Génie génétique 2

GENIE GENETIQUE 2.
P LAN .
Introduction : définition et historique.
Les microorganismes d’intérêt industriel-Rôle des champignons dans les
biotechnologies.
Les productions « naturelles » :
- Méthodes de production en microbiologie industrielle.
- Méthodes pour l’amélioration de la production.
- Production d’antibiotique.
- Production d’acides organiques, de polymères.
- Bioconversion (ex : synthèse de stéroïdes).
Production de protéines recombinantes par génie génétique.
- Transcription et sécrétion des protéines chez les procaryotes (aspects
fondamentaux). Notion de régulation de l’expression des gènes bactériens
- Propriétés de vecteurs d’expression bactérien et levure.
-Avantages et inconvénients des systèmes d’expression hétérologue.
- Ex de synthèse de protéines d’intérêt : hormone de croissance (E. coli et
insuline…)
C HAPITRE 1 : B IOTECHNOLOGIE MICROBIENNE :
HISTORIQUE ET GENERALITES .
B IOTECHNOLOGIE .
DEFINITION
Technique, méthode, ou procédé faisant appel au vivant pour :
- rendre possible
- accélérer
- faciliter
la synthèse ou la transformation d’un produit donné. C’est une science avec
l’exploitation économique comme quasi finalité.
1
PETIT HISTORIQUE.
Préhistoire : lié aux modes de conservation des aliments (séchage, salaison,
sucre,…).
Antiquité : fermentation des aliments (pain, fromage, bière, vin) et tannage des
cuirs (excréments animaux).
VI° siècle : en Occident, progrès des arts de la vinification.
1867 : Pasteur, père de la microbiologie appliquée.
1900 : traitements des eaux usées.
1908 : O. Röhm, utilisation des protéases animales pour poudre à laver et
tannerie (selles canines).
1914-1918 : le nerf de la guerre : en Allemagne, on a besoin de glycérine pour
faire de la glycérine et puis de la nitroglycérine ; Carl Neuberg a travaillé sur
Saccharomyces cerevisae a réussi à inhibé la voie de l’alcool déshydrogénase. On
utilisait comme substrat de la mélasse (déchets de formation du sucre à partir de la
canne à sucre). En Angleterre et au Canada besoin d’acétone (solvant de la nitrocellulose
pour fabrication de poudre explosive) et de butanol (production de caoutchouc
synthétique) et Chaim Weizmann a utilisé Clostridium acétobutylicum et fermentation
de la mélasse pour produire acétone et butanol.
1922 : A. Flemming et la découverte d’antibiotique.
1950 : boum des antibiotiques.
1965 Ajout de la présure dans la fabrication du fromage
1985 : PCR
1995 : tomate transgénique en vente.
1996 : premier génome séquencé
1999 : valeur marchande des protéines recombinante utilisées en pharmacie > 10
milliards de $.
GRANDS SECTEURS.
Boisson et aliments fermentés
Additifs alimentaire
Agriculture
Pharmaceutique
Environnement
Industrie : pâte à papier…
ASPECTS SOCIOLOGIQUES ET ETHIQUES
Production animale et végétale controversée (aliments transgéniques…)
Application médicale mieux bien acceptée.
Application militaire de la biotechnologie interdite au niveau mondiale (anthrax…).
2
PERFORMANCES AU NIVEAU MONDIAL :
En tête des utilisations des biotechnologies, on a la bière puis l’éthanol, puis
l’acide glutamique (exhausteur de goût), puis l’acide citrique, puis les protéases
(lessives). Et seulement après viennent les protéines médicales (céphalosporines,
aspartame, antibiotique, insuline, érythropoïétine).
C HAPITRE II : L ES MICROORGANISMES D ’ INTERET
INDUSTRIEL .
I.
M ICROORGANISME D ’ INTERET INDUSTRIEL .
E. coli : gram- capable de produire
des molécules d’intérêts. Organisme de
choix, parce que bien connu.
Pseudomonas putida : bacille avec
flagelle à une extrémité, capable d’utiliser
des hydrocarbures, et des déchets.
Bacillus subtilis : gram+ plus
pratique pour exporter des molécules
puisque les gram+ n’ont qu’une seul
membrane.
Corynebactérium glutamicum :
capable de produire des acides aminés.
