Optique pour la biologie : Y. Usson
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10/12/15 Op#que pour la Biologie OPTIQUE POUR LA BIOLOGIE Yves USSON, Lab. TIMC-­‐IMAG, Université Grenoble Alpes Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie InvenHon aIribuée aux opHciens hollandais Hans et Zacharria Janssen et son fils en 1590. Galilée 1609 : un occhiolino, un microscope composé d'une lenHlle convexe et d'une autre concave. Ce serait Antoni van Leuuwenhoek (1632-­‐1723) qui a_ré l’aIenHon des biologistes sur les possibilités et l’intérêt de la microscopie. Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 1 10/12/15 Op#que pour la Biologie Bibliometry (Web of sciences) GFP & TPE CLSM EPI-FLUORESCENCE Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie Microscopie confocale Stratégie : rejeter la lumière hors focale Approche : filtrage opHque Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 2 10/12/15 Op#que pour la Biologie InvenHon of confocal microscope Marvin Minsky (1957) Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie Confocal : conjugaison de plan focaux Source laser Plan focal source Plan focal de détecHon Plan focal objet ObjecHf PM Filtre d’arrêt Specimen Grenoble 2015 « pinhole » Séminaire Dautreppe 3 10/12/15 Op#que pour la Biologie Confocal microscopy SecHonnement opHque Mitochondries dans une cellule vivante (rhodamine 123) ConvenHonnel 5 µm confocal Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie Microscopie à excita#on à deux photons Stratégie : confiner la lumière d’excitaHon au foyer de la lenHlle Approche : excitaHon non-­‐linéaire Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 4 10/12/15 Op#que pour la Biologie Principe confocal ExcitaHon bi-­‐photonique Rejet des photons Hors-­‐focaux Provoquer l’excitaHon Au niveau du foyer Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie Comparaison entre SPE et TPE SPE TPE S1 S1 S1’ σa λi λe > λi λi S0 S1’ σa2 λe < λi ΔT λi σa1 S0 Excitation linéaire Emission σSPE = σa = 10-16 cm2 Grenoble 2015 Excitation non-linéaire Emission σTPE = σa1 σa2 ΔT = 10-34cm4.10-15s Séminaire Dautreppe 5 10/12/15 Op#que pour la Biologie ExcitaHon à deux photons Requis: Une très grande densité en photons -­‐ Temporelle: Deux photons doivent aIeindre le fluorophore dans un temps ultra-­‐bref femto-­‐seconde pulsed IR laser -­‐ SpaHale: Deux photons doivent aIeindre le même fluorophore condiHon obtenue grâce au fort pouvoir de focalisaHon d’un objecHf à grande ouverture numérique : forte densité au foyer de la lenHlle Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie ExcitaHon à deux photons DiluHon spaHale Confinement temporel temps Grenoble 2015 Confinement spaHale Confinement temporel Séminaire Dautreppe 6 10/12/15 Op#que pour la Biologie Propriétés de l’excitaHon à deux photons SPEF TPEF SoluHon de FITC ExcitaHon 488nm ExcitaHon 976nm ObjecHf x10 Confinement de la fluorescence Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie ExcitaHon à deux photons Confinement du « photo-­‐blanchissement » y Zone de blanchissement GFP Fluorescence (TPEF) x 0,6µm z Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 7 10/12/15 Op#que pour la Biologie Vers la super-résolution STED, PALM, SR-SIM STED : Modelage de l’émission de fluorescence par déplétion forcée PALM : Détection de signaux ponctuels, ajustement SR-IM : Illumination structurée Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie STED microscopy : STimulated Emission DepleHon Based sur l’uHlsiaHon simultanée de deux sources lasers, la première d’excitaHon normale (λi), la seconde (spaHalement structurée) de dépléHon (λe) créant de la diffusion avant (λs). SPE SE ps ns S1 S1 λs λe > λi λi S0 Absorption linéaire Emission (ns) Grenoble 2015 λe = λs λi S0 Absorption linéaire DépléHon forcée Diffusion vers l’avant Séminaire Dautreppe 8 10/12/15 Op#que pour la Biologie Excitation Fluorescence Emission ns Z Excitation Dépletion, Diffusion forcée Emission finale ns STED Z Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie Principe du STED D’après S. Hell Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 9 10/12/15 Op#que pour la Biologie Comparaison, Confocal versus STED D’après S. Hell Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie Photo Activated Localization Microscopy Repose sur la combinaison de deux approches : 1°) Allumage sélectif et séquentiel des fluorophores : système de photoactivation à bas régime, puis photoblanchiment 2°) Localisation du fluorophore allumé par application d’un modèle de PSF, stockage de la position dans une nouvelle image Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 10 10/12/15 Op#que pour la Biologie Photo AcHvated LocalizaHon Microscopy Tâches de diffracHon non résolues Fluorophore commutable Ajustement PSF Détection du centre Fluorophore commutable Points “résolus” Ajustement PSF Détection du centre Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie After S. Hell Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 11 10/12/15 Op#que pour la Biologie PhotoacHvated LocalizaHon Microscopy (PAL-­‐M) Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie SIM : structured image microscopy Repose sur une modulation spatiale de l’amplitude d’excitation du champ microscopique avec une fréquence égale à la fréquence de coupure de la lentille objectif. Par calcul on déploie le repli spectral créé par la modulation d’amplitude. Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 12 10/12/15 Op#que pour la Biologie La lenHlle réelle considérée comme un filtre passe-­‐bas Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie b-a b b+a amplitude amplitude a Fréquence spaHale Modulation à la fréquence de coupure Repliement spectral amplitude amplitude Fréquence spaHale sin a . sin b = 0,5.(sin(b-a) + sin(b+a)) fréquence spaHale Filtrage passe-­‐bas de la lenHlle Grenoble 2015 fréquence spaHale Déploiement spectral numérique Séminaire Dautreppe 13 10/12/15 Op#que pour la Biologie Structured Illumination Microscopy (SR-SIM) Amélioration : distance de résolution divisée par deux (à trois) Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie Au delà de la fluorescence" Techniques de Microscopie Interférentielle! Digital Holographic Microscopy (DHM)! & Optical Coherent Tomography (OCT) Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 14 10/12/15 Op#que pour la Biologie Digital Holographic Microscopy (DHM)! Stratégie : Holographie et reconstruction numérique! Approche : Holographie/interférométrie! Requis et propriétés:! ! ! Pas de nécessité de marquer ou colorer! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Compatible avec des cellules vivantes ou des tissus vivants! Efficace au travers de spécimens épais transparents! Peut-être couplée à de la fluorescence! Imagerie en temps réel! Refocalisation numérique (hors-ligne)! Mesures nanométriques (épaisseur optique).! Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie DHM : qu’image-t-on, que mesure-t-on?" Objet de phase" Light propagation Onde plane" Front d’onde déformé" To = n . D" To = épaisseur optique" n = indice de refraction" D = épaisseur physique" Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 15 10/12/15 Op#que pour la Biologie Schéma de principe du DHM" Laser diode 658nm" mirroir Cube séparateur" 50/50" Bras de mesure" condenseur" échantillon" Longueur de bras" ajustable" mirroir mirroir Objectif" CCD camera" 1024x1024x8 bits" mirroir Hologramme hors-axe" Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie Hologramme hors-axe (ou paralaxe) Hologramme" Front d’onde de mesure" CCD" Front d’onde de réféence" Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 16 10/12/15 Op#que pour la Biologie Analyse numérique de l’hologramme" Calculs dans le domaine de Fourier" Hologram" Fourier transform" Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie Analyse numérique de l’hologramme" Développement/déploiement de la phase" Correction de planéité" Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 17 10/12/15 Op#que pour la Biologie Refocalisation numérique" En ligne ou hors-­‐ligne Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie Exemple :Analyse du cycle cellulaire : morphologie 3D" Cellules FUCCI (fluorescence)" Grenoble 2015 Phase déployée φ : épaisseur optique" Séminaire Dautreppe 18 10/12/15 Op#que pour la Biologie Metamorphose des plaquettes sanguines(K. Sadoul)" Monitoring morphological minute changes during platelet transformaHon Plein champ: suivi d’une plaqueIe Epaisseur opHque de la plaqueIe traquée Echelle verHcale : micromètres Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie Exemple biophysique, mesure nanométrique" nano-marchess " (hauteurs présumées: 6 à 20 nm)" Dépot multi-couche (3 à 10) de poly-electrolyte sur une lamelle avec insert en plastic" Grenoble 2015 Nano-empreinte" Séminaire Dautreppe 19 10/12/15 Op#que pour la Biologie Exemple biophysique, mesure nanométrique" Image de Phase 10 couches Surface de Phase 10 couches (marche de 20nm) Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie Optical Coherent Tomography (OCT)! Stratégie : utiliser les photons balistiques" Approche: interférométrie" ! ! ! ! Grenoble 2015 Requis et propriétéss:! ! Pas de nécessité de colorer ou marquer! ! Cellules vivantes et tissus vivants! ! Profondeur d’imagerie jusqu’à 500µm! ! Imagerie lente Séminaire Dautreppe 20 10/12/15 Op#que pour la Biologie La tomographie optique cohérente" L’OCT est une technique de microscopie utilisant la lumière rétrodiffusée par le spécimen. Elle s’effectue en lumière blanche et ne nécessite aucune coloration" Lumière rétro diffusée :" • photons balistiques (trajectoire rectiligne)" • photons serpentaires (trajectoire ondulée)" • photons erratiques (trajectoire chaotique)" arrivée" départ" Temps