UE2 - Biopathologie
Date : 18/10/2016 Plage horaire : 16h-18h
Promo : 2016/2017 Enseignant : MERLIO
Ronéistes : AIZEL Lyes
LAURET Axel
Méthodes d’analyses globales et ciblées en génétique et biologie
moléculaire des tumeurs
I. Altérations génétiques
1.Gènes dont les altérations confèrent une propriété aux cellules tumorales
2.Altérations qualitatives/quantitatives de gènes
II. Principales anomalies cytogénétiques des cancers
III. Les méthodes globales
1.La cytogénétique conventionnelle et moléculaire : Historique
2.Principe d’établissement du caryotype m-FISH ou SKY
3.Principe de réalisation de la CGH sur métaphase.
4.Principe de réalisation de la CGH sur microarrays
5.Exemples d’applications
IV. Méthodes ciblées
1.FISH : généralités
2.FISH : profils typiques
3.FISH : profils plus complexes ; applications
a) Recherche de translocations par dissociation de signaux fluorescents.
b) Recherche de changement de nombre de copies.
V. Technique de biologie moléculaire
1.La PCR : généralités
2.Le séquençage de produits de PCR, méthode Sanger
3.PCR quantitative
4.PCR + analyse au séquenceur
5.Détection du changement de statut de méthylation de l’ADN
VI. Conclusion
Ce cours aborde les techniques d’analyse qui permettent de rechercher des altérations moléculaires
présentant un intérêt diagnostique ou thérapeutique dans les cancers. Ces méthodes d'étude permettent
d'analyser, soit globalement le génome tumoral, soit spécifiquement en ciblant certaines régions d'intérêt.
Ce cours va parler surtout de génétique acquise ou somatique présente dans les tumeurs et non de la
génétique constitutionnelle (qui correspond au caractère héréditaire présent au niveau de l’individu). Donc
retenir génétique acquise, altérations spécifiques de la tumeur.
I. Altérations génétiques
Les tumeurs en particuliers les cancers (tumeurs malignes) sont des proliférations anormales qui résultent de
défaut de régulation des voies de contrôle dans la cellule :
la division cellulaire
la survie cellulaire
la différenciation
Les tumeurs résultent également de l'acquisition de capacités :
- Pro-angiogéniques c’est-à-dire qu’elles vont entraîner la formation de vaisseaux (cas des tumeurs
solides),
- Invasives (à progression locale) et métastatiques (progression à distance), capacités que l’on
retrouve donc dans la progression des tumeurs malignes, qui vont finir par tuer l’individu s’il n’y a
pas de traitement.
Les capacités migratoires ne sont pas propres aux cellules cancéreuses : les cellules embryonnaires sont
capables de migrer dans l'organisme.
En principe les normales (à part les cellules sanguines) ne migrent plus sauf dans des conditions
particulières (par exemple les kératinocytes au niveau de la peau vont migrer quand il ya une blessure pour
assurer une réparation).
Les cellules cancéreuses vont réacquérir ces propriétés migratoires mais de manière pathologique.
Dans tous les cas ces dérégulations de voies de contrôles de la cellule implique des altérations au niveau
génique (directe : modifiant la séquence du gène, épigénétique : modifiant l’expression du gène :
surexpression extinction, ou post traductionnelle : pouvant provoquer une inactivation d’un produit d’un
gène).
Ce cours ciblera les méthodes d’études permettant de regarder ces altérations génétiques.
1. Gènes dont les altérations confèrent propriétés aux cellules tumorales
Les cancers peuvent avoir une origine exogène ou endogène.
Remarque : les exemples à apprendre seront revus en ED, ce n’est donc pas la peine d’apprendre les gènes
par cœur, ce qu’il faut retenir de ce cours, ce sont les principes d’explorations :
- Exploration globale : on recherche à avoir le maximum d’informations pour définir des profils de la
tumeur (« carte d’identité de la tumeur »).
- Exploration ciblée : on sait ce que l’on cherche et on va le chercher dedans ou non.
- Exogènes : les gènes viraux :
Il existe des gènes dont les altérations confèrent une propriété aux cellules tumorales. Parfois des gènes
étrangers, par exemple des gènes venant de virus. Gènes viraux. Virus qui infecte les cellules et qui peuvent
être à l’origine d’environ 15% des cancers chez l’homme.
NB : cela dépend largement de l’origine ethnique, géographique des personnes. Il y a des virus endémiques
dans certaines zones du globe et qui ne vont pas entrainer les mêmes mécanismes de tumorigénèse selon que
la personne sera caucasienne, asiatique, africaine etc.
Il y a aussi une interrelation entre le virus, voire les bactéries et l’hôte.
On estime donc 15% des cancers d’origine infectieuse. Pour retenir une origine infectieuse d’un cancer, il
faut qu’il y ait un lien d’association, la présence du virus observé par les cancers. Ceux qui ont le cancer ont
le virus ; ceux qui n’ont pas le virus ne font pas le cancer. Le virus donne plus de cancer dans la cohorte de
patients infectés, il s’agit d’un lien statistique d’association. Mais il faut aussi un lien de causalité, on doit
comprendre les mécanismes biologiques qui permettent au virus de transformer les cellules c’est-à-dire de
les rendre tumorales. Ce lien de causalité est à la fois démontré et peut être reproduit.