3
Streptomyces coelicolor : pour la
production d’antibiotique.
Les bactéries lactiques : transformation de lactose en acide lactique. Nécessaire
pour l’ensilage (processus rendant le foin digestible pour les animaux)…
Les levures : comportement à mi-chemin entre procaryote et eucaryote. Avec
Penicillium pour l’alimentaire et le médical.
II.
S TRUCTURES .
On rappelle que chez les gram+ on a une membrane plasmique et une paroi qui ne
retient pas les molécules sécrétées.
Chez les gram- on a deux membranes lipidiques de part et d’autre d’un feuillet de
peptidoglycanes, qui rend plus difficile les transformations et les sécrétions.
Les champignons utilisés sont dans le groupe des ascomycètes. Les levures
peuvent prendre différentes formes : Saccharomyces (à peu près rond et
bourgeonnant), Torulopsis (qui ressemble à Saccharomyces), d’autres encore on un
aspect de mycélium). On en utilise surtout 4 : S. cerevisae (16K), Candida utilis (8K).
Pichia pastoris (6 à 8 K) et Hansenula polymorpha (4-6 K). Plusieurs milliers de tonnes
sont produites chaque année, surtout pour l’alimentation animale (source de nutriments).
4
SACCHAROMYCES CEREVISAE.
Présence d’un noyau. Présence d’un plasmide : le Plasmide-2-microns (ou plasmide
2µ). Ce plasmide est beaucoup utilisé. Génome : 15 Mb. 50 à 100 copies du plasmide.
Temps de génération g= 1,5h
Manipulation aisé (comme chez les bactéries). Reproduction asexuée possible
(reproduction clonale).
Modifications post-traductionnelles (glysosylation, phosphorylation…) possibles
des protéines.
Nombreux mutants disponible.
CHAMPIGNONS ASCOMYCETES PLURICELLULAIRES, ASPERGILLUS ,
PENICILLIUM…
Plusieurs noyaux dans la même cellule. On a une paroi primaire contenant de la
chitine, en contact avec la membrane plasmique, surmontée d’une paroi secondaire
contenant du glucane.
Aspergillus niger producteur de l’acide citrique.
III.
M ODES DE REPRODUCTION .
Les bactéries se reproduisent par scissiparité (division binaire).
Les levures présentent un cycle haplo-diploïde. On connait les déclencheurs de
cycles, donc on peut imposer le passage de la phase diploïde à la phase haploïde et viceversa.
On peut provoquer la reproduction sexuée en mettant en contact deux cellules
haploïdes ou en mettant une cellule diploïde en carence sévère, ça provoque une méiose
et puis une sporulation de cellules haploïdes qui pourront faire la reproduction sexuée ;
ou favoriser le bourgeonnement en donnant un milieu largement suffisant à une cellule
diploïde.
5
Chez un champignon
multicellulaire, on peut
avoir une reproduction
sexuée ou asexuée. Dans
un mycélium, on peut avoir
production de cellule par
mitose. Cette cellule est
capable de germer en
mycélium.
Sinon, on a des
anthéridies femelles et
des ascogones mâles. Un
pont se forme entre les
deux structures, et on a
un mélange des noyaux
(caryogamie).
Formation
d’asques
diploïdes
(tétrade), suivit d’une
méiose
(octade)
et
libération
de
cellules
capable de germer.
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IV.
P RODUIT D ’ INTERET ( SYNTHESE NATURELLE ).
éthanol
Saccharomyces cerevisae
solvant, carburant, précurseur
de synthèse chimique, bière.
Acide glutamique
Corynebacterium glutamicum
exhausteur de goût.
(Méthionine)
Lysine
Thréonine
Synthèse chimique.
3 acides aminés essentiels dans
le fourrage (alimentation
animale).
C. glutamicum
Mutant d’E. coli
Acide citrique
Aspergilllus niger
acidifiant et conservateur dans
l’industrie alimentaire ;
adoucissant dans les lessives
en poudre ; complexant dans
l’industrie métallurgique.
Acide acétique
Acetobacter et Gluconobacter
acidifiant et conservation
Xanthane (polysaccharide)
Xanthomonas campestris
Dextrane (polysaccharide)
Leuconostoc mesentreoides
épaississant (vinaigrette) ;
substitut de plasma ;
alimentation.
protéases, cellulase, lipases
Bacillus
enzyme pour lessive ; pâte à
papier.
