Horaire des laboratoires de culture cellulaire

101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies - ESP
Culture cellulaire et virologie
Doc 1. INTRO À LA CULTURE CELLULAIRE
La culture cellulaire fait partie des nouvelles biotechnologies et elle est devenue incontournable dans le
domaine de la recherche et des applications biomédicales, agro-alimentaires et environnementales.
 Elle est un outil de recherche qui permet d’étudier directement le fonctionnement des cellules
(ex : développement des cellules cancéreuses), d’effectuer de nombreux tests (effets des
médicaments, des substances toxiques, des virus).
 Elle constitue une alternative à l’expérimentation animale.
 Elle sert à la fabrication de plusieurs produits (vaccins, hormones, enzymes).
 Elle est au cœur du développement du clonage thérapeutique (greffes de cellules), de la
médecine régénérative (greffe de peau, de vaisseaux sanguins) et de la thérapie génique
(modification et introduction de gènes).
 On cultive les cellules animales in vitro depuis le début du siècle dernier. À l’époque, on ne
gardait que des fragments de tissus (ex : peau) et la multiplication des cellules se faisait en
bordure de ces tissus. Depuis ce temps, les techniques ont été raffinées. La découverte
récente des cellules souches a propulsé encore plus la culture cellulaire à l’avant-scène de
l’actualité scientifique, avec en fond de scène la controverse entourant l’utilisation des
embryons humains.
1. But (et défi) de la culture cellulaire :
Recréer in vitro les conditions essentielles à la survie et à la reproduction de cellules se trouvant
normalement dans un organisme complet et complexe : protection, nourriture, entretien des
conditions physico-chimiques, coordination du développement.
Par exemple, la culture in vitro doit suppléer aux principales fonctions suivantes :






Digestion
 assure la nutrition complète des cellules
Respiration
 assure les échanges gazeux et le maintien des concentrations
Immunité
 assure la protection des cellules vs microbes
Excrétion et régulation du milieu  permet l’élimination des déchets, l’équilibre physico-chimique, la
concentration des composés importants (sucres, minéraux, etc.)
Circulatoire
 assure le transport (nutriments, déchets, hormones, globules blancs, anti-corps, chaleur,
etc.) et un milieu liquide équilibré.
Nerveux et hormonal  contrôle du développement, du métabolisme, de la température, etc.
Pour ce faire, les facteurs que l’on peut contrôler sont:




La composition du milieu de croissance (eau et nutriments tels sucres, acides aminés, vitamines, minéraux,
etc.) et son équilibre physico-chimique (pH, pression osmotique) par un milieu de culture approprié.
La température et la concentration de gaz avec un incubateur à CO2
Le rythme de croissance en déterminant la concentration initiale des cellules et ajoutant des facteurs de
croissance (hormones ou sérum de veau fœtal)
La stérilité du milieu en utilisant des techniques de travail en asepsie et en ajoutant des antibiotiques.
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2. Types cellulaires cultivables in vitro
La très grande majorité des cellules animales ne peuvent pas être cultivées in vitro, tout
simplement parce qu’elles ne peuvent se reproduire. De manière générale, plus une cellule d’un organisme
est différenciée, plus elle perd la capacité de se reproduire. Jusqu’à présent, la culture cellulaire ne
s’effectue efficacement qu’avec des cellules souches peu différenciées ou avec des cellules
différenciées mais transformées génétiquement.
2.1 Cellules souches (Campbell, p.480, 865 et
1059).
o Caractéristiques. Ce sont des cellules :
 Indifférenciées (sans fonction spécifique);
 Capables de se reproduire pour
 Assurer leur auto renouvellement et
 Engendrer des cellules spécialisées par
différenciation cellulaire.
o Types selon l’origine. (Campbell, fig. 20.21):
 cellules souches embryonnaires : elles sont
relativement
nombreuses,
très
peu
différenciées, capables de se reproduire
quasi-indéfiniment
(elles
sont
dites
«immortelles») et d’engendrer un grand
nombre de types cellulaires.
 Cellules souches issues d’un adulte : elles
sont beaucoup plus rares, plus différenciées,
avec une capacité de différenciation et de
reproduction souvent plus limitée (50 à 100
générations de cellules in vitro) et donc plus
difficile à cultiver.
o Types selon la capacité de différenciation.
