160000 - 1 - PLURIPOTENCE ET ES

PLURIPOTENCEETES
Pr John DE VOS
Département d’Ingénierie Cellulaire et Tissulaire
INSERM 1183 – Institut de Recherche en
Médecine régénérative et Biothérapies (IRMB)
CPP Sud Méditerrannée IV
Hôpital St Eloi - CHU de Montpellier
[email protected]
@_jdevos_
Cellulessouches
o  Onpeutclasserlescellulessouches(CS)selon
leurscapacitésdedifféren?a?on:
o CSunipotentes
o CSmul?potentes
o CSpluripotentes
Cellulessouches
o  Onpeutclasserlescellulessouches(CS)selon
leurscapacitésdedifféren?a?on:
o CSunipotentes
o CSmul?potentes
o CSpluripotentes
LA
PLURIPOTENCE
EXISTE-T-ELLE?
Embryogenèseprécoce
36|NATURE|VOL526|1OCTOBER2015
Embryogenèseprécoce
Globules polaires
Zone pellucide
Pronuclei
120 µ
FÉCONDATION
o  Ovocyte
o  140µ
o  Zonepellucide
o  Spermatozoïde
ZYGOTE
Embryogenèseprécoce
Blastomères
2 BLASTOMÈRES
4 BLASTOMÈRES
Embryogenèseprécoce
8 BLASTOMÈRES
PUIS 16 - 32
BLASTOMÈRES :
MORULA
Leblastocyste
Liquide
COMPACTION
STADE
BLASTOCYSTE
Leblastocyste
Masse cellulaire interne (MCI)
ou bouton embryonnaire
ou embryoblaste
Trophoblaste
COMPACTION
Blastocèle
STADE
BLASTOCYSTE
Leblastocyste
MCI
Hypoblaste
Épiblaste
ÉCLOSION DU
BLASTOCYSTE
BALSTOCYSTE
ÉCLOS
11
Leblastocyste
ENDOMÈTRE
Syncytiotrophoblaste
IMPLANTATION DU
BLASTOCYSTE
12
Lasegmenta?onenphotos
Fécondation
55 h
36 h
24 h
3–4j
13
Leblastocyste
4–5j
5-6j
5-6j
14
Leblastocyste
o  Blastocyste
o 
o 
o 
o 
o 
64–128cellules
Trophoblaste
Cavitéliquidienne:blastocèle
ICM
=J5-6
o  Nobelmédecine2010:la
féconda?oninvitro(Bob
Edwards)
Masse cellulaire
interne
Trophoblaste
Géographiedel’embryogenèseprécoce
o  Pasde
vascularisa?on:
o  Hypoxie
o  Métabolisme
spécifique
INVIVO,LAPLURIPOTENCEESTFUGACE
J1
Blastocyste (J6)
LA
PLURIPOTENCE
PEUT-ELLE ÊTRE
STABILISÉE ?
Lapluripotencepeut-elleêtrestabilisée?
J1
Blastocyste (J6)
J28
Cellulessouchesembryonnaires
J1
Sang
Blastocyste (J6)
coeur
J28
neurones
Cellulessouchesembryonnaires(ES)
J1
Sang
Blastocyste (J6)
coeur
J28
neurones
Souris: 1981 Evans & Kaufman, Nature 292, p154
HumaIn: 1998 Thomson, Science, 282, p1145
ÉTHIQUE ET
RECHERCHE SUR
L’EMBRYON HUMAIN
Blastocyste
6 jours
1j
6j
28J
35J
10 semaines
LOIRELATIVEÀLABIOÉTHIQUE
LOIRELATIVEÀLABIOÉTHIQUE
Conseil d’orientation
LOIRELATIVEÀLABIOÉTHIQUE
LOIRELATIVEÀLABIOÉTHIQUE
Enjeuxdelarecherchesurl’embryon
o  Majeurs:
o  Lescellulessouchesembryonnaires(«gold
standard»)
o  Compréhensiondelapremièresemainedu
développementhumain
o  Améliora?ondestechniquesdeFIV
LIGNÉES DE
CELLULES SOUCHES
EMBRYONNAIRES (ES)
LignéesES
o  Proliféra?onillimitéeinvitro
o  èlignée
o  pasdelimitedeHayflick(hTERT)
o  Caryotpenormal
o  Glycolyse>OxPhos(«Warburg
metabolism»)
o  èsourceillimitéedecellules:
o  2doublementparsemainex25
semaines
o  è250=1015=1Tonne!
Main?endelapluripotence:cultureen2D
33
CellulesEShumaines
o  Croissanceencolonies(2D)
o  Besoind’unfeederoud’unematricear?ficielle
o  MEF(Murineembryonicfibroblasts)
o  Fibroblasteshumainsdesupport
o  Matrigel®
o  Milieuspécifique
o  basicFibroblastGrowthFactor(bFGF,FGF2)
o  NB:souris:LIF!!
LA
DIFFERENCIATION
DES ES
Différencia?onnondirigéeinvitro
o  Corpsembryoïdes:«embryoid
bodies»=EB
ES
(indifférenciées)
Changement
de milieu
EB
EB 3rd week (HD129, passage 53)
Différencia?onnondirigéeinvivo
o  Tératome
o  Injec?onsouscutanédansune
sourisimmunodéprimée(NSG:
NOD/SCIDIL2RG-/-)
o  Matrigel
o  106cellules
Différencia?ondirigée
o  Grâceàdescombinaisons,successives,de
matrices,co-cultureetfacteursde
croissance
o  Mimerledéveloppementnormal
o  =«recexedecuisine»
o  Enjeuxmajeursactuels
o  But:obtenir100%(oupas)decellules
différenciéesdansuntypecellulairedonné
[1]
B.N.Gomperts,“Induc?onofmul?ciliatedcellsfrominduced
pluripotentstemcells.,”ProceedingsoftheNa1onalAcademyof
Sciences,vol.111,no.17,pp.6120–6121,Apr.2014.
