D1-UE7-Doray-Diagnostic_moleculaire-27.03.17

UE7 – Génétique
Date : 27/03/16
Promo : DFGSM3 2016-2017
Plage horaire : 10h45 – 12h45
Enseignant : Dr. DORAY Bérénice
Ronéistes :
SCHOTT Zoé
HOARAU Christophe
Diagnostic moléculaire
I.
Introduction
a. Champs d’application de la génétique moléculaire
b.Intérêts et conditions du diagnostic génétique
c. Extraction d’ADN
d.Diagnostic direct vs. indirect
II.
Techniques diagnostiques classiques
a. La technique de PCR
b.Stratégie classique de détection des mutations uniques
c. Séquençage - technique PCR séquence Sanger
1. Principe et exemple
2. Avantages et limites de la méthode
d.Exemples de techniques alternatives au Sanger
1. Recherche non ciblée de variant
2. Recherche ciblée de variants
3. Recherche de grands réarrangements
4. Analyse quantitative –recherche d’anomalies de dosage
III.
Approche pangénomique - le NGS (« next generation
sequencing »)
a. Principe et technique
b.Applications du NGS
--------------------------------------------------------------2015 : précisions de la prof avant de commencer le cours, elle ne nous « embêtera pas » sur les différentes
techniques de biologie moléculaire. Le but étant de comprendre comment tout cela fonctionne et leur intérêt
en médecine.(sous entendu ce qui ne change pas en 2017!!!)
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I.
Introduction
• Les avancées révolutionnaires pour la génétique moléculaire :
1970 : endonucléases de restriction
1972-1973 : ligases
1975 : séquençage (Sanger et Coulon, Maxan et Gilbert, Hood)
1985 : PCR → fondamental dans l'étude de n'importe quelle maladie
1998 : puces à ADN ("microarrays"). D'abord utilisées en recherche (technique de CGH). Ne sont utilisées
en pratique courante que depuis 5-6ans.
=> on développe de plus en plus de technique de séquençage de haute définition (ex :NGS)
• Champ d'application de la génétique moléculaire en génétique humaine: (a quoi ça sert?)
→ établir le diagnostic d'une maladie héréditaire (elle donne un exemple d'un cas de drépanocytose. Un
enfant atteint de drépanocytose aura surtout un diagnostic clinic → observation simple de la forme de ses
GR + électrophorèse identifiant l'HbS. Mais dans le cas d'une grossesse à risque pour cette maladie, le
diagnostic ne pourra pas se faire sur les GR du fœtus. Il faudra donc ici utiliser la génétique moléculaire
pour vérifier si oui ou non le fœtus est atteint) (autre exemple/cas : pathologies pour lesquelles on a
BESOIN du test génétique pour confirmer le diagnostic)
→ établir le dépistage des hétérozygotes (porteurs sain de la mutation → problème pour hérédité); le
diagnostic prénatal; le diagnostic pré-implantatoire (dépistage même fondamental); le conseil génétique
aux couples et aux familles,…
• Le diagnostic génétique :
- permet de déterminer les individus porteurs d'une mutation
- permet d'identifier ceux qui ne la portent pas (diagnostic prédictif. Ex: patient dont le père est mort
maladie de Huntington et qui cherche à se rassurer à ce niveau)
- nécessite un consentement éclairé
- ne peut se faire que dans un laboratoire autorisé par un praticien ayant reçu un agrément
• L'extraction de l'ADN peut se faire à partir de différents tissus :
- Sang périphérique +++ (extraction de l'ADN des leucocytes)
- Salive ou Frottis buccaux (études de population, 1 ou 2 tests) → représentent au mieux l'état des cellules
du cerveau car ont pour origine les cellules ectodermiques (proche cerveau)
- Liquide amniotique et Biopsie de trophoblaste → diagnostic prénatal
- Cellule embryonnaire (stade 8) → diagnostic pré-implantatoire
- Cheveux, Sperme (médecine légale)
- Spécimens pathologiques archivés (individus décédés)
- Carte de Guthrie (buvard, goutte de sang talon nouveau né à J3) pour dépistage de Phénylcétonurie,
Hypothyroïdie congénitale, Hyperplasie surrénale, Mucoviscidose et Drépanocytose si population à risque
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• Différents diagnostics
DIRECT
INDIRECT
Mutation non connue dans la famille
La mutation est CONNUE
On cherche donc cette mutation chez l'individu
atteint. Ce qui nous permettra de confirmer le
diagnostic de façon très fiable.