V.
G ENETIQUE .
OUTILS GENETIQUES.
Les vecteurs de clonage permettent de faire plein de copies d’un fragment
d’ADN, ils possèdent un grand nombre d’origines de réplication (si le produit n’est pas
toxique pour la cellule, sinon on en prend qui n’ont pas trop trop d’origines de réplication)
avec un MCS, et un marqueur de sélection. L’origine de réplication bactérienne assure la
bonne répartition des plasmides au cours de la division cellulaire (fonction « part. » pour
« partition »)
Il existe différent réplicon (=origine de réplication) pour une espèce donnée.
Notion d’incompatibilité entre eux (un réplicon d’E. coli ne fonctionne pas forcément
chez B. subtilis).
Le vecteur de clonage n’est pas forcément le plus utile dans l’industrie génétique.
7
Les vecteurs d’expression bactériens : ils permettent la production d’une
protéine homologue ou hétérologue. Ils doivent posséder une origine de réplication
bactérienne, un marqueur de sélection adapté, MCS, signaux d’expression adaptés à
l’espèce (transcription/traduction/sécrétion).
Si on veut faire exprimer un gène humain chez E coli, il faudra faire attention à
plusieurs choses : la présence du promoteur, la présence d’un codon d’initiation (qui n’est
pas toujours ATG chez les bactéries), le RBS ou Ribosome Binding Site (qui est
complémentaire et antiparallèle à la sous-unité 16s du ribosome) et un terminateur de
transcription. Il ne faut pas oublier que la transcription et la traduction sont colinéaire
chez les bactéries (pas très gênant en temps normal) ni que les gènes peuvent être
organisé en opéron (deux gènes dont les protéines agirons ensembles peuvent être corégulés et co-transcrits). Il ne faut pas négliger de virer les introns. Il n’y aura pas de
coiffe en 5’ ni de queue poly-A en 3’ pour un ARNm produit par une bactérie. Enfin, les
bactéries ne savent pas faire des modifications post-traductionnelles de protéines.
Les vecteurs navettes sont des vecteurs adaptés à passer d’une bactérie à un
autre organisme (gram-/gram+ ou bactérie/levure…). On a deux hôtes, le premier est
généralement E. coli, parce que c’est galère de transformer un organisme plus compliqué.
Les vecteurs navettes possèdent des origines de réplications, et des marqueurs de
sélections pour les deux hôtes successifs. (On peut même faire des vecteurs navettes
linéaires surtout utilisés pour le séquençage des génomes, ça donne en fait un minichromosome une fois qu’on lui a ajouté des séquences télomérique et centromérique.)
La fusion transcriptionnelle correspond à l’insertion d’un gène dans un vecteur qui
possède déjà un promoteur, un RBS avant son MCS. L’ARNm sera un hybride. On peut
même accrocher notre gène d’intérêt à une autre protéine synthétisée par l’hôte, soit
pour la protéger de la dégradation soit pour faciliter la purification.
La transformation peut se faire par traitements aux sels, par électroporation ou
la transfection (conjugaison bactérienne ou fusion de protoplastes).
H OTES DE CLONAGE MOLE CULAIRE : AVANTAGES ET
INCONVENIENTS .
ESCHERICHIA COLI.
Génome bien connu, nombreuses souches disponibles, procaryote le plus connu.
Mais il existe des souches particulièrement pathogènes et c’est un organisme gram-.
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BACILLUS SUBTILIS .
Organisme modèle gram+, donc plus facile à transformer et à purifier, capable de
former des endospores ce qui facilite les cultures, et il n’est pas pathogène. Mais il est
génétiquement instable, et il est moins connu qu’E. coli.
SACCHAROMYCES CEREVISAE.
Génome bien connu, non pathogène, assure la maturation d’ARNm et des
protéines, facile à cultiver. Mais les plasmides y sont instables, et pour la plupart des
procaryotes les plasmides ne se répliquent pas.
C HAPITRE III : M ETHODE DE PRODUCTION EN
MICROBIOLOGIE INDUSTRIELLE .
I.