Exemple:épithéliumbronchique
Marqueursdelapluripotence
o  Marqueursdesurface
o  SSEA-3etSSEA-4
o  TRA-1-60etTRA-1-81
o  Ac?vitéphosphatasealcaline
(PAL)
o  Facteursdetranscrip?on
o  OCT4/POU5F1
o  NANOG
o  «coreregulatory
circuitry»
o  OCT4/POU5F1
o  NANOG
o  SOX2
o  Déterminants
«intrinsèques»dela
pluripotence
Cell vol 132:567, 2008
Déterminantsextrinsèquesdelapluripotence
bFGF
FGFR1
IGF-II
Human ESCs
Niche cells
Déterminantsextrinsèquesdelapluripotence
BMP
bFGF
O2
SIP+PDGF
FGFR1
?
?
Erk 1/2
IGF-II
O2
bFGF
Human ESCs
Niche cells
Différencia?oninvivo:sourischimères
Blastocyste
Souris blanche
Différencia?oninvivo:sourischimères
Blastocyste
Souris blanche
Lignée ES souris
de pelage gris
o  Touslesorganes,y
compriscellules
germinales
SourisKOettransgéniques
KO
Nobel médecine 2007 : souris ko et transgénèse:
Martin Evans, Oliver Smithies, Mario Capecchi
Dessouris100%issuesdecellulespluripotentes
Blastocyste
diploïde (2n)
chimère
2de génération
Dessouris100%issuesdecellulespluripotentes
Blastocyste
diploïde (2n)
chimère
2de génération
Blastocyste
tétraploïde
(4n)
o  Blastocystetétraploïde
(fusiondesdeux
blastomèresd’un
embryon2-cellulespar
chocélectrique):
forma?onduplacenta,
maispasdusouriceau
o  Testde
complémenta?ond’un
blastocystetétraploïde
Chimèreshomme/animal
Blastocyste
Souris blanche
Lignée ES ou iPS
humaine
Celluleshumaines=>chimères!
o  NB:ilfaut
descellules
ES“naïves”
Gafni et al. Nature 2013
50
Autressourcesdecellulespluripotentes
o  ES«naïves»vs.ES«engagées(commited)»(EpiSCs)
o  EpiSCs:chezlasouris,dépendantedubFGF(pasLIF),pluripotent
invitromaisnecontribuepasàdessourischimère.
o  ESsouris=«naïve»,EShumaines#EpiSCs
51
Chimèreshomme/animal
o  HiromitsuNakauchi
T.Rashid,T.Kobayashi,andH.NakauchiCellStemCell,vol.
15,no.4,pp.406–409,Oct.2014.
5lignéeshESC
o 
o 
o 
o 
o 
HD83
HD90(VHL+)
HD129(MUCOVISCIDOSE)
HD287(MUCOVISCIDOSE)
HD291
HD90 (p15)‫‏‬
OCT4
HD129 p53 : corps
embryoïde, 3ème semaine
α-SM actin
DAPI
CHU de
Montpellier
Dériva?ondelalignéeHD90
ICM and trophectoderm
separated
After mechanical dissection
x20
D0
x20
D0
x10
D3
After first passage
x10
D6
x10
D8
x20
D9
APPLICATIONS
DES ES
Applica?onsdesCSEh
o  Modélisa?oninvitrodudéveloppement
humain
o  Unesourceillimitédecellulespouruncriblage
pharmaceu?quesurcellulesplus
«physiologiques»
o  Unesourceillimitédecellulespourlathérapie
cellulaire
Pluripotenceetmédecinerégénératrice
Hepatocyte
Cellule
Beta
Cardiomyocyte
Myocyte
Sang
Pluripotence
Keratinocyte
Glia
Neurone
Pluripotenceetmédecinerégénératrice
Infarctus
I. hépatique
Myopathie
Hepatocyte
Diabète
Cellule
Beta
Cardiomyocyte
Myocyte
Sang
Pluripotence
Keratinocyte
Glia
Neurone
Brûlés
Paraplégie
Parkinson
Aplasies
ESSAISCLINIQUES:CELLULESOUCHES
EMBRYONNAIRES
o  ES:Geron:début2010,arrêt2011,
reprisesousl’égidedeAsterias
o  ES:OCATA(ex-AdvancedCell
Therapeu?cs):pathologiesdela
ré?ne;rachetéparASTELLAS
o  USA,UK,CoréeduSud
o  ES:APHP:traitementdel’infarctus
dumyocarde(PMenasché):2
pa?entsinclus
o  ES:Viacyte:disposi?fsous-cutané
produisantdel’insuline:FDAclearance
Montpellier15septembre2015
Schwartzetal.,Lancet,2014
Montpellier15septembre2015
ESSAISCLINIQUES
Schwartzetal.,Lancet,2012
Lyon2016
Limitesàunusagethérapeu?que
1.  Proliféra?on
o  Différencia?on+purifica?on
o  Intérêtdesmodèlesanimaux:lelongterme
2.  Matura?oncellulaire
o  =stadefœtal!(hépatocytes,sang,etc.)
3.  Voied’injec?onpourrégénérerun?ssusolide
4.  Ethique:manipula?ond’embryon
5.  Allogénicité(HLAincompa?ble)
o  Immunosuppression
o  Banquedelignéescompa?bles
o  Sourcedecellulespluripotentes:iPS
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