 Totipotentes : capables d’engendrer tous les types cellulaires. Elles sont prélevées au stade
embryonnaire de blastocyste.
 Pluripotentes : capables de donner naissance à plusieurs mais pas à tous les types cellulaires.
Elles sont prélevées chez l’adulte. Ex: cellules germinales de la moelle osseuse qui assurent la
régénération des cellules sanguines et immunitaires (fig. 42.16).




NB. Certains auteurs présentent une classification plus «fine» de ces cellules:
Totipotente : capable de redonner un individu complet; ce sont seulement les 2 à 8 premières cellules issues du zygote.
Pluripotente : capable de donner tous les types cellulaires; ce sont les cellules embryonnaires issues du blastocyste
Multipotente : capable de donner plusieurs types cellulaires; chez l’embryon et l’adulte. Ex : moelle osseuse.
Unipotente :
capable de donner un seul type cellulaire; chez l’adulte. Ex : peau, intestin.
La définition de chacun de ces niveaux de classification a beaucoup évolué au fur et à mesure des découvertes des dernières
années. Elle peut donc varier sensiblement d’une référence à l’autre.
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o Comportement des cellules souches adultes mises en culture.
La recherche sur la culture des cellules souches montrent qu’elles peuvent présenter beaucoup de
variabilité et de plasticité. Par exemple :
 On a pu isoler des cellules de la peau pluripotentes, capables de générer des neurones, des
cellules musculaires, des adipocytes, etc., selon les facteurs de croissance ajoutés.
 On a pu dédifférencier des cellules adultes pour qu’elles se comportent comme des cellules de
nature embryonnaire.
o Cellules souches et système de régénération du corps.
Les dernières recherches tendent à démontrer que des cellules souches de la moelle osseuse
pourraient constituer le système naturel de régénération du corps :
«Les tissus endommagés sécrètent des composés spécifiques qui entraînent la libération de cellules souches
présentes dans la moelle osseuse. Ces mêmes tissus sécrètent des molécules dont les signaux de détresse
ont pour effet de capter l’attention des cellules souches. À mesure que les cellules souches circulent dans le
sang et traversent les capillaires des tissus endommagés, les molécules de détresse les attirent et facilitent
leur migration à l’intérieur des tissus. Là, les cellules souches se multiplient avant de se transformer en
cellules des tissus en question. Ce phénomène survient à la suite d’une crise cardiaque, d’une fracture, d’un
accident vasculaire cérébral (AVC), etc.»
(DRAPEAU C., Le pouvoir insoupçonné des cellules souches, éd. De l’Homme, 2010).
o Cellules souches et cellules tumorales.
 Les cellules souches partagent plusieurs caractéristiques avec les cellules tumorales, dont
principalement leur grande capacité de reproduction.
 Elles ont été récemment mises en cause dans l'origine de cancers. Elles seraient les seules à
avoir la possibilité de muter de manière à devenir des cellules cancéreuses, en raison du temps
nécessaire à ces mutations - plusieurs années - alors que les cellules différenciées ont souvent
une espérance de vie de quelques semaines seulement. Elles seraient aussi responsables des
récidives de cancers. Ces données jettent donc une ombre sur ces cellules qui ont inspiré
beaucoup d'espoirs.
2.2 Les cellules transformées (génétiquement)
La recherche actuelle avec les cellules différenciées de mammifères s’effectue avec des cellules qui
se multiplient indéfiniment (ou presque) parce qu’elles ont subit des transformations génétiques
o De manière naturelle : ce sont des cellules tumorales (cancéreuses) prélevées directement d’un
animal ou d’un humain;
o De manière artificielle en labo : ce sont de cellules qui ont été modifiées en introduisant des
gènes de cellules tumorales ou de virus.
2.3 Lignées cellulaires
o La liste des différents types cellulaires qui peuvent maintenant être cultivés en laboratoire est
assez impressionnante : fibroblastes; cartilages; muscles squelettiques, cardiaques et lisses;
épithélium de foie, poumon, peau, vessie, rein; neurones et cellules gliales, etc.
o Lorsque les cultures sont bien établies, on parle alors de lignées de cellules. Certains organismes,
comme l’ATCC (American Type Culture Collection), conservent les lignées cellulaires congelées et
procurent des échantillons aux chercheurs qui peuvent ainsi travailler sur des cellules
comparables, partout à travers le monde.
