liste des tableaux - Université de Sherbrooke

Université de Sherbrooke
Étude du métabolisme cérébral au cours du vieillissement sain chez le rat : impact de
la diète cétogène et de la restriction calorique
Par
Maggie Roy
Programme de Physiologie
Thèse présentée à la Faculté de médecine et des sciences de la santé
en vue de l’obtention du grade de philosophiae doctor (Ph.D.)
en Physiologie
Sherbrooke, Québec, Canada
Avril, 2014
Membres du jury d’évaluation
Pr Stephen Cunnane, Département de Physiologie et Biophysique
Pr Rona Graham, Département de Physiologie et Biophysique
Pr Xavier Roucou, Département de Biochimie
Pr Grant Mitchell, Département de Pédiatrie, Faculté de Médecine, Université de Montréal
© Maggie Roy, 2014
“Let food be your medicine”
Hippocrate, 400 av. J.-C
iii
RÉSUMÉ
Étude du métabolisme cérébral au cours du vieillissement sain chez le rat : impact de
la diète cétogène et de la restriction calorique
Par
Maggie Roy
Programme de Physiologie
Thèse présentée à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l’obtention
du diplôme de philosophiae doctor (Ph.D.) en Physiologie, Faculté de médecine et des
sciences de la santé, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4
Les personnes atteintes de la maladie d’Alzheimer présentent une diminution de la
capture cérébrale du glucose, qui semble être impliquée dans le développement des
problèmes cognitifs associés à la maladie. Toutefois, il n’y a encore aucun consensus quant
à savoir si la capture cérébrale du glucose est diminuée chez les personnes âgées
cognitivement saines. En condition de déficit de glucose, les cétones sont le substrat
énergétique alternatif pour le cerveau. La diète cétogène, induisant une cétose légère,
améliore les fonctions cognitives chez les modèles animaux et chez l’homme. Notre
premier objectif était d’évaluer l’effet du vieillissement sain et de la diète cétogène sur la
capture cérébrale du glucose et des cétones chez le rat. Pour cela, la capture cérébrale de
radiotraceurs analogues au glucose et aux cétones a été mesurée par tomographie par
émission de positons. Nos résultats montrent que la capture des deux principaux substrats
énergétiques du cerveau est globalement similaire chez des rats sains jeunes et âgés, mais
est plus élevée suite à la diète cétogène. L’induction d’une cétose légère pourrait corriger la
diminution de capture cérébrale du glucose subvenant au cours de la maladie d’Alzheimer.
Le second objectif était de déterminer l’effet d’une diète cétogène sur le métabolisme
cérébral du glucose et des cétones chez le rat. Pour cela, les différents intermédiaires des
voies métaboliques du glucose et des cétones ont été mesurés par spectroscopie par
résonance magnétique nucléaire. Les résultats démontrent que le métabolisme du glucose et
des cétones dans les cellules du cerveau est plus élevé suite à la diète cétogène. Le contenu
en acide -aminobutyrique, le principal neurotransmetteur inhibiteur, est aussi plus élevé
suite à la diète cétogène, ce qui pourrait contribuer à l’effet antiépileptique de la diète
cétogène. Le troisième objectif était d’évaluer l’impact d’une restriction calorique à long
terme, pouvant induire une cétose légère, sur le métabolisme cérébral chez des rats âgés
sains. Nos résultats montrent que, couplée à une diète à haute teneur en sucrose et faible en
acides gras oméga-3, la restriction calorique à long terme chez les rats âgés ne modifie pas
le profil des métabolites et des acides gras du cerveau. La déficience en acides gras oméga3 et la surcharge de sucrose pourraient empêcher une grande partie des effets bénéfiques de
la restriction calorique au cerveau.
Mots clés : métabolisme cérébral, glucose, cétones, vieillissement, diète cétogène,
restriction calorique, tomographie par émission de positons, spectroscopie par résonance
magnétique nucléaire
iv
SUMMARY
The study of brain metabolism during aging in rats: the effect of the ketogenic diet
and calorie restriction
By
Maggie Roy
Physiology Program
Thesis presented at the Faculty of medicine and health sciences for the obtention of Doctor
degree diploma philosophiae doctor (Ph.D.) in Physiology, Faculty of medicine and health
sciences, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4
Alzheimer’s disease is associated with a reduction of brain glucose uptake, which
may be involved in the development of the cognitive problems associated with the disease.
It is however unclear whether brain glucose uptake is decreased in the cognitively healthy
elderly. Under conditions of glucose deficit, ketones are the alternative brain energy
substrate. A mild ketosis, induced by the ketogenic diet, improves cognitive functions in
animal models and humans. Our first objective was to evaluate the effect of healthy aging
and of a ketogenic diet on brain glucose and ketone uptake in the rat. Brain uptake of
radiotracers analogous to glucose and ketones was measured by positron emission
tomography. Our results show that the uptake of the brains two main energy substrates is
generally similar in healthy young and aged rats, but is higher under the ketogenic diet. The
induction of a mild ketosis may compensate the reduction of brain glucose uptake occurring
in Alzheimer’s disease. The second objective was to assess the effect of a ketogenic diet on
brain glucose and ketone metabolism in the rat. Metabolic pathway intermediates of
glucose and ketones were measured by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Results
show that glucose and ketone metabolism in brain cells is higher under the ketogenic diet.
Content of -aminobutyric acid, the main inhibitory neurotransmitter, is also higher under
the ketogenic diet, which could contribute to the antiepileptic effect of the ketogenic diet.
The third objective was to evaluate the effect of a long-term calorie restriction, which may
induce a mild ketosis, on brain metabolism in healthy aged rats. Our results show that, in
conjunction with a diet enriched in sucrose and low in omega-3 fatty acids, long-term
calorie restriction in aged rats does not change brain metabolite and fatty acid profiles.
Omega-3 fatty acid deficiency and an overload of sucrose may prevent the beneficial
effects associated with calorie restriction in the brain.
Keywords: brain metabolism, glucose, ketones, aging, ketogenic diet, calorie restriction,
positron emission tomography, nuclear magnetic resonance spectroscopy
v
TABLES DES MATIÈRES
Résumé........................................................................................................................................... iii
Summary ........................................................................................................................................ iv
Liste des figures ........................................................................................................................ viii
Liste des tableaux ........................................................................................................................ ix
Liste des abréviations ................................................................................................................. x
1.
2.
Introduction générale ........................................................................................................ 1
État de l’art ............................................................................................................................. 3
2.1.
Le déclin cognitif et le métabolisme cérébral ............................................................... 3
2.1.1.
La maladie d’Alzheimer .............................................................................................................. 3
2.1.2.
Le vieillissement sain .................................................................................................................. 5
2.2.
Les substrats énergétiques du cerveau ........................................................................... 7
2.2.1.
Le glucose ......................................................................................................................................... 7
2.2.2.
Les cétones....................................................................................................................................... 9
2.2.2.1.
Les effets protecteurs des cétones au cerveau .......................................................................... 17
2.3.
La diète cétogène ................................................................................................................... 18
2.4.
La restriction calorique ....................................................................................................... 20
2.5.
La compartimentation neurone : astrocyte ................................................................. 23
2.5.1.
La régulation des neurotransmetteurs ............................................................................. 24
2.5.2.
Le métabolisme énergétique ................................................................................................. 26
2.6.
Les acides gras au cerveau ................................................................................................. 29
2.7.
La mesure du métabolisme cérébral .............................................................................. 30
2.7.1.
La tomographie par émission de positons (TEP) ......................................................... 31
2.7.1.1.
Le 18F-fluorodésoxyglucose ................................................................................................................ 32
2.7.1.2.
Le 11C-acétoacétate ................................................................................................................................ 34
2.7.1.3.
Analyse régionale du cerveau ........................................................................................................... 35
2.7.2.
La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) .............................. 37
2.7.2.1.
Les isotopes stables ............................................................................................................................... 39
2.7.2.2.
La rotation à l’angle magique ............................................................................................................ 40
2.7.2.3.
Les métabolites détectés ..................................................................................................................... 42
3.
Problématique ................................................................................................................... 45
4.
Hypothèses/Objectifs ...................................................................................................... 45
5.
Article 1 ................................................................................................................................ 47
vi
6.
7.
8.
5.1.
Résumé ...................................................................................................................................... 48
5.2.
Abstract ..................................................................................................................................... 49
5.3.
Introduction .............................................................................................................................. 50
5.4.
Results......................................................................................................................................... 51
5.5.
Discussion .................................................................................................................................. 59
5.6.
Conclusion ................................................................................................................................. 62
5.7.
Experimental Procedures ...................................................................................................... 62
ARTICLE 2 ............................................................................................................................. 67
6.1.
Résumé ....................................................................................................................................... 68
6.2.
Abstract ...................................................................................................................................... 69
6.3.
Introduction .............................................................................................................................. 70
6.4.
Materials and Methods ........................................................................................................... 71
6.5.
Results......................................................................................................................................... 74
6.6.
Discussion .................................................................................................................................. 81
6.7.
Conclusions................................................................................................................................ 89
ARTICLE 3 ............................................................................................................................. 90
7.1.
Résumé ....................................................................................................................................... 91
7.2.
Abstract ...................................................................................................................................... 92
7.4.
Material and methods ............................................................................................................. 94
7.5.
Results......................................................................................................................................... 98
7.6.
Discussion ............................................................................................................................... 104
7.7.
Conclusions............................................................................................................................. 108
Discussion ......................................................................................................................... 110
8.1.
La capture cérébrale des cétones et du glucose par imagerie TEP (article 1) ....... 110
8.1.1.
L’effet du vieillissement ...............................................................................................................111
8.1.2.
Les différences régionales de la capture du 11C-AcAc et du 18F-FDG .......................113
8.1.3.
L’effet de la diète cétogène .........................................................................................................115
8.1.4.
Les forces ..........................................................................................................................................119
8.1.5.
Les limites .........................................................................................................................................120
8.2.
Le métabolisme cérébral des cétones et du glucose en spectroscopie RMN (article 2)
................................................................................................................................................... 121
8.2.1.
L’effet de la diète cétogène sur le métabolisme des cétones ...........................................121
8.2.1.1.
Le métabolisme mitochondrial ...................................................................................................... 121
8.2.1.2.
La compartimentation neurone : astrocyte ............................................................................. 125
vii
8.2.2.
L’effet de la diète cétogène sur le système GABAergique ...............................................127
8.2.3.
L’effet de la diète cétogène sur le métabolisme du glucose ............................................130
8.2.4.
Les forces ..........................................................................................................................................131
8.2.5.
Les limites .........................................................................................................................................132
8.3.
L’effet de la restriction calorique sur le métabolisme cérébral chez des rats âgés
(article 3) ............................................................................................................................................... 132
8.3.1.
Les métabolites cérébraux...........................................................................................................133
8.3.2.
Les acides gras cérébraux ...........................................................................................................134
8.3.2.1.
L’effet du vieillissement ....................................................................................................................... 134
8.3.2.2.
L’effet de la restriction calorique .................................................................................................... 137
8.3.3.
8.3.3.1.
L’effet du vieillissement ....................................................................................................................... 137
8.3.3.2.
L’effet de la restriction calorique .................................................................................................... 138
8.3.4.
L’effet d’une diète riche en sucrose ........................................................................................139
8.3.5.
Les forces ..........................................................................................................................................141
8.3.6.
Les limites .........................................................................................................................................141
8.4.
9.
Les transporteurs des substrats énergétiques au cerveau ................................................137
Résumé des effets observés dans les trois articles ......................................................... 142
8.4.1.
Les effets du vieillissement sur le métabolisme cérébral .................................................142
8.4.2.
Les effets de la diète cétogène sur le métabolisme cérébral ............................................143
8.4.3.
La relation entre la diète cétogène et la restriction calorique ........................................144
Conclusions et Perspectives........................................................................................ 146
10.
Remerciements ...........................................................................................................148
11.
Liste des références ...................................................................................................150
12.
Annexes.......................................................................................................................... 173
12.1 Annexe 1: Article méthodologique dans Journal of Visualized Experiments ...... 173
12.2 Annexe 2 : Productions scientifiques ............................................................................... 189
12.3 Annexe 3 : Composition de la diète cétogène et de la diète contrôle ................... 194
viii
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Capture cérébrale du glucose chez un patient Alzheimer ...................................... 4
Figure 2 : Transporteurs du glucose (GLUT) au cerveau ....................................................... 7
Figure 3 : Voie de la glycolyse ............................................................................................... 8
Figure 4 : Cycle de Krebs ....................................................................................................... 9
Figure 5 : Voie de la cétogenèse ........................................................................................... 10
Figure 6 : Schéma de l’approvisionnement du cerveau en cétones ...................................... 11
Figure 7 : Voie de synthèse des cétones à partir de la leucine.............................................. 12
Figure 8 : Régulation de la cétogenèse ................................................................................. 13
Figure 9 : Transporteurs des acides monocarboxyliques (MCT) au cerveau ....................... 14
Figure 10 : Voie de la cétolyse ............................................................................................. 15
Figure 11 : Relation entre la capture cérébrale des cétones et leur concentration plasmatique
...................................................................................................................................... 16
Figure 12 : Effets de la restriction calorique sur les voies métaboliques du foie ................. 21
Figure 13 : Effets de la restriction calorique et des cétones au cerveau ............................... 23
Figure 14 : Cycle glutamate-glutamine ................................................................................ 25
Figure 15 : Recapture de l’acide -aminobutyrique (GABA) par les astrocytes .................. 26
Figure 16 : Navette astrocyte-neurone du lactate ................................................................. 27
Figure 17 : Métabolisme du pyruvate : neurone vs astrocyte ............................................... 28
Figure 18 : Principe de la Tomographie par Émission de Positons (TEP) ........................... 32
Figure 19 : Métabolisme du 18F-fluorodésoxyglucose (18F-FDG)........................................ 33
Figure 20 : Protocole de tomographie par émission de positons double radiotraceurs ........ 35
Figure 21 : Analyse régionale du cerveau de rat .................................................................. 36
Figure 22 : Principe de la résonance magnétique nucléaire (RMN) ..................................... 37
Figure 23 : Traitement du signal de la spectroscopie RMN ................................................. 38
Figure 24 : Multiplicité du signal de résonance .................................................................... 40
Figure 25 : Principe de la rotation à l’angle magique ........................................................... 41
Figure 26 : Fonctions cellulaires des métabolites cérébraux détectés .................................. 44
Figure 27 : Capture cérébrale du 14C--hydroxybutyrate par autoradiographie chez le rat114
Figure 28 : Régulation de l’entrée du glucose au cerveau .................................................. 117
Figure 29 : Isotopomères du glutamate suite à l’infusion du [2,4-13C2]-hydroxybutyrate
.................................................................................................................................... 123
Figure 30 : Impact d’une cétose légère sur le métabolisme astrocytaire ............................ 126
Figure 31 : Impact d’une cétose légère sur la production d’aspartate ................................ 128
Figure 32 : Impact de la leucine hépatique sur la synthèse de l’acide -aminobutyrique
(GABA) au cerveau .................................................................................................... 129
Figure 33 : Modèle des effets de la diète cétogène sur le métabolisme du glucose et des
cétones au cerveau ...................................................................................................... 131
Figure 34 : Processus de peroxydation lipidique in vitro ................................................... 135
Figure 35 : Résumé des effets du vieillissement sur le métabolisme cérébral observés dans
les articles 1 et 3.......................................................................................................... 143
Figure 36 : Résumé des effets de la diète cétogène sur le métabolisme cérébral observés
dans les articles 1 et 2 ................................................................................................. 144
ix
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Études sur la capture cérébrale du glucose chez les personnes âgées saines ....... 6
Tableau 2 : Conclusions de la thèse et perspectives ........................................................... 147
x
LISTE DES ABRÉVIATIONS
GLUT
BHE
Acétyl-CoA
ATP
-HB
AcAc
NAD
HMG-CoA
MCT
ERO
GABA
PDH
PC
AGPI
DHA
TEP
18
F-FDG
CMRglc
IRM
RMN
ppm
HRMAS
Cr
PCr
PCh
GPC
NAA
GSH
Glu
Gln
AGMI
Glucose transporter
Barrière hémato-encéphalique
Acétyl-coenzyme A
Adénosine triphosphate
-hydroxybutyrate
Acétoacétate
Nicotinamide adénine dinucléotide
-hydroxyméthyle-glutaryle-CoA
Monocarboxylic acid transporter
Espèce réactive de l’oxygène
Acide -aminobutyrique
Pyruvate déshydrogénase
Pyruvate carboxylase
Acide gras polyinsaturé
Acide docosahexaénoïque
Tomographie par émission de positons
18
F-fluorodésoxyglucose
Cerebral metabolic rate of glucose
Imagerie par résonance magnétique
Résonance magnétique nucléaire
partie par million
High Resolution Magic Angle Spinning
Créatine
Phosphocréatine
Phosphatidylcholine
Glycérophosphocholine
N-acétylaspartate
Glutathion
Glutamate
Glutamine
Acide gras monoinsaturé
1
1. INTRODUCTION GÉNÉRALE
La maladie d’Alzheimer est accompagnée d’importants changements fonctionnels et
structuraux au cerveau, qui entraînent une perte des fonctions cognitives. Une diminution
d’environ 25% de la capture cérébrale du glucose est retrouvée chez les personnes atteintes
de la maladie d’Alzheimer. Ce phénomène peut être observé jusqu’à 30 ans avant le début
des symptômes cliniques de la maladie. Cependant, il n’y a pas encore de consensus quant
à savoir si cette diminution de la capture cérébrale du glucose est présente chez les
personnes âgées cognitivement saines. En condition de déficit de glucose, les cétones sont
le carburant alternatif pour le cerveau. Jusqu’à présent, le métabolisme cérébral des cétones
a été très peu étudié dans le contexte du vieillissement. Toutefois, il a été montré qu’une
légère élévation des cétones plasmatiques améliore les fonctions cognitives chez un modèle
animal de la maladie d’Alzheimer et chez les patients Alzheimer.
Au regard de ces observations, nos hypothèses sont que : (i) la diminution de la
capture cérébrale du glucose entraîne le développement des problèmes cognitifs retrouvés
dans la maladie d’Alzheimer et (ii) en fournissant au cerveau un substrat alternatif, une
élévation des cétones pourrait compenser ou corriger la diminution de capture cérébrale du
glucose subvenant au cours de la maladie d’Alzheimer, et ainsi prévenir le déclin cognitif.
La capture cérébrale du glucose peut être mesurée par tomographie par émission de
positons (TEP), une méthode d’imagerie du cerveau qui permet de mesurer in vivo la
capture cérébrale et d’effectuer des mesures répétées chez un même individu. Au cours des
dernières années, notre équipe a développé un radiotraceur d’une cétone, le
11
C-
acétoacétate, ce qui permet de mesurer la capture cérébrale des cétones par imagerie TEP.
Nos objectifs généraux étaient de: (i) déterminer si la diminution de capture cérébrale
du glucose est un processus pathologique ou si ce phénomène fait partie du vieillissement
normal du cerveau, (ii) déterminer si la diminution de capture cérébrale est un problème
spécifique au glucose ou s’il s’applique également aux cétones.
Les objectifs spécifiques de ma thèse étaient de : (i) déterminer l’effet du
vieillissement sain et de l’induction d’une cétose légère, par le biais d’une diète cétogène,
sur la capture cérébrale du glucose et des cétones chez le rat. La capture cérébrale du
2
glucose et de l’acétoacétate a été mesurée à l’aide d’un protocole d’imagerie TEP double
radiotraceurs, où les acquisitions avec l’acétoacétate et le glucose étaient enchaînées lors de
la même séance d’imagerie. Ce protocole a ainsi permis la comparaison des deux
principaux substrats énergétiques du cerveau, le glucose et les cétones, chez un même
animal. (ii) Évaluer l’effet de l’induction d’une cétose légère, par le biais d’une diète
cétogène, sur le métabolisme du glucose et des cétones au cerveau. Pour ce faire, les
différents intermédiaires des voies métaboliques du glucose et des cétones ont été mesurés
par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire suite à l’infusion de glucose et d’une
cétone marquée au
13
C. (iii) Évaluer l’impact d’une deuxième condition cétogène, la
restriction calorique à long terme, sur le métabolisme cérébral chez des rats âgés sains.
Nos résultats montrent que la capture des deux principaux substrats énergétiques du
cerveau, le glucose et les cétones, est globalement similaire chez des rats sains jeunes et
âgés. De plus, la capture cérébrale du glucose et des cétones est plus élevée chez les rats
sous diète cétogène, ce qui est aussi accompagné d’un métabolisme plus important du
glucose et des cétones dans les cellules du cerveau. Les résultats de la capture et du
métabolisme sont ainsi très concordants. Enfin, nos résultats montrent que, couplée à une
diète à haute teneur en sucrose et faible en acides gras oméga-3, la restriction calorique à
long terme chez les rats âgés ne modifie pas le profil des métabolites et des acides gras du
cerveau.
3
2. ÉTAT DE L’ART
2.1. Le déclin cognitif et le métabolisme cérébral
2.1.1. La maladie d’Alzheimer
La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative, caractérisée par une
perte progressive des fonctions cognitives, la mémoire étant touchée en premier. Elle
constitue la cause de démence la plus fréquente chez les personnes âgées. À partir de l’âge
de 65 ans, le risque de développer la maladie d’Alzheimer double tous les cinq ans (Batsch
et Mittelman 2012). À ce jour, aucun traitement curatif de la maladie n’existe. De plus, les
tests neuropsychologiques sont la principale méthode de diagnostic utilisée et le diagnostic
précoce de la maladie reste un défi de taille puisqu’aucun marqueur biochimique de
diagnostic n’a été établi. Toutefois, repousser de cinq ans l’apparition des premiers
symptômes permettrait de diminuer de moitié le nombre de personnes atteintes (Dubois
2010).
D’un point de vue neuropathologique, la maladie d’Alzheimer se caractérise par
l’accumulation anormale de deux protéines : le peptide -amyloïde et la protéine Tau, qui
entraîne la formation des plaques amyloïdes et des dégénérescences neurofibrillaires. Une
diminution d’environ 25% de la capture cérébrale du glucose est également observée chez
les personnes atteintes de la maladie d’Alzheimer (Li et al. 2008, Mosconi et al. 2005,
Frackowiak et al. 1981). Les premières régions du cerveau à en être touchées sont le cortex
cingulaire postérieur, le lobe temporal et le lobe pariétal (Figure 1). Une diminution dans le
lobe frontal est observée lorsque la maladie est plus évoluée.
4
Figure 1 : Capture cérébrale du glucose chez un patient Alzheimer
Vue latérale (gauche), sagittale médiane (centre) et frontale (droite) du cerveau. Les zones
colorées correspondent à une différence significative de capture de glucose entre un patient
Alzheimer et une personne âgée saine. Plus la couleur tend vers le jaune, plus la différence
est importante. Les premières régions à être touchées sont le cortex cingulaire postérieur
(CCP), le lobe temporal (T), le lobe pariétal (P), suivi du lobe frontal (F). Tiré de Mosconi
(2005).
La diminution de capture du glucose au cerveau a longtemps été perçue comme
étant uniquement une conséquence du processus neurodégénératif et de la perte des cellules
du cerveau, une plus petite quantité de tissu cérébral nécessitant moins d’énergie.
Cependant, plusieurs évidences nous poussent maintenant à croire que cette diminution de
capture du glucose pourrait aussi être à l’origine de la neuropathologie et des problèmes
cognitifs associés à la maladie d’Alzheimer (Cunnane et al. 2011). D’abord, cette
diminution peut être observée jusqu’à 30 ans avant l’apparition des symptômes cliniques
chez des personnes avec des antécédents familiaux de la maladie d’Alzheimer (Mosconi et
al. 2006), ainsi que chez des porteurs de l’allèle 4 de l’apolipoprotéine E, un facteur de
risque de développer la maladie (Reiman et al. 2004). De plus, il a récemment été mis en
évidence que la diminution de capture du glucose précède l’atrophie cérébrale (Jack et al.
2010). Enfin, un apport en substrat énergétique, soit le glucose ou les corps cétoniques,
rétablit les fonctions cognitives chez les patients (Reger et al. 2004, Watson et Craft 2004).
Ainsi, les cellules du cerveau ne sont pas mortes. Elles semblent seulement en manque de
substrat énergétique pour fonctionner adéquatement. À ce jour, la diminution de capture
cérébrale du glucose est le marqueur le plus précoce à avoir été identifié chez des personnes
à risque de maladie d’Alzheimer (Baker et al. 2011, Scholl et al. 2011, Kennedy et al.
1995).
5
Différents éléments pourraient être à l’origine de cette diminution de capture
cérébrale du glucose : (i) les transporteurs du glucose sont diminués dans plusieurs régions
cérébrales chez les patients Alzheimer (Mooradian et al. 1997, Simpson et al. 1994). (ii) La
voie de l’insuline, potentiellement impliquée dans le transport du glucose à l’intérieur des
cellules du cerveau, est altérée dans la maladie d’Alzheimer (Grillo et al. 2009). Plus
précisément, les récepteurs de l’insuline sont diminués dans le cerveau des patients
Alzheimer (Steen et al. 2005). De plus, le diabète de type 2 augmente le risque de
développer la maladie d’Alzheimer (Ott et al. 1999). Un phénomène de résistance à
l’insuline au cerveau, tel qu’observé à la périphérie chez les patients diabétiques, pourrait
empêcher un approvisionnement adéquat des cellules du cerveau en glucose. Une infusion
aigue d’insuline améliore toutefois les fonctions de mémoire et d’apprentissage chez les
patients Alzheimer (Reger et al. 2008). (iii) L’expression d’enzymes mitochondriales,
impliquées dans le métabolisme énergétique et la production d’énergie, est aussi diminuée
dans le cerveau de patients Alzheimer (Bubber et al. 2005, Sorbi et al. 1983). Il n’est
toutefois pas encore clair si ces trois éléments sont à l’origine ou sont une conséquence des
troubles de capture cérébrale du glucose retrouvés dans la maladie d’Alzheimer.
Une diminution de la capture cérébrale du glucose a également été identifiée dans
d’autres troubles associés au vieillissement, notamment dans le déclin cognitif léger
(Mosconi et al. 2005). Cette condition correspond à une perte légère des fonctions
cognitives, qui ne se répercute pas sur les activités de la vie quotidienne et n’est donc pas
un syndrome démentiel. Certains cas de déclin cognitif léger évoluent toutefois vers la
maladie d’Alzheimer (Petersen et al. 1999). Enfin, les patients atteints de la maladie de
Parkinson, une autre maladie neurodégénérative, démontrent également une diminution de
la capture cérébrale du glucose (Borghammer et al. 2009).
2.1.2. Le vieillissement sain
Le vieillissement normal du cerveau est aussi accompagné de changements
fonctionnels et structuraux. Un déclin des fonctions cognitives, soit la mémoire de travail,
la mémoire à long terme et les fonctions exécutives, peut subvenir au cours du
vieillissement sain (Park et Reuter-Lorenz 2009, Glorioso et Sibille 2011). Les fonctions
motrices sont également diminuées, en particulier la coordination et la vitesse de
6
mouvement (Era et al. 1986, Kauranen et Vanharanta 1996). Le vieillissement
s’accompagne aussi d’une atrophie du cerveau, environ 1,6%/décennie, subvenant dès l’âge
de 30 ans (Cunnane et al. 2011). Cette perte de tissu cérébral touche particulièrement la
matière grise dans la région du lobe frontal (Good et al. 2001). Toutefois, il n’y a encore
aucun consensus quant à savoir si la capture cérébrale du glucose est diminuée chez des
personnes âgées saines. Une dizaine d’études ont démontré une diminution avec l’âge,
principalement dans la région du lobe frontal, alors que d’autres ne retrouvent aucun
changement de la capture cérébrale du glucose au cours du vieillissement sain (Tableau 1).
L’atrophie cérébrale associée au vieillissement peut affecter les valeurs de capture cérébrale
du glucose et doit être prise en compte lors des analyses. Cependant, comme indiqué dans
le tableau 1, plus de la moitié de ces études n’ont pas corrigé pour l’atrophie, ce qui peut
expliquer en partie ces divergences dans la littérature.
Tableau 1 : Études sur la capture cérébrale du glucose chez les personnes âgées saines
ND : non déterminé. Adapté de Cunnane et al. (2011).
7
2.2. Les substrats énergétiques du cerveau
2.2.1. Le glucose
Le glucose est le principal substrat énergétique utilisé par le cerveau. En condition
normale, il subvient à près de 100% des besoins énergétiques du cerveau (Cahill 2006), qui
représentent approximativement 23% des besoins du corps entier (Holliday 1971). Chez
l’homme, le cerveau utilise en moyenne 120 g de glucose/jour (Owen et al. 1967). La
majorité est utilisée pour assurer les processus de neurotransmission et de remodelage des
phospholipides membranaires (Purdon et al. 2002). Le glucose entre dans les cellules du
cerveau via les différents isoformes des transporteurs GLUT (glucose transporters). Pour
atteindre le cerveau, le glucose doit d’abord traverser les cellules endothéliales de la
barrière hémato-encéphalique (BHE) par le transporteur GLUT1 de 55 kDa (Figure 2). Il
peut ensuite entrer dans les astrocytes via le deuxième isoforme GLUT1 de 45 kDa et dans
les neurones qui expriment majoritairement l’isoforme GLUT3 (Maher et al. 1994). Les
deux isoformes du transporteur GLUT1 se différencient par leur degré de glycosylation.
Figure 2 : Transporteurs du glucose (GLUT) au cerveau
Le glucose est acheminé dans les cellules du cerveau via les différents isoformes des
transporteurs GLUT (glucose transporters). Le glucose passe d’abord du sang vers le
cerveau au niveau des cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique par le
transporteur GLUT1 de 55 kDa. Il peut ensuite entrer dans les astrocytes via le deuxième
isoforme GLUT1 de 45 kDa et dans les neurones grâce au transporteur GLUT3.
8
L’entrée du glucose dans la cellule se fait par le principe de diffusion facilitée.
Contrairement aux transporteurs GLUT4 situés dans le tissu adipeux et le muscle strié, les
transporteurs GLUT1 et GLUT3 sont insulino-indépendants. Leur expression à la
membrane plasmique n’est donc pas régulée par l’insuline. Une fois dans la cellule, le
glucose est métabolisé en pyruvate par la voie de la glycolyse au niveau du cytoplasme
(Figure 3).
Figure 3 : Voie de la glycolyse
La glycolyse consiste en une voie de 10 réactions produisant du pyruvate à partir du
glucose. Cette voie peut se diviser en trois phases : (i) la phosphorylation du glucose sur ces
carbones 6 et 1 (étapes 1 à 3), (ii) son clivage en deux molécules de trois carbones (étapes
4-5) et (iii) la production d’énergie sous la forme d’adénosine triphosphate (ATP; étapes 6
à 10). ADP : adénosine diphosphate; NAD : nicotinamide adénine dinucléotide. Tiré de
http://chemwiki.ucdavis.edu/Biological_Chemistry/Metabolism/Glycolysis.
En condition d’anaérobie ou lorsque le pyruvate est en excès, celui-ci est transformé
en lactate. Sinon, le pyruvate est converti en acétyl-coenzyme A (acétyl-CoA), qui entre
dans le cycle de Krebs, au niveau de la mitochondrie (Figure 4). Au cours de ces voies
métaboliques, l’oxydation du glucose en CO2 et H2O produit de l’adénosine triphosphate
(ATP), la principale source d’énergie libre dans la cellule.
9
Figure 4 : Cycle de Krebs
Le cycle de Krebs est constitué de 8 étapes catalysées par huit enzymes différentes
identifiées en bleu. Au cours de ce cycle une molécule d’acétyl-CoA est oxydée en CO2 et
H2O. Les carbones en vert proviennent de l’acétyl-CoA. NAD : nicotinamide adénine
dinucléotide; GDP : guanosine diphosphate; GTP : guanosine triphosphate; FAD : flavine
adénine dinucléotide. Tiré de Berg et al. (2006).
2.2.2. Les cétones
En condition de déficit de glucose, tel qu’un jeûne prolongé, les corps cétoniques ou
cétones sont le substrat alternatif au glucose pour le cerveau, les acides gras ne pouvant être
transportés adéquatement au cerveau (Pardridge 1991). De plus, une très faible quantité
d’énergie est stockée sous la forme de glycogène dans le cerveau. Si l’apport du glucose au
cerveau est interrompu, on estime que le glycogène peut supporter l’activité du cerveau
pour seulement trois minutes (Siesjö 1978). L’acétoacétate (AcAc), le -hydroxybutyrate
10
(-HB) et l’acétone constituent les trois principales cétones. Toutefois, il n’est pas encore
clair si l’acétone, qui est une molécule très volatile, est utilisée comme substrat énergétique
au cerveau puisqu’elle est majoritairement expirée dans l’haleine (Cahill 2006). Il existe
également des cétones à cinq carbones, qui sont présentes de façon minoritaire. La
cétogenèse est le processus par lequel l’acétyl-CoA est transformé en AcAc et -HB et a
lieu dans les mitochondries des hépatocytes (Figure 5). L’acétone est formée par la
décarboxylation spontanée de l’AcAc, alors que le -HB est formé par la réduction de
l’AcAc par l’enzyme -hydroxybutyrate déshydrogénase. Lors de cette dernière réaction, le
NADH (nicotinamide adénine dinucléotide) est oxydé en NAD+. Le ratio -HB : AcAc est
donc dépendant du potentiel d’oxydoréduction dans les mitochondries. En condition
postprandiale, le ratio -HB : AcAc est d’environ 1 : 1.
Figure 5 : Voie de la cétogenèse
La cétogenèse est le processus par lequel les trois cétones (l’acétoacétate, le hydroxybutyrate et l’acétone) sont synthétisées. Deux molécules d’acétyl-CoA sont
combinées pour former de l’acétoacétyl-CoA, qui est converti en -hydroxyméthylglutaryl-CoA (HMG-CoA) par la HMG-CoA synthase mitochondriale. L’HMG-CoA lyase
va ensuite convertir l’HMG-CoA en acétoacétate (AcAc). Le -hydroxybutyrate est formé
par la réduction de l’AcAc, alors que l’acétone est formée par la décarboxylation spontanée
de l’AcAc. La cétogenèse a lieu dans les mitochondries des cellules du foie. NAD :
nicotinamide adénine dinucléotide. Adapté de http://commons.wikimedia.org/wiki/File:
Ketone_bodies_synthesis.svg.
11
En condition de déficit de glucose, les niveaux d’insuline plasmatique sont diminués
et la lipolyse est stimulée dans le tissu adipeux dans le but de fournir l’énergie nécessaire à
l’organisme. Les acides gras produits sont transportés jusqu’au foie, où ils sont -oxydés.
Dans ces conditions, l’oxaloacétate est préférentiellement utilisé pour la gluconéogenèse au
lieu d’être condensé avec l’acétyl-CoA pour entrer dans le cycle de Krebs. L’accumulation
d’acétyl-CoA ainsi générée au niveau du foie favorise la cétogenèse. (Figure 6). Les
cétones produites dans les hépatocytes sont transférées dans la circulation sanguine et
acheminées aux tissus cibles, dont le cerveau, où elles sont utilisées comme substrat
énergétique. La synthèse des cétones préserve ainsi les protéines musculaires qui, en
d’autres cas, seraient catabolisées en acides aminés pour former du glucose par la voie de
gluconéogenèse (Nair et al. 1988). Lors d’un jeûne prolongé, le ratio -HB : AcAc peut
atteindre 6 : 1 étant donné la grande quantité de NADH disponible, provenant de la oxydation des acides gras (Cahill et al. 1966).
Figure 6 : Schéma de l’approvisionnement du cerveau en cétones
En condition de déficit de glucose, l’importante -oxydation des acides gras et l’utilisation
de l’oxaloacétate pour la gluconéogenèse entraînent une accumulation d’acétyl-CoA au
niveau du foie, qui favorise la cétogenèse. Les cétones ainsi produites dans les hépatocytes
sont transférées dans la circulation sanguine et acheminées au cerveau, où elles sont
utilisées comme substrat énergétique. Adapté de Melo et al. (2006).
Les cétones peuvent aussi être synthétisées à partir de la lysine, de la leucine et de
l’isoleucine, des acides aminés essentiels, qui sont obligatoirement ingérés sous la forme de
12
protéines. La leucine est caractérisée comme un acide aminé cétogène puisque son
métabolisme conduit entièrement à la formation de l’HMG-CoA, un des précurseurs des
cétones (Figure 7). L’isoleucine, quant à elle, est caractérisée comme un acide aminé à la
fois cétogène et glucogène, étant donné que son métabolisme donne lieu à la formation
d’acétyl-CoA (utilisé pour la synthèse des cétones) et de succinyl-CoA (utilisé pour la
synthèse du glucose par la gluconéogenèse).
Figure 7 : Voie de synthèse des cétones à partir de la leucine
La leucine est un des trois acides aminés cétogènes. Son métabolisme conduit à la
formation du -hydroxyméthyl-glutaryl-CoA (HMG-CoA), qui est par la suite transformé
en acétoacétate et acétyl-CoA par l’enzyme HMG-CoA lyase.
La cétogenèse est hautement régulée et ce à trois niveaux : (i) la lipolyse dans les
adipocytes du tissu adipeux, contrôlée par les enzymes lipase des triglycérides
adipocytaires et lipase hormono-sensible, qui convertissent les triglycérides en
monoglycérides, (ii) l’entrée des acides gras dans les mitochondries des hépatocytes,
contrôlée par l’inhibition de la carnitine palmitoyltransférase 1 par le malonyl-CoA et (iii)
la -hydroxyméthyl-glutaryl-CoA (HMG-CoA) synthase mitochondriale, qui convertit
l’acétoacétyl-CoA en AcAc dans les mitochondries des hépatocytes (Fukao et al. 2004,
Wang et al. 2008). Les deux premiers points sont régulés par les niveaux circulants
d’insuline, qui inhibe la cétogenèse, et de glucagon, qui stimule la cétogenèse. L’HMGCoA synthase mitochondriale est stimulée par un jeûne prolongé ou une diète riche en gras
et inhibée par l’insuline. Ainsi, à l’état postprandial, les cétones sont présentes en très faible
concentration dans le sang (< 0,1 mM), suite à l’inhibition de la cétogenèse par l’insuline.
13
Lors d’un déficit de glucose, l’insuline chute et l’inhibition des enzymes de la cétogenèse et
de la lipolyse est levée (Fukao et al. 2004). La synthèse des cétones est aussi favorisée lors
de l’ingestion de triglycérides à chaîne moyenne (8 à 10 carbones), retrouvés entre autre
dans l’huile de noix de coco. Les acides gras à chaîne moyenne sont des acides gras très
cétogènes puisqu’ils sont acheminés au foie directement via la veine porte et pénètrent dans
la mitochondrie librement, sans le besoin d’un transporteur (Figure 8).
Figure 8 : Régulation de la cétogenèse
Les cétones sont synthétisées à partir des acides gras dans les mitochondries du foie. La
cétogenèse est d’abord régulée par la lipolyse dans les adipocytes du tissu adipeux,
contrôlée par les enzymes lipase des triglycérides adipocytaires et lipase hormono-sensible.
Les acides gras sont ensuite libérés dans la circulation sanguine et voyagent jusqu’au foie.
Les acides gras sont transportés dans la mitochondrie par la navette de la carnitine grâce à
l’enzyme carnitine palmitoyltransférase 1 (CPT1). L’acétyl-CoA qui en résulte peut être
converti en malonyl-CoA, qui lui inhibe l’enzyme CPT1. Ceci représente la seconde étape
de régulation de la cétogenèse. Enfin, la transformation de l’acétoacétyl-CoA en HMGCoA par la HMG-CoA synthase mitochondriale (HS) constitue la troisième étape de
régulation de la cétogenèse. Adapté de Laffel (1999).
Dans certaines conditions pathologiques, notamment chez des patients diabétiques
de type 1, les niveaux de cétones plasmatiques peuvent parfois atteindre 15-25 mM.
L’acidocétose diabétique est une condition pathologique aiguë où l’on retrouve à la fois une
14
élévation du glucose et des cétones plasmatiques, accompagnée d’une acidose métabolique.
L’augmentation de la production de cétones est due à une sécrétion insuffisante d’insuline,
accompagnée d’une élévation du glucagon. Les cétones sont des acides organiques qui se
dissocient au pH physiologique. L’importante quantité de cétones dans le sang va donc
augmenter considérablement la concentration d’ions H+ et entraîner l’acidose métabolique.
Les cétones entrent dans les cellules du cerveau grâce aux transporteurs MCT
(monocarboxylic acid transporter; (Simpson et al. 2007), qui assurent également le
transport de différents acides monocarboxyliques tels que le lactate et le pyruvate. Les
MCT sont un système de transport couplé au transport de protons. Pour atteindre le
cerveau, les cétones traversent d’abord les cellules endothéliales de la BHE via le
transporteur MCT1 (Figure 9). Elles peuvent ensuite entrer dans les astrocytes par
l’isoforme MCT4 et dans les neurones via le transporteur MCT2.
Figure 9 : Transporteurs des acides monocarboxyliques (MCT) au cerveau
Les cétones sont acheminées dans les cellules du cerveau via les transporteurs MCT
(monocarboxylic acid transporter). Les cétones passent d’abord du sang vers le cerveau au
niveau des cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique par le transporteur
MCT1. Elles peuvent ensuite entrer dans les astrocytes via l’isoforme MCT4 et dans les
neurones grâce au transporteur MCT2.
15
Lors d’une déficience en glucose, les cétones peuvent être utilisées comme substrat
énergétique au niveau du cerveau, ainsi que par plusieurs tissus, tels que le cœur, le rein et
le muscle squelettique. Le foie est le principal site de cétogenèse, mais il est incapable de
métaboliser les cétones, ne disposant pas des enzymes de la cétolyse. Celle-ci se fait via
trois enzymes : (i) la -hydroxybutyrate déshydrogénase, (ii) la succinyl-CoA -cétoacylCoA transférase, qui est l’étape limitante de la cétolyse et (iii) l’acétoacétyl-CoA thiolase
(Figure 10). Les cétones sont ainsi transformées en acétyl-CoA, qui sera utilisé dans le
cycle de Krebs. Le transport et la métabolisation des cétones au cerveau se font donc par
des systèmes indépendants de ceux du glucose.
Figure 10 : Voie de la cétolyse
Les cétones peuvent être utilisées comme substrat énergétique grâce à la voie de la
cétolyse, qui comprend trois étapes : (i) le -hydroxybutyrate est d’abord oxydé en
acétoacétate par la -hydroxybutyrate déshydrogénase, (ii) l’acétoacétate est converti en
acétoacétyl-CoA par l’enzyme succinyl-CoA -cétoacyl-CoA transférase, qui est l’étape
limitante de la cétolyse et (iii) l’acétoacétyl-CoA thiolase génère deux molécules d’acétylCoA, qui seront utilisées dans le cycle de Krebs. NAD : nicotinamide adénine dinucléotide.
