Stage - DLST
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Université Joseph Fourier Département de Licence Science et Technologie Rapport de Stage « Evaluation de l’influence de l’hydrodynamique à l’échelle locale sur la croissance et la structure des biofilms à travers le traitement des images et de la reconstitution 3D. » Marielle EL KAZZY Laboratoire d’accueil : laboratoire des écoulements géophysiques et industriels (LEGI) Directeur du laboratoire : M. Achim WIRTH Responsable du stage : Mme. Zhujun HUANG Licence mécanique-1ère année- Parcours science pour l’ingénieur Année universitaire : 2014-2015 Remerciements Je tiens tout d’abord à remercier l’université joseph Fourier et particulièrement Mme. Patricia Cajot de m’avoir donnée cette magnifique opportunité pour découvrir le monde de la recherche dès ma première année de licence. Je voudrai remercier également le directeur du laboratoire Mr. Achim Wirth de m’avoir accueilli au sein du L.E.G.I qui est l’un des meilleurs laboratoires de Grenoble. Je tiens à remercier infiniment ma responsable de stage Mme. Zhujun Huang pour sa disponibilité son aide et pour tous ses conseils enrichissants. Et pour finir je remercie chaleureusement Ana Meideros doctorante au L.E.G.I de m’avoir accompagné et guidé tout au long du stage, de m’avoir beaucoup aidé dans la rédaction de ce rapport et pour la confiance qu’elle m’a accordée malgré mon manque d’expérience. MERCI… Sommaire I- Introduction.....……………………………………………………………………………....2 II- A propos du LEGI………………………………………………………………………….3 III- La partie expérimentale a) la Bactérie Pseudomonas Putida 6521………………………………………………..5 b) Système gravitaire et chambre d’écoulement ………………………………………..6 c) prise d’images au microscope confocal……………………………………………...10 IV- Le traitement des images (Matlab et image j)……………………………………………11 V- mesure des paramètres structuraux a) Fraction volumique et graphe 2D……………………………………………………12 b) Réalisation de graphe 3D……………………………………………………………13 VI- Conclusion …………………………………………………………………………….…14 ANNEXE 1 : images originales et images traitées ANNEXE 2 : le biofilm en 3D 1 I- Introduction : La biofiltration est un procédé d’épuration qui consiste à traiter l’eau par des microorganismes (bactéries, champignons…) attachés à un lit de matériaux (comme du sable, du gravier, des billes de verre etc…) et qui forme ce qu’on appelle un biofilm. Ce procédé de dépollution biologique simple à mettre en œuvre possède de nombreux avantages : peu de sous-produit, faible production de boues, adaptation à des polluants émergeants etc... Or l’optimisation de ce procédé nécessite la mise au point de modèles prédictifs pour caractériser ce système (c’est-à-dire qu’on ne connait pas les conditions optimal du développement d’un biofilm et on ne peut pas prédire sa structure ou sa forme.) Cependant, celui-ci est difficile à modéliser car il existe de forts couplages entre les mécanismes physiques, biologiques et chimiques en effet la croissance du biofilm va dépendre de nombreux facteurs tel que le débit de l’eau, la concentration de polluants, le système d’écoulements etc…. L'objectif de cette étude consiste à mettre au point une méthodologie pour étudier l'influence des paramètres hydrodynamiques sur le développement du biofilm mono espèce Pseudomonas Putida à l'échelle local. Pour cela, des biofilms sont développés dans une micro chambre d’écoulement et ensuite observés sous microscope confocal à l’aide de marqueurs fluorescents. Des images 2D sont prises en plusieurs positions puis sont utilisées pour effectuer une reconstruction 3D du biofilm et évaluer des paramètres tels que la fraction volumique, l’aire interfaciale ... Mon travail consistait à traiter les images prises aux microscopes confocal à l’aide d’un logiciel informatique adapté : Matlab, pour ensuite les analyser et en tirer les différentes informations déjà citées. 