières banques de ce type ont été
réalisées au milieu des années 90s pour des
métagénomes marins. Diversa a été un des premiers
protagonistes privés, avec TerraGen Discovery
(rachetée en 2001 par Cubist Pharmaceuticals) à se
livrer à ce type d'exploration, souvent à la demande.
Les auteurs énumèrent dans un tableau les sociétés du
domaine. Ces banques doivent être criblées et c'est
souvent un criblage fonctionnel qui est utilisé dans la
mesure où les utilisateurs ont une idée en tête. Mais
n'importe quel criblage praticable à grande échelle est
possible.
Les vecteurs actuels permettent le clonage de voies
métaboliques entières. On essaye de le faire dans des
hôtes faciles à manipuler, et Escherichia coli vient à
l'esprit. Mais le faible nombre de clones positifs lors
d'une passe de criblage (en général moins de 0,01%)
est une limite sérieuse. Statistiquement, pour une
bibliothèque de petits inserts (<10 kb) il faut cribler
entre 105 et 106 clones pour obtenir un seul positif. Par
ailleurs on n'a aucune idée du biais introduit par cette
expression chez E.coli.
Le séquençage métagénomique complet est une
œuvre ambitieuse, car on peut considérer qu'un
gramme de sol ou un litre d'eau de mer contiennent de
très nombreux organismes, et on peut estimer qu'un
métagénome de sol contient entre 20 et 2000 Gb
d'ADN. Dans certaines conditions où la biodiversité
est très réduite ont peut arriver à séquencer
complètement des génomes. Cela a été le cas pour
deux espèces d'effluents acides de mines où 76 Mb ont
été séquencées. Plus de 4000 gènes ont ainsi été
caractérisés, ce qui a permis d'avoir un aperçu du
métabolisme dans les biofilms ainsi analysés.
Le projet de C Venter dans la mer des sargasses est
beaucoup plus ambitieux (comme toujours avec
Venter). Il comporte le séquençage de plus de 1 Gb et
la caractérisation d'environ 1,2 millions de gènes
potentiels. Mais, comme toujours, l'utilisation des
homologies limite la découverte de gènes inconnus.
On n'a d'ailleurs pu assembler que deux génomes au
maximum. C'est la richesse de cet écosystème qui
perturbe les analyses.
2
3.### L'interférence transcriptionnelle est un
terme mal défini qui correspond au fait que
l'expression d'un gène empêche celle d'un autre sur le
même chromosome. KE Shearwin et al.; Trends in
Genetics 21 (JUN05) 339-345 s'employent à clarifier
ce mécanisme.
L'interférence transcriptionnelle est souvent
asymétrique et résulte de l'existence de deux
promoteurs dont l'un est "fort" et l'autre "faible". Ils
peuvent être orientés de façon convergente et assurent
une transcription recouvrante au moins en partie. Ils
peuvent être en tandem, ou même recouvrants.
Ce type de situation peut résulter de l'entrée en
scène d'un élément transposable, mais également dans
le cadre de régulations naturelles.
L'auteur s'intéresse d'abord à ce dernier cas. C'est
notamment le cas du coliphage 186 dont le
promoteur lytique fort réprime partiellement le
promoteur faible lysogène situé 62 pb en aval. Ces
deux promoteurs sont convergents. Mais le
répresseur du promoteur fort lytique par la protéine
d'immunité permet d'avoir un équilibre facilitant une
lysogénie stable. (Voir BP Callen et al. Molecular
Cell 14 (04JUN04) 647–656, un des auteurs de la
revue).
Le cas des promoteurs en tandem est illustré par le
cas du promoteur permettant la transcription d'un
ARN non codant, SRG1 de la levure. Ce promoteur
est actif en milieu riche et interfère avec un
promoteur, orienté dans le même sens, du gène de
biosynthèse de la sérine SER3. Cette interférence est
liée directement à la transcription de SRG1 à travers le
promoteur de SER3 (voir J Martens et al.; Nature 429
(03JUN04) 571-574). Il reste à montrer comment en
milieu pauvre le premier promoteur cesse d'interférer.
Chez Escherichia coli, le promoteur P1 du gène de
la perméase générale pour les acides aminés
aromatiques, aroP, est recouvert par un promoteur
divergent, P3. L'ARN polymérase se lie à P3 en
présence d'acides aminés aromatiques, réduisant ainsi
l'activité de P1.
Chez les eucaryotes supérieurs, cette interférence
a été observée avec des promoteurs remaniés, mais a
également lieu dans un contexte naturel. C'est le cas
pour le gène de la petite GTPase N-Ras dont
l'expression est réprimée par la transcription du
gène unr (upstream of N-ras) immédiatement en
amont. La délétion du promoteur d'unr entraîne une
surexpression de N-ras et une létalité embryonnaire à
l'état homozygote.
Les rétrotransposons apportent dans le génome
leurs promoteurs qui peuvent commander les gènes
au voisinage du site d'insertion. Il n'est donc pas
étonnant qu'on les invoqués dans la cadre de la
variation épigénétique chez les Mammifères, dont le
génome est bourré de rétrotransposons entiers ou
dégénérés (mais un promoteur suffit, en principe). Les
LINEs (Long Interspersed Nuclear Elements) sont
également invoqués. La fréquente transcription des
ADNs à partir du promoteur antisens inclus dans la
partie amont non traduite du rétrotransposon humain
L1, est un argument.
L'interférence transcriptionnelle comme élément de
régulations a surtout été caractérisée dans des
génomes extrachromosomiques, comme phages,
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plasmides, etc… Cela est probablement lié à la
compacité de ces génomes.
L'obstruction d'un promoteur par un complexe
d'élongation du messager est possible car le transit
d'un promoteur d'E.coli prend 2-3 secondes et un
promoteur fort comme le pL du bactériophage λ, qui
se déclenche toutes les 4,5 secondes ne peut que
ralentir de moitié l'activité d'un promoteur faible en
aval ne laissant pas le temps à un complexe de
transcription de s'installer. Pour que l'effet observé soit
plus accusé il faudrait que la polymérase fasse une
pause au niveau du promoteur en aval.
4.### SP Briggs et al.; Plant Physiology 138
(JUN05) 542-544 s'intéressent aux réseaux
d'expression génique. Ces réseaux ont permis de
caractériser les réseaux génétiques en comparant les
patrons d'expression de gènes dans différentes
conditions.
Les réseaux de miRNAs viennent s'y ajouter. Ces
miRNAs sont, on le sait, des régulateurs très
importants (ils régulent probablement le niveau de
10% des protéines). Les gènes qui les codent
représente 1% des gènes humains et 7% des gènes
d'Arabidopsis et interviennent sur 10% des gènes de la
plante. Dans la mesure où le ciblage est lié à une
homologie de séquence entre miRNA et son gène
cible, le repérage est relativement facile.
On commence à pouvoir déceler systématiquement
les cibles des facteurs de transcription en repérant
les facteurs sur la chromatine de la séquence cible.
Malheureusement ces techniques ne sont pas encore
assez fiables.
La mise en œuvre des réseaux de type "tiling" (des
sondes oligonucléotidiques chevauchantes et couvrant
la totalité du génome, si j'ai bien compris) est possible
et leur avantage est d'éviter tout biais. Mais leur coûts
est prohibitifs si on veut repérer tous les sites de
fixation d'une protéine liant l'ADN. Les réseaux de
promoteurs sont plus simples et donc moins coûteux,
mais sont limités par la qualité des annotations
géniques. Ils sont intéressants pour la description des
réseaux d'expression en aval de la fixation d'une
protéine régulatrice sur l'ADN.
Maintenant, si on veut travailler en amont d'un gène,
on peut déterminer si un gène immunoprécipité avec
une protéine liée, entraîne également une autre. Mais
il faut disposer d'une idée préalable sur l'identité de
cette protéine, rien à faire si on ne dispose pas de cette
donnée, et on ne pourra pas découvrir une protéine
insoupçonnée.
On peut également utiliser des combinaisons gènereporteur et observer si cette expression ne serait pas
modifiée chez certains mutants. Ceci donnerait une
indication sur les régulations en amont d'un gène.
Mais on ne saura pas, ainsi, s'il s'agit d'un effet direct
ou indirect.
Enfin, une technique intéressante est celle qui
consiste à réprimer l'expression d'un gène et à voir
quels sont les autres gènes dont l'expression est
modifiée. Il n'est cependant pas possible de
déterminer si cela est un effet direct ou indirect. Cette
technique a été appliquée de façon systématique au
maïs mais, jusqu'à présent, et à cause de
l'impossibilité de multiplexer les collections de
mutants, on ne peut reconstituer de larges réseaux
de transcription.
L'utilisation de code-barre ADN pour marquer des
mutants de délétion a permis de reconstituer les
interactions
fonctionnelles
intervenant
dans
l'adaptabilité de Saccharomyces cerevisiae. On
mélange à quantités égales les divers mutants, et on
laisse la compétition jouer. On détecte ensuite par
réseau de codes-barre les proportions des mutants dans
la population à un instant donné. On détecte ainsi les
mutants ayant un avantage sélectif dans des conditions
données.
On a également pu, ainsi, détecter des synthétiques
létaux, c'est à dire des mutants viables avec une
mutation et létaux quand la mutation est combinée
avec une autre. En moyenne chaque gène possède une
trentaine de partenaires létaux qui ont des fonctions
apparentées. Quand plusieurs gènes ont les mêmes
partenaires, ils font partie d'une même voie.
Chez la levure on estime à 100 000 le nombre
d'interactions synthétiques létale (les interactions
protéines/protéines sont estimées à 25 000).
Si l'application aux plantes serait souhaitable, il faut
réaliser que le nombre de croisements à réaliser, puis
analyser, serait d'environ 350 millions. Autant dire
que cela est impossible et d'autres techniques
viendront supplanter cette technique entre temps.
On pourrait imiter le système de code-barre de la
levure en marquant des gènes suppresseurs
dominants, exprimés de façon transitoire dans des
cellules de plantes en division. Des suppresseurs de
tous les gènes seraient introduits et repérés sur un
réseau après culture. Tout code-barre disparaissant
quand on introduit un gène serait nécessaire à la
viabilité. C'est une forme de létal synthétique.
Ces
suppresseurs
dominants
pourraient
correspondre à un VIGS (Virus Induced Gene
Silencing) ou un facteur de transcription artificiel.
On n'aurait plus que quelques dizaines de milliers de
caractérisations (on connaît, par exemple, 6 378 gènes
chez Arabidopsis).
Les facteurs artificiels de transcription pourraient
être utilisés pour examiner les conséquences d'une
surexpression, car cette dernière est difficile à obtenir
systématiquement. On pourrait d'ailleurs jouer à
transformer un activateur en répresseur en
recombinant les domaines. Fusionnés avec un
domaine de transduction dans Escherichia coli, on
pourrait inoculer la protéine et s'épargner les coûts de
la transformation.
L'auteur a pratiqué une substitution d'allèles variants
dans des souches recombinantes inbred sauvages
d'Arabidopsis et examiné les fluctuations de
l'expression, déterminant ainsi les régulateurs.
Les régulations post-transcriptionnelles sont
indépendantes des transcriptionnelles, et les
variations des messagers ne sont pas des indications
complètes. Les conclusions de l'auteur sont que les
réseaux biochimiques sont mécanistiques mais ne
permettent pas des prédictions fiables des
interactions, tandis que les réseaux génétiques
révèlent des relations quantitatives, mais pas les
mécanismes sous-jacents.
La recherche des gènes à l'intersection de
plusieurs réseaux génétiques a été pratiquée,
3
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notamment avec les multiples partenaires de SGT1
(suppressor of the G2 allele of Skp1) dans l'infection
par Magnaporthe. Chez l'orge et Arabidopsis, SGT1
intervient dans la résistance. On a trouvé plusieurs
autres protéines du riz interagissant avec SGT1 dans
un système à doubles hybrides chez la levure. L'une
d'entre elles, ERP (Elicitor-Response Protein), est
induite par un stress et d'autres par un éliciteur de
Magnaporthe. On peut utiliser ERP comme sonde
pour piéger d'autres protéines interagissant avec elle,
et l'une d'entre elles, inconnue jusqu'à présent, se
révèle indispensable à la résistance au champignon..
5.
Chez
Schizosaccharomyces
pombe,
L'interférence ARN (RNAi) fait intervenir des
transcrits péricentromériques comme siRNAs
(small interfering RNAs), et elle est nécessaire à
l'assemblage de la chromatine correspondante. H Kato
et al.; Science 309 (15JUL05) 467-469 montrent que
c'est l'ARN polymérase II (la transcriptase des
messagers) qui est probablement impliquée dans le
couplage de la transcription péricentromérique
avec la maturation des siRNAs et l'assemblage de la
chromatine. Cette polymérase est un très gros
complexe aux multiples composants.
6. La présence de Wolbachia (une bactérie
symbiote
d'innombrables
invertébrés)
peut
sérieusement perturber la signification des
expériences sur la Drosophile. Elle peut, en effet,
masquer les effets d'une mutation.
La mutation de Sex-lethal empêche les femelles de
former des œufs. La présence de la bactérie rétablit
cette production chez les mutantes. Par ailleurs des
Drosophiles ayant des durées de vie différentes
meurent au même âge quand on les débarrasse des
Wolbachia par la tétracycline. Or dans la collection du
Bloomington Stock Center à Indiana University, 30%
des souches sont infectées. C Ainsworth; Nature 436
(07JUL05) 8 se base sur un article de ME Clark et al.;
Genetics 170 (AUG05) 1667-1675.
7.### Les kinases Aurora B interviennent dans les
divisions cellulaires des eucaryotes. Elles participent
à la phosphorylation de l'histone H3 qui marque
l'entrée en mitose ou méiose qui concorde avec la
condensation des chromosomes. On en connaît deux
familles, avec les Aurora/Ipl1 de la levure et de
Caenorhabditis elegans, et Tousled des cellules
humaines. Les kinases Aurora phosphorylent un
substrat qui joue alors le rôle de sous-unité
régulatrice positive de la phosphorylation de H3.
Les
kinases
Tousled
assurent
bien
la
phosphorylation de H3, mais la kinase Tousled-like,
TLK-1, de C.elegans en semble incapable. Ce rôle
est assuré par une autre kinase orthologue d'Aurora B,
AIR-2, qui possède de multiples rôles. TLK-1 est,
elle, un substrat activateur d'AIR-2,. Z Han et al.;
Current Biology 15, (24MAY05) 894-904 Les deux
kinases agissent donc conjointement. Voir le
commentaire de CT Richie et al.; Current Biology 15
(24MAY05) R379-R382.
8. OE Blacque et al.; Current Biology 15
(24MAY05) 935-941 s'intéressent à la génomique
fonctionnelle des cils (et flagelles). Ils ont analysé le
système de transport intraflagellaire (le long de
l'axonème du cil) qui permet l'assemblage et la
maintenance de l'appareil moteur. Ils ont comparé les
cellules neuronales ciliées et des cellules non ciliées
de Caenorhabditis elegans par la technique SAGE
(Serial Analysis of Gene Expression). Cette technique
implique la préparation de bibliothèques de cDNAs
spéciaux enchaînant de très courts segments d'ADN
(9-14 pb) agissant comme marqueurs spécifiques des
transcrits. La comparaison des séquences de ces
inserts permet de quantifier le niveau d'expression de
nombreux transcrits simultanément. Les auteurs ont,
par ailleurs, observé l'effet d'un facteur de
transcription ciliogène. Ils ont, en quelque sorte, décrit
un transcriptome du cil.
Ceci leur a permis d'identifier de nombreux gènes
impliqués dans le cil. Ils ont confirmé leur fonction
pour 14 d'entre eux. DYF-13, une protéine conservée
au cours de l'évolution, est un élément essentiel du
transport intra-ciliaire.
Les Productions Végétales
Les gènes et les génomes
9. La disponibilité de séquences génomiques
complexes permet une étude comparée de la structure
des génomes. AL Caicedo et al.; Plant Physiology 138
(JUN05) 545-547 donnent un aperçu des possibilités.
Malheureusement, faute de financements, très peu de
génomes végétaux ont été élucidés en totalité (riz et
Arabidopsis).
On ne connaît que très peu de choses sur la
dynamique des changements de cette structure et ses
conséquences sur le contenu génique et son évolution.
Cela inclut les duplications (et plus généralement
polyploïdisations) souvent évoquées, l'origine et
l'extinction des gènes, les rôles des éléments mobiles.
La sélection parmi ces modifications est une
question intéressante, dont celle des modifications
épigénétiques.
Les fonctions assurées par les génomes et leur
évolution peuvent être abordées, car on sait
4
maintenant caractériser les régions ayant une
importance fonctionnelle. Ainsi l'analyse du
polymorphisme de paires de base individuelles, avec
sa distribution très inégale le long du génome, est un
discriminateur appréciable. La quantification des
variations au sein d'une espèce aide à l'identification
des loci sous pression de sélection, qui se traduit par
des patrons de variation différant selon les zones du
génome.
Il existe, par ailleurs, une variabilité phénotypique
de certains caractères au sein d'une espèce (voir la
comparaison entre les écotypes Landsberg erecta et
Columbia d'Arabidopsis) et des déséquilibres de
ségrégation avec des marqueurs peuvent fournir des
données. .
L'existence de réseaux d'interactions au sein
d'unités fonctionnelles intégrées est maintenant
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connue, mais pas dans leurs détails. L'impact sur la
sélection est une question à résoudre.
La génomique des populations intègrent, à un
niveau supérieur, ces interactions et leur impact sur les
gènes, avec les flux de gènes, l'expansion de l'aire de
répartition, les goulot d'étranglement et les dérives
génétiques conséquentes. C'est d'ailleurs à ce niveau
que la sélection est la plus intéressante.
Mais comme les données moléculaires accumulées
(comme les séquences) portent sur des espèces
relativement éloignées et peu nombreuses, les
résultats des analyses vont porter sur des
ramifications relativement profondes de l'arbre
évolutif, les plantes étant relativement peu favorisées
dans ce contexte, par rapport à ce qui se passe du côté
des animaux.
La conservation des séquences indique une pression
de sélection stabilisatrice en faveur de fonctions
importantes. Les séquences importantes dans les
régulations sont, plus difficiles à caractériser
globalement. Une analyse de ce type a été pratiquée
pour l'annotation des génomes animaux et de levure.
Encore une fois les plantes ne sont pas très favorisées.
Régions codantes et régulatrices peuvent être
identifiées en localisant les régions soumises à la
sélection purificatrice. Cette dernière agit
principalement (mais pas uniquement) en éliminant
des mutations désavantageuses, impliquant la
conservation des mutations neutres. Ce principe a été
la base de la théorie neutraliste de l'évolution.
Partout émerge le besoin de disposer de plus de
séquences de plantes différentes.
Le développement
10.### LP Taylor et al.; Current Opinion in Plant
Biology 8 (JUN05) 317-323 analysent le rôle des
flavonoïdes dans le développement des plantes. Ces
produits longtemps considérés comme des métabolites
secondaires, et donc non indispensables, affectent, en
réalité, plusieurs étapes du développement. Ce sont
également des signaux bioactifs perçus par les
microorganismes, des substances allélochimiques
(signaux vers d'autres plantes, souvent d'exclusion),
sans parler de leur rôle dans la nutrition des
herbivores comme nous. La question est de savoir si
ces multiples actions reflètent leur diversité où
l'existence de "récepteurs" communs conservés. Les
flavonoïdes interviennent dans les signaux
hormonaux, la germination du pollen, la protection
contre les UV-B, et agissent comme phytoalexines, en
sus des effets allélopathiques. On connaît leurs effets
dans la nodulation par les divers Rhizobium.
Il n'est d'ailleurs pas sûr que les mêmes substances
aient les mêmes fonctions chez deux espèces
différentes, les flavonoïdes étant un stock de
substances dans lequel la sélection a pu utiliser une
fonction plutôt qu'une autre.
Les auteurs analysent le rôle des flavonoïdes dans
le transport de l'auxine en s'appuyant sur leur
compétition avec un inhibiteur d'efflux de l'auxine.
