mise en evidence de l`effet d`un peptide sur l

VETAGRO SUP
CAMPUS VETERINAIRE DE LYON
Année 2011-Thèse n° 78
MISE EN EVIDENCE DE L'EFFET D'UN PEPTIDE
SUR L'EPIDERMISATION DANS UN MODELE
EXPERIMENTAL DE CICATRISATION
EPIDERMIQUE CHEZ LE PORC
THESE
Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I
(Médecine - Pharmacie)
et soutenue publiquement le 12 Décembre 2011
pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire
par
DELEAGE Alexandre
Né le 29 avril 1985
à Lyon (69)
VETAGRO SUP
CAMPUS VETERINAIRE DE LYON
Année 2011-Thèse n° 78
MISE EN EVIDENCE DE L'EFFET D'UN PEPTIDE
SUR L'EPIDERMISATION DANS UN MODELE
EXPERIMENTAL DE CICATRISATION
EPIDERMIQUE CHEZ LE PORC
THESE
Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I
(Médecine - Pharmacie)
et soutenue publiquement le 12 Décembre 2011
pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire
par
DELEAGE Alexandre
Né le 29 avril 1985
à Lyon (69)
LISTE DES ENSEIGNANTS
REMERCIEMENTS
A monsieur le docteur Didier PIN,
D’avoir encadré ce travail et pour son implication.
A monsieur le professeur Jean-François NICOLAS,
D’avoir accepté la présidence de ce jury
A monsieur le professeur François GARNIER,
D’avoir accepté de faire partie du jury.
A madame le docteur Patricia ROUSSELLE,
D’avoir accepté de faire partie du jury et m’avoir permis de faire cette thèse
Au personnel de l’Institut Claude BOURGELAT,
Pour ses bons soins à nos animaux.
Au personnel du laboratoire de dermatopathologie,
Pour son travail.
A l’Institut de Biologie et Chimie des Protéines,
Pour son financement.
A Biomatèse,
Pour l’intérêt porté à cette étude.
TABLE DES MATIERES
Liste des enseignants
4
Remerciements
6
Table des matières
7
Liste des tableaux
7
Liste des figures
8
Liste des annexes
9
Liste des abbréviations
10
Introduction
11
Le porc, un modèle expérimental de cicatrisation cutanée
13
Structure comparée de la peau chez le porc et chez l’homme
13
L’épiderme
13
Le derme
16
L’hypoderme
17
Le réseau vasculaire
18
Les annexes
18
Physiologie de la cicatrisation
20
Phase exsudative
20
Phase proliférative
23
Phase de maturation
30
Etude de l’efficacité d’un peptide à deux concentrations dans l’épithélialisation de plaies cutanées superficielles
31
Introduction
31
Matériel et méthodes
33
Préparation des solutions
33
Animaux
33
Réalisation des plaies cutanées superficielles
33
Traitement par le peptide
36
Changement des pansements
36
Examens cliniques
36
Examens histologiques et immunohistologiques
36
Résultats
37
Macroscopiques
37
Microscopiques
42
Discussion
49
Du suivi macroscopique
49
Du suivi microscopique
50
Globale
51
Détermination de la profondeur d’excision nécessaire pour retirer l’ensemble des bulbes des follicules pileux au
dermatome.
53
Introduction
53
Matériel et méthodes
53
Animaux
53
Réalisation des plaies cutanées superficielles
54
Examens histologiques
54
Résultats
54
Discussion
55
Conclusion
57
Bibliographie
58
Par ordre d’apparition
58
Par ordre alphabétique
62
Annexes
66
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Comparaison des céramides épidermiques de l’homme et du porc [11].
16
Tableau 2: Tableau comparatif des structures cutanées du porc et de l’homme.
19
Tableau 3 : Ensemble des protocoles des articles ayant inspiré le choix du protocole.
32
Tableau 4 : Pourcentage de surface épithélialisée à J7.
37
Tableau 5 : Résultats des examens histologiques en colorations hemalun éosine des biopsies
réalisées sur le porc 1.
44
Tableau 6 : Résultats des examens histologiques en colorations hemalun éosine des biopsies
réalisées sur le porc 2.
45
Tableau 7 : Résultats des examens histologiques des lambeaux exportés et des biopsies de
fond de plaies à différentes profondeurs.
55
7
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Les différentes couches de l’épiderme [4].
14
Figure 2 : Histologies de peaux en coloration Hémalun éosine.
19
Figure 3 : Réaction vasculaire [24].
21
Figure 4 : Réaction inflammatoire [24].
22
Figure 5 : Réparation dermique [24].
24
Figure 6 : Néoangiogénése [24].
25
Figure 7 : Contraction de la plaie [24].
26
Figure 8 : Réparation épidermique [24].
28
Figure 9 : Réépidermisation [24].
29
Figure 10 : Chronologie des phases de la cicatrisation et éléments mis en jeu [25].
30
Figure 11 : Réalisation des plaies au dermatome.
34
Figure 12 : Les plaies réalisées sur le dos des porcs.
35
Figure 13 : Plaies du porc 1 à J7.
38
Figure 14 : Calques des plaies du porc 1 à J7.
39
Figure 15 : Plaies du porc 2 à J7.
40
Figure 16 : Calques des plaies du porc 2 à J7.
41
Figure 17 : Lèvre de la plaie du site traité du porc 1 à J2 en coloration Hémalun éosine.
42
Figure 18 : Histologies en coloration PAS du porc 2 à J4.
46
Figure 19 : Immunomarquages au Ki67 du porc 1 à J9.
47
Figure 20 : Immunomarquages au Kl1 du porc 1 à J2.
48
Figure 21 : Excisions réalisés au dermatome® sur le dos d’un porc.
54
Figure 22 : Histologie de lambeau exporté et de fond de plaie.
55
8
LISTE DES ANNEXES
Annexe 1 : Anesthésie, analgésie, antibioprophylaxie.
66
Annexe 2 : Fiches de suivi.
67
Annexe 3 : Calendrier (par porc).
68
9
LISTE DES ABBREVIATIONS
PCe :
Céramides du porc
HCe :
Céramides de l’homme
PDGF :
Patelet derived groxth factor
TGFα :
Transforming growth factor alpha
TGFβ :
Transforming growth factor beta
EGF :
Epidermal growth factor
FGF :
Fibroblast growth factor
C5a :
Facteur 5a du complément
LTB4 :
Leukotriene B4
Il-1 :
Interleukine 1
KGF :
Keratinocyte growth factor
IBCP :
Institut de Biologie et Chimie des protéines
ICB :
Institut Claude Bourgelat
Tr :
Site traité
Té :
Site témoin
10
INTRODUCTION
La cicatrisation de la peau est un phénomène qui permet à une peau lésée de
recouvrer ses propriétés et ses fonctions initiales. Parmi ces fonctions, figure la fonction
barrière : essentielle pour prévenir les infections et la déshydratation, et remplie,
essentiellement, par l’épiderme. La perte de cette fonction, lors de lésions cutanées
étendues ulcérées, est péjorative. Le rétablissement précoce de cette fonction est essentiel.
Par ailleurs, la bonne cicatrisation de l’épiderme est très importante pour des raisons
esthétiques, particulièrement en médecine humaine. Aussi, est-il intéressant de disposer de
molécules favorisant l’épithélialisation, d’une part, et, d’autre part, d’une bonne maturation
de la cicatrice épidermique.
Afin d’identifier les molécules d’intérêts, la recherche nécessite de nombreux
tests in vitro, mais aussi, in vivo. Se pose alors le problème du choix du modèle expérimental
et de la méthode à utiliser. Après avoir, tout d’abord, rappelé les raisons anatomiques et
physiologiques qui font du porc un bon modèle expérimental pour l’étude de la cicatrisation
cutanée, nous présenterons une étude de l’efficacité d’un peptide de synthèse sur la
cicatrisation épidermique de plaies cutanées superficielles. Enfin, nous envisagerons
comment améliorer notre protocole expérimental en déterminant la profondeur d’excision
nécessaire pour retirer la totalité des follicules pileux.