Les cétones plasmatiques sont environ dix fois plus élevées chez le nouveau-né que
chez l’adulte (Nehlig 2004, Lockwood et Bailey 1971). En effet, la haute teneur en
triglycérides à chaîne moyenne du lait maternel engendre un état de cétose chez le nouveauné. Les cétones sont un substrat énergétique essentiel pour le développement du cerveau et
jouent un rôle important dans la synthèse des acides aminés, tels que le glutamate et la
glutamine, et des lipides (Webber et Edmond 1977, DeVivo et al. 1975). Le squelette de
carbones des cétones est utilisé pour la synthèse du cholestérol, qui est essentiel dans le
16
processus de myélinisation. Le principal élément régulant la capture cérébrale des cétones
est leur concentration plasmatique. La capture des cétones au cerveau augmente
proportionnellement à leur concentration plasmatique (Figure 11). Ainsi, des conditions
augmentant la cétonémie, tel que le jeûne prolongé, augmentent aussi la capture cérébrale
des cétones. Cette relation reste linéaire jusqu’à des concentrations plasmatiques très
élevées, de l’ordre de 8 mM. À ce jour, il a été montré que les cétones peuvent fournir
jusqu’à 65% de l’énergie utilisée par le cerveau (Cahill 2006, Owen et al. 1967). Le
glucose reste essentiel pour le phénomène d’anaplérose, soit le réapprovisionnement des
intermédiaires du cycle de Krebs, et pour fournir les carbones nécessaires à la synthèse de
l’oxaloacétate et du lactate. Les quelques études du métabolisme cérébral des cétones au
cours du vieillissement n’ont démontré aucun changement chez les personnes âgées saines,
ainsi que chez les patients atteints de la maladie d’Alzheimer (Lying-Tunell et al. 1980,
Lying-Tunell et al. 1981, Ogawa et al. 1996). Au niveau périphérique, la capacité à
produire et à oxyder les cétones est similaire chez les personnes âgées saines et les jeunes
adultes (Freemantle et al. 2009).
Figure 11 : Relation entre la capture cérébrale des cétones et leur concentration
plasmatique
Une relation linéaire existe entre la capture cérébrale du -hydroxybutyrate (CMR-OHB) et
sa concentration plasmatique. Le graphique illustre également la relation avec la
contribution aux besoins énergétiques du cerveau humain. Les données sont tirées de trois
études du métabolisme cérébral chez l’homme : Blomqvist et al. (1995) (■), Blomqvist et
al. (2002) (▼) et Owen et al. (1967) (▲). La ligne pointillée indique qu’à une
concentration plasmatique de 290 M, obtenue suite à la prise d’un supplément cétogène
pendant quatre semaines, le -hydroxybutyrate est subvenu à approximativement 7,8% des
besoins énergétiques du cerveau. Tiré de Courchesne-Loyer et al. (2013).
17
2.2.2.1.
Les effets protecteurs des cétones au cerveau
Les cétones présentent des effets neuroprotecteurs dans plusieurs conditions
pathologiques. Sur des neurones en culture, un traitement avec le -HB protège des effets
toxiques du peptide -amyloïde, impliqué dans la maladie d’Alzheimer, et de la
neurotoxine MPTP (1-méthyle 4-phényle 1,2,3,6-tétrahydro pyridine), utilisée pour mimer
les symptômes de la maladie de Parkinson (Kashiwaya et al. 2000). Chez l’animal, les
cétones ont démontré des propriétés anticonvulsivantes chez un modèle de rat épileptique
(Likhodii et al. 2003, Rho et al. 2002). Les cétones réduisent également le volume de
l’infarctus au cerveau dans un modèle d’ischémie cérébrale chez le rat (Puchowicz et al.
2008). Chez l’homme, les cétones ont aussi des effets bénéfiques au cerveau. L’élévation
des cétones plasmatiques améliore les fonctions de mémoire et d’attention chez des patients
Alzheimer (Henderson et al. 2009, Reger et al. 2004) et diabétiques (Page et al. 2009). Les
cétones ont aussi démontré un potentiel thérapeutique dans des cas de maladies génétiques
rares telles qu’une déficience des transporteurs GLUT1 (Wang et al. 2005) ou de l’enzyme
pyruvate déshydrogénase (Falk et al. 1976).
Certains mécanismes sont proposés pour expliquer les effets neuroprotecteurs des
cétones. Elles protègent contre le stress oxydatif, un phénomène pouvant créer d’importants
dommages aux acides nucléiques, protéines et lipides. En effet, le -HB et l’AcAc
augmentent la survie de neurones en culture exposés au peroxyde d’hydrogène (Kim do et
al. 2007). La production d’espèces réactives de l’oxygène (ERO) est également diminuée
au niveau du complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale (Maalouf et al. 2007,
Sullivan et al. 2004). Le complexe I de la chaîne respiratoire est la source de formation des
ERO dans les neurones (Turrens 2003). Les cétones entraînent aussi une augmentation du
métabolisme oxydatif et de la production d’énergie sous la forme d’ATP (Kim do et al.
2007). À première vue, cet effet peut sembler contradictoire à la diminution des ERO, mais
les cétones stimulent la biogenèse mitochondriale, augmentant ainsi l’efficacité
métabolique des cellules tout en diminuant la production d’ERO par les mitochondries
(Bough et al. 2006, Nylen et al. 2009). Les cétones inhibent également certains facteurs
impliqués dans l’apoptose, soit le processus de mort cellulaire programmée. Le -HB et
l’AcAc inhibent l’activité de la protéine phosphatase 2A, qui stimule l’apoptose (Maalouf
et Rho 2008, Noh et al. 2004). Le processus de déphosphorylation est très important dans le
18
phénomène d’apoptose. En effet, la protéine phosphatase 2A déphosphoryle le facteur de
transcription Bcl-2, ce qui le rend actif. Celui-ci forme ensuite un complexe avec le facteur
Bad, ce qui enclenche le processus d’apoptose dans la cellule (Garcia et al. 2003). Enfin,
les cétones permettent de préserver le processus de potentialisation à long terme, un
phénomène associé à la plasticité synaptique et à la base des fonctions de mémoire et
d’apprentissage (Maalouf et Rho 2008).
2.3. La diète cétogène
Tout comme lors d’un jeûne prolongé, la diète cétogène augmente la concentration
des cétones dans le sang. Il s’agit d’une diète à haute teneur en lipides et faible en protéines
et glucides. La diète cétogène pousse ainsi l’organisme à utiliser les lipides plutôt que les
glucides, contrairement à une diète standard. La quantité importante d’acides gras et le
manque de glucose favorisent la synthèse des cétones au niveau du foie. La diète cétogène
classique comprend un ratio de lipides : protéines + glucides de 4 : 1, alors qu’une diète
nord-américaine typique comprend un ratio de 1 : 2 (Zupec-Kania et Spellman 2008). De
façon générale, la diète cétogène comprend 80% de lipides, généralement des triglycérides
à chaîne longue sous forme de beurre et de crème, et un maximum de 5% de glucides
(Cunnane et al. 2002). La quantité de protéines est déterminée de façon à ce qu’elle soit
juste assez suffisante pour permettre un développement et une réparation du corps
adéquate. La cétonémie sous diète cétogène peut varier entre 0,5-5 mM.
La diète cétogène a été développée dans les années 1920 pour traiter l’épilepsie chez
les enfants (Wilder 1921). L’épilepsie se caractérise par des décharges rythmiques
spontanées de populations de neurones, qui seraient dues en partie à une perte de la
fonction inhibitrice de l’acide -aminobutyrique (GABA) et une libération trop importante
des acides aminés excitateurs. La diète cétogène a été développée dans le but de mimer
l’état physiologique d’un jeûne prolongé, qui avait pour effet de réduire les crises
épileptiques. Quatre cents ans av. J.-C, Hippocrate observa que le jeûne empêchait les
crises chez un homme souffrant d’épilepsie. La diète cétogène est toujours utilisée pour
traiter l’épilepsie réfractaire (Freeman et al. 2006). En effet, chez 20-30% des patients, la
médication actuelle n’arrive pas à contrôler les crises épileptiques et la diète cétogène est
alors le traitement de choix (Neal et al. 2008). Elle diminue de façon significative les crises
19
épileptiques chez deux tiers des patients, un effet qui persiste même après l’arrêt de la diète
(Freeman et al. 2007). La diète cétogène est une thérapie à long terme qui dure en moyenne
deux à trois ans.
En ce qui a trait aux effets secondaires, certaines études ont démontré une
augmentation du niveau de cholestérol plasmatique, un effet qui n’est toutefois pas toujours
présent (Cunnane et al. 2002). Chez l’adulte, une perte de poids est souvent retrouvée. La
diète cétogène reste plus fréquemment utilisée chez les enfants, étant donné les difficultés
de compliance et le risque cardiovasculaire qui accompagnent cette diète à très haute teneur
en gras saturés. Différentes modifications de la diète cétogène classique ont été élaborées
dans le but d’améliorer son efficacité et la compliance des patients. L’une de ces approches
a été d’inclure à la diète cétogène des triglycérides à chaîne moyenne, qui génèrent plus de
cétones par calorie une fois métabolisés (Huttenlocher et al. 1971). Ceci permet donc
d’utiliser un ratio de lipides : protéines + glucides plus faible et représente une diète moins
athérogène. De l’huile de triglycérides à chaîne moyenne est ainsi combinée aux autres
aliments et fournit généralement 45% des calories consommées.
La diète cétogène a été testée dans différents modèles animaux de l’épilepsie dans le
but de déterminer son mécanisme d’action. Elle diminue les crises épileptiques dans
plusieurs modèles de rongeurs, tels que les modèles d’infusion du pentylènetétrazole et de
l’acide kaïnique (Bough et Eagles 1999, Muller-Schwarze et al. 1999), ainsi que les souris
épileptiques knockout pour le gène des canaux potassiques voltage dépendant Kv1.1
(Fenoglio-Simeone et al. 2009). Un certain nombre d’hypothèses ont été proposées pour
expliquer l’effet antiépileptique de la diète : (i) l’hypothèse du pH propose que la diète
cétogène génère une acidification du sang, responsable de l’arrêt des crises. Toutefois, les
études chez l’animal et chez l’homme n’ont montré aucun changement du pH du sang et du
cerveau suite à la diète (Al-Mudallal et al. 1996, Huttenlocher 1976). (ii) L’hypothèse des
cétones postule que celles-ci ont un effet direct sur l’activité épileptique au cerveau
(Likhodii et al. 2003, Rho et al. 2002). Rho et al. (2002) ont montré un effet antiépileptique
de l’AcAc dans un modèle d’épilepsie chez la souris. (iii) L’hypothèse métabolique postule
que la diète cétogène fournit plus d’énergie au cerveau. Cette hypothèse est basée sur le fait
que pour un même nombre de molécules, les cétones produisent plus d’ATP que le glucose
puisqu’elles sont directement métabolisées en acétyl-CoA, sans voie intermédiaire telle que
20
la glycolyse (Nordi et DeVivo 2004). (iv) Enfin, l’hypothèse du GABA propose que les
crises soient diminuées grâce à l’augmentation de l’inhibition GABAergique (Yudkoff et
al. 2001b, Yudkoff et al. 2004). À ce jour, les hypothèses ii, iii et iv sont supportées par
différents groupes et il n’existe encore aucun consensus.
Des études ont aussi démontré un effet protecteur de la diète cétogène dans la
maladie d’Alzheimer (Van der Auwera et al. 2005), la maladie de Parkinson (Vanitallie et
al. 2005), la sclérose en plaques (Kim do et al. 2012), la dépression (Murphy et al. 2004),
les accidents vasculaires cérébraux (Maalouf et al. 2009, Tai et al. 2008, Puchowicz et al.
2008), les traumatismes crâniens (Appelberg et al. 2009) et les tumeurs cérébrales (Scheck
et al. 2012). Comment expliquer le potentiel thérapeutique de la diète cétogène pour un
spectre aussi large de pathologies? Une altération du métabolisme énergétique, en
particulier du métabolisme mitochondrial, semble être le point commun de ces pathologies
(Stafstrom et Rho 2012) et les changements métaboliques associés à la diète cétogène
pourraient ainsi renverser ce phénomène.
Ces multiples effets thérapeutiques de la diète cétogène pourraient aussi être dus à une
réduction : (i) de l’inflammation, soit des médiateurs inflammatoires tels que les
interleukines et le tumor necrosis factor  (Stafstrom et Rho 2012), (ii) du stress oxydatif
par la diminution de la production des ERO (Sullivan et al. 2004), (iii) de l’apoptose, soit
des facteurs pro-apoptotiques tels que la caspase 3 (Noh et al. 2003) et (iv) de l’excitabilité
neuronale par l’augmentation de l’expression de l’enzyme glutamate décarboxylase, qui
permet la synthèse du GABA, le principal neurotransmetteur inhibiteur (Cheng et al. 2004).
2.4. La restriction calorique
Le principe de restriction calorique consiste en une réduction de 15 à 40% de l’apport
calorique quotidien, sans causer de déficience en nutriments. Il s’agit de la méthode non
génétique la plus efficace pour augmenter la longévité chez les modèles animaux. La
première observation a été faite dans les années 1930, où une diminution de la prise
alimentaire comparativement à des animaux nourris ad libitum a entraîné une augmentation
de 42% de la longévité chez des rats (McCay et al. 1935). L’augmentation de la longévité
peut atteindre jusqu’à 50% chez les rats (Yu et al. 1982). La restriction calorique augmente
la longévité chez plusieurs autres organismes, dont la levure, le nématode, le poisson et la
21
souris (Walford et al. 1987). Chez les primates, les résultats sont toujours controversés; une
étude a montré une augmentation de la survie chez les macaques rhésus (Colman et al.
2009), alors qu’une étude plus récente n’a montré aucune augmentation de la survie
(Mattison et al. 2012).
La restriction calorique retarde l’apparition de nombreuses maladies associées au
vieillissement, soit les maladies cardiovasculaires (Johnson et al. 1997), rénales (Fernandes
et Good 1984), neurodégénératives (Mattson 2003, Maswood et al. 2004) et l’apparition de
tumeurs (Sarkar et al. 1982, Engelman et al. 1990). Elle engendre différents changements
métaboliques dans les organes périphériques, incluant une amélioration de la sensibilité à
l’insuline (Barzilai et al. 1998, Dhahbi et al. 2001, Lane et al. 1999). La diminution de la
glycémie entraîne une diminution de la sécrétion d’insuline par le pancréas. Il s’en suit une
diminution du stockage des acides gras au niveau du tissu adipeux, qui engendre des
changements dans les niveaux de cytokines telles que l’adiponectine, qui a pour effet
d’augmenter la sensibilité à l’insuline. Au niveau du foie, la diminution de la glycémie
favorise les voies de la gluconéogenèse, la -oxydation des acides gras, la cétogenèse et la
dégradation des acides aminés au dépend de la glycolyse (Figure 12)(Koubova et Guarente
2003).
Figure 12 : Effets de la restriction calorique sur les voies métaboliques du foie
La restriction calorique diminue la glycémie, ce qui entraîne au niveau du foie une
augmentation des voies en rouge (la gluconéogenèse, la -oxydation des acides gras, la
cétogenèse et la dégradation des acides aminés) et une diminution des voies en noir, telles
que la glycolyse et la cétolyse. Adapté de Koubova et Guarente (2003).
22
Au cerveau, la restriction calorique a montré des effets neuroprotecteurs dans
plusieurs conditions. Elle améliore significativement la performance aux tests
d’apprentissage et de mémoire chez les rongeurs âgés (Ingram et al. 1987, Stewart et al.
1989), ainsi que les fonctions locomotrices dans un modèle primate de la maladie de
Parkinson (Maswood et al. 2004). Tout comme la diète cétogène, la restriction calorique
diminue les crises épileptiques dans plusieurs modèles de rongeurs (Greene et al. 2001,
Mantis et al. 2004).
Malgré que les effets bénéfiques de la restriction calorique soient connus depuis près
de 80 ans, les mécanismes d’action au niveau moléculaire ne sont pas encore clairs.
Plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer les effets neuroprotecteurs de la
restriction calorique : (i) un effet antioxydant par la diminution de la production d’ERO au
niveau du complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale (Sohal et al. 1994, Merry
2002). (ii) Une augmentation des niveaux d’ATP et de la biogenèse mitochondriale (Lin et
al. 2002). (iii) Une diminution de l’activité de facteurs pro-apoptotiques tels que le tumor
suppressor protein p53 et le forkhead transcription factor FOXO-3. La restriction calorique
augmente en fait l’expression de Sirt1, une enzyme faisant partie de la famille des sirtuines,
qui inhibe plusieurs facteurs pro-apoptotiques (Maalouf et al. 2009). (iv) Une augmentation
des niveaux de facteurs neurotrophiques tels que la neurotrophine-3, le glial cell linederived neurotrophic factor et le brain-derived neurotrophic factor, qui favorise le
processus de neurogenèse (Park et Lee 2011). Cependant, aucune des théories proposées
n’intègrent tous les effets de la restriction calorique. Ceci est probablement dû à l’étendue
des effets de la restriction calorique qui génère aussi bien des changements métaboliques et
endocriniens, que des changements dans les processus d’apoptose et de survie cellulaire.
Les effets antioxydant, anti-apoptotique et l’augmentation de la production d’énergie
sous la forme d’ATP sont retrouvés à la fois lors d’une restriction calorique et d’une
élévation des cétones plasmatiques (Figure 13). Ces deux conditions partagent en fait une
caractéristique commune, soit une diminution de l’apport en glucides entraînant une
élévation des cétones. Les effets de la restriction calorique et des cétones sont donc
intimement reliés et il a été proposé que les cétones puissent engendrer les effets
neuroprotecteurs de la restriction calorique (Maalouf et al. 2009). D’autre part, certaines
23
études ont démontré des effets différents, même opposés dans le cerveau d’animaux sous
restriction calorique ou diète cétogène (Greene et al. 2001, Cheng et al. 2003).
Figure 13 : Effets de la restriction calorique et des cétones au cerveau
Les effets antioxydant, anti-apoptotique et l’augmentation de la production d’énergie dans
le cerveau sont des effets communs à la restriction calorique et aux cétones. La stimulation
de la neurogenèse a uniquement été rapportée dans une condition de restriction calorique,
alors qu’un effet sur la plasticité synaptique est propre aux cétones. ERO : espèces réactives
de l’oxygène; ATP : adénosine triphosphate.
2.5. La compartimentation neurone : astrocyte
Le cerveau est composé de deux grandes classes de cellules : les neurones et les
cellules gliales. Ces dernières constituent 50% des cellules du cerveau humain, parmi
lesquelles les astrocytes sont les cellules les plus abondantes (Azevedo et al. 2009). Les
terminaisons des astrocytes font contact avec les neurones d’un côté et les capillaires de
l’autre. Au cours du 20e siècle, le rôle de support des astrocytes était considéré comme
passif. Nous savons maintenant que ces cellules ont un rôle crucial dans la modulation de la
neurotransmission et l’approvisionnement des neurones en substrats énergétiques (Zagami
et al. 2005, Pellerin 2005). Il existe en fait une compartimentation des voies métaboliques
en fonction des types cellulaires au cerveau. La consommation d’énergie serait trop
importante si tous les types cellulaires comptaient toutes les voies métaboliques. Le
24
métabolisme des neurones et des astrocytes est ainsi dépendant l’un de l’autre dû à un
couplage serré et des échanges métaboliques continus.
2.5.1. La régulation des neurotransmetteurs
Le glutamate est le principal neurotransmetteur excitateur au cerveau et est retrouvé
majoritairement dans les neurones. Il est synthétisé dans les neurones glutamatergiques
présynaptiques à partir de la glutamine par l’enzyme mitochondriale glutaminase (Figure
14). Le glutamate peut aussi être synthétisé par l’enzyme glutamate déshydrogénase à partir
de l’-cétoglutarate, un intermédiaire du cycle de Krebs. Lors d’une activation neuronale,
le glutamate est libéré dans la fente synaptique par l’exocytose des vésicules synaptiques.
Une fois dans la fente synaptique, le glutamate peut être recapté par trois mécanismes : (i)
par les neurones postsynaptiques (ii) par les neurones présynaptiques ou (iii) par les
astrocytes, le mécanisme le plus important. Le transport du glutamate à l’intérieur de
l’astrocyte est couplé au transport d’un ion Na+ et se fait par le excitatory amino acid
transporter (EAAT). La recapture du glutamate en excès dans la fente synaptique est l’une
des principales fonctions des astrocytes. Elle permet le maintien d’un niveau adéquat de
glutamate dans le cerveau. En effet, un surplus de glutamate dans la fente synaptique
entraîne
un
phénomène
d’excitotoxicité,
retrouvé
dans
de
multiples
maladies
neurodégénératives telles que la sclérose en plaques et la maladie d’Alzheimer. Ce
phénomène pourrait être dû à la voie de la kynurénine, qui a pour produit l’acide
quinolinique. Cette molécule a pour effet d’augmenter la relâche de glutamate par les
neurones et de diminuer sa recapture par les astrocytes. Ceci engendre une concentration
excessive de glutamate dans la fente synaptique et une neurotoxicité, incluant l’apoptose
des neurones et des astrocytes (Tavares et al. 2002, Guillemin et al. 2005). Dans les
astrocytes, le glutamate est reconverti en glutamine par l’enzyme glutamine synthétase, une
enzyme localisée de manière sélective dans les astrocytes (Peng et al. 1993). La glutamine
est ensuite relâchée dans le milieu extracellulaire et recaptée par les neurones
présynaptiques, permettant ainsi le réapprovisionnement du pool neuronal de glutamate.
C’est le cycle glutamate-glutamine.
25
Figure 14 : Cycle glutamate-glutamine
Lors d’une activation neuronale, le neurone présynaptique libère le glutamate (Glu) dans la
fente synaptique et la transmission du signal se termine grâce à la recapture du Glu,
notamment par les astrocytes. Une fois dans les astrocytes, le Glu peut être converti en cétoglutarate (KG) par la glutamate déshydrogénase (GDH) ou recyclé en glutamine (Gln)
via la glutamine synthétase (GS). La Gln est ensuite transportée vers les neurones et
reconvertie en Glu par la glutaminase (PAG). Le Glu est à nouveau prêt à être libéré pour
de futures activations. AAT : aspartate aminotransférase; EAAT : excitatory amino acid
transporter; TCA cycle: tricarboxylic acid cycle. Tiré de Stobart et Anderson (2013).
Le GABA est le principal neurotransmetteur inhibiteur. Il est issu de la
décarboxylation du glutamate, qui est lui synthétisé à partir de la glutamine dans les
neurones GABAergiques (Figure 15). Toutefois, les astrocytes fournissent une part plus
importante de glutamine aux neurones glutamatergiques qu’aux neurones GABAergiques
(Bak et al. 2006). Tout comme le glutamate, le GABA est recapté par les astrocytes suite à
sa libération dans la fente synaptique. Son transport s’effectue par les GABA transporters
(GAT), où deux atomes de Na+ et un atome de Cl- sont co-transportés avec le GABA vers
l’intérieur de l’astrocyte. Le GABA est ensuite métabolisé en succinate semialdéhyde, puis
en succinate, qui entre dans le cycle de Krebs.
26
Figure 15 : Recapture de l’acide -aminobutyrique (GABA) par les astrocytes
L’acide -aminobutyrique (GABA) est synthétisé dans les neurones GABAergiques en
deux étapes : (i) la conversion de la glutamine en glutamate et (ii) la décarboxylation du
glutamate par l’enzyme glutamate décarboxylase (GAD). Suite à une libération de GABA
dans la fente synaptique, celui-ci est recapté par les astrocytes via les GABA transporters
(GAT). Le GABA est ensuite métabolisé en succinate semialdéhyde, puis en succinate, qui
entre dans le cycle de Krebs et permet la régénération de glutamine. -CG : cétoglutarate.
2.5.2. Le métabolisme énergétique
En 1994, Pellerin et Magistretti ont proposé un mécanisme cellulaire reliant l’activité
neuronale et l’utilisation du glucose par les cellules du cerveau (Figure 16)(Pellerin et
Magistretti 1994). Lors d’une activation neuronale, le glutamate relâché dans la fente
synaptique est recapté par les astrocytes. Lors de sa recapture, le glutamate est cotransporté avec le Na+, ce qui entraîne une augmentation de la concentration intracellulaire
de Na+. Ceci active la pompe Na+-K+-ATPase dans les astrocytes. L’activation de la pompe
stimule la voie de la glycolyse et le lactate produit est libéré par les transporteurs MCT. Le
lactate peut être recapté par les neurones et utilisé comme substrat énergétique. Ce
mécanisme a été nommé l’hypothèse de la navette astrocyte-neurone du lactate. Cette
hypothèse fut très marquante puisqu’elle a introduit un tout nouveau rôle des astrocytes
27
dans l’approvisionnement des neurones en substrats énergétiques. D’autres études ont par
la suite validé cette hypothèse (Bouzier et al. 2000, Bouzier-Sore et al. 2006). Ces études
de compétition entre le glucose et le lactate dans des cultures primaires ont établi que les
astrocytes utilisent plus le glucose que le lactate, alors que les neurones utilisent plus le
lactate que le glucose.
Figure 16 : Navette astrocyte-neurone du lactate
L’hypothèse de la navette astrocyte-neurone du lactate propose un nouveau rôle des
astrocytes dans l’approvisionnement des neurones en substrats énergétiques. Une activation
neuronale engendre la libération du glutamate (Glu) dans la fente synaptique. Lors de la
recapture du Glu par les astrocytes, le Glu est co-transporté avec le Na+, résultant en une
augmentation de la concentration intracellulaire de Na+. Ceci active la pompe Na+-K+ATPase dans les astrocytes, qui stimule la voie de la glycolyse pour la production d’ATP.
Le lactate résultant de la glycolyse est libéré par les transporteurs MCT et peut être recapté
par les neurones et utilisé comme substrat énergétique. Pyr : pyruvate; Gln : glutamine. Tiré
de Kimelberg et Nedergaard (2010).
Tout comme pour le métabolisme du glutamate, les astrocytes possèdent une enzyme
spécifique pour le métabolisme énergétique. Dans les neurones, le pyruvate provenant de la
glycolyse ou du lactate peut être uniquement métabolisé en acétyl-CoA via l’enzyme
pyruvate déshydrogénase (PDH; Figure 17). Dans les astrocytes, le pyruvate peut être soit
28
métabolisé par la PDH ou converti en oxaloacétate par l’enzyme pyruvate carboxylase
(PC), qui est unique aux astrocytes (Yu et al. 1983). La PC permet ainsi le
réapprovisionnement des pools de neurotransmetteurs, tels que le glutamate, synthétisés à
partir des intermédiaires du cycle de Krebs (Shank et al. 1985).
Figure 17 : Métabolisme du pyruvate : neurone vs astrocyte
Les enzymes du métabolisme énergétique diffèrent entre les neurones et les astrocytes.
Dans les neurones, le pyruvate peut être uniquement métabolisé en acétyl-CoA via
l’enzyme pyruvate déshydrogenase (PDH). Dans les astrocytes, le pyruvate peut être soit
métabolisé par la PDH ou converti en oxaloacétate (OAA) par l’enzyme pyruvate
carboxylase (PC). Ceci permet le réapprovisionnement des pools de neurotransmetteurs,
tels que le glutamate, synthétisés à partir des intermédiaires du cycle de Krebs. -KG : cétoglutarate.
Enfin les astrocytes sont le principal site de stockage du glycogène dans le cerveau
adulte (Koizumi 1974, Phelps 1972). Le glycogène est synthétisé à partir du glucose-6phosphate par l’enzyme glycogène synthase. Il est dégradé par la glycogène phosphorylase,
une enzyme exprimée uniquement dans les astrocytes (Stobart et Anderson 2013). Il a été
proposé que le glycogène soit utilisé pour produire du lactate dans la navette astrocyteneurone du lactate (Shulman et al. 2001).
29
2.6. Les acides gras au cerveau
Certains acides gras du cerveau, précisément l’acide docosahexaénoïque, modulent
le métabolisme énergétique cérébral; soit au niveau du transport du glucose à la BHE
(Pifferi et al. 2005a, Pifferi et al. 2010) et de son utilisation par les cellules du cerveau
(Ximenes da Silva et al. 2002). Les acides gras sont des acides carboxyliques constitués
d’une chaîne hydrocarbonée comprenant typiquement un nombre pair de carbones, pouvant
varier entre 4 et 28 chez les mammifères. Les acides gras se divisent en trois grandes
classes selon leur degré d’insaturation, soit leur nombre de doubles liaisons : (i) les acides
gras saturés (aucune double liaison), (ii) les acides gras monoinsaturés (une double liaison)
et (iii) les acides gras polyinsaturés (AGPI; deux doubles liaisons et plus). De plus, les
AGPI se divisent en deux familles selon la position de leur première double liaison à partir
de l’extrémité méthyle : les AGPI n-6 (entre le 6e et 7e carbone) et les AGPI n-3 (entre le 3e
et 4e carbone).
Le cerveau est l’un des organes les plus riches en acides gras. Les lipides constituent
environ 50% du poids sec du cerveau, où ils sont retrouvés majoritairement sous la forme
de phospholipides au niveau des membranes cellulaires (Sastry 1985). Les phospholipides
cérébraux sont riches en AGPI. L’acide docosahexaénoïque (DHA), un AGPI n-3,
représente à lui seul 50% des AGPI des phospholipides cérébraux (Innis 1991). Le DHA
exerce plusieurs fonctions au niveau du cerveau. Il a bien sûr un rôle structural, puisqu’il
est un important constituant membranaire. Les doubles liaisons du DHA entraînent un
certain nombre de courbures dans la molécule, ce qui affecte la fluidité et la perméabilité
membranaire (Stillwell et Wassall 2003) et par conséquent, l’activité de divers
transporteurs, récepteurs et canaux ioniques impliqués dans les processus clés du
fonctionnement cérébral, tels que la neurotransmission. Le DHA est libéré des membranes
cellulaires du cerveau par l’action des enzymes phospholipases A2. Une fois libre, le DHA
peut être converti en médiateur intermédiaire, soit les docosanoïdes (résolvines et
neuroprotectines), qui ont entre autres des propriétés anti-inflammatoires (Bazan 2005). Via
l’activation de facteurs de transcription, le DHA régule aussi l’expression de certains gènes,
dont le brain derived neurotrophic factor, impliqué dans le processus de neurogenèse (Rao
et al. 2007).
30
Deux mécanismes de transport du DHA de la circulation sanguine vers le cerveau ont
été proposés : (i) une diffusion passive au travers des cellules endothéliales de la BHE
(Hamilton et Brunaldi 2007) et (ii) un transport couplé aux lipoprotéines via les
transporteurs LDL (low density lipoprotein) (Edmond 2001). Au cours de ce dernier
mécanisme, les lipoprotéines sont captées par les transporteurs LDL du côté luminal des
cellules endothéliales et hydrolysées à l’intérieur de ces cellules. Le DHA peut ensuite
entrer librement dans le parenchyme cérébral. Une étude chez des souris déficientes en
récepteur LDL a toutefois démontré que ceux-ci ne sont pas essentiels au maintien de la
concentration de DHA au cerveau (Chen et al. 2008).
Le DHA est incorporé de façon intensive dans les membranes des cellules du cerveau
au cours de la période périnatale. En effet, le DHA est un nutriment essentiel au
développement du cerveau, notamment pour la neurogenèse et la myélinisation axonale
(Calderon et Kim 2004, McNamara et Carlson 2006). Dans le contexte du vieillissement et
du déclin cognitif, le DHA a démontré de nombreux effets neuroprotecteurs (Cunnane et al.
2009). En effet, il protège de la toxicité cellulaire engendrée par le peptide -amyloïde
(Calon et Cole 2007), exerce un effet anti-inflammatoire (Bazan 2007) et diminue le stress
oxydatif dans le cerveau de modèles animaux de la maladie d’Alzheimer (Hashimoto et al.
2002). Il a été proposé que ces effets soient médiés par certains dérivés du DHA, dont la
neuroprotectine D1 (Lukiw et al. 2005, Bazan 2006).
2.7. La mesure du métabolisme cérébral
La mesure du métabolisme cérébral, en particulier du métabolisme énergétique, est
d’un grand intérêt d’un point de vue fondamental, pour élucider les mécanismes cellulaires
impliqués dans les maladies neurologiques, et d’un point de vue clinique, pour le diagnostic
de ces pathologies. Avant les années 1980, la consommation du glucose par le cerveau était
mesurée par la différence artérioveineuse de la concentration de glucose dans le sang (Kety
et Schmidt 1948). Cette méthode nécessitait toutefois l’installation de canules dans l’artère
carotide et la veine jugulaire. Des techniques beaucoup moins invasives, telles que la
tomographie par émission de positons (TEP) et la spectroscopie par résonance magnétique
nucléaire (RMN), ont connu un essor important au cours des dernières décennies (Reivich
et al. 1977, Phelps et al. 1979).
31
2.7.1. La tomographie par émission de positons (TEP)
À ce jour, la TEP est l’approche la plus commune pour étudier le métabolisme
énergétique cérébral. Il s’agit d’une méthode d’imagerie scintigraphique où un traceur
radioactif est injecté par voie intraveineuse. Ce traceur, dont les propriétés biologiques sont
connues, est marqué par un atome radioactif [fluor-18 (18F), carbone-11 (11C), azote-13
(13N) ou oxygène-15 (15O)]. Cet atome se désintègre en émettant un positon qui va
s'annihiler avec un électron du milieu. Cette annihilation produit deux photons  de 511
keV qui partent sur une même direction, mais dans un sens opposé (Figure 18). Les
capteurs de la caméra TEP détectent les photons en coïncidence, c’est-à-dire ceux qui
arrivent en même temps, ce qui permet la localisation du lieu de leur émission et la
détermination de la concentration du radiotraceur à chaque point dans le tissu. Il est ainsi
possible de déterminer la distribution d’un radiotraceur dans les différents tissus d’un
organisme, ce qui génère des images dites métaboliques. La TEP permet donc de mesurer
in vivo la capture cérébrale et d’effectuer des mesures répétées chez un même individu,
rendant ainsi possible l’élaboration d’études longitudinales sur le vieillissement ou
l’évaluation d’un traitement.
32
Figure 18 : Principe de la Tomographie par Émission de Positons (TEP)
Une molécule contenant un atome radioactif (18F, 11C, 13N, 15O) est injectée à un
organisme. Cet atome se désintègre en émettant un positon (e) qui va s'annihiler avec un
électron (e-) du milieu. Cette annihilation produit deux photons  de 511 keV qui partent sur
une même direction, mais dans un sens opposé. Le collimateur de la caméra TEP détecte
les photons qui arrivent en même temps, ce qui permet la localisation du lieu de leur
émission et la détermination de la concentration du radiotraceur à chaque point dans le
tissu. Ceci permet de générer une image métabolique du cerveau. Adapté de Langner
(2003).
2.7.1.1.
Le
18
Le 18F-fluorodésoxyglucose
F-fluorodésoxyglucose (18F-FDG) est le radiotraceur le plus couramment
utilisé, notamment en oncologie pour la caractérisation et la localisation des tumeurs. La
capture cérébrale du glucose est étudiée à l’aide du
glucose comprenant un
18
comme le glucose, le
18
18
F-FDG, qui est un analogue du
F sur le carbone 2 à la place du groupement hydroxyle. Tout
F-FDG est transporté dans les cellules du cerveau par les
33
transporteurs GLUT (Figure 19). Il est ensuite phosphorylé par l’enzyme hexokinase pour
former du 18F-FDG-6-phosphate, mais ne peut être transformé en 18F-fructose-6-phosphate
à cause de l’absence du groupement hydroxyle sur le carbone 2. Le
18
F-FDG-6-phosphate
est ainsi piégé et s’accumule dans la cellule. Les études d’imagerie TEP utilisant le
18
F-
FDG permettent donc d’évaluer le flux entrant du radiotraceur dans les cellules, mais ne
permettent pas de suivre son devenir dans la cellule. Le
18
F-FDG a une demi-vie
radioactive de 109,8 minutes. Lors de la décroissance radioactive, le 18F se convertit en 18Osuite à l’émission d’un positon. L’atome
18
O- récupère par la suite un proton d'un cation
hydronium (H3O+) du cytosol, pour former une molécule de glucose-6-phosphate contenant
un
18
O. Le glucose-6-phosphate est ensuite métabolisé de façon normale par la voie de la
glycolyse.
Figure 19 : Métabolisme du 18F-fluorodésoxyglucose (18F-FDG)
Le 18F-fluorodésoxyglucose (18F-FDG) est un analogue du glucose comprenant un 18F sur
le carbone 2 à la place du groupement hydroxyle. Tout comme le glucose, le 18F-FDG est
transporté dans les cellules par les transporteurs GLUT. Il est ensuite phosphorylé par
l’hexokinase pour former du 18F-FDG-6-phosphate, mais ne peut être métabolisé en 18Ffructose-6-phosphate à cause de l’absence du groupement hydroxyle sur le carbone 2. Le
18
F-FDG-6-phosphate est ainsi piégé et s’accumule dans la cellule. Adapté de Duet et al.
(2007).
34
L’analyse cinétique d’acquisitions TEP dynamiques permet de déterminer la
concentration du radiotraceur dans le cerveau en fonction du temps et de déterminer le
cerebral metabolic rate of glucose (CMRglc), une mesure quantitative de la capture
cérébrale du glucose. Le calcul du CMRglc nécessite la fonction d’entrée, qui est la
concentration du radiotraceur dans le plasma en fonction du temps. De plus, un facteur de
correction appelé la lumped constant est appliqué afin de corriger pour les différences de
métabolisme entre le
18
F-FDG et le glucose. En effet, le
18
F-FDG est avantagé auprès des
transporteurs GLUT, mais le glucose est favorisé auprès de l'enzyme hexokinase
(Tokugawa et al. 2007, Lear et Ackerman 1992).
2.7.1.2.
Le 11C-acétoacétate
Le développement du radiotraceur 11C-AcAc a été fait par notre équipe il y quelques
années (Tremblay et al. 2007). L’AcAc est marqué avec un
11
C, qui a une demi-vie
radioactive de 20,4 minutes. Ceci a permis de réaliser les premières études TEP avec le 11CAcAc chez le rat (Bentourkia et al. 2009, Pifferi et al. 2008). Nous avons par la suite
élaboré un protocole TEP double radiotraceurs permettant l’analyse quantitative de la
capture cérébrale du glucose et des cétones (Figure 20). Cette nouvelle méthodologie a fait
l’objet d’un article qui est inséré en annexe 1. La courte demi-vie du
d’enchaîner les acquisitions avec le
11
C-AcAc et le
18
11
C permet
F-FDG lors de la même séance
d’imagerie. Les variations intra-individuelles chez les rats, dues à certains facteurs tels que
l’anesthésie ou le jeûne, sont ainsi réduites. Ce protocole permet donc la comparaison des
deux principaux substrats énergétiques du cerveau, soit le glucose et les cétones, chez un
même animal.
35
Figure 20 : Protocole de tomographie par émission de positons double radiotraceurs
Le protocole de tomographie par émission de positons développé au cours de cette thèse
consiste en une injection séquentielle du 11C-acétoacétate (11C-AcAc) et du 18Ffluorodésoxyglucose (18F-FDG) chez un même animal. Ce protocole double radiotraceurs
est possible grâce à la courte demi-vie du 11C, soit 20,4 minutes. Un délai de 15 minutes
suite à l’acquisition 11C-AcAc est tout de même nécessaire pour assurer la décroissance de
la majorité de la radioactivité. Des prélèvements sanguins sont effectués au cours des
acquisitions pour la détermination de la fonction d’entrée. Le protocole d’acquisitions dure
1h15/animal.
2.7.1.3.
Analyse régionale du cerveau
Les images TEP ont toutefois une faible résolution spatiale (de l’ordre de 1 mm
chez le petit animal) et donne peu d’informations anatomiques. La TEP peut alors être
combinée à une autre modalité d’imagerie : l’imagerie par résonance magnétique (IRM).
L’IRM a une résolution spatiale de l’ordre de 0,1 mm chez le petit animal et donne des
images dites structurelles ou anatomiques. Le recalage des images TEP sur les images IRM
permet de situer les régions anatomiques du cerveau dans les images TEP et ainsi l’analyse
de la capture cérébrale dans différentes régions du cerveau (Figure 21A). Les régions du
cortex, de l’hippocampe, du striatum et du cervelet font souvent l’objet d’études du
métabolisme cérébral chez le rat. Il s’agit de régions qui sont affectées dans des maladies
neurodégénératives associées au vieillissement, telles que la maladie d’Alzheimer et la
maladie de Parkinson (Mosconi et al. 2005, Sterling et al. 2013). Le cortex est responsable
des fonctions exécutives telles que l’attention et l’inhibition (Elliot 2003). L’hippocampe
est impliqué dans les processus de mémoire et d’apprentissage (Cohen et Eichenbaum
1995). Le striatum a pour fonction la planification des mouvements (Rolls 1994) et le
36
cervelet, quant à lui, est responsable de la coordination des mouvements (Ghez et Fahn
1985). De plus, ce sont des régions bien identifiables sur les IRM, en partie dû à leur taille
considérable (Figure 21B).
Figure 21 : Analyse régionale du cerveau de rat
A) L’imagerie par résonance magnétique (IRM ; rangée du haut) a une résolution spatiale
bien plus haute que la tomographie par émission de positons (TEP) et donne des images
dites anatomiques. Le recalage des images TEP et IRM (rangée du bas) permet ainsi
l’analyse de la capture cérébrale dans différentes régions du cerveau. WB : whole brain ;
Cx : cortex ; Hp : hippocampus ; St : striatum ; Cb : cerebellum. Tiré de Roy et al. (2013b).
B) Les zones colorées indiquent les différentes régions d’un cerveau de rat. Le cervelet
(cerebellum) est situé dans la partie postérieure du cerveau (bleu marine) et le cortex
cérébral est la matière grise à la périphérie des deux hémisphères (transparent).
L’hippocampe (hippocampus) est une structure retrouvée en paire dans chacun des
hémisphères, situé dans les lobes temporaux médians, sous la surface du cortex
(bourgogne) et le striatum est également une grosse structure sous-corticale paire (bleu ciel)
Tiré de http://www.civm.duhs.duke.edu/research/researchprojects/Calabrese/calabreseDTI.
37
2.7.2. La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN)
Le métabolisme cérébral peut aussi être mesuré par la spectroscopie RMN. Il s’agit
d’une technique permettant la mesure d’un grand nombre de molécules au sein d’un
échantillon de tissu ou in vivo. Au cerveau, ces molécules incluent entre autres des
composés associés au métabolisme énergétique (glucose et acides aminés) et à la
neurotransmission (glutamate et GABA). Le principe de la RMN repose sur le fait que les
noyaux des atomes effectuent un mouvement de rotation autour d’un axe appelé spin
nucléaire ou moment magnétique nucléaire ( ⃗⃗ . En absence de champ magnétique,
l’orientation de ⃗⃗ est aléatoire. Le phénomène de RMN se produit en trois étapes (Figure
22): (i) la polarisation, où dans un champ magnétique ⃗⃗⃗⃗ , ⃗⃗ s’oriente parallèlement à ⃗⃗⃗⃗ ,
(ii) la résonance, où l’application d’un champ de radiofréquence fait basculer ⃗⃗
perpendiculairement à ⃗⃗⃗⃗ , et (iii) la relaxation, où ⃗⃗ revient à sa position d’équilibre par un
mouvement de précession autour de ⃗⃗⃗⃗ avec une fréquence égale à
appelée fréquence de
Larmor.