O PTIMISATION DE LA BIOPRODUCTION / BIOCONVERSION .
Maintenant qu’on a réussis à faire produire une protéine d’intérêt, ça sous-entend
qu’on doit tout optimiser, sachant qu’au final on veut que ce soit adapté à la
consommation par l’homme pour le moindre coût.
Il faut un milieu de culture adapté, des conditions adaptées (discontinue,
continue, sur gel, en milieu liquide…). Le choix de la souche est primordial : on fait un
crible (parmi les 500 souches qu’on a, on prend celle qui produit le plus et/ou le mieux),
ou bien on fait muter une souche pour la déréguler pour qu’elle produise en masse la
protéine. Enfin, il va falloir purifier au mieux notre molécule d’intérêt.
II.
S ELECTION , AMELIORATION DES SOUCHES .
1- SOURCES NATURELLES.
Sol, eau, pain, fruits avariés, milieux extrêmes…
9
2- AMELIORATION DE LA SOUCHE PAR MUTAGENESE .
Chimique, UV, manipulation génétique (dérégulation).
3- CONSTRUCTION D ’UNE SOUCHE PRODUCTRICE PAR GENIE
GENETIQUE .
On peut aussi simplement construire une souche productrice par génie génétique.
4- POURQUOI AMELIORER LES SOUCHES ?
Augmenter le rendement de production. Eliminer des produits secondaires
indésirables (synthèse de pigments…). Améliorer le procédé de production (diminution
du temps donc du coût de fermentation, …).
En ce qui concerne la mutagénèse, il faut surveiller que les mutations ne soient
pas létales.
5- SELECTION DES MUTANTS EN CULTURE DE SURFACE.
On peut faire un isolement sélectif de mutants à haute performance (si on
cherche ceux qui sont résistants à un antibiotique, on met l’antibiotique et ceux qui
survivent sont les bons : sélection positive).
LA METHODE PENICILLINE POUR L’ISOLEMENT DE MUTANTS AUXOTROPHES.
Pourquoi chercher des mutants auxotrophes ? Pour empêcher la rétro-inhibition
par un produit sur la voie de synthèse du produit d’intérêt (On a la voie suivante :
ABCDEF. Une voie de synthèse partante de D provoque une rétro-inhibition
de cette voie-là, donc si notre bactérie ne sait pas utiliser D, on n’aura aucune
inhibition).
Il faut savoir que la pénicilline agit sur les bactéries en croissance, pas sur les
bactéries en dormance ou en phase stationnaire. On prend des bactéries sensible à la
pénicilline (ou à l’ampicilline, c’est le même principe), et on les met en présence de milieu
riche et de mutagène. Les souches sauvages vont muter avec le mutagène et certaines
vont devenir auxotrophes. Ensuite, on prend des colonies et on les met sur milieu
minimum en présence d’antibiotique. L’ampicilline détruit tous les sauvages qui essaye de
se diviser et laisse les auxotrophes qui ne peuvent pas se diviser sur milieu minimum. On
vire l’ampicilline et on fait pousser. On a généré des auxotrophes (même s’il nous restera
quelques sauvages).
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PROGRAMMATION MUTATIONNELLE : PRODUCTION DE LA LYSINE.
Dans la voie de synthèse de la lysine on a une rétro-inhibition de l’aspartate
kinase par la lysine et par la thréonine.
On peut soit avoir un mutant qui n’est pas affecté par la thréonine. Le mieux ce
serait d’en trouver un qui n’est affecté ni par la thréonine, ni par la lysine.
III- C ROISSANCE DES MICROO RGANISMES .
1- DEUX MODELES PRINCIPAUX :
-
Discontinue ou en batch
Continue ou système ouvert.
On ne fait pas toujours de la culture en système ouvert, parce que les bactéries
se reproduisent souvent mieux en système fermé.
2- CHOIX DU MILIEU DE CULTURE.
Ce qui coute le plus cher c’est en fait l’optimisation du milieu. On utilise souvent
des déchets d’autres industrie (agriculture, cannes à sucre, etc.), du tampon (craie) et
des anti-moussant.