11
Le porc, un modèle expérimental de cicatrisation cutanée
Le porc est un bon modèle animal de cicatrisation cutanée pour l’homme [1,
2]. En effet, les résultats d’études de la cicatrisation chez l’homme et le porc concordent
dans 78% des cas contre, seulement, 53% des cas pour les petits mammifères et 57% des cas
pour des études in vitro [1]. Ceci est dû à une analogie anatomique et physiologique. De
fait, le porc est un modèle qui a largement été utilisé dans différentes études sur les
phénomènes de cicatrisation cutanée.
Structure comparée de la peau chez le porc et chez l’homme
La peau est divisée en deux structures : le derme et l’épiderme qui reposent
sur un tissu sous-cutané riche en lipides, l’hypoderme [3]. On note, aussi, la présence
d’annexes au sein du derme : glandes sudoripares, glandes sébacées et follicules pileux.
L’épiderme
L’épiderme est un épithélium pavimenteux stratifié et kératinisé. Les deux
principales populations cellulaires constitutives de l’épiderme sont les kératinocytes et les
cellules dendritiques.
Les kératinocytes sont largement majoritaires. Ils sont tous issus des cellules
basales puis migrent vers la surface tout en subissant des modifications. On peut ainsi
distinguer six assises épidermiques depuis la lame basale vers l’extérieur [3] :
-Stratum germinativum : cette assise est composée d’une seule rangée de cellules, liées
entre elles par des desmosomes, et repose sur une lame basale à laquelle les keratinocytes
basaux sont liés par des hémidesmosomes. Les cellules qui la composent sont cuboïdes, leur
noyau arrondi et leur cytoplasme riche en tonofilaments. Les cellules du stratum
germinativum présentent un indice mitotique élevé comparées aux cellules des autres
couches [3, 4].
13
-Stratum spinosum : cette assise est composée de trois à quinze rangées de cellules
associées entre elles par des desmosomes. Les cellules qui la composent sont nucléées,
polyédriques et s’aplatissent dans les rangées les plus superficielles ; ces cellules sont
entourées de matériel lipidique déversé dans les espaces intercellulaires par les granules
lamellaires. [3, 4].
-Stratum granulosum : cette assise est composée de deux ou trois rangées de cellules
entourées de matériel lipidique déversé par les granules lamellaires. Les cellules qui la
composent sont aplaties, leur membrane épaissie, leur noyau fragmenté et leur cytoplasme
chargé en grains de kératohyaline [3, 4].
-Stratum compactum : cette assise est composée d’un nombre variable de couches
cellulaires. Les cellules qui la composent sont très aplaties, anucléées et cohésives, leur
membrane densifiée, leur cytoplasme kératinisé. L’espace intercellulaire est comblé par un
matériel lipidique [3, 4].
-Stratum disjunctum : cette assise est composée de cellules qui desquament. Les cellules qui
la composent perdent progressivement leur cohésion et se détachent [3].
Le stratum compactum et le stratum disjunctum forment le stratum corneum.
Figure 1 : Les différentes couches de l’épiderme [4]
Schéma et photographie microscopique en trichrome de Masson des différentes couches
épidermiques.
14
Les
mélanocytes
sont
essentiellement
localisés
dans
le
stratum
germinativum. Ils insinuent leurs dendrites entre les kératinocytes voisins [3]. Il s’agit de
cellules dendritiques pigmentaires contenant de nombreux mélanosomes.
Les cellules de Langerhans sont localisées dans le stratum spinosum. Il s’agit
de cellules dendritiques présentatrices d’antigènes caractérisées par la présence de granules
de Birbeck [2, 5].
L’épiderme, chez nos deux espèces d’intérêt, est assez épais et d’épaisseur
comparable : de 70 à 140 μm pour le porc et de 50 à 120 μm chez l’homme [6]. Cependant,
cette épaisseur varie en fonction des zones du corps. Aussi, il est préférable de comparer les
rapports derme-épiderme qui varient entre 10 :1 et 13 :1 et sont, eux aussi, similaires [2]. De
plus, chacune des différentes couches de l’épiderme contient un nombre comparable de
rangées cellulaires [7].
Les keratinosomes ou corps d’Odland, que l’on observe chez l’homme dans le
stratum spinosum, correspondent aux granules lamellaires décrits chez le porc [5, 8]. Chez
l’homme, comme chez le porc, on note la présence de sillons qui creusent l’épiderme et lui
confèrent une surface irrégulière déterminant des dermatoglyphes [7]. La structure
biochimique des kératines et des lipides du stratum corneum, du porc et de l’homme est
comparable [8]. Le porc et l’homme possèdent de nombreux acides gras libres et
triglycérides à la surface de la peau [9]. La composition des céramides épidermiques porcins
a été determinée [10] et comparée à celle des céramides présents dans l’épiderme humain
dans le Tableau 1.
15
Nom de la chaine longue de base
Hexadecasphingenine
16 :0
Hexadecasphinganine
16 :1
Ceramide de porc (PCe)
Ceramide d’homme (HCe)
1
2
3
4
1
2
3
4
14,4
22,4
9,4
11,2
3,0
3,0
4,6
3,7
3,2
2,3
1,2
1,7
Heptadecasphingenine 17:1
9,6
10,2
11,0
18,5
12,6
7,4
7,6
4,4
Sphingenine
18 :1
36,3
24,5
35,3
28,3
32,9
24,5
20,7
15,2
Sphinganine
18 :0
12
12,9
9,5
13,5
6,3
4,9
5,3
4,0
O-Methylsphingenine
18(OMe) :1 4
4,9
7
5,8
4,8
5,6
5,3
1,1
Hydroxysphinganine
18(h) :0
7,3
11,6
2,2
8,0
23,1
Nonadecasphingenine
19 :1
12,2
31,5
30,1
30,5
Eicosasphingenine
20 :1
Indéfini
16,2
14,5
13,2
5,6
15,4
13,3
9,0
9,2
7,5
10,6
7,3
5,5
9,6
5,3
8,2
7,1
Tableau 1 : Comparaison des céramides épidermiques de l’homme et du porc [11].
Les valeurs sont exprimées en pourcentage de la totalité des longues chaines de bases. Les
fractions de ceramides humains et porcins ont une composition de base similaire (Dans la
deuxième colonne sont indiqués le nombre de carbones et le nombre de doubles liaisons).
La durée de renouvellement total de l’épiderme est comparable dans les deux
espèces, 30 jours pour l’homme et 28 jours pour le porc ; et la durée de migration d’un
kératinocyte de la couche basale jusqu’au stratum granulosum est aussi comparable, 14
jours chez le porc et 13 jours chez l’homme [7].
Le derme
Le derme est un tissu conjonctif dense. Il est composé d’une substance
fondamentale, de protéoglycanes et glycoprotéines structurales, baignant un réseau
vasculaire riche, des cellules et des fibres [3]. Il est en contact avec l’épiderme qu’il nourrit,
via une jonction dermo-épidermique contournée, composée de la membrane plasmique et
des hémidesmosomes des kératinocytes, de la lamina lucida traversée par des filaments
d’ancrage, de la lame basale et de la lame sous-basale traversée par des fibrilles d’ancrage
[3].
16
Le derme peut être subdivisé en deux couches de la profondeur vers la surface :
- La couche réticulaire est un tissu conjonctif dense, riche en fibres et pauvre en cellules. Sa
substance fondamentale est constituée d’acide hyaluronique et de sulfate de chondroïtine.
Elle est composée d’un réseau dense de faisceaux épais de fibres de collagènes, organisés en
trois directions, tous obliques par rapport à la surface de la peau. Ce réseau est complété par
des fibres de collagène plus fines et de fibres élastiques [4].
- La couche papillaire est un tissu conjonctif plus lâche, riche en fibroblastes et, dans une
moindre mesure, de mastocytes et d’histiocytes [2]. Elle est constituée de faisceaux de fibres
fins.
L’épaisseur du derme est comparable dans les deux espèces et varie de 1mm à 2,5 mm chez
le porc et de 1mm à 2 mm chez l’homme [2, 3]. Il existe une très forte homologie entre la
biochimie des principales protéines (collagènes notamment) et leur organisation dans les
matrices dermiques, humaine et porcine. La structure des matrices est histologiquement
similaire [12].