Figure 22 : Principe de la résonance magnétique nucléaire (RMN)
Les noyaux des atomes effectuent un mouvement de rotation autour d’un axe appelé le
moment magnétique nucléaire ( ⃗⃗ . Le principe de résonance magnétique nucléaire repose
sur trois étapes : (i) la polarisation, où dans un champ magnétique ⃗⃗⃗⃗ , ⃗⃗ s’aligne avec ⃗⃗⃗⃗ ,
(ii) la résonance, où l’application d’un champ de radiofréquence fait basculer ⃗⃗
perpendiculairement à ⃗⃗⃗⃗ , et (iii) la relaxation, où ⃗⃗ revient à sa position d’équilibre par un
mouvement de précession autour de ⃗⃗⃗⃗ avec une fréquence égale à . Adapté de Bouzier
(2000).
38
Le mouvement de retour à l’équilibre de ⃗⃗ est détecté sous la forme d’une
sinusoïde amortie. La transformée de Fourier (TF) est ensuite utilisée pour convertir le
signal en fonction du temps en un signal en fonction des fréquences. La figure 23A
représente le signal d’un seul noyau et la figure 23B, le signal de plusieurs noyaux
atomiques. L’intérêt de la RMN repose sur le fait que des fréquences légèrement différentes
sont retrouvées selon l’environnement chimique et électronique d’un noyau. Une petite
plage de fréquences, appelée le déplacement chimique (
), est donc obtenue pour un
même noyau. Ainsi, sur un spectre d’un échantillon donné, une fréquence différente est
observée pour chaque atome de chaque molécule présente dans l’échantillon. Les spectres
de RMN permettent donc d’identifier une grande partie des molécules présentes dans un
échantillon et de mesurer leur contenu.
Figure 23 : Traitement du signal de la spectroscopie RMN
Le mouvement de retour à l’équilibre de ⃗⃗ est détecté sous la forme d’une sinusoïde
amortie. La transformée de Fourier (TF) est ensuite utilisée pour convertir le signal en
fonction du temps en un signal en fonction des fréquences. La figure 23A représente le
signal d’un seul noyau et la figure 23B, le signal de plusieurs noyaux atomiques. En effet,
l’environnement chimique, qui varie d’un atome à l’autre, engendre des fréquences
légèrement différentes. Adapté de Bouzier (2000).
39
2.7.2.1.
Les isotopes stables
Comparativement à la TEP, la spectroscopie RMN détecte les isotopes stables (1H,
13
C,
31
P,
15
N). Seuls les noyaux ayant un spin différent de zéro sont détectables en RMN
(un nombre impair de protons et de neutrons). L’atome d’hydrogène est composé d’un seul
proton et son spin est égal à ½. Dans les systèmes biologiques, l’atome d’hydrogène est
l’élément le plus abondant et la RMN du 1H est grandement utilisée dans les sciences
biologiques. Contrairement au 1H, le 13C a une très faible abondance naturelle (1,1%) et les
études métaboliques requièrent donc l’utilisation d’un composé enrichi en
préalablement infusé à l’individu. L’utilisation du
13
13
C, qui sera
C permet le marquage d’un très grand
nombre de molécules, le carbone étant l’atome de base des molécules biologiques. Tous les
métabolites ayant incorporé le
13
C, dérivés du composé infusé, sont détectés sur un même
spectre. Chaque carbone pour chaque métabolite résulte en un signal à un endroit différent
sur l’échelle de résonances. Il est ainsi possible de déterminer les différentes positions
d’incorporation du
13
C dans les métabolites. Pour un champ magnétique de 11.7 Tesla, tel
qu’utilisé dans cette thèse, la fréquence de Larmor est de 500 MHz pour le 1H et 125,75
MHz pour le 13C. La plage des fréquences (
) est de l’ordre d’une dizaine de partie par
million (ppm) pour le 1H et d’environ 200 ppm pour le 13C.
Le signal de résonance peut comporter plusieurs pics et est alors appelé multiplet.
Cette multiplicité du signal est due aux interactions avec des noyaux de même nature
voisins. Ce phénomène est appelé couplage homonucléaire et est observé aussi bien entre
deux 1H ou deux
13
C, tout dépendant des protocoles. Deux noyaux sont dits voisins s'ils
sont séparés par trois liaisons, simples ou doubles. Un noyau ayant
signal de résonance sous forme d’un multiplet de
voisins présente un
pics. Si on prend l’exemple d’un
spectre 1H d’une solution d’éthanol (Figure 24) : le groupe méthyle, sortant à un
déplacement chimique de 1,3 ppm, est divisé en triplet dû à ses deux voisins protons du
groupement méthylène. Le groupe méthylène, à 3,8 ppm, est lui divisé en quartet dû à ses
trois voisins protons du groupement méthyle. La détermination de la multiplicité du signal
donne ainsi une indication de la structure de la molécule. Le contenu d’une molécule dans
un échantillon est mesuré par l’intégration du pic de résonance. Chaque pic de résonance
est proportionnel au nombre de noyaux (et de molécules) présents dans l’échantillon.
40
Figure 24 : Multiplicité du signal de résonance
La multiplicité du signal de résonance est due aux interactions avec des noyaux voisins.
Deux noyaux sont dits voisins s'ils sont séparés par trois liaisons, simples ou doubles. Un
noyau ayant voisins présente un signal de résonance sous forme d’un multiplet de
pics. Si on prend l’exemple d’un spectre 1H d’une solution d’éthanol: le groupe CH3 (bleu),
sortant à un déplacement chimique de 1,3 ppm, est divisé en triplet dû à ses deux voisins
protons du groupement CH2. Le groupe CH2 (turquoise), à 3,8 ppm, est lui divisé en quartet
dû à ses trois voisins protons du groupement CH3. Le proton du groupe OH (rouge) donne
un simple singulet puisqu’il ne peut pas interagir avec les protons voisins. En effet, les
protons des groupes OH, COOH et NH ne peuvent se coupler avec les autres protons. Tiré
de http://en.wikipedia.org/wiki/Nuclear_magnetic_resonance_spectroscopy (GNU Free
Documentation License).
2.7.2.2.
La rotation à l’angle magique
Pour l’analyse de tissus biologiques à l’état solide, la spectroscopie RMN classique a
toutefois une faible sensibilité due à des déplacements chimiques anisotropes, c’est-à-dire
variant selon l’orientation de la molécule. Il en résulte des pics de résonance très larges qui
se superposent et la séparation des différentes espèces chimiques peut être difficile. La
limite de détection est de l’ordre de 100 nmol/g. Ce manque de sensibilité peut être résolu
grâce à la méthode de High Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS), développée dans
41
les années 1960. Cette technique consiste à faire tourner l’échantillon de tissu, contenu dans
un rotor, à une vitesse de rotation de l’ordre de 5000 Hz, autour d’un axe fixe qui forme un
angle
= 54,7° avec le champ magnétique ⃗⃗⃗⃗ (Figure 25). Cet angle est appelé l’angle
magique; il permet d’éliminer le signal lié aux macromolécules telles que des protéines ou
des phospholipides. La rotation à 5000 Hz permet de réduire les effets d’anisotropie. Ainsi,
la méthode de HRMAS améliore nettement la résolution des spectres et réduit le temps
d’acquisition à environ 10 minutes, comparativement à plusieurs heures avec la RMN
classique. De plus, cette technique ne nécessite aussi peu que 5 mg de tissu et ne requiert
aucune étape d’extraction, évitant ainsi la perte de matériel.
Figure 25 : Principe de la rotation à l’angle magique
Pour l’analyse de tissus biologiques à l’état solide, le principe de High Resolution Magic
Angle Spinning permet une meilleure résolution des spectres. Cette technique consiste à
faire tourner l’échantillon de tissu, contenu dans un rotor, à une vitesse de rotation de
l’ordre de 5000 Hz, autour d’un axe fixe qui forme un angle
= 54,7° avec le champ
⃗⃗⃗⃗
magnétique . L’angle magique permet d’éliminer le signal lié aux macromolécules et la
rotation à 5000 Hz permet de réduire les effets d’anisotropie. Tiré de http://fr.wikipedia.org
/wiki/Spectroscopie_RMN (GNU Free Documentation License).
42
2.7.2.3.
Les métabolites détectés
Les études de spectroscopie RMN HRMAS du 1H permettent de mesurer des
molécules impliquées dans différentes fonctions cellulaires au cerveau et ainsi d’établir un
profil neurochimique propre à la condition étudiée. Les métabolites les plus étudiés se
classifient selon les quatre grandes fonctions suivantes : (i) le métabolisme énergétique (HB,
lactate,
alanine,
créatine),
(ii)
le
métabolisme
membranaire
(choline,
glycérophosphocholine, N-acétylaspartate), (iii) les neurotransmetteurs (glutamine,
glutamate, GABA, aspartate) et (iv) les antioxydants et osmolytes (taurine, myo-inositol,
glutathion; Figure 26).
Le -HB est une cétone qui, comme précédemment décrit, est métabolisé en acétylCoA et utilisé pour la production d’énergie via le cycle de Krebs. Le lactate et l’alanine
peuvent être utilisés comme substrat oxydatif dans le cycle de Krebs ou la synthèse de
glucose par la voie de la gluconéogenèse. La créatine (Cr) reflète le niveau d’utilisation de
l’énergie par la cellule et la phosphocréatine (PCr) agit comme un réservoir des molécules
d’ATP. La Cr et PCr sont aussi un moyen de transport de l’énergie vers les terminaisons
nerveuses.
La choline est utilisée pour la synthèse de la phosphatidylcholine (PCh), une classe
de phospholipides qui est un composant majeur des membranes cellulaires. La choline est
aussi nécessaire à la synthèse de l’acétylcholine, un important neurotransmetteur au
cerveau. La glycérophosphocholine (GPC) est un intermédiaire de la métabolisation de la
PCh et donne une indication du turn-over des membranes. Le N-acetylaspartate (NAA) est
la deuxième molécule la plus abondante au cerveau. Le NAA est formé à partir de
l’aspartate et de l’acétyl-CoA dans les mitochondries des neurones et est couramment
utilisé comme marqueur neuronal. Le NAA est impliqué dans le processus de myélinisation
en fournissant les groupements acétyl pour la synthèse des lipides et de la myéline.
Le glutamate est la molécule la plus abondante dans le cerveau. Sa concentration se
situe entre 10,3-12,9 mol/g dans le cortex de rat (Duarte et al. 2012). Comme
précédemment décrit, le glutamate est le principal neurotransmetteur excitateur, tandis que
le GABA représente le principal neurotransmetteur inhibiteur. L’aspartate est quant à lui le
deuxième plus important neurotransmetteur excitateur au cerveau et se lie aux récepteurs du
glutamate NMDA (N-méthyle-D-aspartate).
43
La taurine est le principal acide aminé impliqué dans le processus d’osmorégulation.
Elle agit autant sur le transport des ions dans la cellule que sur l’état de phosphorylation des
transporteurs membranaires des ions. Le myo-inositol est aussi un osmolyte qui a une
action sur la phospholipase C et la libération du Ca2+ par le réticulum endoplasmique. Le
myo-inositol est synthétisé à partir du glucose-6-phosphate dans la cellule. Enfin, le
glutathion (GSH) est un peptide formé par la condensation du glutamate, de la glycine et de
la cystéine. La conversion de sa forme réduite (GSH) en sa forme oxydée (GSSG) permet
l’élimination de certaines ERO, dont le peroxyde d’hydrogène et en fait un important
antioxydant au cerveau. Le groupement thiol (-SH) porté par le GSH est un agent réducteur
et confère au GSH ses propriétés antioxydantes.
44
Figure 26 : Fonctions cellulaires des métabolites cérébraux détectés
Les métabolites détectés par spectroscopie RMN se classifient selon les quatre grandes
fonctions suivantes : (i) le métabolisme énergétique (rouge; -hydroxybutyrate [-HB],
lactate, alanine, créatine [Cr]), (ii) le métabolisme membranaire (orange; choline,
glycérophosphocholine [GPC], N-acétylaspartate [NAA]), (iii) les neurotransmetteurs
(bleu; glutamine, glutamate, GABA, aspartate) et (iv) les antioxydants et osmolytes (vert;
taurine, myo-inositol, glutathion [GSH]). PLC : phospholipase C; PIP2 :
phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate; GPCR : G protein-coupled receptor; IP3: inositol
1,4,5-trisphosphate; RE: réticulum endoplasmique; AcAc : acétoacétate; OAA:
oxaloacétate; -CG : -cétoglutarate; GSSG : glutathione disulfide; ERO : espèces
réactives de l’oxygène; PCh : phosphatidylcholine; ACh : acétylcholine; PCr :
phosphocréatine.
45
3. PROBLÉMATIQUE
Les personnes atteintes de la maladie d’Alzheimer présentent une diminution de la
capture cérébrale du glucose, qui semble être impliquée dans le développement des
problèmes cognitifs associés à la maladie. Toutefois, il n’y a encore aucun consensus quant
à savoir si la capture cérébrale du glucose est diminuée chez les personnes âgées
cognitivement saines. Ainsi, il n’est pas clair si la diminution de la capture du glucose est
un processus pathologique, ou un processus physiologique faisant partie du vieillissement
normal du cerveau. De plus, la question à savoir si la capture cérébrale des cétones est
modifiée au cours du déclin cognitif et du vieillissement sain ou si la diminution de capture
cérébrale est un problème spécifique au glucose a été très peu abordée dans la littérature.
Les quelques études à avoir évalué cette question, par la technique de différence
artérioveineuse, n’ont noté aucun changement du métabolisme cérébral des cétones chez les
personnes âgées saines et les patients Alzheimer (Lying-Tunell et al. 1980, Lying-Tunell et
al. 1981). De plus, l’induction d’une cétose légère, par le biais de la diète cétogène, rétablit
les fonctions cognitives chez des modèles animaux (Kashiwaya et al. 2013) et chez
l’homme (Krikorian et al. 2012).
4. HYPOTHÈSES/OBJECTIFS
Projet 1
Hypothèses
(i) Dans le contexte du vieillissement sain, la capture cérébrale du glucose serait plus
diminuée que la capture cérébrale des cétones. (ii) En fournissant au cerveau un substrat
alternatif, l’élévation des cétones pourrait compenser ou corriger la diminution de capture
cérébrale du glucose pouvant subvenir au cours du vieillissement.
Objectif
Élucider l’effet du vieillissement sain et de l’induction d’une cétose légère, par le biais de la
diète cétogène, sur la capture cérébrale du glucose et des cétones chez le rat. Pour ce faire,
la capture cérébrale de radiotraceurs analogues au glucose et à l’AcAc a été mesurée par
imagerie TEP.
46
Projet 2
Hypothèse
La diète cétogène pourrait fournir plus d’énergie aux cellules du cerveau en augmentant le
métabolisme oxydatif des cétones au cerveau.
Objectif
Évaluer l’effet de l’induction d’une cétose légère, par le biais de la diète cétogène, sur le
métabolisme du glucose et des cétones au cerveau. Pour ce faire, les différents
intermédiaires des voies métaboliques du glucose et des cétones ont été mesurés par
spectroscopie RMN suite à l’infusion de glucose et -HB marqué au 13C.
Projet 3
Hypothèse
La restriction calorique, un modèle de cétose légère, effectuée chez des rats âgés pourrait
permettre le maintien du métabolisme cérébral au niveau de celui retrouvé chez des rats
jeunes.
Objectif
Évaluer l’impact d’une deuxième condition cétogène, la restriction calorique à long terme,
sur le métabolisme cérébral, incluant différents métabolites, les acides gras et les
transporteurs des substrats énergétiques, chez des rats âgés sains.
47
5. ARTICLE 1
The ketogenic diet increases brain glucose and ketone uptake in aged rats: a dual
tracer PET and volumetric MRI study.
Auteurs de l’article: Roy M, Nugent S, Tremblay-Mercier J, Tremblay S, CourchesneLoyer A, Beaudoin JF, Tremblay L, Descoteaux M, Lecomte R, Cunnane SC.
Statut de l’article: publié dans Brain Research, 1488, 14-23, 7 décembre 2012.
Avant-propos: Mes contributions dans la réalisation de la publication ont été les suivantes:
l’idée d’inclure l’IRM et l’analyse régionale au projet; la mise au point du protocole TEP et
de l’analyse régionale quantitative des données TEP; le suivi des rats pendant les 12 mois
de vieillissement au CHUS; les dosages plasmatiques; les acquisitions IRM et TEP; la
segmentation des images IRM (analyses de volumétrie et capture de l’agent de contraste);
le traitement des données TEP (fusion des images IRM/TEP, segmentation manuelle des
régions cérébrales, modélisation cinétique de la capture des radiotraceurs); la préparation
du manuscrit et des figures; la soumission de l’article et les échanges avec l’éditeur et les
reviewers.
48
5.1. Résumé
Malgré près de 50 ans de recherche, il n’y a encore aucun consensus quant à savoir
si la capture cérébrale régionale du glucose est diminuée chez les personnes âgées saines.
De plus, l’effet du vieillissement sur la capture cérébrale régionale des cétones (-HB et
AcAc), le principal substrat alternatif au glucose pour le cerveau, est toujours inconnu.
Nous avons utilisé un protocole TEP double radiotraceurs pour quantifier la capture
cérébrale du
18
F-FDG et du
11
C-AcAc dans deux études chez des rats mâles Sprague-
Dawley sains: (i) des rats âgés (21 mois; 21M) versus jeunes (4 mois; 4M) et (ii) L’effet
d’une diète cétogène (KD) de 14 jours sur la capture cérébrale du 18F-FDG et du 11C-AcAc
chez des rats de 24 mois (24M). L’IRM a révélé des volumes du cerveau entier similaires
entre les rats 21M et 4M. Les ventricules latéraux étaient cependant 30% plus gros chez les
rats 21M (p=0.001). Les cerebral metabolic rate of AcAc (CMRAcAc) et glucose (CMRglc)
n’étaient pas différent entre les rats 21M et 4M, mais étaient respectivement 28% et 44%
plus élevés chez les rats 24M-KD comparativement aux rats 24M. Le CMRglc était 37-41%
plus bas dans le cortex et 40-45% plus bas dans le cervelet comparativement au CMRAcAc
chez les rats 4M et 21M. Nous concluons que la mesure quantitative de la capture des deux
principaux substrats énergétiques du cerveau est globalement similaire chez des rats sains
jeunes et âgés, que les proportions de la capture régionale, relativement au cerveau entier
sont différentes entre les cétones et le glucose, et que la capture cérébrale des deux substrats
énergétiques est augmentée par une cétose légère.
49
5.2. Abstract
Despite decades of study, it is still unclear whether regional brain glucose uptake is
lower in the cognitively healthy elderly. Whether regional brain uptake of ketones (hydroxybutyrate and acetoacetate [AcAc]), the main alternative brain fuel to glucose,
changes with age is unknown. We used a sequential, dual tracer positron emission
tomography (PET) protocol to quantify brain
18
F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG) and
11
C-
AcAc uptake in two studies with healthy, male Sprague-Dawley rats: (i) Aged (21 months;
21M) versus young (4 months; 4M) rats, and (ii) The effect of a 14 day high-fat ketogenic
diet (KD) on brain
18
F-FDG and
11
C-AcAc uptake in 24 month old rats (24M). Similar
whole brain volumes assessed by magnetic resonance imaging, were observed in aged 21M
versus 4M rats, but the lateral ventricles were 30% larger in the 21M rats (p=0.001). Whole
brain cerebral metabolic rates of AcAc (CMRAcAc) and glucose (CMRglc) did not differ
between 21M and 4M rats, but were 28% and 44% higher, respectively, in 24M-KD
compared to 24M rats. The region-to-whole brain ratio of CMRglc was 37-41% lower in the
cortex and 40-45% lower in the cerebellum compared to CMRAcAc in 4M and 21M rats. We
conclude that a quantitative measure of uptake of the brain’s two principal exogenous fuels
was generally similar in healthy aged and young rats, that the % of distribution across brain
regions differed between ketones and glucose, and that brain uptake of both fuels was
stimulated by mild, experimental ketonemia.
Keywords: Aged rat; ketogenic diet; ketone; 18F-FDG-PET; 11C-acetoacetate; IRM
Abbreviations: AD (Alzheimer’s disease), KD (ketogenic diet), PET (positron emission
tomography),
18
F-FDG (18F-fluorodeoxyglucose),
11
C-AcAc (11C-acetoacetate), CMRAcAc
(cerebral metabolic rate of acetoacetate), CMRglc (cerebral metabolic rate of glucose), MRI
(magnetic resonance imaging), WB (whole brain), Cx (cortex), Hp (hippocampus), St
(striatum), Cb (cerebellum), BBB (blood-brain barrier), VOI (volume of interest), GdDTPA (gadolinium-diethylene-triaminopentaacetic acid)
50
5.3. Introduction
Alzheimer’s disease (AD) is associated with an overall reduction in brain glucose
uptake of ~25%, but whether this reduction is a consequence of the disease or could be
contributing to it is unclear. For example, regional brain hypometabolism can be present in
young adult carriers of apolipoprotein E 4 allele (Reiman et al. 2004) or in those with a
maternal family history of AD (Mosconi et al. 2006). In both cases, brain glucose
hypometabolism can be present three to four decades before the typical age of onset of AD,
thereby potentially contributing to AD neuropathology. It is also unclear whether brain
glucose uptake is decreased in the cognitively healthy elderly; over the last 30 years, about
ten studies have found no difference with age, while about the same number of studies
reported a lower global brain glucose uptake in the elderly (Cunnane et al. 2011).
Methodological differences between studies seem to contribute to the different outcomes
so, at present, it is unclear whether or not brain hypometabolism is part of normal aging or
is part of a neurodegenerative process associated with aging.
Under conditions of glucose deficit, i.e. fasting, ketones (acetoacetate [AcAc] and
-hydroxybutyrate) become the principle alternative brain energy substrates to glucose in
the circulation and can furnish up to 70% of the brain’s energy requirement (Owen et al.
1967, Cahill 2006). Ketones are synthesized from free fatty acids primarily in the liver but
in vitro studies suggest astrocytes could also be a site of ketogenesis (Auestad et al. 1991).
Similar to fasting, blood ketones are raised by the very high-fat, low carbohydrate
ketogenic diet (KD). The KD has been used for nearly a century to treat drug-resistant
childhood epilepsy (Wilder et Winter 1922, Freeman et al. 2006). The KD also has
neuroprotective effects and reduces amyloid pathology in a mouse model of AD (Van der
Auwera et al. 2005) and in aged dogs (Studzinski et al. 2008). In humans, mild,
experimental ketonemia induced by the KD or a ketogenic food supplement given over a
period of up to 90 days reportedly improve memory in mild cognitive impairment
(Krikorian et al. 2012) and in AD (Reger et al. 2004, Henderson et al. 2009). The
mechanism of the beneficial effects of the KD on memory in these studies is unknown, but
one possibility is that mildly elevated plasma ketones increases brain ketone uptake which
may partially compensate for glucose brain hypometabolism, thereby improving fuel
supply to the brain.
51
The brains two main fuels (glucose, ketones) are transported into the brain by
different transporters and are metabolized to acetyl CoA by different pathways. Our recent
11
development of
C-AcAc as a brain PET tracer (Tremblay et al. 2007, Bentourkia et al.
2009, Pifferi et al. 2011) therefore provides an opportunity to assess for the first time how
aging itself or aging plus the KD affect brain uptake of these two key brain fuels in the rat.
Specifically, male Sprague-Dawley rats were used in two studies: (i) Across age; 4 month
old (young; 4M) versus 21 month old (aged; 21M) rats, in which brain ketone (11C-AcAc)
and glucose (18F-fluorodeoxyglucose;
18
F-FDG) uptake were measured using a sequential
dual tracer PET protocol in each rat. Regional brain volumes were also assessed using
magnetic resonance imaging (MRI), as well as blood-brain barrier (BBB) permeability
using the contrast agent gadolinium-diethylene-triaminopentaacetic acid (Gd-DTPA). (ii)
Regional brain
11
C-AcAc and
18
F-FDG uptake in 24 month old rats on a standard diet
(24M) or on a high-fat KD (24M-KD) for 14 days before the dual tracer PET experiment.
5.4. Results
Aging study
Physiological variables in aged rats
Compared with the 4M group, the 21M group was 41% heavier (p=0.0002) but both
groups matched the standard growth curve for male Sprague-Dawley rats (Harlan
Laboratories technical data). The 21M group had 66% higher plasma insulin compared to
the 4M group (p=0.030), but brain weight, and plasma lactate, free fatty acids, glucose,
ketones and triglycerides were not significantly different between the two groups (Table 1).
52
Table 1: Weight and plasma metabolic parameters in 4 month (4M) and 21 month (21M)
old rats fasted for 18 h.
4M
21M
Body weight (g)
448 (39)
631 (41)***
Brain weight (g)
2.27 (0.14)
2.19 (0.07)
Glucose (mM)
6.9 (1.4)
9.0 (2.3)
Acetoacetate (M)
751 (219)
710 (197)
-hydroxybutyrate (M)
1657 (498)
1372 (544)
Lactate (mM)
1.1 (0.2)
1.1 (0.4)
Free fatty acids (mM)
1.8 (1.0)
2.3 (1.0)
Triglycerides (mM)
1.3 (0.5)
1.9 (0.6)
Insulin (U/ml)
8.2 (2.8)
13.6 (4.8)*
Mean (SD); n= 6/group
* p <0.05, *** p <0.001
Brain volume and BBB permeability in aged rats
T2-weighted images revealed no difference in whole brain volume between 4M and
21M rats (2.55±0.09 cm3 for 4M). Individual whole brain volumes were positively
correlated with whole brain weight (r=0.96; p<0.0001; data not shown). Hippocampus,
cortex, striatum and cerebellum volume did not differ between the 4M and 21M groups
(128±8, 546±34, 59±6 and 306±14 mm3, respectively, for the 4M group). However, lateral
ventricle volume was 30% higher in 21M compared to 4M rats (p=0.001; Figure 1A-B).
There was a trend towards higher whole brain uptake of the contrast agent Gd-DTPA in the
21M compared to 4M rats (Figure 1C; p=0.061).
53
Fig 1 - Magnetic resonance images of the brain of 4 month (4M) and 21 month (21M) old
rats. Representative axial views of T2-weighted images showing lateral ventricles
segmentation in white (A). Lateral ventricle volumes are in mm3 (B; Mean±SEM; **:
p<0.01). Blood-brain barrier permeability was assessed by dynamic contrast-enhanced T1weighted imaging following gadolinium-diethylene-triaminopentaacetic acid injection (C).
Gd-DPTA data are mean±SEM normalized using the first time frame; 4M not statistically
different from 21M (p=0.061).
Brain 11C-AcAc and 18F-FDG uptake in aged rats
Whole brain cerebral metabolic rate of AcAc (CMRAcAc; µmol/100 g/min) was
similar in 4M and 21M rats (2.9±0.5 mol/100 g/min for 4M; Figure 2A). No difference in
CMRAcAc with age was seen for cortex, hippocampus, striatum or cerebellum. CMRAcAc
was similar across brain regions in 4M. Plasma AcAc was significantly positively
correlated with whole brain CMRAcAc (r=0.50, p=0.030). Whole brain cerebral metabolic
rate of glucose (CMRglc) was also similar in 4M and 21M rats (23.7±10.3 µmol/100 g/min
54
for 4M; Figure 2B). The only age-related difference observed was for the hippocampus in
which the CMRglc was 51% higher in the 21M group (p=0.031).
Using regional brain volumes obtained by MRI, the CMR/region could be
calculated as well as age-related differences in the relative distribution of CMRAcAc and
CMRglc across specific brain regions. Expressed as nmol/region/min, the cortex had the
highest CMRAcAc and CMRglc, followed by cerebellum, hippocampus and striatum (Figure
2C-D). Whole brain CMRAcAc and CMRglc (nmol/min) were 75±12 and 605±264,
respectively, in 4M rats and were similar for 21M rats.
Fig 2 - Cerebral metabolic rate (CMR) of 11C-AcAc (A and C) and 18F-FDG (B and D) in
the whole brain (WB), cortex (Cx), hippocampus (Hp), striatum (St) and cerebellum (Cb)
of 4 month (4M) and 21 month (21M) old rats. Data are expressed as µmol/100 g/min (A
and B) and nmol/region/min (C and D). Data are mean±SEM (* p<0.05).
The contribution of
11
C-AcAc to brain energy substrate uptake (11C-AcAc +
FDG) was 13% in the whole brain of 4M rats. The contribution of
18
F-
11
C-AcAc to brain
energy substrate uptake was 38% lower in the whole brain, 45% lower in the hippocampus
55
and 52% lower in the striatum of the 21M compared to 4M rats (p=0.032, 0.017, and 0.032,
respectively; Figure 3).
Fig 3 - Percentage contribution of 11C-AcAc to total brain energy substrate uptake (11CAcAc + 18F-FDG) in the whole brain (WB), cortex (Cx), hippocampus (Hp), striatum (St)
and cerebellum (Cb) of 4 month (4M) and 21 month (21M) old rats. Data are mean±SEM
(*: p<0.05).
In comparing the regional brain uptake of the two fuels, in 4M rats,
18
F-FDG
distribution to the cortex and cerebellum was about 40% lower than for 11C-AcAc (p=0.014
and 0.047, respectively), but no difference between the two fuels was observed for the
hippocampus or striatum (Figure 4A). At 4M, the remainder of the brain accounted for 49%
of whole brain CMRAcAc and 68% of whole brain CMRglc (data not shown; p=0.032).
Similar differences between CMRAcAc and CMRglc were found in 21M rats: 18F-FDG brain
uptake was 37% less distributed to the cortex and 45% less to the cerebellum than for
11
C-
AcAc (p=0.016 and 0.036, respectively; Figure 4B). At 21M, the remainder of the brain
accounted for 53% of whole brain CMRAcAc and 66% of whole brain CMRglc (data not
shown; p=0.057).
56
Fig 4 - Comparison of cerebral metabolic rate (CMR) of 11C-AcAc to 18F-FDG in the
cortex (Cx), hippocampus (Hp), striatum (St) and cerebellum (Cb) of 4 month old rats (4M;
A), 21 months (21M; B), 24 months on a standard diet (24M; C) or on a ketogenic diet
(24M-KD; D). CMR data are expressed per region as percentage of whole brain (WB)
values. Mean±SEM (* p<0.05).
Ketogenic diet study
Physiological variables on the KD
The 24M-KD group was 7% heavier than the 24M group (p=0.026; Table 2). The
24M-KD group was in mild ketosis, as shown by the higher plasma -hydroxybutyrate and
AcAc compared to the 24M group (+90% and +63%; p= 0.062 and 0.251, respectively).
Brain weight, and plasma glucose, lactate, free fatty acids, triglycerides and insulin were
not different between the two groups.
57
Table 2: Weight and plasma metabolic parameters in 24 month old rats on a standard diet
(24M) or high-fat ketogenic diet (24M-KD) and fasted for 18 h.
24M
24M-KD
Body weight (g)
630 (27)
672 (22) *
Brain weight (g)
2.23 (0.06)
2.25 (0.09)
Glucose (mM)
9.0 (1.5)
9.7 (2.4)
Acetoacetate (M)
477 (263)
779 (271)
-hydroxybutyrate (M)
719 (198)
1366 (455)
Lactate (mM)
1.2 (0.5)
1.5 (0.4)
Free fatty acids (mM)
1.7 (1.6)
0.8 (0.4)
Triglycerides (mM)
2.5 (1.0)
1.3 (0.7)
Insulin (U/ml)
16.1 (10.6)
21.0 (8.8)
Mean (SD); n= 6/group
* Significant difference between the two groups (p<0.05)
Brain 11C-AcAc and 18F-FDG uptake on the KD
CMRAcAc (µmol/100 g/min) was 28% higher in the whole brain, 45% higher in the
hippocampus and 44% higher in the striatum of the 24M-KD vs. 24M rats (p=0.026, 0.009,
and 0.008, respectively; Figure 5A). Whole brain and regional CMRglc were significantly
higher in 24M-KD compared to 24M rats: +44% in whole brain (p=0.030), +54% in cortex
(p=0.030), +58% in striatum (p=0.035) and +78% in cerebellum (p=0.029; Figure 5B).
58
Fig 5 - Cerebral metabolic rate (CMR) of 11C-AcAc (A and C) and 18F-FDG (B and D) in
the whole brain (WB), cortex (Cx), hippocampus (Hp), striatum (St) and cerebellum (Cb)
of 24 month old rats on a standard diet (24M) or on a ketogenic diet (24M-KD). Data are
expressed as µmol/100 g/min (A and B) and nmol/region/min (C and D). Mean+SEM (*
p<0.05; ** p<0.01).
The same significant differences in CMR were observed when the data were
expressed as nmol/region/min (Figure 5C-D). Whole brain CMRAcAc in 24M and 24M-KD
rats was 60±8 and 76±9 nmol/min, respectively (p=0.026), and whole brain CMRglc was
800±171 and 1152±274 nmol/min, respectively (p=0.030). The contribution of 11C-AcAc to
whole brain energy substrate uptake (11C-AcAc +
18
F-FDG) was 6-7% in 24M and 24M-
KD rats and was similar across brain regions (data not shown).
In 24M rats, there was no significant difference in the brain uptake of the two fuels
as a % of whole brain CMR (Figure 4C). However, in 24M-KD rats, compared to 11C-AcAc
uptake,
18
F-FDG uptake by the cortex was 25% lower but 35% higher in the striatum
(p=0.030 and 0.036, respectively; Figure 4D).
59
5.5. Discussion
Our main observations are that in male Sprague-Dawley rats, CMRAcAc and CMRglc
were similar in aged (21M) compared to young (4M) rats and that the high-fat KD
increases both CMRAcAc and CMRglc in 24 month old rats. Since the region-to-whole brain
ratios differ significantly between CMRAcAc and CMRglc, it may therefore be more
appropriate to refer to conditions inducing lower brain FDG uptake as brain glucose
hypometabolism rather than the more general term - brain hypometabolism.
Aging study
Despite similar whole brain volume in the 21M versus 4M rats, the former had 30%
larger lateral ventricles (Figure 1A-B). To the best of our knowledge, this is the first study
to report differences in brain ventricle volume associated with age in the rat. Though well
within the detection limits of MRI, this larger lateral ventricle volume represents 0.2% of
whole brain volume in the rat, thereby having no significant effect on overall brain volume.
Hippocampus volume was similar in the 21M and 4M rats, which contrasts with
observations from Driscoll et al. (2006), who reported smaller hippocampus volume in 12
and 24 month old female FBNF1 rats. These differences might be explained by sex and
strain differences because Sprague-Dawley rats tend to live longer than Fischer 344 rats
(Charles River Laboratories 1982, Altun et al. 2007).
BBB permeability to the contrast agent, Gd-DTPA, was 87% higher in the 21M rats
(Figure 1C), which agrees with previously described age-related structural changes in the
BBB (Shah et Mooradian 1997). An age-related decrease in rat brain endothelial cell
number and capillary diameter has been previously reported (Barr 1978). Furthermore,
lower occludin, a structural protein critical for BBB tight junctions function, was observed
in 24 month old rats (Mooradian et al. 2003). Whether increased BBB permeability to GdDTPA influenced CMR remains to be determined; this is a possibility given than Gd-DPTA
permeability was 87% higher and that regional CMRglc was also 51-93% higher
(hippocampus and striatum) in the 21M rats. However, regional CMR AcAc was no more
than 8% higher in the striatum of 21M rats, which would be inconsistent with higher nonspecific transport across the BBB.
60
The 4M group had a mean whole brain CMRglc of 23.7 mol/l00 g/min, which is
similar to a comparable study in normal adult male Sprague-Dawley rats fasted 16 h before
the
18
F-FDG PET scan (28.1 mol/ 100 g/min; (Shimoji et al. 2004). CMRglc was not
different in our 21M versus 4M rats (Figure 2B), an observation that differs somewhat with
the literature except that the methodology was also somewhat different; Le Poncin-Lafitte
et al. (1983) reported lower 14C-2-deoxyglucose uptake in the hippocampus and striatum of
aged rats. A recent study reported lower brain
18
F-FDG uptake by semi-quantitative PET
imaging in 23 month old female Wistar rats (Lopez-Grueso et al. 2010). Female rats may
undergo earlier age-related brain glucose hypometabolism than male rats (Higuera-Matas et
al. 2008), which were used in the present study. As well, anesthesia with isoflurane can
significantly decrease 18F-FDG brain uptake (Matsumura et al. 2003), but it seems unlikely
that that explains the similar 18F-FDG brain uptake we observed across groups because the
same anesthesia and PET protocols were followed in all our rats. In humans, brain glucose
uptake is variously reported to be unchanged or lower in the healthy elderly (Kochunov et
al. 2009, Yanase et al. 2005, Curiati et al. 2011); there again, methodological differences
appear to play a key role in the disparity between studies (Cunnane et al. 2011).
To the best of our knowledge, this is the first report in which PET was used to
quantify brain ketone uptake in aged rats. We used the Patlak kinetic model which, for
brain ketone uptake, gives identical results to the one- and two-tissue compartment models
(Blomqvist et al. 1995, Blomqvist et al. 2002). We observed a positive correlation between
brain ketone uptake and plasma ketone concentration, as expected and previously reported
in adult rats (Daniel et al. 1971, Ruderman et al. 1974, Pifferi et al. 2011). Indeed,
CMRAcAc is usually considered to be primarily regulated by arterial AcAc concentration. As
in the present study, CMRAcAc measured by arteriovenous differences in humans was
previously shown not to differ in elderly versus young adults (Gottstein et al. 1971, LyingTunell et al. 1980).
Previous studies of autoradiography in rats have also shown that regional brain
utilization of ketones differs from that of glucose (Hawkins et Biebuyck 1979, Hawkins et
al. 1986). Here, we confirm those results by PET imaging (Figure 4); we show that CMR glc
was lower in the cortex and cerebellum compared to CMRAcAc. In the present study,
CMRAcAc itself did not differ between our young and aged rats, but the tendency towards
61
higher CMRglc in the aged rats (Figure 2B-D) resulted in AcAc contributing 38-52% less to
whole and regional brain fuel uptake (glucose + AcAc) in the aged rats (Figure 3). This
preliminary observation suggests that significant age-related changes in brain fuel
metabolism come to light when comparing brain uptake of glucose and ketones in a
sequential dual tracer PET experiment that would not be possible to observe with one fuel
tracer alone. This observation also depended on being able to quantify CMR, which
required measurement of input functions and volumes of interest by MRI; whether this
differential quantitative effect of age on brain fuel metabolism is present in humans or is
linked to differences in behaviour or cognition remains to be determined.
Ketogenic diet study
We have previously reported increased brain uptake of
18
F-FDG and
11
C-AcAc in
young rats on a KD for 14 days (Pifferi et al. 2011). Those data were expressed using semiquantitative ‘standardized uptake values’ since the plasma time-activity curves necessary to
calculate CMR were not available. Here we confirm that our previous results apply when
the CMRAcAc or CMRglc are calculated, and that 28-78% higher CMRAcAc and CMRglc on
the KD seem to be generalized across different brain regions (Figure 5).
During ketosis, ketones are preferentially used by neurons (Jiang et al. 2011). Ketosis
also increases Krebs’ cycle flux because of AcAc transformation directly into acetyl-CoA
(Yudkoff et al. 2004, Melo et al. 2006). Therefore, increased mitochondrial metabolism
during mild ketosis may increase brain glucose uptake (hence CMRglc) in order to satisfy
the increased need for oxaloacetate and maintain postsynaptic ion gradients. In that case,
higher CMRglc would mainly occur in astrocytes, which prefer glucose as an energy
substrate (Bouzier-Sore et al. 2006). Nuclear magnetic resonance spectroscopy studies also
showed a higher brain 13C-glucose uptake in ketotic mice (Yudkoff et al. 2005a) and in the
Strasbourg strain of rats with genetic absence epilepsy on a KD (Melo et al. 2006).
Nevertheless, not all rat studies of CMRglc during experimental hyperketonemia are
consistent with our present results; some suggest there may be no change in CMR glc (Linde
et al. 2006, al-Mudallal et al. 1995), or that CMRglc may be lower in the frontal cortex and
cerebellum (LaManna et al. 2009). The results of LaManna et al. (2009) do not necessarily
contradict ours because they induced a much higher ketonemia (5 mM versus 1.3 mM -
62
hydroxybutyrate in the present study), which could result in 3-4 fold higher brain ketone
uptake (Cunnane et al. 2011).
5.6. Conclusion
In summary, the present study shows that there are subtle regional and whole brain
differences in CMRAcAc and CMRglc between young and aged male Sprague-Dawley rats.
Hence, 11C-AcAc is a useful new PET tracer permitting better definition of how much brain
fuel metabolism may change under different experimental conditions. If translatable to
humans, our present data imply that brain glucose hypometabolism in the elderly may be
more related to disease-associated processes and is not necessarily part of normal brain
aging. One potentially significant observation is that mild ketonemia induced by the highfat KD increased both CMRAcAc and CMRglc in aged rats (Figure 5), leading us to suggest
that the cognitive benefits associated with a mild experimental ketonemia in AD (Reger et
al. 2004, Henderson et al. 2009), mild cognitive impairment (Krikorian et al. 2012), and in
diabetic patients (Page et al. 2009) may occur at least in part via improved brain uptake of
both ketones and glucose. Further experiments are required to better understand brain
substrate utilization by neurons and astrocytes in aged rats in the context of a KD.
5.7. Experimental Procedures
Study design
Male Sprague-Dawley rats (Harlan Laboratories, Montreal, Canada) were used in
two studies: (i) Across age; 4 month old (young; 4M) versus 21 month old (aged; 21M)
rats, and (ii) Effect of a KD in 24 month old rats fed a standard diet (24M) or fed a high-fat
KD (24M-KD) for 14 days before the PET experiment. There were six rats/group, which
was sufficient to show statistically significant differences in the PET data in our previous
work (Pifferi et al. 2011). Aged rats were obtained at 12 months of age and housed in our
animal facility. 4M and 21M groups underwent an MRI scan approximately 1 week before
the double tracer PET study.
The KD had a ratio of fat to protein and carbohydrate of 3.5: 1.0 (Diet no. 180478;
Dyets Inc, Bethlehem, PA, USA). Fourteen days on the high-fat KD is sufficient to induce
mild ketonemia in rats (Pifferi et al. 2011) but the ketonemia can be transitory even though
63
the rats are continuously on the KD. After the MRI and PET scans, all rats were sacrificed.
The experimental protocol was approved by the Institutional Animal Research Ethics
Review Board and all handling of animals was conducted in accordance with the Animal
Care and Use Committee at the Université de Sherbrooke.
