Conseil Scientifique d`ADRIA Développement
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De la génomique aux outils de diagnostic rapides : Applications industrielles Etat des travaux du projet BOARD Bacilles thermorésistants: des Outils d’Analyses au Recensement des Dangers ADRIA, centre de transfert technologique Modélisation – Formulation, durée de vie, process – Microbiologie prévisionnelle Qualité & sécurité de l’aliment au long de sa durée de vie Outils de diagnostic – Détection, identification, traçabilité – Microbiologie, moléculaire Hygiène de production, maîtrise des flores d’intérêt Gen2Bio, le 27 mars 2008 [email protected] ADRIA, centre de transfert technologqiue Modélisation – Formulation, durée de vie, process – Microbiologie prévisionnelle Outils de diagnostic – Détection, identification, traçabilité – Microbiologie, moléculaire Réponse à des attentes : développement de produit, i.e. expertises, outils, transfert Gen2Bio, le 27 mars 2008 [email protected] (Re) émergence de bactéries …Bactéries sporulées …Un bref état des lieux! Travaux en cours Perspectives & discussion Gen2Bio, le 27 mars 2008 [email protected] Productions primaires C. perfringens dans les élevages - colonisation du tractus intestinal de volaille, porc - contamination des environnements primaires - augmentation de l’antibiorésistance des isolats2 - augmentation de l’incidence d’entérite nécrotique chez les volailles suite à l’arrêt des antibiotiques comme facteurs de croissance3 les phénomènes de colonisation du tractus intestinal et de synthèse de toxines restent encore mal connus Contamination des viandes…plats cuisinés et restauration collective3! Craven SE et al. 2001, Avian dis 45:887-896 Tansuphasiri et al. 2005, Southeast Asia J Trop Med Public Health 36:954-961 3 Van Immerseel F et al. 2004, Avian pathol 33:537-549 1 2 Gen2Bio, le 27 mars 2008 [email protected] Productions secondaires Bacillus Hautement Thermorésistant dans le lait UHT (HRS) - Brevibacillus, Geobacillus stearothermophilus, B. sporothermodurans 1,2 Lait UHT Homologie des empreintes génétiques Lait cru Hétérogénéité des empreintes génétiques 1 2 Scheldeman P et al. 2006, J Appl Microbiol 101:542-555 Olivier Guillaume-Gentil et al. 2004, Appl. Env. Microbiol 68:4216-4224 Gen2Bio, le 27 mars 2008 [email protected] Productions secondaires Bactéries HRS dans les produits appertisés - Moorella … -…Brevibacillus, Geobacillus stearothermophilus, B. sporothermodurans, Paenibacillus Bactéries HRS et acidophiles dans les pectines de fruit - Alicyclobacillus Gen2Bio, le 27 mars 2008 [email protected] Productions secondaires Bacillus psychrotrophes dans les produits pasteurisés, conservés au froid - groupe B. cereus émétique : B. weihenstephanensis 1 + 45 % entre 1999 et 2005 des produits réfrigérés prêts à l’emploi - à noter : transfert du plasmide de B. anthracis vers B. cereus 1Thorsen 2 L et al. 2006, Appl Environ Microbiol 72:5118-5121 Hoffmaster AR et al, 2004, Proc Natl Acad Sci U S A. 101:8449-54. Gen2Bio, le 27 mars 2008 [email protected] 2 Altérations! Bactéries sporulées, sélectionnées par les process ou adaptées aux process… – – – – – – ovoproduits poudre de lait produits pasteurisés conservés au froid produits UHT produits appertisés …etc Adaptation ou sélection par le process ? Etude de prévalence et analyse des dangers Gen2Bio, le 27 mars 2008 [email protected] Prévalence et analyse des dangers Quand la microbiologie fait défaut… – dénombrements des spores après traitement thermique – dénombrement de B. cereus – dénombrement de C. perfringens Alicyclobacillus, Anoxybacillus, Bacillus, Brevibacillus, Clostridium, Geobacillus, Morella, Paenibacillus… Biodiversité de genres, d’espèces et de caractéristiques physiologiques, et donc de génomes! Gen2Bio, le 27 mars 2008 [email protected] (Re) émergence de bactéries …Bactéries sporulées …Un bref état des lieux! BOARD Perspectives & Discussion Gen2Bio, le 27 mars 2008 [email protected] BOARD Bacilles thermorésistants: des Outils d’Analyses au Recensement des Dangers Filières impliquées Gen2Bio, le 27 mars 2008 [email protected] Partenaires Partenaires industriels BBA (Bretagne Biotechnologies Alimentaires) animé par le Pôle Agronomique Ouest ADRO Ouest animé par le Pôle Agronomique Ouest Sociétés des produits de la mer et produits appertisés Gen2Bio, le 27 mars 2008 [email