La jonction dermo-épidermique est moins contournée chez le porc que chez
l’homme, aussi les crêtes épidermiques et les papilles dermiques sont moins nettes. Les
fibres élastiques sont moins nombreuses chez le porc que chez l’homme [13, 14]. Les
mastocytes porcins apparaissent enveloppés par un matériel floculeux contrairement à ce
qui est décrit chez l’homme [5].
L’hypoderme
L’hypoderme est un tissu conjonctif lâche. Il est riche en lobules adipeux et
sépare le derme des tissus sous-jacents. On peut distinguer trois couches :
-Le muscle peaucier, très réduit dans les deux espèces étudiées,
-Le fascia conjonctif, composé de fibres de collagène parallèles à la surface de la peau,
-Le pannicule adipeux, composé d’adipocytes enclavés dans les espaces délimités par le
collagène dermique [3].
17
Le tissu adipeux sous-cutané est abondant dans les deux espèces mais reste plus développé
chez le porc [15].
Le réseau vasculaire
L’épiderme étant avasculaire, l’ensemble des structures vasculaires de la peau
se trouvent dans le derme et l’hypoderme. L’organisation du réseau vasculaire est
comparable dans les deux espèces [5, 8]. L’organisation du système artériel se fait en quatre
plexus. De grosses artères collatérales du réseau artériel musculaire traversent l’hypoderme
jusqu’à sa surface pour former un plexus profond sous-dermique. Ce plexus profond émet
des vaisseaux qui remontent dans le derme formant un plexus moyen d’où partent les
collatérales irrigant les annexes et des artères de petit calibre qui remontent jusqu’à la
surface du derme pour former le plexus sous-épidermique. De ce plexus sous-épidermique,
émanent des artérioles irriguant les papilles dermiques, formant le plexus sous-papillaire. Le
système veineux s’organise de manière analogue [3, 16]. Les annexes cutanées sont mieux
vascularisées chez le porc que chez l’homme [17].
Les annexes
Les structures annexes de la peau sont moins développées chez le porc que
chez l’homme. La peau de porc ne contient pas de glande sudoripare eccrine et les glandes
sudoripares apocrines et les glandes sébacées se repartissent sur toute la surface cutanée
[2].
Le follicule pileux s’organise sur une papille dermique vascularisée, coiffée de
cellules matricielles, dérivant de cellules du stratum germinativum, qui produisent le poil et
ses gaines épithéliales. Ces cellules du stratum germinativum forment un bourgeon
épidermique qui s’enfonce dans le derme. [3, 18]. L’homme, comme le porc, a une pilosité
réduite comparée à la majorité des autres mammifères [2, 14].
En cas de plaie peu profonde, la partie proximale du follicule pileux peut
persister et donner lieu, par l’intermédiaire des cellules de la gaine épithéliale externe du
follicule pileux, à une épidermisation en îlot [19, 20].
18
Epiderme
Derme
Convergence
-Epithélium stratifié kératinisé
-Epaisseur totale
-Populations cellulaires
-Biochimie des kératines
-Biochimie des lipides
-Tissu conjonctif dense
-Epaisseur totale
-Biochimie des collagènes
Hypoderme
-Tissu conjonctif lâche
Réseau vasculaire
-Organisation
-Densité
Glandes sébacées
Glandes annexes
Follicule pileux
Divergence
-Epaisseur du stratum
supérieure chez le porc
corneum
-Manteau floculeux mastocytaire
chez le porc
-Richesse en fibres élastiques chez
l’homme
-Epaisseur du pannicule adipeux
supérieure chez le porc
-Vascularisation des annexes plus
importante chez le porc
-Absence de glande sudoripare
eccrine chez le porc
-Répartition des glandes sudoripares
apocrines
-Distribution variable chez l’homme
-Organisation
-Densité
Tableau 2: Tableau comparatif des structures cutanées du porc et de l’homme.
Figure 2 : Histologies de peaux en coloration hémalun éosine.
Il existe une forte analogie structurelle entre la peau humaine (à gauche) et la peau de porc
(à droite). Le derme papillaire est beaucoup plus facilement identifiable chez l’homme.
19
Physiologie de la cicatrisation
Une plaie cutanée se définit comme une solution de continuité des structures
cutanées [21]. Sa réparation naturelle est la cicatrisation ; elle aboutit au comblement de la
perte de substance et à la réunion des berges de la plaie [20]. Une plaie cutanée peut être
induite par différents agents physiques ou chimiques et être, plus ou moins, étendue. Le
tissu cicatriciel n’est, généralement, qu’une reconstitution partielle et imparfaite du tissu
originel [20, 22]. On distingue, en fonction des lésions, de leur cause et leur durée
d’évolution, plusieurs types de plaies : les plaies aigues, les plaies chroniques et les plaies à
cicatrisation retardée [23]. De même, on distingue deux modes de cicatrisation : par
première ou par seconde intention. La cinétique de la cicatrisation peut se décomposer en
trois phases imbriquées et interdépendantes : la phase exsudative, la phase proliférative et
la phase maturative [21, 20, 24].
Phase exsudative
Il s’agit de la première phase de la cicatrisation. Elle débute immédiatement
après la formation de la plaie et dure environ 72 heures. Elle peut se décomposer en une
réaction vasculaire et une réaction inflammatoire. Elle aboutit à la formation d’un caillot qui
comble la plaie.
- Réaction vasculaire [21, 20, 25]:
Lors de la formation de la plaie cutanée, il y a des lésions de structures
vasculaires à l’origine d’une hémorragie. Ces lésions de l’endothélium vasculaire provoquent
la formation d’un clou plaquettaire. Les plaquettes ainsi agrégées libèrent des facteurs
phlogogènes comme la sérotonine à l’origine d’une vasoconstriction capillaire et des
glycoprotéines intervenant dans le processus de coagulation : le fibrinogène, la fibronectine,
le facteur Von Willebrand et la thrombospondine. Ces médiateurs, associés aux médiateurs
libérés par les cellules lésées, provoquent, entre autres, une vasoconstriction locale,
favorisent l’agrégation et l’activation plaquettaire, activent les voies de la coagulation et la
synthèse de fibrine aboutissant ainsi à la formation d’un clou hémostatique secondaire.
20
Figure 3 : Réaction vasculaire [24].
L’action des plaquettes et des différents acteurs de la coagulation aboutissent à la formation
d’un clou fibrocellulaire qui comble la plaie.
-Réaction inflammatoire [21, 20, 22, 26] :
L’histamine, libérée par les mastocytes et les plaquettes, ainsi que les
produits du catabolisme de l’acide arachinodique et l’activation des facteurs du
complément, sont à l’origine d’une vasodilatation locale, de l’augmentation de la
perméabilité membranaire et d’un chimiotactisme positif sur certains leucocytes.
L’ensemble des signes classiques de l’inflammation décrit par Celse : « rougeur, tuméfaction
avec chaleur et douleur » sont alors présents, accompagnés d’une colonisation de la plaie
par des leucocytes :
Les polynucléaires neutrophiles sont les premières cellules recrutées. Leurs
propriétés, opsonisante et phagocytaire, ainsi que la libération d’enzymes protéolytiques,
permettent la détersion de la plaie. La durée de leur présence dans la lésion dépend du
degré septique de la plaie, leur présence prolongée entraîne un retard de cicatrisation. Dans
le cas d’une plaie stérile, leur action n’excède pas 72 heures.
21
Les macrophages, issus des monocytes du torrent circulatoire, migrent
simultanément aux neutrophiles, mais de façon prolongée et moins intense, aussi sont-ils
majoritaires entre le troisième et le cinquième jour après la formation de la plaie. En plus de
leur rôle phagocytaire, les macrophages stimulent les différentes phases ultérieures de la
cicatrisation via les sécrétions de cytokines et de facteurs de croissance. Les macrophages
favorisent
la
fibroblastogenèse
et
la
neoangiogenèse.