On cherche ici les liaisons génétiques avec la
mutation en cause.
C'est un suivi indirect du gène délétère à l'aide de
marqueurs polymorphes nécessitant l'analyse de
marqueurs génétiques (polymorphisme).
Cette recherche se fait sur plusieurs membres de la
famille et donne des résultats plutôt probabilistes
avec des risques de recombinaison.
Dans le cas de diagnostic indirect elle donne un exemple:
Un couple ayant eu un premier enfant diagnostiqué positif pour la Myopathie de Duchenne, cherche à
savoir si le deuxième enfant désiré le sera aussi. Mais sachant que le gène de Duchenne fait 80 exons, et que
ce n'est pas UNE mutation spécifique qui provoque la myopathie de Duchenne, la mutation responsable de
la maladie du premier enfant n'est pas connue/identifiée.
Le diagnostic indirect nous permettra de voir si le deuxième enfant aura hérité ou non du même
chromosome à risque.
Dans le cas de la myopathie de Duchenne, on sait que c'est sur le chromosome X et je sais aussi à quel
endroit la mutation doit se trouver pour provoquer cette maladie.
Donc au niveau de cette région là, on utilisera les marqueurs polymorphes au niveau du gène de
Duchenne. Le but n'est pas d'essayer de déterminer la mutation (parce que l'on ne la connait pas) mais de
savoir si la configuration génétique du futur enfant sera identique ou non du premier enfant atteint.
→ on observe alors des combinaisons d'allèles : haplotype
Complément de 2015 pr mieux assimiler:
Diagnostic direct : la mutation est connue a priori
•
Recherche de cette mutation chez l’individu atteint, est-ce qu’elle est là ?
•
Permet de confirmer le diagnostic.
•
•
Fiable.
C’est ce qui se fait le plus aujourd’hui.
Diagnostic indirect : la mutation n’est pas connue
•
Souvent fait en parallèle du direct notamment dans le diagnostic pré-natal.
•
Il y a plusieurs années, quand les recherches géniques commençaient à peine à se développer, les gènes en
cause dans des maladies étaient peu connus, c’était donc essentiellement du diagnostic indirect qui était
effectué.
•
Le gène n’est pas connu, on ne connait pas précisément la mutations, la séquence d’introns et d’exons etc.
mais on a testé des individus atteints dans la famille et identifié quel chromosome est malade grâce à des
marqueurs micro-satellites : on regarde comment les micro-satellites se fixent sur le chromosome malade
(dans la famille, un chromosome qui fixe les micro-satellites d’une certaine manière est souvent associé à
la maladie). Si par exempl, dans un dépistage pré-natal, on voit qu’un chromosome fixe les micro-satellites
comme les individus malades dans la famille, on peut craindre qu’il possède la mutation. Ce n’est pas une
technique fiable à 100% car peu précise, et il y a le phénomène de crossing-over pendant la méiose qui
rend la technique encore plus probabiliste.
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•
Recherche de liaisons génétiques avec la mutation en cause.
•
Suivi indirect du gène délétère à l’aide de marqueurs polymorphes.
•
Combinaison d’allèles : haplotypes.
•
Nécessite l’analyse de marqueurs génétiques (polymorphismes).
•
Chez plusieurs membres de la famille.
•
Résultat probabiliste, risque de recombinaison.
•
A La Réunion on utilise cette technique de diagnostic indirect en complément du diagnostic direct pour
diagnostiquer le syndrome RAVINE.
•
Comme on identifie la région du chromosome où est la mutation, la recherche précise de la mutation peut
se faire dans un second temps en recherche.
Exemple d’arbre généalogique avec manifestement une maladie autosomique dominante mais dont on ne connaît pas
la mutation. On a juste la certitude de la maladie et on sait que le gène est localisé entre m1 et m2 illustrés sur la diapo.
