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50 Manuel terrestre de l’OIE 2005
CHAPITRE 1.1.5.
VALIDATION ET CONTRÔLE QUALITÉ DES
MÉTHODES D'AMPLIFICATION EN CHAÎNE PAR
POLYMÉRASE (PCR) UTILISÉES POUR LE
DIAGNOSTIC DES MALADIES INFECTIEUSES
INTRODUCTION
Le diagnostic de maladies infectieuses est réalisé par la détection directe et/ou indirecte d’agents
infectieux. Par les méthodes directes, les particules des agents et/ou leurs composants, tels que
les acides nucléiques, les protéines structurales ou non-structurales, les enzymes, etc., sont
détectés. Les méthodes indirectes démontrent la présence des anticorps induits par les infections.
Les méthodes les plus usuelles pour la détection directe sont l’isolement ou la culture in vitro, la
microscopie électronique, l’immunofluorescence, l’immunohistochimie, les épreuves
immuno-enzymatiques (ELISA), l’hybridation d’acides nucléiques (NAH, Nucleic-acid
Hybridisation), les épreuves à base de micro- et macro-puces et les diverses techniques
d’amplification d’acides nucléiques comme la réaction d’amplification en chaîne par polymérase
(PCR) ou les méthodes d’amplification isothermiques comme l’amplification basée sur les
séquences d’acides nucléiques (NASBA, Nucleic Acid Sequence Based Amplification) ou
l’amplification isothermique par clivage invasif ou par la méthode dite LAMP (Loop-mediated
Isothermal Amplification). Comme les épreuves de NAH, de micro- et macro-puces et les diverses
épreuves d’amplification utilisent pour cibles les molécules d’acides nucléiques, elles sont
également appelées méthodes de diagnostic moléculaire.
Les méthodes les plus usuelles de détection indirecte d’agents infectieux sont les épreuves
sérologiques, telles que la neutralisation virale, l’ELISA, les épreuves d’inhibition de
l’hémagglutination, puis une série de méthodes techniques plus récentes telles que les biocapteurs,
la bioluminétrie, la polarisation de fluorescence, la chimioluminescence, etc. En général, les
laboratoires de diagnostic utilisent simultanément les méthodes directes et indirectes, afin d’obtenir
le plus de certitude possible pour un diagnostic.
Les expériences des deux dernières décennies indiquent que les techniques de PCR vont
finalement supplanter bon nombre des méthodes directes classiques de détection d’agents
infectieux. Il apparaît clairement que la PCR est en train de remplacer l’isolement de virus ou la
culture de bactéries, pour la détection d’agents difficiles ou impossibles à cultiver. Il existe plusieurs
raisons à cette tendance qui incluent le fait que l’isolement de virus nécessite: i) la présence de
microorganismes qui se multiplient (virus ou bactéries) ; ii) des locaux et des équipements coûteux
pour les cultures cellulaires et la maintenance ; iii) un minimum de plusieurs semaines pour réaliser
le diagnostic ; et iv) une expertise particulière qui manque ou diminue aujourd’hui dans bon nombre
de laboratoires. Bien qu’initialement les épreuves de PCR aient été coûteuses et lourdes à mettre
en œuvre, elles sont maintenant devenues des outils relativement peu chers, sûrs et d’emploi facile
dans les laboratoires de diagnostic (2-4, 6, 7, 11-13). La sensibilité et la spécificité de la PCR sont
généralement meilleures que les procédures d’isolement ou les ELISA de capture d’antigène.
L’introduction de diverses méthodes de PCR en temps réel, des automates pour l’extraction des
acides nucléiques et des plateformes automatisées a résulté à l’heure actuelle en un grand arsenal
d’épreuves robustes, très rapides et fiables pour le diagnostic moléculaires. Dans ce chapitre les
applications diagnostiques des diverses méthodes de PCR sont résumées avec un intérêt
particulier pour l’harmonisation et la validation au niveau international.