Ainsi,
une
thérapie
immunosuppressive à base, par exemple, de corticoïdes ralentit fortement la cicatrisation.
Les lymphocytes n’apparaissent, au niveau de la lésion, qu’en dernier lieu, à
partir du troisième jour, et leur nombre est maximum au sixième jour. Leur rôle dans le
processus de cicatrisation est mineur. Leur présence devient essentielle lors d’infection de la
plaie. Si la plupart des lymphocytes T favorisent l’activité fibroblastique par leurs
lymphokines, d’autres populations de lymphocytes T, suppresseurs et cytotoxiques, ont un
effet néfaste sur la cicatrisation [27].
Figure 4 : Réaction inflammatoire [24].
Les leucocytes : neutrophiles puis mastocytes et enfin lymphocytes colonisent la plaie et
aboutissent à sa détersion.
Après détersion de la plaie, la neutralisation des médiateurs de l’inflammation
assure l’arrêt de la phase inflammatoire. La persistance de matériel étranger entraîne le
passage à la chronicité de la plaie.
22
Phase proliférative
Cette phase débute après la détersion correcte de la plaie lors de la phase
exsudative. Elle consiste en la multiplication et la migration des fibroblastes et des
kératinocytes et en leur activité de synthèse ainsi qu’en la néoangiogenèse. Elle aboutit à la
formation d’un tissu de granulation. Les facteurs de croissance, libérés par les granules
plaquettaires, Platelet Derived growth factor (PDGF), Transforming growth factor β (TGFβ),
Transforming growth factor α (TGFα) et Epidermal growth factor (EGF) favorisent le
deplacement et la division des cellules mésenchymateuses et épithéliales ainsi que la
synthèse de collagène et de glycosaminoglycanes [25, 28].
- Réparation dermique [24, 25, 29] :
Elle est le fait de l’activité fibroblastique. Ces fibroblastes sont issus de la
différenciation des fibrocytes associés à l’adventice des petits vaisseaux en marge de la plaie.
Ce recrutement nécessite des médiateurs comme le Fibroblast growth factor (FGF), le
Patelet Derived growth factor (PDGF), les dérivés du facteur 5a du complément (C5a), le
Leukotriène B4 (LTB4), le Transforming growth factor β (TGFβ) et l’interleukine 1 (IL-1) [28].
La migration de ces fibroblastes se fait au sein de la trame conjonctive de fibrine par
haptotactisme grâce à la présence de molécules d’attachement, libérées lors des phases
précédentes, en particulier de fibronectines. A partir du cinquième jour, les fibroblastes
sécrètent une matrice principalement composée de collagène de type III qui remplace, au
fur et à mesure, la matrice de fibrine qui subit une protéolyse contrôlée.
23
Figure 5 : Réparation dermique [24].
Les fibroblastes colonisent le clou fibrocellulaire et synthétisent la matrice collagénique du
tissu de granulation.
- Néoangiogenèse [19, 24, 25] :
La néovascularisation permet l’apport, aux fibroblastes, des éléments
nécessaires à la bonne synthèse collagénique. Les macrophages sont les premiers à coloniser
la trame de fibrine libérant leurs facteurs de croissance, suivent les fibroblastes puis les
bourgeons vasculaires. Les nouveaux vaisseaux proviennent des cellules endothéliales des
vaisseaux marginaux, qui subissent une stimulation, une migration et une prolifération,
avant de former des bourgeons vasculaires qui s’anastomosent. Les cellules endothéliales
des néo-capillaires participent grandement à la protéolyse contrôlée de la matrice de fibrine
permettant la progression des fibroblastes.
24
Figure 6 : Néoangiogénése [24].
Les bourgeons vasculaires irriguent le tissu de granulation et apportent aux fibroblastes les
nutriments nécessaires à la synthèse de collagène.
- La contraction de la plaie [30, 31, 32, 33] :
Il s’agit d’un mouvement centripète des berges de la plaie participant à la
diminution de sa surface. Cette contraction est inconstante et dépend de la nature de la
plaie, de son mode de cicatrisation et de sa localisation. Elle se produit, sous l’épithélium
néoformé, par l’action des myofibroblastes du tissu de granulation, plus riches en actine que
les fibroblastes du derme sain et, donc, plus contractiles. Elle débute lorsque le tissu de
granulation comble entièrement la perte de substance et cesse, par inhibition de contact,
lorsque les marges de pleine épaisseur se rencontrent. Il a été établi que le rôle de la
contraction dans la cicatrisation des plaies est primordial chez les espèces à peau très lâche
comme le rat ou le lapin, mais que ces mécanismes sont très limités chez les espèces à peau
épaisse et immobile comme l’homme ou le porc. L’intensité de l’adhérence, du derme au
tissu sous jacent, ne semble pas influencer la cinétique de fermeture de la plaie.
25
Figure 7 : Contraction de la plaie [24].
La contraction est inconstante et dépend de la nature de la plaie.
26
- Réparation épidermique [19, 21, 20, 25] :
Il s’agit de la reconstitution de l’épithélium stratifié kératinisé. Cette
épithélialisation se fait à partir des cellules du stratum germinativum des berges de la plaie,
de façon centripète et à partir des cellules marginales des follicules pileux de façon
centrifuge. Elle débute 48 heures après la formation de la plaie. Elle consiste en la libération
des kératinocytes marginaux de leurs jonctions intercellulaires leur permettant d’émettre
des pseudopodes et de synthétiser des filaments contractiles ce qui leur permet, ensuite, de
migrer par mouvements amiboïdes. La migration est inhibée par contact. La migration se fait
en « nappes » : des cellules basales « sautent » par dessus les cellules du bord de la plaie,
adhèrent à la lame basale et forment un socle basal au-dessus duquel de nouvelles cellules
vont pouvoir passer. Ce mode d’épithelialisation permet de maintenir une certaine fonction
barrière lors de la cicatrisation. L’épithélialisation peut être activée par des facteurs de
croissance qui peuvent agir sur l’activité mitotique des kératinocytes basaux ou accélérer
leur migration. Chez le porc, le keratinocyte growth factor (KGF) et le PDGF humains
accélèrent significativement l’épidermisation [34, 35, 36]. L’EGF humain favorise l’activité
mitotique des kératinocytes [37] mais aussi leur capacité à migrer [38] accélérant ainsi
l’épidermisation [36]. Le TGFα et l’IL-1 favorisent aussi la migration des kératinocytes [38].
27
Figure 8 : Réparation épidermique [24].
Les cellules basales de l’épiderme se multiplient et migrent sur le tissu de granulation jusqu’à
ce que les bords des lèvres entrent en contact.
28
Figure 9 : Réépidermisation [24].
Les kératinocytes basaux migrent, par mouvement amiboïde, jusqu’à subir une inhibition de
contact.
29
Phase de maturation
Il s’agit d’un ensemble de réarrangements, dans le tissu cicatriciel, qui aboutit
à la restitution des propriétés fonctionnelles de la peau. Cette phase est la plus longue, elle
peut durer 18 mois et ne débute que lorsque la réparation structurale est complète. On
observe, au cours de cette phase, un remplacement partiel du collagène III par du collagène
I, une réorientation et une réorganisation en faisceaux des fibres de collagène, une
diminution de la quantité de protéoglycannes et de fibronectines, une diminution de la
cellularité, la dissémination du nombre de capillaires et l’augmentation de leur diamètre.
Figure 10 : Chronologie des phases de la cicatrisation et éléments mis en jeu [25].
Les différentes phases de la cicatrisation sont superposées et interdépendantes.
30
Etude de l’efficacité d’un peptide à deux concentrations dans
l’épithélialisation de plaies cutanées superficielles
L’étude vise à évaluer l’effet d’un peptide, appliqué à deux concentrations
différentes, sur l’épithélialisation de plaies cutanées superficielles.
