Examen session 1, 2010-2011

Université Joseph Fourier - Grenoble 1
Année 2010-2011
Epreuve finale d’examen de BIO 121 (Session 1)
Conditions d’examen :
Durée : 2h
Ni document, ni calculette, ni téléphone portable.
Réponses directement sur le sujet.
Total des points : 100
Vous décidez d’étudier la glycoprotéine membranaire EXAM codée par le gène exam. Cette
protéine est localisée dans la membrane plasmique des cellules animales. Elle est impliquée
dans différents mécanismes de reconnaissance et de signalisation cellulaire.
Votre étude est menée en 4 étapes, toutes indépendantes les unes des autres.
PARTIE A (25 points)
(Temps conseillé 30 min)
Analyse de sa partie glucidique
On vous propose de déterminer la structure de la partie oligosaccharidique de la protéine
EXAM.
I- Cet oligosaccharide est associé à la protéine EXAM par une liaison osidique avec l’un de
ses acides aminés.
I1- Citez les 2 principaux types de liaison osidique reliant un monosaccharide à un acide
aminé.
I2- Les acides aminés impliqués dans les différents types de liaisons osidiques sont-ils
spécifiques ? Si oui, citez-les et indiquez leur spécificité par rapport au type de liaison
osidique mis en jeu.
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II- Il est possible de purifier la protéine EXAM par chromatographie d’affinité fondée sur
l’utilisation d’une lectine associée de façon covalente à la phase stationnaire de la
chromatographie placée dans une colonne. Cette lectine reconnait de façon spécifique le Dgalactose. La protéine EXAM est ensuite éluée de la colonne à l’aide d’une solution
concentrée de D-galactose.
Après dialyse, une première hydrolyse ménagée en milieu alcalin permet de séparer la
protéine de la partie oligosaccharidique. Puis, l’hydrolyse totale, en milieu acide, de
l’oligosaccharide montre la présence (équimolaire) des sucres suivants :
∗ La N-acétyl-D-glucosamine
∗ L’épimère en C2 du D-glucose.
∗ Un troisième monosaccharide (que vous déduirez).
Représentez selon Haworth et sous forme pyranique ces trois oses (anomère de votre choix
à préciser).
N-acétyl-D-glucosamine
Epimère en C2 du D-glucose
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Monosaccharide déduit
III- Vous décidez de déterminer le type de liaison osidique associant les trois
monosaccharides caractérisés précédemment à l’aide de la technique de perméthylation des
oses. L’analyse du mélange obtenu permet d’identifier les oses modifiés suivants en quantité
égale :
™ Le 2,3,4,6-tétra-O-méthyl-D-ose déduit
™ Le 2,3,4-tri-O-méthyl-D-mannose
™ Le 1,3,6-tri-O-méthyl-N-acétyl-D-glucosamine
Une analyse de l’oligosaccharide en infrarouge montre que les liaisons osidiques mises en
jeu entre les monosaccharides sont toutes du type α. Celle mise en jeu dans la liaison de
l’oligosaccharide à la protéine est par contre du type β.
9 Représentez en Haworth (utiliser la feuille en paysage) l’oligosaccharide
étudié en précisant le type de liaison osidique mise en jeu entre les
monosaccharides.
9 Effectuez ensuite la liaison glycosidique entre le carbone anomérique libre de
l’oligosaccharide et un acide aminé de la protéine choisi en toute
connaissance de cause (structure semi-développée demandée à pH 1).
Cadre de réponse page suivante
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a
Fin Partie A
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PARTIE B (25 points)
(Temps conseillé 30 min)
Etude du gène exam
Les deux extrémités du gène qui code la protéine exam (exam) sont séquencées. Les
résultats obtenus pour le début et la fin du gène sont indiqués ci-dessous :
Début
Fin
3’ GTATACATGTGGCAGCTATGT 5’
5’AGTAACGACGACTAACATATG 3’
I- Représentez le brin complémentaire des séquences en question en l'orientant.
3’ GTATACATGTGGCAGCTATGT 5’
5’AGTAACGACGACTAACATATG 3’
II- Recherchez la présence de sites de restriction NdeI sur ces deux séquences et entourezles.
Donnée : site NdeI
5’CATATG 3’
3’GTATAC 5’
Le gène exam doit être inséré dans le plasmide pET-28a(+) représenté ci-dessous afin de
produire la protéine Exam et de l’étudier.
rés
i
la stan
p
éni ce à
cilli
ne
or
ig
in
e
5
III-Quels sont les 3 éléments importants que l’on retrouve sur tous les plasmides ? Les citer
et préciser leur rôle.
IV- On veut introduire le gène exam dans le plasmide pET-28a(+). Précisez en quelques
lignes les différentes étapes après avoir déterminé le nombre de site NdeI sur le plasmide.
V- Pour faire cette expérience d’insertion de exam dans pET-28a(+), il est préconisé
d’utiliser :
2 µg de plasmide
5 µg d’exam.
On dispose d’une solution à 1000 µg.mL-1 de pET-28a(+) et 2000 µg.mL-1 de gène exam.
