Une vision segmentée de la fermeture dorsale chez

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L’importance de la soudure tissulaire
17 octobre 2008
pour la cicatrisation
pour la morphogenèse
conséquences dramatiques de mauvaises
soudures dans le développement
• de la peau
Une vision
segmentée de la
fermeture dorsale chez
Drosophila melanogaster :
dynamique de la soudure tissulaire, comportement
mécanique et remodelage des frontières segmentales.
coupure
de 2 cm
(souris)
• mésenchyme facial Æ fente labiale ou palatale
~ 18 jours
(Hill, site internet UNSW)
(Barteczko & Jacob, 2004)
(Martin, 1997)
• d’un tissu épithélial monocouche
(épiderme embryonnaire, cornée, intestin…)
coupure
de 25 μm
6 semaines
10 semaines
• tube neural Æ anencéphalie, spina bifida
~ 100 min
1er mois de développement
embryon de Drosophile, stade 16
thèse soutenue publiquement par Fanny PIGNOLÉ SERMAN
La fermeture dorsale dans l’embryogenèse de la drosophile
La fermeture dorsale dans l’embryogenèse de la drosophile
Modèle biologique
10 days
Différence de cinétique dans la soudure tissulaire
10 days
Remodelage de la frontière segmentale lors de la fermeture
(site internet Flymove)
(site internet Flymove)
épiderme
amnioséreuse
Étude de la tension du câble
Conclusion
stades 9 à 17
marquage membranaire
~ 14 heures
Les tissus impliqués dans la fermeture dorsale
épiderme
stades 12 à 15
~ 5 heures
marge
amnioséreuse
Description temporelle de la fermeture dorsale
βCaténine
vue dorsale
~ 3 heures
vue dorsale
fusion
des cellules
stade 14
formation du canthus P
0
120
fusion des bords
vue latérale
temps
(min)
formation du canthus A
stade 14
20
Fusion des cellules par zippering :
stade 15
ptc > Actine
~ 1h
(ptc = pilote des compartiments A)
Génétique de la fermeture dorsale
Description des forces impliquées dans la fermeture dorsale
voie de signalisation JNK
mutants JNK de la fermeture dorsale
Msn (DJNKKKK)
force résistive
de l’épiderme
zippering
contraction de
l’amnioséreuse
Perte de fonction (slp, hep, bsk) :
tension
DJun / DFos
pilote ubiquitaire > Actine
(arm)
scb
arm > αCaténine, bskDN
Gain de fonction (puc) :
mise en évidence
des forces
(Kiehart et al., 2000)
• « dorsal open »
• augmentation de la tension du câble
tension du câble
Hep (DJNKK)
Bsk (DJNK)
~ 15 min
= ablation laser
Slp (DJNKKK)
• « dorsal open »
• défauts de formation du câble d’actine
• perte des attachements entre les tissus
dpp
?
puc
Morphogenèse épithéliale
Æ fermeture dorsale, fermeture du thorax
(drosophile), de la paupière (souris), du tube
neural (souris), cicatrisation...
—————— cicatrisation——————
embryon
larve
adulte
(Martin-Blanco
et al. 1998)
(Galko et al.
2004)
(Ramët et al.
2002)
disque imaginal
étirement de l’épiderme
contraction de l’amnioséreuse
ptc > Actine, hepact
(Bosch et al.
2002)
Un modèle actuel homogène de la marge…
…dans un embryon segmenté
segmentation morphologique
au niveau :
des marqueurs du cytosquelette
des marqueurs de la voie JNK
de la description mécanique
T2
dpp
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
βCaténine
pilote des compartiments P > h-Actine
(en)
A8
segmentation génétique
(Glise & Noselli, 1997)
Actine (phalloïdine)
T3
fermeture dorsale
stade 12
stade 11
puc
modèle de Hutson et al. , 2003
Æ symétrie A-P des marges
Æ forces homogènes
(Melanie)
chaine légère de la Myosine II
stade 10
Peralta et al. , 2007
Æ début d’étude asymétrique
Étude à l’échelle segmentale
Une vision segmentée de la marge ?
Modèle biologique
A P A P…
A
stade 9
temps et vitesse de
fermeture
(n=62)
P
Différence de cinétique dans la soudure tissulaire
marge homogène
marge inhomogène ?
Remodelage de la frontière segmentale lors de la fermeture
La marge est-elle fonctionnellement segmentée ?