2 II- A propos du LEGI Le Laboratoire des Ecoulements Géophysiques et Industriels (LEGI) est un laboratoire de recherche publique de l’Université de Grenoble . C’est une Unité Mixte de Recherche (UMR 5519) commune au Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), à l’Université Joseph Fourier (UJF) et à l’Institut National Polytechnique de Grenoble (Grenoble-INP), qui rassemble plus de 180 personnes dont 70 permanents et autant de doctorants et postdoctorants. Le laboratoire se trouve sur le domaine universitaire à saint Martin d’Hères. Les équipes : Le LEGI comporte principalement quatre équipes de chercheurs : L’équipe EDT: écoulements diphasiques et turbulences (dans laquelle j’ai travaillé) L’équipe EDT se concentre principalement sur l’étude de systèmes modèles, comportant un nombre restreint de paramètres de contrôle, avec l’objectif d’identifier et de caractériser des mécanismes fondamentaux comme par exemple le sujet de mon stage où on étudie l’influence de l’hydrodynamique à l’échelle locale sur la croissance des biofilms. L’équipe Energétique : Cette équipe se consacre à l’étude expérimentale et théorique de phénomènes ou procédés thermiques en lien avec l’industrie ou l’habitat. Leurs principaux domaines d’études sont : changement de phase, les machines hydrauliques et le stockage de l’énergie. 3 le L’équipe MEIGE : Modélisation, Expériences et Instrumentation pour la Géophysique et l’Environnement L’équipe MEIGE regroupe l’ensemble des activités de recherche du LEGI liées aux écoulements en milieux naturels : océan, atmosphère, littoral. Les recherches menées au sein de l’équipe s’attachent principalement à décrire, comprendre et modéliser la dynamique de ces milieux aux petites échelles. L’équipe MoST : MOdélisation et Simulation de la Turbulence Les travaux de recherche de l’équipe MoST portent principalement sur l’étude numérique de la dynamique de la turbulence et de ses conséquences dans les écoulements d’intérêt industriel et géophysique. 4 III- La partie expérimentale a) la bactérie Pseudomonas Putida : La bactérie Pseudomonas Putida 6521 (cf. figure) est le microorganisme qu’on a choisi pour cette étude. C'est une bactérie en forme de bâtonnet droit (0,5 à 1,0 μm de diamètre et de 1,5 à 4,0 μm de longueur) (cf. figure1). Figure 1 : La bactérie P. Putida Cette bactérie se développe en condition d’aérobie, c'est à dire en présence d'oxygène par duplication cellulaire. Sa croissance est optimale pour des températures avoisinant les 20 à 30°C et un pH proche de 7. Cette bactérie couramment utilisée dans le domaine de la microbiologie possède la capacité de fabriquer aisément un biofilm. Elle a déjà été utilisée dans les travaux de thèse de MBAYE (2011). 5 b) système gravitaire et chambre d’écoulement - Le système d’écoulement que nous avons utilisé est un système gravitaire (c’est-à-dire que l’écoulement se fait par attraction gravitationnelle) avec un débit Q = 1000 µL .min-1 (cf. figure 2). Figure 2 : Le système d'écoulement gravitaire - Pour les observations sous microscope confocal, nous avons utilisé deux modèles de chambres d'écoulement : Chambre d'écoulement en polyméthacrylate de méthyle (PMMA) et chambre d'écoulement en élastomère PDMS. Les chambres d'écoulement comportent un micro canal rectangulaire de dimensions : 28mm de longueur, 17mm de largeur, 250µm de hauteur (pour la chambre en PMMA) et 210µm (pour la chambre PDMS) (cf. figure 3 et 4). Figure 4 : Chambre en PDMS Figure 3 : Chambre en PPMA 6 Pour réaliser le PDMS, on procède de la manière suivante : On mélange 20g d’élastomère avec 2g (10% de la masse d’élastomère) du réticulant. On place le mélange sous une pompe à vide pour enlever les bulles présentes dans la préparation. Une fois toutes les bulles disparues, on verse le contenu dans le moule de la chambre en évitant de faire de nouvelles bulles (La présence de celles-ci, induiraient une mauvaise qualité de la chambre et par suite de mauvais résultats). Ensuite le moule est mis au four à 65°C pendant 4h minimum. Et enfin une lame de verre, qui sert de support solide pour la croissance des bactéries est collée par lampe à arc plasma sur le PDMS afin de délimiter les frontières de l'écoulement (cf. figure5). Figure 5 : Le moule rempli par du PDMS La taille et la forme de la chambre permettent de dégager des hypothèses théoriques concernant les profils de