On ne peut pas séquencer tout l’ADN et tous les exons ni les introns, on donc fait le diagnostic indirect. On regarde
comment co-ségrège la maladie avec des marqueurs micro-satellites (connus et recensés dans les bases de données) et
on va pouvoir suivre l’allèle normale ou l’allèle muté. Ces marqueurs sont très nombreux (on n’en a représenté que 2
ici). Ici une très grande famille (idéal), on va tester la marqueur m1 et m2 et on voit que c’est toujours la combinaison
de marqueurs (ou haplotype) [ba] qui co-ségrègent avec la maladie. Donc l’enfant pour lequel on effectue cette
démarche de diagnostic, s’il a l’haplotype [ba] va surement être malade.
Même si l’on ne connaît pas la mutation on peut faire le diagnostic : ça marche très bien dans les grandes familles avec
des individus malades et d’autres sains. Ça marche moins bien quand les familles sont petites, qu’ils se connaissent
mal, que les personnes ne se savent pas encore malades, ou quand le gène est situé dans une région où il y a peu de
marqueurs micro-satellites proches, avec le risque de résultat altéré à cause du crossing-over dans les gamètes entre
ces marqueurs éloignés.
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II. Les techniques diagnostiques classiques
a. La technique de PCR
La première étape est bien sûr de prélever l’ADN. Puis il va falloir l’amplifier pour pouvoir l’analyser.
La PCR est une technique fondamentale permettant l’amplification sélective de façon exponentielle d’une région
donnée grâce à choix de primers spécifiques. Le but étant d’avoir suffisamment d’ADN pour analyse ultérieure.
On mélange l’ADN, l’ADN polymérase et les primers dans des tubes et on les met dans la machine à PCR.
On va d’abord dénaturer l’ADN double brin à 95°C. Une fois les brins séparés par le jeu de complémentarité des bases,
on va avoir les primers en rouge (petits fragments d’ADN sélectionnés pour encadrer la région qu’on veut étudier,
exemple : exon 22 du gène myopathie de Duchenne; on prend les primers qui encadrent cet exon) qui vont s’hybrider
sur la région d’intérêt et cela se fait à 65-66°C.
A 70°C on va avoir l’élongation des primers et donc l’amplification de la région encadrée par ces primers. Ces 3 étapes
constituent 1 cycle et on va laisser la réaction se dérouler sur plusieurs cycles pour amplifier cette région d’intérêt de
l’ADN.
b.Stratégie classique de détection des mutations uniques
Exemple de la drépanocytose
•
Avant on utilisait une technique « compliquée » :
o
Substitution nucléotidique A>T abolissant un site de l’enzyme de restriction BsuI,
o
Réalisation d’une PCR de la région contenant ce site de restriction,
o
Incubation des produits de PCR avec l’enzyme BsuI,
o
Migration sur gel d’électrophorèse.
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Après amplification par PCR de la région d’intérêt (contenant ou pas la mutation), on a du matériel en grande quantité.
On voit que ces régions possèdent des sites de restriction (ER) au niveau desquels l’enzyme de restriction (BsuI) va agir.
La mutation responsable de la drépanocytose va abolir un site ER (codon 6), ainsi les fragments obtenus par l’action
de BsuI vont être plus longs (1,3 kb) que les fragments obtenus à partir d’ADN de l’allèle non muté (1,1 kb), ce qu’on
pourra visualiser sur gel d’électrophorèse. Les patients hétérozygotes (NS) ont les 2 types de fragments. Cette technique
a longtemps été utilisée pour diagnostiquer la drépanocytose avant que ne soient développées les techniques de
séquençage.
•
Actuellement on fait du séquençage ciblé
c.Séquençage- technique PCR séquence Sanger
1. Principe et exemple
Le séquençage Sanger correspond à une lecture base par base de l’ADN. On amplifie la
région d’intérêt (30 nucléotides avant et après la région où l’on cherche la mutation). On
purifie ensuite ces produits de PCR et on fait migrer dans un séquenceur de Sanger.
Réservée pour une analyse de fragment court (150 à 200kb max).
Version automatisée du séquençage Sanger : on « écarte » les brins de l’ADN et dans le tube
on aura ajouté primers, enzymes DNA polymerase et des nucléotides marqués avec un
fluorochrome spécifique (exemple : adénine signal vert…), les produits de la réaction vont
passer dans un capillaire et être détectés par un laser qui va lire les signaux émis par les
fluorochromes donc nucléotides… L’analyse par ordinateur va générer un chromatographe
que l’on pourra lire selon un code couleur. On fait cette lecture dans les deux sens 5’-3’ puis
3’-5’.
