Analyse cytogénétique et moléculaire des tumeurs pulmonaires

Analyse cytogénétique et moléculaire des tumeurs pulmonaires radon-induites chez le rat
Médecine Nucléaire - Imagerie fonctionnelle et métabolique - 2002 - vol.26 - n°3
160
Correspondance : Sylvie Chevillard - CEA DSV DRR - 60-68 avenue du Général Leclerc - 92265 Fontenay-aux-Roses Cedex
Tél.: [phone] - Fax: [phone] - E-mail: [e-mail]
Analyse cytogénétique et moléculaire des tumeurs pulmonaires
radon-induites chez le rat.
M.N. Guilly, Ch. Joubert,
C. Levalois, L. Dano, S. Chevillard CEA DSV DRR - Fontenay-aux-Roses - France
Résumé
Le laboratoire dispose d’un modèle de tumeurs pulmonaires radon-induites chez le rat
qui nous permet d’analyser les altérations cytogénétiques et moléculaires des tumeurs. Le but de
notre étude est de mieux comprendre la cancérogenèse radon- radio-induite et de définir s’il
existe une spécificité des altérations génétiques et moléculaires dans les tumeurs radio-induites
par rapport aux anomalies détectées dans les tumeurs sporadiques ou induites par d’autres agents
carcinogènes. Pour débuter la caractérisation des tumeurs, nous avons recherché les anomalies
génétiques par des approches de cytogénétique globale. Nous avons montré que certaines ano-
malies étaient récurrentes d’une tumeur à l’autre. Les gènes potentiellement impliqués sont le
pro-oncogène MET et le gène suppresseur de tumeur p16, qui sont très fréquemment altérés dans
les tumeurs pulmonaires humaines. Nous avons parallèlement ciblé le gène TP53 en recherchant
si ce gène présentait des altérations dans les tumeurs. Nous avons montré que 8/39 tumeurs
présentaient une mutation et que dans 7 cas, la mutation était une délétion. Cette fréquence
élevée de délétions pourrait constituer une spécificité des altérations radio-induites car ce type
d’altération de TP53 est rarement décrite dans les bases de données de tumeurs (non radio-indui-
tes) humaines ou animales. Dans cette hypothèse, ce type d’altération ne devrait pas être limité au
seul gène TP53 mais devrait être retrouvé dans d’autres gènes inactivés par mutation, tel que p16
par exemple. La poursuite de l’analyse globale des tumeurs nous orientera sur les gènes que nous
devrons cibler pour rechercher une possible signature moléculaire des tumeurs radio-induites.
Radon - Tumeurs radioinduites - Cytogénétique - Mutation

Médecine Nucléaire - Imagerie fonctionnelle et métabolique - 2002 - vol.26 - n°3 161
M.N. Guilly, Ch. Joubert, C. Levalois, L. Dano, S. Chevillard
INTRODUCTION
ðLe radon est un polluant ubiquitaire
naturel d’origine tellurique. Ce gaz,
émetteur de rayons α pose de multi-
ples questions, puisque sa concentra-
tion, forte dans les mines notamment
d’uranium, peut aussi atteindre des
niveaux élevés dans certaines habita-
tions. En terme de dose, il représente
37 % de l’irradiation de la population.
Un excès de cancers du poumon a
été rapporté dans différentes enquê-
tes épidémiologiques chez les tra-
vailleurs des mines, notamment cel-
les d’uranium. Les enquêtes épidé-
miologiques suggèrent également
une association entre la survenue des
cancers du poumon et l’exposition
domestique au radon, mais aucune
corrélation n’a été établie de manière
univoque entre les effets observés et
les niveaux d’exposition [1-4]. Ainsi,
à l’heure actuelle, le risque après ex-
position à de faibles doses est calculé
par extrapolation à partir des données
acquises chez les mineurs.
On sait aujourd’hui qu’une signature
désignant l’origine radio-induite d’un
cancer ne sera pas fournie par les cri-
tères classiques : rien ne permet, par
la clinique, par l’analyse histopatholo-
gique ni par les examens de labora-
toires médicaux, de différencier, par
exemple les adénocarcinomes "spon-
tanés" de ceux qui sont présumés être
radio-induits. Les progrès réalisés en
génotoxicologie, c’est à dire l’étude
moléculaire après exposition à des
toxiques, offre cependant des ouver-
tures prometteuses.
