3_Bistabilite dans la glycolyse - ESI

Flux métabolique
3. Bistabilité dans la glycolyse
Rôle des isoenzymes
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Bistabilité - un commutateur physiologique en métabolisme énergétique
 La glycolyse est la voie métabolique centrale pour générer de l'ATP et la synthèse des
précurseurs pour le métabolisme des nucléotides, des phospholipides et des acides
aminés.
 Le flux glycolytique est élevé dans les cellules cancéreuses par rapport aux tissus adultes
normaux et de grandes quantités de glucose consommé sont détournées vers la
production de lactate, un phénomène connu comme l'effet Warburg. Ce même
comportement est également typique des tissus hautement prolifératifs tels que les tissus
fœtaux et les cellules souches.
 En revanche, les cellules quiescentes ont de faibles flux glycolytiques, et consomment le
glucose à des taux faibles tout en catabolisant la plupart de ce glucose en dioxyde de
carbone.
 Cette différence d'activité glycolytique, constatée dans des cellules différentes, est
accomplie grâce à des niveaux de régulation différents.
o Des exemples en sont la rétro-inhibition (rétroaction négative) allostérique et
l’activation allostérique en aval exercées par les métabolites intermédiaires des
enzymes glycolytiques.
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Régulation allostérique d’enzymes glycolytiques
 Un rôle central est joué par trois enzymes,
o la phosphofructokinase (PFK),
o le pyruvate kinase (PK) et
o la phosphofructokinase / fructose-2,6bisphosphatase (PFKFB)
à travers l’inhibition ou l'activation par trois
intermédiaires réactionnels dans la glycolyse:
o le fructose-1,6-bisphosphate (F16BP),
o le fructose 2,6-diphosphate (F26BP) et
o le phosphoénolpyruvate (PEP).
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Expression d’isoformes en fonction du tissu concerné
 Ces enzymes glycolytiques ont des isoformes multiples (PFKL/M/P, PKM1/M2/L/R et
PFKFB1-4) qui sont soumises à des régulations allostériques différentes.
o Chaque isoforme, par conséquent, influence le flux glycolytique d'une manière
distincte.
 Des tissus et des cellules différents expriment des combinaisons d’isoformes de ces
enzymes distinctes, donnant ainsi lieu à un comportement spécifique de flux
glycolytique qui satisfait les besoins biosynthétiques et énergétiques du type de
cellules en question.
 En général, l'expression des isoformes d'enzymes glycolytiques et leur régulation sont
étroitement liées au contrôle de la croissance cellulaire.
 Il y a des validations croissantes qui indiquent que la perte en contrôle de la croissance
tel que dans la formation de tumeurs, due à des mutations dans les proto-oncogènes
et gènes suppresseurs de tumeurs, est accompagnée par l'altération de l'expression
spécifique d'isoenzymes glycolytiques. Une reprogrammation métabolique s’ensuit.
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Signalisation dans la régulation du flux glycolytique
 Un aspect supplémentaire de la régulation du flux glycolytique est leur modulation due aux
voies de signalisation.
 Les voies de signalisation admettent un comportement du flux glycolytique distinct des
isoformes présentes; ici l'action des voies de signalisation modifie plutôt le comportement
cinétique de l'enzyme cible au lieu d’induire un nouvel isozyme.
o Signalisation par une tyrosine kinase modifie le comportement cinétique de l’isoforme
PKM2 en modulant son comportement allostérique.
o De même, les événements de signalisation déclenchés par le glucagon dans les
hépatocytes modifient la cinétique de l'isoenzyme du foie de PK.
o Protéines kinases A/B/C (PKA, PKB et PKC) se sont avérées influencer la cinétique
d'isoformes PFKFB.
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Biologie systémique
 La composition des isoenzymes glycolytiques, et leurs couches multiples de régulation sont
centrales au contrôle de flux glycolytique et jouent un rôle clé dans la croissance cellulaire et
l'homéostasie.
 Une compréhension globale de l'effet de différentes combinaisons d’isoformes sur le
comportement du flux de la voie de la glycolyse dans son ensemble nécessite une approche
systémique.
 La biologie des systèmes (ou biologie systémique) est la modélisation informatique et
mathématique des systèmes biologiques complexes et est utilisée pour modéliser les états de flux
possible dans la voie glycolytique.
o Un modèle mathématique a été basé sur des équations décrivant la cinétique de toutes les
enzymes et les transporteurs dans la voie glycolytique [1].
 Exemple : L'équation de vitesse pour PFKFB et les constantes cinétiques ont été prises à partir
d'études précédemment rapportées dans la littérature. PFKFB est une enzyme bifonctionnelle avec
les activités de kinase et bisphosphatase distincte, c’est-à-dire avec des sites actifs séparés et
indépendants de l'autre.
o Le kinase (rPFK2) suit la cinétique bi bi ordonnée, avec PEP comme inhibiteur non compétitif.
o Le bisphosphatase (rF2,6BPase) est celle de Michaelis-Menten avec inhibition non compétitive
par le produit F6P.
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L'équation de vitesse pour PFKFB et les constantes cinétiques
 Isoenzymes de PFKFB diffèrent dans leur rapport en activité kinase et bisphosphatase (ratio K/P). Le
choix de l'isoenzyme (ou K/P) a été modélisé en changeant Vmax de rPFK2 et en gardant Vmax de
rF2,6BPase constante.
V f ,PFK 2  41.6 mM h 1
2
KmPFK
, ATP  0.15 mM
2
KmPFK
, F 6 P  0.032 mM
2
KmPFK
, F 26 BP  0.008 mM
K
PFK 2
m , ADP
 0.062 mM
2
KiPFK
, ATP  0.15 mM
K
PFK 2
i ,F 6 P
 0.001 mM
2
KiPFK
, F 26 BP  0.02 mM
K
PFK 2
i , ADP
 0.23 mM
2
KiPFK
, PEP  0.013 mM
rPFK 2
 c c