Ceci a permis d'identifier deux complexes récepteurs
dont un contient une aminopeptidase (AtAPM1)
membranaire sensible aux flavonols, et l'autre
ressemble aux transporteurs MDR des Mammifères
(MultiDrug Resistance) à cassette liant l'ATP.
Le rôle des flavonoïdes est souligné par les
mutations transparent testa 4 (tt4) dans le gène de la
chalcone synthase (CHS),qui sert d'entrée dans la
voie de synthèse des flavonoïdes. Ces mutants
présentent
de
nombreuses
anomalies
du
développement liées aux perturbations du transport
orienté de l'auxine, toutes compensables par addition
de naringénine, un intermédiaire dans cette voie.
Mais le mécanisme exact d'interférence avec le
transport d'auxine reste inconnu. On en a quelques
indications avec des modifications de localisation des
protéines PIN (il en existe au moins cinq chez
Arabidopsis, voir, par exemple, NJ Kaplinsky et al.;
Science 306 (29OCT04) 822-823 ou le Bulletin de
Mars §19), mais on n'a pas encore pu établir s'il s'agit
d'une intervention directe ou indirecte. La protéine
PINOID (PID) est une sérine/thréonine kinase qui
localise PIN1 et pourrait être la cible de
flavonoïdes.
Au moins chez le trèfle blanc, les flavonoïdes sont
également impliqués dans l'inhibition de la
destruction de l'auxine par des peroxydases. Les
flavonoïdes sont très probablement des régulateurs
non essentiels, mais régulateurs quand même. Mais
l'extrapolation entre plantes différentes n'est encore
pas vraiment possible.
Les flavonoïdes sont vraisemblablement synthétisés
par des complexes multienzymatiques à la surface du
réticulum
endoplasmique,
et
sont
donc
vraisemblablement sécrétés, mais il doit en rester dans
le cytoplasme pour expliquer leurs effets.
C'est chez le maïs (et chez les Pétunias) que le rôle
des flavonoïdes (particulièrement des anthocyanes,
pigmentées) dans la germination du pollen a été le
mieux établi. Le métabolisme des flavonols dans le
tapetum de l'anthère et leur glycosylation dans le
pollen pour donner un galactoside hydrosoluble,
grâce à une UDP-galactosyltransférase spécifique du
pollen, a été établi.
Cet effet sur la germination du pollen est observé
depuis les gymnospermes jusqu'aux angiospermes. Il
est donc apparu très tôt chez les végétaux terrestres.
Chez les mutants tt4 d'Arabidopsis une certaine
fertilité est conservée, indiquant que d'autres
substances favorisent la croissance du tube pollinique.
Cet effet existe également à la pointe des poils
absorbants, donc vraisemblablement par le même
mécanisme. Mais curieusement chez ces mutants la
transplantation dans le sol fait disparaître
progressivement le phénotype.
Le rôle des flavonoïdes dans les bienfaits
prébiotiques est soutenu par beaucoup de chercheurs
(et spécialistes du marketing). Beaucoup de ces effets
sont explicables par leurs effets anti-oxydants
(probablement impliqués dans la protection de la
plante contre les UV-B).
Ce sont également des toxines naturelles contre les
plantes voisines (substances allélopathiques). Ainsi
la (-)-catéchine est une puissante phytotoxine
sécrétées par les racines de Centaurea maculosa, ce
qui en fait une plante fortement invasive. Le
mécanisme d'action n'en est pas bien établi. La
neutralisation de ces toxines implique des
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Le Bulletin des BioTechnologies – Août 2005 – n°231
modifications chimiques, une séquestration vacuolaire
ou une excrétion.
On a pu isoler, chez Arabidopsis, des mutants
résistants au sirtinol (sir-1). SIR1 agît comme un
régulateur des signaux auxine et le sirtinol interagît
avec un site fixant l'ATP dans la protéine SIR1.
11. T Paciorek et al.; Nature 435 (30JUN05) 12511256 montrent que l'auxine inhibe l'endocytose et
stimule son efflux hors des cellules.
Ce genre de régulations jouant sur la localisation
des protéines régulatrices est basé sur le
déplacement et le recyclage de vésicules
(constitutive cycling) avec des internalisations et
recyclages de protéines membranaires. C'est le cas des
facilitateurs d'efflux de l'auxine PIN. Ce mécanisme
implique
la
mégaprotéine
probablement
multifonctionnelle
BIG.
L'auxine
régule
l'abondance de PIN et son activité à la surface des
cellules dans le cadre d'une régulation en boucle du
transport de l'auxine.
gestion de l'eau.
L Chaerle et al.; Trends in
Biotechnology 23 (JUN05) 308-315.
La technique visée est une amélioration du
fonctionnement des stomates. Ces stomates ont des
tâches contradictoires, laisser passer le CO2 vers
l'intérieur pour permettre la fixation photosynthétique
du carbone et l'évaporation de l'eau. Un indice qui
rapporte l'assimilation du carbone à la quantité d'eau
évaporée quantifie cette efficacité (WUE pour Water
Use Efficiency).
De nombreux facteurs environnementaux comme la
lumière, la présence d'eau la température, la
concentration du CO2 atmosphérique régulent la
formation et le fonctionnement des deux cellules de
garde des stomates. Mais des signaux internes, comme
des signaux hormonaux interviennent également.
La Physiologie des Plantes
12.### Des chercheurs de Ghent se préoccupe de
l'amélioration des plantes en perfectionnant leur
Les Symbioses
13. On trouvera dans B Hause et al.; Planta 221
(MAY05) 184-196 une revue sur les aspects
moléculaire
des
symbioses
mycorrhiziennes
arbusculaires. Les Glomales sont un petit groupe
mais très répandu assurant ces symbioses
intracellulaires très anciennes sur le plan évolutif et
qui ont sélectionné la mise en place de systèmes
utilisés par des symbioses microbiennes plus tardives.
Les auteurs insistent plus sur les modifications des
cellules colonisées, les défenses déclenchées par la
pénétration du champignon et les transferts entre les
deux partenaires.
14. Le coût en carbone de la symbiose
mycorrhiziennes arbusculaires (AM) pour la vigne a
été mesuré par des chercheurs sud-africains
PE Mortimer et al.; Mycorrhiza 15 (MAY05) 159-165.
Ils ont utilisé des plants d'un an colonisé par Glomus
etunicatum et mesuré les échanges en C et P. Le plant
de vigne dormant utilise massivement son carbone lors
de la reprise de la végétation et entre alors en
compétition avec le champignon. C'est surtout la tige
qui fournit le carbone au champignon.
Une fois établie la symbiose AM améliore le
transport de P mais ceci se fait aux dépens de la
recharge des réserves de C dans les racines. Le déclin
de la colonisation après deux mois est accompagné par
un une réaccumulation de C et une croissance dans la
tige.
15. Des chercheurs de Genève (S Guimil et al.;
Proceedings of the National Academy of Sciences USA
102 (31MAY05) 8066-8070) ont analysé les symbioses
mycorrhiziennes arbusculaires du riz. Ils montrent
que l'expression de 224 gènes est affectée. Ils ont
comparé ces profils à ceux induits par les pathogènes
Magnaporthe grisea et Fusarium moniliforme. Un jeu
de gènes est exprimé par la plante de façon similaire
dans les trois situations, indiquant une réponse
conservée. Ils ont ainsi pu définir des gènes qui sont
probablement impliqués dans la compatibilité entre
les champignons et la plante, quelle que soit l'issue de
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la confrontation, et un autre jeu qui intervient dans le
développement de la maladie.
Une partie des gènes du premier jeu sont impliqués
dans le transport des phosphates et l'addition de
phosphates mime, pour 8% d'entre eux, l'effet de la
symbiose. Les phosphates transportés du champignon
à la plante sont donc des signaux indirects de la
symbiose. Les auteurs montrent, par ailleurs que 34%
des gènes étudiés se comportent de la même façon
chez les Dicotylédones.
16. Deux facteurs de transcription probables, NSP1
et NSP2 (pour Nodulation Signaling Pathway), jouent
des rôles complémentaires mais distincts dans la
régulation du développement des nodules des
Légumineuses. P Kalo et al.; Science 308 (17JUN05)
1786-1789 de Norwich ont étudié NSP2, tandis que
P Smit et al.; Science 308 (17JUN05) 1789-1791 de
Wageningen ont identifié NSP1. Ces deux protéines
font partie de la famille dite GRAS ( (GAI, RGA,
SCR
pour
GIBBERELLIN-INSENSITIVE,
REPRESSOR of ga1-3, SCR SCARECROW). Ces
protéines partagent un domaine C-terminal très
conservé et le complètent par un domaine N-terminal
variable.
La plante émet des flavonoïdes qui induisent la
production de chito-oligosaccharides (facteurs Nod)
par le Rhizobium. Un récepteur probable du facteur
Nod et un canal plastidial à cations intervenant aux
stades précoces de la nodulation avaient été décelés.
Maintenant on s'attaque au tout premier stade.
On savait que les mutations nsp1 et nsp2
n'induisent pas la flambée d'expression qui suit
habituellement la perception de Nod par les poils
absorbants. Les deux groupes ont cloné ces deux
gènes chez Medicago truncatula.
NSP1 et NSP2 sont localisées dans le noyau, donc
au voisinage de la kinase calmoduline dépendante
(CCaMK), agissant en amont et aux séquences cibles
potentielles. Cette localisation implique un rôle de
NSP1 dans la transduction du signal calcium qui est
Le Bulletin des BioTechnologies – Août 2005 – n°231
un évènement très précoce de la réponse à Nod. NSP1
est actif en permanence et NSP2, activé passe dans le
noyau à partir de l'enveloppe nucléaire, agit en aval de
la flambée de calcium et de la kinase CCaMK. Tout
indique que les deux protéines donnent un
hétérodimère. Mais ce qui se passe en aval est moins
clair, car des effets pléiotropes interviennent. On
trouvera d'ailleurs une revue sur cette phase de la
nodulation dans R Geurts et al.; Current Opinion in
Plant Biology 8 (AUG05) 346-352.
Selon les commentateurs I Ganguli; The Scientist
(20JUN05) et MK Udvardi et al.; Science 308
(17JUN05) 1749-1750, ce mécanisme est important,
car il fonctionne également, depuis 460 millions
d'années dans les interactions avec les champignons
mycorhiziens, et a été capturé par les nématodes des
plantes, il y a moins de 20 millions d'années pour
organiser leurs sites d'insertion dans les plantes qu'ils
parasitent (voir RR Weerasinghe et al.; Proceedings of
the National Academy of Sciences USA 102
(22FEB05) 3147-3152 qui suggèrent que les
nématodes ont vraisemblablement emprunté le
mécanisme aux Rhizobium).
17. E Limpens et al.; Proceedings of the National
Academy of Sciences USA 102 (19JUL05) 1037510380 décrivent un gène qui contribuent à la
formation des symbiosomes. Ceux-ci sont des
structures membranaires de la plante enrobant un ou
plusieurs bactéroïdes. Ce gène a été appelé DMI-2
(pour DOES NOT MAKE INFECTIONS 2) et code
un récepteur à kinase. Chez les Légumineuses
primitives les Rhizobium sont hébergés dans le
cordon infectieux qui est entouré par des parois
végétales et donc reste, de fait, extra-cellulaire. Une
réduction de l'expression de DMI-2 entraîne un
phénotype proche des Légumineuses primitives avec
des nodules à croissance indéterminée.
18. La souche Rhizobium tropici CIAT8999-10T est
une souche isolée au CIAT à Cali qui est mutée dans
le gène guaB ce qui l'empêche de former des nodules
fonctionnels (ils sont vides de bactéroïdes). La
fonction codée par guaB est nécessaire aux stades
précoces de la nodulation. Les auteurs ont obtenu un
mutant guaB mutant dérivant de Sinorhizobium
meliloti 1021 qui, contrairement à celui de R.tropici,
est bien auxotrophe pour la guanine, mais induit des
nodules normaux chez la Luzerne et Medicago
truncatula. Le mutant guaB de R.tropici est également
défectif dans sa symbiose avec Macroptilium
atropurpureum et Vigna unguiculata, mais normal
chez Leucaena leucocephala. Ceci indique clairement
que guaB est nécessaire à la symbiose avec des plantes
formant des nodules "évolué" à croissance
déterminée.
Les Pathogènes des Plantes et les Mécanismes de Défense
19. La reconnaissance de composants des
pathogènes par le système des gènes R associe, très
souvent, les protéines RAR1 et SGT1b. RAR1
permettent la préactivation de la protéine R par un
mécanisme encore inconnu. BF Holt et al.; Science
309 (05AUG05) 929-932 montrent que la protéine
SGT1b d'Arabidopsis possède deux fonctions
génétiquement distinctes : SGT1b s'oppose à RAR1
pour limiter l'accumulation de la protéine R, avant une
infection et, par ailleurs, possède une fonction RAR1indépendante sur la mort cellulaire programmée
durant l'infection.
RT Leister et al.; The Plant Cell 17 (APR05) 12681278 montrent que la protéine SGT1 (voir le §4)
complémente l'activité du gène de résistance Bs2 du
poivron (Capsicum annuum) à Xanthomonas
campestris pv vesicatoria (Xcv) exprimant l'effecteur
AvrBs2. Dès la détection d' AvrBs2, la plante
déclenche une cascade de signaux. Les auteurs
montrent que Bs2 s'associe à SGT1 via son domaine
LRR. Il est vraisemblable que SGT1 puisse intervenir
sur la conformation fonctionnelle de Bs2
(chaperone) ou sur la formation d'un complexe Bs2SGT1 nécessaire à la résistance.
20. Chez les plantes, le PTGS (Post-Transcriptional
Gene Silencing) est un système anti-viral. Un virus
qui réussit son infection a donc appris à tourner cet
obstacle en supprimant ou en ignorant la réponse
de la plante. Les siRNAs (small interfering RNAs)
responsable de ce "silencing" s'accumulent dans les
plantes infectées par des virus à génome positif
(directement traductibles). Des chercheurs hongrois
(A Molnar et al.; Journal of Virology 79,n°12
(JUN05) 7812-7818) ont caractérisé les séquences des
siRNAs spécifiques du Cymbidium ringspot
tombusvirus (CymRSV) dans les plantes infectées.
Elles correspondent à une distribution non aléatoire
le long du génome viral, ce qui suggère qu'il existe
des points chauds.
Les siRNAs liés à la protéine suppresseur p19 du
CymRSV présentent la même asymétrie dans leur
polarité (sens ou antisens) que les siRNAs qui ont été
séquencés, et sont des duplexes imparfaits. Les
siRNAs sont issus du clivage direct par DICER de
régions les plus repliées des duplexes imparfaits des
brins (+) de l'ARN viral. Par ailleurs, un TMV
(Tobacco mosaic virus) porteur de courtes répétitions
inversées du gène de la phytoène désaturase
entraîne une plus forte production de siRNAs
correspondant au gène que la séquence antisens. Tout
ceci indique que le brin plus du virus est plus actif
dans l'induction des siRNAs que le brin
complémentaire.
21.### L'article de SJ Gurr et al.; Trends in
Biotechnology 23 (JUN05) 283-290 portant sur les
stratégies de montages de résistances des plantes, en
jouant sur les régulations de ces résistances pour
éviter le gaspillage d'énergie (et donc maintenir ou
augmenter les rendements) par les plantes a été
analysé dans le Bulletin de Juillet §36. Il est
accompagné par une revue complémentaire des
mêmes auteurs sur les gènes pouvant être utilisés.
SJ Gurr et al.; Trends in Biotechnology 23 (JUN05)
275-282.
On ne manque pas de gènes de résistances dans
beaucoup de cas. On peut utiliser des gènes propres à
la plante, des gènes de plantes apparentées, de
pathogènes, voire complètement synthétiques, les
7
Le Bulletin des BioTechnologies – Août 2005 – n°231
exprimer localement sous la commande du pathogène,
dans un tissu donné, faire intervenir l'interférence
ARN. Lesquels utiliser est la question posée quand
on veut pouvoir monter des résistances durables.
En fait, ce qui est admirable c'est qu'il y ait si peu
de maladies graves dans la nature. Nous augmentons
la fréquence de certaines par la domestication de
variétés bien sous tout rapport, mais homogènes et
donc, quand sensibles à un pathogène, subissant des
dégâts généralisés. On pense alors seulement comment
y faire face, et on fait, alors, le bonheur des fabricants
de pesticides, jusqu'à la prochaine alerte, ce qui fait
que des résistances durables sont recherchées et
probablement plus économiques, malgré les
investissements
scientifiques
importants.
Malheureusement la lutte contre les champignons et
les bactéries par transgènes a été, jusqu'à présent,
généralement infructueuse pour des plantes
commerciales.
Les plantes sont rarement malades, car elles
accumulent les couches de protection, depuis des
barrières physiques et des antimicrobiens préformés
jusqu'à des défenses adaptatives diverses.
Les échecs des transgènes ne sont, le plus souvent,
pas dus à la nature du transgène, mais à la façon de
l'exprimer (voir le Bulletin de Juillet§36) qui retentit
sur d'autres aspects économiques de la plante.
Il existe des systèmes de surveillance propres à la
plante détectant la présence de pathogènes. C'est le
cas des gènes R bien connus, reconnaissant les gènes
dits d'"avirulence" qui trahissent la présence d'une
race particulière de pathogène et déclenchent les
défenses.
Les stratégies s'appuyant sur ces gènes R sont
communes
aux
approches
classiques
et
transgéniques. On a quelques exemples de succès
avec des résistances durables comme celle conférée à
la tomate par le gène Bs2 du poivron à Xanthomonas
campestris pv.vesicatoria (voir le §19).
Le problème, en fait, avec ces gènes R est la
spécificité parfois très étroite. Il faut donc empiler de
multiples gènes de résistances différents pour avoir à
la fois une durabilité et une couverture large contre de
nombreux pathogènes voisins. On a, ainsi, empilé
quatre gènes de résistances à Xanthomonas oryzae
pv.oryzae.
Mais si on dispose de nombreux gènes R dans de
nombreuses plantes, leur efficacité et leur spécificité
n'est pas garantie dans une autre plante ou dans un
contexte génétique différent.
Une autre difficulté réside dans le fait que ces
résistances empilées donnent parfois lieu à un
déclenchement inopiné, en l'absence du pathogène,
ce qui entraîne des dégâts. Il arrive que ceci soit dû à
un niveau d'expression inapproprié. Enfin l'expression
de ces gènes a un coût pour la plante, comme cela a
été constaté chez Arabidopsis avec le gène RPM1 de
résistance au pathovar maculicola de Pseudomonas
syringae.
Il existe par ailleurs des systèmes de perception
plus large, du type inné, avec la reconnaissance de
patrons moléculaires comme la présence de
flagelline reconnue par le récepteur RLK (Receptor
Like Kinase), FLS2 reconnaissant un motif conservé
d'amino acides des flagellines bactériennes.
8
Deux stratégies sont possibles pour l'exploitation de
ce type de défenses. L'une serait de forcer l'expression
des RLKs qui sont déployés en même temps que
FLS2 par un traitement par la flagelline (mais est-ce
rentable économiquement?). L'autre consisterait en
une introduction de ce type de récepteurs dans des
cultivars qui en seraient dépourvus. Ainsi l'écotype
Ws-0 d'Arabidopsis est insensible à la flagelline à la
suite d'une interruption du gène FLS2. On peut
corriger ce défaut en introduisant un transgène
complet avec son promoteur. Il n'est, cependant, pas
sûr que l'on puisse obtenir le même résultat avec une
expression hétérologue.
Une stratégie alternative est de faire exprimer par
la plante transgénique un éliciteur du pathogène
sous la commande d'un promoteur activé par le
pathogène.
Une troisième stratégie consiste à s'attaquer
directement à la pathogénicité, en ciblant les
effecteurs injectés par le système de sécrétion de type
III (on a beaucoup étudié le système de Pseudomonas
syringae) tout particulièrement les composants
neutralisant les défenses de la plante.