MRI
MRI was performed using a 7 Tesla small-animal scanner (Varian, Palo Alto, CA,
USA) equipped with 205/120 Magnex gradient coils and a 63 mm volume coil (Varian,
Palo Alto, CA, USA). Rats were anesthetized with 2% isoflurane and a polyethylene
catheter was installed in the tail vein. Body temperature and respiration rate were monitored
to ensure stable physiological conditions throughout the acquisitions. T2-weighted images
were acquired using a fast spin-echo pulse sequence (repetition time/effective echo time:
3500/12 ms; number of averages: 8; field of view: 5 × 5 cm2; matrix: 256 × 256; 0.2 × 0.2
mm2 in-plane resolution; 35 slices of 1 mm). These images were used to assess volumes of
the whole brain, cortex, hippocampus, striatum, cerebellum and lateral ventricles in the 4M
and 21M rats. Volumes of interest (VOIs) were manually drawn on the axial view and
volumes were computed in mm3, using ITK-SNAP software (Yushkevich et al. 2006). A
second set of T1-weighted images were acquired with the contrast agent - gadoliniumdiethylene-triaminopentaacetic acid (Gd-DTPA [Magnevist], 0.9 kDa; Bayer HealthCare
Inc.) - to determine BBB permeability (Cote et al. 2010). A bolus of Gd-DTPA was
injected into the caudal vein (143 mM, 600 l over 1 min). Gd-DPTA injection was done
after 2 time frames (308 s), with uptake determined in the whole brain. Overall, 18 images
were acquired at intervals of 154 s, for a total acquisition time of 46.2 min (repetition
time/effective echo time: 300/2.5 ms; number of averages: 4; field of view: 5 × 5 cm2;
matrix: 128 × 128; 0.4 × 0.4 mm2 in-plane resolution; 35 slices of 1 mm). Data was
normalized using the first time frame.
PET
Prior to undergoing the PET protocol, all rats were fasted for 18 h. They were
imaged on a small-animal PET scanner with a 7.5 cm axial field of view, an isotropic
spatial resolution of 1.2 mm, and an energy window setting of 250-650 keV (LabPET/-
64
Triumph; Gamma Medica, Northridge, CA, USA). Before the PET scan, rats were
anesthetized with 2% isoflurane and a polyethylene catheter was installed in the tail vein
for tracer injection.
18
2007).
11
C-AcAc was synthetized as previously described (Tremblay et al.
F-FDG was prepared using a TRACERlab FDG-MX synthesis unit (GE
Healthcare, Waukesha, WI, USA). The double tracer PET protocol was as follows: (i) 11CAcAc injection (~50 MBq) with a 20 min dynamic scan, (ii) a 15 min delay, and (iii)
18
F-
FDG injection (~50 MBq) with a 40 min dynamic acquisition. Both tracers were injected in
a volume of 300 l 0.9% sodium chloride solution at 1 ml/min followed by a 300 l flush
at 1 ml/min. 18F-FDG acquisition was started 30 s before injection to be able to correct for
residual radioactivity from
11
C-AcAc acquisition. Body temperature and respiration rate
were monitored to ensure stable physiological conditions throughout the PET acquisitions.
Analysis of PET Data
The PET images were reconstructed in 2D using 15 iterations with the following
frames sequence: 1 × 30; 12 × 5; 8 × 30; n × 300 s, where n = 3 for the
11
C-AcAc
acquisition and n = 7 for the 18F-FDG scan. Voxel size was 0.5 × 0.5 × 1.2 mm3. PET scans
were co-registered with the T2-weighted MR images using PMOD software (PMOD
Technologies Ltd, Zurich, Switzerland). A representative MR scan from the 4M and 21M
groups were used to co-register the PET images. Tracer uptake was determined in whole
brain and four brain regions: hippocampus, cerebral cortex, striatum and cerebellum. No
correction for partial volume effect was made as the chosen VOIs had a substantial size
(Phelps 2006). The smallest VOI was the striatum, with a mean volume of 59 mm3. Plasma
time-activity curves for
11
C-AcAc and
18
F-FDG acquisitions were determined using an
image-derived input function (Menard et al. 2010, Bentourkia et al. 2009, Liistro et al.
2010, Tantawy et Peterson 2010). A VOI was drawn on the left ventricular cavity blood
pool on summed
18
F-FDG PET images acquired during the first 90 s following injection.
Image-derived input functions were corrected using two plasma samples taken at 15 and 18
min for
11
C-AcAc acquisitions and 30 and 35 min for
18
F-FDG scans. Radioactivity was
measured in a gamma counter (Packard Cobra, GMI, USA). Regional CMRAcAc and
CMRglc were determined using a multiple-time graphical analysis method (Patlak et al.
1983, Patlak et Blasberg 1985); equation 1), where the measured PET activity (CTissue) is
65
divided by plasma activity (CP) and plotted at a normalized time. After steady state is
achieved, as determined by a 5% maximal deviation from the Patlak regression line, the
plot results in a straight line, where the slope K represents brain influx and V is the tracer’s
distribution volume.
∫
(1)
CMRglc was calculated using equation 2, where [glucose] is the plasma glucose
concentration. A lumped constant (LC) of 0.48 was used as previously reported in rats
(Sokoloff et al. 1977).
(2)
CMRAcAc was calculated from the following equation (Blomqvist et al. 1995):
(3)
Blood analysis
After the PET scan, 5 ml of blood was collected by cardiac puncture before
euthanasia. Blood samples were kept on ice and then centrifuged (6000 RPM; 5 min; 4°C)
to collect plasma. Samples were kept at -80°C until analysed using a clinical chemistry
analyzer (Dimension Xpand Plus, Siemens Healthcare Diagnosis Inc, Deerfield, IL, USA)
with kits for glucose (DF40), lactate (DF16), triglycerides (DF69A) and free fatty acids
(NEFA-HR2, Wako Ltd, Richmond, VA, USA). Plasma AcAc and -hydroxybutyrate were
measured with an open channel of the Dimension analyzer as previously described (Pifferi
et al. 2011). Insulin levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (80INSRTU-E01, Alpco, Salem, NH, USA).
Statistical analysis
Statistical analyses were performed using non-parametric tests (Prism 5; GraphPad,
La Jolla, CA, USA). Data show the comparison between the 4M and 21M groups, and
between the 24M and 24M-KD groups (Mann-Whitney test). Correlations were established
by Spearman’s test. Two-tailed p<0.05 was considered statistically significant.
66
Acknowledgements
This study was financially supported by the Fonds de la recherche en santé du
Québec, Canadian Institutes of Health Research, Canadian Foundation for Innovation, the
Canada Research Chairs Secretariat (SCC), Research Center on Aging, FORMSAV and the
Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de Sherbrooke. The Sherbrooke
Molecular Imaging Center is part of the FRSQ-funded Étienne-Le Bel Clinical Research
Center. The authors thank Melanie Fortier, Dr. M’hamed Bentourkia, Dr. Otman Sarrhini,
Dr. Jacques Rousseau, Caroline Mathieu and Mélanie Archambault for generous support
and technical assistance. The authors would like to thank the image analysis and
visualization platform (http://pavi.dinf.usherbrooke.ca) for their help.
Disclosure Statement
The authors declare no conflicts of interest.
67
6. ARTICLE 2
Modulation of brain glucose metabolism and GABA/glutamate ratio by the ketogenic
diet: an NMR study after 13C-glucose or 13C--hydroxybutyrate infusion
Auteurs de l’article: Roy M, Beauvieux MC, Naulin J, El Hamrani D, Cunnane SC,
Bouzier-Sore AK.
Statut de l’article: soumis dans Journal of Neurochemistry (JNC-2013-0912).
Avant-propos: Ci-dessous sont mes contributions dans la réalisation de la publication. J’ai
effectué la majeure partie du projet au CHU de Bordeaux : le suivi des paramètres
physiologiques au cours des diètes; les protocoles d’infusion des traceurs; le prélèvement
des tissus et du sang; les extractions perchloriques; les acquisitions de spectroscopie RMN
1
H et 13C. J’ai effectué l’analyse des spectres 1H et 13C, la préparation du manuscrit et des
figures et la soumission de l’article à Sherbrooke en collaboration avec les chercheurs de
Bordeaux.
68
6.1. Résumé
La diète cétogène (KD) est utilisée comme traitement alternatif dans les cas
d’épilepsie réfractaire chez l’enfant, mais le mécanisme par lequel elle réduit les crises
épileptiques n’est toujours pas connu. De plus, il n’est pas clair si l’oxydation cérébrale du
glucose (Glc) est modifiée en condition de cétose. Nous avons évalué, par spectroscopie
RMN, les métabolites cérébraux et leur enrichissement en
13
C après une infusion de [1-
13
C]Glc ou [2,4-13C2]-hydroxybutyrate (-HB) chez des rats sous diète contrôle (CT) ou
KD pendant 7 jours. Chez les rats infusés avec le [1-13C]Glc, le groupe KD avait un
enrichissement en
13
C plus élevé du Glc C1 (+16%) et du lactate C3 (+32%)
comparativement aux rats CT, alors que les enrichissements des acides aminés étaient
similaires entre les deux groupes. Chez les rats infusés avec le [2,4-13C2]-HB, le groupe
KD avait un enrichissement plus élevé de tous les acides aminés comparativement aux rats
CT : alanine C3 (+26%; p=0.007), glutamate C4 (+52%; p=0.030), glutamine C4 (+54%;
p=0.025), GABA C2 (+57%; p=0.045) et aspartate C3 (+30%; p=0.047). Indépendamment
du substrat infusé, le ratio GABA/glutamate était 11% plus élevé chez les rats KD
comparativement aux rats CT (p=0.021). L’étude des métabolites du foie par RMN a
révélée l’origine potentielle de l’augmentation du GABA chez les rats KD puisque la KD a
augmenté le contenu hépatique de la leucine et de l’isoleucine, deux acides aminés
cétogènes et précurseurs du GABA. Nous concluons qu’une KD poursuivie pendant 7 jours
augmente la glycolyse et le métabolisme oxydatif des cétones au cerveau ainsi que les
acides aminés cétogènes hépatiques, qui pourraient participer à l’augmentation du contenu
relatif en GABA, le principal neurotransmetteur inhibiteur au cerveau. Ce dernier résultat
pourrait représenter l’un des mécanismes par lequel la KD réduit les crises épileptiques.
69
6.2. Abstract
The ketogenic diet (KD) is an effective alternative treatment for refractory epilepsy
in children but the mechanism by which it reduces seizures is still unknown. It is also
unclear whether or not brain glucose (Glc) metabolism changes under a KD. Using NMR
spectroscopy, we evaluated brain metabolites and their 13C enrichment after an infusion of
[1-13C]Glc or [2,4-13C2]-hydroxybutyrate (-HB) in rats on a control diet (CT) or a KD for
7 days. In [1-13C]Glc-infused rats, the KD group had 16% higher
13
C enrichment of brain
Glc C1 and 32% higher brain lactate C3 enrichment compared to CT rats, while
enrichments of brain amino acids were similar in the two groups. In [2,4-13C2]-HB-infused
rats, the KD group had higher enrichments of all analyzed amino acids compared to CT
rats: alanine C3 (+26%; p=0.007), glutamate C4 (+52%; p=0.030), glutamine C4 (+54%;
p=0.025), GABA C2 (+57%; p=0.045) and aspartate C3 (+30%; p=0.047). The KD group
had also a 11% higher GABA/glutamate ratio compared to CT rats (p=0.021),
independently of the infused substrate. The NMR study of liver metabolites highlighted the
putative metabolic origin of higher GABA in KD rats since the KD increased liver leucine
and isoleucine content, two ketogenic amino acids and GABA precursors. We conclude
that a 7-day KD increased brain glycolysis, brain ketone oxidative metabolism and liver
ketogenic amino acids, which could participate to the increase in brain GABA relative
content, the brain’s major inhibitory neurotransmitter. This latter result may help explain
how the KD reduces seizures in intractable epilepsy.
Key words: Ketogenic diet,
13
C-glucose,
13
C--hydroxybutyrate, neuron, astrocyte, NMR
spectroscopy
Abbreviations: AcetoAc: acetoacetate; AcetoAc-CoA: acetoacetyl-CoA; Ac-CoA: acetylCoA; -KG: -ketoglutarate; -KetoIsoC: -ketoisocaproic acid; Ala: alanine; AA: amino
acids; Asp: aspartate; -HB: -hydroxybutyrate; BCAA: branched-chain amino acid; CT:
control; KD: ketogenic diet; FFA: free fatty acids; Glc: glucose; Glu: glutamate; Gln:
glutamine; HR-MAS: high resolution magic angle spinning; Lac: lactate; OAA:
oxaloacetate; ppm: parts per million; Pyr: pyruvate; PC: pyruvate carboxylase; PDH:
pyruvate dehydrogenase; TCA cycle: tricarboxylic acid cycle.
70
6.3. Introduction
Glucose (Glc) normally provides almost all of the energy requirement of the adult
brain (Cahill 2006). When blood Glc decreases over a period of more than a few hours,
ketones (-hydroxybutyrate [-HB], acetoacetate and acetone) start to replace Glc and can
become the main brain energy substrate during prolonged fasting or starvation (Owen et al.
1967). Under conditions of Glc deficit, low plasma insulin permits increased lipolysis from
adipose tissue and increased fatty acid -oxidation, thereby raising acetyl-CoA in liver
mitochondria and stimulating ketogenesis (Fukao et al. 2004).
Ketones are physiologically more important for the brain in the neonatal period,
during which they are not only an essential energy substrate for brain development, but are
also a key substrate for brain lipid and amino acid synthesis (Webber et Edmond 1977,
DeVivo et al. 1975). Brain ketone uptake is mediated by monocarboxylic acid transporters
(MCT) in endothelial cells of the blood-brain barrier (Simpson et al. 2007). Brain ketone
uptake is primarily regulated by plasma ketone concentration both in rats (Daniel et al.
1971, Ruderman et al. 1974, Pifferi et al. 2011) and in humans (Blomqvist et al. 2002,
Hasselbalch et al. 1995). Thus, conditions that raise plasma ketones also raise brain ketone
uptake (Pifferi et al. 2011, Bentourkia et al. 2009, Roy et al. 2012a), thereby ensuring
efficient replacement of declining Glc availability. One way to sustainably increase plasma
ketone concentration is to follow a very high fat, low carbohydrate and low protein diet, or
ketogenic diet (KD). This type of KD has been used to treat refractory epilepsy in children
for nearly a century (Wilder 1921, Freeman et al. 2006) but the mechanism by which
seizures are reduced is still unknown.
During ketosis, it is unclear whether or not brain Glc metabolism changes; some
studies report no change (Ito et Quastel 1970, Rolleston et Newsholme 1967), whereas
others report a decrease (Jiang et al. 2011, Mans et al. 1987). These discrepancies may be
due to different species, ketosis status and methods of analysis. On the other hand, others
have shown an increase in brain Glc uptake (Pifferi et al. 2011, Roy et al. 2012a) and brain
Glc transporters after a KD (Puchowicz et al. 2007). In light of these uncertainties, the
present study aimed to use NMR spectroscopy to investigate the effect of a very high fat
KD on brain 13C-Glc and 13C--HB metabolism in young adult male Sprague-Dawley rats.
71
In an approach of integrated metabolism, we also investigated the effect of the KD on liver
metabolites, the main site of ketogenesis.
6.4. Materials and Methods
Animals
Male Sprague-Dawley rats weighting 160 g were purchased from Janvier Labs (Le
Genest Saint Isle, France) and housed in a room with controlled temperature (21-23°C) and
a 12/12 h normal light/dark cycle (lights on at 8:00 a.m.). The rats were acclimatized for 6
days and then fed a control diet (CT; number 101091, Safe, Augy, France) or a high fat KD
for 7 days (KD; number 180478). Diet composition was as previously described (Pifferi et
al. 2011). The ratio of fat/(protein + carbohydrate) was 3.5/1.0 (weight/weight) for the KD
and 1.0/12.5 for the CT. Seven days on a high fat KD is sufficient to induce mild ketosis in
rats (plasma ketones < 1 mM) (Taha et al. 2005, Likhodii et al. 2000). The KD group was
fasted for 48 h prior to starting the diet in order to deplete hepatic glycogen stores and favor
ketogenesis (Murphy et al. 2005, Zhou et al. 2008, Kossoff et al. 2009, Beauvieux et al.
2008). Body weight and food intake were monitored every day at 9:00 a.m. Tail vein
ketone concentrations were measured every other day using hand-held test strips (Precision
Xtra, Abbott Laboratories, Alameda, CA, USA). At the end of the 7 day feeding period, the
CT and KD groups were separated in two sub-groups for the substrate infusion: [1-13C]Glc
or [2,4-13C2]-HB (n=6/group). The experimental protocol was approved by the
Institutional Animal Research Ethics Review Board and met the guidelines of the French
governmental agency (authorization no. 3310003).
13
C-substrate infusion
At the end of the 7-day feeding period, the rats were anesthetized with an
intraperitoneal injection of chloral hydrate (8%, 0.5 ml/100 g body weight). [1-13C]Glc (Dglucose)
or
[2,4-13C2]-HB
(sodium
D-3-hydroxybutyrate)
(Cambridge
Isotope
Laboratories, Andover, MA, USA) was then infused into the tail vein over a total period of
60 min. The [1-13C]Glc infusion followed our previous 20 step, time-decreasing
exponential rate protocol, going from 15 to 1.23 ml/h during the first 25 min, after which
the rate was kept unchanged for the last 35 min (Bouzier et al. 2000, Sampol et al. 2013).
72
Using a 750 mM 13C labeled glucose solution, the total infusate volume was 2.92 ml after
60 min, in agreement with reaching a supra-physiological glycaemia (Bouzier 2000, Mason
et al. 1992). [2,4-13C2]-HB (1.5 M) was infused according to a three step protocol (Jiang
et al. 2011): (i) 0 to 5 min at 80 l/min per 200 g body weight, (ii) 5 to 10 min at 40 l/min
per 200 g body weight, and (iii) 10 to 60 min at 16 l/min per 200 g body weight. These
infusion protocols permitted the maintenance of constant
13
C-substrate concentrations in
the blood (Bouzier et al. 2000, Jiang et al. 2011). Body temperature was monitored and
maintained at 37°C during the infusion. At the end of the infusion, while rats were still
anesthetized, the abdomen was immediately partly opened and 2 ml of heparinized blood
was collected in the inferior vena cava. Blood samples were centrifuged (1500 g; 10 min)
within 15 min and plasma was kept at -80°C until analysed. Immediately after the blood
sampling, rats were rapidly euthanized by focused brain microwaves (5 KW, 1 sec; Sacron
8000, Sairem, Neyron, France), which stops post-mortem brain metabolic changes (de
Graaf et al. 2009, Davila et al. 2012). The dome of the skull was cut open with a
microcircular saw and the brain was rapidly removed. Whole brains were plunged into
liquid nitrogen and kept at -80°C until the metabolites were extracted. The liver was also
removed, freeze-clamped in liquid nitrogen and kept at -80°C until the 1H HR-MAS (high
resolution magic angle spinning) NMR analysis.
Brain perchloric acid extracts
Whole brain extraction of water-soluble metabolites into perchloric acid was
performed as previously described (Bouzier et al. 2000) with the following modifications:
after homogenization, the suspension was centrifuged at 3000 g for 10 min. The
supernatant was neutralized with KOH, and centrifuged to eliminate perchlorate salts. Prior
the NMR spectroscopy, samples were lyophilized, then dissolved in 500 l of D2O and
ethylene glycol (1 M; 10 l) was added as an external reference.
HR-MAS NMR spectroscopy
HR-MAS NMR spectroscopy was performed on an 11.7 Tesla spectrometer (DPX
500 MHz, Bruker Biospin, Wissembourg, France). For brain perchloric acid extracts, a 50
l aliquot was placed in the HR-MAS rotor. HR-MAS was performed even though we had
73
brain perchloric acid extract since higher spectrum resolution is achieved and this method
requires less volume of extract. For liver, around 20 mg of tissue was weighed and directly
placed in the HR-MAS rotor, without any chemical extraction, and 20 l of fumarate
(disodic salt, 50 mM in D2O) were added as an external reference (Roy et al. 2013a).
1
H-NMR spectra were acquired with a 90° pulse angle (adjusted for each sample),
relaxation time of 8 s, relaxation delay of 8 s, spectrum width of 10 parts per million (ppm),
acquisition time of 3.28 s, 128 scans and 32 K memory size. The water signal was
suppressed by homonuclear presaturation. Brain Glc C1
13
C enrichment was determined
from the ratio of the integral of the Glc satellite peaks resulting from heteronuclear spincoupling to the sum of the integrals of satellite and central peaks. Brain content of GABA
relative to glutamate (Glu) and brain content of glutamine (Gln) relative to Nacetylaspartate (NAA) was also measured.
1
H-decoupled
13
C-NMR spectra were acquired with a 90° pulse angle, relaxation
time of 20 s, 200 ppm spectrum width, 1.31 s acquisition time, ~5500 scans, and 64 K
memory size. Brain Glu C2/C3 and Gln C2/C3 and Glu C4/Gln C4
13
C enrichments were
measured from these spectra. The integration of the Glu C4 and Gln C4 singlet peaks was
performed (Figure 5).
1
H-observed/13C-edited NMR spectra were acquired as previously described
(Bouzier et al. 2000). The method included a first scan consisting of a standard spin-echo
acquisition, in which 1H coupled to all carbons (12C and
13
13
C) were visible, and a second
scan corresponding to a C inversion pulse, in which only H coupled to 13C were visible.
Brain metabolite
13
1
C enrichments were determined from the ratio of the integral of a
resonance on the edited 13C-1H spectrum to its integral in the standard spin-echo spectrum
(Bouzier et al. 2000). Peaks were integrated using GSim software (open source:
http://sourceforge.net/projects/gsim/files/latest/download).
For liver analysis, pieces of tissue were used and 1H-NMR spectra were acquired to
measure metabolites. A Carr-Purcell-Meiboom-Gill sequence was applied to eliminate the
macromolecule contribution to the baseline. The sequence parameters were as previously
described (Roy et al. 2013a).
74
Plasma metabolites
Plasma samples were analyzed using a clinical chemistry analyzer (Olympus
AU2700, BCO, Villepinte, France) with kits for Glc (BC OSR6221, Beckman Coulter,
Brea, CA, USA), -HB (Ranbut, Randox Laboratories, Crumlin, UK), Lac (BC OSR6193),
free fatty acids (FA115, Randox Laboratories) and triglycerides (BC OSR6118). Insulin
levels were assessed by ELISA (Diasorin, Antony, France). These assays were done in the
medical laboratories of Bordeaux CHU.
Statistical analysis
Statistical analyses were performed using Prism 6 (GraphPad, La Jolla, CA, USA).
Comparisons between the CT and KD groups and between the [1-13C]Glc and [2,4-13C2]HB groups were done using the Mann-Whitney test. Correlations were established by
Spearman’s test. Two-tailed p<0.05 was considered statistically significant.
6.5. Results
Weight gain and plasma measurements
Before starting the KD, rats in that group were fasted for 48 h in order to deplete
hepatic glycogen stores and favor ketogenesis (Murphy et al. 2005, Zhou et al. 2008,
Beauvieux et al. 2008). Fasting led to a decrease of body weight in the KD group (Figure
1A). However, immediately after the reintroduction of the food in KD rats, the slopes of the
growth curves were similar between CT and KD rats (7.2 and 6.9 g/day; p=0.66,
respectively). Blood -HB in CT rats averaged ~0.3 mM during the feeding period. In the
KD group, blood -HB reached a mean value of 3.2 mM during fasting and decreased
thereafter to ~1 mM until day 9 (Figure 1B). On day 9 (before infusion), KD rats had 4 fold
higher blood -HB than CT rats (p=0.009).
75
A
(o n l y i n K D )
Fast
B o d y w e ig h t ( g )
300
D ie t
CT
***
KD
***
250
***
***
2
3
***
***
***
***
***
200
150
0
1
4
5
6
7
8
9
**
**
8
9
T im e (d a y s )
B
4
B lo o d  - H B ( m M )
***
3
2
***
*
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
T im e (d a y s )
Figure 1- Body weight (A) and blood concentration of -hydroxybutyrate (-HB; B) of
rats fed the control diet (CT) or the ketogenic diet (KD) for 7 days. Rats were infused with
13
C-substrates and sacrificed on day 9. The 48 h fasting was conducted only in the KD
group. Values are mean±SEM (n=12/point); *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
At the end of the 1 h [1-13C]Glc infusion, rats in the KD group had 84% higher
plasma Glc compared to rats in the CT group (p=0.004; Table 1). After the [2,4-13C2]-HB
infusion, no statistical difference was found between CT and KD rats in plasma -HB
content, although CT rats had significantly lower blood -HB right before [2,4-13C2]-HB
infusion (0.2 and 0.8 mM; p=0.009, respectively). However, post-[2,4-13C2]-HB infusion,
the KD group had 43% lower triglycerides (p=0.043) and 53% lower plasma insulin
(p=0.008) compared to the CT group. Plasma insulin was statistically higher in KD [1-
76
13
C]Glc-infused rats than in KD [2,4-13C2]-HB-infused rats, reflecting the stimulation of
insulin secretion due to the infused [1-13C]Glc. Plasma Lac and free fatty acids were not
statistically different between the four groups.
Table 1: Plasma metabolite concentrations in anesthetized rats on the control diet (CT) or
the ketogenic diet (KD) at the end of 1 h after infusion of [1-13C]glucose (Glc) or [2,413
C2]-hydroxybutyrate (-HB).
[1-13C]Glc
[2,4-13C2]-HB
CT (n=6)
KD (n=5)
CT (n=6)
KD (n=6)
Glucose (mM)
13.9±3.2
25.6±5.6A
10.0±3.3B
11.4±1.1C
-hydroxybutyrate (µM)
94±85
103±50
5000±1543B
3066±2086C
Insulin (U/ml)
119±70
77±50
81±29
38±17AC
Lactate (mM)
3.9±1.6
3.9±2.1
4.8±0.6
4.5±1.1
Free fatty acids (mM)
0.2±0.2
0.2±0.1
0.2±0.1
0.2±0.2
Triglycerides (mM)
0.8±0.5
0.5±0.2
0.7±0.2
0.4±0.1A
Values are expressed as mean±SD.
A: significant difference between CT and KD rats in the same infusion group
B: significant difference between CT rats infused with [1-13C]Glc or [2,4-13C2]-HB
C: significant difference between KD rats infused with [1-13C]Glc or [2,4-13C2]-HB
13
C enrichments in brain metabolites
Infusion of the
13
C-substrates led to the pattern of labelling of brain metabolites
illustrated in Figure 2, which represents labelling observed after the first turn of the
tricarboxylic acid (TCA) cycle.
77
Figure 2- Schematic representation of metabolite labelling from [1-13C]Glc or [2,4-13C2]HB in neurons and astrocytes. In astrocytes, 13C-labeled pyruvate C3 (Pyr) follows either
the pyruvate dehydrogenase (PDH; ●) or the pyruvate carboxylase (PC; ○) pathway but
only the PDH pathway in neurons. This scheme is limited to the first turn of the
tricarboxylic acid (TCA) cycle. In neurons, half of the molecules of oxaloacetate (OAA)
and aspartate (Asp) are labeled on C2 and the other half on C3. Lac: lactate; Ala: alanine;
Ac-CoA: acetyl-CoA; -KG: -ketoglutarate; Glu: glutamate; Gln: glutamine.
The
13
C enrichments are reported in Table 2. In [1-13C]Glc-infused rats, the KD
group had 16% higher enrichment of Glc C1 and 32% higher Lac C3 enrichment compared
to CT rats. 13C enrichments of brain amino acids did not statistically differ between the CT
and KD groups infused with [1-13C]Glc. In rats infused with [2,4-13C2]-HB, the KD group
had higher 13C enrichment of all metabolites compared to CT rats (Table 2): Lac C3 (+31%;
p=0.007), alanine C3 (Ala; +26%; p=0.007), Glu C4 (+52%; p=0.030), Gln C4 (+54%;
p=0.025), GABA C2 (+57%; p=0.045), and aspartate C3 (Asp; +30%; p=0.047). Only 13C
enrichment in the substrate, -HB C4, did not differ between the two groups. After [2,413
C2]-HB infusion,
13
C incorporation at C4 of acetoacetate (30.4 ppm) was not different
between the CT and KD groups (data not shown).
For the comparison of [1-13C]Glc and [2,4-13C2]-HB-infused rats, enrichments of
metabolites measured after [1-13C]Glc infusion were doubled to take into account the
difference in isotope dilution (one [1-13C]Glc molecule leads to the formation of one
molecule of [2-13C]acetyl-CoA, whereas one [2,4-13C2]-HB molecule gives rise to two
78
molecules of [2-13C]acetyl-CoA). In CT rats, [1-13C]Glc infusion led to significantly higher
13
C enrichments in all brain metabolites, except in Gln C4, than for [2,4-13C2]-HB infusion
(Table 2). In KD rats infused with [1-13C]Glc, 13C enrichment of Asp C3 was significantly
higher (+40%) compared to KD rats infused with [2,4-13C2]-HB. In rats on the KD, Lac
C3 and Ala C3
13
C enrichments were 7-8 fold higher after [1-13C]Glc-infusion than after
[2,4-13C2]-HB-infusion, reflecting the different metabolic entry points between [1-13C]Glc
which leads to [3-13C]pyruvate, and [2,4-13C2]-HB which leads to [2-13C]acetyl-CoA.
Table 2: Brain metabolite 13C enrichments in rats on the control diet (CT) or the ketogenic
diet (KD) at the end of 1 h after infusion of [1-13C]glucose (Glc) or [2,4-13C2]hydroxybutyrate (-HB).
[1-13C]Glc
[2,4-13C2]-HB
CT
KD
CT
KD
Glc C1
47.3±7.2
54.7±6.2A
ND
ND
-HB C4
ND
ND
86.1±2.9
84.4±1.8
Lac C3
15.6±3.3
20.6±2.3A
3.2±0.4B
4.2±0.5AC
Ala C3
16.2±3.1
19.2±1.8
3.5±0.3B
4.4±0.5AC
Glu C4
13.9±2.3
14.8±1.1
19.6±4.8B 29.8±7.3A
Gln C4
10.7±1.6
11.8±1.7
18.5±4.3
GABA C2
12.7±1.9
13.0±1.4
15.9±3.0B 25.0±8.1A
Asp C3
11.5±2.1
12.2±0.9
13.4±2.9B 17.4±3.2AC
28.5±7.8A
Units are percentage (mean±SD; n=6/group). For the comparison of [1-13C]Glc and [2,413
C2]-HB-infused rats, [1-13C]Glc values were doubled before statistical analysis to take
into account the isotope dilution (one 13C-labeled carbon on [1-13C]Glc versus two on [2,413
C2]-HB).
A: significant difference between CT and KD rats in the same infusion group
B: significant difference between CT rats infused with [1-13C]Glc or [2,4-13C2]-HB
C: significant difference between KD rats infused with [1-13C]Glc or [2,4-13C2]-HB
79
Brain GABA, Glu and Gln contents
Brain GABA content relative to Glu was determined from 1H spectra. In [1-13C]Glcinfused rats, the GABA/Glu ratio did not statistically differ between KD and CT rats
(0.21±0.04 vs. 0.19±0.03; respectively). In [2,4-13C2]-HB-infused rats, the GABA/Glu
ratio was significantly higher in KD rats than in CT rats (0.22±0.03 vs. 0.19±0.02; p=0.035,
respectively). When KD rats were compared to CT rats, independently of the substrate
infused, the GABA/Glu ratio was significantly higher in KD rats compared to CT rats
(0.21±0.03 vs. 0.19±0.02; p=0.021, respectively).
In brain 1H spectra, Gln was quantified relative to NAA. The Gln/NAA ratio was
not different after [1-13C]Glc infusion between CT and KD rats (0.81±0.08 vs. 0.80±0.08,
respectively), whereas it was 50% lower in CT rats than in KD rats after [2,4-13C2]-HB
infusion (0.70±0.07 vs. 1.39±0.17, respectively, p=0.002).
Brain Glu and Gln C2, C3 and C4 13C enrichments
13
C incorporation into different carbons of Glu and Gln was measured from
13
C
spectra (Figure 3).
Figure 3- Typical 13C-NMR spectra of whole brain perchloric acid extracts from rats on the
ketogenic diet (KD) infused with either [1-13C]Glc (green) or [2,4-13C2]-HB (blue). These
spectra were used to determine brain glutamate (Glu) and glutamine (Gln) C2, C3 and C4
13
C enrichments. EG: ethylene glycol (external reference).
80
There was no difference between CT and KD rats, so these two groups were
combined for statistical analysis (Table 3). After [1-13C]Glc infusion, the Gln C2/C3 ratio
was 32% higher than the Glu C2/C3 (p=0.009), reflecting pyruvate carboxylase (PC)
activity which is present only in astrocytes and which led to higher enrichment of C2
compared to C3 of Gln. This difference was not observed after [2,4-13C2]-HB infusion
(p=0.075), reflecting once again the different metabolic fates of [1-13C]Glc and [2,4-13C2]HB. Glu C4/Gln C4 was 29% higher in [1-13C]Glc-infused rats compared to [2,4-13C2]HB-infused rats.
Table 3: Brain glutamate (Glu) and glutamine (Gln) C2, C3 and C4 13C enrichments in rats
on the control diet (CT) or the ketogenic diet (KD) at the end of 1 h after infusion of [113
C]glucose (Glc) or [2,4-13C2]-hydroxybutyrate (-HB).
[1-13C]Glc
[2,4-13C2]-HB
Glu C2/C3
0.92±0.16
0.91±0.14
Gln C2/C3
1.21±0.19A
1.03±0.15
Glu C4/Gln C4 3.47±0.27
2.70±0.20B
Values are expressed as mean±SD. Rats on the control diet and the ketogenic diet were
combined since they were identical for these parameters. n=12/group.
A: significant difference between Glu C2/C3 and Gln C2/C3
B: significant difference between rats infused with [1-13C]Glc or [2,4-13C2]-HB
Hepatic branched-chain amino acids
Liver 1H spectra revealed the presence of a peak representing free leucine and
isoleucine in KD rats (0.92 ppm), a peak that was not present in 1H spectra of CT rats
(Figure 4). The stark contrast between the presence (KD) or absence (CT) of these
ketogenic branched-chain amino acids (BCAA) was independent of the nature of the
infusate, pointing to a direct link to the diet.
81
Figure 4- Typical 1H-NMR spectra of a liver sample from a KD rat (A) and a CT rat (B).
The peak assignments are as follows: (1) CH3-(CH2)n- (0.87 ppm); (2) leucine + isoleucine
(0.92 ppm); (3) CH3-(CH2)n- (1.26 ppm); (4) alanine + lysine (1.42 ppm); (5) -CH2CH=CH- (1.99 ppm); (6) L-methionine (2.12 ppm); (7) β-HB (2.41 ppm); (8) CH=CHCH2- (2.80 ppm); (9) choline + phosphocholine (3.19 ppm); (10) glycerophosphorylcholine
(3.24 ppm). Fumarate (disodium salt) was used as an external reference to calibrate the
spectra (singlet at 6.5 ppm, outside the window).
6.6. Discussion
This study aimed to compare for the first time the influence of mild, diet-induced
ketosis in rats on brain metabolism of 13C-Glc and 13C--HB. Our main results are that the
KD induced: (i) a metabolic adaptation that seems to facilitate the brain’s use of ketones as
82
oxidative substrates; (ii) an increase in brain GABA (relative to Glu) and (iii) an increase in
liver leucine and isoleucine, the former of which is a potential precursor of GABA.
Brain Glc metabolism
After [1-13C]Glc infusion,
13
C enrichment in Glc C1 was 47.3% and 54.7% in CT
and KD rats, respectively (Table 2). This higher 13C enrichment in brain Glc C1 in ketotic
rodents has been reported elsewhere (Yudkoff et al. 2005a) and could potentially be
explained by higher brain Glc uptake in the KD rats, which would agree with our previous
positron emission tomography studies in which brain
18
F-fluorodeoxyglucose uptake was
significantly higher in KD rats (Roy et al. 2012a, Pifferi et al. 2011). Our current results are
also supported by the increased number of Glc transporters (GLUT1) in brain endothelial
cells of ketotic rats (Puchowicz et al. 2007). Higher 13C enrichment in brain Glc in the KD
group may also be explained by higher
13
C enrichment in blood Glc, which could
potentially deliver more 13C-labeled Glc to the brain. Indeed, in the present study, brain Glc
C1 13C enrichment was proportional to plasma Glc after [1-13C]Glc infusion. Higher plasma
Glc after the KD, as found in the present study, was previously reported (Melo et al. 2006),
and may be related to lower insulinemia in the KD rats. During ketosis, insulinemia is
decreased, which stimulates lipolysis, inhibits lipogenesis and favours ketone over Glc
tissue utilization (Fukao et al. 2004).
After [1-13C]Glc infusion, 13C enrichment in Lac C3 was 15.6% and 20.6 % for CT
and KD rats, respectively (Table 2). From Glc C1 and Lac C3 13C enrichments in the brain,
we estimate that 65.8% of the labeled Lac was derived from [1-13C]Glc in the CT group
(Glc C1 enriched at 47.3% can give rise to a maximum of 23.7% [47.3/2] of enriched Lac
C3), whereas the % of labeled Lac increased to 86.9 in the KD group, indicating that brain
glycolysis was enhanced on the KD. In the present study, rats were euthanized with
focussed microwaves, which is the only technique that prevents post-mortem Lac
production (Sampol et al. 2013). Therefore, Lac reported here (labeled or not) was derived
strictly from pre-mortem brain aerobic glycolysis, a phenomenon which may be
predominant in astrocytes (Pellerin et Magistretti 1994, Pellerin et Magistretti 2012) which
supply Lac as a supplementary fuel for neurons (Bouzier et al. 2000, Wyss et al. 2011).
The increase in aerobic glycolysis that we observed here in the KD group is in agreement
83
with the previous finding that glycolytic enzymes are upregulated in the hippocampus of
rats on a KD (Bough et al. 2006). Glc conversion to Lac was also reported to be increased
during starvation in rats (Hawkins et al. 1971), a situation also leading to ketone
production.
Although the brain uptake of Glc was higher in KD rats (Roy et al. 2012a, Pifferi et
al. 2011), in the present study, CT and KD rats had similar 13C enrichments of Glu C4, Gln
C4, GABA C2 and Asp C3. This implies that the KD may alter brain Glc uptake but
appears to have little or no effect on the capacity of the brain to use Glc as an oxidative
substrate. This distinction between Glc uptake and oxidative metabolism is compatible with
the fact that the entry of Glc into the brain is not the limiting step in its utilisation (Cunnane
et al. 2011, Pardridge 1983). Our results differ somewhat from a study reporting lower 13C
enrichment in Glu in ketotic mice infused with 13C-Glc (Yudkoff et al. 2005a) but animals
in that study had much higher ketonemia (3935 µM compared to 793 µM in the present
study).
In the present study, the 13C enrichment of Gln C2/C3 after [1-13C]Glc infusion was
~1.2, reflecting pyruvate carboxylase (PC; EC 6.4.1.1) activity, which is present only in
astrocytes (Martinez-Hernandez et al. 1977). Astrocytic PC activity is responsible for the
higher
13
C labeling of Gln C2 than C3 when [1-13C]Glc is the substrate. Indeed, the [3-
13
C]oxaloacetate generated from [3-13C]pyruvate through the anaplerotic pathway leads to
the synthesis of -ketoglutarate labeled with 13C on carbon 2 (Figure 2). Therefore, the Gln
synthesized from -ketoglutarate via Glu has higher
carbon 3. In the present study, the
13
13
C enrichment at carbon 2 than
C enrichment of Glu C2/C3 after [1-13C]Glc infusion
was <1, reflecting the absence of PC activity in neurons. After [1-13C]Glc infusion, the 13C
enrichment of Gln C2/C3 was similar in CT and KD rats, indicating no difference in PC
activity linked to the diet. Higher PC activity in rats on a KD was however observed by
Melo et al. (2006), but in that study, the rats were on the KD for 21 days compared to 7
days in the present study. These disparities suggest that care must be taken when comparing
different studies since the ketonemia level, duration and dietary status (fed or fasted) may
influence the adaptive metabolic changes in the brain.
84
Brain -HB metabolism
Compared to CT rats, the KD rats infused with [2,4-13C2]-HB had higher
enrichment in all amino acids measured (Table 2). The highest
13
13
C
C enrichment was in Glu
C4 (29.8 %), a result similar to the 27% reported elsewhere for a similar study design
(Jiang et al. 2011). We interpret these results to mean that -HB was more extensively
oxidized and recovered in other brain metabolites during mild ketosis. Since Glu is in
equilibrium with -ketoglutarate, the incorporation of
13
C into the different carbon
positions of Glu (and Gln thereafter) essentially reflects 13C enrichment in -ketoglutarate,
and thus gives information on TCA cycle activity and oxidative metabolism (Mason et al.
1992). As shown in Figure 5, Glu homonuclear couplings were increased after [2,4-13C2]HB infusion in the KD group compared to the CT group, indicating that the TCA cycle
turning relative measure was higher in KD rats. No such increase was observed after [113
C]Glc infusion (data not shown), indicating once again that brain metabolism in the KD
group used ketones efficiently for oxidative purposes. The ketone-induced increase in TCA
cycle turning relative measure in KD rats involves catabolism of -HB first to acetoacetate
and then to acetyl-CoA. The latter step implicates the conversion of succinyl-CoA into
succinate, which is also a reaction in the TCA cycle and is consistent with higher TCA
cycle turning relative measure in KD rats (Puchowicz et al. 2008). Stimulation of
mitochondrial biogenesis in the brain is also consistent with the higher Glu C4
enrichment noted in KD rats in the present study (Bough et al. 2006, Nylen et al. 2009).
13
C
85
Figure 5- Typical 13C-NMR spectra of whole brain perchloric acid extracts from [2,413
C2]-HB-infused rats fed the control diet (CT; blue) or the ketogenic diet (KD; green).
Higher glutamate (Glu) and glutamine (Gln) homonuclear coupling (multiplet peaks; ↓)
was observed for KD rats, indicating that the tricarboxylic acid cycle turning relative
measure was higher in this group.
After [2,4-13C2]-HB infusion, labeling of Lac C3 was observed (Table 2, Figure 3).
Since [2,4-13C2]-HB leads to [2-13C]acetyl-CoA and not to [3-13C]pyruvate, the
incorporation of
13
C into Lac could be due in part to pyruvate recycling, during which
malate is converted to pyruvate through malate dehydrogenase enzyme (Cerdan et al.
1990). Lac C3 labeling may also be produced from gluconeogenesis in the liver, a process
that may be up-regulated in KD rats since, in mild ketosis (i.e. conditions of low glycemia),
oxaloacetate is preferentially used for gluconeogenesis instead of condensing with acetylCoA (Laffel 1999). Ketone production was reported to be proportional to the rate of
gluconeogenesis (Garber et al. 1974).
86
Comparison of brain Glc and -HB metabolism
Higher
13
C enrichments in brain metabolites in CT rats infused with [1-13C]Glc
compared to [2,4-13C2]-HB indicates that in normal conditions, Glc is the brain’s main
oxidative substrate compared to ketones (Himwich 1951, Cahill 2006). The fact that the
KD increased the TCA cycle turning relative measure in [2,4-13C2]-HB-infused rats but
not in [1-13C]Glc-infused rats may be because the former involved the infusion of ~2.1
mmoles of ketones, which induced much higher ketonemia in [2,4-13C2]-HB-infused rats
(Table 1) and may have transiently amplified the effect of the KD. Indeed, the effect of
[2,4-13C2]-HB infusion and the KD are confounded and this is one limitation in our study.