Chapitre 1.1.5. — Validation et contrôle qualité des méthodes d'amplification en chaîne par polymérase
(PCR) utilisées pour le diagnostic des maladies infectieuses
Manuel terrestre de l’OIE 2008 51
A. MÉTHODES DE PCR UTILISÉES EN DIAGNOSTICS MOLÉCULAIRES DE ROUTINE
1. Les principes de la PCR
La réaction d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) implique qu’il y ait dans cette technique une
amplification basée sur une réaction enzymatique. Le terme de « réaction en chaîne » fait référence à plusieurs
cycles de copies de l’ADN spécifique, issus dans ce cas du génome d’un agent infectieux. La région devant être
amplifiée est délimitée par deux (ou plus) séquences nucléotidiques courtes, appelées sites d’amorce, qui
encadrent la séquence cible. Les amorces, oligonucléotides courts complémentaires des sites d’amorce, se lient
à la chaîne d’ADN devant être copiée. En utilisant une polymérase, qui n’est pas dénaturée au cours des cycles
de chaleur, il est possible de copier la séquence ciblée par l’ajout aux amorces de nucléotides libres. En répétant
les cycles de chaleur 20 à 40 fois, le taux de copies d’ADN cibles acquises augmente de façon exponentielle en
en produisant suffisamment pour les opérations suivantes, telles que la détection, le clonage ou le séquençage.
La sensibilité du diagnostic par PCR est très élevée car plusieurs millions de copies de la cible sélectionnée sont
produites. La spécificité peut également être très élevée selon les séquences nucléotidiques spécifiques des
cibles sélectionnées, et le motif des amorces. Les amorces peuvent être choisies pour détecter des séquences
de nucléotides très spécifiques dans les génomes des agents infectieux sélectionnés, ou peuvent être choisies
pour être complémentaires de régions bien conservées du génome, permettant ainsi la détection des membres
d’une famille ou du genre d’un agent infectieux. Une synthèse détaillée des techniques moléculaires a été publiée
(17).
a) Amplification de l’ADN
Si le génome de l’agent infectieux est de l’ADN, l’amplification est effectuée directement, avec ou sans
purification préalable de l’ADN cible. Dans de nombreux cas, l’utilisation d’ADN extrait ou purifié à partir d’un
matériel devant être analysé (ex : du sang) permet d’augmenter la sensibilité analytique et diagnostique.
b) Amplification d’ARN (PCR par transcription inverse)
Les génomes de nombreux agents infectieux contiennent de l’acide ribonucléique (ARN) qui ne peut pas
être amplifié directement par PCR. Pour l’amplification par PCR, de l’ADN cible simple brin est nécessaire,
mais n’est pas disponible dans le cas de virus à ARN. Ce problème peut être résolu par l’addition d’une
étape avant de commencer la PCR. En utilisant une transcriptase inverse, il est possible de transcrire l’ARN
en ADN complémentaire (ADNc), qui est un ADN double brin et peut être utilisé dans une épreuve de PCR
(cette procédure est appelée PCR couplée à la transcription inverse : RT-PCR). Traditionnellement, la
réaction de transcription inverse était effectuée dans un tube de réaction séparé et l’ADNc produit, transféré
ensuite dans un nouveau tube pour la PCR. Cependant, sont maintenant disponibles dans le commerce des
polymérases d’ADN stables à la chaleur, ayant une activité de transcriptase inverse, et des tampons
dans lesquels la RT et les polymérases d’ADN sont actives. Les deux permettent de réaliser une réaction de
RT-PCR dans un même tube et en une séquence directe sans manipulations supplémentaires limitant ainsi
les risques de contaminations. Dans la plupart des cas, il sera nécessaire d’extraire et de purifier l’ARN
avant la transcription inverse.
c) Détection d’amplicon de PCR
Le produit de PCR, ou amplicon, peut être détecté en utilisant une variété de procédures. La plus commune
inclue une détection non spécifique des produits de PCR basée sur la taille de l’amplicon en utilisant
l’électrophorèse en gel d’agarose et la révélation de l’ADN avec un colorant intercalant non spécifique, tel
que le bromure d’éthidium (il est possible actuellement de remplacer ce dernier par des colorants non
carcinogènes comme le GelRed). Une reconnaissance spécifique de la séquence cible amplifiée peut être
effectuée par transfert de l’ADN en Southern blot suivi d’une hybridation avec les sondes d’oligonucléotides
complémentaires de la séquence cible. Les sondes d’hybridation peuvent être une enzyme, être
chimioluminescente, ou marquée par un radionucléotide pour permettre la détection visuelle de la séquence
cible spécifique.