Il faut manipuler les facteurs de croissance pour orienter le métabolisme vers la
production de notre produit d’intérêt. Souvent on utilise la technique de fed-batch : on
apporte petit à petit un tout petit peu de carbone pour diriger le métabolisme. Sans
oublier de maintenir température, pH…
Il est à noter que la répression catabolique (rétro-inhibition) agit directement
sur un gène impliqué dans la voie de synthèse.
LES DIFFERENTS TYPES DE FERMENTEURS.
Fermenteur à agitation
pneumatique (« air-lift ») qu’on utilise
pour les levures à mycélium, des pales
risqueraient de briser le mycélium, alors
on envoie des bubulles !
11
Fermenteur à l’état solide : parfois les
microorganismes doivent être
déshydratés et vivre en milieu solide (en
gélose).
Fermenteur à lit fixe : on fixe les
microorganismes sur des petites billes
pour qu’elles puissent avoir un support.
Fermenteur à lit fluidisé : comme
pour le lit fixe on a un support, mais
l’entrée des microorganismes se fait par
la base (le bas) de la cuve.
Unité de culture en dialyse : les déchets
et les substrats migrent vers un autre
compartiment, par osmose.
Unité de culture en continu : c’est
le truc qu’on connait, mélange avec des
pales.
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IV- P RODUCTIVITE P ET PHASE DE PRODUCTI ON .
On définit le facteur p comme le rapport de la concentration en produit d’intérêt
sur le volume du fermenteur fois le temps de fermentation (𝑝 =
𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑑𝑢 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑖𝑡
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 ×𝑇𝑒𝑚𝑝𝑠
).
Si dès le début de la fermentation, le
produit d’intérêt est produit, en même
temps que la formation de biomasse, on
parle de croissance en tropophase.
Si on voit un décalage entre la production
de produit d’intérêt et la phase de
croissance, on a une croissance en
idiophase.
On distingue trois types de fermentation. Les types I et II correspondent à
une croissance en tropohase. Soit le produit est un produit direct du MB (métabolisme
de base) primaire, soit le produit est un produit issu des voies secondaires de MB
primaire (comme les produits du cycle de Krebs). Dans les deux cas on est bien
directement lié au MB primaire.
Dans le cas de fermentation de type III, correspondant à une croissance en
idiophase, le produit d’intérêt est produit qui provient exclusivement du MB secondaire.
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V- M ETHODE DE BIOCONVERS ION ( OU BIOCATALYSE OU
BIOTRANSFORMATION ).
Définition : transformation spécifique et mineure de composés inutilisés dans la
croissance (composé naturel ou étranger au métabolisme de microorganisme).
En gros, dans un monde idéal (où vivent en paix des bisounours, sans guerre, sans
violence, sans maladie, où tout le monde vie en harmonie), on met un précurseur chimique
dans un fermenteur avec des bactéries et on obtient un produit d’intérêt. Mais c’est
rarement aussi facile que ça. On aura en général, des intermédiaires, qu’on devra traiter
par synthèse chimique pour obtenir notre produit d’intérêt.
La transformation d’un composé par des microorganismes est différente des
méthodes chimiques :
- les conditions sont douces
- les réactions sont très spécifiques, énantiospécifique (on ne produit d’une
protéine de série L par exemple), chémospécifique, ou régiosépcifique.
- on peut transformer des molécules insolubles (le précurseur hydrophobe n’a pas
besoin de pénétrer dans la cellule, il peut être transformé par les sécrétions des
bactéries), ou des molécules de grandes tailles.
Lorsqu’on utilise un microorganisme entier, on parle de biocatalyseur.
Lorsqu’on a des cellules en suspension elles ne sont utilisables qu’une fois.
Dans le cas de cellules immobilisées, dans réacteur à lit fixe, plusieurs
utilisations successives sont possibles.
LES CATALYSEURS ENZYMATIQUES.
On a une ou plusieurs enzymes isolées au préalable.
Les avantages de bosser avec une enzyme isolée sont les suivants :
-pas d’utilisation de milieu stérile.
-optimisation de la production plus aisée (pH, température… plus faciles à
contrôler).
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-diffusion de substrats et des produits plus rapides (le substrat n’a pas besoin de
rentrée dans la cellule).
-monoétape.
Quand on travaille avec une cellule entière on a les caractéristiques suivantes :
-enchaînement de plusieurs étapes de synthèse possible (voie entière de
synthèse).