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Des logiciels de lecture ont été développés pour comparer la séquence obtenue avec les séquences connues ou normales
de référence.
Exemple partie interprétation compte-rendu séquence Sanger
ANALYSE DE L'ADN
Séquençage des 21 exons et sites d’épissage du gène DNM2 (19p13.2). GenBank NM_001005360.2 and P50570.2.
RESULTAT
Dans la limite des connaissances actuelles et par les méthodologies utilisées, aucune mutation délétère n’a pu être
détectée sur ADN génomique pour les exons et sites d’épissage testés du gène DNM2.
COMMENTAIRE
Le diagnostic de myopathie centronucléaire par mutation du gène DNM2 est peu probable mais il n’est pas exclu.
En effet, la technique mise en œuvre ne peut détecter une éventuelle anomalie de dosage (délétion d’exon(s) ou de gène,
...), une mutation intronique, une mutation de la région promoteur...
Ci-dessus copie d’un CR de séquençage du CHU Strasbourg sur le gène DNM2 (lié à la myopathie de Duchenne). 21
exons donc 21 séquençages effectués. A chaque fois on amplifie les exons en choisissant les primers qui les flanquent.
Limites : les mutations d’épissage ou celles dans les grands introns ne seront pas détectés. Dans le compte rendu on
reste prudent, on dit qu’on n’a pas détecté de mutation mais que cette dernière n’est pas exclue.
Sensibilité et spécificité des analyses : il faut comprendre ce que l’on peut explorer et ce qui ne peut être prédit.
Exemple d’anomalie de dosage : si la maladie est due à une délétion complète sur l’un des 2 chromosome de l’exon 1,
mais que cet exon est présent sur le 2ème chromosome, on amplifiera et séquençera l’exon normal. On ne peut pas voir
cette anomalie par cette méthode.
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2. Avantages et limites de la méthode
Cette technique est bien pour voir petites insertions délétions et mutations ponctuelles mais tout de même longue et
fastidieuse (surtout si gène avec beaucoup d’exons). De plus les grands réarrangements comme les anomalies de
dosage ou les expansions de triplets (cf. prochains cours) ne seront pas détectés par cette méthode.
d.Exemples de techniques alternatives au Sanger
1. Recherche non ciblée de variant
On a donc mis au point d’autres alternatives à la Sanger pour rechercher des anomalies de manière non ciblée.
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Exemple du HRM (High Resolution Melting) (retenir juste le principe) : permet un pré-screening. Pour le gène de la
mucoviscidose qui fait 70 exons, faire l’analyse en Sanger serait très long, alors on fait un pré-screening au préalable.
Le principe est, avant de chercher quelle est l’anomalie (par Sanger, long), chercher SI il y a une anomalie (ne pas se
prendre un bois après 3 plombs à séquencer en se rendant compte qu’en fait tout est normal).
On regarde exon par exon s’il y a anomalie : on chauffe les brins d’ADN (prédigéré en plusieurs morceaux) qui vont se
libérer puis on refroidit rapidement pour que les brins de recollent de façon homoduplexe (forme originelle) ou en
hétéroduplexe (un brin de la forme normale et un autre de la forme mutée). On repère les hétéroduplexes (présence
d’une mutation) par la courbe de fusion (Tm) différente de celle des homoduplexes sauvages WT.
A ce stade on sait qu’il y a une anomalie mais il faut séquencer par la suite. C’est plus rapide et moins long que le
Sanger d’emblée.
(Toutes les techniques citées ont plus ou moins le même principe.)
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2.Recherche ciblée de variants
Exemple de la mucoviscidose où 1000 mutations connues ponctuelles pour la plupart réparties sur les 27 exons. On
recherche les 36 les plus fréquentes (+ 2 spés Réunion).
On prépare une PCR multiplexe, qui permet d’obtenir plusieurs amplicons dans le même tube (3-4) qu’on va pouvoir
distinguer par des tailles différentes (choix des primers à cet effet). Quand on fait migrer les différents fragments on sait
à quels exons ils correspondent. Suppose de savoir où se trouvent les mutations.
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3.Recherche de grands réarrangements
Le Sanger a un autre défaut : ne détecte pas les grands réarrangements tels que les expansions de triplets qu’on trouve
par exemple dans la maladie de Huntington.