Quelques exemples de méthodes de PCR couramment utilisées sont donnés ci-dessous.
2. PCR conventionnelle
La « PCR conventionnelle » (ou simplement PCR) utilise une paire d’amorce d’oligonucléotides pour amplifier
une petite partie du génome de l’agent infectieux. La sensibilité analytique est typiquement élevée avec un
nombre minimum de 100 à 1 000 copies de l’ADN cible détectable. La spécificité analytique peut être élevée, en
fonction de la sélection de la cible, le motif des amorces et le test d’optimisation. La sensibilité et la spécificité
analytiques peuvent, toutes les deux, être améliorées en effectuant une PCR nichée (voir le point 3 ci-dessous).
Les méthodes de détection, telles que le Southern blotting suivi de l’hybridation avec des sondes, peuvent encore
améliorer la sensibilité et la spécificité, mais elles demandent du temps, nécessitent la manipulation au

Chapitre 1.1.5. — Validation et contrôle qualité des méthodes d'amplification en chaîne par polymérase
(PCR) utilisées pour le diagnostic des maladies infectieuses
52 Manuel terrestre de l’OIE 2008
laboratoire d’ADN amplifié, et l’interprétation des résultats peut être techniquement subjective. Étant donné la
complexité et le coût, ces méthodes de détection ne sont généralement pas considérées aujourd’hui comme des
procédures adaptées à une utilisation courante en laboratoire de diagnostic.
3. PCR nichée
Les épreuves de PCR nichée utilisent deux jeux de cycles d’amplification avec 4 amorces, désignées amorces
externe et interne. En général, les épreuves de PCR nichée procurent une sensibilité et une spécificité
analytiques supérieures par rapport aux épreuves de PCR conventionnelles. Cependant, il existe un risque
important de contamination croisée car les produits issus du premier cycle d’amplification sont souvent utilisés
comme matrice de départ pour le deuxième cycle, ce qui peut entraîner des transferts de matériel entre les
différents tubes de PCR. La PCR nichée a été en grande partie remplacée par des PCR en temps réel qui sont
aussi sensibles mais au cours desquelles les risques de contamination sont réduits. La limite la plus faible de
détection avec la PCR nichée est classiquement inférieure à 10 copies génomiques de l’ADN cible. La spécificité
analytique est également augmentée car dans la PCR nichée, 4 amorces d’oligonucléotides doivent se lier
spécifiquement avec les cibles sélectionnées afin de donner une réaction positive (4).
4. PCR en temps réel
La PCR en temps réel diffère de la PCR classique car les produits amplifiés de PCR sont détectés directement
pendant les cycles d’amplification en utilisant des sondes d’hybridation qui augmentent la spécificité de l’épreuve.
Des méthodes variées en temps réel, telles que TaqMan, les amorces Scorpions, le transfert d’énergie résonant
(FRET pour Fluorescence Resonance Energy Transfer), le transfert d’énergie avec sonde-amorce (PriProET pour
Primer-Probe Energy Transfer), SybrGreen, Light-Upon-eXtension (LUX) ou les techniques Molecular Beacon
sont devenues des outils utilisés en routine pour la détection d’agents infectieux. La PCR en temps réel a
été utilisée pour la détection de bactéries, de virus ou de parasites issus d’un grand éventail d’espèces animales
(2-4, 14, 17). Ces nouvelles techniques présentent plusieurs avantages supplémentaires par rapport aux
méthodes de PCR « classiques » conventionnelles ou de PCR nichées. En général, une seule paire d’amorce est
utilisée, ce qui procure une sensibilité souvent proche ou égale à celle de la PCR nichée traditionnelle, mais avec
un risque beaucoup plus faible de contamination. La fluorescence, indiquant la présence du produit amplifié, est
mesurée à travers le couvercle ou le coté du tube de réaction et une manipulation post-PCR de l’ADN amplifié
n’est pas nécessaire. Ces procédures prennent nettement moins de temps comparées à la détection
traditionnelle du produit de PCR post-amplification en gels d’agarose suivi d’une révélation en bromure d’éthidium
ou de colorant équivalent pour la détection de l’ADN, et là encore, le risque de contamination est réduit.