de vol des photons" Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie La tomographie optique cohérente" Détection des photons balistiques par interférométrie" Est basée sur la longueur de cohérence Lc Si les différents chemins suivis par l'onde diffèrent d'une longueur supérieure à Lc, il n'y aura pas d'interférences." Interféromètre de Michelson" Microscope OCT (Linnick)" Miroir de référence" Caméra C.C.D." 200 images/s" Lame semi-" réfléchissante" objet" Source de" lumière" Source de lumière" blanche" Caméra CCD" Objectif" grande O.N." Miroir de " référence" PZT" Actionneur" piézo" Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 21 10/12/15 Op#que pour la Biologie La tomographie optique cohérente" enveloppes" interférence s" Miroir de référence" Lame semi-" réfléchissante" objet" Z" Caméra CCD" Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie La tomographie optique cohérente" OCT plein champ" Xenopus Laevis ! z! x! y! Arnaud Dubois et al., ESPCI, Paris! Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 22 10/12/15 Op#que pour la Biologie La tomographie optique cohérente" OCT plein champ" Histopathologie" 450 µm" Epithelium œsophage humain (fixé)" Arnaud Dubois et al., ESPCI, Paris! Applied Optics 43, 2874 (2004)! Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie Lumière polarisée et imagerie de bi-réfringence! APPLICATION A LA CARTOGRAPHIE! DU MYOCARDE Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 23 10/12/15 Op#que pour la Biologie Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie Anatomie d’un cardiomyocyte Axe de contracHon Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 24 10/12/15 Op#que pour la Biologie Anatomie d’un cardiomyocyte L’unité contracHle : le sarcomère Microscopie électronique en transmission Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie Anatomie du sarcomère Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 25 10/12/15 Op#que pour la Biologie DISPOSITIF OPTIQUE CAMERA ANALYSEUR TOURNANT LAME PLEINE ONDE REGLABLE PLATINE BASCULANTE A DEUX AXES SPECIMEN POLARISEUR TOURNANT DIFFUSEUR LUMIERE BLANCHE Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie PREPARATION BIOLOGIQUE Inclusion en résine de Méthylmétacrylate Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 26 10/12/15 Op#que pour la Biologie PREPARATION BIOLOGIQUE Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie DISPOSITIF OPTIQUE Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 27 10/12/15 Op#que pour la Biologie Pilier auriculo-­‐ventriculaire en ILP VariaHon de l’intensité transmise en foncHon de la rotaHon polariseur/analyseur Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie VariaHon mesurée en un pixel en foncHon de l’axe de sélecHon du couple polariseur/ analyseur intensité Huit images B A RotaHon (α) couple polariseur/analyseur Modèle empirique (Jouk et al 1995) I (α) = A + B * cos2 (2.(α-­‐Θ+π/4)) Θ : azimuth sur [0 90°] B: dépend de l’élévaHon A: dépend de l’homogénéité du Hssu Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 28 10/12/15 Op#que pour la Biologie MODELISATION DE LA CHAÎNE OPTIQUE AVEC DES MATRICES DE MULLER Polariseur = Objet = Analyseur = Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie MODELISATION DE LA CHAÎNE OPTIQUE AVEC DES MATRICES DE MULLER M = Po . Ob . An M(1,1) intensité de la lumière polarisée transmise Après réducHon et simplificaHon M(1,1) = = Posons B / 2 = (1-­‐cos(ϕ)) / 8 alors M(1,1) = Formule empirique : I (α) = A + B * cos2 (2.(α-­‐Θ+π/4)) = Grenoble 2015 = Séminaire Dautreppe 29 10/12/15 Op#que pour la Biologie Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie SECTION DE CŒUR EN ILP 8 images, pour une rotaHon totale de 78,25° par pas de 11,25° Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 30 10/12/15 Op#que pour la Biologie DISPOSITIF OPTIQUE Pleine onde -­‐45° Pleine onde 0° Pleine onde +45° Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie Analyse en lumière polarisée de l’orientaHon des cellules myocardiques Cartographie (1/2 sphère) l’orientaHon des cardiomyocytes Texture superposée : représentaHon par lignes de courant (Line Integral ConvoluHon) Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 31 10/12/15 Op#que pour la Biologie Le futur… PerspecHves… Jusqu’ici l’usage de l’opHque et des photons en biologie a été essenHellement dédié à l’observaHon et la quanHficaHon de phénomènes biologiques Le futur qui se construit actuellement s’oriente vers un usage intervenHonnel. C’est-­‐à-­‐dire uHliser la lumière pour contrôler, modifier, orienter des mécanismes biologiques. Donner la possibilité d’expérimenter in situ dans les cellules vivantes, opto-­‐ généHque et photo-­‐acHvaHon. TransposiHon dans le domaine de la Santé : développer des approches thérapeuHques nouvelles, ciblage thérapeuHque contrôlé par la lumière. Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 32