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3. Culture des cellules adhérentes et non adhérentes
3.1 Cellules non adhérentes.
Certaines cellules peuvent croître en suspension dans un liquide sans s’attacher les unes aux autres.
C’est le cas des globules blancs. Dans l’organisme, ces cellules de défense sont libres dans la
circulation sanguine et peuvent envahir un tissu infecté, se mouvoir activement dans les tissus, s’y
fixer temporairement et repartir!
3.2 Cellules adhérentes.
Toutes les autres cellules animales nécessitent un «point d’ancrage» pour se reproduire. Elles
croissent en s’attachant les unes aux autres pour former des tissus et des organes. Pour croître in
vitro, les cellules nécessitent :
 Une surface d’attachement telle la paroi d’un flacon de plastique.
 Une concentration initiale minimale; la plupart des cellules doivent être en nombre minimal
pour croître et former un tissu, sinon elles meurent. Tout se passe comme si elles devaient
communiquer entre elles.
 Les cellules adhérentes normales se reproduisent jusqu’à former un tapis continu; leur
croissance est alors stoppée par le phénomène «d’inhibition de contact». Par la suite, elles
dégénèrent assez rapidement. Pour maintenir une culture en vie, il faut transférer une
partie des cellules dans un nouveau flacon. Cette opération s’appelle un “passage”.
3.3 Degré de confluence et passage d’une culture
Il est donc important d’observer la vitesse de croissance des cellules adhérentes. Habituellement,
on détermine au microscope inversé le degré de confluence, i.e. le pourcentage de l’espace occupé
par les cellules sur le plancher d’un flacon. En pratique, s’il est supérieur à 80%, on effectue un
passage. À 100% et plus, la lignée risque de s’éteindre.
3.4 Décollement des cellules adhérentes.
Les cellules adhèrent entre elles et à une surface par l’intermédiaire de leurs protéines
membranaires. Pour prélever des cellules, il faut donc commencer par briser ces liens protéiniques :
 Mécaniquement; par exemple, en raclant le plancher d’un flacon avec de petits râteaux!
 Chimiquement, à l’aide d’un enzyme spécialisé dans la digestion des protéines. On utilise
généralement la trypsine, un enzyme extrait du suc pancréatique sécrété dans l’intestin.
Cet enzyme fonctionne de manière optimale à 37 oC.
3.5 Changement du milieu de culture.
Si on note l’accumulation de déchets dans le milieu de culture sans qu’il y ait lieu d’effectuer un
passage (confluence ≤ 80%). On effectue alors un simple changement de milieu nutritif.
 La plupart du temps, le milieu contient un indicateur de pH qui change de couleur (du rosé
au jaune) avec l’acidité des déchets cellulaires qui s’accumulent.
3.6 Cellules tumorales adhérentes.
En culture, les cellules tumorales adhèrent à la surface d’un flacon mais, tout comme dans
l’organisme, elles ne subissent pas l’inhibition de contact et n’ont pas besoin d’avoir un point
d’ancrage pour se reproduire (Campbell, pp. 248-249, fig. 12.18). Elles peuvent donc s’empiler en
amas. Elles survivent ainsi plus longtemps que les cellules normales, mais elles finissent tout de
même par dégénérer. Il est donc préférable d’effectuer des passages lorsque les cellules en
culture sont confluentes, ne serait-ce que pour faciliter leur observation et leur manipulation.
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4. Matériel et appareils importants
4.1 Milieu de culture : on ajoute généralement 3 types de solutions au milieu de culture :
o Milieu nutritif : solution disponible commercialement contenant
 les éléments nutritifs (organiques et inorganiques)
 des facteurs de croissance
 un indicateur de pH (rouge phénol)
o Sérum de veau (fœtal ou jeune bovin) : de composition non entièrement connue, il demeure un
ajout essentiel à la culture de la plupart des cellules. On peut modifier la vitesse de
reproduction des cellules en altérant la concentration du sérum dans le milieu de culture
(concentrations normalement utilisées : de 1% à 10%)
o Antibiotiques. Leur ajout est facultatif mais contribue grandement à prévenir la contamination
bactérienne.
