Analyse cytogénétique et moléculaire des tumeurs pulmonaires

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Analyse cytogénétique et moléculaire des tumeurs pulmonaires radon-induites chez le rat
Analyse cytogénétique et moléculaire des tumeurs pulmonaires
radon-induites chez le rat.
M.N. Guilly, Ch. Joubert,
C. Levalois, L. Dano, S. Chevillard
CEA DSV DRR - Fontenay-aux-Roses - France
Résumé
Le laboratoire dispose d’un modèle de tumeurs pulmonaires radon-induites chez le rat
qui nous permet d’analyser les altérations cytogénétiques et moléculaires des tumeurs. Le but de
notre étude est de mieux comprendre la cancérogenèse radon- radio-induite et de définir s’il
existe une spécificité des altérations génétiques et moléculaires dans les tumeurs radio-induites
par rapport aux anomalies détectées dans les tumeurs sporadiques ou induites par d’autres agents
carcinogènes. Pour débuter la caractérisation des tumeurs, nous avons recherché les anomalies
génétiques par des approches de cytogénétique globale. Nous avons montré que certaines anomalies étaient récurrentes d’une tumeur à l’autre. Les gènes potentiellement impliqués sont le
pro-oncogène MET et le gène suppresseur de tumeur p16, qui sont très fréquemment altérés dans
les tumeurs pulmonaires humaines. Nous avons parallèlement ciblé le gène TP53 en recherchant
si ce gène présentait des altérations dans les tumeurs. Nous avons montré que 8/39 tumeurs
présentaient une mutation et que dans 7 cas, la mutation était une délétion. Cette fréquence
élevée de délétions pourrait constituer une spécificité des altérations radio-induites car ce type
d’altération de TP53 est rarement décrite dans les bases de données de tumeurs (non radio-induites) humaines ou animales. Dans cette hypothèse, ce type d’altération ne devrait pas être limité au
seul gène TP53 mais devrait être retrouvé dans d’autres gènes inactivés par mutation, tel que p16
par exemple. La poursuite de l’analyse globale des tumeurs nous orientera sur les gènes que nous
devrons cibler pour rechercher une possible signature moléculaire des tumeurs radio-induites.
Radon - Tumeurs radioinduites - Cytogénétique - Mutation
Correspondance : Sylvie Chevillard - CEA DSV DRR - 60-68 avenue du Général Leclerc - 92265 Fontenay-aux-Roses Cedex
Tél.: 01 46 54 88 89 - Fax: 01 46 54 88 86 - E-mail: [email protected]
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Médecine Nucléaire - Imagerie fonctionnelle et métabolique - 2002 - vol.26 - n°3
M.N. Guilly, Ch. Joubert, C. Levalois, L. Dano, S. Chevillard
INTRODUCTION
ðLe radon est un polluant ubiquitaire
naturel d’origine tellurique. Ce gaz,
émetteur de rayons α pose de multiples questions, puisque sa concentration, forte dans les mines notamment
d’uranium, peut aussi atteindre des
niveaux élevés dans certaines habitations. En terme de dose, il représente
37 % de l’irradiation de la population.
Un excès de cancers du poumon a
été rapporté dans différentes enquêtes épidémiologiques chez les travailleurs des mines, notamment celles d’uranium. Les enquêtes épidémiologiques suggèrent également
une association entre la survenue des
cancers du poumon et l’exposition
domestique au radon, mais aucune
corrélation n’a été établie de manière
univoque entre les effets observés et
les niveaux d’exposition [1-4]. Ainsi,
à l’heure actuelle, le risque après exposition à de faibles doses est calculé
par extrapolation à partir des données
acquises chez les mineurs.
On sait aujourd’hui qu’une signature
désignant l’origine radio-induite d’un
cancer ne sera pas fournie par les critères classiques : rien ne permet, par
la clinique, par l’analyse histopathologique ni par les examens de laboratoires médicaux, de différencier, par
exemple les adénocarcinomes "spontanés" de ceux qui sont présumés être
radio-induits. Les progrès réalisés en
génotoxicologie, c’est à dire l’étude
moléculaire après exposition à des
toxiques, offre cependant des ouvertures prometteuses.
Les altérations génétiques détectées
dans les tumeurs peuvent refléter leur
étiologie et le rôle spécifique des
événements précoces dans le développement de celles-ci. Dans les tumeurs solides, il existe de nombreux
réarrangements chromosomiques caractérisés par des pertes et des gains
de matériel génique. Les régions
chromosomiques perdues comporteraient des gènes suppresseurs de tumeurs alors que les régions gagnées
contiendraient des oncogènes potentiellement impliqués dans la transformation maligne. La difficulté est que
chaque région chromosomique perdue ou gagnée peut contenir des centaines de gènes.