Les altérations génétiques détectées
dans les tumeurs peuvent refléter leur
étiologie et le rôle spécifique des
événements précoces dans le déve-
loppement de celles-ci. Dans les tu-
meurs solides, il existe de nombreux
réarrangements chromosomiques ca-
ractérisés par des pertes et des gains
de matériel génique. Les régions
chromosomiques perdues comporte-
raient des gènes suppresseurs de tu-
meurs alors que les régions gagnées
contiendraient des oncogènes poten-
tiellement impliqués dans la transfor-
mation maligne. La difficulté est que
chaque région chromosomique per-
due ou gagnée peut contenir des cen-
taines de gènes.
Afin de déterminer la spécificité des
altérations génétiques dans les tu-
meurs radon-induites, il est indispen-
sable, dans un premier temps, de tra-
vailler sur des modèles expérimen-
taux reproductibles, dans la mesure
où, chez l’homme, la fréquence de ces
tumeurs présumées radon-induites
est faible. De plus, elles se dévelop-
pent le plus souvent dans un con-
texte de tabagisme, et dans tous les
cas, elles sont difficilement attribua-
bles à un seul facteur de risque.
Nous disposons d’un modèle expé-
rimental permettant l’étude des effets
à court et long termes d’une inhala-
tion de radon (faibles et fortes doses,
faibles et forts débits de dose) sur la
cancérogenèse pulmonaire chez le rat
[5]. L’étude des altérations cytogéné-
tiques et moléculaires dans les tu-
meurs pulmonaires radon-induites
permettra, nous l’espérons, de mieux
comprendre les mécanismes de la
cancérogenèse radon- radioinduite et
à terme de définir des outils biologi-
ques signant avec une probabilité éle-
vée la nature radioinduite des tu-
meurs par comparaison avec des tu-
meurs sporadiques de même type
histologique.
DÉMARCHE EXPÉRIMENTALE
ðLa démarche expérimentale suivie
a été de mettre au point, dans un pre-
mier temps, des techniques d’analyse
globale du génome de rat afin de re-
pérer les régions chromosomiques
gagnées ou perdues, pour dans un
deuxième temps développer une ap-
proche ciblée permettant d’identifier
précisément les gènes impliqués et
par quelles voies ils sont activés ou
réprimés. L’étude globale des rema-
niements chromosomiques a été réa-
lisée par cytogénétique classique en
analysant le caryotype des cellules
tumorales (figure 1figure 1
figure 1figure 1
figure 1), les anomalies
détectées étant dans un deuxième
temps confirmées ou précisées par
hybridation in situ à l’aide de sondes
chromosomiques spécifiques que
nous préparons [6].
BRNO4FITC
-4q12-q214
FF
FF
Figurigur
igurigur
igure 1.e 1.
e 1.e 1.
e 1.
Car Car
Car Car
Caryy
yy
yotype d’une tumeur pulmonairotype d’une tumeur pulmonair
otype d’une tumeur pulmonairotype d’une tumeur pulmonair
otype d’une tumeur pulmonaire de re de r
e de re de r
e de rat rat r
at rat r
at radon-induite.adon-induite.
adon-induite.adon-induite.