[1-13C]Glc infusion may have also partly attenuated the ketosis in KD rats.
Asp C3 13C enrichment was 40% higher in KD rats infused with [1-13C]Glc than in
those infused with [2,4-13C2]-HB, supporting the proposal by Yudkoff et al. (2005a) that
ketones reduce Asp production and favor Glu and GABA synthesis. The 13C enrichment of
Glu C4/Gln C4 in our CT rats infused with [1-13C]Glc was 3.63, a result similar to the 3.9
reported in CT rats infused with [1-13C]Glc (Melo et al. 2006). We found that
13
C
enrichment of Glu C4/Gln C4 was lower when [2,4-13C2]-HB was infused compared to [113
C]Glc infusion, an effect also reported elsewhere (Kunnecke et al. 1993). As previously
suggested, this lower ratio suggests that -HB could be more an astrocytic substrate since
Gln is mainly localized in astrocytes (Kunnecke et al. 1993, Yudkoff et al. 2008). However,
an astrocyte-neuron ketone shuttle has been proposed (Guzman et Blazquez 2001) and the
transport of ketones from the astrocyte to the neuron may appear under our conditions.
Ketones have been shown to preserve neuronal synaptic function during glucose
deprivation (Izumi et al. 1998).
Brain GABA content and relationship with liver metabolism
In [2,4-13C2]-HB-infused rats, the ratio of brain GABA/Glu was 16% higher in the
KD group than the CT group (p=0.035), a result supporting the hypothesis that the
anticonvulsant effect of the KD in rodents may be due at least in part to higher brain
GABA, an inhibitor neurotransmitter (Yudkoff et al. 2001b, Yudkoff et al. 2004, Yudkoff
et al. 2008, Erecinska et al. 1996), compared to Glu, an excitatory neurotransmitter. A
87
previous in vitro study showing that ketones inhibit Glu cytotoxicity in primary neurons
also agrees with the present finding (Noh et al. 2006).
We demonstrate for the first time in the liver that a short-term KD increases the
ketogenic BCAA, specifically leucine and isoleucine, a result that was linked exclusively to
the KD and was independent of the type of substrate infused (Figure 4). Leucine is
transaminated by BCAA aminotransferase to produce branched-chain -keto acids, which
can be metabolized to -hydroxy--methylglutaryl-CoA and, subsequently, to acetoacetate.
The increase in hepatic leucine in rats on the KD could potentially arise in part from
competition between increased availability of free fatty acids and BCAA, both of which are
efficient ketogenic substrates (Figure 6).
An increase of plasmatic BCAA in epileptic children submitted to a KD has been
reported near 800 nM, besides of a decrease in insulinemia, and the authors hypothesized
an increased cross of BCAA throughout the blood-brain barrier, which could thus
participate to a better control of seizures (Jirapinyo et al. 2004). We suggest that the hepatic
increase of BCAA in our KD rats is also accompanied by an increase in plasmatic BCAA.
However, we failed to measure this latter by 1H HR-MAS NMR according to a detection
threshold around 200 µM.
The influx of leucine from blood to brain is mediated by a countertransport of Gln
(Yudkoff 1997). Plasma leucine entering the brain can react with -ketoglutarate, the
product of which gives glutamate, and subsequently GABA (Yudkoff 1997, Yudkoff et al.
2004). This has been shown by the administration of
15
N-labeled leucine in KD mice
leading to labeled GABA (Yudkoff et al. 2001a, Bixel et al. 2004, Kanamori et al. 1998).
Therefore we propose that the increase in hepatic BCAA in rats on the KD not only may be
ketogenic but also contributes to raising brain GABA through increased GABA synthesis.
In KD rats, the increase in brain Gln content relative to NAA supports this hypothesis and
may be due to the competition between leucine and Gln as precursor for Glu (Figure 6).
Since leucine increases on the KD, Gln may be less used as a precursor for Glu and may
accumulate. Interestingly, a pilot study highlighted the effectiveness of BCAA as an
adjunct therapy to KD in children with refractory epilepsy (Evangeliou et al. 2009). This
strengthens our hypothesis that the increase of hepatic BCAA consecutive to the KD can
contribute to raise the cerebral level of GABA.
88
Figure 6- Liver and brain metabolic adaptation to a ketogenic diet (KD). A) Under a
control diet, glucose (Glc) is used as the main energy substrate for the brain and GABA is
synthetized from glutamine (Gln), through glutamate (Glu). In the liver, acetyl-CoA (AcCoA) is synthetized from Glc, free fatty acids (FFA) and branched-chain amino acids
(BCAA). B) Under a KD, liver Glc is reduced, whereas FFA are strongly increased. In the
liver, FFA are converted into Ac-CoA which leads to a reduction of Ac-CoA production
from other substrates, among which leucine and isoleucine increase. In the brain, ketones,
produced in the liver from Ac-CoA, become an important energy substrate due to the
decreased Glc supply, and are converted into Ac-CoA that enters brain tricarboxylic acid
(TCA) cycle. Leucine entering the brain from the blood more rapidly than any other amino
acids (Yudkoff et al. 2005b) is used as Glu and GABA precursor, and could be in
competition with Gln, which accumulates. AA: amino acids; -KG: -ketoglutarate; -HB:
-hydroxybutyrate; AcetoAc: acetoacetate; AcetoAc-CoA: acetoacetyl-CoA; -KetoIsoC:
-ketoisocaproic acid.
89
6.7. Conclusions
The present study shows that in the brain, the KD increased glycolysis and Lac
production, brain ketone metabolism and TCA cycle turning relative measure. Therefore,
the present short-term KD protocol stimulates brain oxidative metabolism. Interestingly,
our original approach of integrated metabolism showed that the increase in liver ketogenic
BCAA could participate to the increase in brain GABA relative content. This global result
may help explain how the KD reduces seizures in intractable epilepsy. Further in vivo NMR
spectroscopy experiments in rodent models of epilepsia and epileptic patients are required
to confirm this hypothesis.
Acknowledgements
This study was financially supported by the Fonds de recherche du Québec-Santé,
Canadian Institutes of Health Research, Canadian Foundation for Innovation, Canada
Research Chairs Secretariat and Université de Sherbrooke Research Chair (SCC), CFQCU
program of the FQRNT, INAF and the FRQS Research Center on Aging, Université de
Sherbrooke. Anne-Karine Bouzier-Sore is supported by a public grant from the French
“Agence Nationale de la Recherche” within the context of the Investments for the Future
Program, referenced ANR-10-LABX-57 and named TRAIL. The authors thank Dr. JeanLouis Gallis, Mélanie Fortier, Gérard Raffard, Eric Bezançon and Stéphane Sanchez for
generous support and technical assistance.
Disclosure Statement
The authors declare no conflicts of interest.
90
7. ARTICLE 3
Long-term calorie restriction has minimal impact on brain metabolite and fatty acid
profiles in aged rats on a Western-style diet.
Auteurs de l’article: Roy M, Hennebelle M, St-Pierre V, Courchesne-Loyer A, Fortier M,
Bouzier-Sore AK, Gallis JL, Beauvieux MC, Cunnane SC.
Statut de l’article: publié dans Neurochemistry International, 63(5), 450-457, 22 août
2013.
Avant-propos: Mes contributions dans la réalisation de la publication ont été les suivantes:
le prélèvement des tissus et du sang; les dosages plasmatiques; l’isolation des différentes
structures du cerveau; les Western Blots; l’encadrement d’une stagiaire ayant participé aux
dosages plasmatiques et aux Western Blots; les acquisitions de spectroscopie RMN 1H
(réalisées au CHU de Bordeaux); l’analyse des spectres 1H; la préparation du manuscrit et
des figures; la soumission de l’article et les échanges avec l’éditeur et les reviewers.
91
7.1. Résumé
Les effets neuroprotecteurs de la restriction calorique ont été démontrés dans
plusieurs modèles animaux. Cependant, très peu d’études ont évalué le métabolisme
cérébral et l’utilisation des substrats énergétiques du cerveau chez des animaux soumis à
une restriction calorique. L’effet d’une restriction calorique à long terme sur les
métabolites, les profils d’acides gras et l’expression des transporteurs des substrats
énergétiques a été évalué dans le cerveau de rats âgés. Trois groupes de rats SpragueDawley mâles ont été étudiés: (i) 2 mois nourri ad libitum (groupe 2AL), (ii) 19 mois nourri
ad libitum (groupe 19AL) et (iii) 19 mois soumis à une restriction calorique de 40% à partir
de l’âge de 7.5 mois jusqu’à 19 mois (groupe 19RC). La diète était à haute teneur en
sucrose et faible en acides gras polyinsaturés (AGPI) n-3, dans le but de mimer une diète de
type occidental. La spectroscopie RMN 1H a révélé une augmentation des métabolites du
cortex cérébral chez les rats âgés comparativement aux rats 2AL. Les différences les plus
importantes étaient pour le myo-inositol (+251% et +181%), le lactate (+203% et +188%),
le -HB (+176% et +618%) et la choline (+148% et +120%), chez les rats 19AL et 19RC
respectivement. Cependant, aucune différence des métabolites cérébraux n’a été observée
entre les groupes 19AL et 19RC. Les profils d’acides gras du cortex ont révélé que les
AGPI n-3 étaient 35-47% plus bas et que les acides gras monoinsaturés étaient 40-52% plus
élevés chez les rats 19AL et 19RC comparativement aux rats 2AL. Le transporteur du
glucose dans les microvaisseaux du cerveau (GLUT1) était 68% plus élevé chez les rats
19AL comparativement aux rats 2AL, alors que le transporteur des acides
monocarboxyliques, MCT1, était 61% plus bas chez les rats 19RC comparativement aux
rats 19AL. Nous concluons que sous une diète à haute teneur en sucrose et faible en AGPI
n-3, le cerveau des rats 19AL avait des niveaux plus élevés de métabolites et de GLUT1
comparativement aux rats 2AL. La restriction calorique à long terme chez les rats âgés n’a
pas modifié le profil des métabolites et des acides gras du cerveau, mais a entraîné une
expression plus faible de MCT1 dans les microvaisseaux.
92
7.2. Abstract
The effect of long-term calorie restriction (CR) on metabolites, fatty acid profiles
and energy substrate transporter expression in the brain was assessed in aged rats. Three
groups of male Sprague-Dawley rats were studied: (i) a 2 month old ad libitum-fed (2AL
group), (ii) a 19 month old ad libitum-fed (19AL group), and (iii) a 19 month old group
subjected to 40% CR from the age of 7.5 to 19 months (19CR group). The diet contained
high sucrose and low n-3 polyunsaturated fatty acids (PUFA) so as to imitate a Westernstyle diet. High resolution magic angle spinning-1H-NMR showed an effect of aging on
brain cortex metabolites compared to 2AL rats, the largest differences being for myoinositol (+251% and +181%), lactate (+203% and +188%), -hydroxybutyrate (+176% and
+618%) and choline (+148% and +120%), in 19AL and 19 CR rats, respectively. However,
brain metabolites did not differ between the 19AL and 19CR groups. Cortex fatty acid
profiles showed that n-3 PUFA were 35-47% lower but monounsaturated fatty acids were
40-52% higher in 19AL and 19CR rats compared to 2AL rats. Brain microvessel glucose
transporter (GLUT1) was 68% higher in 19AL rats than in 2AL rats, while the
monocarboxylate transporter, MCT1, was 61% lower in 19CR rats compared to 19AL rats.
We conclude that on a high-sucrose, low n-3 PUFA diet, the brain of aged AL rats had
higher metabolites and microvessel GLUT1 expression compared to 2AL rats. However,
long-term CR in aged rats did not markedly change brain metabolite or fatty acid profile,
but did reduce brain microvessel MCT1 expression.
Key words: Calorie restriction; aged rat; cortex; HRMAS 1H-NMR; brain fatty acid
Abbreviations: CR: calorie restriction ; AL: ad libitum ; NMR: nuclear magnetic resonance;
HRMAS: high resolution magic angle spinning; -HB: -hydroxybutyrate; Lac: lactate;
Ala: alanine; GABA: -aminobutyric acid; NAA: N-acetylaspartate; Glu: glutamate; Gln:
glutamine; Asp: aspartate; Cr: total creatine; Cho: choline; GPC: glycerophosphocholine;
Tau: taurine; MIns: myo-inositol; SFA: saturated fatty acids; MUFA: monounsaturated
fatty acids; PUFA: polyunsaturated fatty acids; GLUT: glucose transporter; MCT:
monocarboxylic acid transporter
93
7.3. Introduction
For nearly 80 years now, calorie restriction (CR) has been reported to extend
lifespan of rodents by up to 50% (McCay et al. 1989, Yu et al. 1982). CR tends to induce
several favorable metabolic changes, including improved insulin sensitivity (Lane et al.
1999, Dhahbi et al. 2001, Barzilai et al. 1998) and up-regulation of liver gluconeogenesis,
fatty acid -oxidation and ketogenesis (Koubova et Guarente 2003). In the brain, CR has
been widely reported to be neuroprotective. It reduces seizure susceptibility in a mouse
model of epilepsy (Greene et al. 2001, Mantis et al. 2004), improves locomotor function in
a primate model of Parkinson’s disease (Maswood et al. 2004) and improves learning and
memory in aged rodents (Ingram et al. 1987, Stewart et al. 1989). CR also has neurogenic
effects by up-regulating brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 (Park et Lee
2011).
CR may also extend longevity through changes in membrane fatty acid composition
(Yu 2005, Pamplona et al. 1998, Hulbert 2005) as reported for the heart (Pamplona et al.
2002, Cefalu et al. 2000), liver (Faulks et al. 2006) and brain (Tacconi et al. 1991,
Williams et Rapoport 1993). CR-induced changes in membrane fatty acid composition
appear to make membranes more resistant to peroxidative damage (Faulks et al. 2006,
Laganiere et Yu 1987). Indeed, peroxidation-resistant monounsaturated fatty acids (MUFA)
are increased in membrane phospholipids of the liver, heart and brain of calorie-restricted
animals (Faulks et al. 2006).
Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy enables the identification of an
extensive range of chemical constituents of tissues. In the brain, these constituents include
those associated with energy metabolism (glucose, lactate and amino acids) and
neurotransmission (glutamine, glutamate, -aminobutyric acid). NMR spectroscopy has
been previously used to study changes in brain metabolites during aging in rodents (KatzBrull et al. 2002), humans (Boumezbeur et al. 2010, Haga et al. 2009, Saunders et al. 1999)
and age-related diseases affecting the brain including Alzheimer’s disease (Esteras et al.
2012, Dedeoglu et al. 2004, Kantarci et al. 2000, Huang et al. 2001). High resolution magic
angle spinning (HRMAS)-NMR spectroscopy provides highly resolved spectra of
metabolite profiles on samples of intact tissue without preparative extraction procedures
(Ratai et al. 2005). HRMAS-NMR spectroscopy has been previously used to study brain
94
anomalies (Ghenimi et al. 2009) and age-related changes in rats (Paban et al. 2010, Zhang
et al. 2009b). However, to our knowledge, it has not yet been used to investigate the effect
of CR on brain metabolites in aged rodents. The present study aimed to evaluate in the
brain of aged rats the influence of a long-term CR on the profile of energy substrates,
glucose and monocarboxylic acid transporters, and major molecules associated with
neurotransmission and long chain fatty acids. The hypothesis was that brain metabolite and
fatty acid profiles in aged calorie-restricted rats would be more similar to those of young
rats, compared to aged rats fed ad libitum. A high-sucrose, low n-3 polyunsaturated fatty
acid (PUFA) diet was used to imitate a Western-style diet (Basciano et al. 2005,
Simopoulos 2006, Simopoulos 1991).
7.4. Material and methods
Animals
Male Sprague-Dawley rats were obtained at ~4 weeks of age (Charles River, StConstant, Qc, Canada), and housed in the Université de Montréal animal care facility.
Three groups were studied: (i) 2 month old ad libitum fed (2AL group; n=8), (ii) 19 month
old ad libitum fed (19AL group; n=5), and (iii) 19 month old subjected to a 40% CR from
the age of 7.5 to 19 months (19CR group; n=8). At 7.5 months old, the rats were
randomized into two groups (19AL and 19CR) and housed in individual cages. 2AL and
19AL rats were given Teklad 04088 diet, and 7.5 months old CR rats were started on
Teklad fortified 04089 diet (Harlan Laboratories, Madison, WI, USA; Table 1). Both diets
had an energy density of 3.8 kcal/g and contained 20.1 % protein, 60.9% carbohydrate and
6.0 % fat. Both diets contained 50% sucrose and an n-6:n-3 PUFA ratio of 57:1, modeled
on the Western-style diet. Higher mineral and vitamin concentration in Teklad diet 04089
ensured that the 19CR group received equivalent and sufficient daily intake of minerals and
vitamins as the other two groups (Faulks et al. 2006). CR was introduced gradually: a 20%
reduction for the first 2 weeks and 40% reduction thereafter. The mean food allotted daily
to each CR rat was 22.3 g/day/kg or 84.7 kcal/day/kg and was calculated according to their
non-restricted food intake at 7.5 months of age. The experimental protocol was approved
by the Centre de Recherche du Centre Hospitalier Universitaire de Montréal Animal Care
95
Committee and all handling of animals was conducted in accordance with Canadian
Council on Animal Care Guidelines.
Table 1: Composition of the diets.
Nutrients
AL (04088)
CR (04089)
Casein, «Vitamin-Free» Test
DL-Methionine
Sucrose
Corn Starch
Corn Oil
16:0
18:0
18:1
18:2
18:3
n-6:n-3 PUFA ratio
Cellulose
Mineral Mix, Ca-P Deficient
Calcium Phosphate, dibasic
Calcium Carbonate
Choline Bitartrate
Thiamin HCl
Riboflavin
Pyridoxine HCl
Niacin
Calcium Pantothenate
Folic acid
Biotin
Vitamin B12
Vitamin A Palmitate
Vitamin E, DL- tocopheryl acetate
Vitamin D3, cholecalciferol
Vitamin K1, phylloquinone
220.0
3.0
499.1428
122.0
58.5
7.1
1.3
16.1
33.3
0.6
57.0
59.0
13.37
14.8
6.5
2.0
0.006
0.006
0.0070
0.03
0.0160
0.0020
0.0002
0.0100
0.0080
0.1000
0.0020
1.5
220.0
3.0
499.1428
122.0
57.5
7.0
1.3
15.8
32.8
0.6
57.0
34.4
22.28
24.7
10.8
3.3
0.010
0.010
0.0117
0.05
0.0267
0.0034
0.0004
0.0167
0.0134
0.1667
0.0034
2.5
Values are given as g/Kg and were provided by Harlan Laboratories. Diet 04088 was given
to 2AL and 19AL rats, and diet 04089 was given to 19CR rats from the age of 7.5 months.
Caloric energy was 3.8 kcal/g for both diets. Diet 04089 was designed for a 40% calorie
restriction (CR). The daily food allotted to each CR rat was calculated according to their
non-restricted food intake at 7.5 months of age. PUFA: polyunsaturated fatty acids.
Blood analysis
Prior to sacrifice, all rats were fasted for 16 h to reduce interindividual variation in
glycaemia. Before euthanasia, animals were anesthetized using isoflurane (5% induction,
2.5% for maintenance) and 5 ml of blood was collected by cardiac puncture using a
96
heparinized syringe. Blood samples were kept on ice and then centrifuged (6000 rpm; 5
min; 4°C) to collect plasma. Plasma samples were kept at -80°C until analyzed using a
clinical chemistry analyzer (Dimension Xpand Plus, Siemens Healthcare Diagnosis Inc,
Deerfield, IL, USA) with kits for glucose (DF40), lactate (DF16), total cholesterol (DF27),
triglycerides (DF69A) and free fatty acids (NEFA-HR2, Wako Ltd, Richmond, VA, USA).
Insulin levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (80-INSRTU-E01,
Alpco, Salem, NH, USA).
Brain metabolites and HRMAS-1H-NMR spectroscopy
After euthanasia, the whole brain was rapidly removed, plunged in liquid nitrogen
and kept at -80°C. HRMAS-1H-NMR spectroscopy was performed on ~20 mg of right
frontal cortex using a 11.7 Tesla spectrometer (DPX 500 MHz, Bruker Biospin,
Wissembourg, France). Brain samples were placed directly in a 50 µl insert (Bruker
Biospin) and 20 µl of 50 mM disodium fumarate (Na2C4H2O4) in D2O was added as an
external standard. Spectra were acquired with a Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) pulse
sequence in order to suppress the signal from macromolecules and lipids (size: 32 K;
number of scans: 32; interpulse delay of the 180° pulses: 1 ms; total echo time: 11.3 s;
relaxation time: 11.2 s; total acquisition time: 7 min, 47 s). The water signal was
suppressed by homonuclear presaturation. Temperature was maintained at 277 K and
samples were rotated at 5 kHz throughout the acquisition.
Peaks for the following brain constituents were of interest (resonance frequency
expressed in parts per million [ppm]): -hydroxybutyrate (-HB; 1.16 ppm); lactate (Lac;
1.29 ppm); alanine (Ala; 1.43 ppm), N-acetylaspartate (NAA; 1.97 ppm), -aminobutyric
acid (GABA; 2.28 ppm), glutamate (Glu; 2.33 ppm), glutamine (Gln; 2.40 ppm), aspartate
(Asp; 2.78 ppm), total creatine (Cr; 2.98 ppm), choline (Cho; 3.15 ppm),
glycerophosphocholine (GPC; 3.18 ppm), taurine (Tau; 3.37 ppm) and myo-inositol (MIns;
4.00 ppm). NMR spectroscopy results were classically expressed as a ratio to creatine,
since the latter is thought to remain steady across brain regions and individuals (Pouwels et
Frahm 1998, Saunders et al. 1999). However, significantly higher brain creatine
concentration has been reported in aged rats (Paban et al. 2010) and in the healthy elderly
(Haga et al. 2009, Schuff et al. 2001, Chang et al. 1996). Disodium fumarate was therefore
97
chosen as an external standard because its resonance peak is at 6.50 ppm in the spectrum
where there are peaks for no other metabolites. This symmetric molecule also allows a
highly resolved signal using low concentrations. Peaks were integrated using GSim
software
(open
source:
http://sourceforge.net/projects/gsim/files/latest/download).
Metabolite peak integrals were therefore normalized to the disodium fumarate peak integral
(6.50 ppm) and not to creatine. Data were corrected by tissue sample weight.
Brain fatty acid profile
Total lipids were extracted from left cerebral cortex homogenates by a modification
of the Folch method (Folch et al. 1957): total lipids were extracted using
chloroform/methanol (2:1 vol/vol) containing butylated hydroxytoluene (0.02% wt/vol) and
then saponified with 1 M methanolic KOH. Fatty acids were transmethylated with 14%
boron trifluoride in methanol at 90°C for 30 min. Fatty acid methyl esters were analyzed by
capillary gas chromatography (Agilent model 6890 GC, Palo Alto, CA, USA). Individual
fatty acids were identified by comparing their retention times with those of standards
(GLC-68A, GLC-411 and GLC-455 from NuChek Prep Inc., Minnesota, USA and a
customized mixture of saturated fatty acids). Fatty acid composition was expressed as
percentage of total fatty acids (Freemantle et al. 2009).
Energy substrate transporter expression
Tissues preparation
Cortex was dissected from the left hemisphere on ice, homogenized in phosphatebuffered saline (PBS) and centrifuged for 10 min at 2500 rpm. The pellet was resuspended
in radio-immunoprecipitation assay (RIPA) buffer containing antiproteases and stored at 80°C prior to analysis. Brain microvessels were extracted from the right hemisphere as
previously described (Pifferi et al. 2005a). Briefly, a homogenate of cortex was separated
by centrifugation at 4500 rpm for 15 min in 17.5% dextran solution (Sigma-Aldrich) to
isolate microvessels. The microvessels were resuspended in RIPA buffer containing
antiproteases and stored at -80°C prior to analysis.
98
Western blots
Glucose transporter (GLUT1 and 3) and monocarboxylic acid transporter (MCT1
and 2) expression were measured as previously described (Pifferi et al. 2011) with the
following modifications: 25 g of brain protein were migrated on a SDS-polyacrylamide
gel electrophoresis and transferred on a polyvinylidene fluoride membrane during 2 h.
Membranes were then probed with the following antibodies: anti-GLUT1 (1/3000;
ab15309, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-GLUT3 (1/500; ab15311, Abcam), antiMCT1 (1/1500; AB3540P, Millipore, Billerica, MA, USA), anti-MCT2 (1/6000; AB3542,
Millipore) and anti--actin (1/10 000; MAB1501R, Millipore). Membranes were incubated
either with anti-rabbit (1/10 000; 111-035-045, Jackson ImmunoResearch, Baltimore Pike,
PA, USA) or anti-mouse (1/10 000; 115-035-062, Jackson ImmunoResearch) antibodies.
Immunological complexes were revealed by chemiluminescence using ECL Plus Western
blotting detection system (RNP2132, GE Healthcare, Baie d’Urfé, QC, Canada). GLUT
and MCT expression was normalized using -actin densitometry for each membrane.
Statistical analysis
Statistical analyses were performed using Prism 6 (GraphPad, La Jolla, CA, USA).
The three groups were compared using analysis of variance by ranks (Kruskal-Wallis test
followed by Dunn’s test). The comparison between 19AL and 19CR growth curves was
made using the Mann-Whitney test. The correlation of brain PUFA to brain MUFA was
established by Spearman’s test. Two-tailed test at p<0.05 was considered statistically
significant.
7.5. Results
Body weight and plasma metabolites
19AL rats gained weight steadily throughout the study period, while 19CR rats lost
27% of their body weight between 7.5 and 19 months of age (Figure 1). At 19 months old,
19AL rats were 88% heavier than the 19CR rats (p=0.004).
99
Fig. 1. Growth curves of rats fed ad libitum (19AL) or subjected to a 40% calorie
restriction (19CR). CR was started at 7.5 months of age and introduced gradually: a 20%
reduction for the first 2 weeks and 40% thereafter. Values are mean±SEM.
Compared to 2AL rats, 19AL rats at 19 months had 229% higher body weight (335±28 vs
1102±79 g) and 110% higher fasting plasma cholesterol (Table 2). Compared to 2AL rats,
19CR rats had 77% higher body weight, 60% higher plasma glucose and 43% lower plasma
free fatty acids. There was no statistical difference between the values for plasma
metabolites in the 19AL and 19CR rats. Plasma insulin, lactate and triglycerides were not
statistically different between the three groups.
100
Table 2: Plasma metabolites in 2 month old ad libitum fed (2AL), 19 month old ad libitum
fed (19AL) and 19 month old rats subjected to a 40% calorie restriction (19CR)d.
2AL (n=8)
19AL (n=5)
19CR (n=8)
Glucose (mM)
7.8 (1.2)
10.5 (2.9)
12.5 (2.9)b
Insulin (U/ml)
6.7 (3.3)
28.8 (38.8)
38.1 (41.8)
Lactate (mM)
2.3 (0.2)
2.5 (0.6)
2.8 (1.0)
Free fatty acids (mM)
1.4 (0.7)
0.8 (0.1)
0.8 (0.3)c
Triglycerides (mM)
1.2 (0.3)
2.5 (1.1)
1.5 (0.8)
Total Cholesterol (mM)
2.1 (0.5)
4.4 (0.8)a
3.4 (1.5)
Values are expressed as mean (standard deviation).
a
Significant difference between 2AL and 19AL rats (++p<0.01).
b
Significant difference between 2AL and 19CR rats (*p<0.05).
c
Significant difference between 2AL and 19CR rats (**p<0.01).
d
All rats were fasted for 16 h prior to blood sampling.
Brain cortex metabolites detected by HRMAS-1H-NMR spectroscopy
A typical HRMAS-1H-NMR spectrum of frontal cortex from a 2AL rat is shown in
Figure 2A. Relative to the external standard, disodium fumarate, most brain metabolites
were significantly higher in 19AL rats compared to 2AL rats: -HB (+176%), Lac
(+203%), GABA (+136%), NAA (+103%), Glu (+97%), Gln (+119%), Asp (+80%), Cr
(+87%), Cho (+148%), GPC (+145%) and MIns (+251%; Figure 2B). Generally, 19CR rats
also had higher content of brain metabolites compared to 2AL rats: -HB (+618%), Lac
(+188%), GABA (+85%), NAA (+55%), Glu (+68%), Gln (+94%), Asp (+50%), Cr
(+64%), Cho (+120%), GPC (+94%) and MIns (+181%). -HB, NAA, GPC and MIns were
not significantly different between 19CR and 19AL rats. Ala, Tau and GPC/Cho were not
statistically different between the three groups (data not shown).
101
1
Fig. 2. A) A typical HRMAS- H-NMR spectrum of a frontal cortex biopsy from a 2AL rat.
1: -hydroxybutyrate (-HB; 1.16 ppm), 2: lactate (Lac; 1.29 ppm), 3: alanine (Ala; 1.43
ppm), 4: N-acetylaspartate (NAA; 1.97 ppm), 5: -aminobutyric acid (GABA; 2.28 ppm),
6: glutamate (Glu; 2.33 ppm), 7: glutamine (Gln; 2.40 ppm), 8: aspartate (Asp; 2.78 ppm),
9: total creatine (Cr; 2.98 ppm), 10: choline (Cho; 3.15 ppm), 11: glycerophosphocholine
(GPC; 3.18 ppm), 12: taurine (Tau; 3.37 ppm), 13: myo-inositol (MIns; 4.00 ppm). B)
Metabolites in frontal cortex relative to the external standard (50 mM disodium fumarate).
Metabolites are ordered according to their chemical shift in ppm. Numbers under
metabolite abbreviations correspond to their position in the spectrum (Figure 2A). Values
are mean±SEM (*p<0.05;**p<0.01).
102
Brain cortex fatty acid profile
The sum of saturated fatty acids (SFA; palmitic and stearic acids) in the cortex was
not different between the three groups (Table 3). Compared to 2AL rats, 19AL rats had
higher 18:1 n-7 and 20:1 n-9 (p<0.05) and 22% lower total n-6 PUFA (p<0.05). Compared
to the 2AL group, 19CR rats had 52% higher total MUFA (p<0.001) and 23% lower total
n-6 PUFA (p<0.05), with significant differences in 18:2 n-6 and 20:3 n-6 (p<0.05). The
sum of n-3 PUFA was also 47% lower in the 19CR group than in the 2AL group (p<0.001),
with significant differences in 20:5 n-3, 22:5 n-3 and 22:6 n-3. Compared to 19AL rats, the
only significant difference in 19CR rats was lower 22:5 n-3 (p<0.001).
Table 3: Fatty acid profile of cortex total lipids in 2 month old ad libitum fed (2AL), 19
month old ad libitum fed (19AL) and 19 month old rats subjected to a 40% calorie
restriction (19CR).
16:0
18:0
∑ SFA
16:1 n-7
18:1 n-9
18:1 n-7
20:1 n-9
∑ MUFA
18:2 n-6
20:3 n-6
20:4 n-6
∑ n-6 PUFA
18:3 n-3
20:5 n-3
22:5 n-3
22:6 n-3
∑ n-3 PUFA
2AL (n=8)
19AL (n=5)
19CR (n=7)
22.6 (1.4)
21.0 (1.2)
43.8 (1.6)
0.5 (0.0)
17.4 (1.3)
3.7 (0.3)
0.9 (0.1)
22.6 (1.6)
1.2 (0.2)
3.7 (4.7)
12.8 (1.3)
17.7 (3.5)
0.0 (0.0)
0.1 (0.0)
0.2 (0.0)
15.6 (1.7)
15.9 (1.7)
23.2 (0.9)
21.1 (1.1)
44.5 (0.5)
0.7 (0.0)
24.3 (0.5)
4.3 (0.2)a
2.2 (0.1)a
31.6 (0.5)
1.0 (0.1)
0.4 (0.2)
12.3 (0.3)
13.7 (0.2)b
0.1 (0.1)
0.0 (0.0)b
0.5 (0.1)
9.7 (0.3)
10.3 (0.3)
23.6 (0.6)
19.7 (0.9)
43.5 (1.0)
1.4 (0.7)e
26.1 (1.3)e
4.5 (0.2)d
2.3 (0.3)d
34.3 (1.3)e
0.9 (0.1)c
0.3 (0.1)c
12.6 (0.8)
13.8 (0.8)c
0.0 (0.0)
0.0 (0.0)e
0.1 (0.1)c,f
8.3 (1.1)e
8.4 (1.1)e
Values are expressed as mean (standard deviation). Units are percentage of total fatty acids.
Fatty acids are identified by number of carbons: number of double bonds, followed by
position of most terminal double bonds. SFA: saturated fatty acids; MUFA:
monounsaturated fatty acids; PUFA: polyunsaturated fatty acids.
a
Significant difference between 2AL and 19AL rats (+p<0.05).
b
Significant difference between 2AL and 19AL rats (++p<0.01).
c
Significant difference between 2AL and 19CR rats (*p<0.05).
d
Significant difference between 2AL and 19CR rats (**p<0.01).
e
Significant difference between 2AL and 19CR rats (***p<0.001).
f
Significant difference between 19AL and 19CR rats ($$$p<0.001).
103
The sum of MUFA was negatively correlated with the sum of total PUFA (n-6 and
n-3) across all three groups (r = -0.91; p<0.0001; Figure 3). The negative correlation with
brain MUFA was also significant for n-6 PUFA (r = -0.71; p=0.0005) and n-3 PUFA (r = 0.90; p<0.0001) when compared separately.
Fig. 3. Significant inverse correlation between the sum of monounsaturated fatty acids
(MUFA) and the sum of total polyunsaturated fatty acids (PUFA; n-6 and n-3) across all
three groups [2 months fed ad libitum (2AL), 19 months fed ad libitum (19AL) and 19
months subjected to a 40% calorie restriction (19CR)] in cortex total lipids (r= - 0.91;
p<0.0001). Units are percentage of total fatty acids.
Energy substrate transporter expression
Compared to the 2AL group, the 19AL group had 68% higher relative expression of
GLUT1 in brain microvessels (p<0.05; Figure 4). There was no significant difference in
brain microvessel GLUT1 expression between 19AL and 19CR rats. MCT1 expression in
brain microvessels was 61% lower in 19CR rats compared to 19AL rats (p<0.05). GLUT3
and MCT2 expression in brain cortex did not differ significantly between the three groups.
104
Fig. 4. Expression of glucose (GLUT) and monocarboxylate transporters (MCT) in brain
microvessels and whole cortex determined by western immunoblot and normalized to actin. Values are mean±SEM (*p<0.05).
7.6. Discussion
This study aimed to evaluate the influence of long-term CR on metabolites, fatty
acid profile and energy substrate transporter expression in the brain of aged rats on a highsucrose, low n-3 PUFA diet. There are three main findings: (i) 19AL rats had higher brain
cortex metabolites, including energy substrates and neurotransmitters, and higher brain
microvessel GLUT1 expression compared to 2AL rats. (ii) CR did not markedly change
brain cortex metabolites or fatty acids compared to the age-matched 19AL rats. (iii) Brain
microvessel MCT1 expression was lower in 19CR rats compared to 19AL rats.
Body weight and plasma metabolites
The lower body weight in 19CR rats compared to 19AL rats (Figure 1), agrees with
the CR phenotype generally reported (Faulks et al. 2006, Ando et al. 2002, Tacconi et al.
1991). However, CR did not affect plasma glucose or insulin (Table 2), which contrasts
with improved insulin sensitivity in CR reported elsewhere (Lane et al. 1995, Bodkin et al.
1995, Reaven et al. 1983). Our high-sucrose diet may explain these results. Indeed, a
chronic high-fructose diet leads to an excess of body fat and hepatic and extrahepatic
insulin resistance in rats (Tappy et al. 2010). Moreover, our 19AL rats were much heavier
than typically observed in 19 month male Sprague-Dawley rats (~650 g; Charles River
technical data). Therefore, our high-sucrose diet may have prevented the lower plasma
105
glucose and insulin normally induced by CR. Elevated plasma glucose in aged AL and CR
rats has also been reported in a study using a 50% sucrose diet (Bedard et al. 2010).
Brain cortex metabolites
To the best of our knowledge, this is the first report of brain metabolites measured
by NMR spectroscopy in aged CR rodents. The higher content of brain metabolites in both
our groups of aged rats (19AL and 19CR) compared to young rats may be linked to several
phenomena: (i) Increased brain density with age, as previously proposed by Chang et al.
(1996), since their aged group had higher Cho, MIns, Cr concentrations and lower water
content. (ii) Several mitochondrial enzymes, notably those of the Krebs cycle, and
respiratory electron transport chain, are reduced in the aged rodent brain (Navarro et al.
2002, Zhou et al. 2009, Yao et al. 2010). Therefore, a global reduction in brain enzymes
may occur in aged rats and lead to increased brain metabolites as a consequence of slower
metabolite degradation. (iii) Brain
18
F-fluorodeoxyglucose uptake is higher in the
hippocampus of aged rats (Roy et al. 2012b), which could also potentially be associated
with higher metabolite concentrations.
Ketones (-HB and acetoacetate) synthetized from fatty acids in the liver are the
principle alternative brain energy substrate to glucose (Cunnane et al. 2011). Similar to
fasting or starvation (Cahill 2006, Owen et al. 1967), brain energy metabolism during CR
depends more on ketones to compensate for the glucose deficit (Koubova et Guarente 2003,
Shetty et al. 2011). Ketones also have protective effects on brain function in several agerelated pathologies (Page et al. 2009, Krikorian et al. 2012, Reger et al. 2004, Maalouf et
al. 2009). In the present study, brain -HB was 160% higher in 19CR rats compared to
19AL rats, although the difference was not statistically significant.
Lac produced in astrocytes has been proposed to be an important oxidative substrate
during neuronal activation (Pellerin et Magistretti 1994). Indeed, Lac may be the neuron’s
preferred energy substrate over glucose (Bouzier-Sore et al. 2006). Higher Lac in both aged
groups (19AL and 19CR) could potentially indicate altered glycolysis due to impaired
mitochondrial metabolism in aged rats (Yao et al. 2010, Navarro et al. 2002).
Many studies report significantly higher brain Cr in the healthy elderly (Haga et al.
2009, Schuff et al. 2001, Chang et al. 1996). Our results agree with Paban et al. (2010) who
106
also observed higher Cr content in the frontal cortex of 18 month old rats. Cho is an
important membrane constituent, mainly in the form of phosphatidylcholine. It is also the
precursor of the neurotransmitter, acetylcholine. As we observed in our aged rats, higher
brain Cho has been found in Alzheimer’s disease and healthy aging, potentially reflecting
higher membrane and/or phospholipid turnover during aging (Chang et al. 1996, Haga et
al. 2009). A decrease in choline acetyltransferase activity was reported in the brain of aged
rats, which was not restored by CR and agrees with our present results (Monti et al. 2004).
The neuronal marker, NAA, is commonly lower during pathological conditions
involving neuronal loss and brain atrophy such as Alzheimer’s disease (Kantarci et al.
2000). However, it is still unclear as to whether brain NAA is lower (Boumezbeur et al.
2010) or unchanged (Saunders et al. 1999) in healthy elderly humans. In the present study,
NAA was higher in 19AL and 19CR rats, which broadly agrees with our previous
observation that 21 month old rats do not display whole brain atrophy (Roy et al. 2012b).
Higher brain cortex NAA was also reported in the early phase of vitamin A deficiency,
which induces an anatomic and metabolic brain profile similar to that observed in
neurodegenerative disorders (Beauvieux et al. 2009). MIns in the brain is mostly found in
astrocytes and is a common marker of gliosis, which occurs in many age-related
neurodegenerative diseases. Our results agree with Paban et al. (2010) who reported higher
MIns content in the frontal cortex of aged rats. Human studies also show higher MIns in the
healthy elderly (Chang et al. 1996, Boumezbeur et al. 2010).
Gln is mostly found in astrocytes and is the precursor of Glu. Gln and Glu are
coupled through the Glu-Gln cycle, which could explain the same pattern that we observed
for these two metabolites. Higher Gln and Glu were observed in our 19AL and 19CR rats
compared to 2AL rats. A high concentration of brain Gln and Glu can be associated with
liver pathologies such as hepatic encephalopathy (Kreis et al. 1991, Ross 1991). Indeed,
compared to 2AL rats, 19AL rats had higher triglycerides in the liver (data not shown),
suggesting a degree of hepatic steatosis with aging.
Brain cortex fatty acid profile
Lipids account for about half the dry matter of the brain where they are mainly
localized to cell membranes. In the present study, the fatty acid profile of brain total lipids
107
was analyzed, which is broadly equivalent to that of phospholipids, since brain fatty acids
are almost exclusively present as phospholipids (Sastry 1985). The sum of MUFA did not
differ between 19AL and 19CR rats (Table 3), but was 52% higher in the 19CR group than
in the 2AL group, an effect also reported elsewhere after only one month of CR in young
mice (Faulks et al. 2006). Higher MUFA and the inverse relation between brain MUFA and
PUFA (Figure 3) during CR would in principle reduce the risk of lipid peroxidation
because MUFA are more resistant to peroxidation than PUFA (Hulbert 2005). The sum of
n-6 PUFA was significantly lower in our 19AL and 19CR rats than in the 2AL rats, which
agrees with a previous report showing a higher MUFA/PUFA ratio in the cortex of 32
month old rats, an effect accentuated by CR (Tacconi et al. 1991).
Energy substrate transporter expression
In the present study, significant differences of brain microvessel GLUT and MCT,
were observed in endothelial cells of the blood-brain barrier. Glucose is transported through
the blood-brain barrier via the 55-kDa isoform of GLUT1 and then enters neurons via
GLUT3. Brain microvessel GLUT1 expression was higher in 19AL rats compared to 2AL
rats (Figure 4), which contrasts with Mooradian et al. (1991) who reported unchanged
GLUT expression in cerebral microvessels of 24 month old rats. Our high-sucrose diet may
contribute to these differences. Indeed, a high-energy diet or a diabetes increases GLUT1
gene and protein expression in the brain, heart, kidney and testicles in rats (Zhang et al.
2009a, Rato et al. 2013, Sokolovska et al. 2011).
This is the first report on brain MCT expression in aged rats. MCT transport
monocarboxylic acids such as ketones, lactate and pyruvate. Endothelial cells of brain
microvessels express mainly MCT1, while neuronal cells express MCT2 (Simpson et al.
2007). Higher brain MCT expression was expected in 19CR rats since CR restricts glucose
supply generally, so ketones in addition to glucose are consumed by the brain.
Nevertheless, MCT1 microvessel expression was lower in our 19CR rats compared to
19AL rats, an effect for which we presently have no clear explanation. Cortex GLUT3 and
MCT2 expression was unchanged in our 19AL and 19CR rats compared to 2AL rats
(Figure 4), which contrasts with lower GLUT3 in the hippocampus of 28 month old female
Wistar rats (Fattoretti et al. 2001). The age and brain region differences or the low n-3
108
PUFA and high sucrose diet may contribute to these disparities. It is also possible that
GLUT and MCT expression in the brain may not be directly related to energy intake
because they do not limit brain energy substrate uptake, i.e. their capacity always exceeds
demand (Leybaert et al. 2007, Daniel et al. 1971, Ruderman et al. 1974).