1- Observer l’association infection-cancer,
2- Démontrer les mécanismes biologiques de causalité,
3- Possibilité de reproduction de la pathogénicité/ tumorogénicité de l’agent infectieux.
Les papillomavirus ou HPV oncogénique sont des virus qui entraînent des cancers du col de l’utérus chez la
femme, et voir des cancers ORL. Les cancers cervicaux vaginaux sont tous liés à la présence d’une infection
par papillomavirus oncogène.
Ce sont des protéines codées par le génome viral E6 et E7 qui ont des actions sur certains gènes cellulaires
importants, comme l’inactivation de TP53 et Rétinoblastome (Rb), entrainant une division cellulaire
incontrôlée.
Le virus d’Epstein-Barr (EBV) entraîne la transfection d’ARN non codants qui joue un rôle dans la
régulation du cycle cellulaire (immortalisation et transformation des cellules). (EBERs, Epstein-Barr
Encoded RNAs et miRNA). Ce virus est à l’origine des cancers du tissu lymphoïde (lymphome B), mais
aussi des cibles non lymphoïde par exemple des carcinomes de l’estomac liés à l’infection.
- Endogènes : les gènes cellulaires :
- Proto-oncogènes, suppresseurs de tumeurs, angiogenèse, protéases, adhésion…
-Ces gènes peuvent avoir des altérations structurales (amplification, translocation) ou
fonctionnelles (c’est à dire une augmentation de la transcription)
Par exemple ils peuvent être impliqués dans :
-des translocations chromosomiques avec/sans fusion génique (pour les proto-oncogène mais
également les gènes suppresseurs de tumeurs),
- des amplifications géniques (pour les proto-oncogènes)
- des mutations génétiques ponctuelles activatrices pour les proto-oncogènes, ou in- activatrices pour
les gènes suppresseurs de tumeurs,
-des délétions pour les gènes suppresseurs de tumeurs
-des modifications épigénétiques (« ce qui est autour du génome » qui permet l’empaquetage et la
régulation du génome ; ADN, histones : méthylation/acétylation)
Ces altérations sont dans la grande majorité des cas somatiques, c’est-à-dire des altérations acquises au
niveau de l’ADN tumoral, mais absentes des autres cellules de l’organisme (notamment des lignées
germinales): ce qui se voit dans les cancers sporadiques.
Il n’y a que dans les cancers héréditaires (5-10%) qu’il y a une altération génétiques de l’ensemble des
cellules de l’individu y compris la lignée germinale. Cependant un cancer héréditaire peut aussi se
développer à partir une altération somatique (par transmission d’au moins un des deux parents puis d’une
anomalie secondaire au niveau du site d’apparition de la tumeur).
Dans le cas de cancers héréditaires, une mutation prédispose mais ne suffit pas à aboutir à un cancer. Dans
les cellules, il va forcément y avoir des mutations supplémentaires qui vont apparaître pour créer le cancer.
Par exemple, quand une mutation héréditaire touche un gène suppresseur de tumeurs, il faut un événement
somatique sur le deuxième allèle pour l'inactiver. Puis, il y aura ensuite forcément une séquence d'autres
mutations qui vont s'accumuler dans les cellules.
Les mutations germinales concernent les cas de cancers héréditaires. Donc, on a une mutation qui
prédispose, le plus souvent un gène suppresseur de tumeur à l'état hétérozygote. Du coup, il faut un
deuxième événement somatique dans quelques clones cellulaires pour aboutir à une perte de fonction. Et
d'autres mutations vont s'accumuler jusqu'à aboutir à un phénotype vraiment cancéreux. Dans le cas de
cancers héréditaires, il faut forcément des mutations supplémentaires.
(Cela touche également des proto-oncogènes mais c'est plus rare.)
L'autre exemple d'altération germinale est l'empreinte génomique parentale qui est présente chez tous les
individus. Pour certains gènes, les deux allèles ne sont pas équivalents sur le plan fonctionnel (un allèle qui
s'exprime et l'autre qui ne s'exprime pas).
Cela concerne toujours les mêmes gènes :
- soit le gène paternel s'exprime et pas le génome maternel (qui est dans ce cas-là méthylée)
- soit le gène maternel s'exprime et pas le gène paternel (qui est dans ce cas-là méthylée).
Pour un gène donné, chez toute l'humanité, ce sera toujours soit l'allèle paternel qui s'exprime ou soit l'allèle
maternel.
Quand il y a des altérations de ce phénomène, il y a donc des pathologies. Cela concerne certains gènes
suppresseurs de tumeurs haplo-insuffisants : un allèle est déjà inactivé par ce phénomène d'empreinte
génomique et il suffit dans ce cas-là, d'un seul événement pour aboutir à une perte de fonction.