Étude de la tension du câble
Æ différencier l’antérieur A et le postérieur P
axe A-P global
compartiments des segments
Conclusion
Étude à l’échelle segmentale
Différence sur l’axe A-P global
Æ comparaison avec une méthode cinétique classique
temps et vitesse
cellulaire de fermeture
(n=62)
(Peralta et al., 2007)
Æ pertinence de la méthode
vitesse cellulaire
Æ composante segmentale
des vitesses
Æ différence entre les parties A
et P globales de l’embryon
Différence sur l’axe A-P global
Étude à l’échelle compartimentale
Æexplications proposées :
temps et vitesse de
fermeture
(n=62)
1) involution de la tête Æ pas satisfaisant
marge-GFP
0’
40’
70’
projection de
15 contours
~ 90 min
2) compensation A-P
77% des embryons ferment au milieu de A3 alors que la
des mouvements A-P
formation du canthus A est plusétude
tardive
100’
arm > Actine
(sur un embryon ptc > αCaténine)
vitesse cellulaire
Æ inhomogénéité cinétique
des compartiments
Explications possibles de l’inhomogénéité :
- différence de largeurs des cellules ?
Explications possibles de l’inhomogénéité :
- différence de comportements mécaniques des cellules ?
1) les filopodes ont une extension de 5 à 7 μm
A
P
ptc > Actine
~ 5 min
5 μm
largeurs
A : 2.4 ± 0.5 μm
donc effet du zippering sur 12 à 17 μm
P : 2.3 ± 0.3 μm
~ 5 - 6 cellules
2x longueur
d’un filopode
2) les cellules en train de fusionner doivent se contracter
début de
fermeture
milieu
fin
- 10 %
(Peralta et al., 2008)
Conclusion sur l’étude cinétique
Æ certaines cellules peuvent se contracter moins
rapidement
Æ rigidité
Æ tension
Que se passe-t-il à la frontière segmentale ?
Modèle biologique
Æ inhomogénéité fonctionnelle de la marge
- sur l’axe A – P global
Différence de cinétique dans la soudure tissulaire
A
P
- entre les compartiments A et P
Remodelage de la frontière segmentale lors de la fermeture
Æ autonomie fonctionnelle du segment ?
Étude de la tension du câble
segments A3-A4
Æ mécanismes de régulation dans le segment
~ 2 heures
Conclusionsuperposition
βCaténine
en > h-actin
Que se passe-t-il à la frontière segmentale ?
stade 13
frontière segmentale
cellule Mixer
stade 13-14
M
cellule
Antérieure
2nde rangée
stade 14
segments A3-A4
**
~ 2 heures
βCaténine
superposition
cellule
Postérieure
2nde rangée
en > h-actin
frontière
segmentale
min
Caractérisation spatiale des intercalations
stage 13
rangée de la marge
0
stade 13
2ème rangée
I
30
1.5
stage 15
stade 13-14
60
P
Initiation
1
nombre d’intercalations
dans une marge
0.5
stade 14
90
T
contact
Ponctuel
0
T1
Terminaison
T2
T3
A1
A2
A3
A4
motif final
120
moyenne sur n = 10
A5
A6
A7
A8
Caractérisation temporelle des intercalations
Caractérisation morphologique de la cellule Mixer
40
périmètre (μm)
30
20
début de fermeture
milieu de fermeture
10
moyenne des
longueurs et
largeurs sur
une marge
fin de fermeture
3 μm
temps (min)
0
-40
temps
-20
0
Caractérisation génétique de la cellule Mixer
20
40
60
80
100
120
Remodelage de la frontière
Æ processus très robuste d’isolement de la cellule M
Æ contrôle
génétique ?
Æ caractérisation morphologique et génétique de M
Æ un processus segment – spécifique
marge
1ère rangée
voie JNK
A1 – A6
amnioséreuse
M
épiderme
puc
Ena
puc
Ptc
(Melanie)
1ère colonne antérieure
(sillon)
puc (JNK)
- Enabled : sillons
en > h-Actine
- Patched : identité antérieure
- Puckered : signalisation JNK dans la marge
marge
M
~ 70 min
Inhibition ubiquitaire de la voie JNK
0’
12’
24’
37’
βCaténine-GFP
cellule Mixer potentielle
arm > bskDN
cellules de la seconde rangée
49’
Inhibition de la voie JNK dans chaque compartiment
70’
βCaténine-GFP
ptc > myr-RFP
ptc > bskDN
cellule Mixer
cellule P de la 2nde rangée
cellule A de la 2nde rangée
inhibition dans A Æ blocage des intercalations
Æ blocage des intercalations
inhibition dans P Æ rien ou diminution faible
Phénotypes des perte et gain de fonction JNK
Surexpression de la voie JNK
sauvage
cellules
9 intercalées
sur 1 marge
au postérieur
à l’antérieur
6
cellules
βCaténine-GFP
ptc > hep
cellules
Mixer
potentielles
cellules indéterminées
cellules A potentielles
12
surexpression dans A Æ forte augmentation des intercalations
0 cellule
16
cellules
cellules
Remodelage de la frontière : contrôle génétique
CaractérisationExpression
génétique de
delaEngrailed
cellule Mixer
dans
: protéine
la cellule
Engrailed
Mixer endogène
Æprocessus très robuste d’isolement de M
cellule Mixer
Æ un processus segment – spécifique
Æ contrôlé par la voie JNK dans le compartiment A
JNK
puc
Paradoxe ?