Introduction
Ce peptide a été développé à l’Institut de Biologie et Chimie des Protéines
(IBCP) par l’équipe du Dr Patricia Rousselle. Il s’agit d’un analogue de synthèse d’une
laminine constitutive de la lame basale de l’épiderme. Sa présence, dans des cultures in vitro
de kératinocytes, favorise leur migration et la régénération d’un épiderme pluristratifié. Afin
d’avoir un aperçu de l’effet de ce peptide sur la cicatrisation in vivo, nous réalisons un suivi
microscopique et macroscopique, de l’épithélialisation de plaies cutanées superficielles, chez
le porc. Le protocole choisi s’inspire de celui de plusieurs études, réalisées chez le porc, du
suivi de cicatrisation de plaies. Les protocoles de ces articles sont résumés dans le Tableau 3.
31
0,4
0,5
0,5
1,2
1,8 ou totale 20x20
Totale
Totale
Totale
Totale
Chvapil [40, 44]
Hong [37]
Lynch [42, 43]
Nanney [45]
Gallant [46]
Stahl [47]
Gross [32]
Yao [48]
Harunari [49]
8
6 à 26
16
6 ou 7
20
10 à 12
8
80
150 à 200
Nombre
Qualité et surface d’épithelium
Surface d’épithelium et de la plaie
Surface de la plaie
Surface de la plaie et inflammation
Contrôle photographique
Surface d’épithélium
Temps d’épithélialisation totale
Surface d’épithelium
Surface d’épithelium
Suivi macroscopique
Hémalun éosine : Epaisseur du derme et inflamation
Hémalun éosine , rouge sirius, trichrome de Mallory
Hémalun éosine et quantification ARN
Hémalun éosine et trichrome de Gomori
Hémalun éosine : épaisseur de l’épithelium
Hémalun éosine et Ki67
Hémalun éosine : épaisseur de l’épithelium
Suivi microscopique
Tableau 3 : Ensemble des protocoles des articles ayant inspiré le choix du protocole.
Le porc est un modèle expérimental très souvent utilisé pour le suivi de la cicatrisation cutanée. Il existe de nombreuses études proposant une
méthode expérimentale proche.
70x70
2,5 cm²
20x20
Ø6
25x25
10x20
40 x 40
22x22
7 x 10
0,3
Mertz [41]
Taille
Profondeur
1er auteur
Matériel et méthodes
Préparation des solutions
Nous disposons d’une solution aqueuse de peptide à 20 μg/mL et d’une
solution de peptide à 50 μg/mL qui nous ont été fournies par l’Institut de Biologie et Chimie
des Protéines (IBCP). Le témoin est une solution salée physiologique (NaCl à 0,9%).
Animaux
Deux porcs charcutiers femelles, de 4 mois, pesant environ 40 kg, ont été
acclimatés une semaine avant le début de l’expérimentation. Ces animaux sont hébergés en
box individuels à l’Institut Claude Bourgelat (ICB), selon leurs normes spécifiques de
températures et d’éclairement, nourris avec un aliment de base pour porc (Porc unique®,
lotte), rationné au poids de l’animal, et abreuvés à volonté avec l’eau du réseau communal.
Chaque porc est identifié par marquage à l’oreille. Une antibioprévention est réalisée à base
d’amoxicilline à 20 mg/kg et acide clavulanique à 5 mg/kg, deux fois par jour, à partir de la
veille du début de l’étude et, ce, pendant les deux semaines suivantes. Les deux animaux
sont euthanasiés à la fin de l’étude, sous anesthésie générale, par injection intracardiaque
ou IV de 6 mL de T61® (Hoechst-Roussel).
Réalisation des plaies cutanées superficielles
La création des plaies cutanées est réalisée sous anesthésie générale. Le
protocole anesthésique inclut une prémédication à base d’atropine (Atropine Aguettant®) à
0,04 mg/kg IM et d’azapérone (Stresnil®, Janssen-Cilag santé animale) à 1mg/kg IM, une
induction à base d’une association tilétamine et zolazepam (Zoletil®, Virbac) à 5mg/kg IM, et
un entretien par inhalation d’oxygène et d’isoflurane (Isoba®, Schering-Plough). Une
analgésie à base de morphine (Morphine Aguettant®), de 0,1 à 0, 3 mg/kg IV ou SC, est
prévue si nécessaire. Après tonte, sont effectués un lavage chirurgical avec un savon à base
de polyvidone iodée à 7,5% (Vétédine savon®, Vétoquinol), puis un rinçage avec du soluté
NaCl 0,9% et l’application de solution de polyvidone iodée à 10% (Vétédine solution®,
Vétoquinol).
33
Trois plaies, de 6x12cm, sont réalisées, de part et d’autre de la colonne vertébrale à l’aide
d’un dermatome (Aesculap®), d’une profondeur de 0,8 mm, comme l’illustrent les Figure 11
et Figure 12. Les plaies sont séparées d’au moins 3 à 4 cm. Une hémostase rigoureuse est
réalisée sans électrocoagulation. Après le dépôt du peptide, les plaies sont recouvertes d’un
pansement non adhérent, constitué d’Opsite®, de Melolin®, et de compresses, maintenues
en place à l’aide de Tensoplast® entourant le corps de l’animal.
Figure 11 : Réalisation des plaies au dermatome.
Le dermatome permet de réaliser des plaies d’une profondeur constante de 0,8mm.
34
Figure 12 : Les plaies réalisées sur le dos des porcs.
Deux sites témoins et quatre sites traités, disposés comme sur la figure, sont réalisés sur chaque
porc.
35
Traitement par le peptide
Sur chaque porc, sont réalisées six plaies : 4 sites traités et 2 sites témoins qui
on été tirés au sort. On traite les plaies du porc n°1 avec la solution à 20 μg/mL et celles du
porc n°2 avec celle à 50 μg/mL. Chaque plaie reçoit 1mL de solution. Les sites témoins
reçoivent 1mL de solution saline. Le premier traitement a lieu après l’hémostase des plaies,
le premier jour, puis le deuxième, quatrième et septième jour lors du changement de
pansements.
Changement des pansements
Le changement des pansements est réalisé, sous anesthésie générale, selon
un protocole simplifié : induction avec l’association de kétamine (Imalgène®, Virbac), à 10
mg/kg IM et de xylazine (Rompun®, Bayer santé animale) à 2mg/kg IM, entretien par
inhalation d’oxygène et d’isoflurane. Les pansements sont changés le deuxième, quatrième,
septième, neuvième, onzième, quatorzième, dix-septième, vingt-et-unième et vingtquatrième jour.
Examens cliniques
Lors de chaque changement de pansements, un examen macroscopique des
plaies est réalisé. Des calques de chaque plaie et de son épithélialisation sont réalisés et
identifiés. Des photos de chaque plaie sont prises, la plaie remplissant le champ de l’objectif,
et identifiées.
Examens histologiques et immunohistologiques
Lors de chaque changement de pansements, une biopsie est réalisée, sur un
site traité et sur un site témoin, pour chaque porc. Les sites sont prélevés à tour de rôle. Les
biopsies superficielles sont réalisées, en côte de melon, sur 1cm de long et 4 mm de large,
sur le front d’épithélialisation avec une lame de bistouri (Swann Morton n°22) puis fixées
dans du formol à 10% et identifiées. Les biopsies subissent une préparation standard après
inclusion en paraffine, elles sont coupées à 5 μm, colorées ou immunomarquées puis
observées au microscope optique.
Les colorations réalisées sont la coloration classique hémalun éosine et la
coloration à l’acide périodique réactif de Shiff qui souligne les lames basales.
36
Les immunomarquages réalisés sont le marquage KL1 qui marque les
cytokératines suprabasales et le marquage Ki67 qui marque les cellules en cycle.
Résultats
Macroscopiques
La surface épidermisée est déterminée à partir des photos et des calques
pour chaque sites. Ces surfaces, pour les sites traités et les sites témoins, sont comparées.
Les différents sites ne présentent une différence d’aspect macroscopique qu’à J7, aussi seuls
les résultats à J7 seront présentés. Les résultats cliniques à J7 sont présentés dans la Figure
13 pour le porc 1 et la Figure 15 pour le porc 2. Dans les Figure 14 et Figure 16, présentant
respectivement les calques des porcs 1 et 2, les zones épidermisées sont représentées en
rouge et le zones non épidermisées en jaune.