Donc il y a bien dans les cancers somatiques ou héréditaires, des altérations somatiques ajoutées dans la
tumeur.
Si on effectue une analyse au niveau de la tumeur on recherchera des mutations somatiques tandis que si
l’analyse s’effectue sur une prise de sang ou d’ADN buccal, on recherche une anomalie germinale puisque
toutes les cellules de l’organisme contiennent cette anomalie.
2. Altérations qualitatives/quantitatives de gènes
Ces altérations de gènes peuvent être : qualitatives ou quantitatives
Exemples d’altérations qualitatives :
- Translocations avec fusion génique qui crée un nouveau gène anormal (car s'il sagit d'une fusion de deux
séquence nucléotidiques normalement indissociées) et donc une protéine de fusion anormale spécifique de la
tumeur qui, qualitativement, n'existe pas dans les cellules normales.
- Mutations (changement d’un nucléotide, micro insertions, micro délétions) qui aboutissent à un
changement de la séquence protéique, soit par exemple un codon stop prématuré, soit au contraire un
changement d'amino-acide ou une duplication de certains amino-acides. On a un changement qualitatif sur la
protéine.
Exemple d’altérations quantitatives :
- Amplifications : augmentation du nombre de copies du gène (et de l'expression du gène)
- Délétions : diminution du nombre de copies du gène (et de l'expression du gène)
Une seule altération pourra modifier les profils d’expression de nombreux gènes donc avoir des
conséquences sur une voie de signalisation par exemple.
L’intérêt de détecter ces altérations :
- But cognitif : compréhension des mécanismes pathogénique.
- Diagnostic : anomalies pathognomiques (spécifique) de certaines tumeurs. Certaines anomalies seraient
caractéristiques/ spécifiques de certaines tumeurs, il est donc nécessaire de démontrer la présence de
l’anomalie génétique pour faire le diagnostic de la tumeur.
- Pronostiques : anomalies associées à l’agressivité tumorale. C’est à dire qu’elles ont un rôle dans un sous-
groupe de patient qui présente l’anomalie et donc possèdent une espérance de vie différente.
- Prédictif ou Théranostic pour thérapie ciblée : certaines mutations vont constituer des critères
d’inclusion ou d’exclusion pour une thérapie particulière.
Des mutations de la cible si elles sont activatrices permettent l’inclusion dans la thérapie. Ex : mutation
EGFR et sensibilité aux ITK (inhibiteurs de la tyrosine kinase) dans le K poumon.
Les patients qui ont cette mutation activatrice vont répondre au traitement car la cellule tumorale dépend de
cette voie métabolique pour sa croissance. Du coup si on lui donne un inhibiteur de cette molécule, la cellule
va y être sensible. Au contraire, certaines mutations pour des raisons conformationnelles (la molécule
thérapeutique ne pourra pas se fixer sur la protéine mutée), peuvent conférer une résistance. Dans ce cas, le
patient ne pourra pas être traité, ce sera un critère d'exclusion (refus d'un protocole thérapeutique). Il sera
orienté vers un autre traitement.
Des mutations d’effecteurs en aval (exclusion, exemple : Ras/ciblage EGFR ; exemple : Ras muté =
insensibilité aux anticorps anti-EGFR (cancer du côlon)). Dans le cas de cancers colorectaux, on peut cibler
avec des anticorps bloquant le récepteur de l'EGF de la voie de signalisation de Ras/MAP kinase. Et si on a
une mutation en aval du gène Ras ou B-Ras (des effecteurs qui sont en aval de la voie), ça ne sert à rien de
bloquer des récepteurs de l'EGF parce que la voie est actif en aval. Par analogie, au relai 4x100m, si le
deuxième coureur n'attend pas que le premier coureur lui passe le témoin pour commencer à courir, on aura
beau arrêter le premier coureur, le deuxième court quand même. Là si on bloque le premier coureur avec un
anticorps bloquant et que le deuxième coureur «Ras» est fou à cause d'une mutation et court sans attendre le
témoin de son équipier, on aura beau essayer de bloquer l'EGFR, la course continue quand même. Dans ce
cas-là, c'est un critère d'exclusion thérapeutique.
Il existe des mutations pouvant expliquer une résistance aux thérapies générales (comme la chimiothérapie):
altérations conduisant à une chimiorésistance (MDR etc.) Par exemple, la protéine appelée MDR (Multi
Drug Resistance), de la même famille que la protéine CFTR (impliqué dans la mucoviscidose) est une
pompe qui sert à faire affluer des constituants de l'intérieur vers l'extérieure de la cellule. Elle a donc un rôle
physiologique dans les transports ioniques. Elle prend également en charge certaines molécules de
chimiothérapie : de ce fait, la molécule de chimiothérapie entre dans la cellule par diffusion mais elle est
rejetée par cette pompe vers l'extérieure et de ce fait, elle n'a pas son effet thérapeutique. Les altérations de
ce type modulent l'efficacité thérapeutique. D'où l'intérêt de détecter toutes ces anomalies pour la prise en
charge du patient.
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