Cc Cc
V f ,PFK 2  C ATP
CF 6 P  ADP F 26 BP 

K eq ,PFK 2 


2
c
2
c
 PFK 2 PFK 2
K mPFK
K mPFK
, ADP C F 26 B [
, F 26 B [C ADP
PFK 2
c
PFK 2 c

 Ki , ATP K m ,F 6 P  K m ,F 6 PC ATP  K m , ATPCF 6 P 
K eq ,PFK 2
K eq ,PFK 2

c
 C ATP
CFc 6 P 

2
c
c
PFK 2 c
c
c
K mPFK
C ADP
CFc 26 BP K m , ATPC ADPCF 6 P
, ADP C ATP CF 26 BP


2
2
K eq ,PFK 2 KiPFK
K eq ,PFK 2
KiPFK
, ATP
, ADP
activité
kinase
c
c
c

C ATP
CFc 6 PCFc 26 BP C ADP
CFc 6 PCFc 26 BP  
CPEP

1



PFK 2
PFK 2 
PFK
2
Ki ,F 26 BP
K eq ,PFK 2 Ki ,F 6 P   Ki ,PEP 
KeqPFK 2  16
activité
phosphatase
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rF 2,6 BPase
VF 2,6 BPaseCFc 26 BP


CFc 6 P  F 2,6 BPase
c
 1  F 2,6 BPase   K m ,F 26 BP  CF 26 BP 
Ki , F 6 P


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VF 2,6 BPase  11.78 mM -1h-1
BPase
3
KmF,2,6
F 26 BP  1*10 mM
BPase
KiF,F2,6
 25*103 mM
6P
7
Biologie systémique (suite)
 La solution mathématique comporte deux volets: celle décrivant l’état stationnaire et
celle correspondant à l’état préstationnaire.
 Le résultat démontre que la glycolyse présente un comportement classique avec des
états stationnaires multiples en termes de flux par rapport à la concentration en
glucose.
 La multiplicité des états stationnaires sépare le métabolisme cellulaire en états
distincts: des états ayant un flux glycolytique élevé et des états avec des flux
glycolytiques faibles.
 Un tel comportement bistable découle de la régulation allostérique complexe qui
dépend à leur tour du type d’isoenzymes glycolytiques exprimés.
o La présence d’isoenzymes du muscle ou du foie de PFK et/ou d’isoformes L, R ou
M2 de PK est nécessaire pour donner lieu à la multistabilité en flux glycolytique.
o Les prédictions de modélisation ont été étayées par des données d'expression des
gènes provenant de divers tissus ainsi que les données expérimentales des cellules
HeLa.
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Bistabilité dans les circuits de régulation
 Il a été montré qu’un comportement bistable agit comme un interrupteur robuste dans de
nombreux circuits de régulation, y compris:
o La maturation des cellules d'oocytes [2].
o La transition entre l’état de repos à l’état prolifératif des cellules mammifères [3].
o La transition entre les états stables de phosphorylation multiples dans les systèmes de
phosphorylation à site multiple [4].
Simulation de flux au niveau du nœud de fructose 6-P
 Phosphofructokinase (PFK) est une enzyme clé dans la glycolyse et existe sous trois isoformes
distinctes.
o Les isozymes du muscle (PFKM) et du foie (PFKL) sont sous activation allostérique
(rétroaction) par F16BP, à divers degrés.
 L’isozyme de plaquette (PFKP), par contre, ne répond pas au contrôle allostérique.
o Les valeurs des paramètres cinétiques correspondant à chaque isozyme ont été obtenues à
partir de la littérature scientifique dans laquelle les valeurs avaient été déterminées
expérimentalement.
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Multiplicité des états stationnaires au nœud F6P
Rétroactivation de PFK par F16BP
Plusieurs solutions possibles
(B) Bistabilité dans la cinétique de PFK
due à la régulation par rétroactivation
de F16BP. La simulation a été
effectuée en utilisant seulement deux
enzymes: PFK et Aldolase (ALDO).
[F6P] était variée et l'état stationnaire
du flux a été résolu algébriquement.
L'activation de PFK par F16BP a été
fixée à KPFK, F16P = 0.65 mM.
Figures 1
Régulation allostérique au nœud F6P
(D) Modulation de la gamme de
bistabilité par le rapport K/P de
PFKFB. L’enzyme bifonctionnelle
PFKFB a été incorporée dans les
calculs de flux avec PFK et ALDO afin
de créer un système de trois enzymes.
Des simulations ont été effectuées à
différentes valeurs de K/P de PFKFB
tout en conservant toutes les autres