A partir de ces calques, le pourcentage de surface épithelialisée est classée
pour chaque plaie. Les résultats sont présentés dans le Tableau 4.
0 à 24%
25 à 49 %
50 à 74%
75à 99%
100%
Porc 1
Aucun
Té 1
Té 2
Tr C et Tr D
Tr A et Tr B
Porc 2
Aucun
Té 2
Té 1
Tr C et Tr D
Tr A et Tr B
Tableau 4 : Pourcentage de surface épithélialisée à J7.
La totalité des sites traités sont épithélisés à plus de 75%. La totalité des sites témoins sont
épithélisés à moins de 75%. (Té : témoin et Tr : traité).
37
Traité C
Témoin 2
Figure 13 : Plaies du porc 1 à J7
Traité A
Témoin 1
Traité D
Traité B
Traité C
Témoin 2
Figure 14 : Calques des plaies du porc 1 à J7
Traité A
Témoin 1
Traité D
Traité B
Traité C
Témoin 2
Figure 15 : Plaies du porc 2 à J7
Traité A
Témoin 1
Traité D
Traité B
Traité C
Témoin 2
Figure 16 : Calques des plaies du porc 2 à J7
Traité A
Témoin 1
Traité D
Traité B
Microscopiques
L’examen histologique, en coloration hémalun éosine, des lambeaux exportés
avec le dermatome révèle un aspect homogène et une profondeur identique. Le niveau de
section passe au sein du derme moyen, sous le niveau des isthmes folliculaires, et laisse en
place des bulbes pilaires.
Les résultats de l’examen histologique des biopsies, en colorations hémalun
éosine, sont consignés dans le Tableau 5 pour le porc 1 et le Tableau 6 pour le porc 2.
Figure 17 : Lèvre de la plaie du site traité du porc 1 à J2 en coloration Hémalun éosine.
L’extrémité de l’épiderme en contact avec la plaie s’affaisse et s’affine en descendant vers le
derme.
42
Jour Site
Traité
J2
Témoin
J4
Traité
Témoin
Traité
J7
Témoin
Traité
J9
Témoin
Traité
J11
Témoin
Traité
J14
Témoin
Observations
•Extrémité de l’épiderme en contact avec la plaie : mouvement descendant
de l’épiderme qui s’affaisse, en s’affinant, vers le derme. (figure 17)
•Absence de lésion épidermique et d’inflammation dermique
•Extrémité de l’épiderme en contact avec la plaie : mouvement descendant
de l’épiderme qui s’affaisse, en s’affinant, vers le derme.
•Présence d’une dégénérescence de l’épiderme, avec nécrose de
coagulation et présence de fibrine
•Inflammation,
congestion
et
œdème
dermiques,
infiltrat
inflammatoire suppuré
•Les kératinocytes des berges progressent et s’étalent sur le coagulum sousjacent ; l’avancée est de 458 µm par rapport au bord initial de la plaie
•Les kératinocytes basaux nouvellement formés sont plus massifs et
allongés que les kératinocytes « normaux »
•Début d’organisation du coagulum : colonisation par des cellules
inflammatoires et quelques cellules dermiques
Indisponible
•Tissu de granulation
•Le tissu de granulation comble entièrement la
de 359 µm d’épaisseur
plaie et un épiderme nouvellement formé couvre
•Tissu de granulation
ce tissu
de 264 µm d’épaisseur
•L’épidermisation est complète, le tissu de •Tissu de granulation
granulation contient de nombreux vaisseaux et de 278 µm d’épaisseur
fibroblastes.
•Tissu de granulation
•L’épiderme est acanthosique, avec absence de
de 132 µm d’épaisseur
crêtes épidermiques
•Une modification nette de la réorganisation du
tissu de granulation est observée par rapport à la
biopsie précédente : les fibres de collagène sont
•Le
tissu
de
orientées parallèlement à l’épiderme, le nombre
granulation reste très
de fibroblastes est diminué, la limite entre le tissu
inflammatoire
de granulation et le derme sous-jacent est moins
discernable.
• Poursuite de la réorganisation du tissu de granulation, avec diminution du
nombre de vaisseaux et de fibroblastes
• Début d’affinement de l’épiderme et réapparition des crêtes, dans les
zones sans inflammation sous-jacente.
Traité
• Poursuite lente de la réorganisation du tissu de granulation
Témoin
Traité
J21
• Aspect de peau normale
Témoin
Traité
•Aspect de peau normale
J24
• Nombreux petits granulomes inflammatoires à cellules géantes, parfois
Témoin
centrés sur un corps étranger, dispersés dans le derme, dans les deux sites
Tableau 5 : Résultats des examens histologiques en colorations hemalun éosine des
biopsies réalisées sur le porc 1.
J17
44
Jour Site
Traité
J2
Témoin
Traité
J4
Témoin
Traité
J7
Témoin
Traité
J9
Témoin
Traité
J11
Témoin
Traité
J14
Témoin
Observations
•Extrémité de l’épiderme en contact avec la plaie : mouvement
descendant de l’épiderme qui s’affaisse, en s’affinant, vers le derme.
•Présence d’une dégénérescence de l’épiderme, avec nécrose de
coagulation et présence de fibrine
•Inflammation,
congestion
et
œdème
dermiques,
infiltrat
inflammatoire suppuré
•Les kératinocytes des berges progressent et s’étalent sur le coagulum
sous-jacent ; l’avancée est de 292 µm par rapport au bord initial de la plaie
•Plaie entièrement comblée par le coagulum
•Croûtes sérocellulaires en surface
•Les kératinocytes des berges progressent et s’étalent sur la plaie, mais
absence de coagulum sous-jacent ; l’avancée est de 135 µm par rapport au
bord initial de la plaie
•Tissu de granulation de 271 µm
d’épaisseur
•Tissu de granulation de 282 µm
•Le Tissu de granulation comble
d’épaisseur
entièrement la plaie et un
•Solutions de continuité dans
épiderme nouvellement formé
l’épidermisation
(bourgeons
couvre ce tissu
d’épidermisation nettement situés
au dessus des sections folliculaires) ;
épidermisation retardée.
•L’épidermisation est complète, le •Tissu de granulation de 254 µm
tissu de granulation contient de d’épaisseur
nombreux vaisseaux et fibroblastes.
•Tissu de granulation de 120 µm
•L’épiderme est acanthosique, avec
d’épaisseur
absence de crêtes épidermiques
•Une modification nette de la réorganisation du tissu de granulation est
observée par rapport à la biopsie précédente : les fibres de collagène sont
orientées parallèlement à l’épiderme, le nombre de fibroblastes est
diminué, la limite entre le tissu de granulation et le derme sous-jacent est
moins discernable.
• Poursuite de la réorganisation du tissu de granulation, avec diminution
du nombre de vaisseaux et de fibroblastes
• Début d’affinement de l’épiderme et réapparition des crêtes, dans les
zones sans inflammation sous-jacente.
Traité
• Poursuite lente de la réorganisation du tissu de granulation
Témoin
Traité
J21
• Aspect de peau normale
Témoin
Traité
J24
•Aspect de peau normale
Témoin
Tableau 6 : Résultats des examens histologiques en colorations hemalun éosine des
biopsies réalisées sur le porc 2.
J17
45
La coloration au PAS permet de mettre en évidence les lames basales. Les
examens histologiques, en coloration PAS, révèlent que la membrane basale néoformée est
bien visible presque jusqu’à l’extrémité de la lèvre de la plaie dans les sites traités alors
qu’elle ne l’est qu’à une certaine distance, en retrait, dans les sites témoins.
Figure 18 : Histologies en coloration PAS du porc 2 à J4.
La distance (double flèche) en l’extrémité de la membrane basale néoformée et l’extrémité
de la plaie est de 400 µm sur le site témoin (en haut) et de 80 µm sur le site traité (en bas).
46
L’immunomarquage à l’anticorps Ki67 colore le noyau des cellules en division
cellulaire. Les examens immunohistologiques avec marquage du Ki67 ne révèlent aucune
différence entre les différents sites des deux porcs. Toutefois, si dans les sites témoins de
nombreuses cellules basales et suprabasales sont positives, seules les cellules basales, à
quelques exceptions près, sont positives dans les sites traités.