On peut utiliser des défenses entièrement
hétérologues, comme des anticorps, comme cela a
été fait dès 1993 pour l'artichoke mottled crinkle
virus. On peut fusionner des anticorps contre un
Fusarium avec un peptide antimicrobien et obtenir
ainsi une résistance chez Arabidopsis contre Fusarium
oxysporum f.sp.matthiolae.
Ces derniers temps, c'est l'exploitation des défenses
antivirales naturelles contre les virus par
l'interférence ARN qui occupe le devant de la scène.
On ainsi obtenu des résistances chez plusieurs
Solanées cultivées. Rappelons que des papayer
résistants aux papaya ringspot virus (PRSV) ont été
monté en urgence en 1994 devant une crise majeure,
et sont commercialisés depuis.
Une des idées d'intervention avancée sur les
résistances consiste à déceler les facteurs de
transcription et autres "master switches" qui
gouvernent l'ensemble des gènes de défense. Mais il
ne faut pas imaginer que ce type de manipulations
n'ait pas sa contrepartie sur d'autres mécanismes
essentiels de la plante. Il faut donc bien connaître le
système. Un des problèmes rencontrés est que les
facteurs de transcription font souvent partie de
grandes familles et que inactivation d'un gène ne
donne souvent aucun phénotype décelable du fait de
redondances. Les facteurs de transcription WRKY en
constituent un exemple. Ils contiennent tous le motif
de quatre acides aminés correspondants. Ils
interviennent dans la sénescence, les défenses contre
les agressions, la formation des trichomes, etc… Il en
existe 72 chez Arabidopsis et leurs fonctions sont
toutes étudiées à Purdue University. On va bien finir
par dégager ceux qui pourraient être utilisés avec le
plus de profit. On a déjà dégagé WRKY18, WRKY29
et WRKY70. Leur surexpression augmente la
résistance à P.syringae et, pour WRKY70, à Erwinia
carotovora subsp carotovora. Les auteurs citent
plusieurs autres exemples.
On peut également agir en amont des facteurs de
transcription, en intervenant sur les MAP kinases
dans les cascades de signaux. Ainsi NPR1 est un
Le Bulletin des BioTechnologies – Août 2005 – n°231
nœud dans les réseaux de défenses associant
résistance systémique acquise (SAR), résistance
systémique induite (ISR), résistances par les gènes
R, acide salicylique, acide jasmonique et éthylène,
mais gare aux effets non intentionnels sur le reste du
métabolisme.
Dans le cas de la SAR, on a un état plus réducteur
dans la cellule ce qui entraîne la conversion des
oligomères de NPR1 inactifs en monomères actifs
qui migrent vers le noyau où, en interaction avec les
facteurs TGA, ils deviennent des facteurs de
transcription. On peut utiliser NPR1 car, surexprimé,
il entraîne une résistance à divers pathogènes. Cet
effet est économe car on ne fait que préparer la plante
à réagir, sans déclencher les défenses inutiles.
Il semble, par ailleurs, exister des signaux
lipidiques utilisables, comme DIR1 (DEFECTIVE IN
INDUCED RESISTANCE 1) qui intervient très
probablement dans les défenses systémiques, et SFD1
(SUPPRESSSOR OF FATTY ACID DESATURASE
DEFICIENCY 1, gène codant la dihydroxyacétone
phosphate réductase). Par ailleurs, une lipase activée
par la fixation de l'acide salicylique, SABP2 (SA
Binding Protein 2) intervient dans les défenses.
Les phytoalexines, des antimicrobiens de faible
masse moléculaire, sont connues depuis longtemps.
Ils dépendent souvent de la famille de la plante. Ce
sont souvent des sesquiterpènes chez les Solanacées,
et des isoflavonoides chez les Papilionacées, et ne
peuvent probablement pas être synthétisés chez
d'autres plantes. Mais on s'est surtout intéressé aux
protéines antimicrobiennes. Elles ont le défaut de
n'être souvent efficaces que contre une gamme
restreinte de pathogènes. Comme souvent dans ce
cas, on peut les empiler dans une plante. Ce sont
généralement de petits peptides lytiques (dont les
défensines de plantes) interagissant directement avec
les membranes microbiennes.
Il existe, par ailleurs, les protéines PR
(Pathogenesis Related) souvent évoquées dans ce
Bulletin. On a construit de multiples plantes
recombinantes surexprimant l'une ou l'autre de ces
protéines avec une augmentation des résistances.
Les syntaxines sont des SNAREs (Soluble N-ethyl
maleimide sensitive factor Adaptor protein REceptors)
qui jouent un rôle dans la fusion des vésicules de
transport chez tous les eucaryotes et caractérisées par
un motif conservé. Il en existe 24 chez Arabidopsis
qui ont été dénommées syntaxines de plantes (SYPs).
Enfin la manipulation de la réaction
hypersensible (HR), celle qui cause une nécrose
localisée autour du point d'infection, peut être
envisagée, mais là aussi avec des précautions pour
éviter de détruire toute la plante de façon
intempestive. Or les promoteurs utilisables ont tous
un bruit de fond suffisamment important pour que
ce risque soit réel. On ne maque donc pas de
solutions envisageables mais toutes ont des contreindications qu'il faut éliminer avant de produire une
plante commercialisable.
22. La virulence pour le haricot et le soja de la
souche 1449B race 7 de Pseudomonas syringae pv.
phaseolicola est portée par un îlot de pathogénicité
porté par un plasmide de 150kb.
L'un des gènes effecteurs, avrPphF (un des trois qui
induisent la réponse hypersensible en présence, pour
avrPphF, du gène de résistance R1), est absent des
races 2, 3, 4, 6 et 8 du pathogène à la suite d'une
délétion de 9,5 kb. Il existe en effet 9 races
distinguables par une batterie de huit cultivars de
haricots qu'elles attaquent. Le reste de PAI est bien
conservé chez 1449B et chez la souche prototype
1448A qui vient d'être séquencée par le TIGR. Cette
délétion a été probablement causée par l'insertion d'un
élément transposable chimérique à gauche de la
délétion. Cet élément consiste en une fusion de IS1492
de Pseudomonas putida et IS1090 de Ralstonia
eutropha. Les bordures de cet élément se retrouvent
dans 66 souches de P. syringae pv. phaseolicola
dépourvues de avrPphF. Par contre six souches
isolées en Espagne présentent une délétion qui se
prolonge de 1 kb plus à droite. Tout indique une
origine clonale de toutes ces souches. LA Rivas et al.;
Applied & Environmental Microbiology 71 (JUL05)
3778-3785.
23. Xylella fastidiosa est un pathogène à large
spectre d'hôte (plus de cent plantes différentes),
attaquant notamment la vigne (maladie de Pierce), les
agrumes, etc… Des chercheurs de Riverside ont
analysé la diversité des souches nord-américaines en
se basant sur dix loci différents (EL Schuenzel et al.;
Applied & Environmental Microbiology 71 (JUL05)
3832-3839).
Ils distinguent trois clades. Deux correspondent à X.
fastidiosa subspecies piercei et X.fastidiosa subsp.
multiplex. Le troisième a été nommé X. fastidiosa
subsp. sandyi. Ceci indique que X.fastidiosa a eu une
origine clonale et a divergé il y a plus de 15 000
ans.bien avant l'introduction de plantes étrangères,
caractérisant la plupart des infections. Les deux clades
X.fastidiosa subsp. sandyi et X.fastidiosa subsp.
piercei évoluent 2,9 fois plus vite que X.fastidiosa
subsp. multiplex. La constance des variations au sein
de X. fastidiosa subsp. piercei et X.fastidiosa subsp.
sandyi, suggère de fortes pressions de sélection par
l'adaptation à la plante hôte.
24. Le Wheat streak mosaic virus du blé (WSMV
tritimovirus de la famille des Potyvirus) est transmis
par un acarien ériophyide, (Aceria tosichella). Sa
structure est voisine des potyvirus qui sont transmis
par des aphides (pucerons). Les tritimovirus et les
potyvirus codent des HC-Pro (Helper ComponentProteinase) nécessaires à la transmission non
persistante par les aphides. Ce composant est
également nécessaire à la transmission par les
Acariens. DC Stenger et al.; Journal of Virology
79,n°14 (JUL05) 9054-9061.
Les Insectes et leur Maîtrise
25. La taille de l'individu adulte chez les insectes
découle, généralement, de celle de la larve au moment
où elle cesse de se nourrir et commence à déambuler
avant de se métamorphoser. On n'en connaissait pas
9
Le Bulletin des BioTechnologies – Août 2005 – n°231
le mécanisme sous-jacent. K King-Jones et al.; Cell
121 (03JUN05) 773-784 montrent qu'il fait intervenir
un récepteur dit "orphelin" (c.a.d. sans fonction
connue) de l'ecdysone, DHR4. De plus, ce récepteur
joue un rôle dominant dans les cascades déclenchées
par l'ecdysone au début de la métamorphose
réprimant, à la fois, les gènes régulateurs précoces et
induisant le facteur de compétence βFTZ-F1 de la mipupaison.
26. Les mâles de Drosophila melanogaster (mais
pas les femelles) effectuent des danses nuptiales pour
lesquelles le gène fruitless (fru) est indispensable. La
différence sexuelle repose sur un épissage différentiel
des messagers entre mâles et femelles. des montages
génétiques montrent que l'épissage mâle est
indispensable aux comportement des mâles que ce
soit pour la danse nuptiale mais aussi pour leurs
préférences sexuelles naturelles pour les femelles. Si
on force un épissage de type mâle chez des femelles
on inverse tout leur comportement sexuel. E Demir et
al.; Cell 121 (03JUN05) 785-794. voir également le
commentaire de C Dulac; Cell 121 (03JUN05) 664666.
27. Des chercheurs israéliens, S Sela et al.; Applied
& Environmental Microbiology 71 (JUL05) 4052-
4056, montrent que la mouche méditerranéenne des
fruits (Ceratitis capitata) mais constitue probablement
un vecteur de contamination des fruits (et donc des jus
de fruits) par des bactéries pathogènes pour l'homme.
Ils ont mesuré cette transmission pour des Escherichia
coli marquées.
28. Des chercheurs de l'INRA à Montpellier
montrent que la petite fourmi urticante (fire ant)
Wasmannia auropunctata utilise une reproduction
clonale chez les mâles comme les femelles.
D Fournier et al.; Nature 435 (30JUN05) 1230-1234.
Les ouvrières stériles sont issues d'une reproduction
sexuée normale, tandis que les reines sont clonales.
Ceci accroît leurs similitudes avec leur parentèle
ouvrière. Les mâles des hyménoptères sont
théoriquement issus d'œufs non fécondés, ils
n'acquièrent leurs adaptations que de leur mère, la
reine. Du fait du caractère clonal de la mère, leur
adaptabilité devient nulle. Ils ont résolu le problème
en étant issus d'œufs fécondés, dont ils éliminent la
garniture
chromosomique
femelle.
Leurs
chromosomes sont donc identiques à ceux de leur
père, et elle est donc également clonale. Il y a, par
conséquent, séparation complète des pools de gènes
paternels et maternels.
Les Biopesticides
29. Les biopesticides ne sont, en général, pas assez
performants pour remplacer complètement les
pesticides chimiques. C'est d'ailleurs sage de leur part
car s'ils exterminent leur casse-croûte il leur faudra
soit trouver des proies alternatives ce qui n'est jamais
bon car on ne sait pas lequel, soit jeûner. Mais, pour
des applications agricoles, on peut se contenter d'une
destruction partielle, mais il faut qu'elle ramène la
densité des populations du prédateur au dessous du
seuil de nuisibilité.
K Brunner et al.; Applied & Environmental
Microbiology 71 (JUL05) 3959-3965 montrent que
l'on peut améliorer les propriétés biopesticides de
Trichoderma atroviride en lui faisant assurer, à la
fois, la fonction pesticide et la stimulation des
défenses généralisées de la plante à protéger.
La souche transgénique SJ3-4 de Trichoderma
atroviride, exprime le gène goxA de la glucose
oxydase d'Aspergillus niger sous la commande du
promoteur homologue de chitinase (nag1). La glucose
oxydase engendre du peroxyde d'hydrogène qui est
l'agent directement pesticide.
Les milieux de cultures du champignon inhibent
trois fois plus la germination des spores de Botrytis
cinerea. La souche transgénique lyse, par ailleurs,
Rhizoctonia solani et Pythium ultimum. Mais, in
planta, SJ3-4 n'a pas vraiment d'effet sur des
inoculums dilués de ces pathogènes. La souche
permet, cependant, une germination de haricots dans
des sols fortement infestés. La protection des racines
de haricots traités par SJ3-4 induit une résistance
systémique des plants, notamment contre B.cinerea.
30. Le génome de 7,1 Mb de Pseudomonas
fluorescens Pf-5 vient d'être complètement séquencé
par le TIGR, en association avec plusieurs équipes
10
américaines IT Paulsen et al. Nature Biotechnology.
23 (JUL05) 873-878. Qualifié de commensal par cette
équipe, c'est un bioprotecteur des plantes. C'est le
premier de cette catégorie. Il a été isolé aux Etats-Unis
de la rhizosphère du coton. Mais si on en croit les
marqueurs rDNAs 16S on retrouve des souches
voisines dans le monde entier.
Cela devrait permettre d'éclaircir les conditions que
doit remplir un bon agent bioprotecteur,. Il faut
typiquement atteindre une densité de population de
l'ordre de 105 à 106 cellules par gramme de racine, en
l'occurrence. Au dessous, aucun bioprotecteur ne
fonctionne en tant que tel. Cela suppose une bonne
compétitivité dans la rhizosphère. Le génome de
P.fluorescens Pf-5 confirme que cette bactérie est
capable d'utiliser un grand nombre de sources de
carbone issues des plantes, qu'elle sait bien pomper
le fer qui est un élément très limitant des sols car, sous
sa forme ferrique (la plus fréquente), il est quasi
insoluble. L'élimination des concurrents est la
propriété recherchée. Elle lui est indispensable pour
limiter la compétition. Les pathogènes du sol, souvent
des champignons, sont limités par des métabolites
secondaires antifongiques, une stimulation des
résistances de la plante par le bioprotecteur, ou la
destruction de facteurs de virulence.
On trouve dans ce génome six groupes de gènes du
métabolisme secondaire dont quatre codant la
production d'antibiotiques connus comme le 2,4diacétylphloroglucinol,
la
pyolutéorine,
la
pyrrolnitrine et l'acide cyanhydrique, mais l'analyse du
génome prédit l'existence de trois nouveaux
métabolites secondaires: un surfactant, un
polycétide et un peptide non ribosomal. Le
biosurfactant n'est autre qu'un lipopeptide cyclique
(voir le §31) voisin de la viscosine qui permet à des
Le Bulletin des BioTechnologies – Août 2005 – n°231
pathogènes de dissoudre les cires épidermiques des
plantes mais aussi d'attaquer des concurrents. De
nombreux Pseudomonas fluorescents en produisent
par un mécanisme non ribosomique.
On trouve plusieurs séquences phagiques intégrées,
ce qui n'a rien d'inattendu. On peut imaginer des rôles
à ces phages dans l'acquisition de diverses propriétés.
31. La souche SB-K88 de Lysobacter supprime la
fonte des semis de betterave causée par
Aphanomyces cochlioides (un Pythium, donc un
oomycète comme les Phytophtora). Lysobacter SBK88 est une colonisatrice de la surface des racines qui
produit une bactériocine, la xanthobaccine A qui est
un lipopeptide cyclique à synthèse non
ribosomique, ayant des propriétés antibiotiques et
surfactantes, qui est également produite par un
Stenotrophomonas (un Pseudomonas). Cette bactérie
colonise les racines de plusieurs plantes, dont la
tomate, l'épinard, Arabidopsis thaliana, et Amaranthus
gangeticus. M.Tofazzal Islam et al.; Applied &
Environmental Microbiology 71 (JUL05) 3786-3796
montrent que la xanthobaccine A immobilise les
zoospores d'A.cochlioides en une minute.
Les Productions animales
L'expression des gènes
32. NR Smalheiser et al.; Trends in Genetics 21
(JUN05) 322-326 s'intéressent aux microRNAs
dérivant des éléments transposables LINE-2 (Long
INterspersed Elements). Les éléments LINES sont des
rétrotransposons de 4,7 kb abondants dans beaucoup
de génomes eucaryotes. LINE-1 est le seul à être
encore actif dans le génome des Mammifères (voir le
§34), mais les autres sont des séquences qui semblent
avoir conservé ou acquis des fonctions secondaires.
En fait, les auteurs traitent plus généralement des
miRNAs issus de la transcription d'éléments
répétés. La production de ces miRNAs résulte du fait
que la transposition en de nouveaux sites crée la
possibilité de transcrire des ARNs en épingle à
cheveux donnant les miRNAs après maturation. Leur
fonction est permise par la complémentarité avec des
messagers transcrits à partir de gènes possédant à
leur voisinage immédiat des portions de ces
rétrotransposons dans leur partie aval non traduite.
Les miRNAs dérivés des LINE-2, en particulier les
MIRs (Mammalian Interspersed Repeats dérivés des
séquences aval de LINE-2) sont particulièrement
intéressants, car l'épingle à cheveux est entièrement
dérivée des répétitions et sont formés à partir de deux
répétitions adjacentes orientées de façon opposée.
Les miRNAs correspondent à deux séquences précises
en aval de la séquence consensus de ces répétitions.
33. La taille du cerveau est gouvernée par l'ephrine
qui intervient sur la prolifération des progénitrices des
cellules neurales, leur différenciation, survie et
migration en régulant positivement leur apoptose.
V Depaepe et al.; Nature 435 (30JUN05) 1244-1250.
Les ephrines sont des ligands liés aux membranes
de récepteurs à tyrosine kinase (dont elles constituent
l'ensemble le plus important) qui jouent également un
rôle dans l'angiogenèse.
Elles fournissent, dans le système nerveux une
information positionnelle et repoussent les cellules en
migration et les axones en croissance.
Les ephrines de type A sont insérées dans le feuillet
externe de la membrane plasmique par une ancre
glycosyl phosphatidylinositol et se lient à des
récepteurs de type A. Les ephrines de type B
possèdent, en outre, un unique domaine
transmembranaire et une queue cytoplasmique.
Les récepteurs des ephrines possèdent un domaine
N-terminal en ß-sandwich fixant le ligand, le domaine
extracytoplasmique possèdant, en outre, des domaines
permettant une dimérisation des récepteurs.
Ceci signifie que les éléments transposables peuvent
ainsi contribuer à la diversité génétique des individus
(pas forcément dans le bon sens). Des études
antérieures avaient montré une activité des L1 dans les
cellules germinales et dans d'autres cellules, mais aux
tous débuts du développement.
Les auteurs fournissent la première preuve d'une
activité de L1 dans des cellules en culture provenant
directement d'un échantillon de tissu, et de son activité
tard dans le développement d'une souris transgénique.
L'expression des L1s dans les cellules précurseurs
de neurones apparaît comme inversement corrélée
avec celle de SOX2 qui est un gène très peu exprimé
dans ces cellules, mais qui intervient dans plusieurs
fonctions des cellules neurales adultes.
L'activation de L1 est associée à des modifications
des histones. L'état d'acétylation et de méthylation des
histones pourrait bien être responsable de la maîtrise
de la cellule sur la transposition de ces éléments.
Par ailleurs et bien qu el nombre d'insertions
analysées soit encore trop faible pour conclure, il
semble
bien
que
la
transposition
cible
préférentiellement les gène exprimés dans les futurs
neurones ou le voisinage immédiat de ces gènes. Enfin
il semble bien que la différenciation des cellules
neuronales primordiales soit également affectée par
ces transpositions. Une insertion dans le gène Psd-93
(postsynaptic density protein of 93 kDa, alias
chapsine) accroît son expression, ce qui induit la
différenciation
neurale.
Voir
également
le
commentaire d'EM Ostertag et al.; p.890-891.