4.2 Solution de lavage :
Pour rincer des cellules et les débarrasser de leurs déchets, il est important d’utiliser une solution
isotonique au pH constant. On se sert habituellement d’une solution tampon à base de phosphate
(PBS pour «Phosphate Buffer Solution»)
4.3 Contenants (voir figure 1)
On peut cultiver les cellules animales in vitro dans différents contenants : flacons, pétris, plaques à
multiples puits, lamelles pour micro-cultures, tubes et cuves pour cultures à grande échelle (ex : pour la
production de virus, de vaccins, la production de produits cellulaires tels interférons, hormones,
enzymes et anticorps). Les flacons que nous utilisons
o possèdent de grandes surfaces sur lesquelles peuvent se fixer et croître les cellules
adhérentes.
o ont une forme favorisant l’observation microscopique des cellules.
Figure 1. Types de contenants utilisés en culture cellulaire.
Plats
Flacons
Plateaux multi-puits
Bouteilles
Caractéristiques des flacons selon leur grosseur
Types Volume de
Volume de
Surface de
Milieu (ml) Trypsine (ml) Croissance (cm2)
T25
T75
T175
T300
8,0-10,0
20-30
45-55
150-400
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0,5
1,0
2,0
4,0
25
75
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300
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4.4 Appareils:
o Enceintes de travail en asepsie (voir figure 2)
Toute contamination microbienne d’une culture cellulaire (bactéries ou mycètes) devient fatale car
les microbes se reproduisent très rapidement et rendent le milieu invivable pour les cellules.
L’utilisation des antibiotiques n’est pas suffisante ni même parfois souhaitable expérimentalement.
La majeure partie des opérations est donc effectuée sous des hottes offrant un environnement
stérile.
 Hottes à flux laminaire. De nombreux labos utilisent un type de hotte dans lequel le système
de ventilation entraîne un flux d’air unidirectionnel (vertical ou horizontal) qui passe à travers
un système de filtres HEPA (High Efficiency Particulate Air) capable de maintenir un air
stérile sous la hotte. L’air sortant de ce type d’enceinte n’est cependant pas filtré et ne
protège pas l’expérimentateur. On y cultive des cellules ne présentant pas de risque biologique.
 Enceintes de sécurité biologique.
Pour les travaux exigeant la protection de
l’expérimentateur (ex : utilisation de virus, bactéries, et les cellules transformées), on utilise
des hottes qui filtrent l’air entrant et sortant.
Figure 2. Enceintes de travail en asepsie
(b) Enceinte de sécurité biologique
(a) Hottes à flux laminaire
horizontal ou vertical
L’air circulant dans la hotte est stérile
mais l’expérimentateur placé devant
l’appareil n’est pas protégé
L’expérimentateur placé devant
l’appareil est protégé
Pour assurer leur stérilité, toutes ces hottes sont généralement désinfectées quelques minutes
avant leur utilisation avec une lampe UV et de l’alcool 70%.
Enfin, pour qu’elles soient efficaces contre la contamination (des produits) et l’infection (de
l’expérimentateur), il est primordial de respecter les règles de base du travail en asepsie.
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o Incubateur à CO2.
 La plupart des cellules animales doivent être cultivées dans un incubateur à température
contrôlée (37oC) et relié à une source d’alimentation en CO2 (5%) afin de recréer les
conditions environnementales de l’intérieur de l’organisme.
 Les contenants utilisés doivent permettre les échanges gazeux entre les cellules et le milieu
ambiant :
 Les bouchons des flacons ont parfois des ouvertures munies de filtres. On dit qu’ils sont de
type ventilé.
 Les bouchons non ventilés doivent être légèrement dévissés pour permettre les échanges
gazeux lorsque les flacons sont placés en incubation.
o Microscope inversé.
Contrairement au microscope ordinaire qui permet d’observer uniquement des préparations très
minces placées sur des lames de verre, le microscope inversé permet d’observer des
préparations plus épaisses telles un flacon de culture. La source lumineuse provient du dessus et
les objectifs sont situés sous la préparation de manière à pouvoir s’approcher du plancher d’un
flacon, là où poussent les cellules.
Figure 3. Microscope inversé
Source lumineuse placée au-dessus
Objectifs
placés au-dessous
Sur un microscope ordinaire les objectifs sont placés au-dessus de la platine.
Or, pour être efficaces, les plus gros objectifs d’un microscope doivent pouvoir
s’approcher de l’objet à grossir; la lentille de l’objectif le plus puissant (100X)
vient carrément s’appuyer sur la lame microscopique. L’observation de cellules
placées sur le plancher d’un flacon serait donc impossible sur un microscope
conventionnel.
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