One limitation in our study design is that euthanasia and manual dissection of the
brain before freezing in liquid nitrogen undoubtedly led to somewhat non-physiological
levels of brain Lac in all three groups (Sampol et al. Submitted). Nevertheless, brain
sampling was performed identically in all rats, which allows direct comparison between the
three groups. Another limitation is that the -HB doublet in the HRMAS spectrum was
contaminated by a macromolecular residual peak. However, these macromolecular residual
peaks are directly proportional to the amount of tissue and our data were corrected by tissue
sample weight, so the contamination was essentially identical in all rats, thereby allowing
the comparison of -HB between the three groups.
7.7. Conclusions
In conclusion, the present study shows that compared to 2AL rats, 19AL rats had
higher brain metabolites, including energy substrates and neurotransmitters, and higher
brain microvessel GLUT1 expression. However, under our experimental conditions, longterm CR did not significantly change brain cortex metabolite or fatty acid profiles, but did
reduce brain microvessel MCT1 expression in aged rats. Long-term CR did not produce
brain metabolite and fatty acid profiles more similar to the 2AL than to the 19AL group.
CR may be beneficial for brain function and metabolism only when performed with a
balanced diet, not in conjunction with a Western-style diet enriched in sucrose and low in
n-3 PUFA. Indeed, learning is impaired in rats on a high-fructose diet (Stranahan et al.
2008, Ross et al. 2009). The potential role of fructose in the effects of a high-sucrose diet
we report here should be further evaluated.
Acknowledgements
This study was financially supported by the Fonds de recherche du Québec-Santé,
Canadian Institutes of Health Research, Canadian Foundation for Innovation, the Canada
Research Chairs Secretariat (SCC), Quebec Network for Research on Aging, the CFQCU
109
program of the FQRNT, a Université de Sherbrooke Chair (SCC), and the Research Center
on Aging, Université de Sherbrooke. Dr Guylaine Ferland and Dr Pierrette Gaudreau are
thanked for providing the 19CR and 19AL rats. The authors also thank Julie Bédard,
Gérard Raffard and Dr. Jacques Rousseau for generous support and technical assistance.
Disclosure Statement
The authors declare no conflicts of interest.
110
8. DISCUSSION
Le présent travail avait pour premier objectif de déterminer l’effet du vieillissement
sain et de l’induction d’une cétose légère, par le biais de la diète cétogène, sur la capture
cérébrale du glucose et des cétones chez le rat. Pour ce faire, la capture cérébrale du
FDG et du
11
18
F-
C-AcAc a été mesurée par imagerie TEP. Un protocole TEP double
radiotraceurs, où les acquisitions avec le 11C-AcAc et le 18F-FDG étaient enchaînées lors de
la même séance d’imagerie, a été utilisé. Ce protocole a donc permis la comparaison des
deux principaux substrats énergétiques du cerveau, soit le glucose et les cétones, chez un
même animal. Afin de mieux caractériser les effets de la diète cétogène sur le métabolisme
cérébral, les différents intermédiaires des voies métaboliques du glucose et des cétones ont
été mesurés par spectroscopie RMN suite à l’infusion de glucose ou -HB marqué au 13C.
Un troisième aspect de ce travail a été d’évaluer l’impact d’une deuxième condition
cétogène, la restriction calorique à long terme, sur le métabolisme cérébral, incluant
différents métabolites, les acides gras et les transporteurs des substrats énergétiques, chez
des rats âgés sains. Les trois articles seront discutés dans l’ordre et les forces et les limites
de chacun seront développées à la fin de chaque partie.
8.1. La capture cérébrale des cétones et du glucose par imagerie TEP (article 1)
La capture cérébrale des cétones et du glucose a été mesurée par imagerie TEP à
l’aide des radiotraceurs
11
C-AcAc et
18
F-FDG, respectivement. La capture des deux
principaux substrats énergétiques du cerveau était globalement similaire chez des rats sains
jeunes et âgés, mais était plus élevée suite à la diète cétogène.
Il est important de ne pas confondre le concept de capture cérébrale du glucose, qui
inclut l’entrée du
18
F-FDG dans les cellules du cerveau et sa conversion par l’enzyme
hexokinase, avec le concept d’oxydation du glucose au cerveau, qui concerne généralement
son métabolisme mitochondrial, principalement au niveau du cycle de Krebs. Ce dernier
aspect a été évalué dans l’article 2.
111
8.1.1. L’effet du vieillissement
La perméabilité de la BHE était plus élevée chez les rats âgés comparativement aux
rats jeunes. Tel que discuté dans l’article 1, ceci a pu affecter la capture du
18
F-FDG et du
11
C-AcAc au cerveau chez les rats âgés. Une capture plus élevée des deux radiotraceurs par
rapport à des rats sans altération de la BHE a peut-être été observée. Sans ce phénomène, la
capture des deux radiotraceurs aurait peut-être été plus faible chez les rats âgés
comparativement aux rats jeunes. Toutefois, la corrélation entre la perméabilité de la BHE
et la capture des radiotraceurs chez les rats âgés n’a pu être déterminée dans la présente
étude. Il s’agit d’un point important à évaluer dans les futures études d’imagerie du cerveau
chez des rats âgés. Suite à ces études, si la perméabilité de la BHE se voit positivement
corrélée avec la capture des radiotraceurs, une correction des valeurs de capture cérébrale
pourrait être appliquée afin d'éliminer cette différence entre des rats âgés et des rats jeunes.
La capture cérébrale du 11C-AcAc était similaire chez les rats âgés comparativement
aux rats jeunes. De plus, nous avons retrouvé une corrélation positive entre la capture du
11
C-AcAc dans le cerveau entier et la concentration plasmatique de l’AcAc chez les deux
groupes. Il est connu depuis de nombreuses années que la capture cérébrale des cétones
chez le rat est directement proportionnelle à leur concentration plasmatique (Daniel et al.
1971, Ruderman et al. 1974, Pifferi et al. 2011). La capture cérébrale des cétones est aussi
fonction de leur constante d’influx au cerveau nommée K. Le CMRAcAc est en fait égal à
cette constante d’influx multipliée par la concentration plasmatique de l’AcAc. Dans notre
étude, pour le cerveau entier, la constante K ne différait pas entre les rats jeunes et les rats
âgés, tel était le cas pour le CMRAcAc. Ainsi, les mécanismes de régulation de la capture
cérébrale des cétones étaient en partie maintenus chez les rats âgés.
En ce qui concerne la capture cérébrale du 18F-FDG, les études chez l’homme ne sont
pas en accord; certaines ne retrouvent aucun changement avec l’âge (Ibanez et al. 2004,
Yanase et al. 2005), alors que d’autres montrent une diminution de la capture cérébrale du
18
F-FDG avec le vieillissement (Bentourkia et al. 2000, Kalpouzos et al. 2009). Plusieurs
différences méthodologiques peuvent être à l’origine de ces divergences : (i) certaines
études n’ont pas effectué de correction pour l’atrophie du cerveau, pouvant subvenir au
cours du vieillissement (Tableau 1 de l’introduction). (ii) Le statut cognitif des participants
n’a pas été établi dans toutes les études. Il est donc impossible de confirmer que toutes les
112
personnes âgées étaient cognitivement saines. (iii) Certaines études ont évalué un
continuum d’âges entre 10-92 ans, alors que d’autres ont évalué un groupe de personnes
jeunes versus un groupe de personnes âgées. De plus, le spectre d’âge du groupe de
personnes âgées était très variable d’une étude à l’autre (55-92 ans).
Depuis, le laboratoire a réalisé une étude TEP-18F-FDG chez des personnes âgées
cognitivement saines âgées entre 65 et 85 ans, où une correction pour l’atrophie cérébrale a
été effectuée (Nugent et al. 2014). Cette étude a révélé une diminution globale significative
de 8% pour la capture cérébrale du
18
F-FDG chez le groupe de personnes âgées. Ceci est
donc faveur d’une diminution de la capture du glucose au cerveau chez les personnes âgées
cognitivement saines.
Dans la présente étude, aucune diminution de la capture cérébrale du 18F-FDG n’a été
observée chez les rats âgés comparativement aux rats jeunes. Une capture plus élevée dans
la région de l’hippocampe et une tendance à un niveau plus élevé dans la région du striatum
ont même été observées chez les rats âgés. Ceci était associé à un pourcentage plus faible
de la contribution du 11C-AcAc à la capture cérébrale totale des substrats énergétiques dans
l’hippocampe et le striatum chez les rats âgés. Ceci est en accord avec une étude TEP chez
l’homme, ayant rapporté que la contribution de l’AcAc à la capture cérébrale totale des
substrats énergétiques est diminuée dans la région du striatum au cours du vieillissement
(Nugent et al. 2014).
L’hippocampe joue un rôle central dans les processus d’apprentissage et de mémoire,
qui peuvent être altérés lors du déclin cognitif associé au vieillissement. Dans le contexte
pathologique de la maladie d’Alzheimer, l’hippocampe est l’une des premières régions
affectées par la diminution de la capture du 18F-FDG (Cunnane et al. 2011, Mosconi et al.
2005). Cette sensibilité peut expliquer pourquoi elle est la seule région touchée par une
modification de la capture du
18
F-FDG dans notre étude. Une capture plus élevée du
18
F-
FDG dans la région de l’hippocampe a été démontrée chez des souris transgéniques
modèles de la maladie d’Alzheimer dans les premiers mois du processus neuropathologique
(Poisnel et al. 2012, Luo et al. 2012). Les auteurs ont proposé que l’augmentation de la
capture du
18
F-FDG corresponde à un phénomène compensatoire en réponse aux
modifications fonctionnelles et structurales des neurones (Luo et al. 2012). Un tel
phénomène pourrait alors également subvenir chez des rats âgés sains pour compenser les
113
modifications fonctionnelles et structurales du cerveau associées au vieillissement, comme
c’est le cas dans notre étude. Chez les souris transgéniques modèles de la maladie
d’Alzheimer, l’augmentation de la capture cérébrale du
18
F-FDG est en lien avec une
augmentation des courants calciques et de l’excitabilité des neurones de l’hippocampe
(Busche et al. 2008, Kuchibhotla et al. 2009). L’hyperactivité de ces neurones serait due à
une diminution de l’inhibition synaptique.
Dans la présente étude, un niveau plus élevé de capture du
18
F-FDG a été détecté
uniquement dans la région de l’hippocampe chez les rats âgés de 21 mois et pourrait
représenter un phénomène transitoire. Une mesure longitudinale de la capture cérébrale du
18
F-FDG chez des rats âgés pourrait permettre d’éclaircir si une élévation de la capture au
cours du vieillissement est retrouvée dans d’autres régions du cerveau.
Une capture du 18F-FDG plus élevée est un phénomène qui a aussi été identifié chez
les patients Alzheimer (Benzinger et al. 2013). Les travaux de Benzinger et al. (2013) ont
démontré qu’avant l’apparition d’une diminution de capture du
d’augmentation de capture du
18
18
F-FDG, une phase
F-FDG a lieu dans le cortex cingulaire postérieur, une
région connue pour être affectée très précocement dans la maladie d’Alzheimer.
Si nos résultats sont transposables à l’homme, une capture cérébrale du 18F-FDG plus
élevée pourrait représenter un changement précoce dans le cerveau lors du vieillissement,
qui ne serait accompagnée d’aucune modification de la capture cérébrale du 11C-AcAc.
8.1.2. Les différences régionales de la capture du 11C-AcAc et du 18F-FDG
Dans la présente étude, environ 25% de la capture du
11
C-AcAc avait lieu dans le
cortex, qui représentait alors la région avec la plus grande capture de cétones. Ceci est en
accord avec une étude de la capture régionale du
14
C--HB par autoradiographie ayant
montré que les cortex frontal et pariétal sont les régions où la capture des cétones est la plus
importante, alors que les régions sous-corticales ont une capture moindre, comme c’est le
cas pour l’hippocampe et le striatum dans notre étude (Figure 27) (Hawkins et al. 1986).
114
Figure 27 : Capture cérébrale du 14C--hydroxybutyrate par autoradiographie chez le
rat
Cette coupe de cerveau illustre que les cortex (C) frontal et pariétal sont les régions où la
capture des cétones est la plus importante dans le cerveau de rats. Les régions souscorticales, dont le striatum (S), présentent une capture moindre. Un niveau élevé de capture
tend vers la couleur rouge, alors qu’une faible capture est illustrée en bleu. Tiré de Hawkins
et al. (1986).
Contrairement au
11
C-AcAc, la proportion de
18
F-FDG capté dans le cortex,
relativement au cerveau entier, était plus faible et ne représentait qu’environ 15% de la
capture totale du
18
F-FDG au cerveau. Les pourcentages de capture du
18
F-FDG dans le
cortex, l’hippocampe, le striatum et le cervelet, relativement au cerveau entier, nous ont
indiqué qu’une proportion importante, environ 65%, de la capture du
18
F-FDG se produit
dans d’autres régions du cerveau non analysées. Une étude de la capture régionale du
14
C-
glucose par autoradiographie a montré que le thalamus, le cortex frontal, le colliculus
inférieur et le complexe olivaire supérieur, faisant tous deux partie de la voie auditive, sont
les régions où la capture du glucose est la plus importante chez le rat (Lu et al. 1983). Notre
étude TEP a donc permis de confirmer in vivo que la capture régionale du
18
F-FDG et du
11
C-AcAc diffère significativement dans le cerveau. Ceci pourrait remettre en cause notre
hypothèse de départ postulant que les cétones puissent compenser la diminution de la
capture cérébrale du glucose lors du déclin cognitif, étant donné que la capture des cétones
pourrait être insuffisante dans certaines régions avec une diminution de capture du glucose,
telles que les régions sous-corticales. Toutefois, la diète cétogène a entraîné une capture du
115
18
F-FDG plus élevée dans le cerveau entier ainsi que dans les sous-régions analysées chez
les rats âgés, ce qui est favorable à notre hypothèse.
8.1.3. L’effet de la diète cétogène
Au cours de leur vie, les deux groupes de rats âgés ont gagné du poids jusqu’à l’âge
de 19 mois et puis ont maintenu un poids d’environ 630 g jusqu’à l’âge de 24 mois
(données non publiées). Suite à la diète cétogène de 14 jours, les rats avaient un poids
corporel 7% plus élevé que les rats âgés sous diète contrôle. Les études antérieures de diète
cétogène chez le rat ont toutefois montré soit une diminution du poids corporel
(Thavendiranathan et al. 2000, Likhodii et al. 2002), soit aucun changement du poids
(Likhodii et al. 2000, Taha et al. 2005), dépendamment de la nature de la diète cétogène.
La perte de poids chez le rat est souvent occasionnée par l’aspect et le goût désagréable de
la diète cétogène. Ainsi, pour éviter que les rats âgés ne mangent pas et se retrouvent en
jeûne ou en restriction calorique, nous avons introduit la diète cétogène de façon graduelle,
en combinaison avec la diète contrôle pendant les deux premiers jours. Cependant, les
études citées plus haut ont été effectuées chez des rats jeunes. Balietti et al. (2008) ont eux
retrouvé une augmentation graduelle significative du poids corporel chez des rats âgés de
19 mois sous diète cétogène, tel que retrouvé dans le présent article. Ainsi, le métabolisme
des lipides (inclus dans la diète cétogène) était peut-être modifié chez les rats âgés dans
notre étude. Une accumulation de gras et une altération du métabolisme lipidique sont
d’ailleurs décrites au cours du vieillissement chez le rat (Nesic et al. 2013, Rivas et al.
2011).
Tel qu’attendu, la capture cérébrale des cétones était plus élevée chez les rats âgés
sous diète cétogène comparativement aux rats âgés sous diète contrôle (voir annexe 3 pour
la composition des diètes). En effet, le niveau d’expression protéique du transporteur
MCT1 à la BHE est plus élevé chez des rats sous diète cétogène comparativement à des rats
contrôles (Puchowicz et al. 2007, Pifferi et al. 2011, Leino et al. 2001). De plus, dans notre
étude, les cétones plasmatiques étaient entre 63-90% plus élevées chez les rats âgés sous
diète cétogène et la concentration artérielle est l’un des principaux facteurs régulant la
capture des cétones au cerveau (Pifferi et al. 2011, Ruderman et al. 1974). Toutefois, la
concentration plasmatique de -HB était plus faible chez les rats âgés de 24 mois sous diète
116
contrôle par rapport aux rats âgés de 21 mois. Ceci indique que les processus de cétogenèse
et de cétolyse sont modifiés au cours du vieillissement chez le rat. Encore aucune étude
dans la littérature n’a approfondi ce point, mais il est possible d’imaginer une modification
du métabolisme des cétones au cours du vieillissement, considérant qu’il y a des
modifications du métabolisme lipidique (Rivas et al. 2011, Nesic et al. 2013).
La capture cérébrale du
18
F-FDG était également plus élevée chez les rats âgés sous
diète cétogène comparativement aux rats âgés sous diète contrôle. L’entrée du glucose au
cerveau est régulée par deux éléments au niveau de la BHE (Figure 28). En premier lieu,
l’entrée est régulée par la différence de concentration du glucose de part et d’autre de la
BHE. Le taux d’entrée du glucose suit la loi d’action de masse et est proportionnel à la
différence de concentration du glucose jusqu’à l’atteinte de l’état d’équilibre de la
concentration de part et d’autre de la BHE (Leybaert et al. 2007). Au cours de la diète
cétogène, les rats pourraient présenter une diminution des niveaux de glucose dans le
cerveau, étant donné la faible teneur de la diète en glucides et l’ajout des cétones comme
substrat énergétique du cerveau. Cette baisse du niveau de glucose du côté cérébral pourrait
ainsi entraîner une augmentation du taux d’entrée au niveau de la BHE. Considérant cette
loi d’action de masse, une utilisation plus importante du glucose dans le cerveau des rats
âgés pourrait entraîner une capture cérébrale du 18F-FDG plus élevée dans l’hippocampe.
En deuxième lieu, l’entrée du glucose au cerveau est fonction de l’activité et du
nombre de transporteurs GLUT1 exprimés à la membrane des cellules endothéliales de la
BHE. Une étude d’immunohistochimie chez des rats sous diète cétogène a révélé un niveau
d’expression du transporteur GLUT1 40% supérieur à celui des rats contrôles (Puchowicz
et al. 2007).
117
Figure 28 : Régulation de l’entrée du glucose au cerveau
L’entrée du glucose au cerveau est régulée par deux éléments au niveau de la BHE : (i) la
différence de concentration du glucose de part et d’autre de la BHE, (ii) l’activité et le
nombre de transporteurs GLUT1 exprimés à la membrane des cellules endothéliales de la
BHE. [G]lum : concentration du glucose du côté luminal; [G]ablum : concentration du glucose
du côté abluminal;
: flux maximal du glucose atteint par un transporteur GLUT1
(mol/g/min); : Km de la relation Michealis-Menten dans le contexte du transport à la
BHE (mmol/L);
: flux maximal du glucose atteint par la BHE. Adapté de Leybaert
(2005).
Nos résultats sont en accord avec le fait que le glucose est un substrat énergétique
essentiel au cerveau et que les cétones ne peuvent fournir 100% de l’énergie utilisée par le
cerveau (Owen et al. 1967). En effet, le glucose est essentiel au phénomène d’anaplérose et
au réapprovisionnement des intermédiaires du cycle de Krebs, notamment l’oxaloacétate.
En condition de cétose, l’utilisation des cétones comme substrat énergétique dans le cycle
de Krebs pourrait être altérée par une anaplérose insuffisante et une synthèse insuffisante
des intermédiaires suivants : l’-cétoglutarate, le succinyl-CoA ou l’oxaloacétate, qui ont
tous trois de petits pools (Brunengraber et Roe 2006). En effet, en condition de cétose,
l’oxaloacétate est préférentiellement utilisé pour la synthèse du glucose plutôt que d’être
condensé avec l’acétyl-CoA dans le cycle de Krebs. Toutefois l’oxaloacétate peut être
synthétisé à partir du pyruvate (par l’enzyme pyruvate carboxylase) ou à partir de
l’aspartate. L’augmentation de la capture cérébrale du glucose que nous avons observée
chez les rats sous diète cétogène pourrait en partie être due au besoin accru de
118
réapprovisionner le pool d’oxalacétate (à partir du pyruvate), permettant de maintenir un
flux du cycle de Krebs adéquat, même accru tel que démontré dans l’article 2. L’efficacité
des thérapies favorisant l’anaplérose a été démontrée dans plusieurs maladies métaboliques
génétiques chez l’homme: la déficience de l’enzyme pyruvate carboxylase, de l’enzyme
phosphoenolpyruvate carboxykinase (qui convertit l’oxaloacétate en phosphoenolpyruvate)
ou des désordres d’oxydation des acides gras à longue chaîne (Roe et Mochel 2006).
Cependant, certaines études antérieures ont montré que la capture cérébrale du
glucose est inchangée (Linde et al. 2006, al-Mudallal et al. 1995, Corddry et al. 1982) ou
diminuée (LaManna et al. 2009, Hasselbalch et al. 1994, Mans et al. 1987) lors d’une
cétose expérimentale. Des différences dans le niveau de l’état de cétose ont pu contribuer
aux divergences dans la littérature. Contrairement à notre étude de courte durée, l’état de
cétose est parfois maintenu pendant plusieurs semaines et la cétonémie peut alors atteindre
des niveaux de l’ordre de 8 mM (Zhang et al. 2013), contrairement à 1,4 mM dans notre
étude. Une cétonémie élevée pendant une période prolongée pourrait mener à une
modulation différente de la capture cérébrale du glucose, suite à des mécanismes
d’adaptation.
Ainsi, la diète cétogène pourrait potentiellement contrecarrer la diminution de la
capture cérébrale du glucose subvenant au cours de la maladie d’Alzheimer, non seulement
en fournissant au cerveau un substrat alternatif (les cétones), mais aussi en corrigeant
l’approvisionnement du cerveau en glucose. La capture cérébrale du
18
F-FDG chez les
patients Alzheimer est corrélée de façon négative avec la sévérité des atteintes cognitives,
entre autres au niveau de la mémoire (Devous 2002, Haense et al. 2008, Sultzer et al.
2003). De façon intéressante, la diète cétogène améliore les fonctions cognitives dans
différents modèles de rongeurs. Des rats âgés sous diète cétogène présentent une meilleure
performance au test de reconnaissance de l’objet et au test du labyrinthe en T, ce qui dénote
une amélioration des fonctions de mémoire et d’apprentissage spatial (Xu et al. 2010).
Chez des souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer, la diète cétogène
améliore les fonctions d’apprentissage et de mémoire, mesurées par le test de la piscine de
Morris (Kashiwaya et al. 2013). Ces effets au niveau des fonctions cognitives sont peut-être
en partie liés à l’augmentation de l’approvisionnement du cerveau en substrats
énergétiques. D’autre part, les effets bénéfiques des cétones sur la cognition peuvent être
119
dus à l’inhibition des processus de stress oxydatif (Maalouf et al. 2007, Kim do et al. 2007)
et d’apoptose (Maalouf et Rho 2008) par les cétones, conférant un effet neuroprotecteur aux
cétones.
À l’heure actuelle, encore aucune étude n’a évalué les effets délétères au cerveau que
pourraient engendrer un traitement cétogène à long terme et une capture cérébrale du
glucose et des cétones élevée. Une augmentation de la production des ERO et du stress
oxydant au cerveau pourrait être observée. Toutefois, les cétones pourraient atténuer cet
effet étant donné qu’elles diminuent la production des ERO par le complexe I de la chaîne
respiratoire mitochondriale (Maalouf et al. 2007, Sullivan et al. 2004). De plus, un effet
d’intolérance au glucose et possiblement de résistance à l’insuline, tel qu’observé à la
périphérie lors de la prise de diètes enrichies en sucrose ou en gras (Le et Tappy 2006),
pourrait être observé au cerveau et entraîner différents problèmes métaboliques au niveau
cérébral.
8.1.4. Les forces
Nous sommes la seule équipe à pouvoir mesurer la capture du 11C-AcAc par imagerie
TEP et l’article 1 est la première étude TEP mesurant la capture cérébrale des cétones chez
des rats âgés. Le protocole TEP double radiotraceurs présente l’avantage de mesurer la
capture cérébrale du 11C-AcAc et du
18
F-FDG chez un même animal au cours de la même
séance d’imagerie et donc dans les mêmes conditions physiologiques. Ceci a permis de
comparer la capture des deux principaux substrats énergétiques du cerveau et de déterminer
la contribution de chacun par rapport à la capture cérébrale totale des substrats
énergétiques. La majorité des études TEP animales expriment les données en standardized
uptake values, qui sont des unités relatives et non absolues (Luo et al. 2012, Poisnel et al.
2012, Lopez-Grueso et al. 2010, Pifferi et al. 2011). Ceci rend la comparaison entre les
différentes études très difficile. Dans la présente étude, le calcul des cerebral metabolic
rates, qui nécessite la mesure et le calcul de la fonction d’entrée dans le plasma, nous a
donné une mesure quantitative précise de la capture cérébrale des deux radiotraceurs. Les
acquisitions IRM, en nous fournissant des images anatomiques de haute résolution, ont
également permis l’étude de régions spécifiques dans le cerveau et ainsi la détermination de
spécificités régionales pour la capture du 11C-AcAc et du 18F-FDG.
120
8.1.5. Les limites
Nous avons inclus un jeûne toute la nuit (18 heures) avant la séance TEP pour
augmenter légèrement la capture des deux radiotraceurs au cerveau (suite à l’article de
(Pifferi et al. 2011). Ceci facilite le traitement des images TEP, surtout pour le 11C-AcAc et
permet de s’assurer que la capture est au-dessus du bruit de fond dans les images. De plus,
une période de jeûne a pour effet de diminuer la variation de la cétonémie entre les rats; les
niveaux de cétones pouvant être très variables d’un rat à l’autre. Il s’agissait d’un point
important dans notre étude étant donné que la valeur de la cétonémie est utilisée pour le
calcul du CMRAcAc. Toutefois, le jeûne de 18 heures a eu pour effet de rapprocher les deux
groupes (CT et KD) en termes de cétose. L’effet cétogène de la diète était donc camouflé
par le jeûne chez les deux groupes. Pour les prochaines études TEP, la période de jeûne
devrait être raccourcie. Après certains tests que nous avons effectués depuis, nous avons
déterminé qu’un jeûne de 6 heures est suffisant pour obtenir des images TEP adéquates. Le
jeûne pourrait peut-être même être éliminé lorsque l’on travaille avec des images TEP
fusionnées à l’IRM. Pour ces raisons, la période de jeûne a été complètement retirée du
protocole pour l’article 2.
De plus, seules quatre régions du cerveau ont été étudiées étant donné la
segmentation manuelle des images. Une analyse automatique des régions du cerveau chez
la souris a été effectuée par d’autres équipes et permet l’identification de sous-régions du
cortex, telles que le cortex entorhinal, une région où les plaques amyloïdes formées au
cours de la maladie d’Alzheimer sont particulièrement localisées (Luo et al. 2012). Une
analyse plus étendue des régions du cerveau aurait pu soulever d’autres différences dans la
capture des deux radiotraceurs et permettre l’association avec les fonctions de ces régions
en question.
Enfin, les rats ont une durée de vie de deux à trois ans et une anatomie du cerveau
très différente de celle de l’homme. Le rat n’est peut-être donc pas le meilleur modèle
d’étude du vieillissement cérébral, en comparaison au primate non-humain par exemple.
Des changements très similaires à ceux retrouvés chez l’homme sont tout de même
observés dans les cerveaux de rats au cours du vieillissement. Au niveau structural : (i) une
diminution de la protéine occludine, du nombre de cellules endothéliales et du diamètre des
capillaires est retrouvée à la BHE (Barr 1978) et (ii) une atrophie de la région de
121
l’hippocampe a été observée chez des rates de 24 mois (Driscoll et al. 2006), ainsi qu’une
atrophie des dendrites des neurones. Au niveau métabolique : (i) une diminution du nombre
de mitochondries est retrouvée dans les cellules du cerveau (Balietti et al. 2010) et (ii) une
baisse de l’activité des enzymes mitochondriales au cerveau (Yao et al. 2010). De plus,
compte tenu de sa petite taille, le rat est un très bon compromis pour des études
métaboliques d’imagerie du cerveau, où des scans répétés doivent être effectués. De plus, le
rat est environ 5 millions d’années plus près de l’homme que la souris en termes
d’évolution.
8.2. Le métabolisme cérébral des cétones et du glucose en spectroscopie RMN
(article 2)
Maintenant que nous avions des réponses concernant l’effet de la diète cétogène sur
la capture cérébrale des cétones et du glucose, nous avons voulu évaluer le devenir de ces
deux substrats dans les cellules du cerveau suite à une diète cétogène. L’article 1 a permis
d’établir que la capture cérébrale des cétones et du glucose est plus élevée chez les rats sous
diète cétogène et l’article 2 démontre que ceci est aussi accompagné d’un métabolisme plus
important des cétones et du glucose dans les cellules du cerveau. Le métabolisme des
cétones et du glucose au cerveau a été mesuré par spectroscopie RMN suite à l’infusion de
-HB ou glucose marqué au 13C. Malgré deux méthodes distinctes et des concentrations de
traceur infusé très différentes dans les deux articles (10-12-10-9 M en TEP vs 0,75-1,5 M en
RMN), les deux études démontrent des résultats très concordants.
8.2.1. L’effet de la diète cétogène sur le métabolisme des cétones
8.2.1.1.
Le métabolisme mitochondrial
Suite à l’infusion de [2,4-13C2]-HB, le métabolisme oxydatif des cétones au cerveau
était plus élevé chez les rats sous diète cétogène comparativement aux rats contrôles. En
effet, les rats sous diète cétogène présentaient un enrichissement en 13C sur le carbone 4 du
glutamate plus élevé que les rats contrôles. Suite à une infusion de [2,4-13C2]-HB, le 13C
s’incorpore sur le carbone 4 de l’-cétoglutarate lors du premier tour du cycle de Krebs. Il a
été démontré que l’-cétoglutarate est très rapidement en équilibre avec le glutamate, que
122
ces deux molécules sont combinées et traitées comme un seul pool lors d’analyses
cinétiques et que le glutamate donne une indication sur l’activité du cycle de Krebs (Mason
et al. 1992, Mason et al. 1995). Cependant, cette information ne représente pas une réelle
mesure du flux du cycle de Krebs puisque cet enrichissement en
13
C du carbone 4 du
glutamate est uniquement dépendant du pool d’-cétoglutarate marqué au 13C.
Une indication plus précise du flux du cycle de Krebs a toutefois été possible en
mesurant l’incorporation du
13
C sur d’autres carbones que le carbone 4 du glutamate. Des
molécules qui diffèrent seulement par les positions des
13
C incorporés sont nommées des
isotopomères. Ceux-ci sont identifiables par le fait que les interactions entre deux atomes
13
C sur une même molécule de glutamate, appelées les couplages homonucléaires (13C-13C),
donnent lieu à des pics secondaires, en plus du pic central, sur les spectres (Figure 29).
L’infusion du [2,4-13C2]-HB a donné lieu à la formation des isotopomères suivants : [413
C]glutamate (singulet), [3,4-13C2]glutamate et [4,5-13C2]glutamate (doublets) et [3,4,5-
13
C3]glutamate (triplet). La superposition de ces pics a résulté en un quintuplet.
L’enrichissement en
13
C des carbones 2, 3 et 5 du glutamate a lieu à partir du deuxième
tour du cycle de Krebs et l’identification de ces isotopomères dans notre étude démontre
que le cycle de Krebs a fait plusieurs tours pendant la période d’infusion du [2,4-13C2]HB. De plus, l’intensité de ces pics secondaires du glutamate était plus élevée chez les rats
sous diète cétogène, dénotant indirectement une vitesse du cycle de Krebs plus élevée chez
les rats sous diète cétogène et validant notre hypothèse de départ. En effet, une
augmentation des couplages homonucléaires du glutamate a été caractérisée comme un flux
du cycle de Krebs plus élevé (Mason et al. 1992, Rodrigues et Cerdan 2005). Ces résultats
sont en accord avec une récente étude démontrant que l’oxydation de l’AcAc est
significativement plus élevée chez des rats sous diète cétogène (Zhang et al. 2013).
123
Figure 29 : Isotopomères du glutamate suite à l’infusion du [2,4-13C2]hydroxybutyrate
Il s’agit d’un spectre 13C de cerveau d’un rat sous diète cétogène infusé avec du [2,413
C2]-HB. L’infusion a donné lieu à l’incorporation d’un 13C sur plusieurs positions de
carbone pour une même molécule de glutamate (Glu). Les différences d’incorporation du
13
C ont entraîné la formation des différents isotopomères suivants: [4-13C]Glu (singulet),
[3,4-13C2]Glu et [4,5-13C2]Glu (doublets) et [3,4,5-13C3]Glu (triplet). La superposition de
ces pics résulte en un quintuplet.
Dans la présente étude, le flux du cycle de Krebs plus élevé chez les rats sous diète
cétogène révèle une efficacité mitochondriale accrue dans le cerveau de ces rats. Dans le
même ordre d’idées, il a été démontré que l’expression de gènes d’enzymes impliquées
dans la glycolyse (phosphofructokinase, acylphosphatase), le cycle de Krebs (malate
déshydrogénase,
isocitrate
déshydrogénase,
succinate
déshydrogénase)
et
la
phosphorylation oxydative (cytochrome C oxydase, NADH déshydrogénase) est augmentée
suite à une diète cétogène (Bough et al. 2006). Le contenu en succinate au cerveau est aussi
augmenté par la diète cétogène et pourrait favoriser une élévation du flux du cycle de Krebs
en fournissant plus de substrat (Puchowicz et al. 2008). De plus, une avancée majeure dans
la compréhension des effets de la diète cétogène au cerveau fut l’identification du processus
de biogenèse mitochondriale. En effet, le nombre de mitochondries est augmenté dans le
cerveau de rongeurs sous diète cétogène (Nylen et al. 2009, Balietti et al. 2010).
124
Le vieillissement peut être accompagné d’une détérioration du fonctionnement
mitochondrial (Lapointe et Hekimi 2010). Plus précisément, une diminution de l’activité
des enzymes mitochondriales, soit la PDH (Yao et al. 2010, Zhou et al. 2009), l’isocitrate
déshydrogénase (Vitorica et al. 1981) et les complexes de la chaîne de transport des
électrons (Yao et al. 2010, Navarro et al. 2002), est retrouvée dans le cerveau de rats âgés.
De plus, le nombre de mitochondries est diminué dans le cerveau de rats âgés et la diète
cétogène rétablit le niveau à celui de rats jeunes (Balietti et al. 2010).
Plusieurs évidences ont aussi montré que des dysfonctions mitochondriales sont
retrouvées dans des maladies neurodégénératives associées au vieillissement, telles que la
maladie d’Alzheimer (Swerdlow et Khan 2009, Yao et al. 2011). Une altération de la
morphologie des mitochondries et une diminution de l’activité des enzymes du cycle de
Krebs (PDH, isocitrate déshydrogénase, -cétoglutarate déshydrogénase) et de l’enzyme
cytochrome C oxydase sont observées dans le cerveau de patients Alzheimer (Sorbi et al.
1983, Bubber et al. 2005, Gibson et al. 1998). Les changements de ces activités
enzymatiques corrèlent tous de façon positive avec la sévérité des symptômes cliniques de
la démence (Bubber et al. 2005). Les études chez les modèles animaux de la maladie
d’Alzheimer ont démontré un déclin du fonctionnement mitochondrial, soit une diminution
de l’expression et de l’activité de l’enzyme PDH et une diminution de la respiration
mitochondriale, avant le développement de la neuropathologie (Varghese et al. 2011, Yao
et al. 2009, Hauptmann et al. 2009). Il a donc été proposé que les dysfonctions
mitochondriales jouent un rôle majeur dans le développement de la pathophysiologie de la
maladie d’Alzheimer et pourraient représenter un biomarqueur de la maladie ainsi qu’une
cible thérapeutique. La diminution de capture cérébrale du glucose retrouvée chez les
patients Alzheimer, pouvant impliquer des changements du métabolisme du glucose au
cerveau, pourrait être liée à la détérioration du fonctionnement mitochondrial. Ces deux
troubles peuvent d’ailleurs subvenir plusieurs années avant le début de la neuropathologie
et des symptômes cliniques de la maladie.
Ainsi, l’efficacité mitochondriale accrue et la stimulation du processus de biogenèse
mitochondriale induit par la diète cétogène pourraient contrecarrer les dysfonctions
mitochondriales associées au vieillissement sain et à la maladie d’Alzheimer. Toutefois, la
125
diète cétogène doit certainement être introduite avant que l’atteinte de la fonction
mitochondriale soit trop sévère.
La majorité des études de spectroscopie RMN ayant évalué le métabolisme
énergétique du cerveau ont utilisé le
13
C-glucose ou le
13
C-acétate comme substrat infusé.
Les études RMN avec l’infusion d’acétate marqué ont lieu depuis quelques décennies
maintenant et ont démontré que l’acétate est majoritairement métabolisé dans les astrocytes
(Berl et al. 1962, Cerdan et al. 1990). Un point intéressant est que l’acétate est métabolisé
de façon très similaire aux cétones; il est directement converti en acétyl-CoA par l’enzyme
acétyl-CoA synthase, sans autre voie intermédiaire. Tel que retrouvé dans notre étude chez
les rats infusés au [2,4-13C2]-HB, une étude a démontré un enrichissement en
13
C du
glutamate et de la glutamine plus élevé suite à l’infusion de 13C-acétate chez des souris sous
diète cétogène (Yudkoff et al. 2005a). L’infusion d’une cétone marquée est cependant une
condition plus physiologique, étant donné que l’acétate est normalement un métabolite
intracellulaire peu présent dans le sang, contrairement aux cétones (Jiang et al. 2011).
8.2.1.2.
La compartimentation neurone : astrocyte
Les études antérieures ayant évalué le métabolisme des cétones dans les deux
compartiments du cerveau (neurone ou astrocyte) ne sont pas en accord: certaines ont noté
une plus grande oxydation des cétones dans le compartiment astrocytaire (Kunnecke et al.
1993, Yudkoff et al. 2008), alors que d’autres rapportent que les cétones sont plus oxydées
dans les neurones (Jiang et al. 2011, Pan et al. 2002). Considérant le cycle glutamateglutamine défini dans l’introduction (Figure 14), les marquages du glutamate et de la
glutamine suite à l’infusion d’un substrat marqué au
13
C ont été utilisés dans la littérature
pour déterminer la préférence des neurones et des astrocytes pour ce substrat (Jiang et al.
2011).
Dans notre étude, comparativement au glucose, les cétones étaient plus oxydées par
les astrocytes, étant donné un marquage plus important de la glutamine (Gln) par rapport au
glutamate (Glu; Glu C4/Gln C4). Nos résultats sont en accord avec l’équipe de Kunnecke et
al. (1993) qui a évalué par spectroscopie RMN le métabolisme cérébral du 13C--HB chez
des rats sous diète standard. Le ratio de Glu C4/Gln C4 marqué au 13C était inférieur chez les
rats infusés au 13C--HB par rapport aux rats infusés au 13C-glucose. L’équipe de Yudkoff
126
et al. (2008) a aussi déterminé que le métabolisme astrocytaire est stimulé chez des
animaux en cétose légère. Ils ont émis l’hypothèse que ceci résulte en une augmentation de
la conversion du glutamate en glutamine, fournissant plus de glutamine aux neurones pour
la synthèse du GABA (Figure 30).
Figure 30 : Impact d’une cétose légère sur le métabolisme astrocytaire
Il a été montré que le métabolisme astrocytaire est plus élevé chez des animaux en cétose
légère comparativement à des animaux contrôles. Ceci pourrait résulter en une
augmentation de la conversion du glutamate en glutamine, un approvisionnement plus
important des neurones en glutamine et une synthèse de l’acide -aminobutyrique (GABA)
plus élevée. OAA : oxaloacétate; Asp : aspartate. Adapté de Yudkoff et al. (2008).
Les divergences dans la littérature pourraient être dues au niveau différent des
cétones plasmatiques entre les études; la capture des cétones au cerveau étant directement
proportionnelle à leur concentration plasmatique. L’étude de Kunnecke et al. (1993) a été
effectuée chez des rats sains non à jeun. L’état de cétose était donc très faible,
contrairement à l’étude de Jiang et al. (2011), qui a été effectuée chez des rats en jeûne
depuis 36 heures, où le niveau des cétones plasmatiques était de 4,2 mM avant l’infusion de
13
C--HB. Ils ont déterminé que dans ces conditions, 70% de l’oxydation des cétones a lieu
dans les neurones.
Dans notre étude, l’enrichissement en
13
C du -HB dans le cerveau n’était pas plus
élevé chez les rats sous diète cétogène comparativement aux rats contrôles, malgré la
capture cérébrale des cétones plus élevée observée dans l’article 1. Ceci peut être dû au fait
que les mesures d’enrichissement ont été faites une heure après le début de l’infusion du
[2,4-13C2]-HB. À ce moment, un équilibre entre la capture et le métabolisme du -HB est
127
peut-être atteint. Des mesures d’enrichissement plus rapidement après le début de l’infusion
auraient peut-être révélé un enrichissement plus élevé chez les rats sous diète cétogène. En
ce qui concerne l’enrichissement en 13C du glucose dans le cerveau, l’élévation chez les rats
sous diète cétogène était toujours observable une heure après le début de l’infusion, la
capture du 13C-glucose étant peut-être plus importante que son métabolisme. D’autre part, il
est connu que les cétones au cerveau sont métabolisées extrêmement rapidement, aussitôt
leur passage au travers la BHE (Blomqvist et al. 1995, Blomqvist et al. 2002). Ce faible
pool de cétones au cerveau a pu empêcher la distinction d’une différence de
l’enrichissement en 13C du -HB entre les rats contrôles et les rats sous diète cétogène.
8.2.2. L’effet de la diète cétogène sur le système GABAergique
Dans la présente étude, le contenu du cerveau en GABA, lorsqu’exprimé relativement
au glutamate, était également plus élevé chez les rats sous diète cétogène. Nos résultats sont
en accord avec l’équipe de Yudkoff et al. qui a émis l’hypothèse qu’une synthèse plus
importante de GABA pourrait contribuer à l’effet antiépileptique de la diète cétogène
(Yudkoff et al. 2008, Yudkoff et al. 2004, Yudkoff et al. 2001b). Ils ont également observé
une concentration plus faible d’aspartate dans le cerveau des animaux sous diète cétogène.
Ils ont proposé que le flux de la réaction catalysée par l’enzyme citrate synthase au niveau
du cycle de Krebs soit plus élevé chez les animaux en cétose, ce qui serait accompagné
d’une utilisation plus importante de l’oxaloacétate, qui serait alors moins disponible pour la
synthèse de l’aspartate (Figure 31). Une plus grande quantité de glutamate serait ainsi
disponible pour la synthèse du GABA chez les animaux en cétose légère. Toutefois, il
n’avait jamais été démontré avant notre étude que les niveaux de GABA étaient plus élevés
chez des rats sous diète cétogène.