Le développement
34. AR Muotri et al.; Nature 435 (16JUN05) 903910 montrent que la transposition de l'élément LINE-1
peut avoir lieu dans les précurseurs des neurones, ce
qui affecte, au moins en culture, leur devenir. La
rétrotransposition d'un L1 humain chez la souris
entraîne la formation d'une mosaïque cellulaire
somatique. Ceci est probablement lié à l'intervention
du facteur de transcription Sox2 (SRY (sex
determining region Y)-box 2) au cours des stades
précoces.
11
Le Bulletin des BioTechnologies – Août 2005 – n°231
Ceci est suffisamment passionnant pour que des
recherches complémentaires viennent vérifier la
généralité de ces observations.
35. L'achèvement de la séquence du génome humain
a permis d'identifier bien des gènes, mais il reste
souvent à identifier les éléments régulateurs liés.
JS Carroll et al.; Cell 122 (15JUL05) 33-43 ont
cartographié l'association du récepteur nucléaire des
œstrogènes, ER, avec les régions non répétitives des
chromosomes 21 et 22 humains. L'ER se lie à un
nombre limité de sites, ce qui n'est pas inattendu, mais
qui sont souvent très éloignés du site de début de la
transcription. Il semble, de plus que la fixation
implique la présence de facteurs de type Forkhead au
voisinage immédiat, plus spécialement du facteur
FoxA1.
vision. L'observation majeure est que les neurones (et
les fibres musculaires) passent, au cours du
développement, par une phase d'activité spontanée
qui dépend d'une expression des canaux ionique
différente de celle des neurones à maturité.
36.### Une revue très touffue de WJ Moody et al.;
Physiological Reviews 85 (JUL05) 883-941 analyse
les rôles successifs des canaux ioniques dans le
développement (et le fonctionnement) des muscles et
des cellules nerveuses, mais en les plaçant dans un
contexte plus large, depuis les débuts de
l'embryogenèse. Ils peuvent avoir des rôles différents
pendant la phase précoce du développement avec la
mise en place des tissus et organes, puis plus tard lors
de leur fonctionnement.
Les auteurs commencent avec le cas de la
maturation de l'ovocyte et le blocage de la
polyspermie, avec l'élimination sélective de certains
canaux qui a surtout été étudié chez l'étoile mer (mais
il faut se rappeler que les Mammifères ont un
comportement différent sur ce point) et sur le Tunicier
Boltenia villosa
Toute une série de flux disparaissent après la
fécondation, chacun à son tour. Celui à Na+ disparaît
dans les deux premières heures (première mitose
embryonnaire). Le canal à Ca2+ n'est éliminé que lors
de la gastrulation. Le canal à K+ ne l'est qu'à la
neurulation, mais il reste jusque là parfaitement
fonctionnel, mais on ne sait pas trop bien si c'est pas
synthèse de nouveaux canaux ou par démasquage
d'existants.
Le cas de la rétine et de la finition des connexions
visuelles, est également évoqué. L'activité des canaux
dans la rétine précède la perception visuelle, et cette
activité participe à l'établissement du patron des
connections réticulogéniculées. Cette activité va
persister un long temps avant la mise en place de la
38. M Jastroch et al.; Physiological Genomics 22
(14JUL05) 150-156 montrent que la protéine
découplante UCP-1 des poissons permet de révéler
une origine très ancienne, mais avec des fonctions
probablement différentes, de la thermogenèse dite
"sans frissons" des Mammifères qui a été caractérisée
dans le tissu adipeux brun des jeunes rongeurs.
Ce type de protéines assure une fuite des protons à
travers la membrane interne mitochondriale sans
régénération d'ATP permettant, ainsi, une
conversion de l'énergie du gradient de protons en
chaleur. Les protéines UCP-2 et UCP-3 ne sont
probablement pas impliquées dans ce mécanisme et
servent à réduire la production d'oxygènes radicalaires
réactifs toxiques. Ces deux protéines sont connues
chez les Vertébrés endothermes (Oiseaux et
Mammifères) et, jusqu'à présent, seule UCP-2 était
connue chez les Vertébrés ectothermes comme les
poissons et les amphibiens.
Les auteurs montrent qu'UCP1 et UCP3 existent
chez les poissons téléostéens. Mais chez la carpe
(Cyprinus carpio), UCP1 est surtout exprimée dans le
foie et sa production diminue avec le froid
contrairement à son homologue des Mammifères. Le
messager d'UCP3 n'est observé que dans les muscles
squelettiques de la carpe et son abondance croît avec
le jeûne. Les trois gènes d'UCPs étaient donc présents
avant la divergence des principales lignées évolutives
des Vertébrés, c'est-à-dire il y a 420 millions d'années,
mais avec des fonctions différentes de celles observées
chez les Vertébrés les plus récents.
39.### Une seconde partie du numéro de Current
Opinion in Immunology 17 (JUN05), dont la première
a été analysée dans le Bulletin de Juillet au §60,
concerne les fonctions effectrices des lymphocytes.
Les avancées récentes ont porté sur les récepteurs
TLRs (Toll-Like Receptors), mais aussi sur des
récepteurs inhibiteurs des cellules NK (Natural
Killers), puis de récepteurs activateurs et de corécepteurs, permettant à ces cellules de distinguer des
cellules étrangères donc potentiellement dangereuses
(nous sommes tous racistes à l'échelle cellulaire).
Les réponses innées et adaptatives ne sont pas des
mécanismes de défense séparés, mais interconnectés.
Les réponses innées sont rapides et précèdent la
réponse adaptative, mais cette dernière est informée
des réponses innées de la défense réglementaire.
La réponse à une infection s'appuie, pendant les
premiers jours, sur les mécanismes innés, car la
réponse des cellules T prend trois à cinq jours à se
développer, et celle par anticorps prend une bonne
semaine. Jusqu'à nouvel ordre, la réponse innée suffit
souvent à elle seule et c'est ce qui se passe chez les
Invertébrés. L Moretta; Current Opinion in
Immunology 17 (JUN05) 303–305.
L'un des mécanismes les plus fascinants est
l'interaction entre les cellules NK (Natural Killer) et
dendritiques (DCs). La revue de A Moretta; p.306311 discute de ces interactions. Cette revue souligne le
La Physiologie
37. JM Bischof et al.; Physiological Genomics 22
(14JUL05) 191-196 ont examiné le patron de
transcription du génome dans l'hypothalamus en se
préoccupant particulièrement des gènes impliqués
dans l'obésité et analysé toutes les données publiées
sur le sujet. C'est essentiellement un article
méthodologique.
Le système immunitaire
12
Le Bulletin des BioTechnologies – Août 2005 – n°231
rôle des récepteurs inhibiteurs spécifiques des
MHC-I et des récepteurs activateurs dans ces
interactions.
Les cellules NK sont attirées vers les sites
d'inflammation ou les ganglions lymphatiques, ce qui
leur permet de rencontrer plus facilement les DCs
alertées.
L'inflammation se traduit, aux sites d'entrée de
l'agent infectieux par la libération de nombreuses
cytokines et chimiokines attirant les NKs vers les
DCs résidentes ainsi que vers d'autres types
cellulaires. Les cellules NK expriment, en effet, des
récepteurs de chimiokines.
Les cellules DC myéloïdes sont de puissantes
présentatrices d'antigènes associées à l'activation
des cellules T et à l'amorçage de la réponse
adaptative. Elles émettent, après avoir ingurgiter un
antigène, de l'IL-12 et de l'IL-15 qui modifient le
comportement des cellules NK. IL-12 induit, en
particulier, la libération de l'interféron γ par les NKs
et augmente leur toxicité. D'un autre côté, une forme
membranaire de l'IL-15 induit la prolifération des
cellules NKs. La production des deux interleukines
varie, d'ailleurs, selon le type de DC myéloïdes. Ainsi,
les cellules de Langerhans ne produisent pas d'IL-12,
mais beaucoup d'IL-15 et IL-18, par exemple. Elles ne
permettent pas l'activation des NKs, faute de
récepteurs d'IL-15α
Des récepteurs inhibiteurs de la réponse aux
MHC-I ont été caractérisés, en premier, dans les
cellules NKs, puis dans un sous-groupe de
lymphocytes T cytolytiques (CTLs), notamment lors
de la gestation. Ces CTLs reconnaissent un petit
nombre de peptides liés au HLA-E, un MHC-I très
peu polymorphe. C'est la séquence leader de
nombreux allèles des MHC-I (HLA-I de l'homme) qui
est reconnue. Ceci fait que ces CTLs reconnaissent de
nombreuses cellules allogénéiques. MC Mingari et al.;
p.312-319
La façon dont s'établit la mémoire des cellules T
commence à être bien connue. A Lanzavecchia et al.;
p.326-332 passent en revue les acquis récents dans ce
domaine. Si on se base sur les données phénotypiques
et fonctionnelles, on peut distinguer deux sous
populations de cellules T "mémoires", les cellules
"centrales" (TCM) et "effectrices" (TEM). Elles se
distinguent par leur ciblage dans le corps, par leur
capacité à proliférer en réponse à des antigènes et
des cytokines, et enfin par leur capacité à piloter les
fonctions effectrices. Ce sont des cellules bloquées à
différents stades de leur différenciation. Elles
peuvent persister toute la vie, même en l'absence
d'antigènes, en partie parce qu'elles produisent des
produits anti-apoptotiques, ce qui leur évite une
élimination par cette voie et qu'elles répondent bien
aux cytokines homéostatiques, ce qui permet une
régénération du stock de TEMs à partir des TCMs
qui ont pour elles leur plus forte capacité à proliférer.
Ces propriétés sont progressivement acquises au fur et
à mesure que la stimulation immunitaire initiale se
renforce.
40.### Dans leur ardeur, les cellules immunitaires
activées pourraient causer des dégâts collatéraux
parfois importants, et il faut un dispositif de
surveillance pour y mettre éventuellement le holà,
soit pour pallier une durée, soit une intensité superflue
des réactions. Une revue porte sur ce problème avec
MV Sitkovsky et al.; Trends in Immunology 26
(JUN05) 299-304.
Les auteurs invoquent le rôle de récepteurs de
l'adénosine extra-cellulaire qui capteraient une
surabondance de celle-ci indiquant des lésions
cellulaires importantes au voisinage. ces récepteurs
purinergiques interviennent à différents niveaux de
l'activité immunitaire.
41. Les récepteurs Toll-like (TLRs) interviennent,
en particulier dans les défenses anti-virales. Comme
ce sont des intervenants du système de l'immunité
innée, ils reconnaissent des motifs communs à une
classe de pathogènes. Dans le cas des virus, il est plus
difficile à comprendre lequel.
L'ARN hélicase RIG-I semble pouvoir reconnaître
les ARNs doubles brins. H Kato et al.; Immunity 23
(JUL05) 19-28 montrent, qu'en fait RIG-I intervient en
déclenchant la production des interférons α/β dans
les fibroblastes et les cellules dendritiques
conventionnelles. RIG-I active IRF3 avec l'aide des
des kinases apparentées à l'IkB kinase. Dans les
cellules dendritiques plasmacytoïdes qui produisent e
grandes quantités d'interféron α, ce sont les TLRs qui
sont directement utilisés plutôt que le système RIG-I
pour la détection des virus (mais encore une fois
comment?).
42. Les réponses à une seconde infection sont
classiquement attribuées aux cellules T "mémoires"
des ganglions lymphatiques permettant une réponse
accélérée, mais il existe également des cellules T
effectrices "mémoires "périphériques, non localisées
dans un tissu particulier qui sont encore plus proches
des invasions possibles. Elles représentent donc un
tissu fonctionnel diffus du système immunitaire. Une
revue de N van Panhuys et al.; Trends in Immunology
26 (MAY05) 242-247 est consacrée à ces cellules.
13
Les Vaccins
Le Bulletin des BioTechnologies – Août 2005 – n°231
43. C Watkins et al.; Vaccine 23 (21JUL05) 42474256 ont suivi l'expression génique dans les cellules
dendritiques (des présentatrices professionnelles des
antigènes aux cellules T, ce sont d'ailleurs les seules
capables d'activer les cellules T naïves) après une
inoculation biolistique d'ADN plasmidique. Ils on
utilisé le gène marqueur de GFP améliorée (EGFP) et
ont suivi l'expression dans les cellules DCs arrivant de
la périphérie où elles ont perçu l'antigène vers les
zones centrales où elles s'associent avec ces cellules T
par le biais d'une synapse immunitaire.
L'analyse montre que des MHC-II, WC6, CD1b et
SIRPα (SIgna -Regulatory Protein) sont exprimées
après immunisation plasmidique. Mais si le plasmide
persiste assez longtemps, sa présence n'est rapidement
plus corrélée avec l'expression d'EGFP.
44. Les salmonelloses ovines entraînent des
symptômes variables selon la souche concernée
(serovars Abortusovis, Dublin ou Typhimurium). Le
sérovar Abortusovis est le plus commun dans l'Europe
du sud et cause des avortements à la sixième semaine
sans signes cliniques préalables.
L'opéron spv est porté par le plasmide de virulence
de plusieurs sérovars de Salmonella, Abortusovis,
Typhimurium, Dublin, Choleraesuis et Gallinarum
mais pas Typhi.
Il existe un vaccin basé sur une souche atténuée
(Rv6) qu'on a d'ailleurs proposé, il y a un certain
temps, d'utiliser pour une production hétérologue.
Trois vaccins vivants (atténués) contre Salmonella
enterica ssp I sérotype Abortusovis basés sur des
bactéries dépourvues d'aroA, cya, crp, cdt et de leur
plasmide de virulence, sont décrits par S Uzzau et al.;
Infection & Immunity 73 (JUL05) 4302-4308. L'effet
est quand même relatif car on constate une diminution,
mais pas une suppression, des avortements. Il reste
donc du travail à faire
45. DN Wedlock et al.; Infection & Immunity 73
(JUN05) 3540-3546 montrent qu'on peut améliorer
l'efficacité de vaccins contre la tuberculose bovine
en associant des vaccins, soit à sous-unités protéiques,
soit au BCG classique, soit à des oligonucléotides
CpG (stimulateurs de l'immunité innée).
46. AA Oñate et al.; Infection & Immunity 73
(JUN05) 3294-3300 décrivent la construction d'un
vecteur viral destiné à un vaccin ARN contre
Brucella abortus. Le vecteur viral utilisé est le virus
Semliki et l'antigène est la superoxyde dismutase
(SOD) à Cu etZn de la bactérie.
47.. BA Aulinger et al.; Infection & Immunity 73
(JUN05) 3408-3414 montrent que l'on peut combiner
un vaccin et une thérapie des infections par Bacillus
anthracis en utilisant un mutant inhibiteur
dominant de la bactérie. Les vaccins actuels sont
basés sur l'antigène protecteur (PA), mais une
immunisation contre PA n'entraîne pas des défenses
contre la bactérie proprement dite. Le mutant constitue
bien un agent immunisant contre la bactérie et semble
efficace, mais le mécanisme reste à élucider (ou à
publier).
48. La microflore intestinale a été façonnée par la
co-évolution avec son hôte, y compris à l'échelle
individuelle. Mais on ne connaît encore que peu de
choses sur l'adaptation symbiotique à l'échelle
moléculaire. SK Mazmanian et al.; Cell 122
(15JUL05) 107-118 montrent que la colonisation du
colon par Bacteroides fragilis, implique un
polysaccharide bactérien qui commande la
maturation cellulaire et la structure des organes
lymphoïdes.Ce pilotage comprend la correction
d'anomalies physiologiques des cellules T, et des
déséquilibres entre Th1 et Th2. Les T helper1 (Th1)
sont celles qui produisent l'interféron γ, et assurent à
la fois les réactions inflammatoires (racolant les
défenses),
et
l'attaque
des
pathogènes
intracellulaires, tandis que les T helper 2 (Th2)
produisent les cytokines IL4, IL5 et IL13) et
encouragent les lymphocytes B à produire les
anticorps circulants.
Le polysaccharide pilote également l'organisation
des ganglions lymphatiques. Lorsqu'il est présenté
par les cellules dendritiques (voir le §) intestinales, il
active les cellules T CD4+, celles qui expriment les
récepteurs des MHC-II.
Les Pathogènes
49.### La population microbienne du tractus
gastro-intestinal humain se monte à quelques 1014
cellules (probablement 10 fois plus que les cellules du
corps humain) et 1,5 kg. Les échanges de signaux
entre les différents participants de cette flore sont
analysés par JB Kaper et al.; Infection & Immunity 73
(JUN05) 3197-3209.
En fait ce tractus est divisé en compartiments très
différents depuis la cavité orale en passant par
l'estomac, l'intestin grêle avec ses trois subdivisions
(duodénum, jéjunum et iléum), et le gros intestin ou
colon. La densité des populations y est très variable,
avec à peine 103 cellules/ml à la sortie de l'estomac,
1010/ml à la valve iléocœcale et de 1011 à 1012/ml dans
le colon. On peut ensuite définir des microdomaines
comme la lumière du tube digestif, la couche
14
muqueuse des épithéliums, les cryptes intestinales,
etc…
La flore elle même est relativement variée et on
estime de 500 à 1 000 le nombre d'espèces différentes
de cette flore. La masse totale est probablement moins
importante que la diversité génétique présente. On
peut considérer la séquence totale métagénomique de
cette population à environ 100 fois celle du génome
humain (évidemment en se servant d'extrapolations à
partir de données sûres). On peut considérer que plus
de 99,9% sont des anaérobies strictes.
La revue se penche sur les communications entre
ces multiples participants. Le "quorum sensing"
(QS) est le mécanisme le plus connu dans ce domaine
(il doit en exister d'autres qui se révèleront plus tard).
Le Bulletin des BioTechnologies – Août 2005 – n°231
Nous interprétons ce signal comme un signal de
ralliement
aux
conditions
favorables
et,
inversement, à la limitation des populations quand
elles dépassent les capacités d'un milieu donné.
On connaît trois mécanismes types de QS. L'un est
essentiellement utilisé par les Gram-, un par les
Gram+, et un dernier considéré comme universel.
Celui des Gram- fait appel, comme c'est le cas pour
V.fischeri, aux acylhomosérine lactones, avec des
fioritures autour de la longueur de la chaîne acylée.
Les Gram+ utilisent des oligopeptides détectés par
des systèmes à deux composants. Ces polypeptides
auto-inducteurs (AIPs) sont issus de peptides
cytoplasmiques clivés et modifiés et exportés. Le
récepteur à deux composants comporte, classiquement
un capteur à histidine kinase membranaire et un
régulateur de réponse cytosolique. Le domaine extracellulaire capte la présence du signal extérieur et
active son domaine histidine kinase qui
s'autophosphoryle alors sur une histidine particulière.
Le système a surtout été étudié dans le cas de
Staphylococcus aureus. L'AIP correspondant est un
peptide produit par AgrD et modifié par AgrB. Le
récepteur est codé par agrAC. L'AIP ne comporte que
8-9 aminoacides avec des cycles thiolactones
internes. Ces AIPs sont plus spécifiques que les
AHLs, car on peut répartir l'espèce en quatre sousgroupes selon l'AIP produit et perçu par chacun de ces
sous-groupes. Certains de ces AIPs peuvent même
inhiber le système d'un autre sous-groupe (un peu
comme les monopoles de presse).
Le
système
universel
permettant
l'intercommunication entre espèces bactériennes est
utilisé par les Gram+ comme les Gram-. C'est ce
dernier système qui est important dans le tractus
gastro-intestinal. On le désigne sous le nom de
système à autoinducteur 2 (AI-2). Il a été détecté
chez V.fischeri qui possède déjà un système à AHL.
Le signal est produit pas LuxS (mais voir plus loin) et
perçu par un récepteur à deux composants
LuxP/LuxQ, la cascade étant similaire à celle des
oligopeptides des Gram+. Ce système a été détecté
chez des dizaines d'autres espèces bactériennes.
LuxS est une enzyme impliquée dans le
métabolisme de la S-adénosylméthionine et convertit
une ribose-homocystéine en homocystéine et 4,5dihydrody-2,3-pentanedione. La 4,5-dihydrody-2,3pentanedione est très instable et réagit avec l'eau pour
donner, en se cyclisant, diverses furanones dont l'une
est supposée être le précurseur d'AI-2.