-inutile d’isoler l’enzyme quand elle est instable ou difficile à isoler.
-MB actif (pouvoir réducteur de l’ATP)  réaction endergonique possible.
ANALYSE/PURIFICATION A DIFFERENTES ETAPES DU « SCALE-UP ».
Le scal-up permet l’extrapolation de l’erlenmeyer (250 mL) au fermenteur (3000
L). On sort notre souche du frigo. On fait une première culture en gélose, puis une
culture dans une fiole inoculum, puis dans un petit fermenteur de 30 L puis on fait une
culture dans un fermenteur de 3000 L. Lors de toutes ces étapes, on surveille
l’apparition de mutations défavorables, les risques de contamination ; et on effectue un
suivi qualité/production à chaque étape.
IV- E XPRESSION DES GENES ET DES SECRETION DES
PROTEINES CHEZ LES BACTERIES .
Organisation d’un gène de structure bactérienne :
-facteurs cis : séquence spécifique à 1 position précise sur le génome
-facteurs trans : facteur diffusible (protéine, ARN,…) position partout sur le
génome (gènes).
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Facteurs cis
Facteurs trans
Transcription
promoteur
(indique le
démarage de la
transcription,
positionne
l’ADN
Polymérase).
Terminateur
ARN
polymérase.
Traduction
codon d’initiation (ATG = AUGN-formylméthionine)
codon d’initiation (TAA TGA TAG)
RBS (ou SD) = site de fixation du ribosome.
Ribosome
I-
L A TRANSCRIPTION .
Il n’existe qu’une seule ARN polymérase de structure simple. Composée de 5
sous-unités : αββ’ et α2. Enfin on a le facteur sigma (σ), nécessaire au démarrage de la
transcription (α2ββ’σ = holoenzyme). Il n’intervient que pour disposer l’ARN polymérase
sur les séquences promotrices et joue un rôle dans l’élaboration d’un complexe ouvert
(on écarte les brins d’ADN pour pouvoir transcrire en ARN (élaboration de la bulle de
transcription qui se déplace). Il ne faut pas oublier qu’il y a des centaines d’ARN
Polymérases dans la cellule. Sur un ADN, on a simultanément plusieurs bulle de
transcription).
La grosse différence avec les eucaryotes, c’est qu’on n’a pas de noyau. Ainsi dès
que l’ARN sort du ribosome, il est traduit (même si la transcription n’est pas terminée).
On remarque que certains gènes sont fortement exprimés. Ils ont en fait des
promoteurs forts. Il s’agit de séquences nucléotidiques, en amont des ORF, appelées
séquences consensus ou canonique. On les connait et on peut les ajouter dans des
vecteurs, si on veut que le gène soit beaucoup exprimé. Chez E. coli on a une séquence
TTGACA ,35 nucléotides avant le promoteur ; TATAAT, 10 nucléotides avant. Il faut
que les séquences soient correctes et que l’espacement aussi soit le bon. En fait, ces
séquences facilitent le travail de σ. σ est bien accroché  la transcription commence
vite et bien  le gène est plus transcrit.
En fait il existe différents facteurs σ. Certains sont recrutés lors de stress, ou à
l’état stationnaire, lors d’un choc thermique, en phase exponentielle. Ce facteur permet
la reconnaissance de gènes lors stress. Ainsi, des gènes qui n’étaient pas ou peu exprimé,
sont fortement transcrits dans les conditions qui le nécessitent (plus de nutriments
dans le milieu  stress nutritionnel  activation de σ70  transcription de gènes de
l’état stationnaire).
Aussi la séquence consensus des gènes de phase exponentielle sont différentes
des séquences consensus des gènes de phases stationnaires, vu qu’elles sont reconnus
par des facteurs σ différents.
16
Si une séquence consensus varie d’un ou deux nucléotides, le gène sera un petit
peu moins transcrits.
ARN pol I: gènes ARNr sauf 5S
ARN pol II: genes prts (ARNm)
ARN pol III: genes ARNt, ARNr 5S, sRNA (petits ARN).
Chez les eucaryotes :
-La TATA Box est positionnée en – 30
-Promoteur proximaux et GC-rich box.
-Enhancer à grande distance.