conditions comme en (B).
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Caractéristiques du flux en région bistable
 Dans la région bistable, le flux peut être dans un état
stationnaire, soit de faible ou de haut flux, selon l'état antérieur
du système.
Figure 1B
 Les entre-deux états sont instables par nature; ils ne sont jamais
réalisés expérimentalement;
o ces états surviennent parce que plus d'une solution est
possible pour une [F6P] donnée dans cette gamme de
concentration.
 Lorsque la concentration de F6P est variée lentement, le flux de
PFK change le long des tracés correspondant uniquement aux
états stationnaires stables.
 Le système est caractérisé par des états de flux faible et flux
haut bien séparés, correspondant à des [F6P] « switchup » et « switch-down » distinctes.
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 À l’état de flux faible, au fur et à mesure que la concentration
de F6P augmente, le flux suit le tracé bas de l'état stationnaire
jusqu'à ce que la concentration en F6P atteigne 0.3 mM (la
concentration de « switch-up », figure 1B), puis le système
subit une transition nette vers un état de haut flux.
 Des augmentations supplémentaires en [F6P] déplacent le
système plus loin le long du tracé correspondant à l'état
stationnaire de haut flux.
Figure 1B
 Inversement, si le système est initialement à un état de haut
flux, au fur et à mesure que la [F6P] diminue, le flux reste à
l'état haut jusqu'à ce que la [F6P] diminue à 0.09 mM (la
concentration « switch-down », figure 1B) où il descend
rapidement à l'état de flux faible.
 Une fois que le système a changé de l'état de faible flux à l'état
de haut flux, ou vice versa, il ne retourne pas à l'état d'origine
suite à de petites fluctuations en [F6P] dans la zone de
concentration « switch up ».
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 Les trois isozymes de PFK sont activés par F26BP et
l'enzyme bifonctionnelle PFKFB catalyse à la fois la
formation et la dégradation de F26BP (figure 1C).
 La concentration à l'état stationnaire de F26BP n’est
donc pas affectée par le niveau d'expression de
PFKFB, mais par l'équilibre entre les activités
relatives des domaines kinase (K) et bisphosphatase
(P) de PFKFB.
Figure 1C
o Ainsi, le flux à travers PFK est indirectement
influencé par le rapport de l'activité K à P de
PFKFB, également appelé ratio K/P.
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 Les différents isozymes de PFKFB possèdent différents
ratios K/P donnant lieu ainsi à des comportements
différents en état stationnaire au niveau du nœud F6P
(figure 1D).
o L'isoforme du cerveau de PFKFB3 (avec K/P  700)
aura une concentration inférieure de F6P
« switch up » par rapport à la PFKFB1 isoforme
musculaire (K/P  0.4).
Figure 1D
 De plus, les régulations d’isozymes PFKFB par des
hormones ou des facteurs de croissance peuvent
moduler le ratio K/P.
o Un tel contrôle munit les cellules avec les
capacités nécessaires afin de moduler le
comportement de l'état stationnaire au nœud F6P,
sans subir un changement dans la composition de
leur isozyme (effet chronique).
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Comportement bistable dans la glycolyse
 Extension de l’analyse à l’ensemble de la voie glycolytique en mettant l’accent sur les
régulations de PFK, PFKFB et PK.
o La rétro-inhibition par G6P de HK et l'activation en aval de PFK par F26BP ont été
utilisées dans toutes les simulations.
 Les éléments de régulation de PFK, PFKFB et PK se regroupent en deux boucles de
contrôle:
o Boucle 1 incluse: la rétroactivation de la PFK par F16BP et l'activation de la PFK
par F26BP.
o Boucle 2 comprend trois éléments de régulation: l’activation en aval de PK par
F16BP, la rétro-inhibition de la PFKFB par PEP et l'activation de la PFK de F26BP.