L’utilisation d’un format en plaque de microtitration à 96 puits, sans besoin de PCR nichée, permet d’automatiser
la procédure et de l’adapter à des dosages de grande envergure (10, 17). Le diagnostic peut être encore plus
automatisé par l’utilisation de robots pour les extractions d’ADN/ARN et le pipetage. En comparaison avec les
méthodes classiques d’amplification, un autre avantage de la PCR en temps réel est la possibilité de réaliser une
épreuve quantitative (6, 7). Avec une PCR en temps réel, le délai de diagnostic peut être réduit de quelques
heures à quelques minutes. La PCR en temps réel peut aussi être utilisée comme une PCR à transcription
inverse en utilisant un protocole à une étape ; cela permet aux étapes de RT et de PCR de se dérouler dans le
même tube au cours du même protocole de PCR (17).
5. PCR multiplexe
Les PCR utilisant des amorces multiples dirigées contre différentes cibles en une seule épreuve sont appelées
épreuves de PCR multiplexe. En PCR multiplexe, des agents infectieux variés peuvent être détectés et
différenciés dans un même tube et en même temps. Les différentes cibles de PCR amplifiées dans une épreuve
classique de PCR sont identifiées à partir de la taille des produits de PCR. L’utilisation des méthodes classiques
de PCR nichée pour la construction d’épreuves multiplexes est compliquée par la nécessité pour les cibles d’être
de différentes tailles, et par le fait que les amorces peuvent entrer en compétition dans le même mélange
réactionnel. Ces deux facteurs peuvent avoir un impact négatif sur l’efficacité de la PCR. En revanche, le concept
de PCR en temps réel (paires d’amorce unique) donne d’excellentes possibilités pour la construction de systèmes
multiplexes à haute sensibilité (4, 9) basés sur une taille plus uniforme des cibles, des conditions d’amplification
uniformes et une détection différentielle des cibles en utilisant des sondes d’hybridation spécifiques marquées
avec des fluorophores différents. Il convient de remarquer que des amorces communes peuvent être utilisées afin
d’amplifier des régions spécifiques du génome d’un groupe d’agents pathogènes, puis des sondes (TaqMan)
fluorescentes peuvent être employées pour discriminer entre les membres de ce groupe. Il ne s’agit pas d’une
PCR multiplexe à proprement parler, bien que cette technique soit décrite à tort comme telle.
6. Autres méthodes de diagnostic moléculaire
Bien que ce chapitre concerne essentiellement le diagnostic basé sur des techniques de PCR, il convient de
mentionner brièvement qu’outre la PCR, il existe beaucoup de nouvelles méthodes pour la détection moléculaire
des agents pathogènes comme, par exemple, les méthodes d’amplification isothermiques (amplification basée

Chapitre 1.1.5. — Validation et contrôle qualité des méthodes d'amplification en chaîne par polymérase
(PCR) utilisées pour le diagnostic des maladies infectieuses
Manuel terrestre de l’OIE 2008 53
sur la séquence des acides nucléiques [NASBA, Nucleic Acid Sequence Based Amplification], amplification
isothermique par clivage invasif ou par la méthode LAMP [Loop-mediated Isothermal Amplification]), diverses
épreuves avec des micro- ou macro-puces utilisant des sondes padlock, des amplifications basées sur un cycle
tournant et d’autres approches moléculaires. Il existe d’autres approches qui sont en cours de développement
pour détecter et analyser les produits de PCR comme MALDI et Luminex. L’avantage de ces approches,
associées avec une PCR multiplexe, est que le typage des différentes souches ou types d’un micro-organisme
est maintenant possible. Il est évident que la gamme des outils du diagnostic moléculaire est renforcée par ces
méthodes.
B. PRINCIPES DE VALIDATION DES ÉPREUVES DE DÉTECTION
DES ACIDES NUCLÉIQUES
Lorsque l’on réalise des analyses sur du matériel clinique, il est important de fournir des données de bonne
qualité. Pour cela, quelques critères clés doivent être remplis. La mise en place de systèmes d’assurance qualité
(AQ) et de contrôle qualité (CQ) est nécessaire, comme par exemple un ensemble de protocoles qualité, incluant
l’utilisation d’échantillons témoins qui assure que le système fonctionne convenablement et confirme la
reproductibilité des données et leur qualité. Les systèmes AQ et CQ, combinés à un personnel compétent et
entraîné, ont déjà été établis dans de nombreux laboratoires de par le monde. Le test de validation est un autre
facteur essentiel pour assurer que les résultats de l’épreuve reflètent le statut réel des échantillons (8).