Figure 19 : Immunomarquages au Ki67 du porc 1 à J9.
L’immunohistologie du site traité (en bas) révèle des cellules en division dans la couche
basale, celle du site témoin (en haut) révèle aussi des cellules marquées dans les couches
suprabasales (flèche).
47
L’immunomarquage à l’anticorps Kl1 marque les kératines suprabasales. Les
examens immunohistologiques avec marquage à l’aide de l’anticorp KL1 révèlent que de
nombreuses cellules suprabasales ne sont pas marquées dans les sites témoins (celles qui
étaient marquées par l’anticorp Ki67), alors que toutes les cellules suprabasales, ou presque,
le sont dans les sites traités.
Figure 20 : Immunomarquages au KL1 du porc 1 à J2.
L’immunohistologie du site traité (en bas) révèle que toutes les cellules suprabasales sont
marquées, celle du site témoin (en haut) révèle des cellules non marquées dans les couches
suprabasales (flèche).
48
Discussion
Tout d’abord, il convient de rappeler que les résultats obtenus ne seront pas
exploités dans l’optique de mettre en évidence un effet significatif ou non du peptide sur la
cicatrisation mais plutôt dans le but d’avoir un premier aperçu de l’influence du peptide in
vivo sur la cicatrisation. Les premiers résultats in vivo permettant, ou non, d’envisager une
étude plus coûteuse. Cette étude n’est donc que le préambule d’éventuels essais, à plus
grande échelle, dans le but d’un possible développement commercial.
Du suivi macroscopique
Les résultats macroscopiques ne présentent de différences entre les sites,
témoins et traités, qu’à J7 et indiquent, pour le porc 1 et le porc 2 de manière équivalente,
une épidermisation complète des sites traités A et B et la persistance de quelques petites
zones non épidermisées des sites traités C et D,
à comparer aux larges zones non
épidermisées des sites non traités. On ne peut pas mettre en évidence un effet de la
concentration du peptide sur l’épidermisation du point de vue macroscopique. Cependant,
chez nos deux sujets à J7, 100% des sites témoins ne sont pas totalement épidermisés pour
seulement 50% des sites traités. De plus, 100% des sites traités sont épithélialisés à plus de
75% alors que 100% des sites témoins sont épithélialisés à moins de 75%. Ceci laisse
présager d’un effet positif de l’application du peptide sur la cicatrisation épidermique des
plaies. Par ailleurs, on ne peut pas exclure un effet « zone » sur la vitesse de cicatrisation : en
effet, certaines plaies sont localisées dans des zones plus mobiles du dos de l’animal. On
peut, à posteriori, regretter de ne pas avoir réalisé plus d’examens macroscopiques entre J4
et J9, quitte à les espacer après J9 quand l’épidermisation est cliniquement complète. De
même, il aurait peut-être été préférable d’exporter une partie plus épaisse de la peau afin de
limiter l’épidermisation en îlots dans le lit des
plaies et de n’avoir qu’un front
d’épidermisation centripète.
49
Du suivi microscopique
En reprenant les résultats de l’examen microscopique, on observe qu’à J2
pour le porc 1, le site traité est moins inflammatoire que le site témoin et que l’épiderme
néoformé est de meilleure qualité, alors que pour le porc 2, les sites ne présentent aucune
différence. Il est peu probable que ceci soit dû à un effet du peptide et il est plus raisonnable
d’incriminer, soit un effet mécanique par frottement du pansement, par exemple, soit une
composante infectieuse mineure.
Les observations faites à J4 semblent plus pertinentes. Pour les deux porcs, on
observe un coagulum en début d’organisation dans les sites traités alors qu’il n’y en a pas
dans les sites témoins. D’autre part, l’avancée de l’épiderme, par rapport au bord initial de
la plaie, semble supérieure dans les sites traités par rapport aux sites témoins, suggérant un
déplacement des kératinocytes basaux plus précoce et plus rapide.
Les examens histologiques à J7 tendent à corroborer les observations
cliniques décrites plus haut. Si, pour le porc 1 dans les deux sites, la plaie est entièrement
comblée par un tissu de granulation recouvert en totalité par un épiderme (dans les deux
cas, la biopsie a été réalisée sur un bord déjà épidermisé du site), pour le porc 2, la plaie est
entièrement comblée par un tissu de granulation dans les deux sites, mais, en revanche, le
site traité est épidermisé en totalité alors que le site témoin présente une épidermisation
incomplète. Par ailleurs, à J7 comme à J9, le tissu de granulation est plus épais dans les sites
traités que dans les sites témoins.
50
Globale
Il semble pertinent de retenir, dans les sites traités, l’importance de l’avancée
de la lèvre d’épidermisation associée à l’avancée de la lame basale à J4, la grande surface
épidermisée à J7, l’épaisseur du derme néoformé à J9, ainsi que la répartition des
kératinocytes en mitose, au niveau de la couche basale, et des kératinocytes en cours de
différenciation dans les couches suprabasales. L’ensemble de ces résultats suggère un effet
du peptide sur la migration des kératinocytes basaux, à l’origine d’une meilleure
organisation des couches cellulaires dans l’épithélium néoformé, et accélérant, de ce fait
l’epidermisation. Par contre, aucun résultat ne permet de conclure quant à l’efficacité
comparée des deux concentrations de peptide. Toutefois, on rappelle, là encore, que les
données sont insuffisantes pour être significatives. Elles permettent, tout au plus, de
présumer d’un mode d’action du peptide sur l’épidermisation et d’orienter d’éventuelles
études plus approfondies de l’efficacité de ce peptide.
51
Détermination de la profondeur d’excision nécessaire pour retirer
l’ensemble des bulbes des follicules pileux au dermatome.
L’étude vise à déterminer à partir de quelle profondeur d’excision des
lambeaux cutanés la totalité des follicules pileux sont exportés.
Introduction
Les follicules pileux persistants dans le lite de la plaie donnent lieu à une
épidermisation cicatricielle en îlot [19, 20]. Or pour le suivi macroscopique de
l’épithélialisation des plaies, l’existence d’un front d’épidermisation unique, progressant de
façon centripète depuis les marges de la plaie, est préférable. D’autre part, on peut penser
que la cicatrisation serait moins rapide sans le phénomène d’épidermisation depuis les
follicules pileux, permettant ainsi un meilleur suivi clinique de la progression du nouvel
épiderme. Nous cherchons, donc, à déterminer une profondeur de plaie minimale
permettant le retrait des bulbes folliculaires.
Chez le chien, cette profondeur à été déterminée à 0,7 mm, dans le cadre de
travaux sur les greffes de peaux [50]. Bien que les perspectives soient différentes pour le
porc, nous adoptons un protocole expérimental comparable.
Matériel et méthodes
Animaux
Cinq porcs charcutiers femelles de 4 mois pesant environ 40 kg ont été
acclimatés une semaine avant le début de l’expérimentation. N’ayant pas été retenus pour
entrer dans le protocole d’une autre étude, sans rapport avec celle-ci, les cinq animaux sont
euthanasiés sous anesthésie générale par injection, intracardiaque ou IV, de 6 mL de T61®
(Hoechst-Roussel). Le protocole anesthésique prévoit une induction avec une association de
kétamine (Imalgène®, Virbac) à 10 mg/kg IM et de xylazine (Rompun®, Bayer santé animale) à
2mg/kg IM.
53
Réalisation des plaies cutanées superficielles
Six plaies de 6x4cm, d’une profondeur de variant de 0,7 mm à 1,2 mm par pas
de 0,1 mm, sont réalisées, l’aide d’un dermatome (Aesculap®), sur le dos de l’animal, mort,
juste après son euthanasie.,
Figure 21 : Excisions réalisés au dermatome® sur le dos d’un porc.
La profondeur des plaies varie entre 0,7 mm et 1,2 mm par pas de 0,1 mm.