adon-induite. Nous réalisons des Nous réalisons des
Nous réalisons des Nous réalisons des
Nous réalisons des
étalements chromosomiques à partir de tumeurs pulmonaires prélevées chez le rat et misesétalements chromosomiques à partir de tumeurs pulmonaires prélevées chez le rat et mises
étalements chromosomiques à partir de tumeurs pulmonaires prélevées chez le rat et misesétalements chromosomiques à partir de tumeurs pulmonaires prélevées chez le rat et mises
étalements chromosomiques à partir de tumeurs pulmonaires prélevées chez le rat et mises
en culture. Après un traitement enzymatique, les chromosomes présentent une alternance deen culture. Après un traitement enzymatique, les chromosomes présentent une alternance de
en culture. Après un traitement enzymatique, les chromosomes présentent une alternance deen culture. Après un traitement enzymatique, les chromosomes présentent une alternance de
en culture. Après un traitement enzymatique, les chromosomes présentent une alternance de
bandes sombres et claires ("banding") qui sont spécifiques d’un chromosome donné, ce quibandes sombres et claires ("banding") qui sont spécifiques d’un chromosome donné, ce qui
bandes sombres et claires ("banding") qui sont spécifiques d’un chromosome donné, ce quibandes sombres et claires ("banding") qui sont spécifiques d’un chromosome donné, ce qui
bandes sombres et claires ("banding") qui sont spécifiques d’un chromosome donné, ce qui
perper
perper
permet de les identifmet de les identif
met de les identifmet de les identif
met de les identifier et de les cier et de les c
ier et de les cier et de les c
ier et de les classerlasser
lasserlasser
lasser..
..
. Le banding de chaque chr Le banding de chaque chr
Le banding de chaque chr Le banding de chaque chr
Le banding de chaque chromosome est comparé auomosome est comparé au
omosome est comparé auomosome est comparé au
omosome est comparé au
banding du chromosome normal correspondant, qui est schématisé par un idéogrammebanding du chromosome normal correspondant, qui est schématisé par un idéogramme
banding du chromosome normal correspondant, qui est schématisé par un idéogrammebanding du chromosome normal correspondant, qui est schématisé par un idéogramme
banding du chromosome normal correspondant, qui est schématisé par un idéogramme
ff
ff
figurigur
igurigur
igurant à gant à g
ant à gant à g
ant à gauche de chaque pairauche de chaque pair
auche de chaque pairauche de chaque pair
auche de chaque paire de chre de chr
e de chre de chr
e de chromosomes.omosomes.
omosomes.omosomes.
omosomes. Le car Le car
Le car Le car
Le caryy
yy
yotype de cette tumeur est simple :otype de cette tumeur est simple :
otype de cette tumeur est simple :otype de cette tumeur est simple :
otype de cette tumeur est simple :
nous obsernous obser
nous obsernous obser
nous observv
vv
vons 3 copies des chrons 3 copies des chr
ons 3 copies des chrons 3 copies des chr
ons 3 copies des chromosomes 3 et 19 de romosomes 3 et 19 de r
omosomes 3 et 19 de romosomes 3 et 19 de r
omosomes 3 et 19 de rat.at.
at.at.
at.
L L
L L
L
’obser’obser
’obser’obser
’observv
vv
vation détaillée des deuxation détaillée des deux
ation détaillée des deuxation détaillée des deux
ation détaillée des deux
chromosomes 4 montre que leur taille et leur «banding» est légèrement différent, et que pourchromosomes 4 montre que leur taille et leur «banding» est légèrement différent, et que pour
chromosomes 4 montre que leur taille et leur «banding» est légèrement différent, et que pourchromosomes 4 montre que leur taille et leur «banding» est légèrement différent, et que pour
chromosomes 4 montre que leur taille et leur «banding» est légèrement différent, et que pour
l’un d’entre eux il n’est pas totalement comparable avec l’idéogramme normal du chromo-l’un d’entre eux il n’est pas totalement comparable avec l’idéogramme normal du chromo-
l’un d’entre eux il n’est pas totalement comparable avec l’idéogramme normal du chromo-l’un d’entre eux il n’est pas totalement comparable avec l’idéogramme normal du chromo-
l’un d’entre eux il n’est pas totalement comparable avec l’idéogramme normal du chromo-
some 4, la partie sous-centromérique semblant délétée.some 4, la partie sous-centromérique semblant délétée.
some 4, la partie sous-centromérique semblant délétée.some 4, la partie sous-centromérique semblant délétée.
some 4, la partie sous-centromérique semblant délétée.