128
Figure 31 : Impact d’une cétose légère sur la production d’aspartate
Chez les animaux en cétose légère, le flux de la réaction catalysée par l’enzyme citrate
synthase est augmenté, ce qui entraîne une utilisation plus élevée de l’oxaloacétate (OAA),
qui est moins disponible pour la synthèse de l’aspartate. Une plus grande quantité de
glutamate serait ainsi disponible pour la synthèse de l’acide -aminobutyrique (GABA). CG : -cétoglutarate. Adapté de Yudkoff et al. (2005a).
Nous avons aussi retrouvé un contenu en leucine et en isoleucine plus élevé dans le
foie des rats sous diète cétogène. La leucine et l’isoleucine sont des acides aminés
essentiels, qualifiés comme cétogènes puisqu’ils engendrent la formation de l’AcAc et de
l’acétyl-CoA. Toutefois, ces deux acides aminés ont certainement contribué de façon
beaucoup moindre que les acides gras à la cétogenèse chez les rats sous diète cétogène. La
leucine (comprise dans la caséine) représentait uniquement 1,4% de la diète cétogène,
comparativement aux lipides qui représentaient 78% de la diète. Dans le contexte d’une
diète cétogène, la leucine et l’isoleucine sont donc en compétition avec la quantité
importante d’acides gras, provenant de la diète cétogène, pour la synthèse des cétones via
l’acétyl-CoA (Figure 32). La leucine et l’isoleucine peuvent ainsi s’accumuler dans le foie.
De façon intéressante, la leucine est l’acide l’aminé qui traverse le plus rapidement la BHE
et est impliqué dans la synthèse du glutamate au cerveau (Smith et al. 1987, Kanamori et
al. 1998). La leucine fournit environ 25% des groupements NH2 nécessaires à la synthèse
129
du glutamate (Kanamori et al. 1998). Une élévation de la concentration de la leucine au
cerveau a aussi été rapportée chez des animaux sous diète cétogène (Yudkoff et al. 2005a,
Melo et al. 2006). Des niveaux plus élevés de leucine au cerveau représentent une
deuxième voie pouvant favoriser une synthèse plus importante du GABA chez les animaux
sous diète cétogène.
Figure 32 : Impact de la leucine hépatique sur la synthèse de l’acide -aminobutyrique
(GABA) au cerveau
La leucine et l’isoleucine, des acides aminés cétogènes, sont en compétition avec la
quantité importante d’acides gras, provenant de la diète cétogène, pour la synthèse des
cétones via l’acétyl-CoA. La leucine et l’isoleucine s’accumulent ainsi dans le foie. La
leucine traverse rapidement la barrière hémato-encéphalique et est impliqué dans la
synthèse du glutamate. L’augmentation de la leucine au cerveau peut ainsi favoriser une
synthèse plus importante de l’acide -aminobutyrique (GABA). OAA : oxaloacétate; CG : -cétoglutarate.
Notre étude suggère ainsi que l’augmentation du contenu en GABA, le principal
neurotransmetteur inhibiteur, en condition de cétose légère pourrait contribuer à l’effet
antiépileptique de la diète cétogène. De nombreux médicaments antiépileptiques agissent
d’ailleurs en augmentant l’efficacité de la neurotransmission GABAergique. La classe des
barbituriques agit notamment sur le récepteur GABA-A. Des niveaux plus élevés de GABA
pourraient aussi être bénéfique dans la maladie d’Alzheimer, où la neurotransmission
GABAergique est altérée (Lanctot et al. 2004). Une perte du nombre de terminaisons
GABAergiques a été retrouvée dans le cerveau de patients Alzheimer (Simpson et al.
130
1988). De plus, on note une diminution de la fonctionnalité, de l’expression de l’ARNm et
de la protéine des récepteurs GABA chez les patients Alzheimer (Limon et al. 2012).
8.2.3. L’effet de la diète cétogène sur le métabolisme du glucose
Suite à l’infusion de [1-13C]Glc, le métabolisme du glucose au cerveau était
majoritairement dans les astrocytes, étant donné un marquage plus important de la
glutamine sur le carbone 2, provenant de la conversion du pyruvate par la PC, une enzyme
exclusivement astrocytaire. Suite à l’infusion de [1-13C]Glc, le métabolisme du glucose au
niveau de la glycolyse était plus élevé chez les rats sous diète cétogène comparativement
aux rats contrôles. Malgré que la phosphorylation oxydative produit environ 15 fois plus
d’énergie que la glycolyse aérobie, cette dernière joue un rôle majeur au cerveau
(Bauernfeind et al. 2013). Elle maintient le turn-over des constituants neuronaux, tels que
les acides aminés et les acides gras, alors que l’énergie générée par la phosphorylation
oxydative est essentielle à l’activité synaptique. La glycolyse aérobie est aussi augmentée
lors d’une activation neuronale induite par une tâche cognitive (Vlassenko et al. 2006,
Kasischke et al. 2004). Ceci est en accord avec l’hypothèse de la navette astrocyte-neurone
du lactate (Figure 16) qui suggère que l’activation de la pompe Na+-K+-ATPase stimule la
voie de la glycolyse.
Nos résultats et l’hypothèse de la navette astrocyte-neurone du lactate ont mené à
l’élaboration du modèle présenté à la figure 33. En condition de diète cétogène, l’oxydation
des cétones au niveau du cycle de Krebs est augmentée dans les astrocytes, résultant en une
augmentation de la conversion du glutamate en glutamine. Plus de glutamine est ainsi
fournie aux neurones pour la synthèse du glutamate et du GABA, pouvant entraîner une
libération plus importante de ces deux neurotransmetteurs dans la fente synaptique et
augmenter leur recapture par l’astrocyte. Le transport du glutamate et du GABA dans
l’astrocyte s’accompagne d’une entrée de Na+, qui active la pompe Na+-K+-ATPase, qui
elle, stimule la voie de la glycolyse pour la production d’ATP (Pellerin et Magistretti
1994). Le pyruvate ainsi formé dans l’astrocyte peut être transformé en oxaloacétate pour
alimenter le cycle de Krebs, dont le flux est augmenté. Le lactate généré par la glycolyse
dans l’astrocyte peut aussi être transféré vers le neurone et utilisé comme substrat
énergétique pour assurer le maintien des fonctions neuronales. L’augmentation de la
131
synthèse de lactate pourrait aussi être due à une accumulation du pyruvate. En effet, sous
une diète cétogène, l’accumulation de l’acétyl-CoA peut inhiber l’enzyme PDH.
Figure 33 : Modèle des effets de la diète cétogène sur le métabolisme du glucose et des
cétones au cerveau
La diète cétogène a entraîné les effets suivants sur le métabolisme énergétique des cellules
du cerveau (indiqués par les flèches noires en gras): (i) un métabolisme oxydatif des
cétones dans l’astrocyte plus élevé, précisément un flux du cycle de Krebs plus élevé, (ii)
un contenu en acide -aminobutyrique (GABA), lorsqu’exprimé relativement au glutamate,
plus élevé et (iii) une conversion du glucose en lactate plus élevé. Ces observations peuvent
conduire aux effets suivants (indiqués par les flèches rouges) : (i) une augmentation de la
recapture du glutamate et du GABA par l’astrocyte, (ii) une importante activation de la
pompe Na+-K+-ATPase, stimulant la voie de la glycolyse pour la production d’ATP, (iii) la
transformation du pyruvate en oxaloacétate (OAA) afin d’alimenter le cycle de Krebs et
(iv) le transfert du lactate de l’astrocyte vers le neurone, où il sera utilisé comme substrat
énergétique. -CG : -cétoglutarate; PC : pyruvate carboxylase.
8.2.4. Les forces
Il s’agit de la première étude dans la littérature comparant le métabolisme du
glucose et du
13
13
C-
C--HB dans le cerveau d’animaux soumis à une diète cétogène. La
méthode de spectroscopie RMN a permis de mesurer un nombre important de métabolites
cérébraux et d’évaluer de façon exhaustive le métabolisme oxydatif du glucose et du -HB
dans les cellules du cerveau. Ainsi, cette étude complète très bien l’étude TEP de la capture
132
cérébrale du glucose et des cétones, où seulement l’entrée des substrats dans le cerveau
était mesurée.
8.2.5. Les limites
Le niveau des métabolites plasmatiques et des métabolites cérébraux sans l’infusion
des substrats marqués n’ont pas été mesurés. Il est donc impossible de réellement dissocier
l’effet de la diète cétogène et de l’infusion des substrats marqués. Par exemple, suite à
l’infusion de [1-13C]Glc chez les rats sous diète cétogène, la glycémie est montée à 25,6
mM et il est impossible de dissocier l’effet de cette hyperglycémie et l’effet de la diète
cétogène sur les métabolites cérébraux. Cette hyperglycémie a peut-être même atténuée
l’état de cétose induit par la diète cétogène. Le manque de sensibilité de la spectroscopie
RMN oblige en fait l’infusion d’une quantité minimale de substrat marqué au
13
C.
Toutefois, la comparaison entre les rats contrôles et les rats sous diète cétogène reste valide
puisque cette même quantité de glucose a aussi été infusée chez les rats contrôles.
Les enrichissements en
13
C des métabolites dans le plasma n’ont pas été mesurés.
Ceci aurait pu apporter à la compréhension des observations faites au niveau du cerveau,
l’approvisionnement du cerveau en substrats énergétiques se faisant par la circulation
sanguine. De plus, nous aurions pu corriger les enrichissements en
13
C des métabolites
cérébraux (Table 2 p.78) par l'enrichissement en 13C du glucose et -HB plasmatique. Ceci
aurait pu corriger pour les différences dans la glycémie et la cétonémie retrouvées entre les
rats contrôles et les rats sous diète cétogène. Les données brutes et les données normalisées
auraient pu être mentionnées dans le texte de la section des résultats de l’article afin de bien
présenter les différences observées entre les deux méthodes de calcul.
8.3. L’effet de la restriction calorique sur le métabolisme cérébral chez des rats
âgés (article 3)
En plus de la diète cétogène étudiée dans les articles 1 et 2, nous avons évalué
l’impact d’une deuxième condition cétogène, la restriction calorique à long terme, sur les
métabolites, les acides gras et les transporteurs des substrats énergétiques dans le cerveau
de rats jeunes nourris ad libitum, de rats âgés nourris ad libitum et de rats âgés sous
restriction calorique de 40% depuis environ un an. Une diète riche en sucrose et faible en
133
AGPI n-3 a été utilisée pour les trois groupes dans le but de mimer la diète de type
occidental. Dans ce contexte nutritionnel, la restriction calorique à long terme chez les rats
âgés n’a pas modifié le profil des métabolites et des acides gras du cerveau.
8.3.1. Les métabolites cérébraux
La spectroscopie RMN du 1H nous a permis de mesurer des molécules impliquées
dans les quatre grandes fonctions cellulaires suivantes : (i) le métabolisme énergétique (HB,
lactate,
alanine,
créatine),
(ii)
le
métabolisme
membranaire
(choline,
glycérophosphocholine, N-acétylaspartate), (iii) les neurotransmetteurs (glutamine,
glutamate, GABA, aspartate) et (iv) les antioxydants et osmolytes (taurine, myo-inositol,
glutathion).
Nous avons retrouvé un contenu au cerveau plus élevé de la majorité des métabolites
analysés par spectroscopie RMN chez les rats âgés comparativement aux rats jeunes. Parmi
les explications les plus plausibles d’une augmentation générale des métabolites, on compte
celle de Chang L. et al. (1996) qui ont proposé qu’une augmentation de la densité du
cerveau survienne au cours du vieillissement. En effet, ils ont retrouvé une diminution
significative du contenu en eau dans le cerveau de personnes âgées. Une seconde
explication réside dans l’augmentation de la perméabilité de la BHE retrouvée chez les rats
âgés dans l’article 1. La pénétration de l’agent de contraste utilisé dans cet article était plus
élevée dans le cerveau des rats âgés. On peut ainsi imaginer que certains métabolites
traversent plus librement la BHE du sang vers le cerveau chez les rats âgés.
Le contenu plus élevé des métabolites cérébraux chez les rats âgés peut aussi être le
résultat d’un phénomène compensatoire afin de contrebalancer certaines dysfonctions du
métabolisme cérébral associées au vieillissement. Ceci concorde avec la capture du glucose
plus élevée dans la région de l’hippocampe chez les rats âgés retrouvée dans l’article 1. Le
contenu en glucose n’a toutefois pas pu être mesuré dans la présente étude étant donné que
le pic du glucose est masqué par d’autres pics sur les spectres 1H de cerveau (Govindaraju
et al. 2000). Tel que discuté dans la section sur la capture cérébrale du glucose, il pourrait
s’agir d’un phénomène transitoire, qui pourrait disparaître chez des rats plus âgés que 19
mois. Des patrons différents de concentration des métabolites dans le cortex cérébral ont
d’ailleurs été retrouvés chez des rats âgés de 18 et 30 mois (Paban et al. 2010).
134
D’un autre point de vue, le contenu plus élevé des métabolites cérébraux chez les rats
âgés peut être dû à une diminution de leur dégradation, suite à une réduction de l’activité de
différentes enzymes au niveau du cerveau. L’activité des enzymes glucokinase (Lee et al.
2013), PDH, isocitrate déshydrogénase (Vitorica et al. 1981) et des complexes de la chaîne
de transport des électrons des mitochondries (Yao et al. 2010, Zhou et al. 2009, Navarro et
al. 2002) est diminuée dans le cerveau de rongeurs âgés. Certains intermédiaires du cycle
de Krebs peuvent ainsi s’accumuler en raison d’une moins grande utilisation. Dans notre
étude, le glutamate, la glutamine et le GABA étaient plus élevés chez les rats âgés et ces
trois métabolites sont d’ailleurs issus d’un intermédiaire du cycle de Krebs, l’cétoglutarate. L’aspartate, qui était aussi plus élevé, est issu de l’oxaloacétate. Une
concentration plus élevée du pyruvate et du fructose-6-phosphate dans le cerveau de rats
âgés a aussi été démontrée dans la littérature (Hoffman et al. 1985) et pourrait être due à
une diminution de certaines enzymes de la glycolyse, qui pourrait aussi expliquer le niveau
de lactate plus élevé que nous avons retrouvé. Une diminution des enzymes de la glycolyse
et du cycle de Krebs avec l’âge concorde avec la diminution du contenu en ATP (Hoyer
1985, Zhou et al. 2009) et de la production de CO2 par la voie glycolyse-cycle de Krebs
(Zubairu et al. 1983) retrouvée dans le cerveau de rats âgés. De plus, une diminution de
l’activité de l’enzyme glutaminase, qui convertit la glutamine en glutamate (de Almeida et
al. 1989), de l’enzyme choline acétyltransférase, qui convertit la choline en acétylcholine,
et de l’enzyme glutamate décarboxylase, qui convertit le glutamate en GABA (Monti et al.
2004), est retrouvée dans le cerveau de rats âgés, pouvant altérer les niveaux de ces
métabolites. Comme retrouvé dans notre étude, une élévation du contenu cérébral en myoinositol, choline et créatine a aussi été observée au cours du vieillissement chez le rat
(Paban et al. 2010) et chez l’humain (Chang et al. 1996).
8.3.2. Les acides gras cérébraux
8.3.2.1.
L’effet du vieillissement
Chez les deux groupes de rats âgés (nourris ad libitum et sous restriction calorique),
un pourcentage plus élevé des acides gras monoinsaturés (AGMI) a été observé, qui était
compensé par des pourcentages plus faibles des AGPI n-6 et n-3. Le pourcentage de DHA
était 38-47% plus faible par rapport aux rats jeunes. Le DHA est l’AGPI n-3 majoritaire
135
dans les membranes des cellules du cerveau (Innis 1991), ce qui indique que d’importantes
modifications dans la composition membranaire sont subvenues chez les rats âgés. Une
perte des AGPI n-3 dans le cerveau de rats âgés a été observée par d’autres équipes (Latour
et al. 2013, Lopez et al. 1995, Favreliere et al. 2003). Certaines études in vitro ont
démontré que les AGMI sont des acides gras résistants au phénomène de peroxydation,
alors que les AGPI n-3 sont plus sujets à la peroxydation (Hulbert 2005). En effet, la
susceptibilité à la peroxydation augmente avec le nombre d’insaturation des phospholipides
membranaires. Les ponts méthylènes (-CH2-), retrouvés entre les doubles liaisons,
possèdent des atomes d’hydrogène très réactifs (Figure 34).
Figure 34 : Processus de peroxydation lipidique in vitro
La peroxydation lipidique est l’oxydation des lipides insaturés par des espèces réactives de
l’oxygène (ERO). Entre les doubles liaisons se retrouvent les ponts méthylènes (-CH2-), qui
possèdent des atomes d’hydrogène très réactifs et qui se lient avec les ERO. Ceci entraîne
la formation d’un radical d’acide gras peroxyl qui va réagir avec un deuxième acide gras
insaturé pour donner un peroxyde d’acide gras et à nouveau un radical d’acide gras. La
peroxydation lipidique devient donc rapidement un cercle vicieux. ERO : espèce réactive
de l’oxygène. Adapté de http://en. wikipedia.org/wiki/Lipid_peroxidation.
136
La peroxydation lipidique est un phénomène causé par le stress oxydatif et la
présence des ERO, qui seraient en partie la cause du phénomène de vieillissement (Harman
1972). Ainsi, l’augmentation des AGMI au cerveau, au dépend des AGPI n-3, pourrait être
un mécanisme mis en place au cours du vieillissement, dans le but de contrecarrer le stress
oxydatif. Hulbert AJ (2005, 2007) a élaboré la membrane pacemaker theory, dans laquelle
il propose que la composition des membranes en acides gras ait un impact majeur sur le
phénomène de peroxydation lipidique et conséquemment, sur la vitesse de vieillissement et
la durée de vie d’un organisme. Toutefois, les propriétés antioxydantes du DHA ont été
démontrées à maintes reprises (Cunnane et al. 2009), notamment dans des études in vivo
chez des modèles animaux de la maladie d’Alzheimer (Cole et al. 2005, Hashimoto et al.
2002).
Dans la présente étude, le pourcentage plus faible d’AGPI n-3 dans le cerveau des
rats âgés est aussi certainement attribuable à la diète en soi, qui était très faible en AGPI n-3
(AGPI n-6/n-3= 57). Un apport limité en AGPI n-3 pendant plus de 50% de la durée de vie
des rats a pu diminuer l’incorporation de ces acides gras dans le cerveau des rats âgés
comparativement aux rats jeunes. Toutefois, nous avons aussi observé un pourcentage plus
faible d’AGPI n-6 chez les rats âgés, malgré un apport bien au-dessus des niveaux
recommandés. Les recommandations de l’AIN-93G sont un ratio AGPI n-6/n-3=7 chez le
rat adulte (comparativement à 57 dans notre étude) (Reeves et al. 1993).
De façon intéressante, il a été montré que l’apport alimentaire en AGPI n-3 module le
métabolisme énergétique cérébral chez le rat. En effet, des rats déficients en AGPI n-3
présentent une diminution de l’expression du gène et de la protéine GLUT1 (Pifferi et al.
2005b, Harbeby et al. 2012), de l’utilisation du glucose (3H-O-méthyle-glucose) et de
l’activité de l’enzyme cytochrome C oxydase dans le cortex cérébral (Ximenes da Silva et
al. 2002). Ainsi, un apport suffisant en AGPI n-3 est peut-être nécessaire pour maintenir un
fonctionnement adéquat du métabolisme énergétique cérébral chez les rats âgés. Un faible
apport alimentaire en DHA est d’ailleurs associé à un plus haut risque de déclin cognitif
chez les personnes âgées (Cunnane et al. 2009).
137
8.3.2.2.
L’effet de la restriction calorique
De façon générale, le profil d’acides gras du cerveau n’a pas été modifié par la
restriction calorique chez les rats âgés. La seule différence significative entre les rats âgés
nourris ad libitum et les rats âgés sous restriction calorique était au niveau de l’acide
docosapentaénoique (22:5 n-3), un acide gras minoritaire dans le cerveau des rats. Ces
résultats vont à l’encontre de notre hypothèse de départ proposant que les profils d’acides
gras chez les rats âgés en restriction calorique soient similaires à ceux des rats jeunes,
comparativement aux rats âgés. En effet, nous aurions pu nous attendre à des modifications
des profils d’acides gras chez les rats âgés sous restriction calorique, étant donné que des
études chez de jeunes rongeurs ont montré des changements de la composition en acides
gras du cerveau (Faulks et al. 2006) et du cœur (Pamplona et al. 2002) suite à une
restriction calorique. Dans notre étude, la restriction calorique a même eu tendance à
exacerber l’effet du vieillissement. Comparativement aux rats âgés nourris ad libitum, les
rats âgés en restriction calorique avaient une tendance à un plus grand pourcentage
d’AGMI (31,6% vs. 34,3%) et un plus faible pourcentage d’AGPI n-3 (10,3% vs. 8,4%).
Ceci peut être tout simplement dû à la réduction de 40% de l’apport en AGPI n-3 chez les
rats âgés en restriction calorique par rapport aux rats âgés nourris ad libitum.
8.3.3. Les transporteurs des substrats énergétiques au cerveau
8.3.3.1.
L’effet du vieillissement
Aucune différence des transporteurs des cétones MCT dans le cortex cérébral et les
cellules endothéliales n’a été observée entre les rats âgés nourris ad libitum et les rats
jeunes. Ceci concorde avec les résultats de l’article 1 ne démontrant aucun changement de
la capture cérébrale des cétones par imagerie TEP chez les rats âgés. Nous avons retrouvé
une expression plus élevée des transporteurs GLUT1 dans les cellules endothéliales de la
BHE des rats âgés nourris ad libitum comparativement aux rats jeunes. Ce résultat
concorde avec la capture cérébrale du glucose plus élevée retrouvée pour certaines régions
du cerveau (hippocampe et striatum) chez les rats âgés dans l’article 1. Une consommation
plus élevée du glucose par le cerveau est généralement associée à une activation neuronale
plus importante. Ceci réfère au concept de couplage neurovasculaire métabolique
(Paemeleire 2002, Magistretti et Pellerin 1999, Leybaert 2005). Ainsi, les rats âgés
138
pourraient présenter une activation plus importante de certaines régions du cerveau, ce qui
pourrait aussi expliquer une élévation de l’ensemble des métabolites cérébraux analysés par
RMN.
Considérant les changements des profils en acides gras chez les rats âgés nourris ad
libitum, l’expression plus élevée du transporteur GLUT1 peut aussi être liée à des
changements structuraux et fonctionnels des membranes cellulaires au cerveau. Les acides
gras membranaires sont majoritairement des AGPI qui comprennent des doubles liaisons,
engendrant différentes courbures dans leur chaîne hydrocarbonée. Les AGPI peuvent ainsi
adopter différentes conformations dans la membrane et modulent la fluidité et la
perméabilité membranaire (Stillwell et Wassall 2003). De plus, les AGPI sont impliqués
dans la formation des rafts lipidiques, qui sont des microdomaines membranaires favorisant
l’activité de certaines protéines.
8.3.3.2.
L’effet de la restriction calorique
Une expression plus faible du transporteur des cétones MCT1 dans les cellules
endothéliales de la BHE a été retrouvée chez les rats âgés sous restriction calorique
comparativement aux rats âgés nourris ad libitum. Il s’agit de l’unique différence observée
au niveau du cerveau entre les rats âgés sous restriction calorique et les rats âgés nourris ad
libitum. Il faut noter que parmi les métabolites cérébraux analysés par RMN, le -HB est le
seul métabolite qui tendait à être plus élevé chez les rats âgés en restriction calorique
comparativement aux rats âgés nourris ad libitum. Les autres métabolites tendaient à être
plus faibles chez les rats âgés en restriction calorique comparativement aux rats âgés
nourris ad libitum. À la lumière de ce résultat, nous aurions pu nous attendre à une
expression plus élevée des transporteurs MCT chez les rats en restriction calorique. En
effet, l’expression des transporteurs MCT est corrélée de façon positive avec l’utilisation
des cétones par le cerveau chez des rats nouveau-nés (Hawkins et Biebuyck 1979,
Vannucci et Simpson 2003) et des rats adultes sous diète cétogène (Leino et al. 2001).
Toutefois, il a été montré que des conditions où le métabolisme énergétique périphérique
est modifié à long terme, telles que l’obésité et le diabète, modulent l’expression de MCT1
au cerveau (Pierre et al. 2007). Les mécanismes moléculaires responsables de ces effets
sont encore mal définis (Halestrap et Wilson 2012). Toutefois, il a été montré que les
139
cellules du cerveau présentent des pools intracellulaires du transporteur MCT qui
pourraient réguler la translocation du transporteur à la membrane (Johannsson et al. 2001,
Bergersen et al. 2005). Ces pools pourraient représenter un site de régulation de
l’expression des MCT sensible au métabolisme énergétique.
8.3.4. L’effet d’une diète riche en sucrose
Les rats âgés sous restriction calorique avaient un poids corporel inférieur à celui
des rats âgés nourris ad libitum, un changement standard dans des conditions de restriction
calorique. La perte de gras est le principal changement phénotypique observé chez des
animaux en restriction calorique (Barzilai et Gabriely 2001). Celle-ci stimule l’oxydation
des acides gras et augmente leur utilisation comme substrat énergétique par l’organisme
(Koubova et Guarente 2003). Toutefois, dans notre étude, la restriction calorique n’a
entraîné aucune modification du glucose et de l’insuline plasmatique chez les rats.
L’amélioration de la sensibilité à l’insuline est l’un des effets principaux normalement
retrouvés suite à une restriction calorique (Barzilai et al. 1998, Dhahbi et al. 2001, Lane et
al. 1999). La diète riche en sucrose consommée pendant près d’un an chez les deux groupes
de rats âgés dans notre étude a pu engendrer cette absence d’effet. Les niveaux de glucose
et d’insuline plasmatiques tendaient même à être plus élevés chez les deux groupes de rats
âgés comparativement aux rats jeunes, indiquant l’installation d’un état de résistance à
l’insuline. Conséquemment à ceci, les niveaux de -HB plasmatiques étaient
significativement plus bas chez les deux groupes de rats âgés (données non publiées).
Le sucrose est un disaccharide composé d’une molécule de glucose et d’une
molécule de fructose. Le fructose est un isomère du glucose; il a la même formule
chimique, mais diffère au niveau de sa structure. La diète de type occidental est riche en
fructose, qui se retrouve majoritairement dans les sucres ajoutés et le sirop de maïs. La
consommation d’une diète riche en fructose conduit au développement d’une dyslipidémie
et de la résistance à l’insuline chez les rongeurs (Thresher et al. 2000, Le et Tappy 2006).
La métabolisation du fructose se fait entièrement au niveau du foie par une voie distincte de
la glycolyse. Le fructose évite ainsi l’étape limitante catalysée par la phosphosfructokinase
dans la glycolyse. La diète riche en fructose entraîne donc un apport massif de carbones
dans le foie qui sont redirigés vers la lipogenèse, pouvant conduire au syndrome
140
métabolique (Le et Tappy 2006). Une étude chez le rat comparant le sucrose, le glucose et
le fructose a démontré que le fructose est le nutriment principal induisant la résistance à
l’insuline (Thresher et al. 2000). La diète riche en fructose est même utilisée pour
modéliser le diabète de type 2 chez le rat (Cohen et al. 1977) et évaluer l’effet de
traitements pharmacologiques (Lee et al. 1994).
Les diètes utilisées dans la présente étude comprenaient 25% de fructose (50% de
sucrose) et une résistance à l’insuline a été démontrée à partir d’un apport de 10% de
fructose chez le rat (Alzamendi et al. 2012, Ohnogi et al. 2012). Les recommandations de
l’AIN-93G sont de 100 g/kg de sucrose (comparativement à 500 g/kg dans notre
étude)(Reeves et al. 1993). Les niveaux plus élevés de glucose et d’insuline chez les deux
groupes de rats âgés peuvent aussi être en partie dus au vieillissement. Des changements du
métabolisme glucidique et de l’action de l’insuline sont retrouvés au cours du
vieillissement (Basu et al. 2007).
Les niveaux d’acides gras et de métabolites cérébraux chez les rats âgés sous
restriction calorique n’ont pas été rétablis aux niveaux des rats jeunes, contrairement à notre
hypothèse de départ. La diète riche en sucrose a pu à nouveau engendrer cette absence
d’effet. Le cerveau a longtemps été perçu comme un organe insensible à l’insuline, les
principaux transporteurs du glucose exprimés (GLUT1 et GLUT3) étant insensibles à
l’insuline. Cependant, plusieurs évidences récentes ont démontré le contraire. Les
récepteurs à l’insuline sont exprimés de façon répandue dans le cerveau, notamment dans
l’hippocampe (Werther et al. 1987, Hill et al. 1986). L’expression des transporteurs
GLUT4 (sensible à l’insuline) et leur colocalisation avec les récepteurs à l’insuline ont été
retrouvées dans les cellules de l’hippocampe et l’injection intracérébroventriculaire
d’insuline induit une translocation des transporteurs GLUT4 à la membrane (Grillo et al.
2009). Les rats sous diète riche en fructose ont une atteinte des fonctions de mémoire et
d’apprentissage spatial, accompagnée d’une diminution de la voie de signalisation de
l’insuline dans l’hippocampe et le cortex cérébral (Ross et al. 2009, Stranahan et al. 2008,
Mielke et al. 2005). De plus, la résistance à l’insuline diminue la capture cérébrale du
glucose chez des personnes pré-diabétiques (Baker et al. 2011).
La diète occidentale est caractérisée à la fois par une déficience en AGPI n-3 et une
teneur élevée en sucrose et/ou fructose. Toutefois, un apport alimentaire adéquat en AGPI
141
n-3 permet de contrecarrer les effets métaboliques néfastes causés par une consommation
élevée de fructose (Simopoulos 2013). Une étude chez le rat a démontré qu’une déficience
en AGPI n-3 accentue les dysfonctions de la voie de signalisation de l’insuline au cerveau
et les déficits de mémoire induits par le fructose (Agrawal et Gomez-Pinilla 2012). Dans
cette même étude, une supplémentation en AGPI n-3 a rétabli ces dysfonctions. Les auteurs
ont proposé que la déficience en AGPI n-3 perturbe la fonctionnalité des membranes
cellulaires du cerveau, entraînant la diminution de la phosphorylation du récepteur à
l’insuline.
À la lumière de ces résultats, nous proposons que la restriction calorique n’ait des
effets bénéfiques sur le fonctionnement du cerveau que lorsqu’elle est couplée à une diète
équilibrée, sans déficience en AGPI n-3 ou enrichie en fructose. D’un point de vue clinique,
une diminution de l’apport calorique n’est peut-être pas suffisante pour observer des effets
neuroprotecteurs; la qualité des nutriments semble avoir un rôle majeur.
8.3.5. Les forces
Il s’agit de la première étude des métabolites cérébraux mesurés par spectroscopie
RMN chez des rats âgés soumis à une restriction calorique. Nous avons utilisé la méthode
de HRMAS, qui n’est pas encore possible avec tous les spectromètres, et qui permet
l’acquisition de spectres hautement résolus, sans étape d’extraction à partir du tissu, évitant
ainsi la perte de matériel. Les diètes riches en sucrose et faibles en AGPI n-3 ont permis
d’évaluer quel pourrait être l’effet réel au cerveau d’une restriction calorique si elle était
appliquée à l’homme, dans les populations occidentales, qui consomment de façon générale
une alimentation riche en sucre et faible en AGPI n-3 (Basciano et al. 2005, Simopoulos
1991).
8.3.6. Les limites
Les animaux utilisés dans la présente étude provenaient de la colonie de rats du Réseau
Québécois de Recherche sur le Vieillissement, à l’Université de Montréal. Nous n’avons
donc pris aucune décision concernant les différents groupes d’études (diètes, nombre
d’animaux). Dans la présente étude, il est impossible de dissocier l’impact d’une diète de
type occidental et l’effet d’une restriction calorique à long terme sur le métabolisme
142
cérébral. Il aurait donc été intéressant d’avoir en parallèle les mêmes trois groupes de rats
sous une diète équilibrée en sucrose et en AGPI n-3.
De plus, le petit nombre d’animaux par groupe peut avoir contribué à l’absence de
différence statistique des métabolites cérébraux, notamment pour le NAA, le GABA, le
glutamate et la GPC, entre les rats âgés en restriction calorique et les rats âgés nourris ad
libitum. Le groupe de rats âgés nourris ad libitum avait un
5 et ce dû à une mortalité
importante vers l’âge de 18 mois des rats âgés nourris ad libitum dans la colonie de rats du
Réseau Québécois de Recherche sur le Vieillissement.
Enfin, les résultats des métabolites cérébraux sont seulement applicables au cortex
frontal et non au cerveau entier. Des différences significatives des métabolites cérébraux
ont effectivement été observées entre différentes régions du cerveau chez le rat (Paban et
al. 2010). D’autres régions pertinentes au vieillissement et au déclin cognitif auraient pu
être analysées, soit le cortex pariétal, le cortex temporal et l’hippocampe.
8.4. Résumé des effets observés dans les trois articles
8.4.1. Les effets du vieillissement sur le métabolisme cérébral
Les changements associés au vieillissement observés dans les articles 1 et 3 sont
résumés à la figure 35 et illustrés en bleu. Les rats âgés présentaient une élévation : (i) de la
perméabilité de la BHE, (ii) de l’expression des transporteurs du glucose (GLUT1) dans les
cellules endothéliales de la BHE, (iii) de la capture cérébrale du glucose dans la région de
l’hippocampe, (iv) du contenu des métabolites cérébraux et (v) des AGMI.
143
Figure 35 : Résumé des effets du vieillissement sur le métabolisme cérébral observés
dans les articles 1 et 3
8.4.2. Les effets de la diète cétogène sur le métabolisme cérébral
Grâce à la complémentarité des articles 1 et 2, nous avons démontré que la diète
cétogène administrée chez le rat engendre une capture plus élevée des deux principaux
substrats énergétiques du cerveau, le glucose et les cétones, qui est aussi accompagnée de
leur métabolisme plus élevé, majoritairement dans les astrocytes (Figure 36). Plus
précisément, la diète cétogène entraîne une vitesse d’oxydation des cétones plus élevée au
niveau du cycle de Krebs et une stimulation de la voie de la glycolyse. Ainsi, nous pouvons
penser qu’une capture du glucose et des cétones plus élevée n’entraîne pas une
accumulation de ces substrats énergétiques au cerveau, étant donné que leur métabolisation
est aussi plus élevée. Les effets observés dans les articles 1 et 2 sont indiqués par les
flèches noires en gras à la figure 36. Ces résultats peuvent conduire aux effets indiqués par
les flèches rouges.
144
Figure 36 : Résumé des effets de la diète cétogène sur le métabolisme cérébral
observés dans les articles 1 et 2
8.4.3. La relation entre la diète cétogène et la restriction calorique
Les effets de la restriction calorique et des cétones peuvent être similaires et parfois
confondus dans la littérature. L’état de restriction calorique est atteint selon deux
méthodes : (i) une réduction quotidienne de la consommation alimentaire ou (ii) un jeûne
intermittent. Les deux approches peuvent entraîner une augmentation des cétones
plasmatiques, mais la deuxième méthode engendre une hausse plus élevée des cétones et est
associée à une réduction plus importante des crises épileptiques (Mattson 2003, Mattson et
Wan 2005). Les mécanismes responsables des effets anticonvulsivants de la restriction
calorique seraient aussi similaires à ceux de la diète cétogène (Greene et al. 2001). De plus,
les protocoles de diète cétogène sont souvent associés à une diminution de l’apport
calorique chez les animaux, due au goût désagréable de la diète et au temps d’adaptation à
ce nouveau régime (Gasior et al. 2006).
145
Dans l’article 3, la restriction calorique n’a pas induit un niveau plus élevé des cétones
plasmatiques comparativement aux rats âgés nourris ad libitum (-HB = 197 M; données
non publiées). Il est toutefois difficile d’identifier si les effets de la restriction calorique
étaient confondus ou non avec ceux des cétones puisqu’il a été montré que le processus de
cétose au cerveau est maintenu malgré un retour à la normale du niveau des cétones
plasmatiques (Taha et al. 2005). Maalouf et al. (2009) ont proposé que les cétones soient
responsables des effets neuroprotecteurs de la restriction calorique, notamment par leur
action sur la fonction mitochondriale. Au niveau périphérique, une récente étude chez
l’homme a démontré que la diète cétogène et la restriction calorique augmentent toutes
deux la sensibilité à l’insuline, mais avec un effet plus prononcé pour la diète cétogène
(Partsalaki et al. 2012).
146
9. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Le présent travail a permis de montrer que le contenu en GABA, le principal
neurotransmetteur inhibiteur, est plus élevé chez les rats sous diète cétogène, ce qui pourrait
contribuer à l’effet antiépileptique de la diète cétogène, celle-ci étant utilisée depuis
plusieurs décennies dans les cas d’épilepsie réfractaire. Les résultats obtenus ont aussi
permis d’établir que la capture cérébrale du glucose et des cétones est plus élevée chez les
rats sous diète cétogène, ce qui est aussi accompagné d’un métabolisme plus important du
glucose et des cétones dans les cellules du cerveau. Les résultats de la capture et du
métabolisme sont ainsi très concordants. Ces changements métaboliques associés à la diète
cétogène pourraient être à l’origine de ses effets neuroprotecteurs. L’augmentation des
réserves énergétiques pour le cerveau permettrait aux cellules du cerveau d’être plus
résistantes à des problèmes métaboliques. D’un point de vue clinique, considérant que les
personnes atteintes de déclin cognitif présentent une diminution de la capture cérébrale du
glucose, l’élévation des cétones, par le biais d’une diète cétogène ou autre, pourrait
permettre la prévention du déclin cognitif en fournissant les substrats énergétiques
nécessaires au bon fonctionnement du cerveau (voir annexe 2 pour la liste des contributions
de cette thèse).
Suite à ces études et afin de valider ces dernières hypothèses, nous suggérons
d’évaluer les effets de la diète cétogène chez un modèle animal présentant une diminution
de la capture cérébrale du glucose et un déclin des fonctions cognitives (Tableau 2). La
souris triple transgénique modèle de la maladie d’Alzheimer pourrait être utilisée
puisqu’elle présente une diminution de la capture cérébrale du
18
F-FDG dès l’âge de 12
mois (Nicholson et al. 2010). Le métabolisme du glucose et des cétones pourrait être évalué
par spectroscopie RMN in vivo. Cette modalité permet la mesure réelle du métabolisme
cérébral et est disponible dans certains centres. La corrélation entre les paramètres du
métabolisme énergétique cérébral mesurés lors de nos études et les tests comportementaux
évaluant les fonctions cognitives, telles que la mémoire et l’apprentissage, pourrait être
évaluée.
Chez l’homme adulte, la compliance pour la diète cétogène est très difficile puisqu’il
s’agit d’une diète très restrictive, au niveau des glucides, et riche en gras. Son utilisation
147
chez des populations de personnes âgées à risque de déclin cognitif n’est donc pas
envisageable. Une approche plus simple que la diète cétogène pour induire une cétose
légère pourrait être la restriction calorique. Toutefois, les résultats obtenus au cours de ce
travail ont permis d’établir que la restriction calorique doit être effectuée dans le cadre
d’une diète équilibrée pour observer des effets bénéfiques au cerveau et non dans le
contexte d’une déficience en AGPI n-3 et une surcharge de sucrose, tel est le cas dans la
diète de type occidental.
Tableau 2 : Conclusions de la thèse et perspectives
148
10. REMERCIEMENTS
D’abord et avant tout, je souhaite adresser mes plus sincères remerciements à mon
directeur de thèse, professeur Stephen Cunnane, de m’avoir accueilli si chaleureusement
dans son équipe. Tu as su me transmettre à merveille ta passion contagieuse pour le
fonctionnement du cerveau. Merci de m’avoir fait confiance à 100% et de m’avoir laissé la
liberté dans mes idées et la liberté d’entreprendre les projets en lesquels je croyais. Tu as
ainsi créé un milieu idéal pour me permettre d’évoluer au maximum en tant que chercheure.
Merci pour les nombreuses relectures et d’avoir poussé mon soucis du détail encore plus
loin.
Je tiens à remercier les membres du jury, les professeurs Rona Graham, Xavier Roucou
et Grant Mitchell, d’avoir accepté d’évaluer ce manuscrit de thèse.
Je souhaite remercier chaleureusement toute l’équipe du professeur Cunnane. Merci
Jennifer pour toutes les heures passées au TEP et pour ta grande énergie. J’ai toujours pu
compter sur toi. Merci Mélanie, tu as été d’une grande aide pour la logistique de mes
projets et m’a toujours donné de judicieux conseils. Merci Scott de ton aide précieuse pour
la conversion de mes images TEP, pour démystifier le logiciel PMOD et pour tes
encouragements tout au long de ma thèse. Merci Alexandre C, tu as été une source de
littérature incroyable et a toujours su répondre à mes questions théoriques. Merci Marie
pour notre collaboration sur les profils lipidiques, pour les relectures, pour les nombreux
conseils lors de la rédaction de ma thèse et pour ton support lors de cette dernière année.
Merci Valérie pour ta participation dans le projet de restriction calorique. Tu as été la
première étudiante sous mon aile et tu as été une excellente stagiaire! Merci Alexandre CL,
tu avais toujours une solution à mes problèmes informatiques et était de très bons conseils
lors de la création de figures. Merci Raphaël pour nos échanges et nos discussions dans le
5607. Merci aussi à tous les étudiants et professeurs de l’unité 56, au centre de recherche
sur le vieillissement, pour nos échanges scientifiques et pour vos délicieux desserts
dégustés lors des pauses «cochonnes».
Merci à toute l’équipe du Centre d’Imagerie Moléculaire de Sherbrooke pour votre
aide précieuse lors des acquisitions. Merci Sébastien pour tes nombreux trucs lors des
acquisitions TEP, d’être aussi passionné et d’avoir partagé ta grande expertise avec moi.
149
Merci Jean-François pour ton implication à 100% pour chacune des acquisitions, pour ta
patience et ta bonne humeur contagieuse. Merci Luc, Mélanie, Caroline, Véronique,
Michel, Jacques et Otman pour votre aide lors du projet TEP-IRM; votre porte était
toujours ouverte pour mes questions et je l’apprécie grandement. Merci au professeur
M’hamed Bentourkia pour les longues discussions que nous avons eu sur le traitement
d’images et merci au professeur Roger Lecomte pour son implication dans l’article vidéo
du Journal of Visualized Experiements.
Un merci particulier aux Dr Anne-Karine Bouzier-Sore, Marie-Christine Beauvieux et
Jean-Louis Gallis au CHU de Bordeaux. Merci pour votre accueil chaleureux à Bordeaux,
malgré toute cette pluie... Merci pour votre grande expertise en RMN que vous avez su me
transmettre. Merci pour les nombreuses conférences skype et les relectures de manuscrits.
Ce fut une chance unique que de collaborer avec vous au cours de ma thèse. Merci aussi à
toute l’équipe du centre de résonance magnétique de Bordeaux, particulièrement Jérôme,
Gérard, Denis, Éric et Stéphane pour votre aide précieuse à l’animalerie et au spectro.
J’espère que le 500DPX s’est remis de son marathon lors de ma dernière visite.