La régulation de l’expression des gènes bactériens au niveau transrationnel sont
fait par des éléments qu’on ajoute :
-les éléments trans : les protéines régulatrices (répresseur ou activateur).
-les éléments cis : les séquences opératrices.
LA REGULATION NEGATIVE.
INDUCTION GENETIQUE :
On, a généralement à faire à un opéron
(pas toujours mais bon…). Entre le
promoteur de l’opéron et de la séquence
opératrice, on une séquence régulatrice.
Cette dernière est fixe. Toujours entre
les deux séquences promotrice et
opératrice. Lorsqu’on a un inducteur (un
facteur environnemental ou cellulaire
qui indique que la cellule devrait ralentir
la transcription) un répresseur se fixe à
la
séquence
régulatrice,
par
encombrement stérique, la transcription
est bloqué, vu qu’on gêne le facteur σ.
Lorsque l’inducteur disparait, il y a une
levée de la répression.
17
REPRESSION GENETIQUE :
Un répresseur est produit mais
sous sa forme inactive. Donc le gène est
transcrit de façon constitutive. En
général, on trouve cela dans les cas
d’opérons de biosynthèse. Par exemple :
s’il y a de l’arginine dans le milieu  pas
besoin d’en synthétiser plus  l’arginine
va se lier au répresseur et l’activer  le
gène est inactivé.
LA REGULATION POSITIVE.
INDUCTION GENETIQUE :
Dans ce cas on a opérateur,
promoteur et ORF. En fait dans
les gènes de ce genre, les
promoteurs sont faible (séquence
-35 mais pas de -10, ou bien un
mauvais espacement entre les
deux séquences). L’initiation de la
transcription se fait moins bien.
Un inducteur va se lier avec
l’opérateur. Des interactions vont
stabiliser et favoriser la liaison
de l’ARN polymérase. L’initiation
de la transcription est optimisée.
18
SANS INDUCTEUR :
Rarement
utilisé
en
génie
génétique.
Parfois
certaines séquences sont très
éloignées (10 problème). Dans
ce cas, lorsqu’une molécule se
fixe
sur
une
séquence
opératrice
éloignée.
L’interaction avec le facteur σ
se fait que si l’ADN se courbe
en épingle à cheveux.
Des protéines histones-like
induisent la courbure de l’ADN.
CONTROLE DE L’EXPRESSION GENETIQUE PAR UN SYSTEME A DEUX COMPOSANTES.
On aune protéine senseur (qui
sent un inducteur provenant de
l’environnement)
qui
est
membranaire. Une autre protéine
joue le rôle de régulateur et se
trouve dans le cytoplasme.
La protéine membranaire est activé
(elle a une fonction réceptrice), et
elle s’auto-phosphoryle (elle a aussi
une activité kinase). Elle va pouvoir
transférer son phosphate à l’autre
protéine régulatrice : qui est soit
activée soit inactivée (ça dépend des
cas et du type de régulation).
19
LE SITE OPERATEUR .
Centaine de paire de base. Il n’y a aucune séquence typique de ce genre de site.
Par contre on a une spécificité entre séquence opératrice et protéine opératrice
(logique^^).
On a souvent des séquences inversées répétée (ça commence par TGTGTG et ça
finit par CACACA, par exemple).
TERMINAISON DE LA TRANSCRIPTION PROCARYOTE.
1- TERMINAISON RHO-INDEPENDANTE.
Au fur et à mesure que l’ADN est
transcrit en ARNm, l’ARN va prendre
une structure appelée « tige-boucle » ou
bien « en épingle à cheveux ». Lorsqu’on
l’ARN Polymérase arrive à une séquence
précise, ça s’arrête
On n’a pas besoin de rajouter un
élément dans le milieu pour arrêter la
transcription. Plus la l’établissement de
la liaison entre le terminateur et la
séquence présente un ΔG° fort, plus la
structure est stable. Pour ce, on doit
avoir un site riche en liaisons GC, un site
long de préférence, et il faut une boucle
de taille correcte (ni trop longue ni trop
courte).
20
2- TERMINAISON RHO-DEPENDANT.