Ce système commande le système de sécrétion de
type III et la production du flagelle chez les E. coli
entérohémorrhagiques (EHEC) O157:H7, par
exemple.
Un nouveau signal a récemment été caractérisé
avec AI-3, dont la synthèse dépend également de
LuxS, mais est nettement différent de AI-2. En fait,
luxS est un gène métabolique général et n'est pas
spécial au quorum sensing. Le résultat est qu'une
manipulation de luxS a un impact sur AI-2 et AI-3, ce
qui oblige à repenser le système.
On a souvent évoqué l'utilité du quorum sensing
dans l'attaque en masse d'un organisme par un
pathogène, pour ne déclencher les facteurs de
virulence (souvent éliciteurs des défenses) que dans
une situation de force (on dirait un enseignement de
l'Ecole de guerre…) mais, dans le tractus digestif, le
vrai problème est surtout celui de la compétition avec
les organismes résidents. Mais si l'existence du QS
est patente dans le tractus digestif, son rôle dans la
pathogenèse l'est moins.
Les EHEC ont dévié la fonction, pour activer leur
gènes de virulence, mais le système AI-3/luxS permet
à ces bactéries de savoir quand elles sont dans le
colon. En effet, de très nombreuses bactéries de ce
compartiment possèdent le système QS AI-3/luxS. Là,
elles perçoivent le signal épinéphrine (et
norépinéphrine) de l'hôte qui déclenche le mécanisme
de lésions cellulaires caractéristiques du LEE (Locus
of Enterocyte Effacement). La norépinéphrine est
produite par les neurones adrénergiques du système
nerveux intestinal, tandis que l'épinéphrine est
synthétisée dans le système nerveux central et dans la
médullosurrénale, puis véhiculée par le sang jusqu'à
l'intestin.
Le signal AI-3 et la cascade de réponse sont
présents chez toutes les Entérobacteriacées étudiées
sur ce point. Ce qui est remarquable c'est que les
gènes sont conservés, y compris dans leur contexte
chromosomique, ce qui indique une forte pression de
sélection.
Mais les EHECs (entérohémorrhagiques) et EPEC
(entéropathogènes) règlent les détails de l'intendance
de façon différente.
Salmonella enterica possède deux systèmes de QS.
La protéine SdiA est l'homologue de LuxR, mais
aucune enzyme de synthèse de type LuxI n'a pu être
détectée. Ceci lui permet, cependant, de percevoir des
signaux AHLs d'autres bactéries. C'est donc un
exemple de communication interspécifique en sus de
AI-2 qui semble intervenir dans la formation de
biofilms.
LuxS régule l'expression d'un transporteur de type
ABC (ATP Binding Cassette) codé par l'opéron lsr
(LuxS regulated) impliqué dans l'internalisation de AI2. On a, par ailleurs, constaté (voir plus haut) que le
système AI-3 est présent chez toutes les
entérobactériacées.
Les populations de Vibrio cholerae ont un
comportement singulier car, contrairement à beaucoup
d'autres bactéries, le QS inhibe les gènes de virulence
à hautes densités cellulaires et les active à faibles
densités. La bactérie semble utiliser trois systèmes de
communication en parallèle. Les trois voies
convergent sur le régulateur de réponse à deux
composants LuxO, homologue du régulateur de même
nom de V. harveyi).
La bactérie possède un système classique à
homosérine lactone (CAI-1), un système à AI-2
(furanosyl borate diester), et un troisième système,
non encore identifié avec précision, révélé par
l'inactivation des deux autres. Voir, en particulier,
BK Hammer et al.; Molecular Microbiology 50
(OCT03) 101-114.
Les trois systèmes comporte une homologue de
LuxR dénommée HapR qui est un répresseur des
gènes de virulence et de la formation des biofilms, et
un activateur de la protéase Hap.
Plus, de nombreuses souches de la pandémie El Tor
ne portent pas de systèmes de QS, comme si ces
15
Le Bulletin des BioTechnologies – Août 2005 – n°231
systèmes étaient contre-sélectionnés au cours de
l'évolution de la bactérie
En ce qui concerne les Escherichia coli
entéroagrégatives (EAEC) qui causent des diarrhées
persistantes, les bactéries commensales du colon
semblent activer l'expression d'un régulateur global
de la transcription. Cela est dû à un ou plusieurs
produits d'autres bactéries comme Enterococcus et
Clostridium, tandis que des souches de Lactobacillus
et de Veillonella répriment ce gène. On n'a, cependant,
pas encore identifié ces substances.
Enterococcus faecalis utilise sa cytolysine non
seulement comme un auto-inducteur de l'expression
de ses gènes, mais comme une toxine létale pour les
cellules cibles eucaryotes, mais comme un détecteur
de la présence de ces cibles et, enfin comme une
bactériocine contre des concurrents éventuels.
Chez Clostridium perfringens, il existe un système
QS à AI-2 (avec le gène luxS-correspondant) qui
gouverne l'expression des toxines α, k et θ. Mais on
sait depuis fort longtemps qu'il existe une molécule
activant la production de la toxine θ, appelée la
substance A, mais elle est distincte de l'AI-2
mentionnée plus haut..
Chez les Shigella, comme S.flexneri qui est
impliquée dans des dysenteries c'est également un
système luxS/AI-2 qui est impliqué dans la virulence,
tout particulièrement sur le système d'injection. Mais
contrairement aux Escherichia coli qui sont soumises
à une pression médiatique considérable de la part des
bactéries commensales (car elles sont uniquement
présentes dans la lumière du tube digestif), les
Shigella ne font que passer et pénètrent rapidement
dans les cellules de la paroi et ne sont pas obligées
d'écouter les autres bactéries.
Par ailleurs, des bactéries comme Pseudomonas
aeruginosa utilisent un de leurs auto-inducteurs (3oxoC12 homosérine lactone,en l'occurrence) pour
moduler les réactions du système immunitaire. La
production du TNFα et de l'interleukine-12 est
déprimée dans les leucocytes et celle de l'interféron γ
est activée
50. Une infection par Salmonella est associée à leur
persistance dans les lymphocytes B et les
macrophages. Et pourtant macrophages, cellules
dendritiques et cellules B font partie des défenses de
l'organisme. Les macrophages activés par l'interféronγ utilisent un mécanisme alternatif de dépeçage des
antigènes de Salmonella pour présenter les fragments
aux lymphocytes T CD8+. L'antigène est désossé dans
un compartiment vacuolaire puis les fragments sont
sécrétés et chargés sur les molécules du MHC-I à la
surface du macrophage et des cellules voisines.
R Rosales-Reyes et al.; Infection & Immunity 73
(JUL05) 3937-3944 montrent que les lymphocytes B
ne savent pas utiliser cette voie. Ceci est dû au fait que
les vacuoles contenant Salmonella enterica serovar
Typhimurium (SCV) sont des compartiments
endosomiques-lysosomaux
tardifs
dans
les
lymphocytes B , tandis que celles des macrophages
sont remodelées au cours du temps. Mais S. enterica
serovar Typhimurium s'en fiche parfaitement et survit
plus facilement dans les cellules de cellules B activées
par l'interféron γ que dans les macrophages activés.
16
L'absence du remodelage dans les cellules B est
corrélée avec l'incapacité de ces cellules à utiliser la
voie alternative. Du coup Salmonella exprime, dans
ces vacuoles incompétentes, les mécanismes de
virulence qui facilitent sa survie.
51. Les souches O78 d'Escherichia coli sont
souvent associées à des pathologies extra-intestinales
chez les animaux d'élevage (notamment des sacs
aériens des volailles) comme chez l'homme. La souche
aviaire (APEC) O78:K80 χ7122 a été étudiée par
MG Lamarche et al.; Infection & Immunity 73
(JUL05) 4138-4145 et le rôle du système de transport
des phosphates Pst dans la virulence de cette souche.
Son inactivation entraîne effectivement une baisse de
la virulence. Cette souche à transport inactivé est
moins résistante à divers effets bactéricides.
L'opéron pstSCAB-phoU fait partie du système
plus général commandé par le capteur à deux
composants PhoB/PhoR qui répond à la
concentration du phosphate. Le capteur PhoR de la
membrane interne phosphoryle classiquement le
régulateur de réponse PhoB, qui va, alors, activer la
réponse des 39 gènes cibles connus en se fixant sur la
"Pho box" de leurs promoteurs. Le système de
transport Pst en fait partie.
Ce système comporte une protéine périplasmique
(PstS) captant le phosphate, deux protéines
transmembranaires (PstA et PstC), une protéine fixant
l'ATP (PstB) et une protéine probablement répresseur
du système PhoU. Il s'agit probablement d'un système
permettant à la bactérie de savoir qu'elle est au bon
endroit pour attaquer.
52. Le virus respiratoire syncytial (RSV) est un
paramyxovirus dont les protéines non structurales
NS1 et NS2 bloquent la réponse anti-virale liée aux
interférons α/β
α/β. Ceci est lié à une action sur la
protéine Stat2, mais uniquement chez l'homme, car
Stat2 de la souris reste insensible. C'est donc une
manipulation spécifique (à tous les sens du terme) de
l'appareil immunitaire conditionnant le spectre d'hôte.
MS Lo et al.; Journal of Virology 79,n°14 (JUL05)
9315-9319.
53. On sait que le virus de la fièvre aphteuse
pénètre dans sa cellule-hôte via une endocytose
dépendant de la clathrine de son récepteur chargé qui
est une intégrine αvβ6. Ce récepteur est localisé dans
les radeaux lipidiques de la membrane. Le récepteur
est non seulement un capteur du virion mais
également un vecteur vers les endosomes. L'infection
fait intervenir les endosomes précoces, mais elle évite
le transfert des endosomes tardifs vers les lysosomes.
S Berryman et al.; Journal of Virology 79,n°13
(JUL05) 8519-8534.
54. L'évasion antigénique est théoriquement facile
chez les virus à ARN du fait de leur très grande
aptitude à muter ou à se réarranger (la sélection
naturelle élimine cependant ceux qui sont trop
débiles). Les modifications dans les glycoprotéines
des souches de virus grippal sont responsables des
modifications annuelles de la composition des vaccins
grippaux.
Le Bulletin des BioTechnologies – Août 2005 – n°231
La pression de sélection par les cellules T
cytotoxiques CD8+ (CTLs) en est, au moins
partiellement, responsable. GE Price et al.; Journal of
Virology 79,n°13 (JUL05) 8545-8559 montrent que
les voies respiratoires sont un endroit favorable aux
variants de ce type. Les voies de la
perforine/granzyme (très bien régulée) et la voie
Fas/FasL (beaucoup plus éclectique) exercent cette
pression de façon coordonnée. Les auteurs le montrent
chez des souris ou ces deux armes sont désamorcées.
55. Des chercheurs espagnols (J Castilla et al.;
Journal of Virology 79,n°13 (JUL05) 8665- 8668)
montrent qu'il existe bien une transmission verticale
(de la mère aux descendants), au moins chez la souris,
du prion de l'encéphalite spongiforme. Cette
transmission a lieu lors d'une reproduction au stade
juste pré-clinique de la maladie, c'est-à-dire que le
prion migre alors du cerveau vers les organes
périphériques. Il est vraisemblable qu'il en soit de
même chez les bovins.
55. C Jacquemot et al.; Journal of Virology 79,n°14
(JUL05) 8904-8908 montrent que l'on peut
déclencher avec une grande efficacité la tremblante
chez la souris en utilisant des injections répétées de
doses sub-liminales du prion correspondant chez des
souris, alors que l'injection de la somme totale de ces
doses d'un seul coup ne déclenche pas la maladie.
56.### Des chercheurs de l'INRA à Tours et Nantes
décrivent la transmission et les caractéristiques
cliniques de l'infection causant l'entéropathie
épizootique du lapin Des chercheurs de l'INRA à
Tours et Nantes décrivent la transmission et les
caractéristiques cliniques de l'entéropathie cunine qui
est apparue fin 1996 en France et qui ravage les
élevages de lapins. Mais ils n'ont encore pu décrire
l'agent. D Licois et al.; Veterinary Research 36 (JULAUG05) 601-613.
57.### Un chercheur australien s'est préoccupé du
coût global de l'entéropathie proliférative (iléite) du
porc. On connaît cette maladie depuis plus de 70 ans.
Elle est causée par la bactérie Lawsonia
intracellularis. La maladie se déclare usuellement
chez des porcs de plus de 12 semaines. On retrouve
cette pathologie chez de nombreux animaux, mais
surtout chez le porc. Des colites ulcératives ont été
détectées chez l'homme, qui pourraient avoir la même
cause.
Il semble que plus de 90% des élevages européens
soient plus ou moins infectés (voir S Chouet et al.;
The Veterinary Record 152 (04JAN03) 14-17).
Une première étude avait établi les coûts liés au
plus faible poids de carcasse, à la mauvaise conversion
de la nourriture en gain de poids, l'utilisation d'espace
et des effets de la morbidité et de la létalité était
arrivée à un coût unitaire de 0,5 à 1 € selon les
conditions économiques. Mais cette évaluation ne
prend en compte que les maladies déclarées. Si on
prend en compte les stades subcliniques, l'évaluation
change. Un des facteurs nouveaux introduits à cette
occasion est celui des pertes lors de la reproduction,
qui augmente le coût de 0,5 €. Cela justifie nettement
l'utilisation d'un vaccin dont le coût est probablement
de 1€ par tête.
Les Productions Microbiennes
58. La transformation de Bacillus subtilis a lieu
grâce à des protéines dites de compétence. Au moins
trois d'entre elles, ComGA, ComFA et YwpH sont
associées aux pôles cellulaires où elles se concentrent
lors du pompage de l'ADN exogène. Lorsque la
compétences s'atténue, elles se redispersent. La
machinerie utilisée est donc labile et localisée aux
pôles cellulaires lors de son fonctionnement. HJ Maier
et al.; Cell 122 (15JUL05) 59-71.
59### nombreux métabolites secondaires, comme
les mycotoxines et les antibiotiques, sont toxiques
pour leurs producteurs et ils possèdent donc les
systèmes d'immunité correspondants. Mais une
excrétion continue facilite quand même les choses.
On trouve, ainsi, de très nombreux transporteurs de
type ABC (à ATP-Binding Cassettes) chez les
Streptomyces producteurs d'antibiotiques et chez
Penicillium chrysogenum producteur de la pénicilline.
Un autre type de systèmes d'efflux existe chez les
bactéries
productrices
de
pigments
et
d'antibiotiques, ainsi que chez les champignons
producteurs de mycotoxines. Un exemple de tels
systèmes d'efflux est celui des CefT qui permet la
sécrétion de la céphalosporine C chez Acremonium
chrysogenum. Il est donc intéressant de mieux
connaître tous ces systèmes. Une revue de JF Martin
et al.; Current Opinion in Microbiology 8 (JUN05)
282-293 les analyse.
Les gènes codant ces systèmes sont le plus souvent
physiquement associés aux gènes de production (et
de résistance). Or la synthèse dépend beaucoup des
conditions de milieu et a généralement lieu en fin de
croissance exponentielle, par exemple.
Les auteurs consacrent, d'abord, leur analyse aux
systèmes de détoxication ou d'expulsion, puis aux
sécrétions des métabolites secondaires avec les
transporteurs ABC de la pénicilline chez
Aspergillus nidulans, et d'autres antibiotiques chez
Streptomyces antibioticus et enfin au système mtrAmtrB de Streptomyces argilaceus et celui
d'exportation de la spiramycine chez Streptomyces
ambofaciens. Le nombre de transporteurs par cellule
est, en règle générale, proportionnel au nombre des
antibiotiques
produits.
Ainsi,
parmi
les
Actinomycètes, les Streptomyces producteurs en ont
beaucoup plus que les Mycobacterium et
Corynebacterium
Il existe, par ailleurs, des transporteurs
"multidrug" qui sont des transporteurs de substances
amphiphiles utilisant les gradients électrochimiques
membranaires pour assurer l'expulsion. Les
transporteurs fongiques et bactériens de ce type se
ressemblent beaucoup.
17
Le Bulletin des BioTechnologies – Août 2005 – n°231
60.###
Les
Géobacteracées
(comme
Desulfuromonas
acetoxidans,
Geobacter
metallireducens et Geobacter sulfurreducens) sont
parmi les microorganisme importants sachant réduire
le fer ferrique dans les sédiments. Leur dominance
est liée à leur capacité à déborder tous les autres
microorganismes sachant, comme eux, réduire Fe3+.
Ce sont également de bons candidats pour des piles
à combustibles basées sur des substrats biologiques,
types déchets organiques. Elles sont, en effet, capables
de coupler l'oxydation de l'acétate à la réduction
d'accepteurs externes d'électrons. La citrate synthase
intervient dans ce couplage car elle joue un rôle
essentiel dans le métabolisme de l'acétate en
condensant l'acétyl-coenzyme A et l'oxaloacétate en
citrate.
Le séquençage du génome de Geobacter
sulfurreducens indiquait la présence de cette enzyme.
Elles seraient apparentées à celles des eucaryotes avec
quelques particularités propres que DR Bond et al.;
Applied & Environmental Microbiology 71 (JUL05)
3858-3865 ont analysé après avoir exprimé son gène
chez Escherichia coli.
Une nouvelle revue sur les piles à combustibles
microbiennes est, par ailleurs, parue avec K Rabaey
et al.; Trends in Biotechnology 23 (JUN05) 291-298.
Lorsqu'un organisme oxyde un substrat, il doit
éliminer les électrons. On peut les subtiliser et créer
un courant électrique entre la bactérie et une anode.
On a, alors, construit une pile à combustible
fonctionnant à basse température. On a tenté
l'opération avec Desulfovibrio desulfuricans, Proteus
vulgaris, Escherichia coli, des Pseudomonas,
Shewanella putrefaciens ainsi qu'avec des enzymes
redox.
On cherche à exploiter ce mécanisme pour créer de
tels générateurs biologiques d'électricité depuis les
années 70s. Ils sont, en principe, intéressants mais
fonctionnent encore mal. En fait de nombreuses
protéines redox sont actives électrochimiquement
dans la cellule, mais le transfert des électrons de la
protéine à l'électrode est inhibé par le voisinage
peptidique du site actif et, de plus, les protéines sont
englobées dans un contexte pariétal insuffisamment
conducteur. On tourne cette difficulté en utilisant ce
que l'on appelle des médiateurs jouant le rôle de
navettes à électrons, comme le rouge neutre, la
thionine, le méthyl viologène ou la 2-hydroxy-1,4naphtoquinone qui permettent le transfert des
électrons de la cellule vers une électrode sans trop se
les faire pirater en cours de route. Mais leur gestion
difficile a empêché toute utilisation commerciale.
Shewanella
putrefaciens
et
Geobacter
metallireducens adhérent étroitement aux particules
de fer ferrique. De plus, 80% de leurs quatre
cytochromes membranaires sont localisés dans la
membrane externe en anaérobiose et peuvent
transférer leurs électrons à l'anode, tandis que la
cathode regroupe protons évacués et oxygène en eau.
Mais il faut bien connaître le métabolisme cellulaire
des électrons et des protons pour l'utiliser dans des
conditions optimales. Les bactéries se procurent de
l'énergie en transférant des électrons d'un substrat
réduit à faible potentiel redox, comme le glucose, à
18
un accepteur d'électrons à fort potentiel redox
comme l'oxygène.
Mais il faut bien réaliser que le substrat utilisé et le
potentiel de l'anode vont influer sur ces équilibres. Un
accroissement du courant de la pile va diminuer le
potentiel de l'anode, obligeant la bactérie à livrer ses
électrons grâce à des complexes plus réduits. Ceci
s'observe quand des accepteurs d'électrons alternatifs
existent comme les sulfates ou nitrates (et ceci est
gênant dans le cas d'utilisation de boues activées de
stations d'épuration). Quand aucun de ces accepteurs
possibles n'est présent, la fermentation est préférable
en cas de potentiel d'anode faible. Le potentiel de
l'anode va donc fixer le potentiel redox du système,
et donc tout le métabolisme du substrat consommé et
même déterminer quelle voie métabolique va entrer en
jeu.