Pour évaluer la performance d’une épreuve de diagnostic, il est nécessaire d’utiliser une méthode de validation
pour documenter la performance attendue de l’épreuve en question. La validation est une évaluation d’une
épreuve de diagnostic afin de déterminer comment l’épreuve satisfait à une utilisation particulière. Les principes
généraux de la validation d’épreuves peuvent être trouvés dans le Chapitre 1.1.4., « Principes de validation des
méthodes de diagnostic des maladies infectieuses ». Ce chapitre étend ces principes de validation aux épreuves
moléculaires de diagnostic. Pour des explications concernant des termes et des définitions, veuillez consulter le
Chapitre 1.1.4.
C. VALIDITATION D’UNE ÉPREUVE — INTRODUCTION
1. Choix d’une épreuve adaptée à son emploi futur
Les épreuves de PCR peuvent être adaptées à de nombreux objectifs. Il est en général possible d’utiliser la PCR
chaque fois qu’il faut réaliser la détection directe d’un agent infectieux. Au cours des premières années du
développement des techniques pour le diagnostic par PCR, de nombreux laboratoires ont été confrontés à des
problèmes de performances et de contamination ; la PCR avait donc une mauvaise réputation comme technique
adaptée au diagnostic. Les améliorations de ces dernières années ont inversé cette opinion. Les nouvelles
technologies (par ex : la PCR en temps réel) font que la PCR est moins susceptible de donner de faux résultats
du fait de contaminations et qu’elle est plus facile à réaliser. En outre, l’extraction automatique des acides
nucléiques et les procédures de pipetage automatisées ont considérablement diminué les coûts, amélioré la
répétabilité, et réduit la charge de travail. Pendant les « premières années », de nombreuses épreuves « faites
maison » ont été développées par les laboratoires sans harmonisation ni validation (ou très peu). L’OIE, les
laboratoires nationaux et les Laboratoires de référence de l’Union Européenne (ECRL, European Community
Reference Laboratories) ont un grand rôle à jouer dans la conduite de programmes de validation et
d’harmonisation. Il convient de reconnaître que la technique de PCR telle qu’elle est réalisée à l’heure actuelle est
sûre (les risques de résultats faussement positifs sont considérablement plus faibles), qu’elle est en règle
générale validée sous une forme ou une autre, et bien adaptée aux emplois pour lesquels elle est développée.
Quelques exemples démontrant l’importance de la PCR sont donnés ci-dessous, et les définitions du ou des
objectifs peuvent être trouvées au Chapitre 1.1.4.
• Permettre le diagnostic quand le titre en anticorps est si faible qu’une exposition à l’agent pathogène ne peut
pas être confirmée par un test sérologique (par ex : le test immuno-enzymatique [ELISA] donnant à
plusieurs reprises des résultats douteux lors de programmes d’éradication de la leucose bovine enzootique).
• Assurer la distinction entre infection et immunité d’origine maternelle chez les jeunes animaux (par ex : les
veaux lors de programmes d’éradication).
• Détecter l’acide nucléique (bactérien ou viral) quand les prélèvements pour le diagnostic ne sont pas
compatibles avec l’isolement du fait de leur toxicité (par ex : le sperme, les fœtus momifiés).

Chapitre 1.1.5. — Validation et contrôle qualité des méthodes d'amplification en chaîne par polymérase
(PCR) utilisées pour le diagnostic des maladies infectieuses
54 Manuel terrestre de l’OIE 2008
• Dans les phases finales de programmes d’éradication, quand une recherche approfondie de rares cas est
nécessaire (par ex : en cas de latence avec un herpesvirus ou le dépistage des animaux faiblement réactifs
au cours des programmes d’éradication de la maladie d’Aujeszky).
• Faire la distinction entre les souches vaccinales et les souches sauvages (stratégie DIVA, differentiating
infected from vaccinated animals).
• Élaborer les relations phylogénétiques des virus et utiliser ces informations en épidémiologie moléculaire.