La répétition de triplets CAG devient pathologique au dessus de 36-37 répétitions. On peut parfois avoir 120 répétitions
CAG. Le problème avec ces répétitions est que la protéine codée par le gène devient anormale.
Ici on utilise une technique basée sur le Sanger. On n’a pas de pics uniques car le nombre de répétitions diffère selon
les cellules (mosaïcisme somatique).
Diagramme de droite : 1è, 2è et 3è lignes patients normaux. 3ème ligne le patient a 2 allèles avec nombre de répétitions
CAG différent mais ça reste normal (21 et 22 reps). 4ème ligne on repère un pic à 40 répétitions et aplati car l’ADN
polymérase commence à fatiguer à ce nombre de répétitions. 5è ligne idem, un allèle pathologique. Dernière ligne
l’individu n’a que des allèles anormaux avec de très nombreuses répétitions (aucun pic) et là c’est embêtant car la mise
en évidence du nombre d’expansions ici pas possible (pas le nombre précis de réps), on doit donc recouper avec la
clinique et d’autres techniques.
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Technique de Southern blot
C’est la technique de référence pour faire le diagnostic de la maladie deHuntington. Cependant de nos jours, le
séquençage nouvelle génération nous permet de dépasser les contraintes liées au Southern Blot. En effet, la technique
de Southern Blot est longue, fastidieuse et assez complexe à réaliser.
Comment fonctionne-t-elle ?
De l’ADN prédigéré avec des enzymes de restriction dans les zones d’intérêt est migré sur gel d’agarose et transféré
sur un papier de chromatographie. Ensuite, avec une sonde marquée (par fluorescence ou plus anciennement par un
marquage radioactif) et spécifique du gène apparenté à la maladie d'Huntington on va marquer les hybridations sondeADN.
Ainsi, en fonction de la taille de mon gène, et donc indirectement du nombre de répétitions présentes, on aura des bandes
(reflet de notre hybridation sonde-ADN) plus ou moins hautes. En effet, plus il y a de répétitions, plus la migration sera
courte. Ce sera en comparant nos bandes obtenues avec une bande de référence (dont la taille de l'ADN est connue)
que l'on déduira le nombre de répétitions.
Au final, on peut faire un diagnostic formel de maladie d'Huntington via cette méthode mais :
1/ Demande beaucoup d’ADN,
2/ Prend beaucoup de temps (3 semaines).
4. Analyse quantitative – recherche d’anomalies de dosage
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Exemple d'une anomalie de dosage :
Pour un gène donné, si l’on a un allèle au sein duquel un exon entier est délété tandis que l'autre allèle est
normal, on aura une anomalie de dosage. En effet, si l’on fait du séquençage traditionnel chez cet individu, on
ne verra pas l'anomalie car notre séquençage traditionnel nous permet uniquement de voir s'il y a présence de
la séquence ou non. Dans cet exemple, la séquence sera présente et même normale (grâce à l'allèle normal de
l'individu) mais ce sera la quantité qui fera défaut (puisque qu'il y a un allèle en moins).
Ainsi, pour détecter ce genre d'anomalie on doit faire appel à un autre type de PCR, il s'agit de la PCR
quantitative.
Lorsque l'on effectue une PCR traditionnelle (en point final), on a augmentation exponentielle de la quantité
d'ADN à chaque cycle, jusqu’à une phase de plateau (environ 36 cycles) où on arrête la PCR. => Cette PCR
ne permet pas une approche quantitative.
Ici, dans notre PCR quantitative, on va pouvoir, comme son nom l'indique, quantifier la quantité d'ADN
présente. Lorsque l'on effectue une PCR quantitative, on mesure à chaque cycle la quantité d'ADN présent car
il existe un lien de proportionnalité entre la quantité d'ADN présent au départ et la quantité d'ADN produit à
chaque cycle MAIS cela est vrai uniquement si l'on se trouve dans la phase exponentielle de notre PCR.
Donc en PCR quantitative, on ne doit pas arriver à la phase de plateau, on s'arrête entre 5 et 30 cycles.