Afin de déterminer la spécificité des
altérations génétiques dans les tumeurs radon-induites, il est indispensable, dans un premier temps, de travailler sur des modèles expérimentaux reproductibles, dans la mesure
où, chez l’homme, la fréquence de ces
tumeurs présumées radon-induites
est faible. De plus, elles se développent le plus souvent dans un contexte de tabagisme, et dans tous les
cas, elles sont difficilement attribuables à un seul facteur de risque.
Nous disposons d’un modèle expérimental permettant l’étude des effets
à court et long termes d’une inhalation de radon (faibles et fortes doses,
faibles et forts débits de dose) sur la
cancérogenèse pulmonaire chez le rat
[5]. L’étude des altérations cytogénétiques et moléculaires dans les tumeurs pulmonaires radon-induites
permettra, nous l’espérons, de mieux
comprendre les mécanismes de la
cancérogenèse radon- radioinduite et
à terme de définir des outils biologiques signant avec une probabilité élevée la nature radioinduite des tumeurs par comparaison avec des tumeurs sporadiques de même type
histologique.
DÉMARCHE EXPÉRIMENTALE
ðLa démarche expérimentale suivie
a été de mettre au point, dans un premier temps, des techniques d’analyse
globale du génome de rat afin de repérer les régions chromosomiques
gagnées ou perdues, pour dans un
deuxième temps développer une approche ciblée permettant d’identifier
précisément les gènes impliqués et
par quelles voies ils sont activés ou
réprimés. L’étude globale des remaniements chromosomiques a été réalisée par cytogénétique classique en
analysant le caryotype des cellules
figure 1
tumorales (figure
1), les anomalies
détectées étant dans un deuxième
temps confirmées ou précisées par
hybridation in situ à l’aide de sondes
chromosomiques spécifiques que
nous préparons [6].
4
-4q12-q21
RNO4 FITC
B
F igur
y otype d’une tumeur pulmonair
at rradon-induite.
adon-induite. Nous réalisons des
iguree 1. Car
Cary
pulmonairee de rrat
étalements chromosomiques à partir de tumeurs pulmonaires prélevées chez le rat et mises
en culture. Après un traitement enzymatique, les chromosomes présentent une alternance de
bandes sombres et claires ("banding") qui sont spécifiques d’un chromosome donné, ce qui
per
met de les identif
ier et de les cclasser
lasser
omosome est comparé au
permet
identifier
lasser.. Le banding de chaque chr
chromosome
banding du chromosome normal correspondant, qui est schématisé par un idéogramme
f igur
ant à ggauche
auche de chaque pair
omosomes. Le car
yotype de cette tumeur est simple :
igurant
pairee de chr
chromosomes.
cary
nous obser
v ons 3 copies des chr
omosomes 3 et 19 de rrat.
at. LL’obser
’obser
v ation détaillée des deux
observ
chromosomes
’observ
chromosomes 4 montre que leur taille et leur «banding» est légèrement différent, et que pour
l’un d’entre eux il n’est pas totalement comparable avec l’idéogramme normal du chromosome 4, la partie sous-centromérique semblant délétée.
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Il existe deux limites importantes
pour l’analyse caryotypique : 1)la
mise en culture des tumeurs primaires, qui ne réussit que dans 30-50 %
des cas, et l’obtention de préparations
chromosomiques de bonne qualité,
2) il est parfois difficile d’analyser ces
remaniements chromosomiques en
termes de gains et de pertes de matériel génétique, dans le cas de remaniements extrêmement nombreux et
complexes. Pour remédier à ces limitations, nous avons d’une part développé les greffes de tumeurs sur
souris immunodéficiente (nude), ce
qui permet d’obtenir du matériel tumoral pur (pas de contamination par
des cellules normales de rat) et en
grande quantité, et d’autre part nous
avons mis au point sur les cellules
de rat une seconde technique d’analyse globale du génome, la CGH
(Comparative Genomic Hybridization) [7, 8]. La CGH ne nécessite pas
la mise en culture des tumeurs. Cette
technique est basée sur l’hybridation
différentielle d’un mélange équimolaire d’ADN provenant de cellules
normales et de cellules tumorales sur
des métaphases normales. Sachant
que l’extraction de l’ADN ne pose pas
de problème majeur, cette technique
permet d’analyser toutes les tumeurs.