 Les trois éléments de régulation allostérique dans la boucle 2, lorsqu'elles
sont actives simultanément, donnent un aperçu de la rétroactivation sur
l’ensemble de la voie glycolytique.
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Comportement bistable dans la glycolyse
 La présence ou l'absence de contrôles allostériques en boucle 1 et boucle 2 est
déterminée par les isozymes présents dans la voie d’un tissu donné (Tableau 1).
o Boucle 1 utilise les isoformes du muscle ou foie de PFK (PFKM ou PFKL), mais pas
l'isoforme de plaquettes (PFKP) puisque celui-ci n'a pas de rétroactivation par
F16BP.
o Boucle 2 fait fonctionner les isoformes de foie (PKL) ou de globules rouges (PKR)
ou fœtal (transformé) (PKM2), qui sont fortement activés par F16BP, mais pas
l'isoforme M1 (PKM1).
 En fonction de quel isozyme est présent, la voie glycolytique dans un tissu ou une
cellule peuvent subir des contrôles allostériques de la boucle 1, de la boucle 2, des
deux ou d’aucun des deux.
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Tableau 1. Propriétés
cinétiques et régulations
allostériques des enzymes de
la glycolyse exprimées dans
les cellules de mammifères.
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Flux glycolytique stationnaire avec boucle 1 et boucle 2 inactives
Figure 2A
Les isozymes de PFKP (aucune
activation par F16BP) et de
PKM1 (aucune activation par
F16BP) ont été utilisés dans la
simulation.
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Le flux d'état stationnaire
présente la cinétique classique
de Michaelis-Menten.
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Flux glycolytique stationnaire avec seulement boucle 1 active
Figure 2B
Les isozymes de PFKL
(KPFK, F16P = 0.65 mM) et de
PKM1 ont été utilisés
dans la simulation.
Quand la seule boucle 1 est
active, le flux glycolytique
montre de la bistabilité.
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Flux glycolytique stationnaire avec seulement boucle 2 active
Figure 2C
Les isozymes de PFKP et de
PKM2 (KPK, F16P = 0.04 mM)
ont été utilisés dans la
simulation.
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Lorsque seule la boucle 2 est
active, le flux glycolytique
montre de la bistabilité.
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20
Flux glycolytique stationnaire avec boucle 1 et boucle 2 actives
Figure 2D
Les isozymes de PFKL et
de PKM2 ont été utilisés
dans la simulation.
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Quand à la fois les boucles 1 et 2
sont actives, des états
stationnaires multiples sont
observés, ressemblant celle de la
superposition de (B) et (C).
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21
Modulation de la multiplicité d'état stationnaire par le ratio K/P dans la
glycolyse
Figure 2E
Dans cette simulation, les
isozymes de PFKL et de
PKM2 ont été utilisés,
tandis que le ratio K/P a
été varié.
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Pour les panneaux A-D, K/P de PFKFB a été fixé à 10
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22
Figures 3
Bistabilité: cellules HeLa
 Des cellules HeLa, initialement propagées en milieu à
haute [glucose] (HG) (25 mM) ou en faible [glucose] (LG)
(0.6 mm), ont été divisées en deux cultures; un contenant
le milieu LG et l’autre de milieu HG.
 Leur flux glycolytique dans les milieux LG et HG étaient
0.05 mmol /109 cellules/h et 0.31 mmol /109 cellules/h,
respectivement, une fois atteint l’état stationnaire.
o Les cellules provenant d'un état à haut flux
(précédemment HG) doivent se retrouver en [glucose]
au-dessous de la concentration « switch-down » afin
d’atteindre l'état de flux faible – cercle rouge.
o Cellules provenant d'un état à flux bas (précédemment