Cette autre technique QMPSF est utilisée pour regarder tous les exons d’un gène (ici gène du syndrome de
SOTOS), on amplifie des amplicons de tailles différentes pour chaque exon, en PCR quantitative et en
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multiplexe, puis on compare les pics des amplicons du patient (rouge) par rapport à un témoin (bleu). Ici tous
les pics sont divisés par deux, donc le patient a un allèle normal et un allèle complètement délété. On peut aussi
détecter des anomalies en plus (insertions ?).
Enfin, on termine par une dernière technique, qui est le NGS (Séquençage Nouvelle Génération).
III.
Approche pangénomique - le NGS (« next generation
sequencing »)
Appelé encore séquençage haut débit. Permet d’explorer de très grandes régions du génome en même temps. Cette
technique a la capacité de remplacer toutes les précédentes sauf peut-être pour les anomalies de dosage.
a. Principe et technique
Séquençage en parallèle de très nombreux fragments d’ADN (séquençage haut débit).
•
Révolution technologique,
•
Très grande rapidité,
•
Séquence en parallèle de millions de petits fragments,
•
Ré-assemblage par l’informatique,
•
Capacité d’analyse variable selon machine.
Ici l’outil fondamental est l’ordinateur, qui va reconstruire à partir de ces petits fragments chevauchant la
séquence canonique à la manière d’un puzzle… Et donc lire en même temps de très grandes régions du génome.
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b. Applications du NGS
• NGS ciblé (moyen débit)
o
o
o
Capture 1/5000 (?) gènes (10-500),
Multiplexage (plusieurs patients en parallèle),
Séquence 0.1 à 1 Mb avec qualité +++.
• Exome (haut débit)
o Kit de capture « universel »,
o Séquence 50 Mb environ,
o Filtre selon objectifs.
Dans nos labos on pratique plutôt les NGS ciblés sur les gènes d’intérêt. Exemple : les 20 gènes du syndrome
de Bardet-Biedel (obésité, retard mentale, problèmes ophtalmos) qu’on va tester en parallèle. Pour un patient
on peut étudier jusqu’à 100 gènes en même temps avec une bonne qualité. On vise à terme un séquençage
génome entier (introns+exons), objet de recherche fondamentale.
Les exomes (étude séquençage de tous les exons connus dans l’espèce humaine) sont étudiés en recherche
surtout, utiles dans le cas des hétérogénéités génétiques …
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Les challenges sont surtout informatiques car demandent beaucoup de mémoire pour stocker toutes ces infos.
QCM (annales)
2014
4. Quand on fait une PCR :
A. La séquence cible est multipliée par recopiages successifs à l’aide d’amorces
oligonucléotidiques.
B. L’ADN polymérase est thermolabile.
C. L’extension par l’ADN polymérase se fait à 55°C.
D. L’hybridation d’une séquence d’ADN est spécifique et réversible.
E. La dénaturation de la molécule d’ADN est réversible en modifiant la température du milieu
réactionnel.
E. La réaction de PCR est réalisée dans un séquenceur.
2015 session 2
2. Concernant l’ADN :
A. Il peut être extrait à partir des globules rouges du patient.
B. Il peut être extrait à partir de villosités choriales.
C. Il ne peut pas être extrait à partir d’un cheveu.
D. La cytogénétique est la discipline qui permet d’étudier l’ADN.
E. Il est dénaturé dès 55°C.
26. Concernant le diagnostic moléculaire indirect :
A. Un diagnostic indirect doit être proposé en première intention chez un patient présentant une
suspicion de syndrome X-Fragile.
B. Un diagnostic indirect est réalisé lorsque la localisation du gène est connue mais pas la
mutation.
C. Un diagnostic indirect est réalisé à l’aide de marqueurs microsatellites.
D. Un diagnostic indirect donne un résultat fiable à 100%.
E. Un diagnostic indirect se fait par FISH interphasique.
2015 Session 1
9. Diagnostic moléculaire direct et indirect :
A. On peut réaliser un diagnostic moléculaire direct quand la mutation n’est pas connue.
B. Un diagnostic moléculaire indirect est plus fiable qu’un diagnostic direct.
C. La première étape du diagnostic moléculaire direct est le caryotype.
D. Le diagnostic indirect moléculaire nécessite de disposer de l’ADN de plusieurs membres de la
famille.
E. Le diagnostic indirect est basé sur la détermination des haplotypes au locus considéré des individus
sains et malades.
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