Aux forts potentiels anodiques la bactérie peut
utiliser sa chaîne respiratoire naturelle avec
transferts concommitants des électrons et des protons
via NADH déshydrogénase, ubiquinone, coenzyme Q
ou cytochrome.
L'utilisation de systèmes à phosphorylation
oxydative permettent d'obtenir une efficacité
énergétique de l'ordre de 65%. C'est le cas de
consortia contenant Pseudomonas aeruginosa,
Enterococcus faecium et Rhodoferax ferrireducens.
Dans une fermentation, deux tiers des électrons sont
utilisés pour donner acétate et butyrate et seul un tiers
peut être soutiré pour donner de l'électricité. Ceci est
dû au fait que les hydrogénases (cas de Clostridium
butyricum et d'Enterococcus faecium) qui utilisent
classiquement les électrons pour transformer les
protons en hydrogène moléculaire sont situés à la
surface de la bactérie et peuvent être roulées par un
transporteur d'électron du milieu où contournées par
un transfert direct à l'anode. Mais on peut venger la
bactérie en oxydant l'acétate dans un compartiment
séparé par une bactérie anaérobie comme un
Geobacter qui soutire les électrons.
Une pile microbienne commence, usuellement, par
augmenter sa biomasse et le courant électrique sera
faible, si le circuit est à faible résistance, maintenant
donc un potentiel d'anode élevé. Ceci va sélectionner,
dans un consortium, les aérobies facultatifs et les
anaérobies. Une fois une certaine biomasse atteinte le
courant va pouvoir augmenter et le potentiel d'anode
diminuera en conséquence et ceci va favoriser les
anaérobies facultatifs au potentiel redox plus faible.
Les anaérobies stricts seront toujours défavorisés par
le potentiel d'anode et par des intrusions éventuelles
d'oxygène.
Si on utilise un circuit à forte résistance, le
potentiel d'anode restera faible, même si le courant est
faible et on va donc sélectionner des anaérobies
facultatifs à bas potentiel redox et des anaérobies
strictes.
61.### Les fermentations à l'état solide sont très
anciennes et sont notamment utilisées pour beaucoup
de
productions
microbiologiques
asiatiques
(notamment des dérivés du soja comme le miso ou la
sauce de soja (procédé koji). On s'en sert également
pour la saccharification du riz avant la production de
saké, et pour colorer le riz avec le pigment de
Le Bulletin des BioTechnologies – Août 2005 – n°231
Monascus purpurea. Toutes ces fermentations sont
essentiellement familiales et les recettes sont le plus
souvent restées secrètes.
On peut citer, parmi les avantages, l'utilisation
directe de substrats simples comme les grains de
céréales, .l'aération facile du fait des cavités situées
entre les grains permettant la croissance d'organismes
aérobies. Le volume des fermenteurs est plus réduit et
surtout les effluents liquides souvent polluants sont
réduits au maximum. La concentration des produits
de fermentation est beaucoup plus élevée qu'en
fermentation liquide. Il en est de même pour
l'utilisation souvent plus efficace du substrat par le
microorganisme du fait de la concentration des
exoenzymes au contact du substrat et du
microorganisme.
Ces fermentations ont été utilisée à une grande
échelle pour la production d'enzymes dès la fin du
19°siècle (takadiastase par exemple). Le procédé a
été utilisé jusqu'en 1950 par la Mold Bran Cy à Eagle
Grove dans l'Iowa qui utilisait à l'époque 10 tonnes de
substrat par jour. Mais ce procédé en milieu solide
imposait le lessivage des claies où poussait le
champignon pour récupérer le mélange d'enzymes. Le
procédé en milieu solide était alors condamné par la
culture en milieu liquide (cultures submergées) que le
Northern Regional Research Laboratory de Peoria
dans l'Illinois a mis au point dans les années 40s pour
le champignon producteur de penicilline, Penicillium
chrysogenum.
L'une des difficultés était que le procédé ne se
prête pas bien à l'accroissement d'échelle. Mais
c'était un procédé économique (mais surtout dans les
pays à main d'œuvre bon marché) car très productif
pour un volume donné, stable. On se pose
continuellement la question de savoir s'il ne serait pas
temps de revenir à des formes élaborées de ce
procédé, notamment pour la production de
"commodities" comme les enzymes ou les aliments
où les problèmes de prix de revient sont cruciaux.
La production de métabolites secondaires, est
souvent différente en fermentation solide qu'en
submergée.
Bactéries et levures peuvent pousser sur substrats
solides entre 40 et 70% d'humidité, cas du compostage
et de l'ensilage, mais seuls les champignons se
multiplient en l'absence d'eau libre.
Ces cultures mixtes sont souvent utilisées pour
obtenir des flaveurs alimentaires particulières. Ainsi
les pousses de bambou sont elles aromatisées par une
fermentation mixte mal définie, mais assurée dans des
conditions proches d'une fermentation solide. Les
bactéries sont pratiquement toutes très sensibles à
l'activité de l'eau (une bactérie halophile peut résister à
une activité de 0,75 seulement) ce qui fait que, dans ce
cas, l'humidité doit être soigneusement contrôlée et les
productions bactériennes en milieu solide ne sont pas
légion. Inversement les cultures fongiques sont, dans
ces conditions semi stériles et tous les appareillages
de stérilisation ne sont, en général, pas nécessaires.
Le plus grand défaut de ce procédé est la quasiimpossibilité de standardiser le procédé et la
reproductibilité relative des résultats. Il est, en effet,
difficile de piloter simultanément et finement, la
disponibilité de l'oxygène (toutes ces fermentations
sont aérobies), de l'humidité et la température qui tend
à s'accroître fortement au cours de n'importe quelle
fermentation. Ce facteur est favorable au compostage,
mais le plus souvent nuisible, notamment à la stabilité
des enzymes produites. Or, en l'absence d'eau liquide,
il est difficile d'évacuer cette chaleur. On joue sur
l'évaporation mais il faut, alors, une aération
importante, et donc à une évacuation d'eau corrélative
qui doit être compensée, mais pas trop, sinon on sort
de l'intervalle de sécurité.
62. Il existe des bactéries un peu limitées
intellectuellement, car elles n'utilisent que peu de
signaux, et ceux-ci sont primitifs. C'est le cas des
bactéries qui habitent des niches stables, notamment
les bactéries intracellulaires. Mais des bactéries
continuellement confrontées avec les aléas des milieux
ont été condamnées par l'évolution à multiplier les
capteurs des conditions de milieu et les voies
intracellulaires de transduction des signaux avec leurs
interactions.
MY Galperin; BMC Microbiology (14JUN05) 5:35
fait l'inventaire de tous ces mécanismes à partir des
167 génomes bactériens et archéens actuellement
déchiffrés. Ces différences peuvent être constatées
même entre bactéries très apparentées.
L'auteur évoque un "quotient intellectuel" suivant le
nombre des voies utilisées. Il compare également le
nombre de capteurs internes voués à l'homéostase
interne par rapport à celui des capteurs du milieu
pour définir des bactéries extroverties et introverties.
Dans ces conditions et parmi les espèces
bactériennes séquencées, le prix Nobel est Wolinella
succinogenes (une ε-protéobactérie voisine des
Campylobacter).
Parmi cette collection les cyanobactéries sont les
plus "introverties" probablement parce que leur
photosynthèse les rend relativement indépendantes du
milieu.
Compte tenu du fait que les premiers génomes
microbiens déchiffrés avaient été choisis pour leur
taille limitée compatible avec les techniques de
l'époque, il n'est pas étonnant que cette taille impliquât
des limitations génétiques. C'est le cas des trois
premiers de ces génomes: Haemophilus influenzae,
Mycoplasma
genitalium
et
l'archée
Methanocaldococcus jannaschii.
Si on commence par se limiter aux récepteurs à
deux composants classiquement impliqués dans la
perception du milieu extérieur, Haemophilus
influenzae ne code que 4 histidines kinases (HKs), et 5
régulateurs de réponse (RRs) et la bactérie ne possède
aucune protéine de chimiotaxie méthylables (MCPs).
Mycoplasma genitalium ou Methanocaldococcus
jannaschii n'en codent aucune.
Quand on est passé à Synechocystis sp. PCC 6803,
on a compté 42 HKs et 38 RRs, et avec le cinquième,
Mycoplasma pneumoniae, on retombait à zéro.
Mais il faut se méfier car les algorithmes utilisés
sont prudents et peuvent rater des gènes de ce type.
Cela a été effectivement le cas, et il y a donc
manifestement une sous-estimation, pas forcément
énorme (Escherichia coli avait été donnée pour 28
HKs, et on en a récemment décompté 30).
19
Le Bulletin des BioTechnologies – Août 2005 – n°231
Maintenant, si on élargit la comparaison aux
protéines impliquées dans la transduction des
signaux, on complique le problème car plusieurs de
ces protéines ont été découvertes après les premiers
séquençages et les recherches par homologies en ont
raté pas mal. C'est le cas des kinases Ser/Thr/Tyrspecifiques (STYKs) et les phosphatases de protéines
dont on sait, maintenant, qu'elles jouent un grand rôle.
On les a retrouvées, a posteriori, chez H. influenzae,
M.genitalium et M.jannaschi. L'auteur commente
quelques découvertes récentes dans la transduction,
notamment dans le domaine des diguanylates cyclase
et hydrolases.
Par ailleurs, l'auteur souligne que les bases de
données dans ce domaine sont, soit anciennes et n'ont
été que médiocrement actualisées, soit sont obtenues
par des techniques automatiques qui sont soumises à
des biais fréquents. Ces bases devraient pouvoir
couvrir tous les microorganismes au minimum pour
permettre de caractériser les voies spécifiques dans
des lignées différentes.
63. L'acide hyaluronique (alias hyaluronane) est
un polysaccharide linéaire non ramifié géant (allant
jusqu'à 8 mDa) constitué de N-acétyl-D-glucosamine
et d'acide D-glucuronique en alternance. On le trouve
partout dans les tissus animaux où il a des fonctions
importantes
structurales,
rhéologiques,
physiologiques, qu'il doit à sa viscoélasticité et qui est
intéressant du fait de son absence d'immunogénicité
lui permettant d'être largement utilisé en cosmétique et
dans dans certains traitements. On estime son marché
à environ un milliard de dollars par an.
Son extraction des crêtes de coq peut entraîner des
allergies chez certaines personnes du fait de produits
aviaires comme impuretés. Ceci a amené à rechercher
d'autres sources comme des Streptococcus atténués
de groupe C qui l'accumulent dans leur capsule. Mais
ces bactéries ne sont pas faciles à faire fonctionner
comme on l'entend, et peuvent produire des
exotoxines. B Widner et al.; Applied & Environmental
Microbiology 71 (JUL05) 3747-3752 (associés à
Novozymes) ont construit un Bacillus subtilis
exprimant le gène hasA de Streptococcus equisimilis
une hyaluronane synthase, ainsi que les gènes
impliqués dans la fourniture des précurseurs UDPsucres. La production d'UDP-glucuronate est, en
effet, limitante chez B.subtilis. Le hyaluronane est de
taille moyenne (1 mDa) et satisfait les auteurs.
64. Y Yan et al.; Applied & Environmental
Microbiology 71 (JUL05) 3617-3623 décrivent la
construction
d'une
chaîne
de
production
d'anthocyanes chez Escherichia coli. Les propriétés
anti-oxydantes de ces flavonoïdes les rendent
commercialement intéressants, à condition de les
produire à faible coût. Comme ces pigments sont
intéressants par ailleurs dans la couleur des fruits et
des fleurs, on connaît relativement bien leurs voies de
synthèse chez les plantes.
Il s'agit de produire des anthocyanes stables et
glycosylées à partir de leurs précurseurs flavanones
incolores comme naringénine et eriodictyol. Les
auteurs (associés à DuPont) ont transplanté les gènes
d'une flavanone 3ß-hydroxylase de pommier Malus
domestica, d'une dihydroflavonol 4-réductase
d'Anthurium andraeanum (une Aracée), d'une
anthocyanidine synthase de M. domestica, et une
UDP-glucose:flavonoïde 3-O-glucosyltransférase de
Petunia hybrida.
Les Escherichia coli ainsi transformées sont
capables de prélever naringénine et eriodictyol et de
les
convertir
en
l'anthocyane
glycosylée
correspondante, pelargonidine 3-O-glucoside ou
cyanidine 3-O-glucoside. Mais le rendement de
conversion reste modeste et on retrouve surtout leurs
précurseurs dihydroflavonols ainsi que les flavonols
correspondants. Cette faiblesse est surtout liée à une
réaction parasite facilitée par l' anthocyanidine
synthase.
65. Escherichia coli est assez bien connue par les
microbiologistes et les industriels. Elle peut stocker
les protéines recombinantes, soit dans l'espace
périplasmique, soit dans le cytoplasme mais on peut
également les faire sécréter dans le mlilieu ce qui les
rend plus facile à collecter (malgré la dilution
inévitable). GT Eomp et al.; Applied & Environmental
Microbiology 71 (JUL05) 3468-3474 montrent qu'il
est possible d'améliorer la sécrétion d'une lipase
hétérologue chez Escherichia coli par évolution
dirigée d'un transporteur de type ABC (voir le §59).
Le transporteur TliDEF de Pseudomonas
fluorescens SIK W1 assure, en effet, le transport de la
lipase thermostable TliA dans l'espace extracellulaire d'Escherichia coli. Il a été modifié par PCR
fantaisiste pour améliorer son efficacité chez cette
bactérie. Le système de sécrétion de type ABC ne
comporte que ces trois protéines. Il se prête donc
mieux à une optimisation artificielle.
Le transporteur est constitué de la protéine ABC
insérée dans la membrane interne des bactéries Gram-,
de la protéine membranaire de fusion qui est
essentiellement périplasmique insérée dans la même
membrane
interne
par
un
seul
domaine
transmembranaire et la protéine de la membrane
externe (une porine) qui forme un tunnel qui traverse
la membrane externe et rejoint la membrane interne.
La protéine ne séjourne, donc, à aucun moment dans
le périplasme.
Les Protéines et les Enzymes
66. R Rodriguez-Sanoja et al.; Current Opinion in
Microbiology 8 (JUN05) 260-267 s'intéressent aux
domaines reconnaissant l'amidon (SBDs) chez les
microorganismes.
Les enzymes s'attaquant à l'amidon, à la cellulose et
aux xylanes ont une structure modulaire avec au
moins un domaine catalytique et un domaine de
20
fixation sur le substrat. Dans le cas des amylases on
distingue plusieurs familles de domaines fixant
l'amidon distinguées par leurs séquences. En fait, ce
sont plutôt les replis du domaine plus que la séquence
qui se ressemblent dans une famille.
Le Bulletin des BioTechnologies – Août 2005 – n°231
On s'est d'abord intéressé à ceux qui permettent une
fixation sur la cellulose cristalline puis aux autres
polysaccharides, comme l'amidon, la chitine; etc….
Le domaine reconnaissant l'amidon s'observe chez
les α-amylases, les cyclodextrine glucanotransférases
bactériennes, les β−amylases bactériennes et les
glucoamylases fongiques. Même si ces enzymes ont
des fonctions catalytiques différentes, leurs domaines
SBDs sont semblables, usuellement logés à l'extrémité
C-terminale, sauf pour la glucoamylase de Rhizopus
oryzae, l'α-amylase de Thermoactinomyces vulgaris et
la pullulanase de Thermotoga maritima, où il est à
l'extrémité N-terminale
67. La forme active de la vitamine B6 est le
pyridoxal 5'-phosphate (PLP). Chez les plantes, les
champignons, les archées et certaines eubactéries, le
PLP est synthétisé à partir du ribulose 5-phosphate et
du glycéraldéhyde 3-phosphate par la PLP synthase,
qui
est
une
glutamine
amidotransférase
hétéromérique. Elle comporte deux sous-unités,
PdxT, qui extrait de l'ammoniac de la glutamine, et
PdxS, qui la greffe sur des phosphosucres à trois et
cinq carbones. La structure de PdxS vient d'être
établie à la résolution de 2,2 Å. J Zhu et al.; Journal of
Biological Chemistry 280 (29JUL05) 27914-27923.
Les auteurs constatent que c'est un dodécamère
cylindrique de sous-unités ayant la configuration
classique en barillet (α/β)8 ce qui indique que le site
actif est probablement sur la paroi interne du cylindre.
Les auteurs ont recherché (avec un modèle), les
endroits dans ce site où pourrait se loger le substrat
ribulose 5-phosphate. L'ayant trouvé ils ont pu en
déduire les acides aminés qui doivent intervenir dans
la catalyse,: Asp24 et Lys149. Ils ont également pu
établir, de cette façon, le site d'amarrage de PdxT.
68. La chaperone Hsp100 ClpA assure le
dépliement de protéines substrats grâce à l'énergie de
l'ATP. Les protéines qu'elle est capable de traiter
doivent comporter un motif reconnu comme la
séquence de 11 acides aminés fixée sur les protéines
en panne de traduction. Le dépliement est couplé à la
translocation dans le canal central de la chaperone
vers la protéase étroitement associée ClpP.
J Hinnerwisch et al.; Cell 121 (01JUL05) 1029-1241
montrent que des boucles du canal central de ClpA et
la fixation à ces boucles dépend du motif utilisé dans
la protéine. Le transfert est assuré par le changement
de la conformation de la boucle D2 du domaine
ATPase après hydrolyse de l'ATP.
69. Clostridium cellulovorans une bactérie
anaérobie digère les produits végétaux grâce à sons
complexe extra-cellulaire, le cellulosome. Celui-ci est,
chez cette bactérie, composé d'un échafaudage non
enzymatique, CbpA, porteur de 9 points d'ancrages
(cohésines) sur lesquels viennent s'ancrer autant de
sous-unités enzymatiques pourvues des domaines
complémentaires appelés dockerines. Ceci dit chaque
groupe donne un nom différent à cette protéine
échafaudage, de sorte que chaque Clostridium à
cellulosome porte un nom différent (CipA, CbpA,
CipC, etc…). R Koukiekolo et al.; Applied &
Environmental Microbiology 71 (JUL05) 3504-3511
ont étudié les synergies entre les cellulases
[endoglucanase E (EngE); endoglucanase L (EngL)] et
les hémicellulases [arabinofuranosidase A (ArfA);
xylanase A, (XynA)] sur des fibres de maïs. Ils ont
construit, dans ce but, des mini-cellulosomes avec
seulement certaines sous-unités.
Si on se fie à la dégradation de différents types de
celluloses et hémicelluloses, et à l'interaction entre
XynA et EngL, on peut déduire que la reconnaissance
dockerine-cohésine n'est pas aléatoire, mais sélective.
On constate, en effet que la population des
cellulosomes peut comporter des enzymes différentes
assemblées sur une même protéine d'échafaudage, à
partir d'un portefeuille commun à l'espèce.
70. Des enzyme thermostables et supportant
l'alcalinité sont nécessaires pour les diverses lessives
et les enzymes saccharolytiques sont utiles dans ces
mélanges et dans l'industrie des amidons et en
papeterie. On les a recherché très tôt chez des
organismes thermophiles, mais on en trouve
également chez des Bacillus mésophiles, tout
particulièrement des α-amylases.
Anaerobranca gottschalkii a été isolée d'une source
chaude du lac Bogoria au Kenya en 2001. Malgré ses
apparences c'est une Gram+ avec une paroi très
réduite. C'est une thermoalcaliphile, anaérobie stricte,
poussant à pH 9.5 et 50-55 °C et ses limites sont pH
6.0-10.5 et 30-65°. Elle mange salé, et il faut ajouter
230 mM d'ions Na+.
M Ballschmiter et al.; Applied & Environmental
Microbiology 71 (JUL05) 3709-3715 ont cloné et les
gènes de deux amylases AmyA et AmyB, enzymes
qu'ils ont caractérisé. AmyA est une lipoprotéine
extracellulaire, donc exposée au milieu alcalin.
AmyB est cytoplasmique. Le pH optimum d'AmyA
(pH 8), avec un large spectre de pH d'activité (plus de
50% d'activité entre pH 6 et pH 9,5) correspond bien à
sa localisation dans le milieu. Au contraire, AmyB
présente un pHopt étroit (6 à 6,5).