en LG) doit se retrouver en [glucose] plus élevée que la
concentration « switch-up » pour atteindre l'état haut
flux – cercle vert.
Figure 3. Les cellules propagées dans un premier temps en milieu de
glucose élevé () ou en milieu de glucose faible () présentent des
taux spécifiques différents de (A) consommation de glucose et (B) la
production de lactate spécifique, lorsqu’exposée à diverses
concentrations de glucose.
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23
Figure 4
Figure 4A.
Graphiques de l'état
stationnaire
glycolytique avec
100%, 50%, 20%, et
10% des niveaux
PFKFB superposent
l’un sur l'autre
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Figure 4B. Impulsion de glucose.
Cette figure montre l'entrée d’un
« pulse » de la concentration de
glucose faite à 50h pour une durée
de 1.5 h et une amplitude
suffisante pour augmenter la
concentration de glucose à partir
de l'état stationnaire de bas flux
(a) dans la région de haut flux (b).
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Figure 4C. Réponse de la glycolyse à un
« pulse » en concentration de glucose
pour les systèmes à différents niveaux
de PFKFB. Les systèmes ont été placés à
l'état bas flux (a) lorsque le « pulse » a
été lancé. Les systèmes à 100% et 50%
de PFKFB changent vers l'état
stationnaire de haut flux (b) pendant la
durée du « pulse » de glucose donnée.
Au contraire, la réponse des systèmes à
20% et 10% de PFKFB n’est pas assez
rapide pour passer à l'état stationnaire
de haut flux.
24
PFKFB module le temps de réponse de la « switch » métabolique
 Il existe quatre isoformes différentes de PFKFB avec des ratios K/P différents (Tableau 1).
 Ces différentes isoformes peuvent ainsi conférer des comportements différents à l’état stationnaire du
flux glycolytique (figure 2E).
 En outre, le ratio K/P est soumis à la régulation hormonale, fournissant un mécanisme de changement
rapide dans le comportement à l'état stationnaire sans avoir recours à la synthèse de nouvelles
isoformes de PFKFB.
 Cependant, comme PFKFB catalyse à la fois la synthèse et l'hydrolyse de F26BP, le niveau de son
expression ne modifie pas le niveau de l'état stationnaire de F26BP, et n’a aucun effet sur le flux
glycolytique, ce qui a été confirmé par le modelage (figure 4A).
 Le niveau de transcription de PFKFB dans les différents tissus révèle une large variation en
expression (Figure non présentée).
 Cette large gamme de niveaux d'expression de PFKFB, même si elle ne modifie pas le
comportement à l'état stationnaire, a un effet profond sur la dynamique du système (temps
de réponse).
 Le niveau de PFKFB affecte le temps de réponse caractérisant le passage du flux glycolytique
d'un état de bas flux à un état de haut flux - le temps de réponse résulte de la partie
préstationnaire de la solution de la simulation.
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 Ceci est illustré par la réponse dynamique de flux glycolytique simulée lors de l'augmentation de
la concentration de glucose correspondant à un état bas à celle d’un état de flux élevé.
o Le ratio K/P de PFKFB utilisé dans la simulation est de 10, correspondant à un état dans lequel
le passage d'un état stationnaire de flux bas à l'état de haut flux est possible dans la gamme
physiologique de concentration de glucose.
 Le système est initialement à un état stationnaire de faible flux dans la région bistable (a). La
concentration en glucose est ensuite augmentée à un niveau où uniquement l’état stationnaire
stable de haut flux est possible (b) (figure 4A).
 Après suffisamment de temps, le système s’établit à son nouvel état stationnaire de haut flux.
 Toutefois, si la concentration de glucose est
ramenée au niveau initial dans la région
bistable après une brève période de temps