protected] Partenaires Partenaires industriels PME Sylvie Hallier Patrice Chablain Stéphane Bonilla Centres R&D Florence Baron Sophie Jan Michel Gauthier Ivan Leguérinel Danièle Sohier Florence Postollec Gen2Bio, le 27 mars 2008 [email protected] BOARD : Objectifs détection & identification aliment Développement d’un outil de diagnostic moléculaire permettant, à partir de matrice alimentaire ou ingrédient, - la détection & identification de bactéries sporulées - la détermination de leur prévalence en IAA pour une meilleure analyse des risques et évaluation des dangers Gen2Bio, le 27 mars 2008 [email protected] Programme R&D Cahier des charges Sélection des genres, espèces cibles Alicyclobacillus, Anoxybacillus, Bacillus, Geobacillus, Moorella, Paenibacillus B. cereus, B. mycoides, B. pumilus, B. subtilis, B. licheniformis, B. thuringiensis, B. sporothermodurans, B. weihenstephanensis, B. laterosporus Seuil de détection > 10/g et résultats à J1 Enrichissement over-night Outil multi-cibles, avec des contraintes de coûts PCR multi-multicilbes plutôt qu’une biopuce….GeneDisc! Gen2Bio, le 27 mars 2008 [email protected] Programme R&D Protocole Objectif détecter une contamination < 10 spores/g 25g aliment + diluant Protocole d’extraction Extraction Enrichissement 20h, 37°C Protocole d’amplification Extraction PCR temps réel Gen2Bio, le 27 mars 2008 [email protected] Programme R&D GeneDisc multi-cibles : Analyse des génomes – Exploiter et séquencer ! Recherche de séquences cibles dans les bases de données & séquençage complémentaire Valider l’identification de la collection pour les tests de spécificité Valider les conditions d’enrichissement / Phylogénie Séquences cibles… Gen2Bio, le 27 mars 2008 [email protected] Programme R&D Arbre phylogénétique Alicyclobacillus acidoterrestris 37°C ANaérobie C. perfringens Moorella thermoacetica Brevibacillus laterosporus 55°C ANaérobie Anoxybacillus flavithermus 30°C aérobie Paenibacillus Geobacillus stearothermophilus B. cereus 55°C aérobie B. subtilis B. pumilus Gen2Bio, le 27 mars 2008 37°C +/- aérobie B. weihenstephanensis B. circulans B. licheniformis [email protected] Programme R&D 25g matrice + 100ml RCM Inoculation aux concentrations désirées 20h à 37°C anaerobiose 20h à 55°C anaerobiose 20h à 30°C aerobiose 20h à 55°C aerobiose Extraction Détection & identification par PCR en temps réel Gen2Bio, le 27 mars 2008 [email protected] Programme R&D GeneDisc multi-cibles : Analyse des génomes – Analyses et alignement des séquences Sélection de sondes oligonucléotidiques Optimisation des mélanges réactionnels Gen2Bio, le 27 mars 2008 [email protected] Programme R&D Deux GeneDisc GeneDisc1: Genres Clostridium Moorella contrôles Bacillus Paenibacillus, Anoxybacillus Geobacillus GeneDisc2: Bacillus spp. Gen2Bio, le 27 mars 2008 B. cereus B. mycoides B. pumilus B. subtilis contrôles B. licheniformis B. thuringiensis B. sporothermodurans B. weihenstephanensis B. laterosporus Bacillus [email protected] Programme R&D Validation de la méthode – Inclusivité et exclusivité – Niveau de détection – Exactitude Matrices artificiellement contaminées Matrices naturellement contaminées : dénombrement des spores et identification par séquençage Gen2Bio, le 27 mars 2008 [email protected] (Re) émergence de bactéries …Bactéries sporulées …Un bref état des lieux! Travaux en cours Perspectives & discussion Gen2Bio, le 27 mars 2008 [email protected] Perspectives & discussion Prévalence des flores sporulées et analyse des dangers Evolution des GeneDisc en fonction de l’état des connaissances : description des espèces et acquisition de séquences BOARD : exemple concret de la génomique aux applications industrielles ! …ANR MEMOSPORE Gen2Bio, le 27 mars 2008 [email protected] Horror vacui… Bactéries sporulées : vers une adaptation aux process de production et de conservation ? – « La nature a horreur du vide. Mais d’autant qu’il ne saurait y avoir d’espace vide en aucun endroit de l’univers, et que les parties de la matière, étant rondes, ne sauraient se rejoindre si étroitement ensemble, qu’elles ne laissent plusieurs petits intervalles au recoin entre elles : il faut que ces recoins soient remplis de quelques autres parties de cette matière. » Descartes, Principa philosophiae, 1644 Gen2Bio, le 27 mars 2008 Merci pour votre attention! [email protected] [email protected] [email protected]