Rho : protéine sous forme d’hexamère,
qui a de l’affinité pour l’ARN et va catalyser la
dissociation des trois acteurs au niveau de la
séquence inversée-répétée. Rho, s’accroche à
l’ARN pendant sa synthèse. Ensuite il glisse,
pour atteindre l’ARN polymérase. Cette
dernière rencontre une petite structure de
l’ARN, L’ARN polymérase s’arrête et rho
rattrape l’ARN polymérase. Activité ATPasique
et
dissociation
du
complexe
ternaire
(ARNm+ARNpol+ADNmatrice).
MATURATION DE L ’ARNR ET ARNT PROCARYOTE.
L’ARN est synthétisé. Il
aura une grande taille. Ensuite,
une maturation aura lieu, pour le
débiter en morceaux, qui seront
traduit séparément.
21
II-
L A TRADUCTION .
Pour la traduction, on a besoin de RBS (appelé aussi SD), correspondant à GGAGG
5 pb avant l’ORF. 64 codons différents. Dans 90% des cas, on a ATG pour le départ avec
la L-formyle-méthionine. Dans certains cas, la protéine commence par une valine (GTG).
Les codons stop sont TGA ; TAG et TAA. Code génétique dégénéré : pour un même acide
aminé, on a plusieurs codons qui correspondent.
L’ARNt est complémentaire, et antiparallèle à l’ARNm.
L’utilisation des codons est variable
d’une espèce à l’autre : pour une espèce
donnée, on a des codons « rares » et
d’autres qui sont préférentiels. Il faudra
faire attention lors de traductions
hétérologues. Les organismes ont très peu
d’ARNt chargés avec l’acide aminé pour les codons rares, ce qui peut poser des
problèmes lors de transcription.
REPLIEMENT ET SECRETION DES PROTEINES BACTERIENNES.
Le polypeptide, une fois synthétisé peut avoir plusieurs destinations :
-cytoplasme
-membrane interne
-membrane externe (Gram-)
-périplasme (Gram-).
-milieu extérieur (sécrétion).
La protéine peut, directement après le relargage par les ribosomes, avoir sa
conformation active et correcte.
Sinon, elle sera prise en charge par les protéines chaperons. Ces protéines
chaperonnes vont aussi intervenir lors de stress pour maintenir l’intégrité des protéines
malgré le stress.
Chez E. coli, on a 5 chaperons :
-Dna K
-Dna J (qui agit de concert avec Dna K)
-GroEL
-GroES (qui agit de concert avec GroEL).
-GrpE (qui agit lors de stress).
Les protéines chaperonnes peuvent agirent soit lorsque le peptide est en cours de
synthèse soit après la synthèse. Elles se fixent au peptide, et sont liées à des l’ATP. Une
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fois liées au peptide, elles expulsent un ADP ce qui augmente l’affinité pour le peptide.
Une fois que tout est en place on a deux possibilités :
-soit les protéines chaperonnes lâchent le peptide en prenant un phosphate à du
GTP
-soit le complexe peptide/protéines chaperonnes dans Gro, qui ressemble à un
tonneau, et seul le peptide en sort.
Pour les peptides à destination externe (milieu extérieur ou périplasme), ils ont
une séquence signale qu’on appelle Peptide Signal. Dans la membrane, on a un système
SRP qui fixe le PS. Ensuite on a translocation et expulsion du peptide. Le PS est clivé au
cours de l’export. L’export utilise toujours de l’énergie (ATP, ou force protomotrice).
Pour les protéines non-repliées sont transloquée par le système Sec. Les protéines
repliées utilisent le système Tat (il existe des mutants Tat- mais pas de Sec-).
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En N-term on trouve le PS. Ce qui est important c’est les domaines : un riche en
N, un domaine riche en acides aminés hydrophobe et une séquence SXS (avec S= acide
aminé neutre et X= n’importe quel acide aminé). On trouve le motif twin-arginine :
RRXFYK pour la reconnaissance par Tat.
LES DIFFERENTES VOIES DE SECRETION.
Pour les Gram- il faut passer deux membranes. Chez les Gram+, il suffit de passer
Sec ou Tat et c’est bon. Mais pour les Gram-, on peut voir des mécanismes en deux
étapes, ou en une étape. La protéine traverse alors soit deux complexe, soit un seul
complexe (surtout pour les bactéries pathogènes.
Merci à Victor pour les diapos.
Méta-Zoheir.
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