(Figure 4B), deux résultats sont possibles: le
système peut rester à l'état d'équilibre à
haut flux, ou retourner au régime de faible
flux initial.
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Figure 4B
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26
 Si le niveau de PFKFB est haut, le flux change plus
rapidement à l'état flux plus élevé et s’installe dans
un nouvel état stationnaire avant que la
concentration en glucose soit retournée à son niveau
initial dans la région bistable (figure 4C).
Figure 4C
 Il reste à l'état haut flux, même après que le glucose
soit retourné dans la région bistable.
 Par contre, à un niveau bas de PFKFB, la réponse est
lente lorsque la concentration de glucose subit un
changement.
 Lors du changement de la concentration de glucose
au niveau initial, le flux revient à son état de bas flux
d'origine (figure 4C).
Le temps de passage au nouvel état stationnaire stable à
haut flux dépend du niveau de PFKFB.
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Comportements glycolytiques typiques observés chez les cellules mammifères
Isozymes de PFKM,
PKM2 et PFKFB avec
ratio K/P = 10
Isozymes de PFKP, PKM1
et puis PFKFB avec ratio
K/P = 0.5
Figure 5
Glucose (mM)
 Deux types de cinétique de l'état stationnaire de la glycolyse ont été observés: le comportement
à l'état stationnaire sans multiplicité d'état stationnaire ou ceux avec multiplicité d'états.
o Le type d’isozymes glycolytiques exprimés constitue la base de la présence ou de l'absence
de la multiplicité des états stationnaires de l'activité glycolytique.
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Conclusion
 Dans la gamme physiologique de la concentration de glucose, le flux glycolytique présente un
comportement avec des états stationnaires multiples.
a) Les états stationnaires multiples proviennent des niveaux de régulation centrés sur PFK et PK.
b) La présence d’isoformes M/L de PFK et de l'isoforme M2 de PK, qui sont tous soumis à
l'activation par leurs effecteurs respectifs, donne lieu à la multiplicité d'état stationnaire.
c) Les ensembles des isoformes, PFKM/PFKL avec PKM2 et PFKP avec PKM1, confèrent de
comportements multiples et contrastants d'états stationnaires au flux glycolytique (figure 5).
 Pour l’ensemble d’isozymes PFKP et PKM1, le flux correspond à un état stationnaire de flux bas pour
les concentrations physiologiques de glucose.
 En revanche, la région bistable conférée par les isozymes PFKM/PFKL et PKM2 peuvent s’étaler sur
une gamme de concentrations physiologiques de glucose.
o Le modèle prédit donc que le flux sera à un état stationnaire de flux élevé dans les conditions
physiologiques.
o Ce n’est qu'après une longue période d'exposition à une concentration de glucose très faible
(< 1 mM) qu’il sera possible de changer le flux glycolytique du système à un état stationnaire
de flux faible.
o Un état stationnaire de haut flux est également associé à une forte production de lactate.
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Références
1. Mulukutla BC, Yongky A, Daoutidis P, Hu W-S (2014) Bistability in Glycolysis Pathway
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doi:10.1371/journal.pone.0098756.
http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0098756
2. Xiong W, Ferrell JE Jr (2003) A positive-feedback-based bistable ‘memory module’
that governs a cell fate decision. Nature 426: 460–465.
3. Yao G, Lee TJ, Mori S, Nevins JR, You L (2008) A bistable Rb-E2F switch underlies the
restriction point. Nat Cell Biol 10: 476–482.
4. Thomson M, Gunawardena J (2009) Unlimited multistability in multisite phosphorylation systems. Nature 460: 274–277.
Université de Montréal
Faculté de Médecine
Département de biochimie
BCM 2505
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