Elle permet aussi de déterminer, en
une étape, l’ensemble des gains et des
pertes de matériel génétique sans renseigner sur les altérations ou remaniements chromosomiques expliquant ces gains et pertes de matériel.
Par conséquent il est souhaitable, lorsque cela est possible, de réaliser sur
la même tumeur l’analyse caryotypique et la CGH.
Par ailleurs, nous avons réalisé la comparaison du caryotype de rat et de
souris [6]. Ce travail avait un double
intérêt : d’une part trier chaque chromosome de rat pour préparer des
sondes spécifiques pour les hybridations in situ et d’autre part, améliorer
les connaissances sur le génome du
rat en comparant son génome avec
celui de la souris qui, lui, est nettement mieux connu. Ceci a été d’une
aide déterminante pour l’interprétation des anomalies génétiques détectées par les approches globales. En
effet, ce travail a permis de rechercher
les homologies entre les altérations
162
génétiques observées dans les tumeurs pulmonaires de rat et leur
équivalent chez la souris. Les correspondances entre le génome de la
souris et celui de l’homme étant déjà
bien établies, nous avons ainsi pu
comparer nos données à celles obtenues dans les tumeurs pulmonaires
humaines. Par conséquent, en fonction des anomalies détectées par les
approches globales, nous pouvons
définir une approche gène(s)
candidat(s) pour poursuivre la caractérisation de ces tumeurs par des techniques de biologie moléculaire classique.
RÉSULTATS
Ces premiers résultats sont encourageants, et permettent, parallèlement à
la poursuite de l’analyse cytogénétique globale, de définir une stratégie
pour étudier de manière plus ciblée
les gènes potentiellement associés au
processus de transformation pulmonaire radon-induite, qui pourraient
constituer des marqueurs spécifiques
de la radon-et/ou radio-induction. Par
ailleurs, les similarités qui semblent
se dégager entre la transformation
radon-induite chez le rat et la tumorigenèse pulmonaire humaine, suggèrent que notre modèle expérimental
est extrapolable à l’homme et qu’il
pourrait constituer un modèle pour
étudier les altérations génétiques précoces associées à la tumorigenèse
pulmonaire humaine, en général.
Analyse caryotypique et CGH
Analyse ciblée du gèneTP53
ðA ce jour, sur une série de 16 tumeurs radon induites en cytogénétique et CGH, nous avons montré
d’une part que certaines anomalies
étaient récurrentes d’une tumeur à
l’autre.
ðNous avons, parallèlement à l’analyse globale des altérations cytogénétiques, développé des approches ciblées pour caractériser sur le plan
moléculaire les mutations induites
par l’irradiation. Nous avons tout
d’abord analysé le gène suppresseur
de tumeur TP53 car il est très fréquemment altéré dans les tumeurs
solides et son inactivation se fait par
mutation d’un allèle et perte de l’allèle sauvage. De ce fait, ce gène est
une des cibles idéales pour définir
s’il existe une spécificité dans le
spectre des mutations radioinduites.
Nous avons recherché les mutations
du gène TP53 par séquençage d’une
série de 39 tumeurs de rat radon-induites, les résultats sont présentés
dans le tableau II. Le point remarquable dans ces résultats, n’est pas directement la fréquence de mutations, qui
est de l’ordre de grandeur de celle
décrite dans les tumeurs humaines
en général, mais le type d’altérations.
A titre comparatif, nous présentons
dans le tableau II la fréquence de
délétions répertoriées dans les bases
de données des mutations de TP53
dans les tumeurs humaines.
D’autre part, il nous est apparu que
les régions altérées présentent des similitudes importantes avec les anomalies cytogénétiques et moléculaires détectées dans les tumeurs pulmonaires humaines [9].
En effet, ces anomalies génétiques
observées dans les tumeurs de rat
sont homologues à des régions chromosomiques fréquemment altérées
(30-80 %) dans les cancers du poumon humains. Les gènes suppresseurs de tumeur ou les proto-oncogènes potentiellement impliqués (gènes candidats) sont MET, p16, p15,
FHIT et RB1, sachant que dans ces
régions perdues d’autres gènes non
encore identifiés peuvent être impliqués. En ce qui concerne les gains, le
chromosome 6 et la bande 7q34-qter
de rat sont homologues des chromosomes 2 et 8 humains sur lesquels
sont localisés des oncogènes de la
famille MYC, souvent amplifiés dans
les cancers humains [9, 10].