Ena
- des cellules de lignages différents n’ont pas d’affinité
- si le mélange est provoqué , elles sont retriées
(Melanie)
tri cellulaire
- par adhésion différentielle
puc
Ptc
(Steinberg, 2007)
- par migration active
(Krieg et al., 2008)
CaractérisationExpression
génétique de
delaEngrailed
cellule Mixer
dans
: protéine
la cellule
Engrailed
Mixer endogène
cellule Mixer
puc
Ena
En
(Melanie)
puc
Ptc
En
Étude de la cinétique d’apparition de la protéine Engrailed
Remodelage de la frontière : transdifférentiation et intercalations
Æ expression de novo de Engrailed
endogène dans M
Æ isolement de M
Rôles des intercalations : phénotypes obtenus
Croisements bloquant les intercalations
contrôlé par la
voie JNK
• ptc > puc
Æ
50 % des embryons ne ferment pas
et présentent des déchirures
• ptc > bskDN Æ
Æ intercalations de ~ 2 cellules
4% des embryons ne ferment pas
90 % ont des défauts de fusion
Conséquences :
pourcentages sur les
segments A1-A6
Æ compartiment de dilatation (+ 20 %)
Æ organisation complexe de la marge
Rôles des intercalations : phénotypes obtenus
Ablations laser des 5 cellules Mixer
Contrôle
Rôles des intercalations : phénotypes obtenus
Mutants enabled
-pas de blocage des intercalations
- mauvaises fusions
Rôle de la tension
dans le remodelage
Remodelage
de la frontière
: conclusion
Rôles des intercalations : bilan
Éviter les surtensions et les déchirures de tissus
- par diminution de la tension du câble
transdifférentiation
intercalations
Réaliser une bonne fusion des bords
JNK
tension ?
- par diminution de la tension du câble
grande robustesse
variabilité
Æ réorganisation
complexe
Æ compartiment de
dilatation
- par un ordonnancement particulier
- par augmentation du nombre d’ « ancrages » Ena
Rôle de la tension ?
Rôle de la tension ?
sauvage
sauvage
Modèle biologique
Différence de cinétique dans la soudure tissulaire
arm > bskDN
arm > bskDN
Remodelage de la frontière segmentale lors de la fermeture
mutant zipper
mutant zipper
gain de fonction
JNK
βCaténine
zipper
perte de fonction
JNK
sauvage
gain de fonction
JNK
zipper
βCaténine
Conclusion
sauvage
Étude de la tension du câble
perte de fonction
JNK
Relâchement continu de tension
Relâchement de tension après insertion
0’
2’
4’
βCaténine
βCaténine
~ 2 heures
~ 20 min
6’
ablation laser
10’
15’
Æ comportements indépendants
des deux segments
17’
ablation laser
Augmentation artificielle de la tension
Augmentation du temps d’insertion par augmentation de la tension
Tension dans le câble : relâchements de chaque jonction
Coupures fines dans le câble
βCaténine
segments A2-A5
x 20
~ 3 min
La vitesse de relâchement initial est
proportionnelle à la force que l’on supprime
Bilan
Æ étude quantitative de la fermeture dorsale
Bilan
Æ étude quantitative de la fermeture dorsale
Modèle biologique
soulignant la grande robustesse du processus
(nombreuses compensations)
soulignant la grande robustesse du processus
(nombreuses compensations)
Différence de cinétique dans la soudure tissulaire
Æ marge fonctionnellement segmentée
- compartiments A et P : différence cinétique
Remodelage de la frontière segmentale lors de la fermeture
Æ marge fonctionnellement segmentée
- compartiments A et P : différence cinétique
différence mécanique
Étude de la tension du câble
- transdifférentiation
à la bordure
des segments
- compartiment de dilatation
Conclusion
différence mécanique
- transdifférentiation
- compartiment de dilatation
à la bordure
des segments
Applications et perspectives
Merci !
Stéphane
compartiment de dilatation
transdifférentiation
Ærégulation de la tension
dans une cicatrisation
Æapplications thérapeutiques
- mécanismes de l’intercalation ?
- transdétermination dans les
disques imaginaux ?
Sophie
Raphaël
Chloe
Jean-Baptiste
Fabienne
Luis
Christian
- régulation par des contraintes
mécaniques ?
Magali
Melanie
Véro
Pauline
Delphine
Astrid
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