AmyA et AmyB ont une gamme de substrats très
semblable, avec une préférence pour l'amylose liénaire
plutôt que l'amylopectine ramifiée, les pullulanes et le
glycogène. Les deux enzymes hydrolysent les α-, ß- et
γ-cyclodextrines. Cette propriété indique que la
bactérie doit en fabriquer comme réserve. Mais seule
AmyA présente une activité transglycosylasique sur
maltooligosaccharides avec une activité ßcyclodextrine glycosyltransférase (CGTase). Il est rare
qu'une α-amylase puisse également posséder une
activité CGTase.
L'Agroalimentaire
71. Une revue de BH Nga; Current Opinion in
Microbiology 8 (JUN05) 307-312 (de Singapore)
porte sur l'analyse des génomes des bactéries
lactiques impliquées dans les fermentations
alimentaires et surtout sur la mise au point de souches
recombinantes.
21
Le Bulletin des BioTechnologies – Août 2005 – n°231
Cette analyse porte évidemment beaucoup sur
Lactococcus lactis bien connu dans ces industries et
dont la génétique, les systèmes de transformation
génétique, et l'expression génétique comme les
systèmes de sécrétion ont donné lieu à de multiples
publications et brevets. Il y a joute les avancées
dans le domaine de l'immunostimulation des
muqueuses.
La séquence génomique de Lactococcus lactis
IL1403 a été établie et comporte 2 365 589 pb. On
peut en déduire l'existence de 2310 protéines, 6
prophages
et
43
séquences
d'insertion.
Streptococcus thermophilus A054 contient 1824 kb.
La revue commence par la génétique de ces
bactéries puis se tourne vers les transferts
génétiques possibles avec, notamment, l'utilisation
de plasmides conjugatifs. Elle insiste sur l'exemple
de l'élément conjugatif intégratif ICESt1 de
S.thermophilus CNRZ368.
L'exemple du transfert horizontal du locus variable
eps de 32,5 kb, codant la synthèse des
exopolysaccharides et contenant 25 ORFs, plus 7
séquences d'insertion est analysé.
Bien entendu, la production de nisine par
plusieurs souches de L.lactis (dont L.lactis 6F3) est
analysée. La nisine est un antibiotique "naturel"
qui est accepté, dans certaines conditions, comme
préservateur en alimentaire. On a identifié, il y a
une dizaine d'années, le transposon conjugatif de
70 kb Tn5276 qui code, classiquement, le
lantibiotique et l'immunité correspondante, en, sus
de la capacité à utiliser le saccharose via un système
de transport par phosphotransférase. Il est présent
dans la souche hollandaise NIZO R5 de L.lactis.
L'intégration de Tn5276 dans le génome de L.lactis
MG1614 est site- et orientation-spécifique.
On a également cherché à exprimer antigènes
vaccinaux (plus éventuellement des cytokines
stimulant l'immunité jouant le rôle d'adjuvants) et
enzymes qui peuvent ainsi être directement introduit
oralement et produits dans le tube digestif. C'est le cas
de plusieurs protéines vaccinales, mais aussi de la
lipase de Staphylococcus hyicus permettant à des
porcs de mieux tolérer une alimentation riche en
lipides.
72. Streptococcus thermophilus utilisé dans les
yaourts et en fromagerie transporte le lactose via une
lactose perméase (LacS), qui fonctionne comme un
antiport avec importation du lactose et exportation
du
galactose
libéré.
Une
β-galactosidase
intracellulaire hydrolyse, en effet, le lactose mais la
plupart des souches ne savent pas utiliser le
galactose, ne consommant que la partie glucose du
substrat, ce qui explique la sélection d'un antiport. Ce
rejet du galactose dans le milieu facilite la vie de
microorganismes nuisibles (notamment des bactéries
lactiques hétérofermentaires qui créent des bulles de
CO2 nuisibles à la texture du fromage ou du yaourt),
en leur fournissant une source de carbone et d'énergie,
et ceci n'est pas souhaité par les industriels. Par
ailleurs, le galactose favorise la formation
d'exopolysaccharides dont il alimente les précurseurs.
Il existe pourtant des souches possédant une
phospho-β-galactosidase, ce qui indique qu'il existe
22
plusieurs voies potentielles de transport du lactose
et de fermentation du galactose.
La voie la plus courante d'utilisation du galactose
est la voie de Leloir chez les S. thermophilus. Les
gènes de la voie sont conservés chez les souches Galde S.thermophilus et elle ne savent pourtant utiliser
que glucose, lactose et saccharose comme sources de
carbone et d'énergie. Mais il existe quelques souches
qui peuvent utiliser le galactose (souches Gal+).
La voie de Leloir utilise un régulateur (GalR),
activateur de transcription fonctionnel sur les deux
groupes de gènes gal et lac (et qui régule
négativement sa propre production) dont le messager
est transcrit en sens inverse des gènes galKTEM
codant une galactokinase (GalK), une galactose 1phosphate uridylyltransférase (GalT), une UDPglucose 4-épimérase (GalE) et une mutarotase (GalM).
La région intergénique galR-galK loge un
promoteur commun aux deux groupes de gènes. Au
moins deux souches de S.thermophilus regroupent
galKTE dans un opéron donnant un messager
polycistronique (CNRZ 302 et SMQ-301), galM ayant
acquis (ou conservé) son propre promoteur..
Jusqu'à présent on a attribué ce défaut, récemment
acquis, à un défaut d'induction (ou de traduction) de
GalK qui est le facteur limitant dans la voie de Leloir.
La souche CNRZ 302 (Gal-) possède des gènes intacts
pour toute la voie, mais ils ne sont que faiblement
exprimés. C'est typiquement un défaut de promoteur.
Les mutations rétablissant le phénotype galactosepositif ne provoque, pourtant, pas une expression
continue (constitutive) ce qui indique que les
S.thermophilus sont, en principe, Gal+ et sont devenus
récemment Gal-.
F de Vin et al.; Applied & Environmental
Microbiology 71 (JUL05) 3659-3667 ont étudié la
capacité de 8 souches laitières de Streptococcus
thermophilus incapables d'utiliser le galactose (Gal-)
après consommation du lactose. Ces souches excrètent
le galactose dans le milieu. Ils ont séquencé la région
intergénique galR-galK. Leurs résultats montrent que
le promoteur gal n'est probablement pas seul en
cause.
Les activités de GalT et GalE sont détectées dans
toutes ces souches. L'activité GalK n'est détectée que
chez deux des huit souches Gal+. Ceci indique que les
six autres doivent utiliser le galactose par une autre
voie.
73. Une nouvelle tomate surexprimant
simultanément deux antioxydants vient d'être
construite en stimulant les voies de synthèse des
terpenoïdes, des phénylpropanoïdes et de l'acide
chlorogénique. GR Davuluri. et al.; Nature
Biotechnology 23 (JUL05) 890−895.
On admet que le lycopène des tomates, les
isoflavones du soja, les glucosinolates des brocolis,
les épicatéchines du thé et du chocolat peuvent
apporter des bienfaits. Mais si on veut faire accepter
cette amélioration on se heurte à des difficultés
psychologiques liées au fait que les biotechnologies ne
peuvent, a priori, que donner que des produits
dangereux comme veulent le souligner certains.
Le groupe de C Bowler, de l'Ecole Normale
Supérieure à Paris, qui associe des chercheurs italiens
Le Bulletin des BioTechnologies – Août 2005 – n°231
et anglais à Seminis Vegetable Seeds et DNA Plant
Technology, agit sur un seul facteur de
transcription, DET1, qui était connu comme un
répresseur de la photomorphogenèse chez
Arabidopsis. Il régule également négativement la
production des caroténoïdes dans les fruits. Une
mutation dans ce facteur stimule, donc, la production
de ces pigments, mais entraîne un nanisme et une
diminution de la production des fruits, ce qui est
fâcheux. Une tentative antérieure consistait à
surexprimer le gène CRYPTOCHROME2 , mais qui
entraînait les mêmes défauts de croissance.
Le groupe a donc réprimé l'expression du gène
DET1 par interférence ARN, en exprimant des ARN
en épingle à cheveu (donnant le double-brin
indispensable) sous la commande d'un promoteur
spécifique du fruit qui évite donc, a priori, les effets
négatifs sur la productivité. Ils ont bien observé la
production de β-carotène et de lycopène, mais
également des phénylpropanoïdes comme l'acide
chlorogénique, la naringénine-chalcone et des
glycosides de la quercetine.
Les niveaux de caroténoïdes et flavonoïdes sont
accrus de dix fois dans certaines des lignées
transgéniques obtenues (cela dépend du promoteur
utilisé)..
Mais le caractère imprévisible des effets de cette
seule modification souligne bien l'imperfection de nos
connaissances. Pat ailleurs, les auteurs ont agit sur un
facteur de transcription, ce qui a, quasiment par
essence, des effets pléiotropes, et une analyse plus
approfondie du phénotype des lignées transgéniques
est nécessaire pour voir si des caractères défavorables
ne viennent pas ternir un peu le bilan. Mais c'est
quand même, après le riz doré de Potrykus, un bel
exemple d'amélioration de la qualité nutritionnelle
d'une plante.
C'est une plante transgénique, me direz vous, oui
mais le gène modifié et le promoteur sont issus de la
même plante. Une modification génétique naturelle
imprévue peut aboutir au même résultat et sera donc
"naturelle" voire "biologique". Enfin les siRNAs
régulateurs ne sont pas transmis à la méiose, même si
le gène qui les produits l'est, mais n'est fonctionnel
que dans le fruit. Voir le commentaire de RA Dixon;
Nature Biotechnology 23 (JUL05) 825-826.
75. Les Escherichia coli produisant des
Shigatoxines
(STEC)
ou
simplement
entéropathogènes (EPEC) peuvent être facilement
isolées des bouses de bovins diarrhéiques.
MA Hornitzky et al.; Applied & Environmental
Microbiology 71 (JUL05) 3405-3412 ont caractérisé la
variabilité observée dans ces échantillons en Australie.
Utilisant une PCR multiplex, puis des cultures, ils
ont caractérisé des combinaisons de gènes stx1, stx2,
eae et ehxA. La très forte prévalence du gène eae de
l'intimine est remarquable chez les STEC, mais pas
inattendue. Le gène est localisé dans le LEE (Locus of
Enterocyte Effacement). Une étude allemande de cas
de diarrhées humaines et de syndrome urémique
hémolytique il y a avait déjà souligné cette
association, chez l'homme (L Beutin et al.; Journal of
Clinical. Microbiology 42 (MAR04) 1099-1108).
La bactérie couvre, en effet, le sommet du piédestal
qu'elle induit à la surface luminale de l'entérocyte avec
sa protéine Tir qui est insérée dans la membrane
entérocytaire qui sert alors de récepteur pour une
autre protéine, l'intimine de la membrane externe de
la bactérie (on n'est jamais si bien servi que par soimême. L'injection du récepteur Tir, ultérieurement
phosphorylé, permet alors l'adhésion via l'intimine et
le soulèvement du piédestal sur lequel repose la
bactérie.
Ils ont pu caractériser 47 sérotypes STEC dont
8:H19, O26:H- O26:H11, O113:H21, O157:H7,
O157:H- et:H- dont on sait qu'ils causent de sérieux
troubles intestinaux chez l'homme. Les sérotypes
Ont:H- et O113:H21 sont les plus fréquents. Cela
confirme bien que les bovins sont des réservoirs de ces
bactéries pathogènes avec des phénotypes très variés.
et al.; Cellular Signalling 17 (JUL05) 891-899
montrent que ces toxines manipulent la régulation de
la traduction.
L'initiation de la traduction est assurée après
phosphorylation d'eIF4E qui se lie, alors, à la partie
amont des messagers. Ceci peut être inhibé par le
répresseur 4E-BP1. C'est à ce niveau que les Stxs
interviennent. Elles activent la phosphorylation
d'eIF4E, mais aussi de la 4E-BP1, ce qui diminue son
effet inhibiteur sur eIF4E.
La sécurité alimentaire
76. Les shigatoxines (Stxs) causent des dommages
irréversibles au niveau des fonctions ribosomales des
eucaryotes. Pourtant, l'infection des cellules
épithéliales intestinales entraîne une surproduction de
certaines protéines comme des cytokines. WE Colpoys
79. A Loy et al.; Applied & Environmental
Microbiology 71 (JUL05) 3624-3632 se sont intéressé
aux bactéries qui poussent dans les eaux minérales
plates. Cette colonisation est observée après quelques
jours seulement si des précautions ne sont pas prises.
On pensait généralement qu'il s'agissait de
γ−protéobactéries, mais il semble qu'il n'en soit rien et
que ce sont surtout des
Hydrogenophaga,
Aquabacterium
et
Polaromonas,
des
βprotéobactéries.
80. L'utilisation des hautes pressions (HPT) dans
les procédés de stérilisation des aliments est étudiée
depuis des années. E Rodriguez et al.; Applied &
Environmental Microbiology 71 (JUL05) 3399-3404
analysent l'effet de ces hautes pressions sur des
Escherichia coli O157:H7 dans des fromages inoculés
avec 105 unités infectieuses/ml. Les fromages
uniquement protégés par des bactéries lactiques
produisant des bactériocines ne montrent qu'une
réduction très relative. Un traitement à 300 MPa au
deuxième jour complété par l'addition de souches de
Lactococcus lactis produisant lacticine 481, nisine A,
entérocines TAB 57, ou AS-48 permet d'abaisser
fortement la contamination dans des fromages à 60
jours. Un traitement HPT à 50 jours supprime
complètement les E.coli pathogènes dans les
fromages.
23
Le Bulletin des BioTechnologies – Août 2005 – n°231
Les mêmes auteurs avaient déjà montré l'efficacité
combinée contre des Staphylococcus aureus.
L'Environnement
81. L'efficacité des biodépollutions dépend de
beaucoup de facteurs. Les microbes n'ont, en général,
aucune propension naturelle à utiliser les
xénobiotiques
(produits
chimiques
d'origine
anthropique, donc de date récente dans la biosphère,
l'évolution et les sélections subséquentes, n'ayant pas
eu le temps d'opérer. Par ailleurs, ce qui est toxique
pour l'homme l'est souvent, pour des raisons
similaires, pour les microorganismes. Il faut donc bâtir
des résistances correspondantes pour opérer dans des
conditions où ils nous sont utiles (c'est-à-dire au
dessus d'un certain seuil où la pollution devient
gênante pour nous). Enfin, s'il arrive à nous
débarrasser d'un produit gênant, ils le transforment
souvent en un autre produit dont il ne faut pas qu'il
soit encore plus toxique. Ces sous-produits sont
fréquents quand il s'agit d'un co-métabolisme, c'est-àdire quand le microorganisme possède une enzyme
laxiste (notamment des cytochromes P450) qui, par
hasard, attaque le xénobiotique, mais sans aucune
utilisation ultérieure (faute de voies métaboliques
adéquates). C'est également le cas quand le substrat à
éliminer n'est qu'un accepteur d'électrons, le
microorganisme se moquant bien de la suite (cas des
bactéries de notre intestin, convertissant les nitrates en
nitrites probablement cancérigènes). La minéralisation
totale en C02, H2O et autres produits simples comme
le méthane ne peut être réalisée que si toutes les voies
de catabolisme sont présentes et elles ne le seront que
si le substrat est un substrat usuellement utilisé par le
microorganisme. Donnez leur des produits pétroliers
bruts, ils les connaissent depuis des millions d'années,
et on comprend que la biodépollution soit facile, mais
le microorganisme ne le fait qu'à son rythme qui n'est
pas le notre.
Il faut donc le stimuler. Quand il s'agit d'un
métabolisme gratuit, il faut fournir le vrai bon substrat
qui leur permet de vivre, ainsi qu'un accepteur
d'électrons acceptable. L'accessibilité du xénobiotique
aux cellules et à leurs enzymes doit être assuré,
beaucoup pouvant être adsorbés dans le sol, difficiles
à déloger et beaucoup sont hydrophobes. C'est
pourquoi la production de détergents par le
microorganisme ou leur adjonction est utile (c'est
particulièrement vrai dans le cas des hydrocarbures.
On parle de bio-stimulation.
Si, par malheur, le microorganisme ne se rend pas
compte de notre sollicitude et continue à être
paresseux, on procède à des additions de
microorganismes spécialisés et déjà améliorés
(bioaugmentation).
On ne manque pas de souches capables d'assurer des
fonctions utiles dans ce domaine et quand on n'en
connaît pas, il suffit de cribler les populations
naturelles pour en trouver. Mais l'un des problèmes
posés est celui de la compétitivité des souches
inoculées face à une population naturelle
probablement adaptée depuis longtemps. Les
pollutions humaines sont rarement le fait d'une seule
molécule, mais représentent souvent une collection de
molécules apparentées ou non. Il faut donc utiliser une
24
batterie de microorganismes, et tous doivent être
également adaptés ce qui pose à la fois le problème de
l'efficacité individuelle et collective (et de leur
compétitivité collective).
Nous pratiquons ces
opérations depuis longtemps notamment dans les
stations d'épuration des eaux usées, ou les boues
activées sont sélectionnées dans les grands bassins
d'aération et sont donc bien compétitives et dont on se
sert pour ensemencer le bassin après un accident de
fermentation
On travaille beaucoup pour améliorer ces souches,
mais les conditions opérationnelles jouent également
un rôle dans l'efficacité pour une souche donnée dans
un lieu donné. Du coup il vaut mieux standardiser au
maximum ces conditions et travailler dans des
bioréacteurs plutôt que dans une nature ouverte.
L'attrait de ces techniques "biologiques" ne doit pas
masquer le fait que beaucoup d'essais de
bioaugmentation ont échoué, la plupart du temps à
cause des imprécisions de nos connaissances,
notamment sur le plan de la compétitivité. Une revue
de S El Fantroussi et al.; Current Opinion in
Microbiology 8 (JUN05) 268-275 porte sur ce vaste
sujet.
Une autre revue mérite d'être lue à ce sujet, c'est
celle de TJ Gentry et al.; Biodegradation 15 (FEB04)
67-75. Elle envisage les différentes stratégies
possibles pour améliorer la persistance des souches
introduites dans l'environnement.
Une autre revue porte plutôt sur la sélection des
souches requises (AC Singer et al.; Trends in
Biotechnology 23 (FEB05) 74-77). On dispose, en
effet, de plus en plus de souches et de consortia
cataboliquement divers et de gènes transférable dans
des souches mieux connues pour leur persistance dans
les sols contaminés mais moins efficaces.
Autrement dit on a cessé de considérer la biologie
d'un site pollué comme une boite noire qu'on traite
empiriquement. Je me rappelle encore de la remarque
qu'il n'y a qu'à rechercher un microbe dans le sol d'une
usine produisant un polluant donné pour en trouver un
et l'utiliser. Ce n'était pas idiot et à permis de trouver,
effectivement, des souches capables d'attaquer un
produit ubiquitaire dans ce milieu, mais un sol d'usine
n'est pas forcément équivalent à des sites pollués par
une marée chimique, par exemple, et la compétition,
même entre souches équivalentes n'est pas la même et
ne se joue pas forcément sur le plan de l'efficacité
82. L'oxydation biologique des sulfures et du soufre
est ubiquitaire dans bien des milieux, notamment les
milieux extrêmes comme les souffleurs sous marins ou
les milieux volcaniques. Ce sont surtout des archées et
des bactéries qui opèrent dans ces milieux, mais
certains de ces procaryotes sont des endosymbiotes
chimioautotrophes d'invertébrés marins auxquels ils
fournissent
les
substrats
énergétiques.
Les
mitochondries de certains de certains vers et
mollusques bivalves peuvent, lors de phases
anaérobies transitoires détoxifier le soufre et ces
réactions peuvent fournir de l'énergie. CG Friedrich et
Le Bulletin des BioTechnologies – Août 2005 – n°231
al.; Current Opinion in Microbiology 8 (JUN05) 253259 passent en revue l'oxydation procaryotique du
soufre. La revue couvre aussi bien le domaine des
bactéries que des archées.