vitesses d'écoulement. La vitesse est réduite à la composante longitudinale, c'est-à-dire suivant la direction x de l'écoulement. ⃗ (𝑢, 𝑣, 𝑤) = 𝑉 ⃗ (𝑢, 0,0) 𝑉 7 Cette vitesse u ne varie que près des parois (x=0 et x=L ; y=0 et y=w). Les mesures de profil de vitesse suivant x et y vérifient cette hypothèse. Par conséquent on peut admettre que : 𝜕𝑢 𝜕𝑢 + =0 𝜕𝑥 𝜕𝑦 L'ordre de grandeur des vitesses locales dans la chambre d'écoulement implique que le nombre de Reynolds est faible par rapport à sa valeur de transition entre le régime laminaire et le régime turbulent. C'est pourquoi, le régime dans la chambre d'écoulement est laminaire. Ceci est également dû aux dimensions internes très faibles (écoulement capillaire). Le nombre de Reynolds dans la chambre d'écoulement est donné par la formule suivante : ℜ= 2𝜌𝑓 𝑄 (𝑤 + ℎ)𝜇 L'expression théorique de la contrainte de cisaillement à la paroi notée Tw, est donnée par la relation suivante : 𝑇𝑤 = 𝜇 × 𝑑𝑢 6𝜇𝑄 = 2 𝑑𝑧 ℎ × 𝑤 8 La vitesse du fluide s’écrit alors : 𝑧 𝑧 2 ℎ ℎ 𝑈�=6𝑈�mean�[( ) − ( ) ] Où U est la vitesse moyenne du fluide qui passe par la section verticale du micro canal. La validation des champs de vitesse dans ces deux chambres d'écoulement (PMMA et PDMS) ont été réalisé en comparant le résultat théorique (équation de la vitesse du fluide) avec les résultats des simulations numériques. Cette comparaison montre que sur la zone d'observation l'écoulement est laminaire de type 2D parabolique (poiseuille) et invariant selon le plan (x, y) (cf. figure 6 et 7). Figure 6 : écoulement de poiseuille (2D parabolique) Figure 7 : simulation de l’écoulement dans la chambre 9 c) Prise d’images au microscope confocal Les images sont prises au microscope confocal à des temps différents, c'est-à-dire à 24 heures, 48 heures et à 72 heures. Pour cela, il faut marquer les cellules à l'aide de fluorochromes. Deux types de fluorochromes sont utilisés, un pour marquer les cellules vivantes et un autre pour les cellules mortes. Le fluorochrome s'appelle le « live dead », leurs noms chimiques respectifs est Syto 9 et l'Iodure de Propidium. La fluorescence est une émission lumineuse provoquée par l'excitation d'une molécule à une longueur d'onde λ, suivit d'une émission spontanée. Ce principe de fluorescence est utilisé dans les microscopes confocaux à balayage laser, les microscopes à fluorescence et les spectrofluoromètres. Ici, les molécules sont excitées grâce au laser d'argon (Ag). Pour la prise des images au microscope confocal, il faut au préalable marquer les cellules avec des fluorochromes afin de pouvoir détecter les cellules convenablement. Il faut être très prudent lors de l'utilisation de ceux-ci car ils sont cancérigènes (travailler sous la haute et porter des gants sont obligatoire). La fluorescence naturelle de la bactérie ne permet pas de traiter correctement les images. Lors de l'injection, on doit protéger la chambre de la lumière car les fluorochromes sont modifiés au contact de celle-ci. De plus, l'injection doit être réalisée avec un débit quasi similaire au débit initialement utilisé, afin de ne pas altérer le milieu. Toutes les images sont prises à des positions en X et Y prédéfinie. Le microscope confocal permet de se placer au centre de la chambre et toutes les autres positions sont imposées par l'expérimentateur. Sachant que la distance entre les séries est de 4 µm et l’intervalle entre les images de chaque série est de 1.14 µm (de hauteur) (cf. figure 8). Figure 8 : Schéma des positions de chaque prise d'image 10 IV- Le traitement des images : Matlab et Image j Afin de traiter les images prises au microscope confocal nous avons choisi d’utiliser le Matlab. Ce logiciel informatique permet la manipulation de matrice, la schématisation de fonctions, l’implémentation d’algorithme etc… et il est utilisé principalement pour effectuer des calculs numériques. Dans notre cas par exemple on l’utilise pour calculer le nombre de bactéries présentes sur l’image, leur taille moyenne la surface qu’elles occupent etc… Pour cela nous avons développé un algorithme spécial qui consiste en plusieurs étapes : 1-l’homogénéisation qui permet d’éliminer les bruits de fond dû à l’éclairage. 