Examens histologiques
Lors de la réalisation des plaies, les lambeaux exportés sont identifiés et fixés
dans du formol à 10%. Des biopsies du fond de chaque plaie, sont réalisées au trépan à
biopsie de 6 mm puis fixées dans du formol à 10% et identifiées. Les lambeaux et les biopsies
subissent une préparation standard puis une inclusion en paraffine. Elles sont ensuite
coupées à 5 μm, et colorées à l’hémalun éosine puis observées au microscope optique. On
évalue la présence (+) ou l’absence (-) de follicule pileux dans le lambeau exporté et dans le
fond de la plaie comme dans la Figure 22.
Résultats
54
Chez les porcs 1, 2, 3 et 4, pour lesquels les biopsies sont interprétables, on
observe la persistance de follicules pileux jusqu’à une profondeur d’excision de 0,8mm. Pour
les porcs 1 et 4, on observe encore des follicules dans le fond de la plaie jusqu’à 1 mm. Les
résultats complets sont présentés dans le Tableau 7.
0,7
0,8
0,9
1
1,1
1 ,2
Lambeau +
+
+
+
+
Porc 1
Fond
+
+
+
Lambeau +
+
+
+
+
+
Porc 2
Fond
+
+
Lambeau +
+
+
+
+
+
Porc 3
Fond
+
+
Lambeau +
+
+
+
+
+
Porc 4
Fond
+
+
+
+
Lambeau Non lu
Non lu
+
+
+
Porc 5
Fond
Non lu
Non lu
Tableau 7 : Résultats des examens histologiques des lambeaux exportés et des biopsies de
fond de plaies à différentes profondeurs.
Figure 22 : Histologie des lambeaux exportés et des fonds de plaie
On note la présence d’un follicule pileux entier retiré avec le lambeau de 1,1mm exporté
chez le porc 4 (à gauche) et la présence d’un follicule pileux persistant dans le fond de la
plaie à 0,7mm chez le porc 1 (à droite).
Discussion
55
Précisons tout d’abord que nous ne tiendrons pas compte des résultats
obtenus chez le porc 5 dans la mesure où deux des biopsies ne sont pas exploitables. De
plus, l’épaisseur des lambeaux, estimée en histologie, ne correspond pas à la profondeur de
coupe, réalisé au dermatome. Ceci est très certainement imputable à une mauvaise
manipulation lors de la recoupe des biopsies ou de l’inclusion en paraffine. Rappelons
ensuite, que le porc présentant une faible densité de follicules pileux, il est possible
d’obtenir une inclusion de lambeau de peau sans follicule pileux, ce qui explique, par
exemple, l’absence de follicule dans le lambeau du porc 1 à 0,7mm, malgré leur présence sur
la biopsie du fond de la plaie.
Chez les porcs 2 et 3, une profondeur de coupe à 0,9 mm semble permettre
de retirer l’ensemble des follicules pileux alors que, chez les porcs 1 et 4, une coupe à une
profondeur de 1,0 mm laisse encore quelques follicules présents. Aussi, la profondeur de
coupe minimale permettant le retrait de tous les follicules pileux chez l’ensemble de nos
quatre porcs semble être de 1,1mm. Cependant, avec une excision à 0,9 ou 1 mm, on
s’affranchit déjà de la présence d’une très grande partie des follicules. Ainsi, l’influence sur la
cicatrisation, des rares follicules isolés persistants avec une excision à 0,9 mm, est
discutable. Dans le cadre d’une étude clinique, sur l’épidermisation cicatricielle de plaies
superficielles, il faudrait donc choisir une profondeur de coupe suffisante pour exporter,
sinon la totalité, au minimum la grande majorité des bulbes pileux profonds, mais assez
faible pour limiter les phénomènes de contraction de plaie et de cicatrisation dermique.
Dans notre étude sur l’efficacité du peptide, nous avions choisi une profondeur de 0,8 mm.
Suite à ce travail, pour une étude clinique plus approfondie des effets de ce peptide, une
profondeur supérieure semble préférable.
56
CONCLUSION
57
BIBLIOGRAPHIE
Par ordre d’apparition
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65
ANNEXES
Annexe 1 : Anesthésie, analgésie, antibioprophylaxie.
Pré médication (20 à 30min avant anesthésie)
 Atropine Sulfate: 0,04 mg/kg (IM)
 Azaperone (Stresnil): 1 mg/kg (IM profonde)
Anesthésie
 Tiletamine + zolazepam (Zoletil): 5mg/kg, puis lorsque l'animal est inconscient:
 Intubation, et relais avec isoflurane + O2 à 1,5-2% (5% pendant quelques minutes si
l'animal n'est pas suffisamment endormi)
Analgésie
- pré-op:
 morphine 0,1 à 0,3mg/kg IV ou SC
- per-op:
 morphine 0,1 à 0,3 mg/kg IV ou SC, à la demande.
- post-op:
 1 injection morphine 0,1 à 0,3 mg/kg SC renouvelable si nécessaire.
 patch fentanyl (Durogesic) 50µg/h (éventuellement renouvelé toutes les
48 à 72h)
Antibioprophylaxie
pré-op: amoxicilline/acide clavulanique (20mg/kg + 5mg/kg) PO, matin et soir, à partir de J-1.
post-op: amoxicilline/acide clavulanique (20mg/kg + 5mg/kg), PO, matin et soir, pendant 2 à
4 semaines, selon l’aspect des plaies.
66
Annexe 2 : Fiches de suivi
Porc N°1 - Concentration de 20 µg/mL
Jour Prise de Réalisation Site traité Site témoin Dépôt du Commentaires
photos
de calques
biopsié
biopsié
peptide
J1
J2
J4
J7
J9
J11
J15
J18
J22
J25
Porc N° 2 - Concentration de 50 µg/mL
Jour Prise de Réalisation Site traité Site témoin Dépôt du Commentaires
photos
de calques
biopsié
biopsié
peptide
J1
J2
J4
J7
J9
J11
J15
J18
J22
J25
67
x
V
5
x
x
x
x
Ma Me J
2
3
4
x
x
x
x
x
4
x
x
3
2
1
+ une biopsie du lambeau exporté
Date (mars)
Jour
Intervention
Pansements
Peptide
Biopsies
(2, 6 à J24)
Photos et
calques
Annexe 3 : Calendrier (par porc)
S
6
5
D
7
6
L
8
x
x
x
x
7
x
x
x
9
Ma Me
9
10
8
J
V
11 12
x
x
x
10 11
S
13
12
D
14
13
L
15
x
x
x
14
Ma
16
15
Me
17
16
J
V
18 19
x
x
x
17 18
S
20
19
D
21
20
L
22
x
x
x
21
Ma
23
22
Me
24
23
J
25
x
x
10
24
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DELEAGE Alexandre
Mise en évidence de l'effet d'un peptide sur l'épidermisation dans un modèle
expérimental de cicatrisation épidermique chez le porc
Thèse d’Etat de Doctorat Vétérinaire : Lyon, le 12 Décembre 2011
RESUME :
Le porc est, actuellement, le meilleur modèle animal, pour l’étude in vivo des phénomènes
de cicatrisation cutanée chez l’homme. C’est donc ce modèle que nous avons choisi pour
l’étude de l’efficacité d’un peptide sur la cicatrisation de plaies cutanées superficielles. Apres
avoir tout d’abord rappelé les raisons anatomiques et physiologiques qui font du porc un
bon modèle expérimental pour l’étude de la cicatrisation cutanée, nous présentons une
étude, de l’efficacité d’un peptide de synthèse sur la cicatrisation épidermique de plaies
cutanées superficielles. Enfin, nous envisageons comment améliorer le protocole
expérimental choisi en déterminant la profondeur d’excision nécessaire pour retirer la
totalité des follicules pileux
MOTS CLES :
-Cicatrisation
-Porc
-Peau--Maladies
-Peptides
-Epiderme
JURY :
Président :
1er Assesseur :
2ème Assesseur :
Monsieur le Professeur Jean-François NICOLAS
Monsieur le Professeur Didier PIN
Monsieur le Professeur François GARNIER
DATE DE SOUTENANCE : 12 Décembre 2011
ADRESSE DE L’AUTEUR :
43 rue saint Romain 69008 LYON