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Il existe deux limites importantes
pour l’analyse caryotypique : 1)la
mise en culture des tumeurs primai-
res, qui ne réussit que dans 30-50 %
des cas, et l’obtention de préparations
chromosomiques de bonne qualité,
2) il est parfois difficile d’analyser ces
remaniements chromosomiques en
termes de gains et de pertes de maté-
riel génétique, dans le cas de rema-
niements extrêmement nombreux et
complexes. Pour remédier à ces li-
mitations, nous avons d’une part dé-
veloppé les greffes de tumeurs sur
souris immunodéficiente (nude), ce
qui permet d’obtenir du matériel tu-
moral pur (pas de contamination par
des cellules normales de rat) et en
grande quantité, et d’autre part nous
avons mis au point sur les cellules
de rat une seconde technique d’ana-
lyse globale du génome, la CGH
(Comparative Genomic Hybridiza-
tion) [7, 8]. La CGH ne nécessite pas
la mise en culture des tumeurs. Cette
technique est basée sur l’hybridation
différentielle d’un mélange équimo-
laire d’ADN provenant de cellules
normales et de cellules tumorales sur
des métaphases normales. Sachant
que l’extraction de l’ADN ne pose pas
de problème majeur, cette technique
permet d’analyser toutes les tumeurs.
Elle permet aussi de déterminer, en
une étape, l’ensemble des gains et des
pertes de matériel génétique sans ren-
seigner sur les altérations ou rema-
niements chromosomiques expli-
quant ces gains et pertes de matériel.
Par conséquent il est souhaitable, lors-
que cela est possible, de réaliser sur
la même tumeur l’analyse caryotypi-
que et la CGH.
Par ailleurs, nous avons réalisé la com-
paraison du caryotype de rat et de
souris [6]. Ce travail avait un double
intérêt : d’une part trier chaque chro-
mosome de rat pour préparer des
sondes spécifiques pour les hybrida-
tions in situ et d’autre part, améliorer
les connaissances sur le génome du
rat en comparant son génome avec
celui de la souris qui, lui, est nette-
ment mieux connu. Ceci a été d’une
aide déterminante pour l’interpréta-
tion des anomalies génétiques détec-
tées par les approches globales. En
effet, ce travail a permis de rechercher
les homologies entre les altérations
génétiques observées dans les tu-
meurs pulmonaires de rat et leur
équivalent chez la souris. Les corres-
pondances entre le génome de la
souris et celui de l’homme étant déjà
bien établies, nous avons ainsi pu
comparer nos données à celles obte-
nues dans les tumeurs pulmonaires
humaines. Par conséquent, en fonc-
tion des anomalies détectées par les
approches globales, nous pouvons
définir une approche gène(s)
candidat(s) pour poursuivre la carac-
térisation de ces tumeurs par des tech-
niques de biologie moléculaire clas-
sique.
RÉSULTATS
Analyse caryotypique et CGH
ðA ce jour, sur une série de 16 tu-
meurs radon induites en cytogénéti-
que et CGH, nous avons montré
d’une part que certaines anomalies
étaient récurrentes d’une tumeur à
l’autre.
D’autre part, il nous est apparu que
les régions altérées présentent des si-
militudes importantes avec les ano-
malies cytogénétiques et moléculai-
res détectées dans les tumeurs pul-
monaires humaines [9].
En effet, ces anomalies génétiques
observées dans les tumeurs de rat
sont homologues à des régions chro-
mosomiques fréquemment altérées
(30-80 %) dans les cancers du pou-
mon humains. Les gènes suppres-
seurs de tumeur ou les proto-onco-
gènes potentiellement impliqués (gè-
nes candidats) sont MET, p16, p15,
FHIT et RB1, sachant que dans ces
régions perdues d’autres gènes non
encore identifiés peuvent être impli-
qués. En ce qui concerne les gains, le
chromosome 6 et la bande 7q34-qter
de rat sont homologues des chromo-
somes 2 et 8 humains sur lesquels
sont localisés des oncogènes de la
famille MYC, souvent amplifiés dans
les cancers humains [9, 10].