Quels volumes de chaque échantillon d’ADN devra t-on utiliser ?
Cadre de réponse page suivante
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Fin Partie B
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PARTIE C (25 points)
(Temps conseillé 30 min)
Analyse de sa partie protéique
Après extraction de la membrane plasmique, la protéine EXAM est étudiée par différentes
méthodes.
Le traitement d’EXAM par le chlorure de Dansyle permet d’identifier deux résidus marqués,
la tyrosine et la glutamine.
I- Lequel de ces deux acides aminés peut-être détecté dans l’UV et pour quelle raison ?
II- A quoi sert le chlorure de Dansyle et que peut-on déduire de ce résultat au sujet de la
protéine EXAM ?
La protéine EXAM est ensuite analysée par chromatographie de filtration sur gel et par
électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS.
III- Quel est le critère commun de séparation de ces deux méthodes ?
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IV- Lors de la filtration sur un gel de domaine de fractionnement 10 kDa - 500 kDa, la
protéine EXAM est éluée dans un volume d’élution (ve) de 20 mL.
9 Sachant que le volume mort est de 10 mL et que le volume total est de 30 mL,
tracer l’allure de la représentation volume d'élution (ve en mL) = f (log de la
masse molaire exprimée en Da).
9 Donner un titre à cette figure dans le cadre prévu à cet effet et légender de
telle sorte que l’on puisse comprendre l’information que vous pouvez obtenir
au sujet de la protéine EXAM.
Donnée : La masse molaire apparente d’EXAM est de 200 kDa (log 200 ∼ 2)
Log 10 = 1 ; log 500 ∼ 3.
Pour l’électrophorèse sur gel d'acrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE), la protéine
EXAM est traitée pendant 10 minutes à 90°C avec un mélange contenant du SDS, de l’urée
avec ou sans agent réducteur.
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V- Quelle(s) liaison(s) est (sont) détruite(s) par l’action de l’agent réducteur ?
VI- Ecrire la formule semi-développée du ou des acides aminés impliqué(s) dans cette
liaison, donner son (ou leur) nom(s) ?
VII- Quelle(s) liaison(s) est (sont) détruite(s) par l’action de l’urée, du SDS et de la
température ?
Le profil électrophorétique obtenu est présenté ci-desous :
(M, témoin de masse molaire ; NR, non réduit et R, réduit)
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VIII- Donner une représentation schématique de la structure d’EXAM en répertoriant sur le
schéma toutes les informations recueillies depuis le début de l’analyse (chlorure de dansyle,
filtration sur gel, SDS-PAGE)
Fin Partie C
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PARTIE D (25 points)
(Temps conseillé 30 min)
Analyse de son environnement lipidique
Pour caractériser la nature de ces lipides, une extraction des lipides est réalisée par
l’utilisation de solvants apolaires (solvants organiques) sur la préparation de protéines
membranaires purifiées. L’analyse de la composition en lipides permet d’identifier un seul
type de lipide (Lipide A). Vous obtenez ainsi les informations suivantes.
i) Traitement des lipides aux phospholipases :
- Le Lipide A est sensible aux phospholipases A, B, C et D.
ii) Analyse du contenu en sucres de ces lipides :
- Lipide A : pas de sucre dans la composition du lipide
iii) Propriétés électrostatiques :
- Le lipide A est globalement neutre.
I- Sur quelle famille de lipide agissent les phospholipases et quelle est l’action spécifique de
chacune des phospholipases A, B, C et D ? Pour répondre, faire le schéma général d'un
lipide appartenant à la famille du lipide A et illustrer à l'aide de flèches l'action de chacune
des phospholipases.
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II- Suite au traitement à la phospholipase D, le lipide A devient anionique. Quels sont les
deux groupements chimiques possibles qui ont été éliminés par la phospholipase D afin
de rendre compte de ce changement de charge ?
III- Après utilisation des phospholipases adaptées sur le Lipide A, il est possible d’extraire les
acides gras composant ce lipide. Ceux ci sont analysés par chromatographie en phase
gazeuse. On identifie que les acides gras majoritaires composant ce lipide, et présent en
quantité stœchiométrique, sont les acides gras C18 :1 (Δ 9) et C18 :2 (Δ 9,12).
a) Dessinez en représentation semi-développée, la structure de ces deux acides
gras.
b) Numérotez le carbone numéro 1 de vos acides gras.
c) Renommez ces deux acides gras selon un autre type de nomenclature vue en
cours (biochimie alimentaire).
Acide gras C18 :1 (Δ 9)
acides gras C18 :1 (Δ 9)
Acide gras C18 :2 (Δ 9,12).
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IV. Avec l’ensemble des informations accumulées jusqu’ici, proposez une structure générale
pour le Lipide A (en représentation semi-développée). Vous pourrez éviter, si vous le
souhaitez, de représenter de nouveau les parties grasses de vos fonctions acyles et de les
remplacer par un radical R1 et R2 (car déjà détaillés à la question précédente). Choisissez
pour la tête polaire une des deux possibilités identifiées à la question II. Donnez le nom
d’usage du lipide correspondant final.
Nom d’usage : ____________________________________
Fin Partie D
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