L'oxydation aérobie du soufre est limitée, chez les
Archées, aux Sulfolobales (des thermoacidophiles).
Chez les bactéries, le soufre est oxydé par des
chimioautotrophes aérobies et des phototrophes
anaérobies;
Les α-protéobactéries possèdent le système
d'oxydation Sox, tandis que les β- et γprotéobactéries, ainsi que les chlorobiacées, ne
possèdent pas les gènes codant la déshydrogénase du
soufre, et doivent oxyder le soufre en sulfate d'une
façon différente.
Les bactéries acidophiles utilisent un autre système
que le système Sox, ce qui est également le cas des
bactéries chimioautotrophes endosymbiotiques.
Par ailleurs des bactéries photosynthétiques
anaérobies peuvent transférer les électrons du soufre
ou d'ou d'autres sources au dioxyde de carbone et le
réduire.
La caractérisation du système Sox chez Paracoccus
pantotrophus, une α-protéobactérie, a permis de
constater que ce système est très répandu chez des
bactéries très diverses. C'est un système
fondamentalement distinct de celui des archées
oxydant le soufre grâce à des protéines spéciales.
Ainsi l'auteur prend pour exemple l'archée
thermoacidophile, Sulfolobale anaérobie facultative,
Acidianus ambivalens. On y a caractérisé plusieurs
protéines impliquées dans l'oxydation du soufre.
L'oxygénase-réductase du soufre (SOR) y est
cytoplasmique.
Elle permet la conversion du soufre, soit en sulfite
et thiosulfate, soit en sulfure en présence d'oxygène.
SOR comporte 24 sous-unités avec un fer non hème à
bas potentiel. Mais du fait de cette localisation
cytoplasmique et de l'absence de cofacteurs en dehors
du fer, la bactérie ne peut coupler l'oxydation du
soufre à une phosphorylation de substrats ou au
transport
d'électrons.
La
SOR
d'Acidianus
tengchongensis(alias Acidianus souche S5) possède
trois cystéines indispensables à sa fonction.
Le "cluster" des 15 gènes sox bactériens a été
caractérisé chez P.pantotrophus. Il comprend,
notamment, le gène soxR régulateur de l'ensemble,
dont le produit se fixe sur les régions intergéniques
soxS–V et soxW–X. Les gènes soxXYZABCD codent
quatre protéines périplasmiques: SoxXA, SoxYZ,
SoxB et Sox(CD) qui constituent le système
enzymatique Sox.
SoxXA comporte un cytochrome c dihème, SoxA
et le monohème SoxX. Le complexe SoxYZ ne
comporte aucun métal ou cofacteur enzymatique,
mais SoxY lie le soufre à différents niveaux
d'oxydation grâce à un motif particulier.
SoxCD est un tétramère avec un hétérodimère α2β2
de la protéine à molybdène SoxC et du cytochrome
c dihème SoxD. C'est une déshydrogénase du soufre
libérant 6 électrons par thiosulfate, ce qui en fait un
type à part. Mais, apparemment, son rôle est encore
mal défini et à distinguer de celui des oxydases (voir
plus loin ce qui se passe chez les Chlorobiacées)
SoxB contient un noyau double à manganèse et
jouerait le rôle de sulfate thiohydrolase en interaction
avec le complexe SoxYZ.
Ce complexe s'attaque à des substrats qui ne sont ni
isostériques, ni isoélectroniques et possédant des
potentiels redox différents, ce qui est quand même
remarquable.
Chez l'annélide pogonophore Vestimentifères Riftia
pachyptila,
sans
intestin,
des
bactéries
chimioautotrophes du voisinage prélèvent leur énergie
en oxydant les sulfures émanant de souffleurs marins,
mais certaines d'entre elles sont captées par le ver et
stockées et entretenues dans un trophosome qui tient
lieu de système digestif. La bactérie est un γprotéobactérie présentant au moins trois formes
différentes.
Les Chlorobiacées sont photosynthétiques (vertes)
sans production d'oxygène qui savent oxyder les
sulfures en sulfates et dépose de façon transitoire des
globules de soufre autour d'elle. Comme le soufre est
moins dense que l'eau il flotte à la surface. C'est ainsi
que se sont constitués les gisements de soufre de la
Louisiane, du Texas et du Mexique et qu'ils se forment
actuellement dans certains sites comme la sebkhra
d'Ain Ezzaouia en Lybie .
Chlorobium tepidum contient un cluster, dont
soxFXYZAB homologues de ceux de P.pantotrophus.
L'absence des gènes soxCD indique que cette bactérie
utilise une autre voie d'oxydation. La bactérie possède,
en revanche, une duplication des gènes dsr codant une
sirohème sulfite réductase dissimilatrice.
Les Chromatium qui sont des bactéries du même
type, mais pourpres et stockant le soufre enveloppé
de protéines dans le périplasme, possèdent le même
jeu de gènes dsr. Allochromatium vinosum est une γprotéobactérie possédant les gènes soxAXB et soxYZ
mais avec des localisations différentes dans le
génome. Le dépôt de soufre durant l'oxydation des
sulfures et thiosulfates en sulfate se fait probablement
sous la forme d'organylsulfanes (chaînes de soufres).
Les gènes dsr permettent l'oxydation anaérobie du
soufre immobilisé.
Le cluster complet de ces gènes dsr d'A.vinosum
comporte 15 gènes, dsrABEFHCMKLJOPNRS. Les
gènes dsrAB codent une sulfite réductase, une
protéine très semblable aux DSR (Dissimilatory
Sulfite Reductases) des bactéries et archées
réduisant les sulfates.
Les protéines transmembranaires DsrKMJOP sont
associées à DsrAB (la sulfite réductase) et constituent
probablement un complexe de transfert d'électrons.
Mais des mutants des gènes dsr conservent la
possibilité d'oxyder sulfures, thiosulfates et sulfites en
présence de lumière. On ne connaît donc toujours pas
comment se fait l'oxydation du soufre stocké.
La β-protéobacterie Thiobacillus denitrificans est
une lithoautotrophe obligatoire pouvant oxyder, si
nécessaire des dérivés du soufre et déposer
transitoirement du soufre moléculaire. Son originalité
est de pouvoir pousser de façon anaérobie en oxydant
les thiosulfates et en réduisant les dérivés oxydés de
l'azote comme nitrates et nitrites en dégageant de
l'azote moléculaire. On retrouve dans la séquence
génomique partielle connue le même cluster de gènes
dsr que chez A.vinosum.
25
Le Bulletin des BioTechnologies – Août 2005 – n°231
On trouve, par ailleurs, des gènes raisonnablement
homologues des gènes sor (oxygénase-réductase du
soufre) des archées évoqués au début de mon
commentaire, chez les archées A.tengchongensis,
Sulfolobus tokodaii et Ferroplasma acidarmanus,
ainsi que chez la bactérie hyperthermophile Aquifex
aeolicus, mais pas chez l'acidophile mésophile
Acidithiobacillus ferrooxidans. On trouve, par contre,
chez cette dernière une duplication des gènes doxDA
codant la thiosulfate:quinone oxydoréductase
(TQO) membranaire décrite chez A.ambivalens qui
permet
l'oxydation
des
thiosulfates
avec
ferricyanure ou décylubiquinone comme accepteurs
d'électrons. La TQO permet donc un couplage entre
oxydation des thiosulfates avec réduction de l'oxygène
par une courte chaînede transport d'électrons.
83. Les Géobactéracées (voir le §60) sont des
réducteurs d'oxydes de métaux comme le fer ferrique
et le manganèse (Mn4+). Des Geobacter sont
également capable de réduire d'uranium. On sait les
utiliser pour précipiter les métaux des eaux en
ajoutant pour substrat de l'acétate qui est oxydé grâce
à ces accepteurs d'électrons. Le génome de Geobacter
sulfurreducens, une δ-protéobactérie, a été séquencé
par le TIGR (BA Methé et al.; Science 302 (12DEC03)
1967-1969). L'analyse de ce génome avait indiqué que
ce génome partageait avec une autre bactérie réduisant
le fer, Shewanella oneidensis, une γ-protéobactérie,
seulement deux gènes (des cytochromes c) non
observés ailleurs, et on en avait conclu que ces
cytochromes intervenaient dans la réduction du fer.
Mais si on élargit la recherche à d'autres groupes on
constate que ce n'est pas un petit nombre de gènes qui
est impliqué, mais que de nombreuses autres
modifications
du
métabolisme,
notamment
énergétiques, sont nécessaires.
E Afkar et al.; BMC Microbiology (06JUL05) 5:41
montrent que la plus importante protéine de la
membrane externe (OMP) de G.sulfurreducens,
OmpJ, n'est justement pas un cytochrome et pourtant
elle est indispensable à la réduction du métal. Elle
est présente chez les autres Géobactéracées auxquels
elle est particulière. Son inactivation entraîne la perte
de nombreux cytochromes. Tout indique qu'il s'agit
d'une réaction à un stress qui entraîne la dégradation
de multiples protéines périplasmiques ou de la
membrane
externe,
dont
les
cytochromes
indispensables à la réduction des métaux. Mais cela
n'explique pas pour autant le rôle particulier d'OmpJ.
La sécurité génétique
84. CG Williams; Nature Biotechnology 23
(MAY05) 530-532 soulève le problème de la
dispersion du pollen des arbres forestiers
transgéniques qui vont apparaître sur le marché. C'est
effectivement un problème plus important que celui
des cultures classiques pour lesquelles la dispersion
est usuellement très limitée en distance. Les pins ont
commencé à être plantés en grand pour leur bois
depuis le milieu du siècle dernier.
Ces arbres sont cultivés sur de grandes surfaces,
notamment Pinus taeda, et font l'objet de recherches
de l'industrie correspondante. Celle-ci gère, avec des
arbres améliorés, environ 11% des forêts exploitées
aux Etats-Unis. Pinus taeda constitue 25 millions
d'hectares dans les états du sud, et fournit 16% des
grumes récoltées dans le monde. On en plante environ
un milliard par an et on le récolte 25 à 35 ans après.
On le commercialise actuellement sous forme
clonale par embryogenèse somatique, ce qui ouvre la
possibilité de cloner des arbres transgéniques. Le vrai
danger est l'uniformité, plus que la transgenèse, car
les plantations traditionnelles sont gérées au niveau
des populations pour conserver une certaine diversité
génétique. On ne plante donc jamais de populations
inbred (autant que je sache il ne se bouture pas) et
aucun conservatoire de gène n'est établi.
Le problème est que ces arbres forment du pollen
et des graines bien avant d'avoir atteint une taille
commerciale. Comme la grande majorité de ces
arbres sont également présents dans les mêmes régions
sous la forme"sauvage", les risques de transmission de
gènes est donc importante car la fécondation
anémophile de ces arbres entraîne le pollen de 11 à 35
kilomètres de l'émetteur et le pollen d'un arbre dépasse
un kilomètre, même si plus de 99,9% se dépose au
voisinage. Ce sont les quelques pourcent restant qui
posent problème. Il ne sert donc à rien d'établir un
cordon de bioconfinement autour d'une plantation. Il
faudrait disposer de stérilités conditionnelles, or cette
caractéristique est quasiment inconnue chez les
conifères, et il faudrait financer d'urgence des
recherches dans ce domaine.
Reste à se poser la question de savoir si les
propriétaires proches de forêts transgéniques ont à y
perdre quelque chose. En effet, ils ne pourront être
soumis au jugement dit "Schmeiser" d'appropriation
frauduleuse de transgènes, et si ces arbres sont cultivés
sur de grandes surfaces, c'est qu'ils ont des qualités
commerciales intéressantes. Le risque est celui d'une
erreur d'évaluation, tout particulièrement dans le
caractère invasif. Mais, pour l'instant, on ne possède
aucune indication pour ou contre, car même une étude
expérimentale ne peut être réalisée en enceinte
confinée.
Néanmoins, il faut souligner qu'aucune étude de
l'impact environnemental de ces arbres n'a été
entreprise. La solution provisoire est de couper les
arbres avant maturation sexuelle, c'est-à-dire avant
d'atteindre leur taille commerciale rentable, ce qui est
quand même une hérésie.
85. La dernière analyse du secteur des biotechnologies par
Ernst & Young [S Lawrence ; Nature Biotechnology 23
(JUL05) 774] souligne que si la profitabilité est encore
problématique, les revenus des compagnies cotées ont
augmenté de 17% en 2004, les pertes ont également
augmenté d'autant par rapport à 2003. Les dépenses de R&D
ont augmenté de 12%. L'emploi a baissé de 21% en Europe
(passant de 32 470 à 25 640), mais augmente en Asie (9 810
à 13 410) et aux Etats-Unis (124 000 à 137 000). Les
Les Sociétés
26
Le Bulletin des BioTechnologies – Août 2005 – n°231
créations de sociétés augmentent en Asie, en Israël et en
Australie.
Aux Etats-Unis 20% des compagnies ont moins d'un an
de cash pour survivre, tandis que 33% en ont pour un à trois
ans, et 47% pour plus de trois ans, l'amélioration étant
constante depuis 2002. En Europe c'est plutôt l'inverse et en
2004, les proportions sont respectivement 22%, 43% et
22%.
86. Le problème des génériques biotechnologiques est
toujours posé. Cela n'empêche pas une firme comme Teva
de développer à grande allure ses capacités dans ce domaine;
Si les pays développés vont mettre des bâtons dans les roues
pour des raisons plus commerciales que sécuritaires, il existe
de très grands marchés pour des produits hors brevets. C'est
le cas de la Chine ou la firme israélienne vient d'acheter
Hualida Biotechnology Pharmaceutical Co., après
Tianjin et Sicor qui lui a déjà apporté 45% de Tianjin. Teva
a déjà réalisé des acquisitions au Mexique et en Lithuanie.
La Chine présente des avantages car son marché est plus
accessible. Au contraire, bien que l'US Food and Drug
Administration (FDA) ait annoncé depuis deux ans des
dispositions pour réglementer les génériques dans ce
domaine, rien n'est sorti. La machine est en place en Europe
et une maison sérieuse, maintenant spécialisée dans les
génériques comme Sandoz, n'arrive pas à faire autoriser son
hormone de croissance humaine.
Pendant ce temps Chine et Inde vont mettre sur le marché
des produits. Ces produits ne seront probablement pas
autorisés chez nous, mais les firmes parties tôt vont se faire
les dents sur les marchés émergents où leur domination va
mettre du temps à être surmontée puis affineront leurs
techniques. Les talents industriels et les infrastructures
seront là. A Katsnelson, Nature Biotechnology 23 (JUL05)
765.
87. La firme britannique Shire a acquis la firme
américaine Transkaryotic Therapies pour 1,6 milliards de
dollars US. Cette dernière a eu pas mal de difficultés ces
dernières années aux Etats-Unis et a perdu, l'an passé pas
moins de 340 millions de dollars. En effet, deux de ses
produits autorisés n'ont que peu de chances d'être des
"blockbusters". Son érythropoïétine a subi des dégâts dans
des contestations avec Amgen sur la propriété industrielle, et
son α-galactosidase A a été rejetée tant que la firme ne peut
prouver sa supériorité par rapport à la Fabrazyme™ de
Genzyme. En fait les revenus de la société ne peuvent venir
que de l'extérieur des Etats-Unis, ce qui la rend plus
attrayante pour une compagnie étrangère. Dans ce cas
précis, la Chambre des Lords a statué sur l'érythropoïétine
en sens inverse de la cour américaine, ouvrant la porte à un
marché européen.
L'un des grands problèmes aux Etats-Unis est vraiment la
hargne mise par les compagnies à défendre ce qu'elles
estiment être leur propriété industrielle, et Shire elle-même
est attaquée à propos d'un médicament de l'attention qui lui
coûte un million de dollars par mois en frais de justice. Ces
batailles sont expliquées par certains par la menace ressentie
par Amgen, Roche et Genentech des coupes sombres dans
les budgets fédéraux du Medicare.
Par ailleurs, Shire est menacée par la dominance du
marché américain pour ses produits (926 millions de dollars
aux Etats-Unis et seulement 186 millions pour le reste du
monde). Le marché européen de l'érythropoïétine pour les
défaillants rénaux représente probablement 1,5 milliard de
dollars. La société pourrait ainsi accompagner un autre de
ses médicaments utilisé pour les mêmes patients. Mais,
surtout, elle pourrait amortir jusqu'à 100 millions de dollars
des frais de R&D de son érythropoïétine sur ses profits.
Mais le danger de la compétition dans ce domaine est
énorme, car les produits de génération suivante sont déjà sur
le marché avec Amgen, Roche et Johnson & Johnson. Des
produits étrangers comme les erythropoïétines cubaine,
chinoise, indienne, coréenne et argentine arrivent également
(voir le §86).
90. GS Mack et al.; Nature Biotechnology 23 (JUL05)
779 discute d'une tendance contraire à celle qui prévaut
usuellement, celle d'acheter une société pas trop loin des
bénéfices avec un produit en fin de validation clinique. Il
s'agit d'acheter des sociétés aux tous premiers stades du
développement avec très peu d'investissements humains et
financiers, et qui ont une bonne idée et qui, au lieu de viser à
tout faire toute seule, misent sur une mise en vente précoce
de leur potentiel qui en fait une sorte de société virtuelle
L'auteur analyse un investisseur dont l'essentiel des
investissements porte sur des sociétés qui ont moins de 5
employés, ce qui les rend très peu coûteuses à l'achat. Cela
permet de remplir à bon compte les pipelines souvent
désespérément vides de grandes compagnies. Mais une
compagnie avec une seule molécule peut quand même jouer
de sales tours, car la moitié des essais cliniques terminaux
seront négatifs
La Politique
91. Les mises en alerte à propos des cas humains de la
grippe aviaire doivent être prises en compte avec méfiance,
car le principe de précaution est mis en œuvre avec
beaucoup de constance. La vérification des cas suspects n'est
souvent assurée qu'ultérieurement et l'OMS augmente et
baisse régulièrement sa gradation dans la vigilance (6
degrés). Après avoir, fin Juin, avait pensé élever le degré 3 à
4 (plusieurs petits foyers localisés)ou 5 (foyers importants) à
la suite des observations au Vietnam. Cette élévation du
risque entraîne conduirait à mettre en œuvre les stocks
d'antiviraux et à limiter les voyages dans ce pays.
L'utilisation par une commission de l'OMS de ses propres
tests PCR a infirmé les conclusions précédentes sur la
présence du virus H5N1. Reste à expliquer le pourquoi de
ces différences. Des études sérologiques vont être réalisée à
Hong Kong.
Les délais d'analyse entraîne une dispersion des patients et
des risques accrus de contagion si des erreurs de diagnostic,
dans un sens ou l'autre,se répètent.
La migration des oiseaux sauvages infectés de Chine vers
le sud va avoir lieu en Septembre et Octobre. D Butler;
Nature 436 (07JUL05) 6. Il faudra suivre la question en
Indonésie où de nombreux cas suspects dispersés sont
signalés.
92. Le fait que Ventria Bioscience, ait dû annuler ses
plantations de riz "médicaux" produisant lysozyme et
lactoferrine dans le Missouri à la suite de plaintes de la
brasserie Anheuser-Busch de Saint Louis, malgré son
respect de toutes conditions officielles, montre que la
sensibilité commerciale est grande et que les firmes
alimentaires ne veulent pas risquer d'être les responsables
d'une erreur comme celle qui a coûté cher à d'autres.
L'exemple du maïs Starlink indique, qu'intentionnellement
ou pas, des contaminations des récoltes par des graines (ou
des pollens transgéniques) ont eu lieu. Ventria a dû déplacer
vers le nord ses deux riz mais doit, cette année, commencer
par adapter ses variétés à ce nouveau site en commençant
par les variétés de base non transgéniques. Mais le choix par
Prodigene et Ventria Biosciences, de plantes comestibles est
probablement un handicap durable et celui du Tabac est
peut-être préférable (cas de Chlorogene).
En tout cas l'US Biotechnology Industry Organization
(BIO) se préoccupe de ce problème.
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