Ces premiers résultats sont encoura-
geants, et permettent, parallèlement à
la poursuite de l’analyse cytogénéti-
que globale, de définir une stratégie
pour étudier de manière plus ciblée
les gènes potentiellement associés au
processus de transformation pulmo-
naire radon-induite, qui pourraient
constituer des marqueurs spécifiques
de la radon-et/ou radio-induction. Par
ailleurs, les similarités qui semblent
se dégager entre la transformation
radon-induite chez le rat et la tumo-
rigenèse pulmonaire humaine, suggè-
rent que notre modèle expérimental
est extrapolable à l’homme et qu’il
pourrait constituer un modèle pour
étudier les altérations génétiques pré-
coces associées à la tumorigenèse
pulmonaire humaine, en général.
Analyse ciblée du gène TP53
ðNous avons, parallèlement à l’ana-
lyse globale des altérations cytogéné-
tiques, développé des approches ci-
blées pour caractériser sur le plan
moléculaire les mutations induites
par l’irradiation. Nous avons tout
d’abord analysé le gène suppresseur
de tumeur TP53 car il est très fré-
quemment altéré dans les tumeurs
solides et son inactivation se fait par
mutation d’un allèle et perte de l’al-
lèle sauvage. De ce fait, ce gène est
une des cibles idéales pour définir
s’il existe une spécificité dans le
spectre des mutations radioinduites.
Nous avons recherché les mutations
du gène TP53 par séquençage d’une
série de 39 tumeurs de rat radon-in-
duites, les résultats sont présentés
dans le tableau Itableau I
tableau Itableau I
tableau I. Le point remarqua-
ble dans ces résultats, n’est pas direc-
tement la fréquence de mutations, qui
est de l’ordre de grandeur de celle
décrite dans les tumeurs humaines
en général, mais le type d’altérations.
A titre comparatif, nous présentons
dans le tableau IItableau II
tableau IItableau II
tableau II la fréquence de
délétions répertoriées dans les bases
de données des mutations de TP53
dans les tumeurs humaines.
Nos résultats montrent que la fré-
quence des délétions est beaucoup
plus élevée que celle observée dans

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M.N. Guilly, Ch. Joubert, C. Levalois, L. Dano, S. Chevillard
les tumeurs spontanées ou celles in-
duites par d’autres mutagènes. De
plus, au sein des délétions, les pertes
de deux ou plusieurs nucléotides
sont beaucoup plus fréquentes dans
les tumeurs radioinduites chez le rat
et chez l’homme, que dans les tu-
meurs spontanées humaines. Outre
la mise en évidence d’une spécificité
des altérations génétiques radioindui-
tes, ces résultats nous mettent sur la
piste des mécanismes de la cancéro-
genèse induite par l’irradiation. En
effet, les mutations ponctuelles et les
délétions d’une base indiquent pré-
férentiellement des erreurs dans la
réparation de bases altérées ou dans
la réplication, alors que les délétions
supérieures à 1 base seraient plutôt
la résultante de cassures-fusions dou-
ble brins de l’ADN.
TT
TT
Taa
aa
abb
bb
bleau I.leau I.
leau I.leau I.
leau I.
Mutations du gène Mutations du gène
Mutations du gène Mutations du gène
Mutations du gène TP53.TP53.
TP53.TP53.
TP53. Les m Les m
Les m Les m
Les mutations ont été rutations ont été r
utations ont été rutations ont été r
utations ont été recec
ecec
echerher
herher
hercc
cc
chéeshées
héeshées
hées
par séquençapar séquença
par séquençapar séquença
par séquençagg
gg
ge de la pare de la par
e de la pare de la par
e de la partie codante du gène tie codante du gène
tie codante du gène tie codante du gène
tie codante du gène TP53.TP53.
TP53.TP53.
TP53.
Sur 39 tumeurSur 39 tumeur
Sur 39 tumeurSur 39 tumeur
Sur 39 tumeurs anals anal
s anals anal
s analysées,ysées,
ysées,ysées,
ysées, 8 présentaient une altér 8 présentaient une altér
8 présentaient une altér 8 présentaient une altér
8 présentaient une altération du gène.ation du gène.
ation du gène.ation du gène.
ation du gène.