2-l’identification du contour des bactéries en effectuant un gradient du niveau de gris. 3- la binarisation : par définition la binarisation est une opération qui produit deux classes de pixels : des pixels noirs et des pixels blancs (suite à cette opération on obtient des images en noir et blanc dans lesquelles le contour des bactéries est bien visible.) Après ces trois étapes principales le Matlab peut comptabiliser le nombre de bactéries présentes sur l’image ainsi que la surface qu’elles recouvrent et les différentes informations nécessaires. Certaines images prises sous microscope confocal ont une qualité insuffisante pour procéder à l'analyse. C'est pourquoi, après un premier traitement automatique, on procède systématiquement à un contrôle visuel, en comparant les images traitées aux images originales. Si l'opérateur juge que les images ne sont pas traitées correctement par l'algorithme, celles-ci doivent être alors traitées à nouveau de façon ``manuelle'', en ajustant le seuil jusqu'à ce que l'on juge le traitement correct (voir annexe 1). Une fois le traitement des images effectué, la visualisation du biofilm en 3D est réalisée sur le logiciel Image j (voir annexe 2). 11 V- Mesure des paramètres structuraux a) Fraction volumique et graphe 2D : Après avoir traité les images sur Matlab et tirer toutes les informations nécessaires telle que la taille moyenne des bactéries la surface qu’elles occupent etc… nous avons classé ces informations dans des tableaux Excel. Ensuite, à l’aide des résultats trouvé, nous allons calculer la fraction volumique ФV et puis tracer ФV=f(z) avec z la hauteur de l’image qui varie entre 0 et 250 µm (hauteur de la chambre d’écoulement). 12 Cette fraction volumique nous permet d’avoir un profil de la répartition des bactéries dans la hauteur de la chambre pour toutes les positions étudiées (cf. figure 9). 0,12 Evolution des bactéries pour une position donnée (P9) 0,1 ΦV 0,08 0,06 0,04 0,02 0 0 5 10 15 20 z( µm) 25 30 35 40 45 Figure 9 : graphe montrant la variation de la fraction volumique ФV en fonction de la hauteur z. D’après le graphe obtenu on peut remarquer que les bactéries sont très développées au contact de la paroi et que leur volume diminue au fur et à mesure qu’on s’éloigne de celle-ci. b) Réalisation de graphe 3D Afin d'avoir une vision beaucoup plus globale de la répartition des bactéries, des graphes en trois dimensions sont réalisés avec Matlab (cf. figure 10). On trace ϕV=f(x, z) pour un y donné. Ces graphes nous permettent de déterminer si les bactéries sont réparties de la même manière sur l'ensemble de la chambre d’écoulement. Figure 10 : graphe représentant la variation de ϕV en fonction de x et z pour un y=34.82µm 13 VI- Conclusion Faire ce stage était une expérience très enrichissante et très importante pour moi. En effet j’ai pu découvrir le monde de la recherche : ce monde où les sciences n’ont pas de limites. Pendant ce stage j’ai pu approfondir mes connaissances dans différents domaines scientifique notamment en hydrodynamique, en biologie en informatique etc… j’ai beaucoup appris sur le traitement des images, j’ai pu découvrir des logiciels informatiques très utilisé dans la recherche comme Matlab et Image j, j’ai pu rencontrer des chercheurs et faire des échanges très enrichissants au niveau culturel et scientifique et en plus tout cela, j’ai eu l’occasion de voir la plateforme tournante Coriolis qui se trouve au LEGI et qui est la plus grande plateforme tournante au monde dédiée à la mécanique des fluides. Comme conclusion j’ai trouvé que la recherche est un travail qui demande beaucoup de patience dans la manipulation des expériences une grande capacité d’initiative et un esprit critique afin de trouver les bons résultats. 14 ANNEXE 1 : images originales et images traitées A gauche image original à droite image binarisée et bien traitée. A gauche images original, au milieu image maltraitée, à droite image traitée après l'imposition du niveau de gris. ANNEXE 2 : le biofilm en 3D visualisation en 3D du biofilm à l'aide du logiciel Image j