• Permettre un premier diagnostic rapide et sûre lors de l’apparition de foyers (par ex : les foyers d’influenza
aviaire hautement pathogène en 2006).
• Estimer la charge virale (par ex : dans les infections à circovirus porcin type 2).
• Dépistage rapide des animaux vaccinés qui semblent présenter des symptômes.
• Détection d’agents pathogènes mutants résistants aux antibiotiques, etc.
• Démontrer l’absence d’infection chez les animaux vivants ou les produits d’origine animale. Cependant, il
convient de remarquer que certains animaux infectés peuvent ne pas avoir d’acide nucléique détectable
dans les tissus examinés.
2. Considérations préliminaires sur le développement d’une épreuve
a) Précautions et témoins
En raison de l’incertitude en ce qui concerne la sûreté et la fiabilité de la PCR utilisée en routine pour le
diagnostic, des précautions particulières doivent être prises dans les laboratoires utilisant cette technique
pour la détection des agents infectieux afin d’éviter les réactions faussement positives ou faussement
négatives. Ces précautions associées à des témoins internes (imitant les résultats) garantissent une
interprétation correcte des résultats, sans réponses faussement positives dues à des contaminations. Les
témoins internes réels utilisant des « gènes de ménage » rentrent en compétition avec la séquence cible
mais seulement pour les réactifs en excès tels que la polymérase et les nucléotides. Un minimum de
compétition implique que la quantité de la cible soit connue, ce qui n’est pas le cas avec les échantillons de
terrain. Des ARNs « en armure » (Armored RNA
®
) permet au mime d’être ajouté au cours de l’étape
d’extraction, ce qui permet de savoir si l’extraction a été réalisée avec succès. L’inconvénient de l’utilisation
de « gènes de ménage » comme témoins internes est qu’ils peuvent être présents en grande quantité chez
les agents pathogènes recherchés.
b) Précautions à prendre pour éviter des résultats faussement positifs
Des réactions faussement positives (échantillons négatifs se révélant positifs lors de la PCR) peuvent
survenir lors de problèmes liés au laboratoire (contaminations croisées) ou de problèmes liés à l’épreuve
elle-même (optimisation insuffisante des performances). Les erreurs proviennent soit du fait d’un transfert de
produit à partir d’un échantillon positif soit, et c’est le cas le plus fréquent, du fait d’une contamination
croisée à partir de produits issus d’expériences précédentes, et divers protocoles et équipements ont été
utilisés pour éviter des réactions faussement positives. Les échantillons et les réactifs doivent être
manipulés dans des hottes à flux laminaire séparées, hottes qui sont par ailleurs régulièrement
décontaminées par des rayons UV (l’utilisation de la lumière ultra-violette exige un bon entretien pour être
efficace) ou de l’eau de Javel. La mise au point et l’utilisation de portoirs et d’instruments pour ouvrir les
tubes peuvent prévenir les résultats faux-positifs (2). En outre, il convient d’appliquer les bonnes pratiques
de laboratoire notamment pour les étapes élémentaires (extraction de l’ADN, préparation du mélange réactif
et des amorces, préparation des échantillons, électrophorèse sur gel d’agarose des produits de
l’amplification, etc.) qui devront être réalisées dans des zones différentes du laboratoire ou dans des locaux
distincts (Fig. 1 ; référence 1, 4, 17). Il faut aussi utiliser des lots différents de pipettes au cours de chaque
étape. L’utilisation d’une pression positive ou de pointes à filtre est recommandée. Les différentes étapes
devraient, dans la mesure du possible, être réalisées par des personnes différentes, chacune d’entre elles
étant confinées à des zones limitées du laboratoire. Le maximum de précautions doit être pris pour éviter
l’introduction de produits d’amplification dans les zones « propres » du laboratoire à partir de zones du
laboratoires potentiellement contaminées en interdisant les échanges de papiers, de matériel, de personnes
ou de tout autre vecteur de contamination. Les mouvements en sens inverse ne devraient être possibles
qu’après décontamination des surfaces, des équipements, des tubes, etc., et après changement des
blouses et des gants. Si l’on suspecte que l’échantillon contient une grande quantité d’agent pathogène ou
d’acide nucléique, il est préférable de le diluer avant son introduction dans les zones « propres » du
laboratoire.