Tumeurs Mutations de TP53
14661 Délétion > 40 bases
14663 Délétion: 27 bases
14875 Délétion > 40 bases
15395 Transition: 124 TAC (Tyr) → TGC (Cys)
15413 Délétion > 40 bases
15469 Délétion: 184 bases
15546 Délétion: 2 bases
15650 Délétion: 3 bases
DELETIONS
Total 1 pb > 1pb
Toutes tumeurs 935/10397
9 %
426/935
45 %
509/935
55 %
Poumon 107/1232
9 %
60/107
56 %
47/107
44 %
TT
TT
Taa
aa
abb
bb
bleau II.leau II.
leau II.leau II.
leau II.
Récapitulatif des délétions de Récapitulatif des délétions de
Récapitulatif des délétions de Récapitulatif des délétions de
Récapitulatif des délétions de TP53 décrTP53 décr
TP53 décrTP53 décr
TP53 décrites dans les bases deites dans les bases de
ites dans les bases deites dans les bases de
ites dans les bases de
données de tumeurdonnées de tumeur
données de tumeurdonnées de tumeur
données de tumeurs humaines.s humaines.
s humaines.s humaines.
s humaines. Nous a Nous a
Nous a Nous a
Nous avv
vv
vons distingué les délétionsons distingué les délétions
ons distingué les délétionsons distingué les délétions
ons distingué les délétions
d’une paird’une pair
d’une paird’une pair
d’une paire de bases de celles supére de bases de celles supér
e de bases de celles supére de bases de celles supér
e de bases de celles supérieurieur
ieurieur
ieures à 1 paires à 1 pair
es à 1 paires à 1 pair
es à 1 paire de bases.e de bases.
e de bases.e de bases.
e de bases.
CONCLUSION
ðAinsi, il est peu réaliste d’imaginer
obtenir une véritable signature des
radiations par l’analyse des mutations.
C’est plutôt la nature des lésions, en
particulier l’observation d’une série
de délétions de plus de deux paires
de bases, qui devrait avoir une valeur
pour suspecter l’origine radioinduite
d’une tumeur. Dans cette hypothèse,
ce type d’altération ne devrait pas être
limité au seul gène TP53 mais devrait
être retrouvé dans d’autres gènes
suppresseurs inactivés par mutation,
tel que p16, par exemple. Nous pour-
suivons nos études sur les tumeurs
radioinduites de l’animal dans ce sens,
et développons en collaboration avec
B. Dutrillaux et B. Malfoy (Institut Cu-
rie, Paris) une approche similaire sur
les tumeurs humaines radio-induites
[11]. Par ailleurs, nous développons
d’autres modèles de tumeurs radio-
induites chez le rat : des tumeurs du
poumon induites par inhalation de
plutonium et de neptunium et des
ostéosarcomes induits par des injec-
tions de plutonium. L’analyse de ces
tumeurs nous permettra de définir si
ces premières conclusions ont une
portée générale, quels que soient les
tumeurs, les types d’irradiation et les
voies de contamination.

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Genetic and molecular analysis of radon-induced rat lung tumours
We have a model of radon-induced rat lung tumours, which allow us to analyse the
cytogenetic and molecular alterations of the tumours. The aim is to better understand the
mechanisms of radio-induced carcinogenesis and to define if it exists a specificity of radio-induced
genetic alterations as compared to the genetic alterations found in the sporadic tumours. We have
started our analysis by developing global cyctogenetic and molecular approaches. We have shown
that some alterations are recurrent. The genes that are potentially involved are the oncogene
MET and the tumour suppressor gene p16, which are also frequently altered in human lung
tumours. Simultaneously, we have focussed our analysis by targeting the search of mutation in
the tumour suppressor gene TP3. We have found that 8 of 39 tumours were mutated by deletion in
the coding sequence of TP53. This high frequency of deletion, which is not observed in the
human p53 mutation database could constitute a signature of radio-induced alterations. On this
assumption, this type of alteration should not be only found on TP53 gene but also in other
suppressor genes which are inactivated by a mutation such as p16 for example . The work we are
carrying out on radio-induced tumours among humans and animals is directed to this end.
Radon - Radio-induced tumours - Cytogenetic - Mutation