Enfin, je tiens à remercier sincèrement mes proches pour leur présence et leur support
inconditionnel tout au long de ma thèse. Merci à mes parents pour leur grande écoute et
leurs nombreux encouragements. Un énorme merci de m’avoir permis de partir étudier en
France. Ce fut l’expérience la plus extraordinaire de ma vie et c’est là que mon histoire
d’amour pour le cerveau a débutée. Merci Maxime d’avoir été présent depuis le début et à
chacune des étapes de ma thèse. Tu as été un réel mentor scientifique pour moi. Merci pour
ta compréhension et pour les nombreuses heures que tu as passées à me donner conseil.
C’est grâce à ton soutien que j’ai pu traverser toutes les étapes de mon doctorat. Je tiens à te
dédier cette thèse.
150
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173
12. ANNEXES
12.1 Annexe 1: Article méthodologique dans Journal of Visualized Experiments
Cet article comprend un vidéo et le manuscrit ci-dessous (2013 Dec 28;(82):50761).
TITLE: A dual tracer PET-MRI protocol for the quantitative measure of regional brain
energy substrates uptake in the rat
AUTHORS: Maggie Roy, Scott Nugent, Sébastien Tremblay, Maxime Descoteaux, JeanFrançois Beaudoin, Luc Tremblay, Roger Lecomte and Stephen C. Cunnane.
Maggie Roy
Research Center on Aging and Department of Physiology and Biophysics
Université de Sherbrooke
Sherbrooke, Canada
[email protected]
Tel.: +1 819 780 2220 ext 45393
Scott Nugent
Research Center on Aging and Department of Physiology and Biophysics
Université de Sherbrooke
Sherbrooke, Canada
[email protected]
Sébastien Tremblay
Sherbrooke Molecular Imaging Center, Étienne-Le Bel Clinical Research Center
Université de Sherbrooke
Sherbrooke, Canada
[email protected]
Maxime Descoteaux
Department of computer science
Université de Sherbrooke
Sherbrooke, Canada
[email protected]
Jean-François Beaudoin
Sherbrooke Molecular Imaging Center, Étienne-Le Bel Clinical Research Center
Université de Sherbrooke
Sherbrooke, Canada
[email protected]
Luc Tremblay
Sherbrooke Molecular Imaging Center, Étienne-Le Bel Clinical Research Center
Université de Sherbrooke
174
Sherbrooke, Canada
[email protected]
Roger Lecomte
Sherbrooke Molecular Imaging Center, Étienne-Le Bel Clinical Research Center
Department of Nuclear Medicine and Radiobiology
Université de Sherbrooke
Sherbrooke, Canada
[email protected]
Stephen C. Cunnane
Research Center on Aging and Department of Physiology and Biophysics
Université de Sherbrooke
Sherbrooke, Canada
[email protected]
CORRESPONDING AUTHOR: Maggie Roy
KEYWORDS: Positron emission tomography (PET), 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG),
11
C-acetoacetate (11C-AcAc), magnetic resonance imaging (MRI), kinetic modeling,
cerebral metabolic rate, rat
SHORT ABSTRACT:
Small-animal positron emission tomography enables the assessment of the brain’s two main
energy substrates – glucose and ketones. In the present method, 11C-acetoacetate and 18Ffluorodeoxyglucose are injected sequentially in each animal, and their uptake is measured
quantitatively in specific brain regions determined from the magnetic resonance images.
LONG ABSTRACT:
We present a method for comparing the uptake of the brain’s two key energy substrates:
glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the rat. The developed method is
a small-animal positron emission tomography (PET) protocol, in which 11C-AcAc and 18Ffluorodeoxyglucose (18F-FDG) are injected sequentially in each animal. This dual tracer
PET acquisition is possible because of the short half-life of 11C (20.4 min). The rats also
undergo a magnetic resonance imaging (MRI) acquisition seven days before the PET
protocol. Prior to image analysis, PET and MR images are co-registered to allow the
measurement of regional cerebral uptake (cortex, hippocampus, striatum and cerebellum).
A quantitative measure of 11C-AcAc and 18F-FDG brain uptake (cerebral metabolic rate;
mol/100 g/min) is determined by kinetic modeling using the image-derived input function
(IDIF) method. Our new dual tracer PET protocol is robust and flexible; the two tracers
used can be replaced by different radiotracers to evaluate other processes in the brain.
Moreover, our protocol is applicable to the study of brain fuel supply in multiple conditions
such as normal aging and neurodegenerative pathologies such as Alzheimer’s and
Parkinson’s diseases.
175
INTRODUCTION:
Context and rationale
Positron emission tomography (PET) enables the minimally-invasive study of functional
processes in the brain. Glucose is the brain’s main energy substrate, but in conditions of
glucose deficiency, ketones (acetoacetate [AcAc] and -hydroxybutyrate) are the main
alternative energy substrates. Brain energy metabolism has been widely studied by PET
using the most common PET tracer, 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG), a glucose analog.
Our group recently developed a novel radiotracer - 11C-AcAc - to measure brain ketone
metabolism (Tremblay et al. 2007). Magnetic resonance imaging (MRI) is a much higher
resolution technique (0.1 mm × 0.1 mm in-plane resolution) than PET, and is needed to
clearly localize anatomical brain regions required for the regional PET analysis of brain
energy metabolism.
PET data are commonly expressed as standardized uptake values (SUV) (Pifferi et al. 2011,
Lopez-Grueso et al. 2010, Fueger et al. 2006, Luo et al. 2012, Poisnel et al. 2012). SUV
are the tissue activity concentration normalized by the fraction of the injected dose/unit
weight, as initially proposed over 70 years ago (Kenney et al. 1941). These units are still
widely used because they require simpler PET acquisition and image analysis
methodologies. However, an important limitation is that SUV are relative not absolute
units, making it difficult to compare results across different studies. This difficulty of
comparison may contribute to contradictory findings in the literature on brain glucose
uptake in the elderly (Cunnane et al. 2011). Therefore, the quantitative cerebral metabolic
rate (CMR; mol/100 g/min) has particular advantages (Shimoji et al. 2004, Tantawy et
Peterson 2010, Roy et al. 2012a). Generating CMR values requires a dynamic PET
acquisition and the plasma radioactivity counts as a function of time, i.e. the plasma timeactivity curve (TAC) or ‘input function’. The input function can be obtained by multiple
blood samplings throughout the PET acquisition (Yu et al. 2009, Shimoji et al. 2004) or by
the image-derived input function (IDIF) method, in which a region of interest is drawn on a
blood pool (heart’s left ventricle or major artery) (Roy et al. 2012a, Bentourkia et al. 2009,
Menard et al. 2010, Liistro et al. 2010, Croteau et al. 2010).
Goal
The aim of our method was to quantitatively compare for the first time the uptake of the
brain’s two key energy substrates, glucose and ketones, using PET and MRI in rodents.
11
C-AcAc and 18F-FDG were used sequentially in the same animal. The protocol was
designed to measure regional uptakes in different relevant brain structures (cortex,
hippocampus, striatum and cerebellum) clearly visible in the MR images. The protocol was
also specifically intended to permit quantitative analysis of tracer brain uptake, i.e. CMR of
both 18F-FDG and 11C-AcAc. Although this protocol was developed to study brain energy
substrates, the radiotracers we used could be replaced by others, and the same methodology
can be used to study different brain functional processes.
Advantages over existing methods
PET and MRI do not require the animal to be sacrificed after the acquisition. Therefore,
follow-up studies of treatments are possible. Thus, baseline data followed by an
experimental condition can be measured within the same animal, thereby reducing both
176
biological variability and the number of animals required. A key advantage of our dual
tracer PET protocol is to compare both tracers uptake in the same animal under the same
physiological conditions within the same imaging session, thereby reducing even more
biological variability and systematic discrepancies. This dual tracer PET protocol is
feasible primarily because of the short physical half-life of 11C (20.4 min) and the fast
biological washout of 11C-AcAc, which leave minimal residual 11C radioactivity during the
second acquisition with 18F-FDG. The MRI scan is an important feature of this protocol as
it enables the tracer uptake to be studied in specific brain areas. In addition, this method
enables an absolute quantitative measure of brain tracer uptake in contrast to relative units
obtained by the SUV method. Finally, 11C-AcAc images have a low signal-to-noise ratio
because of relatively low brain AcAc uptake under physiological conditions, which makes
automatic 11C-AcAc and MR images registration challenging. Hence, because 11C-AcAc
and 18F-FDG acquisitions are sequential (no motion of the animal), the 18F-FDG to MRI
alignment can be applied to 11C-AcAc images.
Key papers where the protocol has been used
We have used the dual tracer PET protocol in a study involving the comparison of the
fasted state and the ketogenic diet (KD) in young rats (Pifferi et al. 2011). We showed that
both fasting and the KD increase significantly both 11C-AcAc and 18F-FDG brain uptake.
However, these were not quantitative results as we did not use the dynamic PET imaging
and tracer kinetic modeling methodology at that time. Thereafter, we undertook a regional
and quantitative study of brain metabolism in aged rats, where the effect of aging and a KD
were evaluated on brain 11C-AcAc and 18F-FDG uptake (Roy et al. 2012a). We also
showed that the percentage of distribution across brain regions was different between 11CAcAc and 18F-FDG. Furthermore, not only the CMR of 11C-AcAc but also that of 18F-FDG
was increased in the whole brain as well as in the striatum of aged rats on the KD.
PROTOCOL:
All experiments were completed in accordance with the Animal Care and Use Committee
at the Université de Sherbrooke and the experimental protocol was approved by the
Institutional Animal Research Ethics Review Board (protocol #011-09).
1. Brain anatomy with MRI
1.1. Let rats acclimatize in the animal facility for a minimum of 7 days prior to the
protocol. Perform brain MRI scans 1-2 weeks prior to the dual tracer PET protocol
to allow full recovery from the anesthesia.
1.2. Anesthetize the rat in an induction chamber. Use 2% isoflurane and 1.5 l/min
oxygen throughout the protocol for anesthesia. Pinch the hind leg to ensure the
animal is fully anesthetized. CAUTION: inhalation of isoflurane can cause
headache, dizziness or unconsciousness in some cases; it should always be used in
the presence of an air exchange system in a suitably ventilated room.
1.3. Position the rat on the MRI examination table in the head-first prone position with
a nose cone for isoflurane. Position the respiration and rectal probes. Monitor the
respiration rate during the experiment and maintain body temperature at 37° C with
an automated air warming system.
177
1.4. Acquire T2-weighted MR images using a fast spin-echo pulse sequence with
acquisition parameters as detailed previously (Roy et al. 2012a). Place the rat on a
heated mat during recovery from anesthesia.
2. Dual tracer PET acquisitions
2.1. Use a small-animal PET scanner equipped with avalanche photodiode detectors, an
axial field of view of ~7.5 cm and an isotropic spatial resolution of 1.2 mm
(Bergeron et al. 2009). Due to its short physical half-life, prepare 11C by proton
bombardment of natural nitrogen (through the 14N(p,)11C nuclear reaction) in a
cyclotron on-site before each experiment.
2.2. Fast the rat for 18 h prior to PET scanning. Fasting allows higher brain uptake of
11
C-AcAc and 18F-FDG, thereby improving signal-to-noise ratio.
2.3. Anesthetize the rat in an induction chamber. Transfer the rat onto a heating mat
with a nose cone for isoflurane. Start 11C-AcAc synthesis at this time. The
synthesis takes 18 min from the end of bombardment, as previously described
(Tremblay et al. 2007).
2.4. Position the rat on its side. Prepare a PE50 polyethylene catheter filled with
heparinized 0.9% sodium chloride solution (saline). Install the catheter in the tail
vein for tracer injection. Install a second catheter in the mid-ventral tail artery for
blood sampling throughout the acquisitions.
2.5. Rapidly transfer the rat to the scanner table in the head-first prone position with a
nose cone for isoflurane. Position the respiration and rectal probes. Monitor the
respiration rate during the experiment and maintain body temperature at 37° C with
an automated warming air system. Move the scanner table forward into the scanner
to ensure the appropriate imaging of the brain and the heart simultaneously. As an
anatomical landmark, position the edge of the field of view on the rat’s eyes (with
the help of laser lines).
2.6. Using a concentrated 11C-AcAc solution (~1 GBq/ml), prepare a syringe of ~50
MBq of radioactivity (a range of 45-55 MBq is acceptable). Adjust the volume to
300 l with saline. CAUTION: Radioactivity can be harmful for the health. It
should always be handled behind a lead shield. The experimenter should be
wearing a body and ring dosimeter. A Geiger counter should also be on during the
experiment.
2.7. Install the syringe on an injection pump. Start the bolus injection of 11C-AcAc at a
rate of 1 ml/min (injection duration: ~19 sec). On a second pump, immediately
after terminating the 11C-AcAc injection, start the injection of 300 l of saline at a
rate of 1 ml/min, which is important for an optimal injection of tracer into the
blood circulation.
178
2.8. Start a dynamic PET data acquisition 30 sec before starting the bolus injection for a
total duration of 20.5 min. The 30 sec data acquisition before the tracer injection
provides a measure of the ambient background to be subsequently subtracted from
the PET data. Set the regular sampling mode and the energy window at 250-650
keV.
2.9. Collect two 200 l blood samples at ~15 and 18 min after starting the 11C-AcAc
injection. Inject heparinized saline in the catheter after each sampling to avoid
blood clotting. Take note of the time at the beginning and the end of blood
sampling and use the mean time. Centrifuge at 6,000 RPM for 5 min and collect
plasma. Measure radioactivity counts in plasma using a gamma counter calibrated
with the PET scanner.
2.10. After the 11C-AcAc scan, allow a waiting period of 20 min to ensure that most of
radioactivity has decayed. The period can vary from 15-30 min. Do not move the
scanner bed and leave the rat under isoflurane throughout this period.
2.11. During this time, using a concentrated 18F-FDG solution (~5.5 GBq/ml), prepare a
syringe of ~50 MBq. Proceed exactly as mentioned in steps 2.6 and 2.7. Start a
dynamic acquisition of a total duration of 40.5 min, including the 30 sec before the
injection. Collect two 200 l blood samples at ~30 and 35 min after starting the
18
F-FDG injection.
2.12. At the end of the 18F-FDG acquisition, take one final 200 µl blood sample.
Centrifuge and collect plasma. Keep plasma samples at -80°C for glucose and
AcAc analysis.
2.13. Finally, place the rat on a heating mat during the waking period. Keep the animal
for a longitudinal follow-up, or alternatively, euthanize the rat for brain sampling
and further biochemical studies.
2.14. Reconstruct the PET images according to the following time frame sequences: 1 ×
30; 12 × 5; 8 × 30; and n × 300 sec, where n=3 for 11C-AcAc acquisition and n=7
for 18F-FDG acquisition.
3. Plasma glucose and AcAc analysis
3.1. Measure plasma glucose and AcAc with a clinical chemistry analyzer. Perform
assays within 48 h of the blood sampling to minimize AcAc decarboxylation into
acetone. Measure glucose concentration with DF40 kit as previously described
(Freemantle et al. 2009) and AcAc with an open channel (Pifferi et al. 2011). This
type of analyzer is more accurate than strips (0.1 M) and has a broad detection
window.
4. Quantitative PET Analysis
4.1. Use PMOD software or an equivalent system for small-animal PET image analysis.
4.2. Plasma time-activity curve (TAC)
179
4.2.1. Load 18F-FDG data. Sum image frames of the first 60 sec following injection
(when tracer is mainly in blood).
4.2.2. Using a manual drawing tool, draw a volume of interest (VOI) on the left
ventricular cavity blood pool (a large pool centered in the bottom part of
images). Draw the VOI ~1mm inside of the edge of the blood pool (red
voxels) to ensure no inclusion of tissue and avoid tissue radioactivity spill into
the blood pool (Figure 1A). Copy the VOI to the entire dynamic image series
and generate a curve of radioactivity as a function of time (TAC).
4.2.3. In a spreadsheet such as Microsoft Excel 2010, use radioactivity counts of
the two plasma samples taken during the acquisition to correct plasma TAC
(Figure 1B). Use the following equation:
(
).
Some smoothing of the plasma TAC can be performed.
4.2.4. Verify if residual radioactivity from 11C-AcAc is present in the first 30 sec of
18
F-FDG scan, prior to injection. If so, subtract the following factor from all
(
)
⁄
the subsequent time frames of the TAC:
, where R is the
11
residual radioactivity, t1/2 is the half-life of C (20.4 min) and T is the time
frame (Bentourkia et al. 2009, Pifferi et al. 2011). Residual radioactivity from
11
C-AcAc after a waiting period of 20 min can be up to 1.5% of maximal 18FFDG counts.
4.3. 18F-FDG/MRI co-registration
4.3.1. Apply co-registration obtained with 18F-FDG images to the 11C-AcAc
images. This is necessary because 11C-AcAc images have a low signal-to-noise
ratio and automatic co-registration is difficult.
4.3.2. Load the corresponding MRI data. Load all 28 18F-FDG time frames in the
same orientation as the MR images (on three axes).
4.3.3. Compute the 18F-FDG summed image of the 28 time frames. This generates
an image with higher counts, so it is easier to work with for co-registration
with MRI than individual image frames.
4.3.4. Perform the automatic co-registration of the 18F-FDG summed image on MR
images (Figure 2). Apply the transformation to all individual 18F-FDG image
frames. Save the transformation which will later be applied to 11C-AcAc
images.
4.4. Volumes of interest (VOIs)
4.4.1. Using segmentation software such as PMOD, select MRI data and choose
preferred plane for manual drawing. Choose the manual or the semi-automatic
180
drawing tool, depending on brain region size and image contrast. Locate brain
structures according to a standard rat brain atlas (Paxinos et Watson 2007).
4.4.2. Draw the VOIs. As shown in Figure 3, segment the whole brain, cortex,
hippocampus, striatum and cerebellum, but other regions could be chosen.
Save the VOIs, which will be applied to the co-registered 18F-FDG and 11CAcAc images.
4.4.3. Apply VOIs to 18F-FDG co-registered images. Select the VOI statistics to
visualize brain TAC. If needed, correct TAC by subtracting the decaycorrected mean radioactivity in the first 30 sec from all the subsequent time
frames.
4.5. Cerebral metabolic rate calculation
4.5.1. Load brain and the corresponding plasma TACs.
4.5.2. Select Patlak plot kinetic model (Patlak et al. 1983, Patlak et Blasberg 1985).
Set the lumped constant to 0.48 (Sokoloff et al. 1977) and the corresponding
plasma glucose concentration (Figure 4B). Set the maximal relative deviation
from the Patlak plot to 5%. Fit the data to the model.
4.6.
11
C-AcAc images
4.6.1. Compute the 18F-FDG summed image of the 24 first time frames to have the
same number of frames as the 11C-AcAc scan. Otherwise, 11C-AcAc/MRI coregistration fails. Perform the automatic co-registration of 18F-FDG on MRI.
Save the transformation process which will be used for 11C-AcAc image coregistration.
4.6.2. Repeat steps 4.2 and 4.3 for 11C-AcAc images. Use 18F-FDG transformation
in step 4.6.1 and apply it to all individual 11C-AcAc image frames. Repeat
steps 4.4 and 4.5 and use 18F-FDG saved VOIs. Set the lumped constant to 1.
REPRESENTATIVE RESULTS:
As seen in Figure 2, 11C-AcAc uptake is low within the brain itself. As mentioned earlier,
ketones consumption by the brain is very low on a short-term fasting. 11C-AcAc uptake is
higher in the tongue and cheek muscles. Indeed, ketones are rapidly taken up by rat skeletal
muscles (Robinson et Williamson 1980). In contrast, 18F-FDG uptake is mostly in the brain
and the cheek muscles. Figure 2 shows that during the co-registration process, MR images
are fixed and PET images move due to an alignment in the axial plane.
We use the Patlak kinetic model (Patlak et al. 1983, Patlak et Blasberg 1985) to determine
brain uptake, which has been previously used for 11C-ketone and 18F-FDG kinetic modeling
(Blomqvist et al. 1995, Blomqvist et al. 2002, Shimoji et al. 2004, Yu et al. 2009). This
model uses equation 1, where the measured PET activity (CTissue) is divided by plasma
activity (CP) and plotted at a normalized time. The variable K represents brain influx and V
is the tracer’s distribution volume. After brain uptake steady state is achieved, the curve
results in a straight line (Figure 4A). The slope represents brain influx (K). Typical values
181
of brain influx (K) and distribution volume (V) in the whole brain for 18F-FDG are ~0.0165
min-1 and ~0.6425 ml blood/ml tissue, respectively (Figure 4B). As for 11C-AcAc, typical
values are ~0.0325 min-1 and ~0.5315 ml blood/ml tissue.
∫
(1)
Cerebral metabolic rate of glucose (CMRglc) and AcAc (CMRAcAc) are calculated according
to equations 2 and 3. Brain influx and plasma concentrations are required. For CMR glc, the
lumped constant (LC) is used to convert 18F-FDG uptake to glucose uptake. We use a LC
value of 0.48, as previously reported in rats (Sokoloff et al. 1977). No constant is used for
CMRAcAc calculation as the radiotracer has the exact same chemical formula as the
endogenous molecule.
(2)
(3)
One can expect whole brain CMRglc and CMRAcAc of approximately 24 and 3 mol/100 g
/min, respectively, in healthy adult rats fasted for 18 h prior the PET acquisitions (Roy et
al. 2012a). In the rat, CMRAcAc is therefore about 12% of that of CMRglc.
182
FIGURES:
Figure 1: Plasma time-activity curve (TAC) assessment. A) Volume of interest drawn on
the blood pool in the left ventricle of the heart using a manual drawing tool. This is an 18F18
FDG image showing the average radioactivity for the first 60 sec after the injection. B) FFDG plasma TAC obtained by image-derived input function (IDIF; black), the two plasma
18
samples collected 30 min (red) and 37.5 min (orange) after the injection and F-FDG
plasma TAC after correction with radioactivity counts of the two plasma samples (blue).
183
Figure 2: PET/MRI automatic co-registration process. Axial PET and MR images before
(left) and after (right) automatic co-registration with PMOD software. 18F-FDG (top) and
11
C-AcAc (bottom) images are shown. 11C-AcAc/MRI co-registration is performed using
the 18F-FDG/MRI transformation parameters.
184
Figure 3: Volumes of interest (VOIs) drawing. VOIs drawn on axial MR images (top).
18
VOIs applied to F-FDG co-registered images (bottom). WB: whole brain; Cx: cortex; Hp:
hippocampus; St: striatum; Cb: cerebellum.
185
Figure 4: Kinetic modeling of brain 18F-FDG uptake using PMOD software. A) Patlak plot
18
of F-FDG uptake in the whole brain. Y axis correspond to the measured PET activity
(CTissue) divided by plasma activity (CP) and X axis correspond to the normalized time
(
∫
The curve results in a straight line once steady state is reached. The slope
represents brain influx (K). B) Cerebral metabolic rate of glucose (MRGlu.) and plot
parameters of the corresponding 18F-FDG acquisition, where Plasma Gluc. is the plasma
glucose concentration, Max. Err. is the maximal relative deviation from the Patlak
regression line, Slope is the brain influx (K) and Intercept is the distribution volume (V).
186
DISCUSSION:
Critical steps
A critical step in this dual tracer PET protocol is to be able to simultaneously scan the
heart’s left ventricle and the brain at the same time. This requires a PET scanner with a
sufficient axial length, i.e. a minimum of 7.5 cm. A few test scans are needed to determine
the exact position of the scanner table (X, Y, Z values), where the brain and the heart are
scanned correctly.
Tracer injection is also a crucial point for a successful PET acquisition. The catheter must
be correctly inserted in the vein. Heparinized saline solution should flow into the vein
smoothly without blood clotting. For a quantitative measure of brain uptake, an accurate
plasma TAC is essential. When drawing the VOI on blood in the left ventricle, it is
important to include the fewest possible tissue pixels. Blood samples are also crucial to
correct the plasma TAC derived from the PET images. Indeed, as seen in Figure 1B,
radioactivity in plasma samples may be different than in the IDIF. This is due to the spill-in
effect in the last time frames (contamination of blood by radiation in adjacent tissues)
(Soret et al. 2007), which affects the IDIF. The brain MR image is essential for regional
brain analysis. After the co-registration process, the alignment of PET and MR images of
every brain slice should be verified to ensure that the subsequent PET regional brain
analysis is accurate. Finally, a good fit of data to the Patlak plot is required for accurate
calculation of CMR. Data should be as linear as possible; if not, the plasma and brain TAC
should be rechecked.
Limitations
A significant limitation of PET imaging is that it provides no information on the chemical
status of the radiotracer, i.e. degradation to other metabolites in the brain. Indeed, 18F-FDG
is taken up by brain cells, where it is trapped as 18F-FDG-6-phosphate. This contrasts with
nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMRS) where the labeled atom can be
monitored in multiple metabolic pathways (Jiang et al. 2011, Melo et al. 2006, Yudkoff et
al. 2005a). However, PET requires very low amounts of radiotracer (10-12-10-9 M)
compared to NMRS, and therefore better reflects physiological conditions. Another
limitation comes from the plasma TAC derived from the PET images, which can be inexact
because of the spill-out effect from blood to tissues in the first time frames (Soret et al.
2007). Indeed, the present method does not include blood sampling in the first time frames.
When drawing the VOI in the left ventricle, heart tissue may be included in the VOI
without noticing because of heart beat, which may affect the plasma TAC. Indeed, the
present method does not include electrocardiogram-gated PET acquisitions. The multiple
blood sampling method is the gold standard for the most accurate plasma TAC, but remains
demanding and invasive for small animals. Indeed, this technique would require
approximately 18 blood samplings per scan for both scan, which would represent a
considerable volume of blood sampled. Finally, for 11C-AcAc acquisitions, no correction
for loss of 11C-CO2 from the tissue is performed. However, previous 11C-ketone PET
studies showed that loss of 11C-CO2 had minimal impact on data, since the Patlak plot was
well described by a straight line, and did not correct data for this loss (Blomqvist et al.
1995, Blomqvist et al. 2002).
187
Possible modifications
This protocol is also applicable for the study of mice models. Fasting can be shortened to 6
h prior to the PET scan. However, with less than 6 h, 11C-AcAc brain uptake will not be
high enough for accurate CMR computation. Indeed, the brain consumes more ketones as
the fasting period is prolonged. We have previously shown that after a 48 h fasting, brain
11
C-AcAc uptake increases by 160% and that brain 18F-FDG uptake also increases by 277%
(Pifferi et al. 2011). Electrocardiogram-gated PET acquisitions can be performed and may
enable a more accurate plasma TAC. One can use another type of anesthetic such as
propofol or ketamine depending of the Institutional Animal Care and Use guidelines. If an
injection of anesthetic needs to be done during the dual PET tracer protocol, it should be
performed between the two scans and attention should be paid not to move the animal. A
longer delay is also possible between the two PET scans to reduce residual radioactivity
from 11C in the 18F-FDG scan. However, the total period for anesthesia should be kept as
short as possible since anesthesia decreases brain metabolism (Matsumura et al. 2003). For
quantitative PET analysis, any custom software enabling co-registration process and kinetic
modeling can be used. If the automatic PET-MRI co-registration process is not possible, the
registration can be performed manually. It is however a longer process and prone to human
error. Finally, the two-tissue compartment kinetic model is also a good model for 18F-FDG
brain uptake analysis and has been previously used in animal PET studies (Yu et al. 2009,
Tantawy et Peterson 2010). As for 11C-AcAc, the one and two-tissue compartment models
were shown to give identical results as the Patlak model (Blomqvist et al. 1995, Blomqvist
et al. 2002).
Significance of the method
The presented method permits sequential measurement of regional brain uptake of two PET
tracers and, hence, their comparison in the same animal under the same conditions.
Therefore, this protocol is ideal for comparative studies of brain metabolic pathways using
these PET tracers. Since the animals recover from the procedure, it can be repeated after an
experimental intervention. This method also enables the absolute quantitative assessment of
cerebral metabolic rates (mol/100 g/min) in contrast to relative data obtained by the SUV
method.
Future applications
The investigation of brain ketone and glucose metabolism using 11C-AcAc and 18F-FDG
uptake by PET is relevant in many physiological and pathological processes such as aging,
neurodegenerative patterns and tumor expansion or treatment. Other PET tracers can be
studied with the present protocol: 11C-palmitate and 18F-fluorothioheptadecanoic acid
uptake can be used to evaluate fatty acids esterification in conditions such as aging or type
2 diabetes. 11C-Pittsburgh Compound-B, which binds fibrillar amyloid- plaques, could
potentially be used in conjunction with 18F-FDG for the study of Alzheimer-like brain
pathologies. Furthermore, 18F-fluorodopamine is useful to evaluate dopamine circuits in
disease such as Parkinson. This dual tracer PET and MRI protocol can be applied to the
study of other organs such as the liver, heart, kidney or tumors.
188
ACKNOWLEDGMENTS: This study was financially supported by the Fonds de la
recherche en santé du Québec, Canadian Institutes of Health Research, Canadian
Foundation for Innovation and the Canada Research Chairs Secretariat (SCC). The
Sherbrooke Molecular Imaging Center is part of the FRQS-funded Étienne-Le Bel Clinical
Research Center. The authors thank Mélanie Fortier, Jennifer Tremblay-Mercier, Alexandre
Courchesne-Loyer, Dr. Fabien Pifferi, Dr. M’hamed Bentourkia, Dr. Otman Sarrhini, Dr.
Jacques Rousseau, Caroline Mathieu and Mélanie Archambault for generous support and
technical assistance. The authors would like to thank the image analysis and visualization
platform (http://pavi.dinf.usherbrooke.ca) for their help.
DISCLOSURES
The authors declare that they have no competing financial interests.
189
12.2 Annexe 2 : Productions scientifiques
Publications
Articles invités
Roy M, Nugent S, Tremblay S, Descoteaux M, Beaudoin JF, Tremblay L, Lecomte R,
Cunanne SC. A dual tracer PET-MRI protocol for the quantitative measure of regional
brain energy substrates uptake in the rat. Journal of Visualized Experiments. 2013 Dec
28;(82):50761.
Cunnane SC, Nugent S, Roy M, Begdouri H, Courchesne-Loyer A, Croteau E, Tremblay S,
Pifferi F, Bocti C, Paquet N, Bentourkia M, Barberger-Gateau P, Fulop T, Rapoport SI.
Brain fuel metabolism, aging and Alzheimer’s disease. Nutrition. 2011 Jan;27(1):3-20.
Articles
Roy, M, Beauvieux MC, Naulin J, El Hamrani D, Cunnane SC, Bouzier-Sore AK.
Modulation of brain glucose metabolism and GABA/glutamate ratio by the ketogenic diet:
an NMR study after 13C-glucose or 13C--hydroxybutyrate infusion. Journal of
Neurochemistry. En révision (JNC-2013-0912).
Nugent S, Tremblay S, Chen KW, Ayutyanont N, Roontiva A, Castellano CA, Fortier M,
Roy M, Courchesne-Loyer A, Bocti C, Lepage M, Turcotte E, Fulop T, Reiman EM,
Cunnane SC. Regional patterns of brain glucose and acetoacetate metabolism: A
comparison in younger and older adults. Neurobiology of Aging. 2013 Dec 1. pii: S01974580(13)00611-8.
Roy M, Hennebelle M, St-Pierre V, Courchesne-Loyer A, Fortier M, Bouzier-Sore A,
Gallis J, Beauvieux M, Cunnane SC. Long-term calorie restriction has minimal impact on
brain metabolite and fatty acid profiles in aged rats on a Western-style diet.
Neurochemistry International. 2013 Aug 22;63(5):450-457.
Courchesne-Loyer A, Fortier M, Tremblay-Mercier J, Chouinard-Watkins R, Roy M,
Nugent S, Castellano CA, Cunnane SC. Stimulation of mild, sustained ketonemia by
medium-chain triacylglycerols in healthy humans: estimated potential contribution to brain
energy metabolism. Nutrition. 2013 Apr;29(4):635-40.
Roy M, Nugent S, Tremblay-Mercier J, Tremblay S, Courchesne-Loyer A, Beaudoin JF,
Tremblay L, Descoteaux M, Lecomte R, Cunanne SC. The ketogenic diet increases brain
glucose and ketone uptake in aged rats: A dual tracer PET and volumetric MRI study.
Brain Research. 2012 Dec 7;1488:14-23.
Chapitres de livre
Castellano CA, Nugent S, Courchesnes-Loyer A, Roy M, Hennebelle M, St-Pierre V,
Fortier M, Tremblay S, Bocti C, Paquet N, Fulop T, Cunnane SC. Détérioration du
métabolisme énergétique cérébral dans la maladie d’Alzheimer : une condition spécifique
au glucose? Médecine-Sciences Publications. Soumis 7 novembre 2013.
190
Communications orales
1. Roy M, Beauvieux MC, Naulin J, El Hamrani D, Cunnane SC, Bouzier-Sore AK.
Effet de la diète cétogène sur le métabolisme cérébral chez le rat: Étude par
spectroscopie RMN. 3e Journée scientifique de l’Institut de Nutrition Aquitaine
Québec. Bordeaux (France), Décembre 2013.
2. Roy M, Hennebelle M, St-Pierre V, Courchesne-Loyer A, Fortier M, Bouzier-Sore
AK, Gallis JL, Beauvieux MC, Cunnane SC. Effets d’une restriction calorique à
long terme sur le profil neurochimique de rats âgés. 5e journée annuelle du Centre
des Neurosciences de Sherbrooke. Sherbrooke (Canada), Décembre 2013.
3. Naulin J, Roy M, Beauvieux MC, Gallis JL, Raffard G, Franconi JM, Cunnane SC,
Bouzier-Sore AK. Adaptation of rat brain metabolism after ketogenic diet and its
implication in epilepsy: a 13C-NMR study. 30th Annual Meeting of the European
Society for Magnetic Resonance in Medicine and Biology. Toulouse (France),
Octobre 2013.
4. Nugent S, Castellano CA, Tremblay S, Fortier M, Roy M, Courchesne-Loyer A,
Bocti C, Turcotte E, Lepage M, Fulop T, Cunnane SC. L’hypométabolisme du
cerveau chez les personnes âgées varie selon le carburant et les régions cérébrales
concernés. 11e journée de la recherche du Réseau Québécois de recherche sur le
vieillissement, Québec (Canada). Octobre 2013.
5. Courchesne-Loyer A, Castellano CA, Nugent S, Roy M, Fortier M, Tremblay S,
Turcotte E, Fulop T, Cunnane SC. A PET and MRI approach to study brain glucose
and ketone metabolism during aging and Alzheimer’s disease. Third Annual
Symposium: Dietary Therapy for Epilepsy and Other Neurological Disorders.
Chicago (États-Unis), Septembre 2012.
6. Nugent S, Castellano C, Roy M, Lepage M, Turcotte E, Allard M, Fulop T,
Cunnane SC. La détérioration du métabolisme cérébral est liée à l’état du
métabolisme glucidique périphérique: une situation qui augmente le risque de
troubles cognitifs lors du vieillissement? 4e journée annuelle de la plateforme
COLosSUS (Complications de l’Obésité à l’Université Laval et à l’Université de
Sherbrooke). Québec (Canada), Février 2012.
7. Roy M, Tremblay-Mercier J, Tremblay S, Fortier M, Bentourkia M, Cunnane SC.
L’approvisionnement du cerveau en carburants est-il affecté au cours du
vieillissement sain? Une étude TEP chez le rat. 3e journée annuelle du Centre des
Neurosciences de Sherbrooke. Sherbrooke (Canada), Décembre 2011.
8. Roy M, Tremblay-Mercier J, Tremblay S, Fortier M, Bentourkia M, Cunnane SC.
Métabolisme cérébral du glucose et des cétones chez les rats âgés. 9e journée de la
recherche du Réseau Québécois de Recherche sur le Vieillissement. Magog
(Canada), Octobre 2011.
191
9. Roy M, Tremblay-Mercier J, Tremblay S, Fortier M, Bentourkia M, Cunnane SC.
Métabolisme cérébral du glucose et des corps cétoniques lors du vieillissement chez
le rat. 79e journée annuelle de l’Association Francophone pour le Savoir.
Sherbrooke (Canada), Mai 2011.
Communications par affiche
1. Beauvieux MC, Naulin J, El Hamrani D, Roy M, Bouzier-Sore AK, Gallis JL,
Cunnane SC. Le régime cétogénique augmente rapidement les acides aminés
branchés dans le foie: étude par spectroscopie 1H HRMAS chez le rat. Les Journées
Francophones de Nutrition. Bordeaux (France), Décembre 2013.
2. Roy M, Hennebelle M, St-Pierre V, Courchesne-Loyer A, Fortier M, Bouzier-Sore
AK, Gallis JL, Beauvieux MC, Cunnane SC. La restriction calorique à long terme
ne modifie pas le profil des métabolites et des acides gras du cerveau chez des rats
âgés sous une diète de type occidental. 3e Journée scientifique de l’Institut de
Nutrition Aquitaine Québec. Bordeaux (France), Décembre 2013.
3. Roy M, Hennebelle M, St-Pierre V, Courchesne-Loyer A, Fortier M, Bouzier-Sore
AK, Gallis JL, Beauvieux MC, Cunnane SC. La restriction calorique à long terme
ne modifie pas le profil des métabolites et des acides gras du cerveau chez des rats
âgés. 11e Journée annuelle du Réseau Québécois de Recherche sur le
Vieillissement. Québec (Canada), Octobre 2013.
4. Hennebelle M, Roy M, St-Pierre V, Courchesne-Loyer A, Cunnane SC. Restriction
calorique et composition lipidique des tissus chez des rats âgés. 11e Journée
annuelle du Réseau Québécois de Recherche sur le Vieillissement. Québec
(Canada), Octobre 2013.
5. Beauvieux MC, Naulin J, El Hamrani D, Roy M, Bouzier-Sore AK, Gallis JL,
Cunnane SC. Increase in hepatic branched-chain amino acids leucine and
isoleucine by the ketogenic diet: a study by 1H HRMAS spectroscopy in the rat liver.
30th Annual Meeting of the European Society for Magnetic Resonance in Medicine
and Biology. Toulouse (France), Octobre 2013.
6. Cunnane SC, Courchesne-Loyer A, Roy M, Nugent S, Castellano CA, Tremblay S,
Turcotte E, Fulop T. Dual tracer PET and MRI approach to study deteriorating
brain fuel metabolism during aging. 5th Conference Clinical Trials on Alzheimer’s
Disease. Monte Carlo (Monaco), Octobre 2012.
7. Courchesne-Loyer A, Nugent S, Roy M, Castellano CA, Tremblay S, Fortier M,
Cunnane SC. Métabolisme cérébrale des cétones; possible utilisations
thérapeutiques. 4e journée annuelle de la plateforme COLosSUS, Lac Beauport
(Canada), Février 2012.
8. Roy M, Tremblay-Mercier J, Tremblay S, Fortier M, Bentourkia M, Cunnane SC.
Brain glucose and ketone metabolism in aged rats: a double tracer pet study.
192
XXVth International Symposium on Cerebral Blood Flow, Metabolism and
Function and the Xth International Conference on Quantification of Brain Function
with PET. Barcelone (Espagne), Mai 2011.
9. Harbeby E, Tremblay S, Tremblay-Mercier J, Archambault M, Roy M, Beaudoin
JF, Lallemand MS, Rousseau J, Huertas A, Guesnet P, Lecomte R, Cunnane SC.
Brain glucose uptake in omega-3 fatty acid deficiency: an 18F-Fluorodeoxyglucose
Positron Emission Tomography (FDG-PET) study in the rat. Brain Lipids
Conference. Paris (France), Mars 2011.
10. Cunnane SC, Nugent S, Castellano A, Courchesne-Loyer A, Roy M, Tremblay S,
Fulop T. Métabolisme énergétique cérébral insuffisant: problème causal dans la
maladie d’Alzheimer (MA)? 11th International Colloque on Cognitive Aging. Liège
(Belgique), Septembre 2010.
11. Cunnane SC, Nugent S, Castellano A, Roy M, Croteau E, Tremblay S, Fortier M,
Sarrhini O, Begdouri H, Bentourkia M, Fulop T. Comparaison du métabolisme du
glucose et des cétones lors du vieillissement: étude TEP à double traceur chez
l’humain. 11th International Colloque on Cognitive Aging. Liège (Belgique),
Septembre 2010.
12. Castellano CA, Fortier M, Trembley-Mercier J, Courchesne-Loyer A, Nugent S,
Roy M, Tremblay S, Cunnane SC. Comment freiner la progression de la maladie
d’Alzheimer ? Colloque provincial sur la maladie d'Alzheimer. Orford, (Canada),
Septembre 2010.
13. Roy M, Nugent S, Sarrhini O, Begdouri H, Tremblay S, Fortier M, Fulop T,
Bentourkia M, Cunnane, SC. Brain glucose and ketones metabolism during aging:
a double tracer PET study in humans. Alzheimer's Association International
Conference on Alzheimer's Disease. Honolulu (Hawaii), Juillet 2010.
14. Harbeby E, Tremblay S, Tremblay-Mercier J, Archambault M, Roy M, Beaudoin
JF, Rousseau J, Huertas A, Guesnet P, Lecomte R, Cunnane SC. Omega-3 fatty
acids and brain glucose utilization: an 18F-Fluorodeoxyglucose Positron Emission
Tomography (FDG-PET) study in the rat. 9th biennial scientific meeting of the
International Society for the Study of Fatty Acids and Lipids. Maastricht (Pays-bas),
Juin 2010.
15. Roy M, Pifferi F, Tremblay S, Tremblay-Mercier J, Fortier M, Bentourkia M,
Cunnane SC. Métabolisme cérébral du glucose et des corps cétoniques lors du
veillissement chez le rat. 7e journée annuelle du Centre de Recherche sur le
Vieillissement. Magog (Canada), Mai 2010.
16. Roy M, Pifferi F, Tremblay S, Tremblay-Mercier J, Fortier M, Bentourkia M,
Cunnane SC. Métabolisme cérébral du glucose et des corps cétoniques lors du
veillissement chez le rat. 11e journée annuelle de la Société Québécoise de
lipidologie, nutrition et métabolisme. Québec (Canada), Avril 2010.
193
17. Roy M, Pifferi F, Tremblay S, Tremblay-Mercier J, Fortier M, Bentourkia M,
Cunnane SC. Métabolisme cérébral du glucose et des corps cétoniques lors du
veillissement chez le rat. 2e journée annuelle de la plateforme COLosSUS. Québec
(Canada), Février 2010.
194
12.3 Annexe 3 : Composition de la diète cétogène et de la diète contrôle
Macronutriments
Diète contrôle
Diète cétogène
Protéines
Caséine
87
154
L-cystine
3,0
5,4
Glucides
Fécule de maïs
466
Sucrose
138
Dextrine
165
33
Fibres
Cellulose
41
72
Vitamines
AIN-93G-VX
0,33
0,59
Minéraux
AIN-93G-MX
27
48
Lipides
Huile de soja
70
124
Huile de lin
56
Beurre
508
Ratio
lipide : protéine + glucide
1,0 : 12,5
3,5 : 1,0
Les valeurs sont données en g/Kg. Adapté de Pifferi et al. (2011).