Nos résultats montrent que la fréquence des délétions est beaucoup
plus élevée que celle observée dans
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M.N. Guilly, Ch. Joubert, C. Levalois, L. Dano, S. Chevillard
les tumeurs spontanées ou celles induites par d’autres mutagènes. De
plus, au sein des délétions, les pertes
de deux ou plusieurs nucléotides
sont beaucoup plus fréquentes dans
les tumeurs radioinduites chez le rat
et chez l’homme, que dans les tumeurs spontanées humaines. Outre
la mise en évidence d’une spécificité
des altérations génétiques radioinduites, ces résultats nous mettent sur la
piste des mécanismes de la cancérogenèse induite par l’irradiation. En
effet, les mutations ponctuelles et les
délétions d’une base indiquent préférentiellement des erreurs dans la
réparation de bases altérées ou dans
la réplication, alors que les délétions
supérieures à 1 base seraient plutôt
la résultante de cassures-fusions double brins de l’ADN.
Ta b leau I.
Mutations du gène TP53. Les m
utations ont été rrec
ec
her
c hées
mutations
echer
herc
par séquença
ge de la par
tie codante du gène TP53.
séquençag
partie
Sur 39 tumeur
ysées, 8 présentaient une altér
ation du gène.
tumeurss anal
analysées,
altération
Tumeurs
Mutations de TP53
14661
Délétion > 40 bases
14663
Délétion: 27 bases
14875
Délétion > 40 bases
15395
Transition: 124 TAC (Tyr) → TGC (Cys)
15413
Délétion > 40 bases
15469
Délétion: 184 bases
15546
Délétion: 2 bases
15650
Délétion: 3 bases
Ta b leau II.
Récapitulatif des délétions de TP53 décr
ites dans les bases de
décrites
données de tumeur
v ons distingué les délétions
tumeurss humaines. Nous aav
d’une pair
e de bases de celles supér
ieur
es à 1 pair
e de bases.
paire
supérieur
ieures
paire
DELETIONS
Toutes tumeurs
Poumon
Total
1 pb
> 1pb
935/10397
426/935
509/935
9%
45 %
55 %
107/1232
60/107
47/107
9%
56 %
44 %
Médecine Nucléaire - Imagerie fonctionnelle et métabolique - 2002 - vol.26 - n°3
CONCLUSION
ðAinsi, il est peu réaliste d’imaginer
obtenir une véritable signature des
radiations par l’analyse des mutations.
C’est plutôt la nature des lésions, en
particulier l’observation d’une série
de délétions de plus de deux paires
de bases, qui devrait avoir une valeur
pour suspecter l’origine radioinduite
d’une tumeur. Dans cette hypothèse,
ce type d’altération ne devrait pas être
limité au seul gène TP53 mais devrait
être retrouvé dans d’autres gènes
suppresseurs inactivés par mutation,
tel que p16, par exemple. Nous poursuivons nos études sur les tumeurs
radioinduites de l’animal dans ce sens,
et développons en collaboration avec
B. Dutrillaux et B. Malfoy (Institut Curie, Paris) une approche similaire sur
les tumeurs humaines radio-induites
[11]. Par ailleurs, nous développons
d’autres modèles de tumeurs radioinduites chez le rat : des tumeurs du
poumon induites par inhalation de
plutonium et de neptunium et des
ostéosarcomes induits par des injections de plutonium. L’analyse de ces
tumeurs nous permettra de définir si
ces premières conclusions ont une
portée générale, quels que soient les
tumeurs, les types d’irradiation et les
voies de contamination.
163
Analyse cytogénétique et moléculaire des tumeurs pulmonaires radon-induites chez le rat
Genetic and molecular analysis of radon-induced rat lung tumours
We have a model of radon-induced rat lung tumours, which allow us to analyse the
cytogenetic and molecular alterations of the tumours. The aim is to better understand the
mechanisms of radio-induced carcinogenesis and to define if it exists a specificity of radio-induced
genetic alterations as compared to the genetic alterations found in the sporadic tumours. We have
started our analysis by developing global cyctogenetic and molecular approaches. We have shown
that some alterations are recurrent. The genes that are potentially involved are the oncogene
MET and the tumour suppressor gene p16, which are also frequently altered in human lung
tumours. Simultaneously, we have focussed our analysis by targeting the search of mutation in
the tumour suppressor gene TP3. We have found that 8 of 39 tumours were mutated by deletion in
the coding sequence of TP53. This high frequency of deletion, which is not observed in the
human p53 mutation database could constitute a signature of radio-induced alterations. On this
assumption, this type of alteration should not be only found on TP53 gene but also in other
suppressor genes which are inactivated by a mutation such as p16 for example . The work we are
carrying out on radio-induced tumours among humans and animals is directed to this end.
Radon - Radio-induced tumours - Cytogenetic - Mutation
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